NO342966B1

NO342966B1 - Fremgangsmåter for behandling av immunforstyrrelser assosiert med organtransplantasjon med løselige CTLA4-mutantmolekyler

Info

Publication number: NO342966B1
Application number: NO20075078A
Authority: NO
Inventors: David Hagerty; James Rusnak
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2005-04-06
Filing date: 2007-10-09
Publication date: 2018-09-10
Also published as: JP2008535841A; CY1119145T1; IL186189A; MX2007012222A; SI1868635T1; EP1868635A1; PT1868635T; AR055052A1; AU2006231622B2; US7482327B2; PL1868635T3; AU2006231622A1; NO20075078L; NZ561655A; ME02930B; EA200702180A1; US20100041602A1; EP1868635B1; KR20070119728A; US20070009511A1

Abstract

SAMMENDRAG Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer anvendelse av oppløselige CTLA4 mutantmolekyler som binder med større aviditet til CD80 og/eller CD86-antigenet enn villtype CTLA4 eller ikke-mutert CTLA4Ig ved behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon.

Description

FREMGANGSMÅTER FOR BEHANDLING AV IMMUNFORSTYRRELSER ASSOSIERT MED ORGANTRANSPLANTASJON MED LØSELIGE CTLA4-

MUTANTMOLEKYLER

RELATERT SØKNAD

Foreliggende søknad krever prioritet under tittel 35 § 119(e) fra United States provisional Application nr.60/668,774, innlevert 6. april, 2005, idet innholdet i denne er omfattet her i sin helhet ved referanse.

Gjennom hele foreliggende søknad er forskjellige publikasjoner referert. Beskrivelsene i disse publikasjonene er omfattet i sin helhet i foreliggende søknad for å mer fullstendig beskrive teknikkens stand for det området som foreliggende oppfinnelse angår.

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av oppløselige CTLA4 mutantmolekyler, med økt bindingsaviditet for CD80 (B7-1) og CD86 (B7-2) sammenlignet med villtype CTLA4, ved behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Gitt den sentrale rollen av T-celler i transplantatavstøtning, er et vanlig mål for gjeldende immunsuppressive behandlinger å blokkere T-celleaktivering og funksjon (Sayegh MH, Turka LA. The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplant rejection. N Engl J Med 1998;338(25):1813-21). T-celler krever både et antigenspesifikt (Signal 1) og kostimulerende signal (Signal 2) for fullstendig aktivering (Lenschow DJ, Walunas TL, Bluestone JA. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev Immunol 1996;14:233-58). En av de best karakteriserte kostimulatoriske reaksjonsveier omfatter CD28-CD80/86 (B7–1/2) interaksjonen ( Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev Immunol 1993;11:191-212). Cytotoksisk T-lymfocytt antigen 4 (CTLA4) binder til CD80/86 med høyere aviditet enn CD28 og blir transient uttrykt på T-celler etter deres aktivering, hvor det forstyrrer interaksjonen mellom CD28 og CD80/86 ( Oosterwegel MA, Greenwald RJ, Mandelbrot DA, Lorsbach RB, Sharpe AH. CTLA-4 and T cell activation. Curr Opin Immunol 1999;11(3):294-300.). Dette skaper et negativt feedback-signal for T-celleaktivering.

Intervensjon i denne reaksjonsveien har tidligere blitt søkt oppnådd med CTLA4Ig. CTLA4Ig er med hell anvendt som en strategi for å behandle T-cellemedierte autoimmunlidelser slik som revmatoid artritt ( Kremer JM, Westhovens R, Leon M, et al. Treatment of rheumatiod arthritis by selective inhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA4Ig. N Engl J Med 2003;349(20):1907-15) og psoriasis (Abrams JR, Lebwohl MG, Guzzo CA, et al. CTLA4Ig-mediated blockade of T-cell costimulation in patients with psoriasis vulgaris. J Clin Invest 1999;103(9):1243-52).

LEA29Y har blitt studert i ikke-humane primate transplantasjons-modeller alene og i kombinasjon med andre immunsuppressive midler. Christian Larsen et al (C. Larsen, T. Pearson, A. Adams, P. Tso, N. Shirasugi, E. Strobert, D.

Anderson, S. Cowan, K. Price, J. Naemura, J. Emswiler, J. Greene, L.A. Turk, J. Bajorath, R. Townsend, D. Hagerty, P. Linsley og R. Peach; Rational Development of LEA29Y (belatacept), a High-Affinity Variant of CTLA4-Ig with Potent Immunosuppressive Properties; American Journal of Transplantation; Vol.5, Issue 3, mars 2005, s,443) har vist den forbedrede immunsuppressive aktiviteten av LEA29Y når sammenlignet med CTLA4-Ig i en ikke-human primat-modell anvendt for å undersøke nyre allograft avstøtning. LEA29Y ble administrert intraoperativt (10 mg/kg intravenøst), ved dag 4 (15 mg/kg) og ved postoperative dager 14, 28, 42, 56 og 70 (20 mg/kg intravenøst). CTLA4Ig (16 mg/kg) ble administrert intraoperativt og ved postoperative dager 4, 8, 11 og 16. Behandlingsregimet omfattet også MMF (15 mg/kg bid s.c. ved dagene 0-14, qd ved dagene 15-180), metylprednisolon (subkutan injeksjon i henhold tii følgende plan, dag 0: 20 mg, dag 1: 16 mg, dag 3: 8 mg, dag 4:4 mg, dag 5-14: 3 mg, dag 15-180: 1 mg) og basiliximab (0,3 gm/kg i.v. ved dag 0 og 4). Overlevelse for nyreallograftmottagere behandlet med LEA29Y var klart bedre enn den for en gruppe behandlet med CTLA4-Ig til tross for komparable serum konsentrasjoner. Kontrollmottagere behandlet med albumin viste en lignende median overlevelsestid som gruppen behandlet med CTLA4-Ig. Imidlertid, til tross for vedvarende behandling med LEA29Y, opplevde alle mottagere en betydelig nedgang i nyrefunksjon (økning i serumkreatinin).

Andrew Adams et al (A. Adams, N. Shirasugi, T. Jones, M. Durham, E. Strobert, S. Cowan, P. Rees, R. Hendrix, K. Price, N. Kenyon, D, Hagerty, R.

Townsend, D. Hollenbaugh, T. Pearson og C. Larsen; Development of a Chimeric Anti-CD40 Monoclonal Antibody That Synergizes with LEA29Y to Prolong Islet Allograft Survival; The Journal of Immunology; Jan 2005; 174; s.542) har vist at kombinasjonen av LEA29Y og Chi220 (en kimær anti-human CD40 mab) virker synergistisk i en ikke-human primat modell av pankreas øytransplantasjon for å forlenge allograft overlevelse. LEA29Y ble administrert intravenøst intra-operativt (20 mg/kg); ved postoperative dager 4, 7 og 14; deretter hver andre uke inntil dag 100. Ytterligere doser (20 mg/kg) ble administrert månedlig i 6 måneder. Fire protokoller ble testet: 1) LEA29Y alene, 2) Chi220 (anti-CD40), 3) LEA29Y kombinert med Chi220 og 4) LEA29Y kombinert med anti-CD20.

a. Andrew Adams et al (A. Adams, N. Shirasugi, M. Durham, E. Strobert, D. Anderson, P. Rees, S. Cowan, H. Xu, Y. Blinder, M. Cheung, D. Hollenbaugh, N. Kenyon, T. Pearson og C. Larsen; Calcineurin Inhibitor-Free CD28 Blockage-Based Protocol Protects Allogeneic Islets in Nonhuman Primates; Diabetes, Vol.

51(2), februar 2002, s.265) har vist at kombinasjonen av LEA29Y, rapamycin og anti-IL-2R mAb betydelig forlenget øy-allograft overlevelse. i en ikke-human primat modell av pankreas øytransplantasjon. LEA29Y ble administrert intravenøst intraoperativt (10 mg/kg) og ved postoperativ dag 4 (15 mg/kg). Ytterligere doser på 20 mg/kg ble gitt ved postoperativ dag 14 og hver andre uke inntil postoperativ dag 154.

I løpet av 2003 ble mer enn 25,000 organer transplantert i USA.

Nyretransplantasjon representerte omtrent 60% av de faste organtransplantasjonene fulgt av levertransplantasjoner ved 21%, hjerte ved 8%, lunge ved 4% og de resterende 7% representerte andre organtransplantasjoner slik som bukspyttkjertel og tarm. (OPTN/SRTR Annual Report 2004 ved www.optn.org)

Nyretransplantasjon er den mest effektive behandling for endepunkt nyresykdom. Den tilveiebringer forbedret overlevelse og livskvalitet (QoL).

Opprettholdelse av et fungerende nyretransplantat bemyndiger livslang immunsuppressiv behandling for å forhindre immun ødeleggelse av transplantatet. Gjeldende immunsuppressive regimer gir 1 års overlevelsesgrad på 89% for kadaver og 94% for levende donor transplantater. Over tid er det imidlertid progressivt tap av både subjekter og transplantater. Fem års overlevelse for kadaver og levende-relaterte donor nyretransplantater er 66% og 79%, henholdsvis.(United Network for Organ Sharing Renal Transplant Registry 2003 ved www.unos.org)

De mest vanlige årsakene til langsiktig subjekt og transplantat-tap er kardiovaskulær sykdom og kronisk allograft nefropati (CAN), henholdsvis.(L.C. Paul, Chronic allograft nephropathy – A model of impaired repair rom injury? Nephrol Dial Transplant 2000;15:149-151) Paradoksalt nok bidrar de viktigste behandlingene for nyretransplantasjon, calcineurinhemmerne (CNIs), CsA og takrolimus, direkte til langsiktig tap av allograft og subjekt død, ettersom de er iboende nefrotoksiske og også forårsaker eller forverrer kardiovaskulær risiko, omfattende hypertensjon, hyperkolesterolemi og diabetes mellitus. Ikke desto mindre danner disse midlene hjørnesteinen i alle konvensjonelle immunsuppressive regimer for nyretransplantasjon.

For øyeblikket er det ingen godkjente midler som kan erstatte CNI’er som hjørnesten for opprettholdelse av immunosuppressiv behandling hos et bredt spekter av subjekter. Ett middel, sirolimus(rapamycin, Rapamune<®>fra Wyeth/Ayerst), er godkjent for anvendelse i et CNI-sparsomt regime. CNI’er må imidlertid fortsatt anvendes med sirolimus i minst 3 måneder etter transplantasjon. Viktigere er det at sirolimus er godkjent som et CNI-sparsomt middel i denne settingen kun for subjekter med lav til moderat risiko for graft-tap. Følgelig er det, for de med høyere risiko for graft-tap, for hvilke unngåelse av de nefrotoksiske effektene av CNI’er ville ha størst fordeler, ingen godkjente alternativer til CNIs. Det er derfor et udekket medisinsk behov for immunosuppressive midler som kan gi akseptabel kontroll av alloimmunresponsen komparabel med standard av praktiserte terapier uten toksisiteter som bidrar til langvarig subjekt død og tap av graft. Ideelt ville midlet være anvendelig ikke bare for lavrisiko subjekter, men også for subjekter med høyere risiko for tap av transplantat.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon ved administrering avCTLA4 mutantmolekyler som binder med større aviditet til CD80 og/eller CD86-antigenet enn villtype-CTLA4 eller ikke-mutert CTLA4Ig. CTLA4-molekylene har en første aminosyresekvens omfattende det ekstracellulære domenet av CTLA4, hvor visse aminosyrerester innen S25-R33-regionen og M97-G107-regionen er mutert. De muterte molekylene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en andre aminosyresekvens som øker oppløseligheten av mutantmolekylet.

Ett eksempel på et CTLA4 mutantmolekyl er L104EA29YIg (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4), som beskrevet her. Et annet eksempel på et CTLA4 mutantmolekyl er L104EIg (Figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6), som beskrevet her. L104EA29YIg og L104EIg binder CD80 og CD86 med større aviditet enn CTLA4Ig.

Administrering av CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen kan utføres over ulike tider. Typisk omfatter regimer for administrering en tidlig fase, hvor doser er høyere og administreringshyppigheten er økt under perioden med høyest immunologisk risiko, fulgt av en vedlikeholdsfase. Den tidlige fasen kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon.

Administreringsregimet under tidlig fase kan variere avhengig av status for mottageren/graftet.

I én utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon ved å administrere til et subjekt en effektiv dose av et CTLA4 mutantmolekyl med et ekstracellulært domene av CTLA4 som vist i SEKV ID NR:8 som starter med alanin i posisjon 26 eller metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150, eller en del derav. I tillegg er, i det ekstracellulære domenet eller del derav en alanin i posisjon 55 substituert med et tyrosin og et leucin i posisjon 130 er substituert med en glutaminsyre. Videre omfatter regimet for administrering et tidlig fase-regime, hvor tidlig fase-regimet kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon og omfatter administrering som initielt er hyppigere enn månedlig.

I en annen utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon ved å administrere til et subjekt en effektiv dose av et CTLA4 mutantmolekyl med en aminosyresekvens som starter med metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 av SEKV ID NR:4 eller med en aminosyresekvens som starter med alanin i posisjon 26 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 av SEKV ID NR:4. Videre omfatter regimet for administrering av CTLA4 mutantmolekyl et tidlig fase-regime, hvor tidlig faseregimet kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon og omfatter administrering som initielt er hyppigere enn månedlig.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 viser likevekt bindingsanalyse av L104EA29YIg, L104EIg og villtype CTLA4Ig til CD86Ig.

Figurene 2A & 2B illustrerer data fra FACS-analyser som viser binding av L104EA29YIg, L104EIg og CTLA4Ig til human CD80- eller CD86-transfekterte CHO-celler som beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Figurene 3A & 3B viser hemning av proliferasjon av CD80-positive og CD86-positive CHO-celler som beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Figurene 4A & 4B viser at L104EA29YIg er mer effektiv enn CTLA4Ig med hensyn til å hemme proliferasjon av primære og sekundære allo stimulerte T-celler som beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Figurene 5A-C illustrerer at L104EA29YIg er mer effektive enn CTLA4Ig med hensyn til å hemme IL-2 (FIG.5A), IL-4 (FIG.5B) og γ-interferon (FIG.5C) cytokinproduksjon av allo stimulerte humane T-celler som beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Figur 6 viser at L104EA29YIg er mer effektiv enn CTLA4Ig med hensyn til å hemme proliferasjon av fytohemaglutinin-(PHA)-stimulerte ape T-celler som beskrevet i Eksempel 2, nedenfor.

Figur 7 (SEKV ID NR: 3 og 4) viser et nukleotid og aminosyresekvens av et CTLA4 mutantmolekyl (“L104EA29YIg”) omfattende et signalpeptid; et mutert ekstracellulært domene av CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 1 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 124 eller som starter ved alanin i posisjon –1 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 124; og en Ig-region som beskrevet i Eksempel 1, nedenfor. SEKV ID NR: 3 og 4 viser en nukleotid og aminosyresekvens, henholdsvis, av et CTLA4 mutantmolekyl (“L104EA29YIg”) omfattende et signalpeptid; et mutert ekstracellulær domene av CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 27 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150 eller som starter ved alanin i posisjon 26 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150; og en Ig region.

Figur 8 (SEKV ID NR: 5 og 6) viser et nukleotid og aminosyresekvens av et CTLA4 mutantmolekyl (“L104EIg”) omfattende et signalpeptid; et mutert ekstracellulært domene av CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 1 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 124 eller som starter ved alanin i posisjon –1 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 124; og en Ig-region som beskrevet i Eksempel 1, nedenfor. SEKV ID NR: 5 og 6 viser en nukleotid og aminosyresekvens, henholdsvis, av et CTLA4 mutantmolekyl (“L104EIg”) omfattende et signalpeptid; et mutert ekstracellulært domene av CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 27 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150 eller som starter ved alanin i posisjon 26 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150; og en Ig region.

Figur 9 (SEKV ID NR: 7 og 8) viser en nukleotid og aminosyresekvens av et CTLA4Ig som har et signalpeptid; en villtype aminosyresekvens av det ekstracellulære domenet av CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 1 til asparaginsyre i posisjon 124 eller som starter ved alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon 124; og en Ig-region. SEKV ID NR: 7 og 8 viser en nukleotid og aminosyresekvens, henholdsvis, av en CTLA4Ig omfattende et signalpeptid; en villtype aminosyresekvens av det ekstracellulære domenet CTLA4 som starter ved metionin i posisjon 27 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150 eller som starter ved alanin i posisjon 26 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 150; og en Ig-region.

Figurene 10A-C er en SDS-gel (FIG.10A) for CTLA4Ig (brønn 1), L104EIg (brønn 2) og L104EA29YIg (brønn 3A); og størrelseseksklusjonskromatografi av CTLA4Ig (FIG.10B) og L104EA29YIg (FIG.10C).

Figurene 11A og 11B illustrerer et bånd-diagram av den CTLA4 ekstracellulære Ig V-lignende folden dannet fra løsningsstrukturen bestemt ved NMR-spektroskopi. FIG. 11B viser et utfoldet bilde av S25-R33-regionen og MYPPPY-regionen som indikerer lokaliseringen og sidekjede-orienteringen av de aviditets-fremmende mutasjonene, L104 og A29.

Figur 12 viser et skjematisk diagram av en vektor, piLN-L104EA29Y, som har L104EA29YIg-insersjonen.

Figur 13 viser nukleotid og aminosyresekvens av CTLA4-reseptor (SEKV ID NR: 9 og 10).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

DEFINISJONER

Alle vitenskapelige og tekniske betegnelser anvendt i foreliggende søknad har betydninger vanlig anvendt på området hvis ikke angitt på annen måte. Som anvendt i foreliggende søknad har de følgende ordene eller uttrykkene de angitte betydningene.

Som anvendt her refererer “ligand” til et molekyl som spesifikt gjenkjenner og binder et annet molekyl, for eksempel er en ligand for CTLA4 et B7-molekyl.

Som anvendt her har “villtype CTLA4” eller “ikke-mutert CTLA4” aminosyresekvensen av naturlig forekommende, fullengde CTLA4 som vist i Figur 13 (SEKV ID NR: 9 og 10; også som beskrevet i U.S. Patenter nr.5,434,131, 5,844,095, 5,851,795) eller hvilken som helst del eller derivat derav, som gjenkjenner og binder en B7 eller interfererer med en B7 slik at den blokkerer binding til CD28 og/eller CTLA4 (f.eks. endogen CD28 og/eller CTLA4). I spesielle utførelsesformer starter det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4 med metionin i posisjon 1 og ender ved asparaginsyre i posisjon 124 eller det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4 starter med alanin i posisjon -1 og ender ved asparaginsyre i posisjon 124. Villtype CTLA4 er et celleoverflateprotein, som har et N-terminalt ekstracellulært domene, et transmembran domene og et C-terminalt cytoplasmatisk domene. Det ekstracellulære domenet binder til mål-molekyler, slik som et B7-molekyl. I en celle blir det naturlig forekommende, villtype CTLA4-proteinet translatert som et umodent polypeptid, som omfatter et signalpeptid ved den N-terminale enden. Det umodne polypeptidet gjennomgår post-translasjonell prosessering, som omfatter kløyving og fjerning av signalpeptidet for å danne et CTLA4 kløyvingsprodukt som har en nydannet N-terminal ende som skiller seg fra den N-terminale enden i den umodne formen. Fagfolk på området vil forstå at ytterligere post-translasjonell prosessering kan forekomme, hvilken fjerner én eller flere av aminosyrene fra den nydannede N-terminale enden av CTLA4 kløyvingsproduktet. Alternativt kan signalpeptidet ikke fjernes fullstendig, hvilket danner molekyler som starter før den vanlige start-aminosyren metionin. Følgelig kan det modne CTLA4-proteinet starte ved metionin i posisjon 1 eller alanin i posisjon –1. Den modne formen av CTLA4-molekylet omfatter det ekstracellulære domenet eller hvilken som helst del derav, som binder til B7.

“CTLA4Ig” er et oppløselig fusjonsprotein omfattende et ekstracellulært domene av villtype CTLA4 bundet til en Ig hale eller en del derav som binder et B7. En spesiell utførelsesform omfatter det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4 (som vist i Figur 9, SEKV ID NR: 7 og 8) som starter ved metionin i posisjon 1 og slutter ved asparaginsyre i posisjon 124; eller som starter ved alanin i posisjon -1 til asparaginsyre i posisjon 124; en sammenføynings (”junction”) aminosyrerest glutamin i posisjon 125; og en immunglobulin-del omfattende glutaminsyre i posisjon 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356 (DNA som koder for CTLA4Ig ble deponert den 31. mai, 1991 ved American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 under bestemmelsene ifølge Budapestkonvensjonen og er tildelt ATCC aksesjonsnummer ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80. CTLA4Ig-24, en kinesisk hamster ovarie (CHO)-cellelinje som uttrykker CTLA4Ig ble deponert den 31. mai, 1991 med ATCC identifikasjonsnummer CRL-10762). De oppløselige CTLA4Ig-molekylene kan, eller kan ikke, omfatte en signal (leder)-peptidsekvens.

Som anvendt her er et “fusjonsprotein” definert som én eller flere aminosyresekvenser bundet sammen ved anvendelse av metoder velkjent på området og som beskrevet i U.S. Pat. nr.5,434,131 eller 5,637,481. De bundne aminosyresekvensene danner derved ett fusjonsprotein.

Som anvendt her angir “oppløselig” hvilket som helst molekyl eller fragmenter og derivater derav, ikke bundet eller tilknyttet til en celle, dvs. sirkulerende. For eksempel kan CTLA4, B7 eller CD28 gjøres oppløselige ved å feste en immunglobulin (Ig)-gruppe til det ekstracellulære domenet av CTLA4, B7 eller CD28, henholdsvis. Alternativt kan et molekyl slik som CTLA4 gjøres oppløselig ved å fjerne dets transmembrandomene.

Som anvendt her er “det ekstracellulære domenet av CTLA4” den delen av CTLA4 som gjenkjenner og binder CTLA4-ligander, slik som B7-molekyler. For eksempel omfatter et ekstracellulært domene av CTLA4 metionin i posisjon 1 til asparaginsyre i posisjon 124 (Figur 13, SEKV ID NR: 9 og 10). Alternativt omfatter et ekstracellulært domene av CTLA4 alanin i posisjon –1 til asparaginsyre i posisjon 124 (Figur 13, SEKV ID NR: 9 og 10). Det ekstracellulære domenet omfatter fragmenter eller derivater av CTLA4 som binder et B7-molekyl. Det ekstracellulære domenet av CTLA4 som vist i Figur 13 (SEKV ID NR: 9 og 10) kan også omfatte mutasjoner som endrer bindingsaviditeten av CTLA4-molekylet for et B7-molekyl.

Som anvendt her betyr et “CTLA4 mutantmolekyl” villtype CTLA4 som vist i (SEKV ID NR: 9 og 10) eller hvilken som helst del eller derivat derav, som har en mutasjon eller multiple mutasjoner (fortrinnsvis i det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4). Et CTLA4 mutantmolekyl har en sekvens som er lik men ikke identisk med sekvensen av villtype CTLA4-molekyl, men binder fortsatt en B7. Mutasjonene kan omfatte én eller flere aminosyrerester erstattet med en aminosyre som har konservativ (f.eks. erstatte en leucin med en isoleucin) eller ikke-konservativ (f.eks. erstatte et glysin med en tryptofan) struktur eller kjemiske egenskaper, aminosyredelesjoner, addisjoner, frameshift eller trunkeringer. CTLA4 mutantmolekyler kan omfatte et ikke-CTLA4 molekyl deri eller tilknyttet dertil.

Mutantmolekylene kan være oppløselige (dvs. sirkulerende) eller bundet til en celleoverflate. Ytterligere CTLA4 mutantmolekyler omfatter de beskrevet i U.S. Patentsøknad Serial Nummer 09/865,321, 60/214,065 og 60/287,576; i U.S.

Patenter nummer 090,9145,844,095 og 5,773,253; og som beskrevet av Peach, R. J., et al., i J Exp Med 180:2049-2058 (1994)). CTLA4 mutantmolekyler kan fremstilles syntetisk eller rekombinant.

“L104EA29YIg” er et fusjonsprotein som er et oppløselig CTLA4-mutantmolekyl omfattende et ekstracellulært domene av villtype CTLA4 med aminosyreendringene A29Y (en tyrosin aminosyrerest erstatter en alanin i posisjon 29) og L104E (en glutaminsyre aminosyrerest erstatter et leucin i posisjon 104) eller en del derav som binder et B7-molekyl, bundet til en Ig-hale (omfattet i Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; DNA som koder for L104EA29YIg ble deponert den 20. juni, 2000 med ATCC nummer PTA-2104; samtidige U.S. Patentsøknader Serial Nummer 09/579,927, 60/287,576 og 60/214,065). De oppløselige L104EA29YIgmolekylene anvendt ved metodene ifølge oppfinnelsen kan eller kan ikke omfatte en signal (leder) peptidsekvens. Typisk, ved metodene ifølge oppfinnelsen, omfatter molekylene ikke en signalpeptidsekvens.

Som anvendt her betyr betegnelsen “mutasjon” en forandring i nukleotid eller aminosyresekvensen av et villtype-molekyl, for eksempel en endring i DNA og/eller aminosyresekvensene av villtype CTLA4 ekstracellulært domene. En mutasjon i DNA kan endre et kodon hvilket fører til en endring i aminosyresekvensen. En DNA-endring kan omfatte substitusjoner, delesjoner, insersjoner, alternativ spleising eller trunkeringer. En aminosyreendring kan omfatte substitusjoner, delesjoner, insersjoner, addisjoner, trunkeringer eller prosessering eller kløyvingsfeil av proteinet. Alternativt kan mutasjoner i en nukleotidsekvens føre til en stille mutasjon i aminosyresekvensen som er velforstått på området. I dette henseende koder visse nukleotid-kodoner for samme aminosyre. Eksempler omfatter nukleotid-kodonene CGU, CGG, CGC og CGA som koder for aminosyren, arginin (R); eller kodonene GAU og GAC som koder for aminosyren, asparaginsyre (D). Følgelig kan et protein være kodet for av ett eller flere nukleinsyremolekyler som avviker i deres spesifikke nukleotidsekvens, men fortsatt koder for proteinmolekyler som har identiske sekvenser. De aminosyrekodende sekvensene er som følger:

Mutantmolekylet kan ha én eller flere mutasjoner.

Som anvendt her betyr en “ikke-CTLA4 proteinsekvens” eller “ikke-CTLA4 molekyl” hvilket som helst proteinmolekyl som ikke binder B7 og ikke interfererer med bindingen av CTLA4 til dets mål. Et eksempel omfatter, men er ikke begrenset til, en immunglobulin (Ig) konstant region eller del derav. Fortrinnsvis er den Ig konstante regionen en human eller ape Ig konstant region, f.eks. human C(gamma)1, omfattende hengsel, CH2 og CH3-regionene. Den Ig konstante regionen kan muteres for å redusere dens effektorfunksjoner (U.S. Patenter 5,637,481, 5,844,095 og 5,434,131).

Som anvendt her er et “fragment” eller “del” hvilken som helst del eller segment av et CTLA4-molekyl, fortrinnsvis det ekstracellulære domenet av CTLA4 eller en del eller segment derav, som gjenkjenner og binder dets mål, f.eks. et B7-molekyl. Det ekstracellulære domenet av CTLA4 kan omfatte mutasjoner som forandrer bindings aviditeten av CTLA4-molekyl for et B7-molekyl.

Som anvendt her refererer “B7” til B7-familien av molekyler omfattende, men ikke begrenset til, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) og B7-3 som kan gjenkjenne og binde CTLA4 og/eller CD28.

Som anvendt her er “B7-positive celler” hvilke som helst celler med én eller flere typer av B7-molekyler uttrykt på celleoverflaten.

Som anvendt her er et “derivat” et molekyl som deler sekvenshomologi og aktivitet med dets parentale molekyl. For eksempel omfatter et derivat av CTLA4 et oppløselig CTLA4-molekyl som har en aminosyresekvens minst 70% lik det ekstracellulære domenet av villtype CTLA4 og som gjenkjenner og binder B7 f.eks. CTLA4Ig eller oppløselig CTLA4 mutantmolekyl L104EA29YIg.

