CN103930130B - 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
公开了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，该细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结。该方法包括：(a)在IL-21的存在下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以便允许富集抗原反应性细胞；和(b)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(a)的所述细胞，以便允许增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
Description
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及包含中央型记忆T淋巴细胞表型的耐受诱导(toleranceinducing)和/或移植物抗白血病(graftversusleukemia)反应性抗第三方细胞，并且更具体地但不排他地涉及其产生方法并且涉及其在移植中和在疾病治疗中的应用。
背景技术
骨髓(BM)移植为患有血液系统恶性肿瘤及其他血液疾病的患者提供了治愈性治疗。但是，BM移植物包含供体T细胞，其响应宿主抗原(Ag)并且引起多系统的移植物抗宿主病(GVHD)。在80年代初，在半相合(三HLA位点不匹配)设置(setting)中、在重症联合免疫缺陷(SCID)患者中证明了没有GVHD的有害影响的骨髓移植(BMT)。在这样的设置中几乎是一致致命的GVHD问题由于T细胞耗竭而完全被防止。
然而，在白血病患者中，T细胞耗竭的BM的临床结果是令人失望的，因为GVHD防止的益处被显著增加的移植物排斥反应速率抵消。显示，该排斥反应是由放射化学疗法耐性宿主来源的T细胞所介导的[Reisner等,ProcNatlAcadSciUSA.(1986)83:4012-4015]。克服这个问题的一个方法是在使用免疫抑制药物超致死调理(调节，conditioning)和功能失活宿主T细胞之后进行BMT。尽管如此，这种策略由于缓慢的免疫重建和相当毒性的免疫抑制剂所致的机会性感染而受到阻碍。
虽然在高风险白血病患者中，这种移植相关的致命性是可以接受的，但是如果应用至具有较长预期寿命的患者，这将是无法忍受的。因此，使用降低强度的调理，连同不太严重的免疫消融，来促使与降低GVHD的风险相关联的T-耗竭的BM(TDBM)移植物的植入是必要的(warranted)。在这种降低的调理下确立供体型嵌合状态代表了移植生物学中最令人向往的目标，因为其通常与针对来自原始供体的细胞或组织的持久耐受性相关联。然而，经受住(surviving)温和的预备疗法(preparatoryregimen)的宿主免疫细胞的显著水平代表植入供体细胞的艰难障碍。
克服排斥异源TDBM的一种方法利用了大细胞剂量。首次在啮齿类动物模型中证明了“大剂量(megadose)”的TDBM移植可以克服T细胞介导的移植物排斥反应[Lapidot等,Blood(1989)73:2025-2032；Bachar-Lustig等,NatMed.(1995)1:1268-1273；Uharek等,Blood(1992)79:1612-1621]。但是，在人类中一直难以实现BM接种物的显著增加。为了克服这个问题，已经使用促进来自BM的造血干细胞(人类中的HSC、CD34+细胞)的动员(mobilization)的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)来提高采集自血液的HSC的产率，并且将T细胞耗竭的HSC补充至常规TDBM中[Aversa等,NEnglJMed.(1998)339:1186-1193；Aversa等,JClinOncol.(2005)23:3447-3454；Reisner和Martelli,ImmunolToday(1999)20:343-347；Handgretinger等,BoneMarrowTransplant.(2001)27:777-783]。
CD34的“大剂量”移植提出有趣的问题，即这些细胞如何克服由宿主细胞毒性T淋巴细胞前体(CTLp)给出的屏障。这个问题部分地由以下发现所回答，即CD34部分中的细胞被赋予(endow)了强有力的禁止活性(否决活性，vetoactivity)[Gur等,Blood(2005)105:2585-2593；Gur等,Blood(2002)99:4174-4181；Rachamim等,Transplantation(1998)65:1386-1393]。其他细胞类型也已经显示出介导禁止活性，包括T淋巴细胞(例如CD8+CTL)、自然杀伤细胞和树突状细胞。各种细胞类型的禁止反应性的直接比较显示，CTL包含最强的禁止效果[Reich-Zeliger等,JImmunol.(2004)173:6654-6659]。
Reisner与其同事描述了已开发出一种产生无GVH反应性的禁止CTL的方法，其中在没有外源性IL-2的条件下针对第3方刺激子来刺激CTL。这种方法基于观察到的在原代培养物中只有活化的CTLp能够经受住IL-2脱除。在体外和体内都显示，这种方法耗尽了来自抗第3方禁止CTL的GVH反应性[PCT公开号WO2001/049243，Bachar-Lustig等,Blood.2003；102:1943-1950；Aviner等,HumImmunol.(2005)66:644-652]。将这些抗第3方禁止CTL导入至接受者中(和移植一起)防止了移植物排斥反应而未引起GVHD(PCT公开号WO2001/049243)。
已经考虑了用于移植体的移植而无移植排斥和/或移植物抗宿主病的各处方法，其中一些概述如下。
PCT公开号WO2007/023491公开了使用致耐受性细胞用于在受试者中减少或防止非同源移植物的移植物排斥反应。所公开的致耐受性细胞(tolerogeniccell)(例如CD4+CD25+细胞)可以来源于与受试者和移植物都非同源的任何供体(“第三方”致耐受性细胞)。移植物(例如骨髓)可以来源于与受试者是同种异体(allogeneic)或异种(xenogeneic)的任何移植物供体。
PCT公开号WO2002/102971公开了使用包含增强禁止活性的经培养的造血祖细胞(HPC)以诱导对从供体移植至接受者的移植体的耐受性。所公开的致耐受性细胞优选地表达CD33并且在移植体(例如，细胞或器官移植体)的移植之前、同时或之后进行给予。
PCT公开号WO2002/043651公开了使用免疫效应子细胞(immuneeffectorcell)的非-GVHD诱导群体用于疾病治疗。为了得到免疫效应子细胞的非-GVHD诱导群体，在包括IL-2缺乏的条件下，将第一细胞群体(例如T-淋巴细胞)与第二细胞群体(其与受试者是非同源的且与第一细胞群体也是非同源的)(例如EBV-感染的B淋巴细胞)共同培养，随后补充IL-2进行共同培养。所得到的免疫效应子细胞可以用于治疗疾病，如恶性疾病、病毒性疾病和自身免疫性疾病。
美国专利号6,759,035公开了在实体器官移植接受者中抑制移植物排斥反应并诱导T细胞耐受性的方法。该公开的方法包括从供体和接受体中取出外周血单核细胞(PBMC)，在诱导T细胞抑制子活性的化合物(例如，TGF-β、IL-15和IL-2)的存在下将该供体和接受者的细胞一起培养，并且与移植体一起将接受者抑制子T细胞给予至接受者以防止该接受者的T细胞杀灭供体细胞，从而诱导耐受性和移植体的长期存活。
美国专利号6,803,036公开了用于处理供体细胞以在接受者患者中改善移植物抗宿主病的方法。该公开的方法包括从供体中取出PBMC并且用抑制性组合物(例如IL-10、IL-2、IL-4、IL-15和TGF-β)处理这些细胞充足的时间以诱导T细胞耐受性。然后将细胞导入至接受者患者中。在导入至患者之前，可以将经处理的细胞添加至供体干细胞中。
PCT公开号WO2010/049935公开了一种细胞的分离群体，其包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的非GVHD诱导抗第三方细胞，这些细胞是耐受性诱导细胞并且在移植后能够归巢至淋巴结。
发明内容
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种产生细胞的分离群体的方法，这些细胞包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，这些细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性的，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括：(a)在IL-21的存在下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，以允许富集抗原反应性细胞；和(b)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养由步骤(a)获得的细胞，以允许增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生细胞的分离群体。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种产生细胞的分离群体的方法，这些细胞包含具有中央型记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，这些细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有移植物抗白血病(GVL)活性的，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，方法包括：(a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁(non-adherent)的外周血单核细胞(PBMC)以获得CD8+T细胞；(b)在IL-21的存在下，使CD8+T细胞与第三方树突状细胞接触12小时至5天，以允许富集抗原反应性细胞；(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用第三方树突状细胞培养由步骤(b)获得的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养由步骤(c)获得的细胞5-20天以允许增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生细胞的分离群体。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种产生细胞的分离群体的方法，这些细胞包含具有中央型记忆性T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞，这些细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性的，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括：(a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁的外周血单核细胞(PBMC)以获得CD8+T细胞；(b)在IL-21的存在下，使CD8+T细胞与非同源的(非同基因的，non-syngeneic)树突状细胞接触12小时至5天以允许富集抗原反应性细胞；(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用非同源的树突状细胞培养由步骤(b)获得的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养由步骤(c)获得的细胞5-20天以允许增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞，从而产生细胞的分离群体。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种包含具有中央型记忆T细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，其中该细胞的分离群体的至少50％是CD3+CD8+细胞，CD3+CD8+细胞的至少50％包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+标记(signature)，并且进一步地，其中这些细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性的，并且在移植后能够归巢至淋巴结。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种根据本发明的方法产生的包含具有中央型记忆T细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，这些细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性的，并且在移植后能够归巢至淋巴结。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种在需要其的受试者中治疗疾病的方法，其中疾病选自由恶性疾病、病毒性疾病和自身免疫性疾病所组成的组，该方法包括向受试者给予治疗有效量的本发明的细胞的分离群体，从而治疗受试者。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种治疗需要细胞或组织移植的受试者的方法，该方法包括：(a)将细胞或组织移植体移植至受试者中；和(b)向受试者给予治疗有效量的本发明的细胞的分离群体，从而治疗受试者。
