PL223054B1 - Sposób otrzymywania erytrytolu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania erytrytolu. Wynalazek dotyczy dwustopniowego prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu przez drożdże Yarrowia lipolytica, w pożywkach zawierających w swoim składzie kwasy tłuszczowe, jako główny składnik frakcji glicerynowej otrzymywanej w procesie produkcji biodiesla z olejów roślinnych, oraz dodatkowo glicerol, w bardzo niskim pH.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania erytrytolu. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym.

Znane są sposoby otrzymywania erytrytolu z czystej glukozy, sacharozy i mieszaniny glukozy i fruktozy przy udziale drożdży w hodowlach okresowych i okresowych zasilanych.

Jednym ze sposobów jest produkcja erytrytolu z glukozy przez szczep Torula sp. Produkcję przy udziale tego szczepu prowadzi się na wstrząsarce w 250 ml kolbach stożkowych w podłożu o składzie: (g/l) glukoza 400; ekstrakt drożdżowy 20. Po 138 godzinach hodowli wstrząsanej uzyskuje się 196 g/l erytrytolu z wydajnością 0,49 g/g (Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim, Deok-Kun Oh, Biotechnology Letters. 2000, 22, str. 983).

W innym sposobie produkcji erytrytolu z glukozy przez drożdże z gatunku Pseudozyma tsukubaensis KN75 w hodowli okresowej zasilanej prowadzonej przez około 90 godzin w bioreaktorze, otrzymano 245 g/l erytrytolu, z szybkością objętościową produkcji erytrytolu 2,86 g/lh i wydajnością erytrytolu 0,61 g/g. (Marimuthu Jeya, Kyoung-Mi Lee, Manish Kumar Tiwari, Jung-Soo Kim, Paramasamy Gunasekaran, Sang-Yong Kim, In-Won Kim, Jung-Kul Lee. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009. 83, str. 225).

Znany jest również sposób okresowej produkcji erytrytolu zasilanej syropem glukozowym przez szczep Trichosporon sp. W hodowli wgłębnej w 5 litrowym bioreaktorze, w temperaturze 35°C, przy szybkości mieszania równej 600 obr/min otrzymywano do 240 g/l erytrytolu z wydajnością od 0,40 do 0,45 g/g. (Jinbyung Park, Byungcheol Seo, Jungryul Kim, Yongkun Park. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1998, 86 (6), str. 577).

Z kolei, w produkcji erytrytolu z glukozy przez drożdże z rodzaju Moniliella sp. N61188-12, w 144 godzinnej hodowli okresowej zasilanej prowadzonej w 2000 litrowym bioreaktorze, gdzie zastosowano wysokie stężenie całkowite glukozy równe 400 g/l otrzymano 237,8 g/l erytrytolu z szybkością objętościową produkcji erytrytolu 1,98 g/lh i z wydajnością 0,595 g/g (Shie-Jea Lin, Chiou-Yen Wen, Pei-Ming Wang, Jang-Cheng Huang, Chi-Liang Wei, Jin-Wei Chang, Wen-Shen Chu. Process Biochemistry. 2010, 45, str. 973).

Znany jest również proces okresowej produkcji erytrytolu w pożywkach syntetycznych zawierających jedynie glicerol jako źródło węgla i energii przez drożdże z gatunku Yarrowia lipolytica. Po 80 godzinach hodowli ze 150 g/l glicerolu uzyskano 80 g/l erytrytolu z szybkością objętościową produkcji erytrytolu 1 g/lh. (Tomaszewska L., Rywińska A., Gładkowski W. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2012, 39, str. 1333).

Nieznane są natomiast sposoby produkcji erytrytolu w pożywkach zawierających w swoim składzie kwasy tłuszczowe, jako główny składnik frakcji glicerynowej otrzymywanej w procesie produkcji biodiesla, oraz dodatkowo glicerol. Nieoczekiwanie okazało się, że drożdże Yarrowia lipolytica potrafią syntetyzować erytrytol z powyższych substratów w procesie dwustopniowym i bardzo niskim pH.

Frakcja glicerynowa stanowi produkt uboczny procesu metanolizy oleju rzepakowego, prowadzonego głównie w celu otrzymania estrów metylowych kwasów tłuszczowych, nazywanego biodieslem. Frakcja glicerynowa zawiera 30-40% gliceryny, do 50% mydeł (sole metali wyższych kwasów tłuszczowych) wraz ze zemulgowanymi estrami metylowymi, a resztę stanowi metanol. W skali przemysłowej frakcja glicerynowa jest poddawana dwustopniowemu procesowi przetwarzania. W pierwszym etapie, w wyniku zakwaszenia frakcji glicerynowej kwasem mineralnym, następuje rozdzielenie frakcji glicerynowej na frakcję kwasów tłuszczowych i frakcję gliceryny surowej, a następnie w drugim etapie odparowywany jest toksyczny metanol.