Som anvendt her er å “regulere” en immunrespons å aktivere, stimulere, oppregulere, hemme, blokkere, nedregulere eller modifisere immunresponsen. De autoimmune sykdommene beskrevet her, kan behandles ved å regulere en immunrespons f.eks. ved å regulere funksjonelle CTLA4- og/eller CD28- positive celleinteraksjoner med B7-positive celler. For eksempel omfatter en fremgangsmåte for å regulere en immunrespons å bringe de B7-positive cellene i kontakt med et oppløselig CTLA4-molekyl ifølge oppfinnelsen for slik å danne oppløselige CTLA4/B7-komplekser, hvor det oppløselige CTLA4-molekylet påvirker omsetning av et endogent CTLA4 og/eller CD28-molekyl med nevnte B7-molekyl.

Som anvendt her betyr å “blokkere” eller “hemme” en reseptor, signal eller molekyl å forstyrre aktivering av reseptoren, signalet eller molekylet, som detektert ved en test kjent på området. Blokkering eller hemning kan være partiell eller total. For eksempel kan blokkering av en cellemediert immunrespons detekteres ved å bestemme funksjonaliteten av transplantatet, slik som konsentrasjonene av serumkreatinin etter nyretransplantasjon.

Som anvendt her betyr “blokkering av B7-interaksjon” å forstyrre bindingen av B7 til dens ligander, slik som CD28 og/eller CTLA4, hvilket derved hindrer T-celle og B7-positiv celle-interaksjoner. Eksempler på midler som blokkerer B7-interaksjoner omfatter, men er ikke begrenset til, molekyler slik som et antistoff (eller del eller derivat derav) som gjenkjenner og binder til hvilke som helst av CTLA4, CD28 eller B7-molekyler (f.eks. B7-1, B7-2); en oppløselig form (eller del eller derivat derav) av molekylene slik som oppløselig CTLA4; et peptidfragment eller annet småmolekyl utformet til å forstyrre cellesignalet gjennom den CTLA4/CD28/B7-medierte interaksjonen. I en foretrukket utførelsesform er det blokkerende midlet et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl, slik som L104EA29YIg (ATCC PTA-2104).

Som anvendt her betyr “behandle” eller “behandling av” en lidelse eller sykdom å ta hånd om en sykdom eller lidelse ved medisinske eller andre behandlinger. Behandling av en sykdom eller lidelse kan undertrykke immunmedierte hendelser forbundet med en sykdom, forbedre symptomene på en sykdom eller lidelse, redusere alvorlighetsgraden av en sykdom eller lidelse, endre forløpet av sykdom eller lidelse progresjon og/eller forbedre eller kurere den grunnleggende sykdom eller lidelse problemet. Behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon kan for eksempel oppnås ved å regulere en immunrespons f.eks. ved å regulere funksjonelle CTLA4- og/eller CD28-positiv celle interaksjoner med B7-positive celler. Alternativt kan behandling av en immunsykdom eller forstyrrelse oppnås ved å forebygge eller hemme sykdommen eller lidelsen fra å oppstå eller utvikle seg gjennom anvendelse av blandingene beskrevet her. For eksempel omfatter behandling av nyretransplantat avstøtning hemming av nyretransplantat avstøtning som målt ved glomerulær filtrasjonshastighet (GFR). For eksempel omfatter behandling av immunforstyrrelser forbundet med organtransplantasjon forebygging av organavstøtning ved administrering av L104EA29YIg. Videre kan behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon forlenge overlevelsen av verten og det transplanterte organet.

Som anvendt her omfatter “immunsystem sykdom” hvilken som helst sykdom mediert av T-celle interaksjoner med B7-positive celler omfattende, men ikke begrenset til, autoimmune sykdommer, immunproliferative sykdommer og immunlidelser forbundet med graft transplantasjon.

Som anvendt her betyr “ immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon” hvilken som helst transplantasjons-relatert sykdom mediert av T-celle interaksjoner med B7-positive celler omfattende, men ikke begrenset til, immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon avstøtning, graft relaterte lidelser, transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD) (f.eks. slik som kan følge av benmargtransplantasjon, eller ved induksjon av toleranse), avstøtning av graftet eller transplantatet omfattende akutt avstøtning av graftet eller transplantatet og kronisk avstøtning av graftet eller transplantatet. Graftet kan være fast organ allografter eller xenografter, vev eller celle allografter eller xenografter eller ytre anatomi allografter eller xenografter, omfattende men ikke begrenset til hud, øyceller (også kjent som øyer), muskler, hepatocytter, neuroner, hjerte, lever, nyre, lunge, vedheng, lemmer, nese, øre eller ansikt.

Som anvendt her omfatter immunoproliferative sykdommer, men er ikke begrenset til, T-celle lymfom; T-celle akutt lymfoblastisk leukemi; testikulært angiocentrisk T-cellelymfom; og godartet lymfocyttisk angiitt.

Som anvendt her omfatter autoimmune sykdommer, men er ikke begrenset til sykdommer slik som lupus (f.eks. lupus erythematosus, lupus nefritt), psoriasis; Hashimotos thyreoiditt, primær myxødem, Graves sykdom, pernisiøs anemi, autoimmun atrofisk gastritt, Addisons sykdom, diabetes (f.eks. insulinavhengig diabetes mellitus, type I diabetes mellitus, type II diabetes mellitus), goodpastures syndrom, myasthenia gravis, pemfigus, Crohns sykdom, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), sympatisk oftalmia, autoimmun uveitt, multippel sklerose, autoimmun hemolytisk anemi, idiopatisk trombocytopeni, primær biliær cirrhose, kronisk aktiv hepatitt, colitis ulcerosa, Sjøgrens syndrom, revmatiske sykdommer (f.eks. revmatoid artritt, psoriatisk artritt), polymyositt, sklerodermi og blandet bindevevssykdom.

For en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen beskrevet heri angis følgende beskrivelse.

BLANDINGER OG FREMGANGSMÅTER IFØLGE OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny klasse immunosuppressiv terapi for transplantasjon. Det er et fusjonsprotein som binder til B7-molekylene på overflaten av antigenpresenterende celler (APC’er) og hemmer ønsket kostimulering for T-celleaktivering. De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen skiller seg fra eksisterende immunosuppresserende midler i den begrensede distribusjonen av dens molekylære mål og spesifisiteten av dens effekt. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oppløselige CTLA4 mutantmolekyler som gjenkjenner og binder CD80 og/eller CD86. I noen utførelsesformer har de oppløselige CTLA4 mutantene en høyere aviditet til CD80 og/eller CD86 enn CTLA4Ig. For eksempel binder L104EA29YIg med omtrent 2 ganger mer aviditet enn villtype CTLA4Ig (nedenfor referert til som CTLA4Ig) til CD80 og med omtrent 4 ganger mer aviditet til CD86. Denne sterkere bindingen resulterer i at L104EA29YIg er mer effektiv enn CTLA4Ig med hensyn til blokkering av immunresponser.

En utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter for behandling av immunsystemsykdommer. Fremgangsmåtene omfatter å administrere en terapeutisk blanding, omfattende oppløselige CTLA4 mutantmolekyler beskrevet her, til et subjekt i en mengde effektiv til å lindre minst ett av symptomene forbundet med immunsystem-sykdommer. I tillegg kan de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her gi langvarig behandling for immunsystem-sykdommer ved å blokkere T-celle/B7-positiv celle-interaksjonene, hvilket derved blokkerer T-celleaktivering/stimulering ved kostimulerende signaler slik som B7-binding til CD28, som fører til induksjon av T-celle-anergi eller toleranse. Immunsystemsykdommer omfatter, men er ikke begrenset til, autoimmune sykdommer, immunoproliferative sykdommer og immunlidelser forbundet med graft transplantasjon beskrevet ovenfor.

En annen utførelsesform tilveiebringer fremgangsmåter for å indusere toleranse i et subjekt som har immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon ved å administrere en terapeutisk blanding omfattende oppløselige CTLA4 mutantmolekyler beskrevet her.

De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her fremviser hemmende egenskaper in vivo. Under betingelser hvor T-celle/B7-positiv celleinteraksjoner, for eksempel T-celle/B celle-interaksjoner, oppstår som et resultat av kontakt mellom T-celler og B7-positive celler, kan binding av innførte CTLA4 mutantmolekyler for å reagere med B7-positive celler, for eksempel B-celler, interferere, dvs. hemme, T-celle/ B7-positiv celle-interaksjonene hvilket fører til regulering av immunresponser.

En annen utførelsesform tilveiebringer fremgangsmåter for å regulere immunresponser. Immunresponser nedregulert (redusert) ved de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her kan være ved hemming eller blokkering av en immunrespons allerede under utvikling eller kan omfatte å forhindre induksjon av en immunrespons. De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her kan hemme funksjonene av aktiverte T-celler, slik som T lymfocyttproliferasjon, cytokinsekresjon og/eller cytokinproduksjon, ved å undertrykke T-celle-responser eller ved å indusere spesifikk toleranse i T-celler eller begge. Videre kan de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her, ved å påvirke CTLA4/CD28/B7 reaksjonsveien hemme T-celleproliferasjon og/eller cytokinsekresjon hvilket følgelig fører til redusert vevsdestruksjon og induksjon av T-celle resistens (”unresponsiveness”) eller anergi.

CTLA4 mutantmolekyler omfatter i det minste det ekstracellulære domenet av CTLA4 eller deler derav som binder CD80 og/eller CD86. Den ekstracellulære delen av et CTLA4 mutantmolekyl omfatter en aminosyresekvens som starter med metionin i posisjon 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124 (figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6). Alternativt kan den ekstracellulære delen av CTLA4 omfatte en aminosyresekvens som starter med alanin i posisjon – 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124 (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

I én utførelsesform er det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet et fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære domenet av CTLA4 som har én eller flere mutasjoner i en region av en aminosyresekvens som starter med serin ved 25 og slutter med arginin ved 33 (S25-R33). For eksempel kan alanin i posisjon 29 av villtype CTLA4 være substituert med tyrosin (kodonene: UAU, UAC).

Alternativt kan alanin være substituert med leucin (kodonene: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), fenylalanin (kodonene: UUU, UUC), tryptofan (kodon: UGG) eller treonin (kodonene: ACU, ACC, ACA, ACG). Som fagfolk på området lett vil forstå, svarer uracil (U)-nukleotidet av RNA-sekvensen til thymin (T)-nukleotidet av DNA-sekvensen.

I en annen utførelsesform er det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet et fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære domenet av CTLA4 som har én eller flere mutasjoner i eller nær en region av en aminosyresekvens som starter med metionin ved 97 og slutter med glysin ved 107 (M97-G107). For eksempel kan leucin i posisjon 104 av villtype CTLA4 kan være substituert med glutaminsyre (kodonene: GAA, GAG). Et CTLA4 mutantmolekyl som har denne substitusjonen er referert til her som L104EIg (Figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

I enda en annen utførelsesform er det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet et fusjonsprotein omfattende det ekstracellulære domenet av CTLA4 som har én eller flere mutasjoner i S25-R33 og M97-G107-regionene. For eksempel omfatter et CTLA4 mutantmolekyl i én utførelsesform, tyrosin i posisjon 29 istedenfor alanin; og glutaminsyre i posisjon 104 istedenfor leucin. Et CTLA4 mutantmolekyl som har disse substitusjonene er referert til her som L104EA29YIg (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4). Nukleinsyremolekylet som koder for L104EA29YIg er inneholdt i pD16 L104EA29YIg og ble deponert den 19. juni, 2000 ved American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manasas, VA 20110-2209 (ATCC nr. PTA-2104). pD16 L104EA29YIg-vektoren er et derivat av pcDNA3-vektoren (INVITROGEN).

Oppfinnelsen tilveiebringer videre et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl omfattende et ekstracellulært domene av en CTLA4-mutant som vist i Figur 7(SEKV ID NR: 3 og 4) eller figur 8 (SEKV ID NR: 5 og 6) eller del(er) derav og en gruppe som endrer oppløseligheten, affinitetet og/eller valens av CTLA4 mutantmolekylet.

I henhold til en utøvelse av oppfinnelsen kan gruppen være en immunglobulin konstant region eller del derav, f.eks. én eller flere av et CH1 domene, hengsel, CH2-domene eller CH3-domene. For in vivo anvendelse er det foretrukket at immunglobulin konstant regionen ikke fremkaller en skadelig immunrespons i subjektet. For eksempel kan det, i kliniske protokoller, være foretrukket at mutantmolekyler omfatter humane eller ape immunglobulin konstante regioner eller deler derav. Eksempler på egnede immunglobulindomener omfatter, men er ikke begrenset til, IgCγ1 (IgCgamma1), IgCγ2 (IgCgamma2), IgCγ3 (IgCgamma3), IgCγ4 (IgCgamma4), IgCμ (IgCmu), IgCα1 (IgCalfa1), IgCα2 (IgCalfa2), IgCδ (IgCdelta) eller IgCε (IgCepsilon). Andre isotyper er mulig. Videre er andre immunglobulin konstante regioner eller del derav mulige (fortrinnsvis andre svakt eller ikke-immunogene immunglobulin konstante regioner eller del derav ).

For kliniske protokoller er det foretrukket at immunglobulin-gruppen ikke fremkaller en skadelig immunrespons i et subjekt. Den foretrukne gruppen er immunglobulin konstant region eller del derav, omfattende de humane eller ape immunglobulin konstante regionene eller del derav. Ett eksempel på en egnet immunglobulin-region er human C γ1, omfattende hengsel, CH2 og CH3-regionene som kan mediere effektorfunksjoner slik som binding til Fc-reseptorer, hvilket medierer komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) eller medierer antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC). Immunglobulingruppen kan ha én eller flere mutasjoner deri, (f.eks. i CH2-domenet, for å redusere effektorfunksjoner slik som CDC eller ADCC) hvor mutasjonen modulerer bindingsevnen av immunglobulinet til dets ligand, ved å øke eller redusere bindingsevnen av immunglobulinet til Fc-reseptorer. For eksempel kan mutasjoner i immunglobulingruppen omfatte endringer i hvilke som helst eller alle dens cysteinrester innenfor hengselsdomenet, for eksempel er cysteinene i posisjonene 130, 136 og 139 substituert med serin (Figur 9, SEKV ID NR: 8).

Immunglobulingruppen kan også omfatte prolin i posisjon 148 substituert med et serin, som vist i Figur 9 (SEKV ID NR: 8). Videre kan mutasjonene i immunglobulingruppen omfatte som har leucin i posisjon 144 substituert med fenylalanin, leucin i posisjon 145 substituert med glutaminsyre eller glysin i posisjon 147 substituert med alanin. Eksempler på immunglobulingrupper omfatter de beskrevet og angitt i U.S. Patentpublikasjoner nr.2002/0114814 A1 og 2004/0151725 A1, U.S. Patenter Nr.6,444,792 og 6,750,334 og WO 97/28267.

Andre grupper omfatter polypeptid-tags. Eksempler på egnede tags omfatter men er ikke begrenset til p97-molekylet, env gp120-molekylet, E7-molekylet og ova-molekylet (Dash, B., et al. (1994) J. Gen. Virol. 75:1389-97; Ikeda, T., et al. (1994) Gene 138:193-6; Falk, K., et al. (1993) Cell. Immunol.

150:447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204:789-93). Andre molekyler for anvendelse som tags er mulig (Gerard, C. et al. (1994) Neuroscience 62:721-739; Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. et al., (1987) Science 238:1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233:209-212).

Oppfinnelsen tilveiebringer videre oppløselige mutante CTLA4Ig fusjonsproteiner fortrinnsvis mer reaktive med CD80 og/eller CD86-antigenet sammenlignet med villtype CTLA4. Ett eksempel er L104EA29YIg som vist i Figur 7 (SEKV ID NR: 3 og 4).

I en annen utførelsesform omfatter det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet en sammenføynings (”junction”) aminosyrerest, som er lokalisert mellom CTLA4-delen og immunglobulin-delen. Sammenføynings-aminosyren kan være hvilken som helst aminosyre, omfattende glutamin. Sammenføynings-aminosyren kan innføres ved molekylære eller kjemiske syntesemetoder kjent på området.

I en annen utførelsesform omfatter det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet immunglobulin-delen (f.eks. hengsel, CH2 og CH3-domenene), hvor hvilken som helst eller alle cysteinrestene, innenfor hengsel-domenet av immunglobulin-delen er substituert med serin, for eksempel cysteinene i posisjonene 130, 136 eller 139 (figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

Mutantmolekylet kan også omfatte prolin i posisjon 148 substituert med et serin, som vist i Figur 7 (SEKV ID NR: 3 og 4) eller figur 8 (SEKV ID NR: 5 og 6).

Det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet kan omfatte en signalpeptidsekvens bundet til den N-terminale enden av det ekstracellulære domenet av CTLA4-delen av mutantmolekylet. Signalpeptidet kan være hvilken som helst sekvens som vil tillate sekresjon av mutantmolekylet, inkludert signalpeptidet fra oncostatin M (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol.9: 28472853) eller CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323:346-349) eller signalpeptidet fra hvilket som helst ekstracellulært protein.

Mutantmolekylet kan omfatte oncostatin M signalpeptidet bundet ved den N-terminale enden av det ekstracellulære domenet av CTLA4 og det humane immunglobulinmolekylet (f.eks. hengsel, CH2 og CH3) bundet til den C-terminale enden av det ekstracellulære domenet av CTLA4. Dette molekylet omfatter oncostatin M signalpeptidet omfattende en aminosyresekvens som har metionin i posisjon –26 til og med alanin i posisjon –1, CTLA4-delen omfattende en aminosyresekvens som har metionin i posisjon 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124, en forbindelses (”junction”) aminosyrerest glutamin i posisjon 125 og immunglobulin-delen omfattende en aminosyresekvens som har glutaminsyre i posisjon 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356.

De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved molekylære eller kjemiske syntesemetoder. De molekylære metodene kan omfatte følgende trinn: innføre i en egnet vertscelle et nukleinsyremolekyl som uttrykker og koder for det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet; dyrke vertscellen innført på denne måten under betingelser som tillater vertscellen å uttrykke de mutante molekylene; og isolere de uttrykte mutantmolekylene. Signalpeptid-delen av mutantmolekylet tillater proteinmolekylene å bli uttrykt på celleoverflaten og å bli utskilt av vertscellen. De translaterte mutantmolekylene kan gjennomgå posttranslasjonell modifikasjon, som omfatter kløyving av signalpeptidet for å produsere et modent protein som har CTLA4 og immunglobulin-delene.

Kløyvingen kan forekomme etter alanin i posisjon –1, hvilket resulterer i et modent mutantmolekyl som har metionin i posisjon 1 som den første aminosyren (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6). Alternativt kan kløyvingen forekomme etter metionin i posisjon –2, hvilket resulterer i et modent mutantmolekyl som har alanin i posisjon –1 som den første aminosyren.

Fagfolk på området ville være klar over at ekspresjon av L104EA29YIg i pattedyrceller kan føre til fremstilling av N- og C- terminale varianter, slik at proteinene fremstilt kan ha aminosyresekvensen med restene: (i) 1 til 357, (ii) -1 til 357; (iii) 1 til 356 eller (iv) -1 til 356 (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

En foretrukket utførelsesform er et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl som har det ekstracellulære domenet av human CTLA4 bundet til hele eller en del av et humant immunglobulinmolekyl (f.eks. hengsel, CH2 og CH3). Dette foretrukne molekylet omfatter CTLA4-delen av det oppløselige molekylet omfattende en aminosyresekvens som har metionin i posisjon 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124, en sammenføynings (”junction”) aminosyrerest glutamin i posisjon 125 og immunglobulindelen omfattende glutaminsyre i posisjon 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356. Delene som har det ekstracellulære domenet av CTLA4 er mutert slik at alanin i posisjon 29 er substituert med tyrosin og leucin i posisjon 104 er substituert med glutaminsyre. Immunglobulin-delen av mutantmolekylet kan muteres, slik at cysteinene i posisjonene 130, 136 og 139 blir substituert med serin og prolin i posisjon 148 blir substituert med serin. Dette mutantmolekylet blir betegnet her som L104EA29YIg (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4).

En annen utførelsesform av L104EA29YIg er et mutantmolekyl som har en aminosyresekvens som har alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon 124, en sammenføynings aminosyrerest glutamin i posisjon 125 og immunglobulindelen omfattende glutaminsyre i posisjon 126 (f.eks. 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356). Andelen som har det ekstracellulære domenet av CTLA4 er mutert slik at alanin i posisjon 29 blir erstattet med tyrosin; og leucin i posisjon 104 blir erstattet med glutaminsyre. Immunglobulindelen av mutantmolekylet er mutert slik at cysteinene i posisjonene 130, 136 og 139 blir erstattet med serin og prolin i posisjon 148 blir erstattet med serin. Dette mutantmolekylet blir betegnet her som L104EA29YIg (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4). Etter at signalsekvensen er spaltet, kan L104EA29YIg enten starte med en metionin i posisjon 1 eller starte med alanin i posisjon -1.

Et annen mutantmolekyl ifølge oppfinnelsen er et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl som har det ekstracellulære domenet av human CTLA4 bundet til det humane immunglobulinmolekylet (f.eks. hengsel, CH2 og CH3). Dette molekylet omfatter delen av aminosyresekvensen som koder for CTLA4 ved å starte med metionin i posisjon 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124, en sammenføynings (”junction”) aminosyrerest glutamin i posisjon 125 og immunglobulindelen omfattende en aminosyresekvens som har glutaminsyre i posisjon 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356.

Andelene som har det ekstracellulære domenet av CTLA4 er mutert slik at leucin i posisjon 104 er substituert med glutaminsyre. Hengsel-delen av mutantmolekylet er mutert slik at cysteinene i posisjonene 130, 136 og 139 er substituert med serin og prolin i posisjon 148 er substituert med serin. Dette mutantmolekylet er betegnet her som L104EIg (Figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

Alternativt er en utførelsesform av L104EIg et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl som har et ekstracellulært domene av human CTLA4 bundet til et humant immunglobulinmolekyl (f.eks. hengsel, CH2 og CH3). Dette foretrukne molekylet omfatter CTLA4-delen omfattende en aminosyresekvens som starter med alanin i posisjon -1 til og med asparaginsyre i posisjon 124, en sammenføynings (”junction”) aminosyrerest glutamin i posisjon 125 og immunglobulindelen omfattende glutaminsyre i posisjon 126 til og med lysin i posisjon 357 eller glysin i posisjon 356. Andelene som har det ekstracellulære domenet av CTLA4 er mutert slik at leucin i posisjon 104 er substituert med glutaminsyre. Hengsel-delen av mutantmolekylet er mutert slik at cysteinene i posisjonene 130, 136 og 139 er substituert med serin og prolin i posisjon 148 er substituert med serin. Dette mutantmolekylet er betegnet her som L104EIg (Figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

Videre tilveiebringer oppfinnelsen et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl som har: (a) en første aminosyresekvens av et membran glykoprotein, f.eks. CD28, CD86, CD80, CD40 og gp39, som blokkerer T-celleproliferasjon, fusjonert til en andre aminosyresekvens; (b) hvor den andre aminosyresekvensen er et fragment av det ekstracellulære domenet av mutant CTLA4 som blokkerer T-celleproliferasjon, slik som for eksempel et aminosyremolekyl omfattende metionin i posisjon 1 til og med asparaginsyre i posisjon 124 (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6); og (c) en tredje aminosyresekvens som virker som et identifikasjonsmerke eller forbedrer oppløselighet av molekylet. For eksempel kan den tredje aminosyresekvensen bestå i det vesentlige av aminosyrerester av hengsel, CH2 og CH3-regionene av et ikke-immunogent immunglobulinmolekyl. Eksempler på egnede immunglobulinmolekyler omfatter, men er ikke begrenset til, human eller ape immunglobulin, f.eks. IgCγ1. Andre isotyper er også mulige.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon ved å administrere til et subjekt en effektiv dose av et CTLA4 mutantmolekyl med et ekstracellulært domene av CTLA4 som vist i SEKV ID NR:8 som starter med alanin i posisjon 26 eller metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 eller en del derav. I tillegg er, i det ekstracellulære domenet eller del derav en alanin i posisjon 55 substituert med et tyrosin og et leucin i posisjon 130 er substituert med en glutaminsyre. Videre omfatter administreringsregimet et tidlig fase-regime, hvor tidlig fase-regimet kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon og omfatter administrering som initielt er hyppigere enn månedlig.

I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon ved å administrere til et subjekt en effektiv dose av et CTLA4 mutantmolekyl med en aminosyresekvens som starter med metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 av SEKV ID NR:4 eller med en aminosyresekvens som starter med alanin i posisjon 26 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 av SEKV ID NR:4. Videre omfatter administreringsregimet av CTLA4 mutantmolekylet et tidlig fase-regime, hvor tidlig fase-regimet kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon og omfatter administrering som initielt er hyppigere enn månedlig.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre nukleinsyremolekyler omfattende nukleotidsekvenser som koder for aminosyresekvensene svarende til de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen. I én utførelsesform er nukleinsyremolekylet et DNA (f.eks. cDNA) eller en hybrid derav. Alternativt er nukleinsyremolekylene RNA eller hybrider derav.

I tillegg tilveiebringer oppfinnelsen en vektor, som omfatter nukleotidsekvensene ifølge oppfinnelsen. Et vert-vektor-system tilveiebringes også. Vert-vektor-systemet omfatter vektoren ifølge oppfinnelsen i en egnet vertscelle. Eksempler på egnede vertsceller omfatter, men er ikke begrenset til, prokaryote og eukaryote celler.

Oppfinnelsen omfatter farmasøytiske blandinger for anvendelse ved behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon omfattende farmasøytisk effektive doser av oppløselige CTLA4 mutantmolekyler. I visse utførelsesformer blir immunlidelsene forbundet med graft transplantasjonen mediert av CD28- og/eller CTLA4-positiv celle-interaksjoner med CD80 og/eller CD86-positive celler. De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene er foretrukket CTLA4-molekyler som har én eller flere mutasjoner i det ekstracellulære domenet av CTLA4. Den farmasøytiske blandingen kan omfatte oppløselige CTLA4 mutant proteinmolekyler og/eller nukleinsyremolekyler og/eller vektorer som koder for molekylene. I foretrukne utførelsesformer har de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene aminosyresekvensen av det ekstracellulære domenet av CTLA4 som vist i enten Figurene 7 (SEKV ID NR: 3 og 4) eller 8 (SEKV ID NR: 5 og 6), L104EA29Y eller L104E, henholdsvis. Enda mer foretrukket er det oppløselige CTLA4 mutantmolekylet L104EA29YIg som beskrevet her.

Blandingene kan i tillegg omfatte andre terapeutiske midler, omfattende, men ikke begrenset til, medikament toksiner, enzymer, antistoffer eller konjugater.

De farmasøytiske blandingene omfatter også fortrinnsvis egnede bærere og adjuvantia som omfatter hvilket som helst materiale som når kombinert med molekylet ifølge oppfinnelsen (f.eks. et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl, slik som, L104EA29Y eller L104E) beholder molekylets aktivitet og er ikke-reaktivt med subjektets immunsystem. Eksempler på egnede bærere og adjuvantia omfatter, men er ikke begrenset til, humant serumalbumin; ionebyttere; alumina; lechitin; buffersubstanser, slik som fosfater; glysin; sorbinsyre; kaliumsorbat; og salter eller elektrolytter, slik som protamin-sulfat. Andre eksempler omfatter hvilke som helst av de standard farmasøytiske bærerne slik som et fosfatbufret saltoppløsning; vann; emulsjoner, slik som olje/vann-emulsjon; og forskjellige typer av fuktemidler. Andre bærere kan også omfatte sterile løsninger; tabletter, omfattende belagte tabletter og kapsler. Typisk inneholder slike bærere tilsetningsmidler slik som stivelse, melk, sukker, visse typer av leire, gelatin, stearinsyre eller salter derav, magnesium eller kalsiumstearat, talkum, vegetabilsk fett eller oljer, gummier, glykoler eller andre kjent tilsetningsmidler. Slike bærere kan også omfatte smaksmiddel og farge tilsetningsstoff eller andre bestanddeler. Blandinger omfattende slike bærere blir formulert ved velkjente konvensjonelle metoder. Slike blandinger kan også formuleres i forskjellige lipidpreparater, slik som for eksempel liposomer så vel som i forskjellige polymere blandinger, slik som polymere mikrokuler.

De farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen kan administreres ved anvendelse av konvensjonelle administreringsmetoder omfattende, men ikke begrenset til, intravenøs (i.v.) administrering, intraperitoneal (i.p.) administrering, intramuskulær (i.m.) administrering, subkutan administrering, oral administrering, administrering som et suppositorium eller som en topisk kontakt eller implantasjonen av en anordning med langsom frigjøring slik som en miniosmotisk pumpe, til subjektet.

De farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen kan være i en rekke doseringsformer, som omfatter, men er ikke begrenset til,flytende løsninger eller suspensjoner, tabletter, piller, pulvere, suppositorier, polymere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer og injiserbare eller infuserbare løsninger. Den foretrukne formen avhenger av administreringsmetoden og den terapeutiske anvendelsen.

En typisk farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intravenøs (i.v.) administrering er listet opp nedenfor.

Blanding av lyofilisert L104EA29YIg 100 mg/medisinglass medikament produkt

a Hvert medisinglass inneholder 10% overfyll for medisinglass, nål og sprøyte opphold av den rekonstituerte løsningen.

Det lyofiliserte medikament-produktet kan rekonstitueres med en vandig bærer. Den vandige bæreren av interesse her er én som er farmasøytisk akseptabel (sikker og ikke-toksisk for administrering til et menneske) og er anvendelig for fremstilling av en flytende formulering, etter lyofilisering. Typisk blir det lyofiliserte medikament-produktet rekonstituert til ca.25 mg/ml med 10 ml enten Sterilt vann for Injeksjon, USP (SWFI) eller 0,9% Natriumklorid Injeksjon, USP. Den rekonstituerte løsningen blir ytterligere fortynnet til medikament-produkt konsentrasjoner mellom 1 og 10 mg/ml med 0,9% Natriumklorid Injeksjon, USP. Det fortynnede medikament-produktet for injeksjon er isotonisk og egnet for administrering ved intravenøs infusjon.

En surfaktant kan tilsettes til formuleringen i en mengde tilstrekkelig til å redusere eller forhindre interaksjon av det rekonstituerte medikament-produktet med en silikonisert sprøyte.

Den mest effektive administreringsmetoden og doseregimet for blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse avhenger av alvorlighetsgraden og forløpet av sykdommen, pasientens helse og respons på behandling og bedømmelsen ved den behandlende legen. Følgelig skulle doseringene (også kjent som doser) av blandingene titreres til den individuelle pasienten.

De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene kan administreres til et individ i en mengde, ved en hyppighet over en tidsperiode (f.eks. tidsrom og/eller mangfoldige ganger) tilstrekkelig å blokkere endogene B7 (f.eks. CD80 og/eller CD86)-molekyler fra å binde deres respektive ligander, i subjektet. Blokkering av endogen B7/ligand-binding hemmer derved interaksjoner mellom B7-positive celler (f.eks. CD80- og/eller CD86-positive celler) med CD28- og/eller CTLA4-positive celler. Dose av et terapeutisk middel er avhengig av mange faktorer omfattende, men ikke begrenset til, type vev angrepet, type immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon som behandles, alvorlighetsgraden av sykdommen, et subjekts helse og subjektets respons på behandlingen med midlene.

Doser av molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen er basert på kroppsvekt og administreringsregimer kan dikteres av mål serum bunn (”trough”) profilene. Typisk vil mål bunn (”trough”)-serumkonsentrasjon av CTLA4 mutantmolekyler ifølge oppfinnelsen på mellom 3µg/ml og 30µg/ml over de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon være tilstrekkelig til å opprettholde funksjon av allograftet, foretrukket mellom 5µg/ml og.

20 µg/ml. Typisk er mål bunn-serumkonsentrasjon av CTLA4 mutantmolekyler ifølge oppfinnelsen under vedlikeholdsfasen mellom 0,2 µg/ml og 3µg/ml, fortrinnsvis mellom 0,25µg/ml og 2,5µg/ml.

CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen kan administreres i en mengde på mellom 0,1 til 20,0 mg/kg vekt av pasienten, typisk mellom 1,0 til 15,0 mg/kg. For eksempel kan L104EA29Y administreres ved 10 mg/kg vekt av pasienten under den tidlige fasen, høyrisiko perioden som følger transplantasjon og reduseres til 5 mg/kg vekt av pasienten for en vedlikeholdsdose.

Administrering av molekylene eller farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan utføres over ulike perioder. Typisk omfatter administreringsregimer en tidlig fase, hvor doser er høyere og administreringshyppigheten er økt under perioden for størst immunologisk risiko, fulgt av en vedlikeholdsfase. Tidlig fase-regimet kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon og omfatter administrering som initielt er hyppigere enn måndelig, fortrinnsvis så ofte som daglig, ukentlig eller annenhver uke avhengig av den immunologiske risikoen og/eller mål bunn (”trough”) serumkonsentrasjon. Vedlikeholdsfasen starter når den tidlige fasen slutter og omfatter administrering som ikke er hyppigere enn måndelig og varer så lenge som nødvendig, typisk så lenge pasienten beholder transplantatet. Som anvendt her er dag 1 definert som dagen for transplantasjon eller den første dagen for behandling med molekyler eller farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen.

Dosen av CTLA4 mutantmolekyler ifølge oppfinnelsen i den tidlige fasen er 8 til 12 mg/kg vekt av pasienten, fortrinnsvis ca.10 mg/kg. Dosen av CTLA4 mutantmolekyler ifølge oppfinnelsen i vedlikeholdsfasen er 3 til.7 mg/kg vekt av pasienten, fortrinnsvis ca.5 mg/kg.

Den tidlige fasen kan være i området fra de første 3 til 6 månedene etter transplantasjon. Administreringsregimet under tidlig fase kan variere avhengig av status for mottageren og/eller graftet. For eksempel ville et mer intensivt tidlig fase-regime administrere en høyere dose av molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen ved dag 1, dag 5, uke 2 visitt (f.eks. dag 13-17), deretter hver andre uke i de første 3 månedene (f.eks. ved uke 4 visitt, uke 6 visitt, uke 8 visitt, uke 10 visitt og uke 12 visitt), fulgt av månedlig administrering til og med måned 6 visitt (f.eks. ved måned 4 visitt, måned 5 visitt og måned 6 visitt). Et eksempel på et typisk mer intensivt tidlig fase-regime er administrering av 10 mg/kg vekt av pasienten av L104EA29YIg ved dagene 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 og 169. Et mindre intensivt regime, for eksempel, ville administrere molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen ved dag 1, uke 2 visitt, uke 4 visitt, deretter månedlig til og med måned 3 visitt. Et eksempel på et typisk mindre intensivt tidlig fase-regime er administrering av 10 mg/kg vekt av pasienten av L104EA29YIg ved dagene 1, 15, 29, 57 og 85.

Typisk blir en tidlig fase etterfulgt av en vedlikeholdsfase hvor lavere doser av molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen blir administrert ved én til to måneders intervaller så lenge det er behov for det, typisk så lenge pasienten beholder transplantatet. Et eksempel på vedlikeholdsfasen for det mer intensive regimet beskrevet ovenfor omfatter månedlig administrering av 5 mg/kg vekt av pasienten av L104EA29YIg med start ved måned 7 visitten. Mens et eksempel på vedlikeholdsfasen for det mindre intensive regimet ovenfor ville omfatte månedlig administrering av 5 mg/kg vekt av pasienten av L104EA29YIg med start ved måned 4 visitten.

Alternativt ville fagfolk på området være i stand til å modifisere administreringsregimet som respons på pasientens risikostatus og/eller respons på terapien etter transplantasjon. For eksempel kunne den tidlige fasen av det mindre intensive regimet beskrevet ovenfor bli modifisert ved å tilføye administrering ved dag 5 til regimet, hvilket derved øker administreringshyppigheten under perioden for størst immunologisk risiko.

Som anvendt her refererer “fire uker,” “måned”, “måneder” eller “månedlig” en periode på 28 ± 5 dager. Som anvendt her angir “to uker” en periode på 14 ± 3 dager.

Fleksibilitet i administreringsregimene er nødvendig for å lette tidsplanleggingen av administrering i livene til mottagerne av transplantat, mens mål bunn (”trough”)-profilen av CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen opprettholdes. Tillatte vinduer for administrering av dosene kan være som følger:

Mål-datoen er et resultat av å addere den ønskede varigheten til den forutgående reelle visitt-dagen. Den ønskede varigheten for uke 2 visitten er 10 dager. Den ønskede varigheten er 14 dager for en visitt planlagt for to uker fra den forutgående visitten, f.eks. en uke 6 visitt etter en uke 4 visitt. Den ønskede varigheten er 28 dager for a visitt planlagt for en måned eller fire uker fra den tidligere visitten, f.eks. en måned 4 visitt etter en måned 3 visitt. Den ønskede varigheten er 56 dager for en visitt planlagt i to måneder fra den tidligere visitten, f.eks. en måned 8 visitt etter en måned 6 visitt. For eksempel, en dag 15 reell visitt-dato pluss 14 dager ender med en uke 4 mål-dato for dag 29. Basert på visitt-vinduene ovenfor, kan administreringen finne sted ved dag 29 ± 3 dager. Skulle administreringen forekomme ved dag 26, blir denne dagen den reelle visittdatoen anvendt for beregningen av neste mål-dato.

Lavrisiko for resipienter med akutt avstøtning omfatter typisk de som mottar transplantater fra levende relaterte donorer og godt matchede mottagere/donorer. Høyrisiko for resipienter med akutt avstøtning omfatter typisk de som mottar transplantater fra marginale donorer eller re-transplantasjoner, har høy panel reaktive antistoffer eller er afrikanske-amerikanske.

I tillegg til den umiddelbare risikoen for akutt transplantatavstøtning, fører anvendelse av vedlikeholdsmedikamenter slik som calcineurinhemmere og steroider over lang tid til toksisiteter som negativt påvirker langvarige resultater og pasientens livskvalitet. For eksempel omfatter bivirkninger av vedlikeholdsmedikamenter nefrotoksisitet (CAN) hvilket resulterer i sviktende nyrefunksjon og/eller tap av transplantatet og kardiovaskulære og metabolske sykdommer slik som hypertensjon, hyperlipidemi og diabetes som resulterer i kardiovaskulær sykdom og død. Ytterligere bivirkninger omfatter hirsuitisme, alpecia, gingival hyperplasi, tremor, neurotoksisitet og bentap som resulterer i ikke-etterlevelse og redusert livskvalitet. Molekylene eller farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å unngå disse resultatene, for å redusere forekomst, utvikling og/eller progresjon av disse resultatene ved behandling av immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon eller for å behandle immunlidelser forbundet med graft transplantasjon i subjekter med risiko for disse resultatene. Molekylene eller farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å forbedre nyrefunksjon slik som målt ved GFR.

Administrering av molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen kan være gjennom en 30 minutters til én eller flere timers intravenøs infusjon. Alternativt kan enkelt til multiple subkutane injeksjoner levere den nødvendige dosen. Typisk er en 30 minutters intravenøs infusjon administreringsruten anvendt under den tidlige fasen av behandling mens pasienten er på sykehuset og/eller som har faste visitter hos fagfolk innen helsevesenet for overvåkning. Subkutan injeksjon er den typiske administreringsmåten anvendt under vedlikeholdsfasen, hvilket derved tillater pasienten å returnere til deres normale plan ved å redusere visittene til fagfolk innen helsevesenet for intravenøse infusjoner.

En alternativ utførelsesform ifølge oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon i subjekter som har mottatt en alternativ immunosuppressive terapi etter transplantasjon. Subjekter på en alternativ farmasøytisk immunosuppressiv terapi kan endre eller skifte eller bytte til en behandling omfattende molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse, for derved å få bort det alternative medikamentet. Typisk blir det farmasøytiske midlet som skal elimineres trappet ned over en passende tidsperiode, basert på de pålagte instruksjonene for det spesifikke medikamentet, mens molekylene eller den farmasøytiske blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse samtidig blir administrert oftere enn månedlig. Straks subjektet er fullstendig fri fra det alternative medikamentet, kan subjektet returnere til et standard vedlikeholdsregime ved anvendelse av molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan et subjekt som mottar CsA/MMF ± kortikosteroidregime skifte ut CsA med L104EA29YIg for et L104EA29YIg/MMF± kortikosteroidregime. Ombyttingen av administreringsplanen kan omfatte en nedtrapping av dosen av CsA over to måneder og administrering av 5 mg/kg av L104EA29YIg hver 2. uke i løpet av de to månedene. Straks CsA blir fjernet, ville subjektet deretter gå inn i vedlikeholdsfasen og fortsette å motta 5 mg/kg hver 4. eller 8. uke for resten av varigheten av behandlingen i fravær av CsA.

En utførelsesform tilveiebringer passende doser for et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl beskrevet her som er effektiv for blokkering av B7 interaksjoner med dens ligand og/eller behandling av en immunsystem sykdom. For eksempel kan dosen være basert på kroppsvekt og administreringsregimer kan være diktert av mål serum bunn (”trough”)-profilene. For eksempel kan de effektive mål bunn serum konsentrasjonene av oppløselige CTLA4 mutantmolekyler beskrevet her for å behandle en sykdom i immunsystemet være mellom ca.0,2µg/ml og ca.

30µg/ml. Alternativt kan de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her administreres i en mengde på mellom ca.0,1 til ca.20,0 mg/kg vekt av pasienten for å behandle sykdommer i immunsystem.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre fremgangsmåter for behandling av immunlidelser forbundet med graft transplantasjon. I spesielle utførelsesformer blir immunforstyrrelsene forbundet med graft transplantasjon mediert av CD28- og/eller CTLA4-positiv celle-interaksjoner med CD80/CD86-positive celler. I en ytterligere utførelsesform blir T-celle-interaksjoner hemmet. Disse fremgangsmåtene omfatter å administrere til et subjekt de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen for å regulere T-celle-interaksjoner med CD80- og/eller CD86-positive celler. Eksempler på immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon er beskrevet ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å forebygge eller hemme eller forhindre fast organ, vev, celle og/eller ytre anatomi transplantatavstøtninger ved et subjekt, hvor subjektet er en mottager av transplantat fast organ, vev, celle og/eller ytre anatomi. Typisk blir, ved transplantasjoner, avstøtning av graftet initiert gjennom dets gjenkjennelse som fremmed ved T-celler, fulgt av en immunrespons som ødelegger graftet. De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan, ved å hemme T lymfocytt-proliferasjon og/eller cytokinsekresjon, føre til redusert vevdestruksjon og induksjon av antigen-spesifikk T-celle resistens (”unresponsiveness”) som kan resultere i langvarig graft aksept.

Studiet beskrevet i Eksempel 3 sammenlignet effektiviteten og sikkerheten av L104EA29YIg som et vedlikeholds immunosuppressivt stoff med cyklosporinA (CsA) over 12 måneder når anvendt som del av et CNI-fritt kombinasjonsregime bestående av basiliximab(Simulect<®>; Novartis)-induksjon, mykofenolatmofetil (MMF; CellCept<®>; Roche) og kortikosteroider i nyre-transplantat mottagere. Mål omfattet bedømmelse av forekomsten av akutt avstøtning (biopsi-bekreftet eller antatt) ved 6 måneder og 1 år; målt glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) gjennom ioheksol utskilling ved 1, 6 og 12 måneder; parametere for hypertensjon omfattende serum-kolesterol og triglyserider; og total sikkerhet. Andre forhåndsspesifiserte analyser omfattet pasientdød eller tap av transplantat ved 1 år; alvorlighetsgraden av akutt avstøtning; forekomsten av post-transplantasjon diabetes mellitus [definert som hvilken som helst terapi nødvendig for hyperglykemi i >4 uker eller en hemoglobin A1C (HbA1c) >7%, hos pasienter ikke tidligere kjent å være diabetiske]; beregnet GFR, ved anvendelse av Modifikasjon av Diett i Nyresykdom (MDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation. Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999;130:461-470), Jelliffe (RW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med.1973;79:604-605), Cockcroft-Gault (Cockcroft DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 1976;16:31-41) og Nankivell (Nankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR. Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59(12):1683-1689) formler; farmakokinetikk og immunogenisitet. Diagnose og behandling av akutt avstøtning (AR) var basert på Banff 97 kriteriene og grad (Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.). Post hoc-analyse ble utført for forekomsten av kronisk allograft nefropati (CAN).

Dette 12-måneders studiet viste at L104EA29YIg-basert vedlikeholdsterapi ga ekvivalent effektivitet i forebygging av AR pasient og graftoverlevelse sammenlignet med CsA. I tillegg viste L104EA29YIg betydelige forbedringer i nyrefunksjon og reduksjoner i CAN sammenlignet med CsA-basert vedlikeholds immunsuppresjon. L104EA29YIg var sikker og veltolerert og ble ikke forbundet med typiske CNI-relaterte toksisiteter.

Forbedret nyrefunksjon i løpet av det første posttransplantasjon året er vist å korrelere med bedre langsiktige resultater (Hariharan S, McBride MA, Cherikh WS, Tolleris CB, Bresnahan BA, Johnson CP. Post-transplant renal function in the first year predicts long-term kidney transplant survival. Kidney Int 2002;62(1):311-8) siden langvarig anvendelse av CNI’er er begrenset av deres nefrotoksisitet (Danovitch GM. Immunosuppressive medications for renal transplantation: a multiple choice question. Kidney Int 2001;59(1):388-402), hvilket fører til redusert graftfunksjon og nyre utilstrekkelighet med alle dets ledsagende problemer.

Følgelig er kanskje de mest bemerkelsesverdige funnene sett ved L104EA29YIgbehandling de bedre GFR’ene forbundt med den 12-måneders nyre histologien som viser reduksjoner i utvikling og/eller progresjon av CAN sammenlignet med CsA. Dette var et overraskende resultat og første gang at et funn av denne typen er vist i et randomisert Fase II forsøk av en immunosuppressiv terapi. Siden vedlikehold av nefronmassen, ved forebygging av immunologiske, kardiovaskulære og/eller metabolske byrder bidrar til fordelaktige effekter på både pasient og graftoverlevelse er det mulig at L104EA29YIg kan være forbundet med bedre langvarige resultater.

Disse resultatene er spesielt viktige med den økende anvendelsen av organer fra utvidede kriterier-donorer eller mottagere siden disse er spesielt følsomme for CNI-relatert toksisitet. Reduksjon av forekomsten av CV og metabolske hendelser hos pasienter som har gjennomgått nyretransplantasjon er også sentralt for å forbedre langvarige resultater.

Molekylene eller de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle immunforstyrrelser forbundet med graft-transplantasjon hos subjekter som er ”utvidede kriterier”-mottagere og/eller som mottar grafts fra ”utvidede kriterier”-donorer. Disse kriteriene, som er basert delvis på kriterier utstedet av United Network of Organ Sharing (UNOS), kan omfatte én eller flere av de følgende: donoralder mindre enn 10 eller større enn eller lik 60 år; donor etter hjertedød; forventet kald iskemisk tid for donororgan større enn eller lik 24 timer; subjekter som gjennomgår første gangs transplantasjon med en aktuell PRA � 50% eller som gjennomgår retransplantasjon med PRA ≥ 30%; subjekter med tidligere graft-tap på grunn av akutt avstøtning under de første 6 månedene etter transplantasjon; subjekter med positiv T-celle lymfocytotoksisk kryssmatch ved anvendelse av donor-lymfocytter og mottager-serum; subjekter med HIV-infeksjon; subjekter med aktiv tuberkulose som krever behandling innenfor de forutgående 3 år; eller andre kriterier utstedet av United Network of Organ Sharing (UNOS). Et eksempel på mulige utvidede kriterier for en donor og/eller donornyren omfatter minst 1 av de følgende utvidede kriteriene for organdonasjon a) Donoralder ≥60 år ELLER b) Donoralder 50 – 59 år og 1 av de følgende: (i) Cerebrovaskulær episode (CVA) hypertensjon SCr > 1,5 mg/dl ELLER (ii) CVA hypertensjon ELLER (iii)CVA SCr > 1,5 mg/dl ELLER (iv) Hypertensjon SCr > 1,5 mg/dl ELLER c) CIT ≥24 timer, donoralder > 10 år ELLER d) Donor med hjertedød (”non-heart beating donor”).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for å hemme graft-versus-vert sykdom i et subjekt. Denne fremgangsmåten omfatter å administrere til subjektet et oppløselig CTLA4 mutantmolekyl ifølge oppfinnelsen, alene eller sammen, samtidig eller sekvensielt, med enda ytterligere ligander, reaktive med IL-2, IL-2R, IL-4 eller γ-interferon. For eksempel kan et oppløselig CTLA mutantmolekyl ifølge foreliggende oppfinnelse administreres til en mottager av et benmargtransplantat for å hemme alloreaktiviteten av donor T-celler.

Alternativt kan donor T-celler i et benmarg graft gjøres tolererbart til en mottagers alloantigener ex vivo før transplantasjon.

De oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen, for eksempel L104EA29Y, kan administreres som den eneste aktive bestanddelen eller sammen, samtidig eller sekvensielt, med én eller flere andre medikamenter i immunmodulerende regimer, immunosuppressive midler og/eller andre antiinflammatoriske midler f.eks. for behandling, forhindring eller hemming eller forebygging av allograft eller xenograft akutt eller kronisk avstøtning eller for å indusere toleranse. For eksempel kan de anvendes i kombinasjon med en calcineurinhemmer (f.eks. cyklosporin A eller FK506); et immunosuppressivt makrolid (f.eks. tacrolimus, rapamycin, sirolimus) eller et derivat derav (f.eks.40-O-(2-hydroksy)etyl-rapamycin, sirolimus, centican); et lymfocytt målsøkende middel (f.eks. FTY720) eller en analog derav (FK778, Jak-3), kortikosteroider; cyklofosfamid; azatiopren; metotrexat; leflunomid eller en analog derav; mizoribin; mykofenolsyre; mykofenolatmofetil; 15-deoksyspergualin eller en analog derav; immunosuppressive monoklonale antistoffer (f.eks. basiliximab, daclizumab), ligander, monoklonale antistoffer eller antistoffragmenter derav mot leukocytt reseptorer (f.eks. MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD 27, B7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB eller deres ligander); eller andre immunmodulerende forbindelser (f.eks. CTLA4/CD28-Ig) eller andre adhesjonsmolekyl-hemmere (f.eks. mAbs) eller lavmolekylvekt inhibitorer omfattende LFA-1 antagonister, Selektin antagonister og VLA-4 antagonister. Forbindelsen er spesielt anvendelig i kombinasjon med en forbindelse som interfererer med CD40 og dens ligand (f.eks. antistoffer mot CD40 og antistoffer mot CD40-L), slik som Chi220 (US Patent 6,051,228) f.eks. i de ovenfor beskrevne indikasjonene, for eksempel induksjon av toleranse.

Når de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen blir administrert samtidig eller sekvensielt sammen med annen immunosuppressiv / immunomodulerende terapi, for eksempel som her spesifisert, vil doser av den koadministrerte immunosuppresserende eller immunomodulerende forbindelsen selvfølgelig variere avhengig av typen ko-medikament anvendt, f.eks. hvorvidt det er et steroid eller et cyklosporin, av det spesifikke medikamentet anvendt, av lidelsen som behandles og så videre.

I henhold til foregående tilveiebringer foreliggende oppfinnelse videre terapeutiske kombinasjoner, f.eks. et kit, f.eks. for anvendelse i hvilken som helst fremgangsmåte som definert ovenfor, omfattende et L104EA29YIg, i fri form eller i farmasøytisk akseptabel saltform, som skal anvendes samtidig eller i rekkefølge med minst én farmasøytisk blanding omfattende et immunosuppresserende middel, immunmodulerende eller anti-inflammatorisk medikament. Kitet kan omfatte instruksjoner for dets administrering.

I henhold til foregående, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i et enda ytterligere aspekt fremgangsmåter som definert ovenfor omfattende koadministrering, f.eks. samtidig eller i rekkefølge, av en terapeutisk effektiv dose av oppløselig CTLA4 mutantmolekyl ifølge oppfinnelsen, med immunosuppressive midler. Immunosuppressive midler omfatter oppløselig gp39 (også kjent som CD40 ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), oppløselig CD29, oppløselig CD40, oppløselig CD80 (f.eks. ATCC 68627), oppløselig CD86, oppløselig CD28 (f.eks. 68628), oppløselig CD56, oppløselig Thy-1, oppløselig CD3, oppløselig TCR, oppløselig VLA-4, oppløselig VCAM-1, oppløselig LECAM-1, oppløselig ELAM-1, oppløselig CD44, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med gp39 (f.eks. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 og ATCC HB-12056), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD40 (f.eks. ATCC HB-9110), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med B7 (f.eks. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, osv.), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD28 (f.eks. ATCC HB-11944 eller mAb 9,3 som beskrevet av Martin et al (J. Clin. Immun.4(1):18-22, 1980), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med LFA-1 (f.eks.

ATCC HB-9579 og ATCC TIB-213), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med LFA-2, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med IL-2 eller IL-2R, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med IL-12, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med IFN-gamma, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD2, antistoffer ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD48, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med hvilke som helst ICAM (f.eks. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 og ICAM-3), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CTLA4 (f.eks. ATCC HB-304), ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med Thy-1, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD56, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD3, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD29, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med TCR, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med VLA-4, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med VCAM-1, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med LECAM-1, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med ELAM-1, ligander, antistoffer eller antistoffragmenter reaktive med CD44. I visse utførelsesformer er monoklonale antistoffer foretrukket. I andre utførelsesformer er antistoffragmenter foretrukket. Antistoffragmenter omfatter men er ikke begrenset til Fab, Fab ́, F(ab ́)2 , Fv, scFv og domene antistoffer (dAbs) omfattende men ikke begrenset til de beskrevet i WO2006/030220. Som fagfolk på området lett vil forstå, kan kombinasjonen omfatte de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen og ett andre immunosuppressivt middel, de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene med to andre immunosuppressive midler, de oppløselige CTLA4 molekyler med tre andre immunosuppressive midler, osv. Bestemmelsen av den optimale kombinasjonen og doser kan bestemmes og optimaliseres ved anvendelse av fremgangsmåter velkjent på området.

En spesielt anvendelig kombinasjon er L104EA29YIg eller farmasøytisk blanding derav med en forbindelse som interfererer med IL-2 og dens ligand, spesifikt en antagonist målrettet mot IL-2R (alfa) som er selektivt uttrykt på overflaten av aktiverte T-lymfocytter. En forbindelse som binder til IL-2R(alfa) hemmer kompetitivt IL-2 mediert aktivering av lymfocytter, som er en kritisk reaksjonsvei i den cellulære immunresponsen involvert i avstøtning av allotransplantat.

Noen spesifikke kombinasjoner omfatter de følgende: L104EA29YIg og CD80 monoklonale antistoffer (mAbs); L104EA29YIg og CD86 mAbs;

L104EA29YIg, CD80 mAbs og CD86 mAbs; L104EA29YIg og gp39 mAbs;

L104EA29YIg og CD40 mAbs; L104EA29YIg og CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 og CD86 mAbs og gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD80 og CD86 mAbs og CD40 mAbs; og L104EA29YIg, anti-LFA1 mAb og anti-gp39 mAb. Et spesifikt eksempel på en gp39 mAb er MR1. Andre kombinasjoner vil lett oppfattes og forstås av fagfolk på området.

I henhold til det foregående, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse i et enda ytterligere aspekt fremgangsmåter som definert ovenfor omfattende koadministrering, f.eks. samtidig eller i rekkefølge, av en terapeutisk effektiv dose av oppløselig CTLA4 mutantmolekyl ifølge oppfinnelsen, med et tilleggsmiddel og/eller et kortikosteroid. Målet er å erstatte de toksiske calcineurinhemmerene med CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen. Imidlertid kan CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen også ko-administreres samtidig eller sekvensielt med CNI’er slik som cyklosporin (Neoral<®>, Sandimmune<®>fra Novartis) og tacrolimus (FK506, Prograf<®>fra Fujisawa).