根据本发明的一些实施方式的方面，提供了一种治疗需要未成熟的造血细胞移植的受试者的方法，该方法包括：(a)将未成熟的造血细胞移植至受试者中；和(b)向受试者给予治疗有效量的本发明的细胞的分离群体，从而治疗受试者。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(a)之前，从PBMC中耗尽非贴壁细胞(非粘附细胞，non-adherentcell)。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(a)之前，从PBMC中耗尽CD4+和/或CD56+细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(a)之前，从PBMC中选择CD45RA+和/或CD45RO-细胞。
根据本发明的一些实施方式，PBMC包含CD8+T细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用一种或多种第三方抗原培养由步骤(a)获得的细胞。
根据本发明的一些实施方式，一种或多种第三方抗原包括树突状细胞。
根据本发明的一些实施方式，树突状细胞是经辐射的树突状细胞。
根据本发明的一些实施方式，一种或多种第三方抗原选自由以下组成的组：第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质以及由自体呈递细胞、非自体呈递细胞呈递的或在人工载体或人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
根据本发明的一些实施方式，第三方细胞是选自由以下组成的组的刺激细胞：纯化自外周血淋巴细胞、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞和人工抗原呈递细胞的细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(a)之后且在步骤(b)之前，从PBMC中选择CD45RA+和/或CD45RO-细胞。
根据本发明的一些实施方式，CD8+T细胞包含幼稚CD8+T细胞(初始CD8+T细胞，CD8+Tcell)。
根据本发明的一些实施方式，树突状细胞包括体外扩增的树突状细胞。
根据本发明的一些实施方式，树突状细胞包括经辐射的树突状细胞。
根据本发明的一些实施方式，在IL-21存在下的接触进行12小时至5天。
根据本发明的一些实施方式，在IL-21存在下的接触进行2至3天。
根据本发明的一些实施方式，在IL-21存在下的接触进行3天。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前选择经活化的细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括在步骤(b)之后且在步骤(c)之前选择经活化的细胞。
根据本发明的一些实施方式，选择经活化的细胞是通过选择CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
根据本发明的一些实施方式，选择经活化的细胞在接触之后进行12至72小时。
根据本发明的一些实施方式，在IL-21、IL-15和IL-7存在下，用一种或多种第三方抗原的培养进行12小时至3天。
根据本发明的一些实施方式，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7存在下的培养进行5至20天。
根据本发明的一些实施方式，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7存在下的培养进行7至11天。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(b)之后，耗尽同种异体反应性(同种异基因反应性，alloreactive)细胞。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在步骤(d)之后，耗尽同种异体反应性细胞。
根据本发明的一些实施方式，耗尽同种异体反应性细胞是在使包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)的细胞与宿主抗原呈递细胞(APC)接触之后通过耗尽CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
根据本发明的一些实施方式，外周血单核细胞(PBMC)相对于受试者是同源的(syngeneic)。
根据本发明的一些实施方式，外周血单核细胞(PBMC)相对于受试者而言是非同源的。
根据本发明的一些实施方式，非同源的PBMC相对于受试者是异种的或同种异体的。
根据本发明的一些实施方式，具有T中央型记忆表型的抗第三方细胞包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+标记。
根据本发明的一些实施方式，分离群体的细胞的至少50％是CD3+CD8+细胞，这些CD3+CD8+细胞的至少50％具有标记。
根据本发明的一些实施方式，恶性疾病包括白血病或淋巴瘤。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体与受试者是同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体与受试者是非同源的。
根据本发明的一些实施方式，方法包括：在移植之前，在亚致死(sublethal)、致死或超致死(supralethal)的条件下调理受试者。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体与受试者是同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体来源于选自由HLA相同的同种异型供体、HLA不相同的同种异型供体和异种供体组成的组的供体。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体包含未成熟的造血细胞。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体选自由肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺脏、皮肤、肠和淋巴/造血组织或器官所组成的组。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体包括联合移植的多个器官。
根据本发明的一些实施方式，联合移植包括移植未成熟的造血细胞和实体器官(solidorgan)。
根据本发明的一些实施方式，未成熟的造血细胞和实体器官获自同一供体。
根据本发明的一些实施方式，未成熟的造血细胞是在实体器官的移植之前、同时或之后进行移植的。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体是在细胞或组织移植之前、同时或之后给予的。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体与受试者是同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体与受试者是非同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体与细胞的分离群体来源于同一供体。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体与受试者是同源的而细胞的分离群体与受试者是非同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞或组织移植体与受试者是同源的并且细胞的分离群体与受试者是同源的。
根据本发明的一些实施方式，细胞的分离群体是在未成熟的造血细胞之前、同时或之后给予的。
根据本发明的一些实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于同一供体。
根据本发明的一些实施方式，供体与受试者是非同源的。
根据本发明的一些实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于受试者。
根据本发明的一些实施方式，方法进一步包括：在移植之前在亚致死、致死或超致死的条件下调理受试者。
根据本发明的一些实施方式，受试者是人类受试者。
除另有限定外，本文中所使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实施方式的实践或测试中可以使用与本文的方法和材料类似或等同的方法和材料，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，本专利说明书(包含定义)将优先考虑。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非旨在进行必要的限制。
附图说明
本文仅通过举例的方式参照附图描述了本发明的一些实施方式。现在具体参照附图的细节，需要强调的是，所示的细节仅是举例且其目的在于说明性地讨论本发明的实施方式。在这一点上，对于本领域技术人员来说，在结合说明书和附图之后，如何可以实践本发明的实施方式将是显而易见的。
在附图中：
图1A至图1B是描绘人类自体(autologous)(图1A)和人类同种异体(图1B)设置的示意图。值得注意的是，该两种设置的彼此差异在于参与Tcm产生的骨髓(BM)供体(宿主与同种异体)、应答子(responder)(宿主与同种异体)和刺激子(stimulator)(任何同种异体供体和与宿主MHC没有交叉反应的第3方)的来源。
图2A至图2B是描绘小鼠同源(图2A)和同种异体(图2B)设置的示意图。值得注意的是，该两种设置的彼此差异在于参与Tcm产生的BM供体(同源或F1与同种异体)、应答子(同源或F1与同种异体)和刺激子(同种异体与第三方)的来源。
图3A至图3B是描绘用于产生Tcm的自体人类方案(protocol)(图3A)与同源小鼠方案(图3B)的比较的示意图。
图4A至图4C描绘了抗第3方中央型记忆产生(“参考对照实验”)的动力学。在含有IL-21的培养基中，用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率刺激幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步活化而在含有IL-7和IL-15的培养基中扩增直至第12.5天。在第7.5、10.5和第12.5天，使用FACS分析来评价细胞的表型(表面标志物表达)(图4A)和来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比(图4B)，并且通过台盼蓝拒染法(台盼蓝排除法，trypanblueexclusion)来评价细胞数量(图4C)。对于每个时间点，数据表示为n个独立实验的平均值±SE。
图5A至图5C描绘了展示同种异体DC的引发(priming)作用的典型实验。值得注意的是，没有DC引发的单独的IL-21或IL-7加IL-15在幼稚CD8T细胞中不能诱导中央型记忆表型并且不良地支持它们的扩增。图5A图解了在含有IL-21的培养基中用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率刺激3天的CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21+DCd(3-13)IL7+IL15)；图5B至图5C图解了在在不存在刺激下用IL-21(图5B)或用IL-7和IL-15的组合(图5C)分别培养至第10或第13天的CD8T细胞。