Istotą wynalazku jest to, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się kwasy tłuszczowe powstałe w wyniku rozdzielenia frakcji glicerynowej, która jest produktem ubocznym, powstałym w wyniku procesu produkcji biodiesla, na kwasy tłuszczowe i wodę glicerynową w obniżonym odczynie środowiska. Kwasy tłuszczowe dodaje się w ilości od 10 do 30 g, niejonowe surfaktanty w ilości od 0,1 do 3,0 g, ekstrakt drożdżowy w ilości od 0,1 do 5,0 g, bakto-pepton od 0,5 do 5 g, oraz pozostałą ilość wody. Następnie ustala się pH na poziomie od 4 do 5, po czym tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca, wytrząsa z prędkością od 150 do 200 obr./min., w temperaturze co najmniej 26°C przez co najmniej dwie doby. Tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią (NH ₄)₂SO₄ w ilości od 1,0 do

PL 223 054 B1

10,0 g/L, MgSO₄-7H₂O w ilości od 0,2 do 2 g/L, NaCI w ilości od 1 do 40 g/L, KH₂PO₄ w ilości od 0,1 do 1,5 g/l; oraz kwasy tłuszczowe, niejonowe surfaktanty, ekstrakt drożdżowy w ilościach jak poprzednio oraz pozostałą ilość woda. Hodowlę prowadzi się w temperaturze co najmniej 26°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200, szybkości napowietrzania od 100 do 800 ml/min. Po upływie co najmniej dwóch dób, do pożywki dodaje się glicerol w ilości maksymalnie 20% wagowych, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,5-3,0 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania glicerolu z pożywki. Następnie oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, a brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym. Jony usuwa się na wymieniaczach jonowych. Płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej, a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.

Korzystnie jest, gdy na wyhodowaną biomasę dodatkowo dodaje się od 1 do 4% wagowych NaCI na 1 litr pożywki produkcyjnej znajdującej się w bioreaktorze.

Korzystnie także jest, gdy po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 2,7-2,9.

Korzystnie również jest, gdy glicerolem jest gliceryna surowa z produkcji biodiesla.

Zaletą sposobu według wynalazku, jest możliwość otrzymywania dużych ilości erytrytolu z odnawialnych surowców roślinnych oraz z surowców będących odpadami poprzemysłowymi. Ponadto dodawanie glicerolu do pożywki dopiero w 48 godzinie hodowli, znacznie zwiększa stężenie końcowe erytrytolu w płynie pofermentacyjnym. Zaletą jest również to, że wydajność produkcji erytrytolu osiąga poziom 0,1-0,61 g/g, natomiast końcowe stężenia erytrytolu wynosi od 10 do 122 g/l. Dodatkowo otrzymuje się od 15 do 20 g/l suchej biomasy drożdży.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest na przykładach.

P r z y k ł a d 1. Podłoże inokulacyjne o objętości 50 ml zawierające: kwasy tłuszczowe - 20 g/l; ekstrakt drożdżowy - 2 g/l, bakto-pepton - 3 g/l, niejonowe surfaktanty w formie preparatu Span20 0,25 g/l, wodę wodociągową do 1 litra, zaszczepia się szczepem Yarrowia lipolytica A-311 i prowadzi hodowlę przez 72 godziny w kolbie stożkowej o objętości 300 ml, w temperaturze 29°C na wstrząsarce rotacyjnej przy 160 obr/min. Hodowla ta stanowi materiał szczepienny właściwej hodowli produkcyjnej, którą przeprowadza się w 5-litrowym bioreaktorze, zawierającym 2 litry podłoża produkcyjnego o składzie: kwasy tłuszczowe - 20 g/l, Span20 - 0,5 g/l, (NH₄)₂SO₄ - 3 g/l, MgSO₄-7H₂O - 1 g/l, NaCI - 25 g/l, KH₂PO₄ - 0,25 g/l, ekstrakt drożdżowy -1 g/l, woda wodociągowa do 1 litra. Do utrzymania pH środowiska hodowlanego na poziomie 2,8 stosuje się 10 M NaOH. W trakcie procesu utrzymuje się stałą temperaturę 30°C, szybkość obrotową mieszadła 800 obr./min. i szybkość napowietrzania 0,6 litra powietrza/min. Po 48 godzinach prowadzenia hodowli w podłożu z kwasami tłuszczowymi, jako źródłem węgla, dodaje się 200 g/l glicerolu. Po 300 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki, otrzymuje się 122 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 17 g/l suchej biomasy drożdży. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,46 g/lh.