Eksempler på tilleggsmidler omfatter men er ikke begrenset til inhibitorer av inosin monofosfat dehydrogenase (IMPDH), f.eks. mykofenolatmofetil (MMF, Cellcept<®>fra Roche Laboratories) og mykofenolsyre (Myfortic<®>fra Novartis); rapamycin (sirolimus, Rapamune<®>fra Wyeth/Ayerst); azatioprin (Azarsan<®>fra Salix, Imuran<®>, generisk); et lymfocytt målsøkende middel, f.eks. FTY720(fra Novartis); FK778(fra Fujisawa); Jak-3 (fra Pfizer); og Certican<®>(everolimus fra Novartis).

Eksempler på kortikosteroider omfatter men er ikke begrenset til, betamethason, budesonid, kortisol, kortison, dexamethason, hydrocritison, metylprednisolon, prednisolon, prednison og triamcinolon.

Typisk omfatter kombinasjoner for ko-administrering, men er ikke begrenset til, L104EA29YIg og minst ett tilleggsmiddel valgt fra gruppen listet opp ovenfor; L104EA29YIg og minst ett kortikosteroid valgt fra gruppen listet opp ovenfor; L104EA29YIg, MMF(Cellcept fra Roche) og et kortikosteroid valgt fra gruppen listet opp ovenfor; L104EA29YIg, rapamycin (sirolimus, Rapamune<®>fra Wyeth/Ayerst) med eller uten et kortikosteroid valgt fra gruppen listet opp ovenfor.

Kombinasjonene for ko-administrering beskrevet ovenfor kan anvendes med et induksjonsmiddel slik som immunosuppressive monoklonale antistoffer, f.eks. basiliximab (Simulect<®>fra Novartis), muromonab (Orthoclone OKT3<®>fra Orto Biotech), rituximab (Rituxan<®>fra Genentech) og daclizumab (Zenapax<®>fra Roche Labs); eller antithymocytt-globulin (Thymoglobulin<®>fra SangStat). For eksempel omfatter egnede kombinasjoner men er ikke begrenset til basiliximab (Simulect<®>fra Novartis) med L104EA29YIg, MMF(Cellcept fra Roche) og prednisolon; eller daclizumab (Zenapax<®>fra Roche), L104EA29YIg og rapamycin (sirolimus, Rapamune<®>fra Wyeth/Ayerst).

Typisk blir ikke standarddosene og administreringsregimet for de koadministrerte medikamentene beskrevet ovenfor påvirket ved tilsetning av CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen til behandlingsregimet. Imidlertid kan fagfolk på området ordinere lavere doser av de ko-administrerte medikamentene, f.eks. tilleggs- midler og/eller kortikosteroider, på grunn av innføring av de mindre toksiske CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen inn i behandlingsregimet.

Fastsatt informasjon kan være basert på pakningsvedlegget for hvert koadministrert medikament. Et kortikosteroid kan ko-administreres med molekylene eller den farmasøytiske blandingen ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan subjekter behandles daglig med kortikosteroider. En steroid vedlikeholds og avtagende strategi kan omfatte 500 mg i.v. metylprednisolon ved ankomst i betjeningsrommet (OR) 250 mg i.v. metylprednisolon ved dag 2, fulgt av prednison (eller prednisolon) 100 mg oralt ved dag 3, fulgt av en gradvis reduksjon av prednison (eller prednisolon) på 20 - 30 mg/dag ved slutten av uke 2, fulgt av en gradvis reduksjon av prednison (eller prednisolon) på ikke lavere enn 2,5 mg/dag til og med måned 6. Subjekter kan forbli på minst 2,5 mg /dag gjennom hele forløpet av deres behandling.

Ytterligere koadministrerte medikamenter kan omfatte mykofenolatmofetil (MMF). Typisk blir MMF administrert i 2 oppdelte doser i en konsekvent plan i relasjon til tid på dagen og måltider. Et eksempel på et administreringsregime for MMF omfatter 2 g daglig. Den første dosen kan administreres preoperativt.

Påfølgende doser kan administreres p.o. så snart subjektet kan tolerere medisinering gjennom munnen. Dosen og planen kan reguleres på grunnlag av laboratorieverdier (f.eks. redusert WBCs) og subjektets tolerabilitet.

Pakningsvedlegget gir fullstendig fastsatt informasjon.

Et annen koadministrert medikament kan omfatte basiliximab. Rekonstituert basiliximab (20 mg i 5 ml) kan fortynnes til et volum på 50 ml med normal saltoppløsning eller dekstrose 5% og administreres som en i.v. infusjon over 20-30 minutter. Den første 20 mg dosen kan administreres ved dag 1 (dagen for transplantasjon). Den andre 20 mg dosen kan gis ved dag 5. Pakningsvedlegget gir fullstendig fastsatt informasjon

Videre tilveiebringes terapeutiske kombinasjoner, f.eks. et kit, f.eks. for anvendelse i hvilken som helst fremgangsmåte som definert ovenfor, omfattende en L104EA29YIg, i fri form eller i farmasøytisk akseptabel saltform, som skal anvendes samtidig eller i rekkefølge med minst én farmasøytisk blanding omfattende et tilleggsmiddel og kortikosteroider. Kitet kan omfatte instruksjoner for dens administrering.

Merket og/eller instruksjonene kan indikere at den farmasøytiske blandingen kan anvendes alene eller i kombinasjon, samtidig eller sekvensielt med et andre middel for å behandle en valgt tilstand f.eks. sykdommer i immunsystemet, autoimmune sykdommer, immunproliferative sykdommer, immunforstyrrelser forbundet med graft transplantasjon som beskrevet ovenfor.

Merket kan indikere passende doser for molekylene beskrevet her. For eksempel kan merket indikere at doser for et molekyl som er effektiv for blokkering av B7-interaksjoner med dens ligand og/eller behandling av en sykdom i immunsystemet kan være basert på kroppsvekt og administreringsregimer kan være diktert av mål serum bunn (”trough”) profilene. For eksempel kan merket indikere at de effektive mål bunn serum konsentrasjonene av CTLA4 mutantmolekyler beskrevet her for å behandle en sykdom i immunsystemet kan være mellom ca.0,2µg/ml og ca.30µg/ml. Alternativt kan merket indikere at CTLA4 mutantmolekylene beskrevet her kan administreres i en mengde på mellom ca.0,1 til ca.20,0 mg/kg vekt av pasienten for å behandle sykdommer i immunsystemet.

FREMGANGSMÅTER FOR FREMSTILLING AV MOLEKYLENE IFØLGE

OPPFINNELSEN

Ekspresjon av CTLA4 mutantmolekyler kan finne sted i prokaryote celler. Prokaryoter er oftest representert ved forskjellige stammer av bakterier. Bakterien kan være en gram-positiv eller en gram-negativ. Typisk er gram-negative bakterier slik som E. coli foretrukket. Andre mikrobielle stammer kan også anvendes.

Sekvenser som koder for CTLA4 mutantmolekyler kan inserteres inn i en vektor utformet for å uttrykke fremmede sekvenser i prokaryote celler slik som E. coli. Disse vektorene kan omfatte vanlig anvendte prokaryote kontrollsekvenser som er definert her til å omfatte promotere for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindingssete sekvenser, omfatte slike vanlig anvendte promotere som beta-laktamase (penicillinase) og laktose (lac) promoter-systemene (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), tryptofan (trp) promoter-systemet (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res.8:4057) og den lambda avledede PL-promoteren og N-gen ribosombindingssete (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128).

Slike ekspresjonsvektorer vil også omfatte replikasjonsorigo og selekterbare markører, slik som et beta-laktamase eller neomycin fosfotransferase-gen som gir resistens mot antibiotika, slik at vektorene kan replikere i bakterier og celler som inneholder plasmidene kan selekteres for når dyrket i nærvær av antibiotika, slik som ampicillin eller kanamycin.

Ekspresjonsplasmidet kan innføres i prokaryote celler gjennom en rekke standardmetoder, omfattende men ikke begrenset til CaCl2-sjokk (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110 og Sambrook et al. (eds.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. Ed., Cold Spring Harbor Press, (1989)) og elektroporering.

I henhold til utøvelsen av oppfinnelsen er eukaryote celler også egnede vertsceller. Eksempler på eukaryote celler omfatter hvilken som helst dyrecelle, hva enten primær eller immortalisert, gjær (f.eks. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe og Pichia pastoris) og planteceller. Myelom, COS og CHO-celler er eksempler på dyreceller som kan anvendes som verter.

Spesielle CHO-celler omfatter, men er ikke begrenset til, DG44 (Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet.12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC nr. CCL-61), CHO-K1 Tet-On cellelinje (Clontech), CHO betegnet ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, DET), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF betegnet ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), og RR-CHOK1 betegnet ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Eksempler på planteceller omfatter tobakk (hele planter, cellekultur eller kallus), mais, soyabønne og ris-celler. Mais, soyabønne og risfrø er også akseptable.

Nukleinsyresekvenser som koder for CTLA4 mutantmolekylene kan også inserteres i en vektor utformet for å uttrykke fremmede sekvenser i en eukaryot vert. De regulatoriske elementene av vektoren kan variere i henhold til den spesielle eukaryote verten.

Vanlig anvendte eukaryote kontrollsekvenser for anvendelse i ekspresjonsvektorer omfatter promotere og kontrollsekvenser kompatible med pattedyrceller slik som for eksempel CMV promoter (CDM8 vektor) og avian sarcoma virus (ASV) (πLN vektor). Andre vanlig anvendte promotere omfatter ”early” og ”late” promotere fra Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273:113) eller andre virale promotere slik som de avledet fra polyoma, Adenovirus 2 og bovin papilloma virus. En induserbar promoter, slik som hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802) kan også anvendes.

Vektorer for å uttrykke CTLA4 mutantmolekyler i eukaryoter kan også omfatte sekvenser betegnet enhancer-regioner. Disse er viktige ved optimalisering av genekspresjon og er funnet enten oppstrøme eller nedstrøms for promoterregionen.

Eksempler på ekspresjonsvektorer for eukaryote vertsceller omfatter, men er ikke begrenset til, vektorer for mammalske vertsceller (f.eks. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc Vektorer, pCMV vektorer, pSG5 vektorer (Stratagene)), retrovirale vektorer (f.eks. pFB vektorer (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) eller modifiserte former derav, adenovirale vektorer; Adeno-assosierte virusvektorer, baculovirus-vektorer, gjærvektorer (f.eks. pESC-vektorer (Stratagene)).

Nukleinsyresekvenser som koder for CTLA4 mutantmolekyler kan integreres inn i genomet til den eukaryote vertscellen og replikere ettersom vertsgenomet replikerer. Alternativt kan vektoren som bærer CTLA4 mutantmolekyler inneholde replikasjonsorigo som muliggjør ekstrakromosomal replikasjon.

For å uttrykke nukleinsyresekvensene i Saccharomyces cerevisiae, kan replikasjonsorigo fra det endogene gjærplasmidet, 2 μ sirkelen anvendes. (Broach, (1983) Meth. Enz.101:307). Alternativt kan sekvenser fra gjærgenomet som er i stand til å fremme autonom replikasjon anvendes (se for eksempel Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; og Clarke et al., (1983) Meth. Enz.101:300).

Transkripsjonkontroll-sekvenser for gjærvektorer omfatter promotere for syntese av glykolytiske enzymer (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg.7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Ytterligere promotere kjent på området omfatter CMV promoteren gitt i CDM8-vektoren (Toyama og Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promoteren i 3-fosfoglycerat kinase (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem.255:2073) og de for andre glykolytiske enzymer.

Andre promotere er induserbare fordi de kan reguleres ved miljøbestemte stimuli eller vekstmediet for cellene. Disse induserbare promoterne omfatter de fra genene for varmesjokkproteiner, alkohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, syre fosfatase, enzymer forbundet med nitrogenkatabolisme og enzymer ansvarlige for utnyttelse av maltose og galaktose.

Regulatorsekvenser kan også plasseres ved 3’-enden av de kodende sekvensene. Disse sekvensene kan tjene til å stabilisere budbringer RNA. Slike terminatorer er funnet i den 3’ utranslaterte regionen etter de kodende sekvensene i mange gjær-avledede og mammalske gener.

Eksempler på vektorer for planter og planteceller omfatter, men er ikke begrenset til, Agrobakterie Ti plasmider, blomkål mosaikkvirus (CaMV) og tomat golden mosaikkvirus (TGMV).

Generelle aspekter for pattedyrcelle vertssystem transformasjoner er beskrevet av Axel (U.S. Patent nr.4,399,216 bevilget 16. aug., 1983). Mammalske celler kan transformeres ved metoder omfattende men ikke begrenset til, transfeksjon i nærvær av kalsiumfosfat, mikroinjeksjon, elektroporering eller gjennom transduksjon med virale vektorer.

Fremgangsmåter for innføring av fremmede DNA-sekvenser inn i plante og gjærgenomer omfatter (1) mekaniske metoder, slik som mikroinjeksjon av DNA inn i enkeltceller eller protoplaster, vortexing av celler med glasskuler i nærvær av DNA eller skyting av DNA-belagte wolfram eller gullkuler inn i celler eller protoplaster; (2) innføring av DNA ved å gjøre cellemembraner permeable for makromolekyler gjennom polyetylenglykol-behandling eller å ved utsette dem for høyspenning elektriske pulser (elektroporering); eller (3) anvendelse av liposomer (inneholdende cDNA) som fusjonerer med cellemembraner.

Ekspresjon av CTLA4 mutantmolekyler kan detekteres ved metoder kjent på området. For eksempel kan mutantmolekylene detekteres ved Coomassie merking SDS-PAGE-geler og immunoblotting ved anvendelse av antistoffer som binder CTLA4. Protein utvinning kan utføres ved anvendelse av standard metoder for proteinrensning, f.eks. affinitetskromatografi eller ionebytterkromatografi, hvilket gir hovedsakelig rent produkt (R. Scopes i: “Protein Purification, Principles and Practice”, Tredje Utgave, Springer-Verlag (1994)).

US patentsøknad US Publikasjonsnummer 2005/0019859, 2005/0084933 og WO 04/058944 beskriver fremgangsmåter for fremstilling av proteiner ifølge oppfinnelsen, spesifikt rekombinante glykoprotein-produkter, ved dyr eller mammalske cellekulturer og inntas her ved referanse.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre oppløselige CTLA4 mutantmolekyler fremstilt ovenfor her.

CTLA4IG KODON-BASERT MUTAGENESE

I én utførelsesform ble seterettet mutagenese og en ny screeningsmetode anvendt for å identifisere mange mutasjoner i det ekstracellulære domenet av CTLA4 som forbedrer bindings-aviditet for CD86. I denne utførelsesformen ble mutasjoner foretatt i rester i regionene av det ekstracellulære domenet av CTLA4 fra serin 25 til arginin 33, C’-tråden (alanin 49 og treonin 51), F-tråden (lysin 93, glutaminsyre 95 og leucin 96) og i regionen fra metionin 97 til og med tyrosin 102, tyrosin 103 til og med glysin 107 og i G-tråden i posisjonene glutamin 111, tyrosin 113 og isoleucin 115. Disse setene ble valgt basert på undersøkelser av kimære CD28/CTLA4 fusjonsproteiner (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058) og på en modell som predikerer hvilke aminosyrerest sidekjeder som ville være eksponert for løsningsmiddel og en mangel på aminosyrerest-identitet eller homologi ved visse posisjoner mellom CD28 og CTLA4. Likeså anses hvilken som helst rest som romlig er i tett nærhet (5 til 20 Ångstrøm Enheter) til de identifiserte restene som del av foreliggende oppfinnelse.

For å syntetisere og screene oppløselige CTLA4 mutantmolekyler med endrede affiniteter for CD80 og/eller CD86, ble det tatt i bruk en totrinns strategi. Forsøkene medfører først å frembringe et bibliotek av mutasjoner ved et spesifikt kodon av en ekstracellulær del av CTLA4 og deretter screene disse ved BIAcoreanalyse for å identifisere mutanter med endret reaktivitet til CD80 eller CD86. Biacore analysesystemet (Pharmacia, Piscataway, N.J.) anvender et overflate plasmon resonans detektorsystem som hovedsakelig omfatter kovalent binding av enten CD80Ig eller CD86Ig til en dekstran-belagt sensorchip som er lokalisert i en detektor. Testmolekylet kan deretter injiseres inn i kammeret inneholdende sensorchipen og mengden av komplementært protein som binder kan bedømmes basert på endringen i molekylvekt som er fysisk forbundet med den dekstranbelagte siden av sensorchipen; endringen i molekylvekt kan måles ved detektorsystemet.

FORDELER IFØLGE OPPFINNELSEN

Fordi CTLA4-binding til CD80 og CD86 er karakterisert ved raske “on”-rater og raske dissosiasjons (“off”)-hastigheter og fordi CTLA4Ig-CD86 komplekser dissosierer omtrent 5 til 8 ganger raskere enn CTLA4Ig-CD80-komplekser, ble det resonnert med at avdemping av hastigheten for dissosiasjon av CTLA4Ig fra CD80 og/eller CD86 ville resultere i molekyler med kraftigere immunosuppressive egenskaper. Følgelig er oppløselige CTLA4 mutantmolekyler som har en høyere aviditet for CD80- eller CD86-positive celler sammenlignet med villtype CTLA4 eller ikke-muterte former av CTLA4Ig, forventet å blokkere primingen av antigenspesifikk aktiverte celler med høyere effektivitet enn villtype CTLA4 eller ikkemuterte former av CTLA4Ig.

EKSEMPLER

De følgende eksemplene er presentert for å illustrere foreliggende oppfinnelse og for å hjelpe fagfolk ved utøvelse og anvendelse av samme.

Eksemplene er ikke på noen som helst måte ment å begrense omfanget av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Dette eksemplet gir en beskrivelse av metodene anvendt for å fremstille nukleotidsekvensene som koder for de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene ifølge oppfinnelsen. En enkeltsete mutant L104EIg ble fremstilt og testet for bindingskinetikk for CD80 og/eller CD86. L104EIg-nukleotidsekvensen ble anvendt som et templat for å fremstille den dobbelt-sete mutante CTLA4-sekvensen, L104EA29YIg, som ble testet for bindingskinetikk for CD80 og/eller CD86.

CTLA4Ig kodon-basert mutagenese

En mutagenese og screenings-strategi ble utviklet for å identifisere mutante CTLA4Ig molekyler som hadde langsommere dissosiasjonshastigheten (“off” rater) fra CD80 og/eller CD86 molekyler. Enkelt-sete mutant nukleotidsekvenser ble dannet ved anvendelse av CTLA4Ig (U.S. Patenter nr: 5,844,095; 5,851,795; og 5,885,796; ATCC Aksesjonsnummer 68629) som et templat. Mutagene oligonukleotid PCR-primere ble utformet for tilfeldig mutagenese av et spesifikt cDNA-kodon ved å tillate hvilken som helst base i posisjonene 1 og 2 av kodonet, men bare guanin eller thymin i posisjon 3 (XXG/T; også kjent som NNG/T). På denne måten kunne et spesifikt kodon som koder for en aminosyre bli tilfeldig mutert til å kode for hver av de 20 aminosyrene. I dette henseende gir XXG/T mutagenese 32 potensielle kodoner som koder for hver av de 20 aminosyrene. PCR-produkter som koder for mutasjoner i tett nærhet til -M97-G107 av CTLA4Ig (se Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4; eller figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6), ble kløyvet med SacI/XbaI og subklonet inn i tilsvarende kløyvet CTLA4Ig πLN (også kjent som piLN) ekspresjonsvektor. Denne metoden ble anvendt for å danne enkelt-sete CTLA4 mutantmolekylet L104EIg (Figur 8, SEKV ID NR: 5 og 6).

For mutagenese i nærhet til S25-R33 av CTLA4Ig, ble først et stille NheI-restriksjonssete innført 5’ for denne løkken, ved PCR primer-rettet mutagenese. PCR-produkter ble kløyvet med NheI/XbaI og subklonet inn i tilsvarende kløyvede CTLA4Ig eller L104EIg-ekspresjonsvektorer. Denne metoden ble anvendt for å danne dobbelt-sete CTLA4 mutantmolekylet L104EA29YIg (Figur 7, SEKV ID NR: 3 og 4). Spesielt ble nukleinsyremolekylet som koder for enkelt-sete CTLA4 mutantmolekylet, L104EIg, anvendt som et templat for å danne dobbelt-sete CTLA4 mutantmolekylet, L104EA29YIg. piLN-vektoren som har L104EA29YIg er vist i Figur 12.

Eksempel 2

Det følgende gir en beskrivelse av screeningsmetodene anvendt for å identifisere enkelt- og dobbelt-sete mutante CTLA4 polypeptider, uttrykt fra konstruksjonene beskrevet i Eksempel 1, som viste en høyere bindingsaviditet for CD80 og CD86 antigener, sammenlignet med ikke-muterte CTLA4Ig molekyler.

Gjeldende in vitro og in vivo studier indikerer at CTLA4Ig alene er ute av stand til å fullstendig blokkere primingen av antigenspesifikke aktiverte T-celler. In vitro studier med CTLA4Ig og den ene eller andre av monoklonalt antistoff spesifikt for CD80 eller CD86 som måler hemming av T-celleproliferasjon indikerer at anti-CD80 monoklonalt antistoff ikke forsterket CTLA4Ig hemming. Imidlertid forsterket anti-CD86 monoklonalt antistoff hemmingen, hvilket indikerer at CTLA4Ig ikke var like effektiv i å blokkere CD86 interaksjoner. Disse data underbygger tidligere funn ved Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801) som viser at hemning av CD80-medierte cellulære responser krever omtrent 100 ganger lavere CTLA4Igkonsentrasjoner enn for CD86-medierte responser. Basert på disse funnene ble det formodet at de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene som har en høyere aviditet for CD86 enn villtype CTLA4 skulle være bedre i stand til å blokkere priming av antigenspesifikk aktiverte celler enn CTLA4Ig.

For dette formål ble de oppløselige CTLA4 mutantmolekylene beskrevet i Eksempel 1 ovenfor screenet ved anvendelse av en ny screeningsmetode for å identifisere mange mutasjoner i det ekstracellulære domenet av CTLA4 som forbedrer bindings-aviditeten for CD80 og CD86. Denne screeningsstrategien ga en effektiv fremgangsmåte for å direkte identifisere mutanter med tilsynelatende langsommere “off”-rater uten behov for proteinrensing eller kvantifisering siden “off”-rate-bestemmelse er konsentrasjonsuavhengig (O’Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

COS-celler ble transfektert med individuelle miniprep-renset plasmid-DNA og propagert i mange dager. Tre dagers kondisjonerte dyrkningsmedier ble påført på BIAcore biosensor-chips (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sverige) belagt med oppløselig CD80Ig eller CD86Ig. Spesifikk binding og dissosiering av mutante proteiner ble målt ved overflate plasmon resonans (O’Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem.212:457-468). Alle forsøk ble kjørt på BIAcore™ eller BIAcore™ 2000 biosensorer ved 25ºC. Ligander ble immobilisert på NCM5 sensorchips av forskningskvalitet (Pharmacia) ved anvendelse av standard N-etyl-N’-(dimetylaminopropyl) karbodiimidN-hydroksysuccinimid kobling (Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem.198: 268-277; Khilko, S.N., et al.(1993) J. Biol. Chem.

268:5425-15434).

Screeningsmetode

COS-celler dyrket i 24 brønners vevskulturplater ble transient transfektert med DNA som koder for mutant CTLA4Ig. Dyrkningsmedier inneholdende utskilt oppløselig mutant CTLA4Ig ble oppsamlet 3 dager senere.

Kondisjonerte COS celle-dyrkningsmedier fikk strømme over BIAcore biosensor chips derivatisert med CD86Ig eller CD80Ig (som beskrevet i Greene et al., 1996 J. Biol. Chem.271:26762-26771) og mutantmolekyler ble identifisert med “off”-rater langsommere enn den observert for villtype CTLA4Ig. cDNA’ene korresponderende til selekterte medie-prøver ble sekvensert og DNA ble fremstilt for å utføre større skala COS celle transient transfeksjon, fra hvilket mutant CTLA4Ig protein ble fremstilt etter protein A-rensning av dyrkningsmedier.

BIAcore analyse-betingelser og likevektsbinding data-analyse ble utført som beskrevet i J. Greene et al.1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 og som beskrevet her.

BIAcore data-analyse

Senosorgram baseliner ble normalisert til null respons-enheter (RU) før analyse. Prøver ble kjørt over simulert (”mock”)-derivatiserte strømceller for å bestemme bakgrunnsrespons enhet (RU)-verdier beroende på bulk refraktiv indeks-forskjeller mellom løsninger. Likevekt dissosiasjonskonstanter (Kd) ble beregnet fra plots av Req versus C, hvor Req er steady-state-responsen minus responsen i en simulert-derivatisert chip og C er den molare konsentrasjon av analytt. Bindingskurver ble analysert ved anvendelse av kommersiell ikke-lineær kurvetilpasning programvare (Prism, GraphPAD Programvare).

Eksperimentelle data ble først tilpasset til en modell for en enkelt ligandbinding til en enkelt reseptor (1-sete-modell, dvs. et enkelt langmuir system, A+B↔AB) og likevekt assosiasjonskonstanter (Kd=[A]•[B]\[AB]) ble beregnet fra ligningen R=Rmaks•C/(Kd+C). Deretter ble data tilpasset til den enkleste to-setemodellen for ligand-binding (dvs. til en reseptor som har to ikke-interagerende uavhengige bindingsseter som beskrevet ved ligningen R=Rmaks1•C\(Kd1+C)+Rmaks2•C\(Kd2+C)).

Goodness-of-fits for disse to modellene ble analysert visuelt ved sammenligning med eksperimentelle data og statistisk ved en F-test for ”summen av de kvadrerte avvikene fra gjennomsnittet” (”sums-of-squares”). Den enklere ettsete-modellen ble valgt som beste tilpassing, hvis ikke to-sete-modellen tilpasses betydelig bedre (p<0,1).

Assosiasjon og disassosiasjonsanalyser ble utført ved anvendelse av BIA evaluering 2,1 Programvare (Pharmacia). Assosiasjonshastighet konstanter kon ble beregnet på to måter, forutsatt både homogene enkelt-sete interaksjoner og parallelle to-sete interaksjoner. For enkelt-sete interaksjoner ble kon verdier beregnet i henhold til ligningen Rt=Req(1-exp<-ks(t-t>0), hvor Rt er en respons på et gitt tidspunkt, t; Req er steady-state-responsen; t0 er tidspunktet ved starten av injeksjonen; og ks=dR/dt=kon•Ckoff og hvor C er en konsentrasjon av analytt, beregnet i form av monomere bindingsseter. For to-sete interaksjoner ble kon verdier beregnet i henhold til ligningen Rt=Req1(1-exp<-ks1(t-t>0<)>+Req2(1-exp<ks2(t-t>0<)>. For hver modell ble verdiene av kon bestemt fra den beregnede slope (til ca.70% maksimal assosiasjon) av plots av ks versus C.

Dissosiasjons-data ble analysert i henhold til ett-sete (AB=A+B) eller to-sete (AiBj=Ai+Bj) modeller og hastighetskonstanter (koff) ble beregnet fra beste tilpassings-kurver. Bindings-sete-modellen ble anvendt bortsett fra når den resten var større enn maskin bakgrunn (2-10 RU, i henhold til maskin), i hvilket tilfelle tobindingssete-modellen ble anvendt. Halvtid av reseptor-besittelse ble beregnet ved anvendelse av relasjonen t1/2=0,693/koff.

Strømningscytometri

Murin mAb L307,4 (anti-CD80) ble anskaffet fra Becton Dickinson (San Jose, California) og IT2,2 (anti-B7-0 [også kjent som CD86]), fra Pharmingen (San Diego, California). For immunmerking ble CD80-positive og/eller CD86-positive CHO-celler fjernet fra deres dyrkingskar ved inkubering i fosfatbufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 10mM EDTA. CHO-celler (1-10 x 10<5>) ble først inkubert med mAbs eller immunglobulin fusjonsproteiner i DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), deretter vasket og inkubert med fluorescein isotiocyanat-konjugert geit anti-mus eller anti-human immunglobulin andre trinn reagenser (Tago, Burlingame, California). Celler ble gitt en endelig vask og analysert i en FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE og størrelseseksklusjonskromatografi

SDS-PAGE ble utført på Tris/glysin 4-20% akrylamidgeler (Novex, San Diego, CA). Analytiske geler ble merket med Coomassie Blue og bilder av våte geler ble oppnådd ved digital scanning. CTLA4Ig (25 μg) og L104EA29YIg (25 μg) ble analysert ved størrelseseksklusjonskromatografi ved anvendelse av en TSK-GEL G300 SWXL kolonne (7,8 x 300mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) ekvilibrert i fosfatbufret saltoppløsning inneholdende 0,02% NAN3 ved en strømningshastighet på 1,0 ml/min.