图6A至图6B描绘了同种异体DC的引发的作用，通过对Tcm水平的平均相对影响以及相对于参考对照组的倍数扩增来展示。在含有IL-21的培养基中以4:1的比率用经辐射的同种异体第三方DC刺激幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21+DCd(3-13)IL7+IL15)。可替代地，在不存在刺激下用IL-21或用IL-7和IL-15的组合培养幼稚CD8T细胞直至第13天。通过台盼蓝拒染法评价细胞的细胞数(图6A)，并且使用FACS分析评价来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比(图6B)。对于每个时间点，数据表示为n个独立实验的平均值±SE。
图7A至图7C描绘了展示IL-21在抗第三方Tcm的引发和扩增阶段中的作用的典型实验。值得注意的是，从引发阶段去除IL-21降低了扩增和Tcm诱导，而在整个培养中存在IL-21则增加了Tcm诱导。图7A图解了在含有IL-21的培养基中以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激3天的幼稚CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步活化而用IL-7和IL-15扩增直到第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21+DCd(3-13)IL7+IL15)；图7B至图7C图解了在不存在IL-21下以4:1的比率用经辐射的第3方DC刺激3天的幼稚CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(图7B)，或者在引发阶段(单独的IL-21)和在扩增阶段(与IL-7和IL-15一起)中用持续存在IL-21以4:1的比率用经辐射的第3方DC刺激(图7C)。
图8A至图8B描绘了需要IL-21以优化Tcm产率(多个独立实验的平均值)。如上处理幼稚CD8T细胞并且通过台盼蓝拒染法评价培养物的细胞数(图8A)，并且使用FACS分析评价来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比(图8B)。分别示出每个实验的结果，且线条表示了n个实验的平均结果。
图9A至图9B描绘了用于诱导Tcm表型和强扩增的最佳应答子/DC比。在IL-21的存在下，以逐渐增多数量的经辐射的同种异体第3方DC刺激4x105个幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21+100,00DCd(3-13)IL7+IL15)。由台盼蓝拒染法评价培养物的细胞数(图9A)，并且使用FACS分析评价来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比(图9B)。分别示出每个实验的结果且线条表示n个实验的平均结果。
图10描绘了不同的GMP级试剂对CD8+和幼稚CD8+CD45RA+T细胞的富集的影响的评价。通过在专门设计用来去除贴壁的骨髓细胞的板中过夜孵育以耗尽供体PBMC的贴壁细胞(上图)，并且在第0天，将非贴壁细胞分为四个测试组，每个测试组进行不同的磁分选方案。通过FACS分析评价细胞的细胞组成及Tcm表型。左列(CD45RO和CD45RA)中的结果是在CD3+CD8+细胞上选通(gated)的。此结果代表了所进行的两个独立实验中的典型实验。
图11描绘了示出在用第3方DC刺激后7天，用于分离CD8T细胞的不同GMP级试剂对具有Tcm表型并污染有NK和NKT细胞的CD8+T细胞的比例的影响的典型实验。将保持在具有单独IL-7的培养物中的未刺激的细胞用作参考(上图)。最左列(CD45RO和CD45RA)与最右列(CD62L和CD45RO)中的结果是在CD3+CD8+细胞上选通的。
图12描绘了示出在用第3方DC刺激后14天，用于分离CD8T细胞的不同GMP级试剂对具有Tcm表型并污染有NK和NKT细胞的CD8+T细胞的比例的影响的典型实验。将保持在具有单独IL-7的培养物中的未刺激的细胞用作参考(上图)。最左列(CD45RO和CD45RA)与最右列(CD62L和CD45RO)中的结果是在CD3+CD8+细胞上选通的。
图13A至图13B描绘了用于分离CD8T细胞的不同GMP级试剂对在用第3方DC刺激7天后的具有Tcm表型的CD8T细胞水平的影响。CD3+CD8+NKT-T细胞(图13A)和Tcm(图13B)的平均百分比显示为在利用了所有4种试剂(CD4/CD56/CD19/CD45RA)的最佳对照组中获得的水平的百分比。
图14A至图14C描绘了用于分离CD8T细胞的不同GMP级试剂对在用第3方DC刺激10天后的具有Tcm表型的CD8T细胞的最终产率的影响。在第10天，从第0天的平均倍数扩增(图14A)以及在磁力分选后的平均产率(图14B)表示为在利用所有四种选择试剂(CD4/CD56/CD19/CD45RA)的最佳对照组中获得的水平的百分比。通过将磁力分选后的产率(在第0天)乘以从第0天(在第10天)的倍数扩增来计算在第10天的Tcm的产率(图14C)。
图15描绘了改变同种异体DC刺激子的来源对Tcm细胞的扩增潜力仅有轻微的影响。使用CliniMacs系统通过耗尽CD4+和CD56+细胞从解冻白细胞分离物(leukapheresis)中富集CD8T细胞。然后将富集的CD8T细胞分为两个测试组，在培养袋中，用不同的经辐射的同种异体第三方DC以6:1的比率在含有IL-21的培养基中刺激每个测试组3天。此后，细胞未接受进一步活化而在含有IL-7、IL-15和IL-21的培养基中扩增直至第11天。在第5、7、9和11天，由台盼蓝拒染法测定培养物的细胞数。
图16A至图16B描绘了改变同种异体DC刺激子的来源对细胞组成只有轻微的影响。使用用于大规模分离的CliniMacs系统通过耗尽CD4+和CD56+细胞从解冻白细胞分离物中富集CD8T细胞。然后将富集的CD8T细胞分为两个测试组，在培养袋中，用不同的经辐射的同种异体第三方DC(分别为图16A和16B)以6:1的比率在含有IL-21的培养基中刺激每个测试组3天。此后，细胞未接受进一步的活化而在含有IL-7、IL-15和IL-21的培养基中扩增直至第11天。在第0、5、9和12天，通过FACS分析评价培养细胞的细胞组成。所有的结果都是从淋巴选通和存活选通(7AAD-)来选通的。
图17A至图17B描绘了改变同种异体DC刺激子的来源对细胞组成只有轻微的影响。使用CliniMacs系统通过耗尽CD4+和CD56+细胞从解冻白细胞分离物中富集CD8T细胞。然后将富集的CD8T细胞分为两个测试组，在培养袋中，用不同的经辐射的同种异体第三方DC以6:1的比率在含有IL-21的培养基中刺激每个测试组3天。此后，细胞未接受进一步的活化而在含有IL-7、IL-15和IL-21的培养基中扩增直至第11天。在第0、5、9和12天，通过FACS分析评价培养细胞的Tcm表型(CD45RO+CD62L+)组成。所有的结果都是从淋巴选通和存活选通(7AAD-)与CD8T细胞(CD3+CD8+CD56-CD16-)来选通的。
图17C描绘了在与B细胞淋巴瘤和浆细胞白血病细胞系的混合淋巴细胞反应(MLR)22小时后的凋亡细胞百分比。在有和没有5倍过量的抗第3方Tcm的条件下孵育钙黄绿素AM预标记的Daudi,H.My2C1RHLAA2K66A突变体或L363细胞系22小时。通过FACS测定膜联蛋白V+(AnnexinV+)细胞。数据显示为五个重复培养物的平均值±SD。***p<0.001数值表示与在不存在Tcm的条件下培养的样品相比存在统计学显著变化。
图18描绘了显示富集CD8T细胞的典型实验，其在移植物抗白血病(GVL)检测前的第14天，通过使用磁珠分选，广泛地耗尽非CD8T细胞(即，CD4+T细胞、γ/δT细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、粒性细胞和红细胞系细胞)。
图19A至图19D描绘了H.MyC1R(“Neo”)和H.MyC1RHLAA2K66A突变体转染子(transfectant)(“K66A”)B-细胞淋巴母细胞(lymphoblastoidcell)系，它们用钙黄绿素AM标记，钙黄绿素AM是在细胞死亡后会释放的活体染料，然后在1至5比率的、有或没有抗第3方Tcm细胞的条件下孵育22小时，该比率有利于抗第3方Tcm细胞。22小时后，回收细胞并且通过测量幸存的钙黄绿素+染色细胞的数量来分析存活率，并且通过FACS分析来自钙黄绿素+群体的膜联蛋白V+细胞来分析凋亡。图19A至图19B和图19C至图19D分别代表了两个独立的实验；图19A和图19C示出杀灭而图19B和图19D示出凋亡。
通过以下公式来计算B淋巴母细胞系细胞杀灭的百分比：
负值意味着在Tcm的存在下增殖了B-细胞淋巴母细胞系。
通过以下公式来计算经历了特定的凋亡的B淋巴母细胞系细胞的百分比：＝(评估孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)–(对照孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)。
图20描绘了用于分离CD8T细胞的不同GMP级试剂对K66A杀灭水平的影响。在有利于抗第三方Tcm细胞的1至5比率下有或没有抗第三方Tcm细胞的条件下，孵育H.MyC1RHLAA2K66A突变体转染子细胞系22小时。在22小时后，回收细胞并且通过FACS测量幸存的钙黄绿素+染色细胞的数量来分析存活率(两个独立实验的平均值)。H.MyC1RHLAA2K66A突变细胞的平均杀灭百分比显示为通过采用所有四种试剂(CD4/CD56/CD19/CD45RA)分离的最佳对照组获得的水平的百分比。
图21至图22是描绘用于产生用于自体移植(图21)和同种异体移植(图22)的Tcm的方案的示意图。
图23A至图23D描绘了一个典型实验，其展示了添加细胞因子的时间对在由同种异体第3方单核细胞来源的成熟DC刺激的CD8T细胞中诱导Tcm表型的作用。图23A图解了在含有IL-21的培养基中以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激3天的幼稚CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21+DCd(3-13)IL7+IL15)；图23B图解了在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激7天的幼稚CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天；图23C图解了在引发阶段(单独的IL21)及扩增阶段(连同IL-15一起)中持续存在IL-21下，以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激的CD8T细胞；图23D图解了在匮乏(deprivation)细胞因子的条件下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激7天的CD8T细胞。此后，细胞未接受进一步的活化而用单独的IL-15扩增直至第13天。
图24A至图24B描绘了在人类同种异体模型中添加细胞因子的时间的作用；实验总结。在含有IL-21的培养基中以4:1的比率使经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15扩增直至第13天(“参考对照组”＝d(0-3)IL21→d(3-13)IL7+IL15)。其他组按图表中所示的进行处理。通过台盼蓝拒染法评价培养物的细胞数(图24A)，并且使用FACS分析来评价来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比(图24B)。对于每个时间点，数据表示所示数量(n)的独立实验的平均值±SE。
图25描绘了通过阳性选择CD137+细胞来富集抗第3方特异性CD8T细胞。在IL-21的存在下，用经辐射的同种异体第3方DC(以5.7:1的比率)刺激幼稚CD8T细胞。在刺激14小时后，通过磁力分选来阳性地选择CD137+细胞。通过FACS来评价CD8T细胞上的CD137的表达。