P r z y k ł a d 2. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym, że biosyntezę erytrytolu prowadzi się szczepem Yarrowia lipolytica A-101 w pH równym 2,8, natomiast hodowlę w podłożu z kwasami tłuszczowymi przy pH 4,5, prowadzi się przez 48 godzin, a następnie dodaje się 100 g/l glicerolu. Po 98 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 25 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 18 g/l suchej biomasy drożdży. Proces biosyntezy er ytrytolu rozpoczyna się w 48 godzinie hodowli. Całkowita objętościowa szybkość produkcji erytrytolu wynosi 0,25 g/lh.

P r z y k ł a d 3. Przygotowuje się inokulum i prowadzi proces jak w przykładzie 1, z tym, że biosyntezę erytrytolu prowadzi się ze szczepem Yarrowia lipolytica A-8 w pH równym 2,8, natomiast hodowlę w podłożu z kwasami tłuszczowymi przy pH 5,0 prowadzi się przez 48 godzin, a następnie dodaje się 100 g/l glicerolu. Po 100 godzinach prowadzenia procesu biosyntezy w 1 litrze pożywki otrzymuje się 10 g/l erytrytolu oraz dodatkowo 19 g/l suchej biomasy drożdży.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania erytrytolu drogą biosyntezy z wykorzystaniem kultur drożdży Yarrowia lipolytica, znamienny tym, że przygotowuje się podłoże w taki sposób, że na 1 litr objętości miesza się kwasy tłuszczowe powstałe w wyniku rozdzielenia frakcji glicerynowej, która jest produktem ubocznym procesu produkcji biodiesla, na kwasy tłuszczowe i wodę glicerynową w obniżonym odczy4

   PL 223 054 B1 nie środowiska, w ilości od 10 do 30 g, niejonowe surfaktanty w ilości od 0,1 do 3,0 g, ekstrakt drożdżowy w ilości od 0,1 do 5,0 g, bakto-pepton od 0,5 do 5 g, oraz pozostałą ilość wody, po czym ustala się pH na poziomie od 4 do 5, następnie tak przygotowane podłoże wprowadza się do naczynia w ilości od 20 do 30% jego objętości, całość sterylizuje się, chłodzi się do temperatury pokojowej, a następnie zaszczepia się podłoże czystą kulturą drożdży Yarrowia lipolityca, wytrząsa z prędkością od 150 do 200 obr./min., w temperaturze co najmniej 26°C przez co najmniej dwie doby, po czym tak uzyskane inokulum wprowadza się do bioreaktora, korzystnie w ilości 10% objętości roboczej, gdzie pozostałą objętość stanowią (NH₄)₂SO₄ w ilości od 1,0 do 10,0 g/L, MgSO₄-7H₂O w ilości od 0,2 do 2 g/L, KH₂PO₄ w ilości od 0,1 do 1,5 g/l, oraz kwasy tłuszczowe, niejonowe surfaktanty, ekstrakt drożdżowy w ilościach jak poprzednio oraz pozostałą ilość woda i prowadzi hodowlę w temperaturze co najmniej 26°C, przy obrotach mieszadła na minutę od 400 do 1200, szybkości napowietrzania od 100 do 800 ml/min, po upływie co najmniej dwóch dób dodaje się do pożywki glicerol w ilości maksymalnie 20% wagowych, przy czym poziom pH utrzymuje się na poziomie 2,5-3,0 przez cały czas prowadzenia procesu biosyntezy erytrytolu, do momentu wyczerpania glicerolu z pożywki, po czym oddziela się biomasę drożdży od cieczy poprzez filtrację, brzeczkę pofermentacyjną poddaje się dekoloryzacji na węglu aktywnym, a jony usuwa na wymieniaczach, następnie płyn zawierający erytrytol zatęża się do około 50% suchej masy na wyparce próżniowej a powstałe w temperaturze pokojowej kryształy, oddziela się poprzez filtrację, przemywa wodą i suszy.
2. 2. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że na wyhodowaną biomasę dodaje się także od 1 do 4% wagowych NaCI na 1 litr pożywki produkcyjnej znajdującej się w bioreaktorze.
3. 3. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że po dodaniu glicerolu utrzymuje się pH na poziomie 2,7-2,9.
4. 4. Sposób, według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że glicerolem jest gliceryna surowa z produkcji biodiesla.