CTLA4XC120S og L104EA29YXC120S

Enkeltkjede CTLA4XC120S ble fremstilt som tidligere beskrevet (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). I korthet ble et onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4)-ekspresjonsplasmid anvendt som et templat, forover primeren,

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG

ble valgt til å matche sekvenser i vektoren; og revers primeren,

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC

svarte til de siste syv aminosyrene (dvs. aminosyrene 118-124) i det ekstracellulære domenet av CTLA4 og inneholdt et restriksjonsenzymsete og et stoppkodon (TGA). Revers primeren spesifiserte en C120S (cystein til serin i posisjon 120)-mutasjon. Spesielt blir nukleotidsekvensen GCA (nukleotidene 34-36) av revers primeren vist ovenfor erstattet med én av de følgende nukleotidsekvensene: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT eller GCT. Som fagfolk på området vil forstå er nukleotidsekvensen GCA en revers komplementær sekvens av kodonet TGC for cystein. Tilsvarende er nukleotidsekvensene AGA, GGA, TGA, CGA, ACT eller GCT de revers komplementære sekvensene av kodonene for serin. Polymerasekjedereaksjonsprodukter ble kløyvet med HindIII/XbaI og direksjonalt subklonet inn i ekspresjonsvektoren πLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXC120S ble fremstilt på en identisk måte. Hver konstruksjon ble verifisert ved DNA-sekvensering.

Identifikasjon og biokjemisk karakterisering av mutanter med høy aviditet Tjuefire aminosyrer ble valgt for mutagenese og de resulterende ~2300 mutante proteinene undersøkt for CD86Ig-binding ved overflate plasmon resonans (SPR; som beskrevet, supra). De dominerende effektene av mutagenese ved hvert sete er oppsummert i Tabell II. Tilfeldig mutagenese av noen aminosyrer i S25-R33 endret tilsynelatende ikke ligand-binding. Mutagenese av E31 og R33 og restene M97-Y102 resulterte tilsynelatende i redusert ligandbinding. Mutagenese av restene S25, A29 og T30, K93, L96, Y103, L104 og G105, resulterte i proteiner med langsomme “on” og/eller langsomme “off”-rater. Disse resultatene bekrefter tidligere funn angående at rester i S25-R33-regionen og rester i eller nær M97-Y102 påvirker ligandbinding (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058.

Mutagenese av setene S25, T30, K93, L96, Y103 og G105 resulterte i identifikasjon av noen mutante proteiner som hadde langsommere “off” rater fra CD86Ig. Imidlertid ble, i disse tilfellene, den langsomme “off”-raten kompromittert ved en langsom “on”-rate som resulterte i mutante proteiner med en total aviditet for CD86Ig som var tilsynelatende lik den sett med villtype CTLA4Ig. I tillegg resulterte mutagenese av K93 i betydelig aggregering som kan ha vært ansvarlig for de kinetiske endringene observert.

Tilfeldig mutagenese av L104 fulgt av COS celle-transfeksjon og screening ved SPR av dyrkningsmedie-prøver over immobilisert CD86Ig ga seks medieprøver inneholdende mutante proteiner med omtrent 2 ganger langsommere “off”rater enn villtype CTLA4Ig. Når det korresponderende cDNA fra disse mutantene ble sekvensert, ble hver funnet å kode for en leucin til glutaminsyre-mutasjon (L104E). Substitusjon av leucin 104 til asparaginsyre (L104D) påvirket tilsynelatende ikke CD86Ig-binding.

Mutagenese ble deretter gjentatt ved hvert sete listet opp i Tabell II, denne gangen ved anvendelse av L104E som PCR-templatet istedenfor villtype CTLA4Ig, som beskrevet ovenfor. SPR-analyse, igjen ved anvendelse av immobilisert CD86Ig, identifiserte seks dyrkningsmedie-prøver fra mutagenese av alanin 29 med proteiner som har omtrent 4 ganger langsommere “off”-rater enn villtype CTLA4Ig. De to langsomste var tyrosin-substitusjoner (L104EA29Y), to var leucin (L104EA29L), én var tryptofan (L104EA29W) og én var treonin (L104EA29T). Tilsynelatende ble ingen langsom “off” rate-mutanter identifisert når alanin 29 ble tilfeldig mutert, alene, i villtype CTLA4Ig.

Den relative molekylvekten og status for aggregering av renset L104E og L104EA29YIg ble bedømt ved SDS-PAGE og størrelseseksklusjonskromatografi. L104EA29YIg (~1 μg; brønn 3) og L104EIg (~1 μg; brønn 2) hadde tilsynelatende samme elektroforetiske mobilitet som CTLA4Ig (~1 μg; brønn 1) under reduserende (~50kDa; ßME; pluss 2-merkaptoetanol) og ikke-reduserende (~100kDa; -ßME) betingelser (FIG.10A). Størrelseseksklusjonskromatografi viste at L104EA29YIg (FIG.10C) tilsynelatende hadde samme mobilitet som dimere CTLA4Ig (FIG.10B). De største toppene representerer proteindimer mens den raskere eluerende mindre toppen i FIG.10B representerer høyere molekylvektaggregater. Omtrent 5,0% av CTLA4Ig var til stede som høyere molekylvektaggregater men det var ingen bevis for aggregering av L104EA29YIg eller L104EIg. Derfor kunne den sterkere bindingen til CD86Ig sett med L104EIg og L104EA29YIg ikke tilskrives aggregering indusert ved mutagenese.

Likevekt og kinetisk binding-analyse

Likevekt og kinetisk binding-analyse ble utført for protein A renset CTLA4Ig, L104EIg og L104EA29YIg ved anvendelse av overflate plasmon resonans (SPR). Resultatene er vist i Tabell I.

TABELL I

Likevekt og tilsynelatende kinetiske konstanter

(verdier er gjennomsnitt ± standard avvik fra tre forskjellige forsøk)

Observerte likevekt dissosiasjonskonstanter (Kd; Tabell I) ble beregnet fra bindingskurver dannet over et område av konsentrasjoner (5,0-200 nM).

L104EA29YIg binder sterkere til CD86Ig enn L104EIg eller CTLA4Ig. Den lavere Kd for L104EA29YIg (3,21 nM) enn L104EIg (6,06 nM) eller CTLA4Ig (13,9 nM) indikerer høyere bindings-aviditet for L104EA29YIg til CD86Ig. Den lavere Kd for L104EA29YIg (3,66 nM) enn L104EIg (4,47 nM) eller CTLA4Ig (6,51 nM) indikerer høyere bindings-aviditet for L104EA29YIg til CD80Ig.

Kinetisk binding-analyse viste at de komparative “on”-ratene for CTLA4Ig, L104EIg og L104EA29YIg-binding til CD80 var lignende, i likhet med “on”-ratene for CD86Ig (Tabell I). Imidlertid var “off”-rater for disse molekylene ikke ekvivalente (Tabell I). Sammenlignet med CTLA4Ig, hadde L104EA29YIg omtrent 2 ganger langsommere “off”-rate fra CD80Ig og omtrent 4 ganger langsommere “off”-rate fra CD86Ig. L104E hadde “off”-rater mellomliggende mellom L104EA29YIg og CTLA4Ig. Siden innføring av disse mutasjonene ikke betydelig påvirket “on”-rater, skyldtes økningen i aviditet for CD80Ig og CD86Ig observert med L104EA29YIg sannsynligvis primært en reduksjon i “off”-rater.

For å bestemme hvorvidt økningen i aviditet av L104EA29YIg for CD86Ig og CD80Ig skyldtes mutasjonene som påvirker måten ved hvilken hver monomer assosierte som en dimer eller hvorvidt det var aviditet-fremmende strukturelle endringer innført i hver monomer, ble enkeltkjede-konstruksjoner av CTLA4 og L104EA29Y ekstracellulære domener fremstilt etter mutagenese av cystein 120 til serin som beskrevet supra og ved Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. De rensede proteinene CTLA4XC120S og L104EA29YXC120S ble vist å være monomere ved gel-permeasjonskromatografi (Linsley et al., (1995), supra), før deres ligand-bindende egenskaper ble analysert ved SPR. Resultater viste at bindingsaffinitet for begge monomere proteinene for CD86Ig var omtrent 35-80 ganger mindre enn den sett for deres respektive dimerer (Tabell I). Dette underbygger tidligere publiserte data som fastslår at dimerisering av CTLA4 var nødvendig for høy-aviditet ligand-binding (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

L104EA29YXC120S bandt med omtrent 2 ganger høyere affinitet enn CTLA4XC120S til både CD80Ig og CD86Ig. Den økte affiniteten var beroende på omtrent 3 ganger langsommere dissosiasjonsgastighet fra begge ligander. Derfor var sterkere ligand-binding ved L104EA29Y mest sannsynlig beroende på aviditetfremmende strukturelle endringer som hadde blitt innført i hver monomere kjede heller enn endringer hvor molekylet ble dimerisert.

Lokalisering og strukturell analyse av aviditets-fremmende mutasjoner Løsnings-strukturen av det ekstracellulære IgV-lignende domenet av CTLA4 har nylig blitt bestemt ved NMR spektroskopi (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531. Dette tillot nøyaktig lokalisering av leucin 104 og alanin 29 i den tredimensjonale folden (FIG.11A-B). Leucin 104 er plassert nær den svært konserverte MYPPPY aminosyresekvensen. Alanin 29 er plassert nær den C-terminale enden av S25-R33-regionen, som romlig er i umiddelbar nærhet av MYPPPY-regionen. Selv om det er betydelig interaksjon mellom restene ved basen av disse to regionene, er det tilsynelatende ingen direkte interaksjon mellom L104 og A29 selv om de begge utgjør del av en sammenhengende hydrofob kjerne i proteinet. De strukturelle konsekvensene av de to aviditetsfremmende mutantene ble bedømt ved modellering. A29Y-mutasjonen kan lett tilpasses i kløften mellom S25-R33-regionen og MYPPPY-regionen og kan tjene til å stabilisere konformasjonen av MYPPPY-regionen. I villtype CTLA4, danner L104 omfattende hydrofobe interaksjoner med L96 og V94 nær MYPPPY-regionen. Det er svært usannsynlig at glutaminsyre-mutasjonen inntar en konformasjon lik den for L104 av to grunner. For det første er det ikke tilstrekkelig plass til å romme den lengre glutaminsyre-sidekjede i strukturen uten signifikant forstyrrelse for S25-R33-regionen. Dernest ville de energetiske kostnadene ved å begrave den negative ladningen av glutaminsyre sidekjeden i den hydrofobe region være høye. I stedet predikerer modellerings-studier at glutaminsyre-sidekjeden flipper ut til overflaten hvor dens ladning kan stabiliseres ved solvation. En slik konformasjonell endring kan lett innrettes ved G105, med minimal fordreining av andre rester i regionene.

Binding av høyaviditets mutanter til CHO-celler som uttrykker CD80 eller CD86

FACS-analyse (Fig. 2) av CTLA4Ig og mutantmolekyler som binder til stabilt transfekterte CD80+ og CD86+CHO-celler ble utført som beskrevet her. CD80-positive og CD86-positive CHO-celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av CTLA4Ig, L104EA29YIg eller L104EIg og deretter vasket. Bundet immunglobulin fusjonsprotein ble detektert ved anvendelse av fluorescein isotiocyanat-konjugert geit anti-human immunglobulin.

Som vist i Figur 2 ble CD80-positive eller CD86-positive CHO-celler (1,5x10<5>) inkubert med de angitte konsentrasjonene av CTLA4Ig (lukkede kvadrater), L104EA29YIg (sirkler) eller L104EIg (triangler) i 2 timer. ved 23ºC, vasket og inkubert med fluorescein isotiocyanat-konjugert geit anti-humant immunglobulin antistoff. Binding til totalt 5,000 viable celler ble analysert (enkelt bestemmelse) på en FACScan og gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) ble bestemt fra data histogrammer ved anvendelse av PC-LYSYS. Data ble korrigert for bakgrunnsfluorescens målt for celler inkubert med andre trinns reagens kun (MFI = 7). Kontroll L6 mAb (80 µg/ml) ga MFI < 30. Disse resultatene er representative for fire uavhengige forsøk.

Binding av L104EA29YIg, L104EIg og CTLA4Ig til humane CD80-transfekterte CHO-celler er omtrent ekvivalent (FIG.2A). L104EA29YIg og L104EIg binder sterkere til CHO-celler stabilt transfektert med human CD86 enn CTLA4Ig (FIG.2B).

Funksjonelle analyser

Humane CD4-positive T-celler ble isolert ved immunomagnetisk negativ seleksjon (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med.176:1595-1604). Isolerte CD4-positive T-celler ble stimulert med phorbal myristat acetat (PMA) pluss CD80-positive eller CD86-positive CHO-celler i nærvær av titrerende konsentrasjoner av inhibitor. CD4-positive T-celler (8-10 x 10<4>/brønn) ble dyrket i nærvær av 1 nM PMA med eller uten bestrålte CHO-celle stimulatorer. Proliferative responser ble målt ved tilsetning av 1 µCi/brønn av [3H]tymidin i løpet av de siste 7 timene av en 72 timers kultur. Hemning av PMA pluss CD80-positive CHO eller CD86-positive CHO, stimulerte T-celler ved L104EA29YIg og CTLA4Ig ble utført. Resultatene er vist i FIG.3. L104EA29YIg hemmer proliferasjon av CD80-positive PMA behandlede CHO-celler mer enn CTLA4Ig (FIG.3A). L104EA29YIg er også mer effektiv enn CTLA4Ig i å hemme proliferasjon av CD86-positive PMA behandlede CHO-celler (FIG.3B). Derfor er L104EA29YIg en mer potent inhibitor av både CD80- og CD86-mediert kostimulering av T-celler.

Figur 4 viser hemming ved L104EA29YIg og CTLA4Ig av allo stimulerte humane T-celler fremstilt ovenfor og ytterligere allo stimulert med en human B lymfoblastoid cellelinje (LCL) betegnet PM som uttrykte CD80 og CD86 (T-celler ved 3,0x10<4>/brønn og PM ved 8,0x10<3>/brønn). Primær allo stimulering forekom i 6 dager, deretter ble cellene ble pulset med<3>H-thymidin i 7 timer, før inkorporering av radioaktivt merke ble bestemt.

Sekundær allo stimulering ble utført som følger. Syv dagers primære allo stimulerte T-celler ble høstet over lymfocytt separasjons-medium (LSM) (ICN, Aurora, OH) og fikk hvile i 24 timer. T-celler ble deretter restimulert (sekundær), i nærvær av titrerende mengder av CTLA4Ig eller L104EA29YIg, ved tilsetning av PM i samme forhold som ovenfor. Stimulering inntraff i 3 dager, deretter ble cellene pulset med radioaktivt merke og høstet som ovenfor. Effekten av L104EA29YIg på primære allo stimulerte T-celler er vist i FIG.4A. Effekten av L104EA29YIg på sekundære allo stimulerte T-celler er vist i FIG.4B.

L104EA29YIg hemmer både primære og sekundære T-celle proliferative responser bedre enn CTLA4Ig.

For å måle cytokinproduksjon (Figur 5), ble duplikate sekundær allo stimulerings plater satt opp. Etter 3 dager ble dyrkningsmedier analysert ved anvendelse av ELISA kits (Biosource, Camarillo, CA) ved anvendelse av betingelser anbefalt av produsenten. L104EA29YIg ble funnet å være mer potent enn CTLA4Ig med hensyn til blokkering av T-celle IL-2, IL-4 og γ-IFN cytokinproduksjon etter et sekundært allogen stimuli (FIG.5A-C).

Effektene av L104EA29YIg og CTLA4Ig på ape blandet lymfocytt respons (MLR) er vist i Figur 6. Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’S; 3,5x10<4>celler/brønn fra hver ape) fra 2 aper ble renset over lymfocytt separasjons medium (LSM) og blandet med 2 μg/ml phytohemaglutinin (PHA). Cellene ble stimulert 3 dager deretter pulset med radioaktivt merke 16 timer før høsting. L104EA29YIg hemmet ape T-celleproliferasjon bedre enn CTLA4Ig.

TABELL II

Effekten på CD86Ig-binding ved mutagenese av CTLA4Ig ved setene listet opp

(Den dominerende effekten er angitt med et “+” tegn)

EKSEMPEL 3

Dette studiet sammenlignet effektiviteten og sikkerheten av L104EA29YIg, beskrevet ovenfor, som et vedlikeholds immunosuppresserende middel med CsA over 12 måneder når anvendt som del av et CNI-fritt kombinasjonsregime bestående av basiliximab(Simulect<®>; Novartis) induksjon, mykofenolatmofetil (MMF; CellCept<®>; Roche) og kortikosteroider i mottagere av nyretransplantat.

Voksne mottagere av et ikke-HLA-identisk nyreallograft fra en levende eller død donor var kvalifiserte. Subjekter med et tidligere nyretransplantat, en historie med panel-reaktive antistoffer på >20% eller de ansett av forskeren å ha høyere risiko for akutt avstøtning ble begrenset til <10% av studiepopulasjonen.

Eksklusjonskriterier omfattet underliggende nyresykdom av fokal og segmental glomerulosklerose, Type I eller II membranproliferativ glomerulonefritt eller hemolytisk-uremisk syndrom/trombotisk trombocytopen purpura; aktiv hepatitt B eller C eller HIV; og donoralder >60 eller <6, donorer med hjertedød eller donornyre kald iskemi tid på >36 timer.

Dette var et åpen-label, randomisert, aktiv-kontrollert, multippel-dose, multisenter-studie utført i USA, Europa og Canada. Kvalifiserte pasienter av begge kjønn med en alder på ≥18 år som gjennomgår en nyretransplantasjon (død eller levende donor, bortsett fra når donor og mottager var HLA-identiske) ble randomisert til behandling i et 1:1:1-forhold med en L104EA29YIg mer-intensivt (MI) behandlingsregime, L104EA29YIg mindre-intensivt (LI) behandlingsregime eller Cyklosporin A (CsA); alle i kombinasjon med induksjonsterapi med basiliximab (Simulect<®>; Novartis), tilleggs vedlikeholdsterapi med mykofenolatmofetil (MMF; CellCept<®>; Roche) og kortikosteroider. Begge L104EA29YIg regimene omfattet en tidlig fase, hvor L104EA29YIg ble administrert ved 10 mg/kg og en vedlikeholdsfase, hvor L104EA29YIg ble administrert ved 5 mg/kg ved q4 uke eller q8 uke intervaller. Doser for hvert regime var basert på kroppsvekt. Disse dosene ble diktert av mål bunn (”trough”) profilene vist å være effektive under ikke-humane primate studier. Disse profilene nødvendiggjorde doser som var høyere initielt, under perioden med høyest immunologisk risiko (Dag 0-90). Den tidlige fasen var lengre i MI-regimet (6 versus 3 måneder) og omfattet hyppigere dosering.

L104EA29YIg mer intensive (MI) behandlingsregimer besto av administrering av 10 mg/kg ved dagene 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 og 169, fulgt av 5 mg/kg hver 4. eller 8. uke. L104EA29YIg mindre intensivt (LI) behandlingsregime besto av 10 mg/kg ved dagene 1, 15, 29, 57 og 85, fulgt av 5 mg/kg hver 4. eller 8. uke. L104EA29YIg ble administrert i en 30 minutters intravenøs infusjon. Pasienter randomisert til CsA mottok to ganger daglige doser (7 3 mg/kg) for å oppnå det forhånds-angitte området for mål serumkonsentrasjoner på 150-400 ng/ml under den første måneden og 150-300ng/ml under månedene 2-12, som er i overensstemmelse med gjeldende medisinsk praksis. Alle pasienter mottok MMF 2 g daglig og basiliximab 20 mg hver 4. dag. Et kortikosteroid gradvis minkende regime ble også gitt bestående av en iv bolus av metylprednisolon 500 mg ved dag 1 og 250 mg ved dag 2, fulgt av oral prednison 100 mg ved dag 3, 50 mg ved dag 4, 25 mg ved dagene 5–30, 22,5 mg ved dagene 31–44, 20 mg ved dagene 45–58, 17,5 mg ved dagene 59–72, 15 mg ved dag 73–86, 12,5 mg ved dagene 87–100 og 10 mg ved dagene 101–114. Etter Dag 114, kunne prednison-dosen reduseres med 2,5 mg hver andre måned men ikke til mindre enn 5 mg pr. dag.

Det primære formålet var å demonstrere at L104EA29YIg ikke var dårligere enn CsA i å forhindre akutt avstøtning ved 6 måneder. Sekundære formål omfattet bedømmelse av forekomsten av akutt avstøtning (biopsi-bekreftet eller antatt) ved 6 måneder og 1 år; målt glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) via ioheksol utskilling ved 1, 6 og 12 måneder; parametere for hypertensjon; serumkolesterol og triglyserider; og total sikkerhet. Andre forhånds-spesifiserte analyser omfattet pasientdød eller graft-tap ved 1 år; alvorlighetsgraden av akutt avstøtning; forekomsten av posttransplantasjon diabetes mellitus [definert som hvilken som helst terapi nødvendig for hyperglykemi for >4 uker eller en hemoglobin A1C (HbA1c) >7%, hos pasienter ikke tidligere kjent å være diabetiske]; beregnet GFR, ved anvendelse av Modifikasjon av Diett i Nyresykdom (MDRD, Levey AS, Bosch JP, Lewis JP, Greene T, Rogers N, Roth D. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a new prediction equation.

Modification of Diet in Renal Disease Study Group. Ann Intern Med 1999;130:461-470), Jelliffe (RW. Creatinine clearance: Bedside estimate. Ann Inter Med.

1973;79:604-605), Cockcroft-Gault (Cockcroft DW, Gault MH. Prediction of creatinine clearance from serum creatinine. Nephron 1976;16:31-41) og Nankivell (Nankivell BJ, Gruenewald SM, Allen RD, Chapman JR. Predicting glomerular filtration rate after kidney transplantation. Transplantation.1995; 59(12):1683-1689) formler; farmakokinetikk og immunogenisitet. Diagnose og behandling av akutt avstøtning (AR) var basert på Banff 97 kriteriene og grad (Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.). En post hoc-analyse ble utført for forekomsten av kronisk allograft nefropati (CAN).

Diagnose og behandling av akutt avstøtning (AR) var basert på Banff 97 kriteriene og grad (Racusen LC, Solez K, Colvin RB, et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999;55(2):713-23.).

Intraoperative nyreallograft biopsier ble utført for å bedømme baselinje histologi. Biopsivev ble merket og gradert i henhold til Banff 97 effektiv klassifisering av nyretransplantat patologi. Biopsier ble evaluert ved en uavhengig patolog blindet for behandling for å bekrefte alle episoder av klinisk-mistenkt AR før behandling for AR.

Ytterligere endepunkter omfattet: klinisk mistenkt og biopsi bevist akutt avstøtning (CSBPAR) ved 12 måneder; død eller graft-tap ved 1 år; alvorlighetsgrad av AR episoder (målt ved anvendelse av Banff 97 skalaen); behandlingssvikt (definert som forskerens mening; ≥ grad IIB avstøtning; tilbakevendende eller steroid-resistent avstøtning); nyrefunksjon ved 1, 6 og 12 måneder (glomerulære filtrasjonshastigheter [GFR’er] bedømt ved Ioheksol utskilling) og bevis for kronisk allograft nefropati (CAN) (interstitiell fibrose og tubulær atrofi); parametere for hypertensjon (diastolisk blodtrykk [BP] ≥90 mm Hg og/eller systolisk BP ≥140 mm Hg); serumlipider; sikkerhet, tolererbarhet og ugunstige hendelser (AEs) hos pasienter behandlet med L104EA29YIg sammenlignet med CsA-behandlede pasienter.

For sikkerhet og tolerabilitet-bedømmelser, ble AEs, laboratoriemålinger (hematologi, biokjemi og urinanalyse) og vitale tegn registrert under vanlige faste kliniske visitter.

Resultater

Totalt 218 pasienter gjenomgikk nyretransplantasjon og ble randomisert til MI-gruppen (N=74), LI-gruppen (N=71) eller CsA (N=73). Baselinje demografiske og kliniske karakteristika var lik mellom de tre behandlingsgruppene. Totalt 164 pasienter fullførte 1 år med behandling. For pasientene som avbrøt før 1 år (N=16 vs 16 vs 20; MI regime versus LI regime versus CsA), var de mest vanlige årsakene AEs (N=5 versus 8 vs 9) og behandlingssvikt (N=7 versus 5 versus 3).

Forekomsten av CSBPAR inntraff sjeldent i alle behandlingsgruppene og det var ingen statistisk signifikant forskjell i forekomsten av hverken CSBPAR eller biopsi-bevist akutt avstøtning (BPAR) mellom behandlingsgruppene. Ved 6 og 12 måneder var forekomsten av CSBPAR 6,8%, 5,6% og 8,2% for MI, LI og CsA-behandling, henholdsvis.

Forekomst av BPAR var også lignende mellom grupper ved 6 og 12 måneder, selv om BPAR var litt høyere i LI-gruppen enn i de andre to gruppene (18,9%, 29,6% og 17,8% for MI, LI og CsA-behandling henholdsvis). Biopsi-bevist akutt avstøtning var hyppigere enn CSBPAR i alle behandlingsgrupper og var mest vanlig i LI-gruppen. Imidlertid ble mange av disse hendelsene funnet å forekomme hos pasienter med L104EA29YIg ved under ønskede bunn (”trough”) serumkonsentrasjoner.

Ingen statistisk signifikant forskjell mellom behandlingsgrupper ble sett i alvorlighetsgraden av AR; imidlertid var antallet lite og førte ikke til graft-tap.

Dette studiet var ublindet for å undersøke medisinering for å tillate standard for omsorg med hensyn til CsA, som sannsynligvis bidro til det økte antallet av biopsier tatt i L104EA29YIg-gruppene (N=345) sammenlignet med CsA-gruppen (N=144). Selv om dette ikke er uventet for et studie utformet på denne måten, kunne det ha økt raten av diagnose av nyre histologiske abnormiteter i L104EA29YIg behandlingsgruppene.

Død og/eller graft-tap var sjeldent i alle behandlingsgrupper, med 1 død angitt i MI-gruppen, 4 i CsA-gruppen og ingen i LI-gruppen. De fleste graft-tap ble ikke forårsaket av immunologiske hendelser og kun 3 graft ble mistet i MI og CsA-gruppene versus 1 i LI-gruppen.

Signifikante forbedringer i nyrefunksjon ble sett med L104EA29YIg -basert behandling sammenlignet med CsA-basert immunsuppresjon. Ioheksol utskilling var høyere med L104EA29YIg-behandling ved alle tidspunktene, med en gjennomsnittlig forbedring på 11 ml/min/1,73m<2>(~20%) sammenlignet med CsA ved 12 måneder.

Ved 12 måneder var kronisk allograft nefropati (CAN) mellom 30 og 50% mindre vanlig, i relative termer, i L104EA29YIg - enn CsA-behandlede pasienter. Rater for ny eller forverring av CAN ved 12 måneder var 29%, 19% og 44% for MI, LI og CsA-grupper, henholdsvis.

Ved 1 år var gjenommsnittlig systolisk blodtrykk 3–4 mmHg høyere hos pasienter behandlet med CsA (133 mmHg) versus pasienter i MI (130 mmHg) og LI (129 mmHg) behandlingsgruppene. Dette var til tross for lavere anvendelse av anti-hypertensiv medisinering i L104EA29YIg-gruppene (MI: 87,5%; LI 84,1%: CsA 92,2%). Totalt serum-kolesterol var litt lavere med L104EA29YIg (MI: 198 mg/dl; LI: 201 mg/dl) versus CsA- (212 mg/dl) behandlede pasienter selv om bruk av lipidsenkende medikamenter også var lavere med L104EA29YIg (MI: 36,1%; LI: 31,9%; CsA : 53,1%).