图26描绘了通过阳性选择CD137+细胞来富集抗体第3方特异性CD8T细胞没有降低Tcm表型的获得。在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步的活化并用IL-7和IL-15扩增直至第10天(“参考对照组”)。可替代地，在IL-21的存在下以5.7:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。在刺激14天后，通过磁力分选阳性地选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC再刺激CD137+细胞直至第3天。此后，用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天。通过FACS分析细胞来评价来自CD8T细胞的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比。
图27描绘了增殖动力学的比较。在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞3天。此后所细胞未接受进一步的活化并用IL-7和IL-15对其进行扩增直至第14天(“参考对照组”)。或者，在IL-21的存在下以5.7:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。在活化14小时后，通过磁力分选来阳性地选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC再刺激CD137+细胞直至第3天。此后用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天。在第10天，将细胞分成两个测试组。在第一组中，用IL-7和IL-15继续扩增细胞直至第14天(“抗第3方CD137+”)，而在IL-7和IL-15(在1至2的比率)的存在下用经辐射的宿主PBMC活化第二测试组中的细胞。24小时后，通过磁力分选耗尽CD137+细胞。用IL-7和IL-15重新接种CD137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第3方CD137+和抗宿主CD137-”)。在指定的天数通过台盼蓝拒染法计数细胞。
图28描绘了在用经辐射的宿主PBMC活化后通过耗尽CD137+细胞来耗尽抗宿主特异性克隆。在培养的第10天(阳性选择抗第3方特异性克隆的9天后)，在IL-7和IL-15的存在下通过经辐射的宿主PBMC(以1:2的比率，有利于宿主PBMC)活化细胞。24小时后，使细胞耗尽CD137+细胞。通过FACS分析评价CD8T细胞上CD137的表达。
图29描述了二阶段磁力分选技术，其基于抗原特异性活化CD8T细胞后的CD137上调成功地耗尽抗宿主克隆并且增加对第3方抗原特异的细胞的百分比。在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞3天。此后细胞未接受进一步的活化并用IL-7和IL-15扩增直至第14天(“参考对照组”)。可替代地，在IL-21的存在下以5.7:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。在活化14小时后，通过磁力分选阳性地选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC再刺激CD137+细胞直至第3天。此后，用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天。在第10天，将细胞分成两个测试组。在第一个组中，用IL-7和IL-15继续扩增细胞直至第14天(“抗第3方CD137+”)，而在IL-7和IL-15(以1至2的比率)的存在下用经辐射的宿主PBMC活化第二测试组中的细胞。在24小时后，通过磁力分选耗尽CD137+细胞。用IL-7和IL-15再接种CD137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第3方CD137+和抗宿主CD137-”)。在第14天，通过CFSE检测针对第3方或经辐射的宿主PBMC评价抗第3方和抗宿主同种异体反应性。对于CFSE检测，在IL-7的存在下，在有和没有2x106个(20gy)经辐射的PBMC刺激子的条件下孵育1x106个CFSE+应答子84小时。84小时后，回收细胞并且通过FACS通过测量CFSE低染色的CD8T细胞(CD3+CD8+CD56-)的细胞数量来分析细胞分裂。为了获得细胞的绝对值，将样品悬浮于恒定体积中，并且在恒定的预定时间段内对每个样品进行流式细胞计数。具体的分裂细胞数＝(具有APC的分裂细胞的数目)–(不具有APC的分裂细胞的数目)。负值意味着，响应于宿主PBMC活化作用的分裂细胞的数目甚至低于不含任何活化作用的分裂细胞的数目。
具体实施方式
本发明在其一些实施方式中涉及包含中央型记忆T淋巴细胞表型的耐受诱导和/或移植物抗白血病反应性抗第三方细胞，并且更具体地但不排他地涉及其产生方法并且涉及其在移植和在疾病治疗中的应用。
参照附图和所附的描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细讲解本发明的至少一个实施方式之前，可以理解的是，本发明在其应用方面并不局限于以下说明书中列示的细节或其实施例所例示的细节。本发明能够采用其他实施方式或能够以不同的方式来实践或实施。另外，可以理解的是，本文所采用的措辞和术语是出于描述的目的，而不应被视为限制。
当将本发明应用于实践时，本发明者们已经发现了一种抗第三方中央型记记T(Tcm)细胞的改进的群体，其在移植后归巢至淋巴结并且诱导耐受性和抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)而不诱导移植物抗宿主(GVH)反应。
如下文中以及随后的实施例章节中所示出的，本发明者们提供了产生用于同种异体和自体应用的Tcm细胞的方法。如图1A和图21所示的，通过首先在IL-21的存在下将CD8+T细胞暴露于同种异体刺激物(例如树突状细胞)接触3天，随后向具有抗原刺激物的细胞中加入IL-15和IL-7，再接触1至2天，从而产生了赋有抗疾病活性(例如抗肿瘤活性)的自体Tcm细胞。随后，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下将所获得的细胞再培养6至8天。
如图1B和图22所描绘的，通过首先在IL-21的存在下将CD8+T细胞暴露于第三方刺激物(例如树突状细胞)3天，产生了同种异体Tcm细胞，其是耐受性诱导细胞并且赋有GVL活性。从培养开始约14小时后，通过阳性选择CD137+来选择经活化的细胞，并且用IL-21再培养这些细胞。随后，向具有抗原刺激物的IL-21培养物中添加IL-15和IL-7再培养1至2天。随后，在无抗原的环境中在IL-21、IL-15和IL-7的存在下将所获得的细胞再培养6至8天。在培养结束时，在使Tcm细胞与宿主型抗原呈递细胞(例如树突状细胞)接触之后，通过耗尽CD137+细胞来耗尽Tcm细胞的同种异体反应性细胞。
由本发明者们产生的细胞包含多于50％的CD3+CD8+细胞并且包含TCR非依赖性抗白血病活性(参见实施例2)，CD3+CD8+细胞的多于50％是Tcm细胞(即包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+标记，例如参见下列实施例章节的实施例1)。
合起来看，这些结果证实，在同种异体移植是必要的情况下(例如造血干细胞移植或实体器官移植)，抗第三方Tcm细胞能够用作移植物促进细胞并且用于疾病治疗。另外，这些结果证实，在需要自体移植的情况下(例如对于血液系统恶性肿瘤而言)，第三方Tcm细胞能够在疾病治疗中进行应用。
因此，根据本发明的一个方面，提供了包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的非-GVHD诱导抗第三方细胞的细胞的分离群体，细胞是耐受性诱导细胞并且在移植之后能归巢至淋巴结。
本文中使用的用语“细胞的分离群体(isolatedpopulationofcells)”是指已经从它们的自然环境(例如人体)中分离出来的细胞。
本文中使用的术语“非-GVHD(non-GVHD)”是指具有显著降低的移植物抗宿主诱导反应性或不具有移植物抗宿主诱导反应性。因此，正如在移植后的100天内通过受移植的受试者的生存、体重和整体外表所证明的，所产生的本发明的细胞不会显著导致移植物抗宿主病(GVHD)。
本文中使用的术语“同源的(syngeneic)”是来源于基本上与受试者基因相同的个体的细胞或组织。典型地，基本上完全近交的哺乳动物、哺乳动物克隆或纯合子孪生哺乳动物是同源的。
同源细胞或组织的实例包括来源于受试者的细胞或组织(在本领域中也称为“自体的”)、受试者的克隆或受试者的纯合孪生子。
本文中使用的术语“非同源的(non-syngeneic)”是指来源于与受试者的淋巴细胞是同种异体的(allogeneic)或异种的(xenogeneic)个体的细胞或组织。
本文中使用的术语“同种异体的(同种异型的、同种异基因的，allogeneic)”是指来源于与受试者是相同的物种但是与受试者基本上是非克隆的供体的细胞或组织。典型地，相同物种的远交(outbred)系、非合子(non-zygotic)孪生哺乳动物彼此之间是同种异体的。但应当理解的是，相对于受试者，同种异体供体可以是HLA相同或HLA不相同的。
本文中使用的术语“异种的(xenogeneic)”是指细胞或组织其相对于受试者的相当大比例的淋巴细胞的种类而言，基本上表达不同种类的抗原。典型的，不同种类的远交哺乳动物彼此之间是异种的。
本发明设想了来源于各种物种的异种细胞或组织，例如但不限于牛科动物(例如，奶牛)、马科动物(例如，马)、猪类(例如猪)、羊科动物(ovids)(例如，山羊、绵羊)、猫科动物(例如，家猫(Felisdomestica))、犬科动物(例如，家犬(Canisdomestica))、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠)或灵长类(例如，黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴)。
异种来源(例如猪源)的细胞或组织优选获自已知没有人畜共患病(zoonose)(如，猪内源性逆转录病毒)的来源。类似地，人类来源的细胞或组织优选获自基本上无病原体的来源。
本文中使用的用语“抗-第三方细胞(anti-thirdpartycell)”是指靶向(例如通过T细胞识别)一种或多种第三方抗原的淋巴细胞(例如T淋巴细胞)。
本文中使用的用语“一种或多种第三方抗原(thirdpartyantigenorantigens)”是指在供体或接受者中不存在的可溶性或不溶性(例如膜相关的)的一种抗原或多种抗原，如下文中的详细描述。
例如，第三方抗原可以是第三方细胞、病毒的抗原，如例如埃-巴二氏病毒(EBV)或巨细胞病毒(CMV)或细菌的抗原，如鞭毛蛋白。病毒性抗原或细菌性抗原可通过用其感染的细胞(例如细胞系)来呈递或由通过其他方式使细胞来表达病毒/细菌蛋白质。自体或非自体抗原呈递细胞可以用来呈递与其融合或负载的短合成肽。此类短肽可以是病毒来源的肽或代表任何其他抗原的肽。
可以使用专用软件来分析病毒或其他序列以鉴定免疫原性短肽，即，I类MHC或II类MHC中存在的肽。
相对于接受者来说，第三方细胞可以是同种异体的或异种的(下文中进行了进一步的详细说明)。在同种异体第三方细胞的情况下，此类细胞具有不同于供体但是其与接受者HLA抗原不发生交叉反应的HLA抗原，以便针对此类细胞产生的抗第三方细胞不具有针对移植体或接受者抗原的反应性。
根据本发明的一个实施方式，同种异体或异种的第三方细胞是选自由纯化自外周血淋巴细胞(PBL)、脾脏或淋巴结、细胞因子动员的PBL、体外扩增的抗原呈递细胞(APC)、体外扩增的树突状细胞(DC)和人工抗原呈递细胞的细胞组成的组的刺激细胞。
本发明的人工APC可以被设计以表现与第3方肽或第3方MHC的自体MHC，而不会与外源肽致敏(pulsed)。因此，根据一个实施方式，人工APC包含用第三方MHC决定簇(determinant)和共刺激分子转染的K562肿瘤细胞[如先前所描述的，例如SuhoskiMM等,MolTher.(2007)15(5):981-8]、或者使用第三方MHC决定簇和共刺激分子转染的成纤维细胞。
第三方抗原可呈递在细胞、病毒或细菌的表面上或者由其衍生和/或纯化。此外，病毒或细菌抗原可展示(display)在被感染的细胞上，而细胞抗原可以展示在人工载体(例如脂质体)或人工抗原呈递细胞(例如用一种或多种第三方抗原转染的白血病或成纤维细胞系)上。
第三方抗原可以进一步包括由自体呈递细胞、非自体呈递细胞呈递的或呈递在人工载体或人工抗原呈递细胞上的合成肽。
另外，第三方抗原例如可以是提取或纯化自各种来源的蛋白质。可以用作本发明的第三方抗原的纯化的蛋白质的实例是卵白蛋白。可以设想其他实例。
利用细胞、病毒、细菌、病毒感染的细胞、细菌感染的细胞、病毒肽呈递细胞或细菌肽呈递细胞作为第三方抗原是特别有利的，因为此类第三方抗原包括多样化的抗原决定簇并且如此引导形成多样化群体的抗第三方细胞，在需要此类重建的情况下，这可以进一步用于更快速地重建T细胞例如在经过致死或亚致死的辐射或化疗过程之后。
此外，当抗第三方细胞针对第三方抗原时，细胞被赋有抗疾病活性。术语“抗疾病活性(anti-diseaseactivity)”是指Tcm细胞抵抗患病细胞(例如癌症细胞，如移植物抗白血病(GVL)活性)的活性(例如，杀灭能力)。这种活性典型地是由于由LFA1-I/CAM1结合介导的TCR非依赖性杀灭所带来的[Arditti等,Blood(2005)105(8):3365-71.Epub2004Jul6]。
根据本发明的一个实施方式，第三方细胞包含树突状细胞。
根据本发明的一个实施方式，第三方细胞包含成熟树突状细胞。
产生第三方树突状细胞(其可以用作用于诱导Tcm细胞的刺激细胞)的方法在本领域中是众所周知的。因此，作为非限制性的实例，可以从第三方非同源细胞供体获得外周血单核细胞(PBMC)[例如在Tcm细胞是同源的情况下，例如自体的，那么相对于受试者，树突状细胞(DC)可以是非同源的，例如同种异体的；而当Tcm细胞是非同源的，例如同种异体的，那么DC选自于是非同源的供体，例如同种异体的，并且HLA与受试者和Tcm细胞都是不匹配的]。然后，可以通过塑料吸附并且使用补充有人血清(例如1％的人血清)、青霉素/链霉素和GM-CSF(800IU/ml)以及IL-4(20ng/ml)(可获自例如Peprotech,Hamburg,Germany)的DC细胞培养基进行培养(例如在细胞培养板中)来分离单核细胞。在培养约48小时后，可以添加包含GM-CSF(1600IU/ml)和IL-4(20ng/ml)的DC培养基。约24小时后，可以收获非贴壁细胞，并且可以将大细胞(大多为不成熟的DC)重新悬浮于含有GM-CSF(800IU/ml)、IL-4(20ng/ml)、LPS例如来自大肠杆菌O55:B5，10ng/ml)和IFNγ100IU/ml)(可获自例如Peprotech,Hamburg,Germany)的新鲜培养基中，接种并且孵育过夜。第二天，可以弃去非贴壁细胞，并且在冰下孵育20分钟后，使用例如冷的PBS/1％HS温和地取出贴壁的DC，从而获得了由成熟DC组成的大细胞。
根据一个实施方式，第三方细胞包含经辐射的树突状细胞。
因此，根据一个实施方式，以约5-10Gy、约10-20Gy、约20-30Gy、约20-40Gy、约20-50Gy、约10-50Gy来辐射DC。根据一个具体的实施方式，以约10-50Gy(例如30Gy)来辐射DC。
根据一些实施方式，本发明的抗第三方细胞包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型。
本文中使用的用语“中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型(centralmemoryT-lymphocyte(Tcm)phenotype)”是指归巢至淋巴结的T细胞毒性细胞的子集。在人类中，具有Tcm表型的细胞典型地包含CD3+/CD8+/CD62L+/CD45RO+/CD45RA-标记。可以理解的是，Tcm细胞可以在单个细胞上表达所有的标记的标志物或者可以在单个细胞上供表达标记的标志物的一部分。
可以理解的是，细胞的分离群体的至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至100％是CD3+CD8+细胞。根据具体的实施方式，细胞的分享群体包含约70-90％的CD3+CD8+细胞。
可以理解的是，CD3+CD8+细胞的至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或甚至100％具有Tcm细胞标记。根据具体的实施方式，约30-80％的CD3+CD8+细胞具有Tcm细胞标记(例如40-50％)。
根据一个实施方式，提供了包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，其中细胞的分离群体的至少50％是CD3+CD8+细胞，该CD3+CD8+细胞的至少50％包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+标记，并且进一步地，其中细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结。
如前，Tcm细胞典型地在移植之后归巢至淋巴结。根据一些实施方式，本发明的抗第三方Tcm细胞在移植之后可以归巢至淋巴结，例如，外周淋巴结和肠系膜淋巴结。这些细胞的归巢特性使得它们能够以快速且有效的方式发挥其耐受性作用。
因此，本发明的抗第三方Tcm细胞是耐受性诱导细胞。
本文中使用的用语“耐受性诱导细胞(toleranceinducingcell)”是指这样的细胞，与不存在经给予的耐受性诱导细胞的接受者的细胞(例如接受者的T细胞)的响应性相比，当接受者的细胞接触细胞时，细胞降低了接受者的细胞的响应性。耐受性诱导细胞包括禁止细胞(即导致与其接触的宿主T细胞凋亡的T细胞)，如先前在PCT公开号WO2001/049243和WO2002/102971中所描述的。
根据一些实施方式，本发明的Tcm细胞可以是非基因修饰的细胞或基因修饰的细胞(例如，已经过基因工程设计以表达或不表达特定基因、标记物或肽或以分泌或不分泌特定细胞因子的细胞)。可以使用本领域中任何已知的方法来基因工程设计细胞，例如通过失活相关基因或通过插入干扰多肽表达的反义RNA(参见例如WO/2000/039294，在此通过引用的方式并入)。
根据本发明的一些实施方式，提供了一种产生细胞的分离群体的方法，该方法包括：(a)在IL-21的存在下，使外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原接触，从而富集抗原反应性细胞；和(b)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(a)的细胞，从而增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
本发明的抗第三方Tcm细胞典型地是通过首先在补充有IL-21的培养物(或其他不含细胞因子的培养物，即未添加任何另外的细胞因子)中使同源或非同源的外周血单核细胞(PBMC)与一种或多种第三方抗原(例如，如上的)接触来产生的。这个步骤通常进行约12至24小时、约12至36小时、约12至72小时、24至48小时、24至36小时、约24至72小时、约48至72小时、1至2天、2至3天、1至3天、2至4天、1至5天、2至5天、2至6天、1至7天、5至7天、2至8天、8至10天或1至10天，并且允许富集抗原反应性细胞。根据具体的实施方式，在补充有IL-21的培养物(或其他不含细胞因子的培养物)中使同源或非同源的PBMC与一种或多种第三方抗原(例如，如上所描述的)的接触进行1至5天(例如3天)。这个步骤是典型地是在约0.001至3000ng/ml、0.001至1000ng/ml、0.01至1000ng/ml、0.1至1000ng/ml、1至1000ng/ml、10至1000ng/ml、10至500ng/ml、10至300ng/ml、10至100ng/ml、100至1000ng/ml、1至100ng/ml、1至50ng/ml、1至30ng/ml、10至50ng/ml、10至30ng/ml、10至20ng/ml、20至30ng/ml、20至50ng/ml、30至50ng/ml、30至100ng/ml、1至10ng/ml、0.1至10ng/ml、0.1至100ng/ml、1ng/ml、10ng/ml至100ng/ml的IL-21的存在下来进行的。根据具体的实施方式，IL-21的浓度为10至50ng/ml(例如30ng/ml)。
根据具体的实施方式，在不含细胞因子的培养物(例如仅补充有IL-21)中使同源或非同源的PBMC与一种或多种第三方抗原接触，此种培养条件仅能够使得可以承受一种或多种第三方抗原的刺激并活化的那些细胞(即抗原反应性细胞)存活并富集，因为这些细胞可以分泌促使它们存活的细胞因子(例如IL-2)(所有其余细胞在这些培养条件下都会死亡)。
一种或多种第三方抗原(例如树突状细胞)与PBMC的比率典型地为约1:1至约1:10，例如约1:4、约1:6、约1:8或约1:10。根据具体的实施方式，一种或多种第三方抗原(例如树突状细胞)与PMBC的比率为约1:2至约1:8(例如1:4)。
其次，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下培养抗第三方细胞，从而增殖包含Tcm表型的细胞。这个步骤典型地进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-20天、1-15天、1-10天、1-5天、5-20天、5-15天、5-10天、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、2-5天、2-8天、2-10天、4-10天、4-8天、6-8天、8-10天、7-9天、7-11天、7-13天、7-15天、10-12天、10-14天、12-14天、14-16天、14-18天、16-18天或18-20天。根据具体的实施方式，在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，将抗第三方细胞培养约7-11天(例如8天)。
这个步骤典型地是在浓度为约0.001-3000ng/ml、0.001-1000ng/ml、0.01-1000ng/ml、0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、10-500ng/ml、10-300ng/ml、10-100ng/ml、100-1000ng/ml、1-100ng/ml、1-50ng/ml、1-30ng/ml、10-50ng/ml、10-30ng/ml、10-20ng/ml、20-30ng/ml、20-50ng/ml、30-50ng/ml、30-100ng/ml、1-10ng/ml、0.1-10ng/ml、0.1-100ng/ml、1ng/ml-100ng/ml的IL-21的存在下进行的。根据具体的实施方式，IL-21的浓度为10-50ng/ml(例如30ng/ml)。
这个步骤是进一步在浓度为约0.001-3000ng/ml、0.001-1000ng/ml、0.01-1000ng/ml、0.05-1000ng/ml、0.1-1000ng/ml、0.5-1000ng/ml、0.05-500ng/ml、0.5-500ng/ml、0.1-100ng/ml、0.1-10ng/ml、0.5-100ng/ml、1-100ng/ml、5-100ng/ml、1-50ng/ml、5-50ng/ml、1-10ng/ml、5-10ng/ml、1-5ng/ml、2-3ng/ml、2-5ng/ml、2-7ng/ml、3-5ng/ml、3-7ng/ml、4-5ng/ml、5-6ng/ml、5-7ng/ml、1-8ng/ml、10-100ng/ml、10-1000ng/ml、100-1000ng/ml的IL-15的存在下进行的。根据具体的实施方式，IL-15的浓度为1-10ng/ml(例如5ng/ml)。
这个步骤是进一步在浓度为约0.001-3000ng/ml、0.001-1000ng/ml、0.01-1000ng/ml、0.05-1000ng/ml、0.1-1000ng/ml、0.5-1000ng/ml、0.05-500ng/ml、0.5-500ng/ml、0.1-100ng/ml、0.1-10ng/ml、0.5-100ng/ml、1-100ng/ml、5-100ng/ml、1-50ng/ml、5-50ng/ml、1-10ng/ml、5-10ng/ml、1-5ng/ml、2-3ng/ml、2-5ng/ml、2-7ng/ml、3-5ng/ml、3-7ng/ml、4-5ng/ml、5-6ng/ml、5-7ng/ml、1-8ng/ml、10-100ng/ml、10-1000ng/ml、100-1000ng/ml的IL-7的存在下进行的。根据具体的实施方式，IL-7的浓度为1-10ng/ml(5ng/ml)。
本发明者通过繁重的实验和筛选采集了许多标准，其可以被用来改进包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的增殖，该抗第三方细胞没有移植物抗宿主(GVH)反应性细胞和/或是增强的抗疾病(如GVL)反应性细胞。