Fire (5,5%) pasienter døde i CsA-gruppen sammenlignet med 1 i L104EA29YIg behandlingsgruppene. Hyppigheten av ugunstige hendelser (AEs) var komparable mellom behandlingsgruppene; imidlertid var relaterte AEs betydelig lavere etter L104EA29YIg-behandling enn CsA-behandling. Intravenøs administrering av L104EA29YIg var veltolerert uten noen infusjonsreaksjoner. L104EA29YIg-behandlede pasienter viste ikke typiske CsA-relaterte ugunstige hendelser, slik som anemi, leukopeni, hirsutisme, tremor og gingival hyperplasi. L104EA29YIg-basert terapi ble ikke forbundet med noen økt risiko for infeksjoner eller maligne sykdommer sammenlignet med CsA-basert terapi.

Konklusjon

Dette 12-måneders studiet viser at L104EA29YIg-basert vedlikeholdsterapi gir ekvivalent effektivitet med hensyn til forebygging av AR pasient og graftoverlevelse sammenlignet med CsA. I tillegg viste L104EA29YIg signifikante forbedringer i nyrefunksjon og reduksjoner i CAN sammenlignet med CsA-basert vedlikeholds immunsuppresjon. L104EA29YIg var sikker og veltolerert og var ikke forbundet med typiske CNI-relaterte toksisiteter.

Hyppigheter av CSBPAR og BPAR var lignende mellom de tre behandlingsgruppene som viser at de lave AR-ratene observert med CsA-basert terapi også blir oppnådd med L104EA29YIg. Majoriteten av BPAR’er ble klassifisert som subkliniske, hvilket indikerer at nyrefunksjon ikke var svekket. Den numerisk lavere raten av AR i MI-gruppen, sammenlignet med LI-gruppen, indikerer en mulig doseavhengig respons med L104EA29YIg. Hyppigere biopsier i L104EA29YIg gruppene kunne potensielt ha ført til over-diagnose av både akutt og kronisk avstøtning i disse gruppene, hvilket indikerer at fordelene med L104EA29YIg terapi kan underdrives i dette studiet.

Majoriteten av BPAR-hendelser oppsto innenfor de første tre posttransplantasjon månedene, som ikke er uventet siden andre har vist at høyere doser av immunosuppresserende midler er nødvendig under den tidlige posttransplantasjons-perioden (Wiecek A, Nowicki M, Kokot F, Ritz E. Acute failure of the transplanted kidney--pathophysiology, diagnosis and prevention. Ann Transplant 1996;1(4):5-9 og Bennett WM. Posttransplant acute renal failure. Ren Fail 1997;19(2):225-6). Siden flertallet av disse hendelsene oppsto ved under ønskede bunn (”trough”)-verdier, skulle det tas i betraktning å endre regimet i den første måneden for behandling, før et steady state nås. Majoriteten av BPAR’ene sett under vedlikeholdsfasen oppsto ved svært lave eller udetekterbare nivåer av L104EA29YIg, hvilket indikerer at forekomsten av AR under disse periodene var relatert til utilstrekkelig immunsuppresjon, som kan unngås ved endringer i doseregimet.

Dette studiet viser at L104EA29YIg er forbundet med lignende totale AE rater sammenlignet med CsA, med færre AE’er relatert til studie medikament. Ingen reelle forskjeller i antallet av viral-relaterte AE’er ble identifisert mellom de tre behandlingsgruppene.

I nærvær av lave AR-rater, er det nye målet for opprettholdelse av immunsuppresjon reduksjon i langvarige helsekomplikasjoner, omfattende hypertensjon, hyperlipidemi, medikament-toksisitet og forhindring av arrdannelse. Som i autoimmune sykdommer, dukker det opp en ny generasjon av immunselektive vedlikeholds immunosuppressive midler. Hemming av T-celle kostimulering gjennom immunselektiv ko-stimulering blokkering med L104EA29YIg representerer et nytt paradigme, hvilket gir løfte om mer selektiv vedlikeholds immunsuppresjon, reduserte toksisiteter og forbedrede langvarige resultater ved nyretransplantasjon.

EKSEMPEL 4

Det finnes vesentlige umettede medisinske behov for nye terapier i nyretransplantasjon som kan gi kortsiktig subjekt og graftoverlevelse komparable med CNI’ene uten deres langvarige nefrotoksiske, kardiovaskulære og metabolske effekter. Behovet er spesielt stort blant mottagere av ECD karakteriserte nyreallografter, hvis langvarig subjekt og graftoverlevelsesgrad er desidert lavere enn de for mottagere av allografter fra donorer som oppfyller standard kvalifikasjonskriterier. L104EA29YIg, et immunosuppressivt middel med en ny virkningsmekanisme, er en lovende ikke-nefrotoksisk kandidat for anvendelse i nyretransplantat mottagere av ECD allografter. Fordi L104EA29YIg kan administreres på tidspunktet for transplantasjon heller enn på en forsinket måte, som ofte er nødvendig med CNI’er – spesielt i de allografter med initiell svekket nyrefunksjon – gir det immunsuppresjon på en rettidig måte og uten behov for polyklonale antilymfocytt preparater. Dette kan forklares som sammenlignbare rater for akutt avstøtning med en fordelaktig sikkerhetsprofil. Ettersom L104EA29YIg ikke er forventet å være nefrotoksisk skulle ytterligere fordeler bli sett med hensyn til allograft-struktur (dvs, CAN) og funksjon (dvs, GFR). Til slutt skulle, i motsetning til CNI’er, den målrettede virkningsmekanismen for L104EA29YIg gi immunsuppresjon uten negativt å påvirke den kardiovaskulære/metabolske profilen. En total fordel-risiko bedømmelse for anvendelse av L104EA29YIg i denne aktuelle populasjon er gitt nedenfor.

To doseregimer (som beskrevet i Eksempel 3, med en mindre modifikasjon av LI-regimet og ved anvendelse av hver 4. uke vedlikeholdsinfusjons-planen) vil bli studert.

Primære formål

1) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetningen (”composite”) av subjekt og graftoverlevelse ved 12 måneder.

2) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetningen av målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved måned 12 eller en reduksjon i målt GFR ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12.

Sekundære formål

1) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 12 måneder.

2) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på biopsibevist CAN ved 12 måneder.

3) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 3 måneder og endring fra baselinje (3 måneder) til 12 måneder.

4) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 30 ml/min/1,73 m<2>ved 12 måneder.

5) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på beregnet GFR ved 3, 12, 24 og 36 måneder og endring fra baselinje (3 måneder) til 12, 24 og 36 måneder.

6) Bestemme effektene av L104EA29YIg, relativt til CsA, på PTDM ved 12, 24 og 36 måneder.

7) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for hypertensjon ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende SBP og DBP, forekomst og utbredelse av hypertensjon og kontrollert hypertensjon og intensitet av behandlingsregime.

8) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for dyslipidemi, ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende serum totalt, ikke-HDL, lavtetthet lipoprotein (LDL) og HDL kolesterol og TGs, forekomst og utbredelse av dyslipidemi og kontrollert dyslipidemi og intensitet av behandlingsregime.

9) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på subjekt og graftoverlevelse ved 24 og 36 måneder.

10) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for akutt avstøtning ved 6 måneder, omfattende forekomsten og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning, anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyrefunksjon og forventet DGF, den initielle anvendelsen av lymfocytt-depleterende terapi for behandling av akutt avstøtning, forekomsten av steroid-resistent akutt avstøtning, forekomsten av fullstendig gjenvinning (SCr som går tilbake til baseline) etter akutt avstøtning, forekomst av subklinisk avstøtning og forekomsten av alle behandlede akutt avstøtning-episoder uansett histologiske funn.

11) Evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på QoL. 12) Bestemme den totale sikkerheten av L104EA29YIg, i forhold til CsA.

Tertiære formål

1) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på slope og intercept for beregnet GFR fra baselinje (3 måneder) til 12, 24 og 36 måneder.

2) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 45 ml/min/1,73 m<2>ved 12 måneder.

3) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med < 75 ml/min/1,73 m<2>beregnet GFR ved måned 12 og subjekter med en reduksjon i beregnet GFR fra måned 3 til måned 12 på minst 15 ml/min/1,73 m<2>.

4) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomsten av DGF.

5) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for akutt avstøtning ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende forekomsten og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning, anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyrefunksjon og forventet DGF, den initielle anvendelsen av lymfocytt-depleterende terapi for behandling av akutt avstøtning, forekomsten av steroid-resistent akutt avstøtning, forekomsten av fullstendig gjenvinning (SCr som går tilbake til baseline) etter akutt avstøtning, forekomst av subklinisk avstøtning og forekomsten av alle behandlede akutt avstøtning-episoder uansett histologiske funn.

6) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på en sammensetning (”composite”) kardiovaskulær sykdom endepunkt (erklært kardiovaskulær død, myokardinfarkt, iskemisk slag, ikke-valgfri innleggelse for kardiovaskulær årsak og perkutan koronar intervensjon) ved 12, 24 og 36 måneder.

7) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på en sammensetning (”composite”) kardiorenal sykdom endepunkt (død, graft-tap, ikkedødelig myokardinfarkt og slag) ved 12, 24 og 36 måneder.

8) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på Framingham Risiko Score ved 12, 24 og 36 måneder.

9) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomst av avbrytelse av studie-medikament.

10) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på anti-donor human leukocytt antigen (HLA)-antistoffer.

11) Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på C4d positivitet i biopsi-prøver.

Studiedesign

Varigheten av studiet er 3 år med en påfølgende 8 ukers oppfølgingsperiode for sikkerhets-evalueringer. Ved slutten av den treårige behandlingsperioden kan subjekter være kvalifisert for et langvarig utvidet studie.

Dette er et randomisert, delvis-blindet, aktiv-kontrollert, parallell-gruppe studie. Alle subjekter vil motta en nyre fra en donor med utvidede kriterier som definert nedenfor. Disse kriteriene er basert delvis på de utstedet av United Network of Organ Sharing (UNOS); de omfatter også andre trekk vanlig anvendt for å identifisere potensielt kompromitterte organer, slik som de fra donorer med hjertedød (DCD, ”non-heart beating donor”) eller med forlenget kald iskemi tid (CIT).

Omtrent 540 subjekter vil bli randomisert i et 1:1:1 forhold for behandling med enten L104EA29YIg (MI regime), L104EA29YIg (LI-regime) eller CsA. Alle subjekter vil også motta induksjon med basiliximab og et bakgrunn vedlikeholds immunosuppressivt regime av MMF og kortikosteroider. Subjekter randomisert til MI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) ved dagene 1 og 5, deretter hver 2. uke til og med måned 3 (Ukene 2, 4, 6, 8, 10 og 12) og deretter hver 4. uke til og med 6 måneder (Ukene 16, 20 og 24). Etter 6 måneder vil subjekter i MI-behandlingsgruppen motta vedlikeholdsdosen på L104EA29YIg 5 mg/kg administrert hver 4. uke inntil fullførelse av forsøket ved 36 måneder. Subjekter randomisert til LI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) på dager 1 og 5 og deretter hver 2. uke til og med måned 1 (Ukene 2 og 4) og hver 4. uke til og med måned 3 (Ukene 8 og 12). Etter 3 måneder vil subjekter i LI-behandlingsgruppen motta vedlikeholdsdosen av L104EA29YIg 5 mg/kg administrert hver 4. uke inntil fullføring av forsøket ved 36 måneder.

Blinding mellom LI og MI-gruppene vil bli opprettholdt med anvendelse av placebo-infusjoner i LI-behandlingsgruppen ved ukene 6 og 10. Subjekter randomisert til CsA vil motta doser to ganger daglig som er utformet for å oppnå en spesifisert bunn (”trough”) serum konsentrasjonsområde i overensstemmelse med gjeldende medisinsk praksis.

Anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater (Thymoglobulin eller ATGAM ) er tillatt - men ikke nødvendig - for subjekter randomisert til CsA som opplever svekket nyreallograft-funksjon og forventet DGF. Disse midlene er vanlig anvendt i denne egenskapen, hvilket gir immunsuppresjon inntil graft-funksjon gjenvinnes for administrering av CsA. Avgjørelsen om å anvende og dosere et polyklonalt antilymfocytt preparat i denne kliniske settingen er etter forskerens skjønn innenfor metodens retningslinjer. Sikkerheten og effektiviteten av L104EA29YIg vil bli bedømt ved 1, 2 og 3 år.

Primære resultat-mål

Hvert L104EA29YIg-baserte regime vil bli sammenlignet med det CsA-baserte regimet ved de følgende primære effektivitet resultat-målene: (1) sammensetningen (”composite”) av subjekt og graftoverlevelse ved 12 måneder; (2) sammensetningen av målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved måned 12 eller en reduksjon i målt GFR ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12. Hensikten er å demonstrere ikke-underlegenhet for død og graft-tap og overlegenhet for nyrefunksjon. Endepunktet for subjekt og graft-overlevelse ble valgt siden disse målene er de viktigste kliniske resultatene for allograft-mottagere. Selv om allograft-tap kan forhindres ved effektiv immunsuppressiv terapi, kan samme terapi øke risiko for død fra infeksjon, PTLD, malign sykdom, nefrotoksisitet eller kardiovaskulær sykdom. Således er de passende for å undersøke det sammensatte endepunktet for subjekt og graft-overlevelse som et oppsummerende mål for netto fordelen med immunosuppressive terapi for allograft-mottagere. Dette sammensatte endepunktet har den ytterligere fordelen av å være vurderbart i alle subjekter uten bias på grunn av manglende data eller feilklassifisering av subjekt.

Nyrefunksjon som et endepunkt ble valgt siden relasjonen mellom posttransplantasjon nyrefunksjon og langsiktig nyreresultat gjentatte ganger har blitt vist i forskjellige settinger. Assosiasjonen er til stede hvorvidt nyrefunksjon blir målt noen få dager etter transplantasjon, på tidspunktet for utskrivning fra sykehuset eller ved 6 og 12 måneder etter transplantasjon. Den har blitt observert i mottagere av nyrer fra levende og døde donorer, i mottagere av nyrer fra yngre og eldre døde donorer, i andre transplantat-mottagere og i voksne og pediatriske mottagere.

Resultater av multisenter undersøkelser bekrefter betydningen av SCr for predikering av langvarig graft-overlevelse. Relasjonen mellom nyrefunksjon og langvarig prognose er sterk og reproduserbar, men ikke strengt lineær. I en analyse av voksne nyre- transplantat mottagere, avslørte undersøkelse av relasjonen mellom SCr ved 1 år og projektert median graft halveringstid et tydelig vendepunkt ved SCr > 1,5 mg/dl. Tilsvarende avslørte undersøkelse av relasjonen mellom forandring i SCr fra 6 måneder til 1 år (Δ SCr) og projektert median graft halveringstid et tydelig vendepunkt ved Δ SCr ≥0,3 mg/dl. Følgelig er både det absolutte nivået av nyrefunksjon ved 1 år og forandringen i nyrefunksjon fra 6 måneder (eller et lignende stabilt, tidlig posttransplantasjons-tidspunkt) til 1 år egnet for anvendelse som resultat-mål. Tilstedeværelsen av ikke-lineæritet i relasjonen av nyrefunksjon til langvarig resultat indikerer at bestemte mål av nyrefunksjon ville være av større klinisk relevans enn dimensjonale. Terskelverdier på > 1,5 mg/dl ved 1 år for nyrefunksjon og forandring i SCr på ≥0,3 mg/dl fra måned 6 til år 1 synes passende.

I studiene referert ovenfor ble den prognostiske betydningen av nyrefunksjon demonstrert ved anvendelse av SCr som en markør. Disse studiene var generelt for store for å anvende direkte målinger av glomerulær filtrering.

Begrensningene av SCr som en markør for nyrefunksjon er velkjent. SCr-nivåer reflekterer primært balansen mellom nyreutskilling av creatinin og endogen dannelse av creatinin. Den sistnevnte kan være betydelig påvirket av variasjoner i muskelmasse, infeksjon, inflammasjon og steroid anvendelse, som alle er vanlige i transplantasjon-populasjonen. Videre kan nyreutskilling av creatinin forekomme ved 2 ruter - glomerulær filtrering og sekresjon i tubuli. Innvirkningen av tap av glomerulær filtrering på SCr blir vanligvis maskert ved kompensasjonsøkninger i tubuli sekresjon og nytten av økt SCr som en markør for nyresvekkelse er derved redusert. Det har vært beregnet at 40% av subjekter med redusert GFR vil ha normal eller lav SCr. En rekke formler har blitt utviklet som søker å forbedre korrelasjonen mellom SCr og GFR ved å gjøre rede for effekten av demografiske og biometriske faktorer. Nivået av overensstemmelse mellom GFR beregnet fra forskjellige formler og reell GFR målt ved inulin utskilling ble studert i 294 transplantat-mottagere med stabil nyrefunksjon. Proporsjonen av predikerte GFR-verdier som avviker fra målt inulin-utskilling med minst 10 ml/min/1,73 m<2>varierte fra 34% for Jelliffe-formelen til 53% for Nankivell formelen. Formelen foreslått av Levey et al vil anvendes for å beregne GFR i dette studiet. Denne formelen har blitt vist å predikere GFR mer nøyaktig i transplantasjon populasjonen, som har den beste korrelasjonen mellom predikert og målt verdi enn andre formler, slik som Nankivell. Gitt den vesentlige forskjellen mellom den virkelige GFR og beregnet GFR, vil utskilling ved en riktig glomerulær filtreringsmarkør anvendes for å bedømme det primære endepunktet av nyrefunksjon (Appendix 1). En GFR på 60 ml/min/1,73 m<2>eller endring i GFR på minst 10 ml/min/1,73 m<2>, vil anvendes som det omtrentlige likedannete for terskelverdiene av SCr på 1,5 mg/dl eller endring i SCr på minst 0,3 mg/dl etablert i store epidemiologiske studier.

Endringskomponenten av det sammensatte endepunktet vil bli bedømt fra månedene 3 til 12, siden posttransplantasjon nyrefunksjon er overveiende stabil ved måned 3.

Andre resultat-mål

De viktigste sekundære målene er å evaluere effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 12 måneder og på biopsi-bevist CAN ved 12 måneder. Disse endepunktene er utskilt fra andre sekundære endepunkt for å understreke deres betydning i evalueringen av L104EA29YIg. Som beskrevet ovenfor kan den funksjonelle nefron-massen og nyre-reserve i ECD nyrer lett reduseres på tidspunktet for transplantasjon beroende på donoregenskaper (f.eks. eldre alder, kardiovaskulære ko-morbiditeter, anskaffelsesmetoder og CIT) med resulterende subjekt og graft-overlevelsesgrad som er godt under den observert med standard kriterier donororganer. Siden nyrefunksjon potensielt er redusert ved tidspunkt for transplantasjon, er det mulig at en vesentlig proporsjon av subjekter kan oppfylle kriterier for det koprimære nyrefunksjon endepunktet på tidspunktet for innføring i studiet eller bestemmelse av baselinje nyreallograftfunksjon. Følgelig er et vesentlig sekundært formål for fremgangsmåten å evaluere virkningene av L104EA29YIg, relativt til CsA, i forskjellen i målt GFR ved 12 måneder. Dette vesentlige sekundære endepunktet tillater innsikt i virkningene av L104EA29YIg, sammenlignet med CsA, uavhengig av preeksisterende donor variabilitet i denne ECD-populasjonen. Det bidrar også til evaluering av nyrefunksjon totalt og styrker ytterligere konklusjonen om at L104EA29YIg tilveiebringer en signifikant medisinsk fordel i nyretransplantat-mottagere. Det gjenværende vesentlige sekundære formålet er den biopsi-beviste CAN ved 12 måneder. CAN er neste kun etter død med et fungerende graft som den ledende årsak til sent nyreallograft-tap. Paradoksalt nok er CNI’er antatt å bidra til CAN gjennom direkte (dvs, direkte nefrotoksiske effekter) og indirekte reaksjonsveier (dvs, ugunstige kardiovaskulære og metabolske effekter). Beroende på dens spesifikke virkningsmekanisme er det usannsynlig at L104EA29YIg er verken direkte nefrotoksisk eller negativt endrer kardiovaskulærr og metabolske parametere.

I eksemplet ovenfor ble fordelaktige effekter sett i den reduserte forekomsten av CAN blant L104EA29YIg-behandlede subjekter. I foreliggende studie, ville tilveiebringelse av en reduksjon i forekomsten av CAN, sammen med en forbedring i nyrefunksjon, styrke konklusjonen om at L104EA29YIg tilveiebringer en betydelig medisinsk fordel i mottagere av nyretransplantat.

Effektiviteten av L104EA29YIg i forhindring av akutt avstøtning vil bli bedømt ved en rekke resultat-mål. Disse omfatter dens forekomst, alvorlighetsgrad, mottagelighet for terapi og resultat. Tolkningen av disse målene blir imidlertid komplisert av intrinsiske forskjeller i L104EA29YIg og CsA. L104EA29YIg blir administrert på tidspunktet for transplantasjon, mens CsA blir initiert straks det er bevis for begynnende nyrefunksjon. Det er antatt at noen subjekter randomisert til CsA i dette studiet vil motta et polyklonalt antilymfocytt preparat for å gi immunosuppressiv behandling hvis initiell nyrefunksjon er svekket og DGF er forventet. Denne terapeutiske virkningen kan forhindre eller maskere utviklingen av akutt avstøtning i CsA-behandlede subjekter og gjøre subjektet ikke evaluerbart for resultat-målene for akutt avstøtning. Fordi det er unødvendig å gå til lignende handling i subjekter randomisert til L104EA29YIg – som behandles fra tidspunktet for transplantasjon – er den komparative bedømmelsen av akutt avstøtning ulik. For å mer nøyaktig vurdere effektiviteten av L104EA29YIg i forhindring av akutt avstøtning, vil anvendelse av polyklonale lymfocytt preparater i denne evnen også bli angitt sammen med andre mål for akutt avstøtning.

Studiepopulasjon

Studiepopulasjonen omfatter mottagere av nyreallografter som er potensielt suboptimale på grunn av donor karakteristika, anskaffelsesmetoder, CIT eller andre faktorer. De spesifikke kvalifikasjonskriteriene er basert på de ”utvidede kriteriene” for organdonasjon utstedet av UNOS. Mottagere av nyrer fra donorer med utvidete CIT eller fra DCDs, vil også være berettiget. Generelt vil immunologiske kriterier ikke spille en vesentlig rolle i subjektseleksjon. Subjekter ved varierende nivåer av immunologisk risiko er kvalifiserte. Studiet vil imidlertid utelukke subjekter med høyest immunologisk risiko (positiv kryssmatch, panel reaktive antistoffer [PRA] på ≥30% eller de tidligere transplantert). Disse subjektene kan kreve terapi for å redusere deres antistoff-mengde, slik som plasmaferese, som er utenfor omfanget av denne protokollen. Subjekter vil bli innført ved omtrent 90 steder globalt.

Primære effektivitet resultat-mål

1) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetningen (”composite”) av subjekt og graftoverlevelse ved 12 måneder.

2) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetningen av målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved måned 12 eller en reduksjon i målt GFR ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12.

Sekundær effektivitet resultat-mål

1) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 12 måneder.

2) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på biopsibevist CAN ved 12 måneder.

3) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 3 måneder og forandring fra baselinje (3 måneder) til 12 måneder. 4) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 30 ml/min/1,73 m<2>ved 12 måneder.

5) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på beregnet GFR ved 3, 12, 24 og 36 måneder og forandring fra baselinje (3 måneder) til 12, 24 og 36 måneder.

6) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på PTDM ved 12, 24 og 36 måneder.

7) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for hypertensjon ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende SBP og DBP, forekomst og utbredelse av hypertensjon og kontrollert hypertensjon og intensitet av behandlingsregime.

8) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for dyslipidemi, ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende serum totalt, ikke-HDL, LDL og HDL kolesterol og TG’er, forekomst og utbredelse av dyslipidemi og kontrollert dyslipidemi og intensitet av behandlingsregime.

9) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på subjekt og graft-overlevelse ved 24 og 36 måneder.

10) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for akutt avstøtning ved 6 måneder, omfattende forekomsten og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning, anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyrefunksjon og forventet DGF, den initielle anvendelsen av lymfocytt-depleterende terapi for behandling av akutt avstøtning, forekomsten av steroid-resistent akutt avstøtning, forekomsten av fullstendig gjenvinning (SCr går tilbake til baseline) etter akutt avstøtning, forekomsten av subklinisk avstøtning og forekomsten av alle behandlede akutte avstøtnings-episoder uansett histologiske funn. 11) Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på QoL 10) Bedømme den totale sikkerheten av L104EA29YIg, i forhold til CsA.

Tertiære resultat-mål

1) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på slope og intercept av beregnet GFR fra baselinje (3 måneder) til 12, 24 og 36 måneder.

2) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 45 ml/min/1,73 m<2>ved 12 måneder.

3) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med < 75 ml/min/1,73 m<2>beregnet GFR ved måned 12 og subjekter med en reduksjon i beregnet GFR fra måned 3 til måned 12 på minst 15 ml/min/1,73 m<2>.

4) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomsten av DGF.

5) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål for akutt avstøtning ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende forekomsten og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning, anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyrefunksjon og forventet DGF, den initielle anvendelsen av lymfocytt-depleterende terapi for behandling av akutt avstøtning, forekomsten av steroid-resistent akutt avstøtning, forekomsten av fullstendig gjenvinning (SCr går tilbake til baseline) etter akutt avstøtning, forekomsten av subklinisk avstøtning og forekomsten av alle behandlede akutte avstøtnings-episoder uansett histologiske funn. 6) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på et sammensatt kardiovaskulær sykdom endepunkt (erklært kardiovaskulær død, myokardinfarkt, iskemisk slag, ikke-valgfri innleggelse for kardiovaskulær årsak og perkutan koronar intervensjon) ved 12, 24 og 36 måneder.

7) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på en sammensatt kardiorenal sykdom endepunkt (død, graft-tap, ikke-dødelig myokardinfarkt og slag) ved 12, 24 og 36 måneder.

8) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på Framingham Risiko Score ved 12, 24 og 36 måneder.

9) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomst av avbrytelse av studie-medikament.

10) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på anti-donor HLA-antistoffer.

11) Bedømme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på C4d positivitet i biopsi-prøver.

Definisjon av Graft-tap Graft-tap er definert som enten funksjonelt tap eller fysisk tap. Funksjonelt tap vil være definert som et forlenget nivå av SCr ≥ 6,0 mg/dl (530 mol/l) som bestemt ved det sentrale laboratoriet for ≥ 4 uker eller ≥ 56 påfølgende dager av dialyse eller svekkelse av nyrefunksjon i en slik grad at subjektet mottok et andre transplantat. Alle årsaker til graft-tap vil bli avgjort ved en uavhengig EAC.

Definisjon av Forsinket Graft Funksjon (DGF) DGF er definert som behandling med dialyse ved studiets dag 8 (postoperativ dag 7).

Definisjon av Kronisk Allograft Nefropati (CAN) Biopsi-bevist CAN vil bestemmes av en blindet sentral histopatolog ved anvendelse av Banff 97 effektiv klassifisering av nyretransplantasjon patologi. Forekomsten av CAN vil bestemmes ved å sammenligne alle post-Dag 1 biopsier med baselinje-biopsier oppnådd på tidspunktet for transplantasjon. Denne sammenligningen etablerer tilstedeværelsen og alvorlighetsgraden av hvilken som helst preeksiterende histopatologi som senere kan tolkes som CAN.

Definisjon av Posttransplantasjont Diabetes Mellitus PTDM vil bli definert i henhold til definisjonen angitt ved en nyere internasjonal konsensus retningslinje.20 Disse kriteriene er oppsummert som: a) Symptomer på diabetes pluss tilfeldig plasmaglukose (PG) konsentrasjon ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/L) ELLER

b) fastende plasmaglukose (FPG) ≥ 126 mg/dl (7,0 mmol/l) ELLER c) 2-timers PG ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l) under en oral glukose toleransetest OG d) en bekreftende laboratorietest basert på målinger av venøs PG må utføres ved en annen dag i fravær av tvetydig hyperglykemi ledsaget av akutt metabolsk dekompensasjon. Studiet vil anvende FPG for evaluering av PTDM, imidlertid, dersom subjekter blir evaluert ved anvendelse av disse andre metodene og funnet å oppfylle kriteriene ovenfor, vil de bli betraktet som å ha PTDM.

Definisjon av mål for hypertensjon Hypertensjon vil være som definert i dette studiet i henhold til den sjuende rapporten til Joint National Committee on the Prevention, Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Pressure21 for subjekter med kronisk nyresykdom. Denne definisjonen er basert på SBP ≥ 130 mm Hg eller DBP ≥ 80 mm Hg. I tillegg er alle subjekter som har en SBP < 130 mm Hg og en DBP < 80 mm Hg som mottar en antihypertensiv medisinering(er) for indikasjon av hypertensjon eller med en medisinsk historie av hypertensjon omfattet i denne definisjonen. Forekomsten av hypertensjon er definert som proporsjonen av subjekter som utvikler hypertensjon etter randomisering og transplantasjon. Utbredelsen av hypertensjon er definert som proporsjonen av subjekter ved hvilket som helst gitt tidspunkt som svarer til den ovenfor angitte definisjonen av hypertensjon. Kontrollert hypertensjon er definert som en SBP < 130 mm Hg og en DBP < 80 mm Hg mens de mottar en antihypertensiv medisinering for indikasjon for hypertensjon eller som mottar en antihypertensiv medisinering for en annen indikasjon med en medisinsk historie av hypertensjon. Subjekter med en SBP < 130 mm Hg og en DBP < 80 mm Hg som er foreskrevet en antihypertensiv medisinering(er) for en indikasjon(er) forskjellig fra hypertensjon (f.eks. betablokkere for forebygging av migrene) uten noen medisinsk historie med hypertensjon vil ikke bli betraktet som å ha verken hypertensjon eller kontrollert hypertensjon. Intensitet av behandlingsregime er definert som den totale mengden av antihypertensive medikamenter anvendt for å kontrollere hypertensjon. Alle antihypertensive medikamenter vil bli tellet for indikasjon av hypertensjon i subjekter med hypertensjon eller kontrollert hypertensjon siden de antihypertensive effektene er til stede uavhengig av indikasjon.

Definisjon av mål for dyslipidemi Dyslipidemi er definert i henhold til nyere retningslinjer fra National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKF-K/DOQI).22 Dyslipidemi er definert som hypertriglyseridemi (TG’er ε 500 mg/dl [5,65 mmol/l]), hyperkolesterolemi (LDL ε 100 mg/dL [2,59 mmol/l]) eller forhøyet ikke-HDL (ikke-HDL ε 130 mg/dL [3,36 mmol/l]) i nærvær av høy TG’er (TG’er ε 200 mg/dl [2,26 mmol/l. Kontrollert dyslipidemi er definert i dette studiet som subjekter som mottar farmakologisk behandling for én av de ovenfor angitte dyslipidemiene som med hell er behandlet og deres lipidverdier faller under tersklene beskrevet i det forrige avsnittet. Noen av disse midlene har spesifikke forsiktighetsregler og/eller advarsler angående utgangsdosen eller maksimal anbefalt dose med ledsagende anvendelse av CsA, dosering med nyre utilstrekkelighet eller kan forårsake endringer av CsA PK. Viser til det passende pakningsvedlegget for spesifikke anbefalinger. Hvilket som helst annet middel (dvs, ikke-statin terapi) anvendt som et antihyperlipidemisk middel vil bli ansett som Nivå I behandlingsintensitet. Ledsagende anvendelse av et statin og et middel av en annen klasse (f.eks. ezetimib) vil heve intensitetsnivå av statin-terapi ved 1 nivå; derfor er mer enn 5 intensitetsnivåer mulig.

Akutt avstøtning vil bli definert som en klinisk-patologisk hendelse som krever klinisk bevis og biopsi bekreftelse. Allograft biopsier vil bli evaluert for tilstedeværelsen og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning av en blindet sentral uavhengig patologt ved anvendelse av Banff 97 effektiv klassifisering av nyretransplantasjon patologi. I analysene av akutt avstøtning vil biopsi tolkning og klassifisering av sentral patolog erstatte lokal tolkning. Biopsier utført for mistenkt akutt avstøtning som ikke fullstendig oppfyller kriteriene, men er tolket av den sentrale patologen som akutt avstøtning og fører til behandling for akutt avstøtning, vil bli tellet som akutt avstøtning. Subklinisk avstøtning er definert som histologiske funn ved den sentrale patologen i overensstemmelse med akutt avstøtning, men som mangler dens kliniske korrelat. Steroid-resistent akutt avstøtning er definert som mangler på forbedring i SCr og/eller histologiske funn som nødvendiggjør anvendelse av lymfocytt-deplesjons terapi etter behandling med kortikosteroider. Framingham Risiko Score Denne risiko-scoren anvender data fra Framingham Hjerte Studie23 for å bedømme 10-års risiko for ”streng” koronar hjertesykdom (myokardinfarkt og koronar død). Risikofaktorene omfattet i denne beregningen er alder, kjønn, total kolesterol, HDL kolesterol, SBP, diabetes, behandling for hypertensjon og eventuelt sigarettbruk i den foregående måneden.

Bestemmelse av prøve-størrelse

Det primære formålet er å bedømme effekten av L104EA29YIg på subjekt og graft-overlevelsesgrad og nyrefunksjon ved 12 måneder sammenlignet med CsA. De 2 ko-primære endepunkter er: (1) proporsjonen av subjekter med et overlevende graft ved 12 måneder posttransplantasjon og (2) proporsjonen av subjekter hvis målt GFR ved 12 måneder er < 60 ml/min/1,73 m<2>og/eller hvis målt GFR minsket ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12. En prøve-størrelse på 180 subjekter pr. behandlingsgruppe vil gi 83% evne til å fastslå at den øvre grensen for den 97,3% 2-sidede CI’er for den absolutte forskjellen (mellom hvert L104EA29YIg-regime og CsA-regimet) i det første ko-primære endepunktet (subjekt og graft-overlevelse) ikke vil overstige 10%, hvis den riktige subjekt og graft-overlevelsesraten ved 12 måneder er 80% for CsA-regimet og 83% for hver av 2 L104EA29YIg-regimene. For nyrefunksjon endepunktet, er prøvestørrelsen på 180 subjekter pr. gruppe bemyndiget til å detektere en reduksjon på 25% i proporsjonen av subjekter som svarer til de målte GFR endepunktet for hvert L104EA29YIg-regime sammenlignet med CsA-regimet, forutsatt at 75% av CsAsubjekter svarer til nyrefunksjon endepunkt og 25% frafall pr. behandlingsgruppe. Totalt vil 180 subjekter pr. behandlingsgruppe gi minst 80% bemyndigelse til å detektere 1 L104EA29YIg regime som svarer til begge ko-primære endepunkter med total Type I error kontrollert ved 0,05 signifikansnivå (Dunnett justering).

Inklusjonskriterier

Mål-populasjon: 1) subjektet er en førstegangs mottager av et nyretransplantat fra en død donor 2) Donoren og/eller donornyre oppfyller minst 1 av de følgende utvidede kriteriene for organdonasjon: a) Donoralder ≥ 60 år ELLER b) Donoralder 50 – 59 år og 1 av de følgende: (i) Cerebrovaskulær episode (CVA) hypertensjon SCr > 1,5 mg/dl ELLER (ii) CVA hypertensjon ELLER (iii)CVA SCr > 1,5 mg/dl ELLER (iv) Hypertensjon SCr > 1,5 mg/dl ELLER c) CIT ≥ 24 timer, donoralder > 10 år ELLER d) Donor med hjertedød (”non-heart beating donor”) 3) Menn og kvinner, i alderen 18 og eldre, innbefattet 4) WOCBP må anvende en adekvat fremgangsmåte for prevensjon for å unngå graviditet gjennom hele studiet og i opptil 8 uker etter studiet på en slik måte at risiko for graviditet er minimalisert WOCBP inkluderer hvilken som helst kvinne som har opplevd første menstruasjon og som ikke har gjennomgått vellykket kirurgisk sterilisering (hysterektomi, bilateral tubal ligering eller bilateral ooforektomi) eller er ikke postmenopausal (definert som amenoré ≥ 12 påfølgende måneder; eller kvinner på hormonerstatningsterapi med dokumentert serum follikkelstimulerende hormon-nivå > 35 mIU/ml). Selv kvinner som anvender orale, implanterte eller injiserbare befruktningshindrende hormoner eller mekaniske produkter slik som en intrauterin anordning eller barriere-metoder (pessar, kondomer, spermicider) for å forhindre graviditet eller praktiserer avholdenhet eller hvor partneren er steril (f.eks. vasektomi), skulle anses å ha befruktningsdyktig potensiale. WOCBP må ha en negativ serum graviditetstest (minimum sensitivitet 25 IU/l eller ekvivalente enheter av humant chorion gonadotropin [HCG]) innen 72 timer før starten av studie-medisinering. 5) Menn må anvende en tilfredsstillende metode for befruktningshindring gjennom hele studiet og i opptil 8 uker etter siste infusjon, slik at risiko for graviditet hos deres partnere er minimalisert.

Eksklusjonskriterier

1) WOCBP som er uvillige eller ute av stand til å anvende en akseptabel metode for å unngå graviditet i hele studieperioden og i opptil 8 uker etter siste infusjon. 2) Kvinner som er gravide eller ammer 3) Kvinner med en positiv graviditetstest ved innføring eller før administrering av studie-medikament 4) Menn uvillige eller ute av stand til å anvende en tilfredsstillende metode for prevensjon i hele studieperioden og i opptil 8 uker etter siste infusjon av studie-medisinering 5) Donoralder < 10 år 6) Subjekter med underliggende nyresykdom av: a) Fokal segmental glomerulosklerose (biopsi bevist) b) Type I eller II membranoproliferativ glomerulonefritt c) hemolytisk-uremisk syndrom/trombotisk trombocytopen purpura syndrom7) Subjekter med vanlig PRA ≥ 30% 8) Subjekter med en positiv T-celle lymfocytotoksisk kryssmatch 9) Subjekter med hvilket som helst tidligere fast organ transplantat (omfattende nyre) 10) Subjekter som mottar et samtidig fast organ (hjerte, lever, bukspyttkjertel) eller celle (øy, benmarg, stamcelle) transplantat 11) Subjekter som mottar parete nyrer fra de utvidete kriteriene donor (dobbelt nyretransplantat) 12) Subjekter som er hepatitt C antistoff-positive eller polymerasekjedereaksjon (PCR)-positive for hepatitt C 13) Subjekter som er hepatitt B overflate antigen-positive eller PCR-positive for hepatitt B 14) Subjekter med kjent human immunsvikt-virus (HIV)-infeksjon 15) Subjekter med aktiv tuberkulose (TB) som krever behandling innen de foregående 3 år eller hvilket som helst subjekt som tidligere krevde trippel (eller mer) kombinasjonsterapi for TB. Subjekter med et kjent positivt renset protein derivat (PPD) vil ikke være kvalifisert for studiet hvis ikke de fullførte behandling for latent TB og har en negativ brystrøntgen på tidspunktet for innføring. PPD-testing utført innenfor siste 12 måneder er akseptabelt så lenge det er dokumentasjon for resultatene.

Subjekter uten en PPD i de siste 12 månedene som har et tidligere negativt result kan innføres hvis de også har et negativt brystrøntgen ved innføring, ingen symptomer indikative for TB, ingen kjente TB-kontakter, ikke for tiden oppholder seg i, nylig reist til eller tidligere innvandret fra et område endemisk for TB. En PPD respons som er ≥ 10 mm i varighet eller et Heaf score på > 1 i ikke-Bacille Calmette-Guérin (ikke-BCG) immuniserte subjekter eller > 2 i BCG-immuniserte subjekter skulle anses som en positiv test. Mer konservative kriterier kan anvendes i henhold til de publiserte retningslinjene og/eller lokale standarder godkjent av det medisinske samfunnet 16) Subjekter med hvilken som helst aktiv infeksjon eller andre kontraindikasjoner som normalt ville utelukke transplantasjon 17) Subjekter hvis forventet levealder er alvorlig begrenset av sykdomstilstand eller annen underliggende medisinsk tilstand 18) Subjekter med en historie av kreft (andre enn ikke-melanom hudcelle kreft kurert ved lokal reseksjon) innen siste 5 år 19) Subjekter med en historie av stoffmisbruk (medikament eller alkohol) innen de siste 5 årene eller psykotiske lidelser som ikke er kompatible med tilstrekkelig studie oppfølging 20) Subjekter med aktivt magesår sykdom, kronisk diaré eller gastrointestinal malabsorpsjon 21) Subjekter med lokale laboratorieverdier som er Common Toksisitet Kriterier (CTC) Grade II eller høyere kan ikke delta i studiet. Imidlertid vil visse spesifiserte laboratorie-parametere som er unntak til CTC Grade II være tillat. De følgende toleransene er registrert:

Hematologi: Hemoglobin kan være under CTC Grade II (men ikke under 8 g/dl) Blodplater kan være under CTC Grade II, men ikke under 80,000/mm3 (80 x 109/l) Total hvite blodcelle (WBC) tellinger kan være under CTC Grade II, men ikke under 3000/mm3 (3 x 109/l) Granulocytt og lymfocytt-tellinger kan ha hvilken som helst verdi Kjemi: SCr og blod urea nitrogen (BUN)-verdier kan ha hvilken som helst verdi. Blodglukose kan ha hvilken som helst verdi Urinalyse: Urinalyseresultater kan ha hvilken som helst verdi 22) Alle kvinner på 40 år eller eldre og kvinner ved hvilken som helst alder som har første grad slektninger med en historie med brystkarsinom eller som har andre risikofaktorer for brystkarsinom, må har et screening mammogram eller gi resultater av et screening mammogram utført innen 6 måneder for innføring. Subjekter med et mammogram som er mistenkt for malign sykdom og i hvis muligheten for malign sykdom ikke kan akseptabelt utelukkes etter ytterligere kliniske, laboratorie eller andre diagnostiske evalueringer vil bli utelukket. Hvis screening mammogrammet ikke ble utført innen 6 måneder for innføring, men subjektet er ansett som en egnet transplantasjons kandidat ved lokale kriterier, kan baselinje mammogram oppnås innen 4 uker etter transplantasjon 23) Subjekter som har vanskelig i.v. tilgang eller andre grunner som sannsynligvis ville utelukke bedømmelse av det ko-primære endepunktet for målt GFR eller subjekter som er det er usannsynlig at de vil (f.eks. på grunn av preeksisterende koagulasjons utfall) eller uvillige til å gjennomgå metoden spesifisert 12-måneders allograft biopsi 24) Subjekter med en historie med virkelig allergi mot i.v. iodinerte røntgenkontrastmidler 25) Subjekter som har anvendt hvilket som helst medikament under utredning innen 30 dager før dag 1 visitten 26) Subjekter tidligere behandlet med L104EA29YIg 27) Arrestanter eller subjekter som er tvangsinnlagt (ufrivillig sperret inne) for behandling av enten en psykiatrisk eller fysisk (f.eks. infeksiøs sykdom) sykdom må ikke innføres i dette studiet.

Administrering av L104EA29YIg

Dag 1 er definert som dagen for transplantasjon (posttransplantasjon Dag 0). Infusjon av dage 1 dosen skulle starte etter at kirurgen har gjort en innledende intraoperative bedømmelse og har konkludert med at subjektet fortsatt er en transplantasjons kandidat og transplantasjonen vil forløpe og før start av transplantat vaskulær anastomose. Infusjonsdoser vil være basert på subjektets reelle kroppsvekt ved studiets dag 1 og vil ikke bli modifisert under forløpet av studiet, hvis ikke det er en endring i kroppsvekt ± 10%. Studie-medikament skulle administreres til subjektet ved en relativt konstant hastighet over 30 minutter. Dag 1 og Dag 5 (post-transplantat Dag 4) dosene skulleadministreres omtrent 96 timer fra hverandre (± 6 timer). Påfølgende visitt og infusjons vinduer er gitt nedenfor. For subjekter på dialyse, skulle infusjon av L104EA29YIg og bestemmelse av subjektets vekt finne sted etter dialysebehandling.

L104EA29YIg MI regime: Subjekter randomisert til MI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) ved dagene 1 og 5 og deretter hver andre uke i 2 måneder (Ukene 2, 4, 6, 8, 10 og 12) og deretter hver 4. uke inntil 6 måneder (Ukene 16, 20 og 24). Etter 6 måneder vil subjekter i MI-behandlingsgruppen motta L104EA29YIg ved vedlikeholdsdosen på 5 mg/kg hver 4. uke inntil fullføring av forsøket ved 36 måneder.

L104EA29YIg LI-regime: Subjekter randomisert til LI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) ved dagene 1 og 5 og deretter hver andre uke i 2 uker (Ukene 2 og 4) og deretter hver 4. uke i 2 måneder (Ukene 8 og 12). Etter 3 måneder vil subjekter i LI behandlingsgruppen motta L104EA29YIg ved vedlikeholdsdosen på 5 mg/kg hver 4. uke inntil fullføring av forsøket ved 36 måneder. Blinding mellom LI og MI-gruppen vil konserveres med anvendelse av 2 placeboinfusjoner i LI-behandlingsgruppen. Derfor vil subjekter randomisert til LI-regimet administreres placebo (dekstrose 5% i vann for injeksjon [D5W]) infusjoner ved ukene 6 og 10.

Administrering av cyklosporin (CsA)

Den daglige dosen av CsA skulle administreres i 2 oppdelte doser i en fast plan i relasjon til tid på dagen og måltider. På studie visitt-dager, må subjektet holde tilbake morgen CsA-dosen inntil etter bunn (”trough”) CsA blodnivå trekkes. På studievisitt dager, når subjektet skal ha standardisert BP overvåkning og/eller målt GFR bedømmelser, skal disse målingene fullført før CsA-dosering. Den initielle daglige dose skulle være 7 ± 3 mg/kg (dvs, 4 – 10 mg/kg). Påfølgende doser skulle være regulert for å opprettholde et forhåndsdefinert område av bunn (”trough”) serumkonsentrasjoner: 1. måned: mål-nivå 150-300 ng/ml Etter 1. måned: mål-nivå på 100-250 ng/ml. Overvåkning av CsA-nivåer ved anvendelse av plasmakonsentrasjonen 2 timer etter dosering (C2) skal ikke anvendes i dette studiet. Selv om en nyere internasjonal konsensus redegjørelse for forvaltning av Neoral ved C2 overvåkning favoriseres anvendelse av C2-overvåkning, er det også klart angitt mangelen på data angående langvarige effekter på nyrefunksjon, forekomst av CAN og generell sikkerhetsprofil forbundet med C2-overvåkning.24 Videre er ikke alle subjekter egnet for C2-overvåkning, omfattende subjekter med diabetes, langsom gastrisk tømming eller subjekter som anvender ledsagende medisinering som endrer CsA-utskilling. Videre kan lave C2-nivåer komme av enten virkelig lav absorpsjon (hvor CsA-dosen skulle være økt) eller fra langsom absorpsjon (hvor det er en forsinket maksimum plasmakonsentrasjon og en økning i dose kan produsere toksisitet). Til slutt er denne utøvelsen ikke universell og fremtidig validering av denne utøvelsen er utenfor omfanget av foreliggende metode. For ytterligere prescribing informasjon, se pakningsvedlegget. CsA skulle være initiert i alle subjekter ved dag 7. For subjekter for hvilke forskeren tror at det ikke er i den beste interesse for subjektet å initiere CsA i det hele tatt (f.eks. på grunn av svekket nyrefunksjon) og velger å anvende en ikke-studie medisinering (f.eks. sirolimus) istedet, vil denne handlingen anses som en avbrytelse av studiemedisinering.

For subjekter med umiddelbar allograft-funksjon: For subjekter randomisert til behandling med CsA, skulle den første dosen av CsA administreres så snart som, men ikke før, det er bevis for tilstrekkelig allograft-funksjon.

Tilstrekkelig allograft-funksjon er definert som en reduksjon i SCr på minst 1 mg/dl sammenlignet med den initielle posttransplantasjonsverdien eller urin produksjon ≥ 250 ml i en 12 timers (eller mindre) periode posttransplantasjon.

For subjekter med svekket nyreallograft-funksjon og forventet DGF: Subjekter med postoperativ svekket allograft-funksjon og forventet DGF er kvalifiserte - men ikke påbudt - til å motta et polyklonalt antilymfocytt preparat. Hvorvidt et subjekt mottar et polyklonalt lymfocytt-preparat eller ikke, skulle CsA bli initiert når det er bevis for gjenvinning av allograft-funksjon (som definert ovenfor) eller ved dag 7.

Kortikosteroider

Alle subjekter i denne undersøkelsen vil bli behandlet med daglige kortikosteroider. STEROID OPPRETTHOLDELSE – GRADVIS MINKENDE Dag for transplantasjon (Dag 1): metylprednisolon (som natrium succinat) 500 mg i.v. ved ankomst i betjeningsrommet (OR)

Dag 2: metylprednisolon (som natrium succinat) 250 mg i.v.

Dag 3: prednison (eller prednisolon) 100 mg oralt (p.o.)

Dag 4 til og med dag 14 (dvs, slutten av uke 2): gradvis minkende prednison (eller prednisolon) til 20 - 30 mg p.o. daglig

Dag 15 til og med måned 6: gradvis minkende prednison (eller prednisolon) ikke lavere enn 2,5 mg p.o. daglig

Subjekter må forbli på minst 2,5 mg p.o. daglig til og med år 3.

De første 2 doser (studie dag 1, dag for transplantasjon og studie dag 2, postoperativ dag 1) skal administreres i.v. De resterende dosene skal administreres p.o. Imidlertid er i.v. dosering av en ekvivalent dose av metylprednisolon tillatt ved tidspunkter når oral dosering ikke er mulig. Slike grunner for i.v. heller enn p.o. dosering er sykdom som kommer mellom, postoperativ tarmslyng eller andre årsaker etter forskerens skjønn. Hvis metylprednisolon ikke er tilgjengelig, er anvendelse av et annet i.v. kortikosteroid middel dose-ekvivalent med metylprednisolon tillatt.

Mykofenolatmofetil dosering

Alle subjekter i dette studiet vil bli behandlet med MMF. Daglig MMF skulle administreres i 2 oppdelte doser i en fast plan i relasjon til tid på dagen og måltider. Dosen skulle være 2 g daglig; imidlertid, i afrikanske-amerikanske, kan 3 g daglig administreres ifølge forskerens skjønn, 25 MMF skulle administreres p.o. Intravenøs dosering er tillatt, hvis nødvendig på grunn av sykdom som kommer mellom, postoperativ tarmslyng eller andre årsaker etter forskerens skjønn. Den første dosen skulle administreres preoperativt. Påfølgende doser skulle administreres p.o. så snart som subjektet kan tolerere medisinering gjennom munnen. Dosen og planen kan reguleres bestemt på grunnlag av laboratorieverdier (f.eks. reduserte WBC’er) og subjekt tolererbarhet (se nedenfor). For fullstendig prescribing informasjon, se pakningsvedlegg.

For subjekter som utvikler kvalme, diaré eller andre MMF-relaterte gastrointestinale ugunstige effekter (f.eks. symptomer fullstendig bedømt og ansett ikke å ha en etiologi forskjellig fra intoleranse for MMF), kan MMF-dosen reduseres til den maksimalt tolererte dosen. For subjekter som utvikler neutropeni (absolutt nøytrofil telling < 1,3 x 103/ L), skulle dosering med MMF avbrytes eller dose reduseres som pr. pakningsvedlegget.

Basiliximab dosering

Alle subjekter i dette studiet vil bli behandlet med det anbefalte doseringsregimet av basiliximab. Basiliximab skulle administreres gjennom en perifer eller sentral vene kun. Rekonstituert basiliximab (20 mg i 5 ml) skulle bli fortynnet til et volum på 50 ml med normal saltoppløsning eller dekstrose 5% og administrert som en i.v. infusjon over 20-30 minutter. Den første 20 mg dosen skulle administreres ved dag 1 (dagen for transplantasjon; postoperativ dag 0). For subjekter randomisert til L104EA29YIg, skulle denne første basiliximab-infusjonen forekomme så snart som mulig etter fullføring av L104EA29YIg-infusjonen. Den andre 20 mg dosen skulle gis ved dag 5 (postoperativ dag 4). Den andre basiliximab-dosen skulle ikke administreres til subjekter hvis de har mottatt eller er forventet å motta en lymfocytt-depleterende behandling. For ytterligere informasjon, se pakningsvedlegget.

Polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyreallograft-funksjon og forventet DGF

Anvendelse av polyklonale antilymfocytt preparater (Thymoglobulin eller ATGAM) er tillatt - men ikke nødvendig - for subjekter randomisert til CsA som opplever svekket nyreallograft-funksjon og forventet DGF etter transplantasjon.

Anvendelse av andre polyklonale antilymfocytt preparater eller polyklonale antitymocytt globuliner er tillatt i regioner hvor markeds tillatelse eksisterer og hvis de er indikert for behandling av akutt avstøtning ved nyretransplantasjon. Bemerk av OKT3 ikke skal anvendes for dette formål, men kan anvendes for behandling av Banff 97 Grade IIb eller større akutt avstøtning eller steroid-resistent akutt avstøtning. Anvendelse av Campath 1-H<®>(alemtuzumab) er ikke tillatt i denne fremgangsmåten, ettersom den ikke er indikert for anvendelse i nyretransplantasjon. Disse midlene er vanlig anvendt i denne kapasitet, hvilket gir immunsuppresjon inntil graft-funksjon tillater administrering av CsA. Derfor kan polyklonale antilymfocytt preparater anvendes i denne kliniske settingen, etter forskerens skjønn, i subjekter som oppfyller ≥ 1 av de følgende kriteriene som er observert i nærvær av en tydelig transplantat arterie og vene og ingen bevis for hydronefrose ved sonogram: a) Urinproduksjon < 250 cc/12 timer b) Ingen signifikant forbedring (< 1 mg/dl) i SCr fra baselinjeverdi over de første 24 - 72 timer posttransplantasjon c) Dialysebehandling. Anvendelse av disse midlene for svekket nyreallograft-funksjon og forventet DGF er ikke tillatt i L104EA29YIgbehandlede subjekter.

Sulfametoksazol/Trimetoprim dosering

Alle subjekter som deltar i dette studiet som ikke har noen kontraindikasjoner skulle motta sulfametoksazol/trimetoprim forebygging for å forhindre urinveis- og Pneumocystis carinii infeksjoner. Dosering og administrering skal bestemmes ved nivået av nyrefunksjon i overensstemmelse med pakningsvedlegget. Subjekter med en kontraindikasjon eller intoleranse for sulfa-medikamenter eller trimetoprim kan motta profylaktisk terapi med inhalert pentamidin etter forskerens skjønn. For fullstendig pålagt informasjon, se pakningsvedlegget.

Valganciclovir / Ganciclovir, Acyklovir / Valacyklovir dosering

Alle mottagere som ikke har noen kontraindikasjoner mot valganciclovir, ganciclovir, acyklovir og valacyklovir skulle bli profylaktisk behandlet med disse medikamentene for å forhindre infeksjoner på grunn av CMV og Herpes simplex. De følgende er retningslinjer for dosering og varighet av profylaktisk behandling: Forebygging for de første 10 dagene posttransplantasjon eller under T-celle-depleterende terapi: Alle transplanterte subjekter vil motta valganciclovir eller ganciclovir pr. protokoll i 10 dager etter kirurgi. Hvis behandlet med T-celledepleterende terapi for induksjonsterapi eller behandling for akutt avstøtning, vil subjektet motta valganciclovir eller ganciclovir for hele varigheten av den T-celledepleterende terapien. Hvis subjektet blir utskrevet før 10 dager, vil enten oral valganciclovir, ganciclovir, valacyklovir eller acyklovir starte basert på CMV immunstatus som beskrevet nedenfor.

Valganciclovir for forebygging: Creatinin utskilling ≥60 ml/min , dose 900 mg daglig; Creatinin utskilling 40 - 59 ml/min, dose 450 mg daglig; Creatinin utskilling < 40 ml/min, dose 450 mg hver andre dag.