根据一个实施方式，在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC耗尽了非贴壁细胞。
根据一个实施方式，在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前，PBMC耗尽了CD4+和/或CD56+细胞。
根据一个实施方式，在IL-21的存在下与一种或多种第三方抗原接触之前，对PBMC选择CD45RA+细胞。
可以使用本领域中众所周知的方法来进行CD4+和/或CD56+细胞的耗尽，如通过基于亲和力的纯化(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)。为了提高培养物中的CD8+细胞的纯度(即，消除细胞培养物中的其他淋巴细胞，如TCD4+细胞或NK细胞)或为了提高CD8+T细胞的数量，该步骤可能是有益的。
根据一个实施方式，PBMC包含非贴壁细胞。
根据一个实施方式，PBMC包含CD8+T细胞。
根据一个实施方式，PBMC包含幼稚CD8+T细胞。
可以通过选择表达CD45RA+的细胞和/或表达CD45RO-的细胞来实现幼稚CD8+T细胞的选择，并且可以使用本领域中众所周知的方法来进行幼稚CD8+T细胞的选择，如通过基于亲和力的纯化(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)。
根据一个实施方式，PBMC包含CD45RA+细胞。
根据本发明的教导可以进行的另外的步骤包括：在从细胞培养物中去除一种或多种第三方抗原之前(即在产生无抗原的环境之前)，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下使用一种或多种第三方抗原培养PBMC细胞。这个步骤典型地进行约12-24小时、约12-36小时、约12-72小时、24-48小时、24-36小时、约24-72小时、约48-72小时、1-2天、2-3天、1-3天、2-4天、1-5天或2-5天，并且是以相同于以上所示剂量的IL-21、IL-15和IL-7来实现的。根据具体的实施方式，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下使用一种或多种第三方抗原对PBMC细胞培养12小时至4天(例如1-2天)。
另外地或可替代地，可以进行允许选择和分离经活化的细胞的另外的两个步骤过程。在PBMC与受试者非同源的情况下，此类选择步骤有助于去除潜在的宿主反应性T细胞(如下进一步的详细描述)。
因此，可以两阶段方法来进行分离经活化的细胞。在第一阶段，在IL-15和IL-7的存在下培养细胞之前选择经活化的细胞。该第一阶段典型地是在IL-21的存在下，使PBMC与一种或多种第三方抗原初步接触之后来进行的。该选择过程仅选取可以由第三方抗原活化的那些细胞(例如表达以下的活化标志物)，并且典型地在PBMC与一种或多种第三方抗原的初步接触之后，进行约12-24小时、约24-36小时、约12-36小时、约36-48小时、约12-48小时、约48-60小时、约12-60小时、约60-72小时、约12-72小时、约72-84小时、约12-84小时、约84-96小时、约12-96小时。根据具体的实施方式，选择过程在PBMC与一种或多种第三方抗原的初步接触之后进行约12-24小时(例如14小时)。
分离经活化的细胞可以通过基于亲和力的纯化来进行(例如，通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)并且可以针对任何活化标志物(包括细胞表面标志物，例如但不局限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137；或者非细胞表示标志物，例如但不局限于IFN-γ和IL-2)来进行。分离经活化的细胞还可以使用本领域中众所周知的方法(例如通过FACS)通过基于形态学的纯化(例如分离大细胞)来进行。典型地，也从经活化的细胞中选择表达CD8+的细胞。另外，可以利用上述方法的任何组合来有效地分离经活化的细胞。
根据本发明的一个实施方式，选择经活化的细胞是通过选择CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
经活化的细胞的分离的第二阶段典型地是在培养结束时进行的(即在无抗原的环境中用IL-21、IL-15和IL-7培养之后)。该阶段通过耗尽在使中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)与经辐射的宿主抗原呈递细胞(APC，例如树突状细胞)接触之后活化的那些细胞而耗尽同种异体反应性细胞。如上所描述的，分离经活化的细胞可以通过基于亲和力的纯化(例如通过使用MACS珠、FACS分选机和/或捕获ELISA标记)来进行并且可以针对任何活化标志物(包括细胞表面标志物，例如但不局限于CD69、CD44、CD25、CFSE、CD137；或者非细胞表示标志物，例如但不局限于IFN-γ和IL-2)来进行。
根据本发明的一个实施方式，耗尽同种异体反应性细胞是通过耗尽CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
以下是可以根据本发明的一些实施方式进行使用的方案的一些非限制性实例。
根据本发明的一个实施方式，提供了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性(例如移植物抗白血病(GVL)活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括：(a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁的外周血单核细胞(PBMC)，以便获得CD8+T细胞；(b)在IL-21的存在下使该CD8+T细胞与第三方树突状细胞接触12小时至5天，以便能够富集抗原反应细胞；(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用第三方树突状细胞培养获自步骤(b)的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下培养获自步骤(c)的细胞5-20天，以便能够增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
以上所描述的方案典型地用于非同源移植并且因此所使用的PBMC典型地相对于受试者而言是同种异体的(例如来自同种异体供体)。
根据本发明的一个实施方式，提供了一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的抗第三方细胞的细胞的分离群体，细胞赋有抗疾病活性(例如抗肿瘤细胞活性)，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，该方法包括：(a)用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁的外周血单核细胞(PBMC)，以便获得CD8+T细胞；(b)在IL-21的存在下使该CD8+T细胞与非同源树突状细胞接触12小时至5天，以便能够富集抗原反应细胞；(c)在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用非同源树突状细胞培养获自步骤(b)的细胞12小时至3天；和(d)在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤(c)的细胞5-20天，以便能够增殖包含中央型记忆T淋巴细胞(Tcm)表型的细胞。
上述方案典型地用于同源移植并且因此所使用的PBMC典型地相对于受试者而言是自体的(例如来自该受试者)。
因此，如上提及的，PBMC相对于受试者而言可以是同源的或非同源的。
根据本发明的一些实施方式，本发明的非同源PBMC相对于受试者而言可以是同种异体的或异种的(以下进行了进一步的详细说明)。
将相对于该细胞的预定用途来确定PBMC的来源(参见下文进一步详细的说明)并且完全处于本领域技术人员的能力范围内，特别是鉴于本文所公开的详细内容。
在需要消除移植物排斥反应且克服移植物抗宿主病(GVHD)的情况下，例如在同种异体和异种细胞或组织的移植中，使用耐受性诱导细胞是特别有益的。
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种治疗需要细胞或组织移植的受试者的方法，该方法包括将细胞或组织移植体移植入受试者中并且向该受试者给予治疗有效量的细胞的分离群体。
本文中使用的术语“治疗(treating)”包括终止(abrogate)、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状或者基本上防止病症的临床或美学症状的出现。
本文中使用的术语“受试者(subject)”或“需要其的受试者”是指哺乳动物，优选人类，任何年龄的男性或女性，他们需要细胞或组织移植或者患有可以使用Tcm细胞进行治疗的疾病。典型地，由于可以通过细胞或组织移植进行治疗的疾病或病理或不希望的病症、状态、或症状、或身体异常、形态异常或生理异常，受试者需要细胞或组织移植(本文中也称为接受者)。以下提供了此类疾病的实例。
本文中所使用的用语“细胞或组织移植”是指身体的细胞(例如单个细胞或一组细胞)或组织(例如实体组织/器官或软组织，其可以全部或部分地移植)。可以根据本发明的教导移植的示例性组织或器官包括但不限于肝脏、胰腺、脾脏、肾脏、心脏、肺、皮肤、肠和淋巴/造血组织(例如淋巴结、派尔(Peyer)氏斑胸腺或骨髓)。可以根据本发明的教导移植的示例性细胞包括但不限于未成熟的造血细胞，包括干细胞。另外，本发明还考虑了整个器官的移植，例如肾脏、心脏、肝脏和皮肤。
取决于应用，可以使用与受试者同源或非同源的细胞或组织来实现方法。
根据本发明的一个实施方式，受试者和供体都是人类。
取决于应用和可用的来源，本发明的细胞或组织可以获自产前有机体、产后有机体、成人或尸体供体。另外，取决于应用，的细胞或组织可以是幼稚的或基因修饰的。此类确定完全处于本领域普通技术人员的能力范围内。
可以利用本领域中已知的任何方法来获得细胞或组织(例如，用于移植)。
可以以许多方式来实现细胞或组织向受试者的移植，其取决于不同的参数，例如细胞或组织类型；接受者的疾病的类型、阶段或严重度(例如，器官功能衰竭)；特定于受试者的身体或生理参数；和/或所期望的治疗结果。
本发明的细胞或组织移植体的移植，取决于应用，可以通过将细胞或组织移植体移植至各种解剖位置的任何一处来实现。细胞或组织移植体可以移植至同位(homotopic)解剖位置(用于移植体的正常的解剖位置)、或至异位(ectopic)解剖位置(用于移植体的非正常的解剖位置)。取决于应用，可以有利地将细胞或组织移植体植入在肾小囊下或植入至肾脏、睾丸脂肪、皮下(subcutis)、大网膜、门静脉、肝脏、脾脏、心脏腔、心脏、胸腔、肺脏、皮肤、胰腺和/或腹腔内的空间中。
例如，根据本发明的教导，肝组织可以被移植到肝脏、门静脉、肾小囊、皮下、大网膜、脾脏和腹腔内的空间中。将肝移植至各种解剖位置在本领域中被普遍地实行用于治疗可以由通过肝脏移植术进行治疗的疾病(例如肝功能衰竭)。类似地，根据本发明的胰腺组织的移植可以通过将该组织移植至门静脉、肝、胰腺、睾丸脂肪、皮下、大网膜、肠袢(小肠的U形环的浆膜下层)和/或腹腔内的空间中来实现。胰腺组织的移植可以用来治疗可以通过胰腺移植进行治疗的疾病(例如糖尿病)。同样地，可以将肾脏、心脏、肺或皮肤组织等的组织移植到上述的任何解剖位置以用于治疗患有例如肾功能衰竭、心脏衰竭、肺衰竭或皮肤损伤(例如烧伤)的接受者。
本发明的方法例如还可以用于治疗患有需要不成熟的造血干细胞移植的疾病的接受者。
在后一种情况下，可以将来源于例如供体的骨髓、动员的外周血(例如通过白细胞分离法)、胎肝、卵黄囊和/或脐带血的未成熟的自体、同种异体或异种的造血细胞(包括干细胞)且优选是T细胞耗竭的CD34+未成熟造血细胞移植到患有疾病的接受者中。此类疾病包括但不限于白血病，如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性非淋巴母细胞性白血病(ANLL)、急性髓细胞性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)；严重联合免疫缺陷综合征(SCID)，包括腺苷脱氨酶(ADA)、骨硬化病(石骨症，osteopetrosis)、再生障碍性贫血、高雪氏病(Gaucher'sdisease)、地中海贫血症和其他先天性或遗传决定的造血异常。