Ganciclovir for forebygging: Hvis subjektet er ute av stand til å tolerere orale medisineringer eller valganciclovir ikke er tilgjengelig for anvendelse, kan ganciclovir suspensjon eller kapsler anvendes i stedet. Creatinin utskilling ≥ 70 ml/min, dose 1 g 3 ganger daglig; Creatinin utskilling 50 - 69 ml/min, dose 500 mg 3 ganger daglig; Creatinin utskilling 25 - 49 ml/min, dose 500 mg to ganger daglig; Creatinin utskilling 10 - 24 ml/min, dose 500 mg daglig; Creatinin utskilling < 10 ml/min, dose 500 mg etter hemodialysis 3 ganger/uke. Hvis i.v. ganciclovir er nødvendig, se pakningsvedlegg for dosering.

Forebygging etter 10 dager posttransplantasjon gjennom minst 3 måneder: CMV Antistoff Seropositiv Donor til en CMV Antistoff seronegative mottager: Fortsette valganciclovir eller ganciclovir protokollen listet opp ovenfor i ≥ 3 måneder.

CMV Antistoff seropositiv eller seronegativ donor til en CMV antistoff seropositiv mottager: Oral acyklovir i ≥ 3 måneder posttransplantasjon: Serumkreatinin ≥50 ml/min, dose 800 mg oralt 4 ganger daglig; Serum-kreatinin 25 -49 ml/min, dose 800 mg oralt 3 ganger daglig; Serum-kreatinin 11 - 24 ml/min, dose 800 mg oralt to ganger daglig; Serum-kreatinin < 10 ml/min, dose 800 mg oralt daglig; Ved hemodialyse, dose 800 mg daglig etter hemodialyse Valacyklovir kan være settes i stedet for acyklovir på tidspunktet for utskrivning for subjektets bekvemmelighet. Serum-kreatinin ≥50 ml/min, dose 500 mg oralt 2 ganger daglig; Serum-kreatinin 25 - 49 ml/min, dose 500 mg oralt daglig; Serum-kreatinin 11 - 24 ml/min, dose 500 mg oralt daglig; Serumkreatinin < 10 ml/min, dose 250 mg oralt daglig; Ved hemodialyse, dose 250 mg daglig etter hemodialyse

CMV Antistoff seronegativ donor til en CMV antistoff seronegativ mottager: Oral Acyklovir protokoll nødvendig for herpes-forebygging kun: fortsette i ≥ 3 måneder posttransplantasjon. Acyklovir 400 mg p.o. to ganger daglig eller valacyklovir kan settes i stedet for acyklovir på tidspunktet for utskrivning for subjektets bekvemmelighet. For fullstendig pålagt informasjon, vises til pakningsvedlegg.

Infusjon-kun visitt-prosedyrer

a) For subjekter randomisert til L104EA29YIg-behandling: En negativ graviditetstest er nødvendig før L104EA29YIg-administrering. Dosen skal baseres på subjektets vekt ved den siste tidligere studie-visitten. Subjekter skulle overvåkes for vitale tegn (pre- og post-infusjon) og AE’er skulle bedømmes. PK-prøver kan være nødvendig ved noen visitter.

b) For subjekter randomisert til CsA-behandling: Subjekter skal kontaktes for å bedømmes for AE’er kun. Denne visitten kan være en telefonkontakt og skulle forekomme innenfor det foreskrevne visitt vinduet for den spesifiserte visitten.

Visitt vinduer

a) For subjekter randomisert til L104EA29YIg-behandling: Dag 1 og 5-dosene skulle administreres omtrent 96 timer fra hverandre (± 6 timer). For å lette tidsplanlegging for infusjon-kun visittene, er de følgende vinduene tillatt for påfølgende doser: Visitt uke 2, Visitt vindu mål-dato ± 2 dager; Visitt uke 4 -måned 6 Visitt vindu mål-dato ± 3 dager, Visitt måned 7 – måned 36, Visitt vindu mål-dato ± 5 dager; Visitt oppfølging 8 uker, Visitt vindu mål-dato ± 5 dager.

b) For subjekter randomisert til CsA-behandling: Etter Dag 5, behøver subjekter bare å delta i klinikk-visitter ved ukene 2, 4, 8 og 12; deretter ved hver 3. måned intervall-visitt. Ved ikke-3-måneders interval l-visitter (dvs, ukene 6, 10, 16, 20, 28, 32, osv), vil en telefonkontakt gjenomføres for å oppsamle AE-informasjon. Klinikk og kontakt visitter skal forekomme innenfor samme visitt vinduer som spesifisert ovenfor for subjekter randomisert til L104EA29YIg. Mål-datoene for 3og 12-måneders GFR bedømmelser er uke 12 ± 14 dager og uke 52 ± 14 dager. Under visse omstendigheter og med tidligere godkjennelse ved den medisinske overvåkeren, kan de målte GFR bedømmelsene ved måned 3 og måned 12 utføres til og med måned 6 og måned 15, henholdsvis. Slike grunner som kan berettige utvidelse av en målt GFR bedømmelse omfatter tilstedeværelsen av en samtidig akutt avstøtningsepisode eller behov for å gjenta en bedømmelse av tekniske grunner.

Mål-datoen for den 12-måneders allograft biopsien er uke 52 ± 14 dager. Tilsvarende kan, under visse omstendigheter og med tidligere godkjennelse ved den medisinske overvåkeren, allograft biopsi oppnås til og med måned 15. Slike grunner som kan berettige utvidelse av en allograft biopsi omfatter midlertidig behov for antikoagulasjon.

EKSEMPEL 5

Fagfolk på området kunne anvende administreringsprogrammet beskrevet i Eksempel 4 ovenfor for å utforme et studie omfattende en ulik studie-populasjon, donorkriterier og/eller formål. For eksempel vil dette transplantasjonsstudiet evaluere subjekter som mottar et nyretransplantat fra en levende donor eller død donor med forventet kald iskemi tid < 24 timer. Subjekter ved varierende nivåer av immunologisk risiko vil være kvalifiserte. Imidlertid vil studiet utelukke subjekter med høyest immunologisk risiko. Subjekter vil bli randomisert til MI, LI eller CsA-avdelingene som beskrevet ovenfor i Eksempel 4.

Primære formål

Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetningen (”composite”) av subjekt og graftoverlevelse ved 12 måneder. Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på sammensetning av målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved måned 12 eller en reduksjon i målt GFR ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12. Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomsten av akutt avstøtning ved 12 måneder.

Sekundære formål

Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 12 måneder. Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på biopsibevist CAN ved 12 måneder. Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på de individuelle komponentene av det primære sammensetnin (”composite”) endepunktet for målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved måned 12 eller en reduksjon i målt GFR ≥ 10 ml/min/1,73 m<2>fra måned 3 til måned 12. Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på trippel sammensetning endepunkt for død, graft-tap og akutt avstøtning ved 12, 24 og 36 måneder.

Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved 24 måneder Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på målt GFR ved 3 og 24 måneder og forandring fra baselinje (3 måneder) til 12 måneder og til 24 måneder.

Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en målt GFR < 30 ml/min/1,73 m<2>ved 12 og 24 måneder.

Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på beregnet GFR ved 6, 12, 24 og 36 måneder og forandring fra 6 måneder til 12, 24 og 36 måneder.

Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på PTDM ved 12, 24 og 36 måneder. Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål av hypertensjon ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende SBP og DBP, forekomst og utbredelse av hypertensjon og kontrollert hypertensjon og intensitet av behandlingsregime. Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål av dyslipidemi, ved 12, 24 og 36 måneder, omfattende serum totalt, ikke-HDL, lavtetthet lipoprotein (LDL), og HDL kolesterol og TG’er, forekomst og utbredelse av dyslipidemi og kontrollert dyslipidemi og intensitet av behandlingsregime. Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på subjekt og graft-overlevelse ved 24 og 36 måneder. Bestemme virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med en beregnet GFR < 60 ml/min/1,73 m<2>ved 24 og 36 måneder. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på mål av akutt avstøtning ved 6, 12, 24 og 36 måneder, omfattende forekomsten og alvorlighetsgraden av akutt avstøtning, anvendelsen av polyklonale antilymfocytt preparater for svekket nyrefunksjon og forventet forsinket graft-funksjon (DGF), den initielle anvendelsen av lymfocyttdepleterende terapi for behandling av akutt avstøtning, forekomsten av steroid resistent akutt avstøtning, forekomsten av fullstendig gjenvinning (SCr går tilbake til baseline) etter akutt avstøtning, forekomsten av subklinisk avstøtning, forekomsten av alle behandlede akutt avstøtnings-episoder uansett histologiske funn og tiden for oppstart av akutt avstøtning. Evaluere virkningene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på QoL. Bestem den totale sikkerheten av L104EA29YIg, i forhold til CsA. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på slope og intercept av beregnet GFR fra 3 måneder til 12, 24 og 36 måneder. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med < 60 ml/min/1,73 m<2>beregnet GFR ved måned 12 eller subjekter med en reduksjon i beregnet GFR fra måned 3 til måned 12 på minst 10 ml/min/1,73 m<2>. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomsten av DGF. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med Stadium 1 til og med Stadium 5 kronisk nyresykdom ved 12 og 24 måneder som bedømt ved målt GFR. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på proporsjonen av subjekter med Stadium 1 til og med Stadium 5 kronisk nyresykdom ved 36 måneder som bedømt ved beregnet GFR. Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på et sammensatt (”composite”) kardiovaskulær sykdom endepunkt (erklært kardiovaskulær død, myokardinfarkt, iskemisk slag og revaskularisering [kirurgisk eller perkutan] prosedyrer) ved 12, 24 og 36 måneder. Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på en sammensatt kardiorenal sykdoms endepunkt (død, graft-tap, ikke-dødelig myokardinfarkt og slag) ved 12, 24 og 36 måneder. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på Framingham Risiko Score ved 12, 24 og 36 måneder. Bestem effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på forekomsten av avbrytelse av studie-medikament. Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på anti-donor humane leukocytt antigen (HLA)-antistoffer. Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på angiotensin II type 1 (AT1)–reseptor-antistoffer. Bestemme effektene av L104EA29YIg, i forhold til CsA, på C4d positivitet i biopsi- prøver

Studiedesign

Varigheten av studiet er 3 år med en påfølgende 8 ukers oppfølgende periode for sikkerhetsevalueringer. Dette er et randomisert, delvis-blindet, aktivt kontrollert, parallel-gruppe studie. Alle subjekter vil motta et nyretransplantat fra en levende donor eller en død donor med en forventet CIT < 24 timer.

Omtrent 660 subjekter vil bli randomisert i et 1:1:1 forhold for behandling med enten L104EA29YIg (MI regime), L104EA29YIg (LI regime) eller CsA. Alle subjekter vil også motta induksjon med basiliximab og et bakgrunns vedlikeholds immunosuppressivt regime av MMF og kortikosteroider. Subjekter randomisert til MI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) ved dagene 1 og 5, deretter hver 2. uke til og med måned 3 (Ukene 2, 4, 6, 8, 10 og 12) og deretter hver 4. uke til og med 6 måneder (Ukene 16, 20 og 24). Etter 6 måneder vil subjekter i MI behandlingsgruppen motta vedlikeholdsdosen av L104EA29YIg 5 mg/kg administrert hver 4. uke inntil fullføring av forsøket ved 36 måneder. Subjekter randomisert til the LI-regimet vil motta i.v. L104EA29YIg (10 mg/kg) ved dagene 1og 5 og deretter hver 2. uke til og med måned 1 (Uker 2 og 4) og hver 4. uke til og med måned 3 (Ukene 8 og 12). Etter 3 måneder vil subjekter i LI behandlingsgruppen motta vedlikeholdsdosen av L104EA29YIg 5 mg/kg administrert hver 4. uke inntil fullførelse av forsøket ved 36 måneder. Blinding mellom LI og MI-gruppene vil bevares med anvendelse av placeboinfusjoner i LI-behandlingsgruppen ved ukene 6 og 10. Subjekter randomisert til CsA vil motta doser to ganger daglig som er utformet for å oppnå et spesifisert bunn (”trough”) serum konsentrasjonsområde i overensstemmelse med gjeldende medisinsk praksis. Sikkerheten og effektiviteten av L104EA29YIg vil bli bedømt ved 1, 2 og 3 år. En uavhengig DSMB vil betrakte data fra studiet på en løpende basis og gjøre anbefalinger for å endre utførelsen av forsøket, om nødvendig.

Studiepopulasjon

Studiepopulasjon omfatter mottagere av nyreallografter fra levende donorer eller døde donorer med en forventet CIT < 24 timer. Generelt vil ikke immunologiske kriterier spille en vesentlig rolle i subjekt-seleksjon. Subjekter med varierende nivåer av immunologisk risiko er kvalifisert. Studiet vil imidlertid utelukke subjekter med størst immunologisk risiko (positiv kryssmatch, aktuelle panel reaktive antistoffer [PRA] på ≥ 50% eller de tidligere transplantert med en aktuell PRA ≥ 30%). Disse subjektene kan kreve terapi for å redusere deres antistoff-mengde, slik som plasmaferese, som er utenfor omfanget av denne protokollen. Subjekter vil bli innført ved omtrent 100 steder globalt.

Inklusjonskriterier

Mål-populasjon: 1) subjektet er en mottager av et nyretransplantat fra en levende donor eller død donor med en forventet CIT < 24 timer 2) Menn og kvinner, i alderen 18 og eldre, inkludert 3) WOCBP må være ved anvendelse av en tilfredsttillende metode for prevensjon for å unngå graviditet gjennom hele studiet og i opptil 8 uker etter studiet på en slik måte at risiko for graviditet er minimalisert WOCBP omfatter hvilken som helst kvinne som har opplevd første mesntruasjon og som ikke har gjennomgått vellykket kirurgisk sterilisering (hysterektomi, bilateral tubal ligering eller bilateral ooforektomi) eller er ikke postmenopausal (definert som amenoré i 12 påfølgende måneder; eller kvinner på hormonerstatningsterapi [HRT] med dokumentert serum follikkelstimulerende hormon [FSH] nivå > 35 mIU/ml). Selv kvinner som anvender orale, implanterte eller injiserbare befruktningshindrende hormoner eller mekaniske produkter slik som en intrauterin anordning eller barriere-metoder (pessar, kondomer, spermicider) for å forhindre graviditet eller praktiserer avholdenhet eller hvor partneren er steril (f.eks. vasektomi), skulle anses å ha befruktningsdyktig potensiale. WOCBP må ha en negativ serum graviditetstest (minimum sensitivitet 25 IU/l eller ekvivalente enheter av humant chorion gonadotropin [HCG]) innen 72 timer før starten av studie-medisinering.

Eksklusjonskriterier

1) WOCBP som er uvillige eller ute av stand til å anvende en akseptabel metode for å unngå graviditet for hele studieperioden og i opptil 8 uker etter siste infusjon. 2) Kvinner som er gravide eller ammer 3) Kvinner med en positiv graviditetstest ved innføring eller før administrering av studie-medikament.4) Genetisk identiske donor mottager-par (dvs, identiske tvillinger).5) Donoralder < 10 år.6) Subjekter som mottar og utvidede kriterier donororgan som definert ved: a) Donoralder ≥ 60 år ELLER b) Donoralder 50 – 59 år og 1 av de følgende: (i) Cerebrovaskulær episode (CVA) hypertensjon SCr > 1,5 mg/dl ELLER (ii) CVA hypertensjon ELLER (iii) CVA SCr > 1,5 mg/dl ELLER (iv) Hypertensjon + SCr > 1,5 mg/dl ELLER c) Forventet CIT ≥ 24 timer ELLER d) Donor med hjertedød (”non-heart beating donor”). 7) Subjekter med underliggende nyresykdom av: a) Primær fokal segmental glomerulosklerose b) Type I eller II membranoproliferativ glomerulonefritt c) Hemolytisk-uremisk syndrom (HUS) / trombotisk trombocytopen purpura syndrom Hvis et subjekt har ESRD av ukjent etiologi og/eller har ingen histologisk bekreftet diagnose, kan subjektet innføres inn i studiet så lenge det ikke er noen kliniske tegn eller symptomer i overensstemmelse med den kliniske diagnosen av primær fokal segmental glomerulosklerose, Type I eller II membranoproliferativ glomerulonefritt eller HUS, som ansett av forskeren. 8) Subjekter som gjennomgår primær (først-time) transplantat med en current PRA ≥ 50% eller subjekter som gjennomgår retransplantasjon med en PRA ε 30%.9) Subjekter med tidligere graft-tap på grunn av akutt avstøtning.10) Subjekter med en positiv T-celle lymfocytotoksisk kryssmatch. 11) Subjekter med tidligere ikke-nyre fast organtransplantat (subjekter som gjennomgår nyre retransplantasjon er kvalifiserte inntil andre studiekriterier blir oppfylt) eller subjekter som gjennomgår multi-organ transplantasjon (f.eks. nyre-bukspyttkjertel) eller subjekter ansett sannsynlig å ha et andre fast organ eller celle transplantat (f.eks. bukspyttkjertel eller øy-transplantat) i de neste 3 år ved forskeren. 12) Subjekter som mottar et samtidig fast organ (hjerte, lever, bukspyttkjertel) eller celle (øy, benmarg, stamcelle)-transplantat.13) Subjekter som mottar parede nyrer (dobbelt eller en bloc nyre transplantasjon). 14) Subjekter som er kjent hepatitt C antistoff-positive eller polymerasekjedereaksjon (PCR)-positive for hepatitt C.15) Subjekter som er kjent hepatitt B overflate antigen-positive eller PCR-positive for hepatitt B.16) Subjekter med kjent human immunsvikt-virus (HIV)-infeksjon.17) Subjekter med aktiv tuberkulose (TB) som krever behandling innenfor de forutgående 3 år eller hvilket som helst subjekt som tidligere krevde trippel (eller mer) kombinasjonsterapi for TB. Subjekter med et kjent positivt renset protein-derivat (PPD) vil ikke være kvalifisert for studiet hvis de ikke fullførte behandling for latent TB og har en negativ brystrøntgen på tidspunktet for innføring. PPD-testing utført innen de siste 12 måneder er akseptabelt så lenge det er dokumentasjon for resultatene. Subjekter uten en PPD i de siste 12 måneder som har et tidligere negativt resultat kan innføres hvis de også har en negativ brystrøntgen ved innføring, ingen symptomer indikative for TB, ingen kjente TB kontakter, oppholder seg ikke for tiden i, nylig reist til eller tidligere innvandret fra et område endemisk for TB. En PPD-respons som er ≤ 10 mm i varighet eller et Heaf score på > 1 i non-Bacille Calmette-Guérin (ikke-BCG) immuniserte subjekter eller > 2 i BCG-immuniserte subjekter skulle anses som en positiv test. Mer konservative kriterier kan anvendes i henhold til de publiserte retningslinjene og/eller lokale standarder godkjent av det medisinske samfunnet.

18) Subjekter med hvilken som helst aktiv infeksjon eller annen kontraindikasjon som normalt ville utelukke transplantasjon. 19) Subjekter hvis forventet levealder er alvorlig begrenset av sykdomstilstand eller annen underliggende medisinsk tilstand. 20) Subjekter med en historie med kreft (andre enn ikke-melanom hudcellekreft kurert ved lokal reseksjon) innen siste 5 år.21) Subjekter med en historie av stoffmisbruk (medikament eller alkohol) innen de siste 5 år eller psykotiske lidelser som ikke er kompatible med tilfredsstillende oppfølging av studiet. 22) Subjekter med aktivt magesår sykdom, kronisk diaré eller gastrointestinal malabsorpsjon.

Administrering av og visitt vinduer for L104EA29YIg MI og LI og CsA-regimer, omfattende liste som nødvendig, vil være som beskrevet ovenfor og i Eksempel 4.

Hvilket vil være klart for fagfolk på området til hvilket oppfinnelsen tilhører, kan foreliggende oppfinnelse legemliggjøres i former forskjellig fra de spesifikt beskrevet ovenfor uten å avvike fra idéen eller essensielle egenskaper ifølge oppfinnelsen. De spesielle utførelsesformene ifølge oppfinnelsen beskrevet ovenfor skal, derfor, betraktes som illustrative og ikke begrensende. Omfanget av foreliggende oppfinnelse er som angitt i de tilhørende kravene heller enn å være begrenset til eksemplene inneholdt i foregående beskrivelse.

Claims

Patentkrav

1. CTLA4-mutantmolekyl som omfatter et ekstracellulært domene av CTLA4 som vist i SEQ ID NO: 8, som starter med alanin i posisjon 26 eller metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150, hvor i det ekstracellulære domene en alanin i posisjon 55 er substituert med en tyrosin og en leucin i posisjon 130 er substituert med en glutaminsyre for anvendelse ved behandling av en immunforstyrrelse forbundet med graft transplantasjon, hvor behandlingen omfatter et tidlig fase-regime og et vedlikeholds fase-regime og hvor (i) den tidlige fase diett i området fra de første 3 til 6 måneder etter transplantasjonen og omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet til et individ på dag 1, uke 2 visitt, uke 4 visitt og deretter månedlig til måned 3 visitten i en dose på 10 mg / kg vekt av individet, og (ii) vedlikeholdsfasen begynner etter at det tidlige fase-regimet er avsluttet og involverer administrasjon som ikke er hyppigere enn månedlig av en effektiv dose av CTLA4-mutantmolekyl til et individ for å sørge for serumkonsentrasjoner av CTLA4-mutantmolekylet på mellom 0,2 μg / ml og 3 μg / ml under vedlikeholdsfasen.

2. Molekyl til anvendelse ifølge krav 1, hvor det tidlige fase-regimet omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekyl på dag 1, uke 2 visitt, uke 4 visitt, uke 8 visitt og uke 12 visitt.

3. Molekyl til anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor det tidlige fase-regimet videre omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekyl på dag 5.

4. Molekyl til anvendelse ifølge krav 3, hvor det tidlige fase-regimet omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet på dag 1, dag 5, uke 2 visitt, deretter hver annen uke i de første 3 måneder, etterfulgt av månedlig administrasjon gjennom måned 6 visitten.

5. Molekyl til anvendelse ifølge krav 3, hvor det tidlige fase-regimet omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet på dag 1, dag 5, uke 2 visitt, uke 4 visitt, uke 6 visitt, uke 10 visitt, måned 4 visitt, måned 5 visitt og måned 6 visitt.

6. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, hvor den effektive dosen av CTLA4-mutantmolekylet under vedlikeholdsfasen er 5 mg / kg vekt av individet.

7. Molekyl til anvendelse l ifølge krav 1, hvor behandlingen omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet i en dosering på 10 mg / kg vekt av individet på dagene 1, 15, 29, 57, 85 og i en dose på 5 mg / kg vekten av individet deretter.

8. Molekyl til anvendelse ifølge krav 1, hvor behandlingen omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet i en dose på 10 mg / kg vekt av individet på dagene 1, 5, 15, 29, 57, 85 og ved en dosering på 5 mg / kg vekt månedlig av individet deretter.

9. Molekyl til anvendelse ifølge krav 1, hvor behandlingen omfatter administrering av CTLA4-mutantmolekylet i en dose på 10 mg / kg vekt av individet på dagene 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113 , 141, 169 og i en dosering på 5 mg / kg vekt månedlig av individet deretter.

10. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, hvor immunforstyrrelsen assosiert med graft transplantasjonen omfatter fast organ, vevs og/eller celle transplantatsavstøtning.

11. Molekyl til anvendelse ifølge krav 10, hvor immunforstyrrelsen assosiert med graft transplantasjon omfatter nyretransplantasjon-avstøtning.

12. Molekyl til anvendelse ifølge krav 1, hvor individet er en utvidet kriterie-mottaker og/eller som mottok transplantatet fra en donor med utvidet kriterium.

13. Molekyl til anvendelse ifølge krav 12, hvor de utvidede kriteriene inkluderer ett eller flere av følgende: graft fra donoralder mindre enn 10 år eller høyere enn eller lik 60 år; graft fra giver etter hjertedød; graft med forventet kald-iskemisk tid av donororganet større enn eller lik 24 timer; individ som gjennomgår første gangs transplantasjon med en nåværende PRA ≥ 50%, eller gjennomgår retransplantasjon med PRA ≥ 30%; individ med tidligere graft tap på grunn av akutt avstøtning i de første 6 måneder etter transplantasjon; individ med positiv T-celle lymfocytotoksisk kryssoverføring ved bruk av donorlymfocytter og mottakerserum; individ med HIV-infeksjon; individ med aktiv tuberkulose som krever behandling innen de foregående 3 årene; eller andre kriterier utstedt av United Network of Organ Sharing (UNOS).

14. Molekyl til anvendelse ifølge krav 12, hvor de utvidede kriterier for en donornyre inkluderer minst 1 av følgende utvidede kriterier for organdonasjon a) donoralder ≥60 år; eller b) donoralder 50-59 år og 1 av følgende: (i) cerebrovaskulær ulykke (CVA) hypertensjon SCr> 1,5 mg / dL eller (ii) CVA hypertensjon eller (iii) CVA SCr> 1,5 mg / dL eller (iv) hypertensjon SCr> 1,5 mg / dL; eller c) CIT ≥24 timer og donor alder> 10 år; eller d) donor med hjertedød (donor uten hjerteslag).

15. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, hvor CTLA4-mutantmolekylet omfatter:

(a) en aminosyresekvens som starter med metionin i posisjon 27 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 i SEQ ID NO: 4, eller

(b) en aminosyresekvens som starter med alanin i posisjon 26 og slutter med asparaginsyre i posisjon 150 i SEQ ID NO: 4.

16. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15, hvori CTLA4-mutantmolekylet videre omfatter en aminosyresekvens som forandrer oppløseligheten, affiniteten og/eller valensen til det oppløselige CTLA4-mutantmolekylet.

17. Molekyl til anvendelse ifølge krav 16, hvor aminosyresekvensen som forandrer oppløseligheten, affiniteten og/eller valensen, omfatter en immunglobulindel.

18. Molekyl til anvendelse ifølge krav 17, hvor immunoglobulindelen er en konstant region eller en del av den immunoglobulin-regionen.

19. Molekyl til anvendelse ifølge krav 18, hvor den konstante immunglobulinregionen eller delen derav er mutert for å redusere effektorfunksjonen.

20. Molekyl til anvendelse ifølge krav 18 eller 19, hvor den immunoglobulin-konstante region eller del derav omfatter et hengsel, CH2- og CH3-regioner av et humant eller apeimmunoglobulinmolekyl.

21. Molekyl til anvendelse ifølge krav 17, hvor immunoglobulinet omfatter en aminosyresekvens som starter med glutaminsyre i posisjon 152 og slutter med lysin i posisjon 383, som vist i SEQ ID NO: 4.

22. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15 som videre omfatter en kryss-aminosyrerest og et immunoglobulin, hvor kryss-aminosyreresten er lokalisert mellom aminosyresekvensen som slutter med asparaginsyre i stilling 150 og immunoglobulinet.

23. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, hvor CTLA4-mutantmolekylet omfatter:

(a) en aminosyresekvens som starter med metionin i stilling 1 og slutter med lysin i posisjon 357 eller glycin i posisjon 356 i figur 7, eller

(b) en aminosyresekvens som starter med alanin ved posisjon -1 og slutter med lysin i posisjon 357 eller glycin i posisjon 356 i figur 7.

24. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 23, hvor CTLA4-mutantmolekylet skal administreres samtidig med minst ett av midlene valgt fra gruppen bestående av basiliximab, daclizumab, anti-tymocytglobulin, kalsininininhibitorer, syklosporin, tacrolimus, mykofenolatmofetil, mykofenolsyre, rapamycin, azatioprin, muromonab, rituximab, sirolmus, everolimus, FTY720, FK778, Jak-3, centikum, kortikosteroider, betametason, budesonid, kortisol, kortison, dexametason, hydrocritison, metylprednisolon, prednisolon, prednison og triamcinolon.

25. Molekyl til anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 24, hvor CTLA4-mutantmolekylet skal administreres samtidig eller sekvensielt med midler som omfatter basiliximab og MMF.

26. Molekyl til anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 24, hvor CTLA4-mutantmolekylet skal administreres samtidig eller sekvensielt med midler som omfatter daclizumab og sirolium.