可以理解的是，可以使用本领域中已知的用于细胞移植的任何方法来将本发明的未成熟的自体、同种异体或异体的造血细胞移植至接受者中，例如但不限于细胞输注(例如I.V.)或通过腹膜内途径。
可选地，当将本发明的细胞或组织移植体移植到具有有缺陷的器官的受试者中时，可能有利的是首先至少部分地从受试者中移除衰退的器官，从而使移植体的发展及其结构/功能与该受试者的解剖学/生理学的一体化获得最佳化。
根据一个实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于同一供体。
根据一个实施方式，未成熟的造血细胞和细胞的分离群体来源于同一受试者。
本发明的方法还设想了联合移植多个器官(例如心脏和肺组织)，在这种情况下，受试者可以通过此步骤而获得有益的影响。
根据一个实施方式，联合移植包括移植未成熟的造血细胞和实体组织/器官或一些实体器官/组织。
根据一个实施方式，未成熟的造血细胞和实体器官或获自同一供体。
根据另一个实施方式，未成熟的造血细胞和实体器官/组织或多个器官/组织获自不同的(非同源的)供体。
根据一个实施方式，未成熟的造血细胞是在移植实体器官之前、同时或之后进行移植的。
根据一个实施方式，首先通过将未成熟的造血细胞连同本发明的Tcm细胞一起移植以在受试者中诱导造血嵌合，引起移植自同一供体的其他组织/器官的耐受性。
根据一个实施方式，使用本发明的Tcm细胞本身来减少对移植自同一供体的移植的组织/器官的排斥反应。
在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体以及细胞的分离群体来源于同一供体。
在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体与受试者是同源的，而细胞的分离群体与受试者是非同源的。
在进一步的实施方式中，细胞或组织移植体与受试者是同源的，且细胞的分离群体与受试者是同源的。
在根据本发明的教导将细胞或组织移植体移植到受试者中之后，根据标准的医疗实践，最好是根据现有技术的各种标准技术的任何一种来监测脏器的生长功能和免疫相容性。例如，可以在移植之后通过标准的胰腺功能检查(例如，胰岛素的血清水平的分析)来监测胰腺组织移植体的功能。同样地，在移植之后可以通过标准的肝功能检查(例如，白蛋白、总蛋白、ALT、AST和胆红素的血清水平的分析，以及血液凝血时间分析)来监测肝组织移植体。可以通过计算机化断层扫描或超声成像来监测细胞或组织的结构性发展。
取决于移植的背景，为了有利于细胞或组织移植体的移植，方法可以进一步有利地包括在移植之前在亚致死、致死或超致死的条件下调理受试者。
当涉及调理本发明的受试者时，本文使用的术语“亚致死(sublethal)”、“致死(lethal)”和“超致死(supralethal)”，是指骨髓毒性和/或淋巴细胞毒性治疗，当将治疗分别应用于受试者的代表性群体时，典型地为：基本上对群体的所有成员都是非致死的；对一些但并非该群体的所有成员是致死的；或在正常的无菌条件下，对该群体的所有成员基本上都是致死的。
根据一个实施方式，该调理步骤是通过在超致死的条件下对受试者进行调理的，例如在清髓性(myeloablative)条件下。
可替代地，该调理步骤是在致死或亚致死条件下对受试者进行调理的，例如通过在减髓性(myeloreductive)条件下调理受试者。
可以用来调理受试者的调理剂的实例包括但不限于辐射、药理剂和耐受性诱导细胞(如本文所描述的)。
药理剂的实例包括骨髓毒性药物、淋巴细胞毒性药物和免疫抑制药物。
骨髓毒性药物的实例包括但不限于白消安、二甲基马利兰(mileran)、马法兰和塞替派。
方法可以进一步有利地包括在移植细胞或组织移植体之前、同时或之后使用免疫抑制方案来调理受试者。
适合类型的免疫抑制方案的实例包括给予免疫抑制药物、耐受性诱导细胞群体(如下文中详细描述的)和/或免疫抑制性辐射。
在现有技术的文献中提供了用于选择和施用适合于移植的免疫抑制方案的大量指导(例如，参见：KirkpatrickCH.和RowlandsDTJr.,1992.JAMA.268,2952；HigginsRM.等,1996.Lancet348,1208；SuthanthiranM.和StromTB.,1996.NewEngl.J.Med.331,365；MidthunDE.等,1997.MayoClinProc.72,175；MorrisonVA.等,1994.AmJMed.97,14；HantoDW.,1995.AnnuRevMed.46,381；SenderowiczAM.等,1997.AnnInternMed.126,882；VincentiF.等,1998.NewEngl.J.Med.338,161；DantalJ.等1998.Lancet351,623)。
优选地，免疫抑制方案由向受试者给予至少一种免疫抑制剂组成。
免疫抑制剂的实例包括但不限于：甲氨蝶呤、环磷酰胺、环孢素、环孢菌素A、氯喹、羟氯喹、柳氮磺胺吡啶(柳氮磺吡啶，sulphasalazopyrine)、金盐、D-青霉胺、来氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滞、英夫利昔单抗(REMICADE)、依那西普、TNFα阻断剂、靶向炎性细胞因子的生物制剂以及非类固醇抗炎药(NSAID)。NSAID的实例包括但不限于：乙酰水杨酸、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、水杨酸镁、双水杨酸酯(salsalate)、水杨酸钠、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、对乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制剂、曲马多、雷帕霉素(西罗莫司)和雷帕霉素类似物(例如CCI-779、RAD001、AP23573)。这些试剂可以单独给予或组合给予。
与移植体的类型无关，为了避免移植物排斥反应和移植物抗宿主病，本发明的方法利用了新的抗第三方Tcm细胞(如下文中的详细描述)。
根据本发明的方法，这些抗第三方Tcm细胞是在细胞或组织移植体的移植同时、之前或之后给予的。
可以通过本领域中已知的用于细胞移植的任何方法给予抗第三方Tcm细胞，例如但不限于细胞输注(例如I.V.)或通过腹膜内途径。
为了不受理论的限制，治疗有效量是足够用于免疫耐受、抗肿瘤作用和/或免疫重建而不诱导GVHD的抗第三方Tcm细胞的量。由于本发明的Tcm细胞在移植之后归巢至淋巴结，可以需要更低量的细胞(与先前使用的细胞剂量相比，参见例如WO2001/049243)来达到细胞的有益效果(例如免疫耐受、抗肿瘤作用和/或免疫重建)。可以理解的是，可以需要更低水平的免疫抑制药来与本发明的Tcm细胞进行组合(例如从治疗方案中排除雷帕霉素)。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是在考虑到本文提供的详细公开内容的情况下。
对于在本发明的方法中使用的任何制剂，可以从体外和细胞培养测定中初步估计治疗有效量或剂量。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或滴度。此类信息可以用来更准确地确定人类中的有用剂量。
例如，在组织移植的情况下，输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量应当多于1x104/Kg体重。输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量通常应当在1x103/Kg体重至1x104/Kg体重的范围内、在1x104/Kg体重至1x105/Kg体重的范围内、在1x104/Kg体重至1x106/Kg体重的范围内、在1x104/Kg体重至1x107/Kg体重的范围内、在1x104/Kg体重至1x108/Kg体重的范围内、在1x103/Kg体重至1x105/Kg体重的范围内、在1x104/Kg体重至1x106/Kg体重的范围内、在1x106/Kg体重至1x107/Kg体重的范围内、在1x105/Kg体重至1x107/Kg体重的范围内、在1x106/Kg体重至1x108/Kg体重的范围内。根据具体的实施方式，输注到接受者中的抗第三方Tcm细胞的数量应当在1x105/Kg体重至1x107/Kg体重的范围内。
因此，本发明的新的抗第三方Tcm细胞可以用作细胞或组织移植用的辅助疗法(如下文中的描述)。另外，本发明的新的Tcm细胞还被赋有抗疾病活性(例如，抗肿瘤细胞活性，如下文中进一步的详细描述)，因此其本身可以用于疾病治疗。
根据具体的实施方式，为了获得移植物抗病变细胞活性(例如，抗肿瘤作用，如抗白血病治疗)，可以使用同源细胞以及非同源细胞。
因此，本发明的方法可以被应用于治疗任何疾病，例如但不限于：恶性疾病、与移植物的移植相关的疾病、感染性疾病(如病毒性疾病或细菌性疾病)、炎症性疾病和/或自身免疫性疾病。
可以使用本发明的方法进行治疗的疾病包括但不限于：恶性疾病，如白血病[例如，急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性淋巴母细胞性前B细胞白血病、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、急性-巨核细胞白血病、单核细胞白血病、急性髓系白血病、急性髓细胞性白血病、伴随嗜酸粒细胞增多的急性髓细胞性白血病(acutemyeloidwitheosinophilia)、B细胞型白血病、嗜碱性粒细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性白血病、B细胞型白血病、嗜酸性粒细胞白血病、Friend白血病、粒细胞或髓细胞白血病、毛细胞白血病、淋巴细胞白血病、巨核细胞白血病、单核细胞白血病、单核细胞-巨噬细胞白血病、髓母细胞性白血病(myeloblastic)、髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病(myelomonocytic)、浆细胞性白血病、前B细胞型白血病、早幼粒细胞白血病(promyelocytic)、亚急性白血病、T细胞型白血病、淋巴肿瘤、易患骨髓恶性肿瘤、急性非淋巴细胞性白血病、T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)和B-细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)]、淋巴瘤(例如，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、胸腺淋巴瘤)、癌瘤、母细胞瘤和肉瘤；与移植物的移植相关的疾病(例如，移植物排斥反应、慢性移植物排斥反应、亚急性移植物排斥反应、超急性排斥反应、急性排斥反应和移植物抗宿主病)；感染性疾病，包括但不限于慢性感染性疾病、亚急性感染性疾病、急性感染性疾病、病毒性疾病(例如EBV、CMV、HIV)、细菌性疾病、原生动物传染病、寄生虫病、真菌病、支原体病和朊病毒病；炎症性疾病(例如，慢性炎性疾病和急性炎症性疾病)；和自身免疫性疾病(例如，心血管疾病、类风湿疾病、腺疾病、胃肠道疾病、皮肤疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、肌肉疾病、肾病、与生殖有关的疾病、结缔组织疾病和全身性疾病)。
因此，本发明的方法可以更进一步有利地应用于在受试者中治疗疾病，同时伴随地促进与抗第三方Tcm细胞同源的细胞或组织移植体的移植(例如，在细胞或组织移植体与抗第三方细胞来源于同一供体的情况下)。
本文中使用的术语“约(about)”是指±10％。
术语“包含(comprise)”、“含有(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”以及它们的词形变化是指“包括但不局限于”。
术语“由……组成(consistingof)”是指“包括并限于”。
术语“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部件，但只是在该另外的成分、步骤和/或部件不会实质上改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本的和新颖的特征的时候才可行。
本文中使用的单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种化合物(acompound)”或“至少一种化合物(atleastonecompound)”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，可以以一定范围的样式呈现本发明的各种实施方式。应当理解的是，在一定范围样式内的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应当被解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，一定范围的描述应当被视为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，一定范围如1至6的描述应当被视为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及处于该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。不论范围的宽度如何，这都适用。
每当在本文中指定数值范围时，其是指包括该处于该指定范围内的任何引用的数值(分数或整数)。用语“在第一个指定数字和第二个指定数字之间的范围(ranging/rangesbetweenafirstindicatenumberandasecondindicatenumber)”和“第一个指定数字至第二个指定数字的范围(ranging/rangesfromafirstindicatenumbertoasecondindicatenumber)”在本文中可互换使用并且是指包括第一和第二指定数字以及它们之间的所有分数和整数数字。
本文中使用的术语“方法(method)”是指用于完全给定任务的方式、手段、技术和步骤，包括但不限于已经为化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者所公知的或者可以容易地从已知的方式、手段、技术和步骤开发出的那些方式、手段、技术和步骤。
可以理解的是，为了清楚起见而在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简便起见而在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以分开地或以任何适合的子组合或适合地在本发明的其他实施方式中提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施方案的必要特征，除非该实施方式在没有那些元素的条件下不起作用。
上文描绘的以及如下权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面都能够在以下实施例中找到支持。
实施例
现在参考下面的实施例，其与上述说明一起以非限制性的方式阐明本发明。
一般地，本文中使用的命名以及本发明中利用的实验步骤包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。些技术在文献中进行了充分说明。参见，例如，"MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook等,(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"卷I-IIIAusubel,R.M.,编(1994)；Ausubel等,"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APracticalGuidetoMolecularCloning",JohnWiley&Sons,NewYork(1988)；Watson等,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork；Birren等(编)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",卷1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998)；美国专利号US4,666,828、US4,683,202、US4,801,531、US5,192,659和US5,272,057阐述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",卷I-IIICellis,J.E.,编(1994)；"CurrentProtocolsinImmunology"卷I-IIIColiganJ.E.,编(1994)；Stites等(编),"BasicandClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.Freeman和Co.,NewYork(1980)；可用的免疫测定广泛描述于专利和科学文献中，参见，例如美国专利号3,791,932、US3,839,153、US3,850,752、US3,850,578、US3,853,987、US3,867,517、US3,879,262、US3,901,654、US3,935,074、US3,984,533、US3,996,345、US4,034,074、US4,098,876、US4,879,219、US5,011,771和US5,281,521；"OligonucleotideSynthesis"Gait,M.J.,编(1984)；“NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.和HigginsS.J.,编(1985)；"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.和HigginsS.J.,编(1984)；"AnimalCellCulture"Freshney,R.I.,编(1986)；"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986)；"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsinEnzymology"卷1-317,AcademicPress；"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990)；Marshak等,"StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996)；所有这些文献都通过引用并入，如同在本文中完全阐述一样。在该文件中提供了其他的一般的参考文献。相信其中的步骤在本领域中是众所周知的并且为读者提供了方便。其中包含的所有信息均通过引用并入。
通用的材料和实验步骤
外周血单核细胞(PBMC)
通过Ficoll密度梯度离心从患者和健康志愿者的全血中分离出PBMC。当标示时，细胞类型通过先前描述的血清学方法定为I类HLA[组织分型技术手册(ManualofTissueTypingTechniques).WashingtonDC,NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,NIHDHEWPublication76-545,1976,第22页]。
肿瘤细胞系
使用H.My2C1RHLAA2K66A转染子细胞和H.My2C1RHLAA2w.t.转染子B细胞系。
使用C1R，其为一种缺乏表面HLAA和B抗原的人类B细胞淋巴母细胞系，如先前所描述的其通过γ射线照射并随后通过选择I类单克隆抗体和补体而来源于Hmy.2B-LCL[StorkusWJ,等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:2361-2364]。
使用了C1R-neo，如先前所描述的，其为在1987年通过使用经修饰的新霉素耐药性真核表达载体pSP65-Neo(该载体没有携带插入物)电穿孔C1R细胞系而建立的一种稳定转染子细胞系[GrumetFC,等，Hum.Immunol.(1994)40:228-234]。
树突状细胞产生
使用3ml补充有1％人血清和青霉素/链霉素加GM-CSF(800IU/ml)和IL-4(20ng/ml)的CellgroDC培养基(Peprotech,Hamburg,Germany)在6孔板中通过塑料贴壁培养分离出单核细胞。培养48小时后，加入1.5ml的培养基(1600IU/ml的+GM-CSF和20ng/ml的IL4)。24小时后，收获非贴壁细胞并且对大细胞进行计数(大多数为未成熟DC)，重悬于含有GM-CSF800IU/ml、IL-420ng/ml、10ng/ml来自大肠杆菌O55:B5的LPS(Sigma,Deisenhofen,Germany)和IFNγ(Peprotech,100IU/ml)的新鲜培养基中，并且以约106DC每孔接种在2ml中并且孵育过夜。第二天，弃去非贴壁细胞，并且在冰上孵育20分钟后使用冷的PBS/1％HS温和地取下贴壁DC。对由成熟DC组成的大细胞进行计数。用30Gy辐射细胞以避免生长(outgrowth)少数潜在的NK-细胞或记忆T细胞的污染，然后用于T细胞刺激。
从PBMC中分离幼稚CD8T细胞
使用CD8阴性选择试剂盒(Miltenyi,BergischGladbach,Germany)根据制造商的说明通过对幼稚CD8T细胞进行初步阴性选择分离幼稚CD8T细胞。随后使用CD45RO-珠并在LD柱上耗尽经历过抗原的CD8+T-细胞。
产生抗第3方中央型记忆人CD8T细胞
分离出幼稚CD8T细胞并且将其重悬在补充有IL-21(Peprotech,30ng/ml)的T细胞培养基中。将经辐射的DC以1:4DC:T-细胞比率以4x105个T-细胞每孔加入到48孔板中。每个孔的总体积为500μl。
在初步培养72小时后，加入500μl含有IL-7和IL-15(Peprotech,5ng/ml终浓度)的T细胞培养基，并且如结果部分中概述的，随后每2-3天喂养一次细胞。
GVL检测
通过Ficoll密度梯度离心获得H.MyC1R("Neo")和H.MyC1RHLAA2K66A突变体转染子("K66A")B淋巴母细胞系，并且使用0.15μg/ml钙黄绿素AM(MolecularProbes,Inc,Eugene,OR)(一种细胞死亡时被释放的活体染料)根据制造商的说明进行标记。随后，在24孔板中，以有利于抗第3方Tcm的1至5的比率、在存在或不存在抗第3方Tcm的条件下，孵育2x105个钙黄绿素标记的B淋巴母细胞系的细胞22小时。在共同培养之前，通过阴性选择试剂盒(Miltenyi,BergischGladbach,Germany)对抗第3方Tcm富集CD8+T细胞。未向MLR中加入外源性细胞因子。回收细胞并且通过FACS通过测量幸存的钙黄绿素染色的B淋巴母细胞系的细胞的数量来分析存活率。为了检测由膜联蛋白V+的细胞凋亡，用5μl膜联蛋白V-APC(BD)在室温下孵育样品15分钟。随后，洗去未结合的膜联蛋白V，并且通过FACS分析样品。为了获得细胞绝对值，将样品悬浮于恒定体积中并且在恒定预定的时间段内获得每个样品的流式细胞计数，并且与用固定体积和固定进料细胞数量获得的流式细胞计数进行比较。存活率表示相对于单独的B淋巴母细胞系的细胞的存活。
通过以下公式来计算B淋巴母细胞系细胞杀灭的百分比：
通过以下公式来计算经历了特定的凋亡的B淋巴母细胞系细胞的百分比：＝(评估孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)–(对照孔中的％钙黄绿素+膜联蛋白V+B淋巴母细胞系细胞)。
基于CD137活化标志物的用于耗尽同种异体反应性的两阶段磁力分选方法
在IL-21(Peprotech,30ng/ml)的存在下，以6:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。活化14小时后，通过磁力分选(Miltenyi,BergischGladbach,Germany)阳性选择CD137+细胞。然后在IL-21(Peprotech,30ng/ml)的存在下以4:1的比率用经辐射的同种异体第3方DC再刺激CD137+细胞直至第3天。此后，使用5ng/mlIL-7和5ng/mlIL-15(Peprotech)扩增细胞直至第10天。在第10天，将细胞分成两个测试组。在第一组中，用IL-7和IL-15继续扩增细胞直至第14天，而在IL-7和IL-15(以1-2的比率)的存在下用经辐射的宿主PBMC来活化第二测试组中的细胞。24小时后，通过磁力分选来耗尽CD137+细胞。用IL-7和IL-15再接种CD137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第三方CD137+和抗宿主CD137-”)。在第14天，通过CFSE检测针对第三方或经辐射的宿主PBMC来评价抗第3方和抗宿主的同种异体反应性。对于CFSE检测，在IL-7的存在下，在有或没有2x106个经辐射的(20gy)PBMC刺激子的存在下孵育1x106CFSE+应答子84小时。84小时之后，回收细胞并且由FACS通过测量CFSE低染色的CD8T细胞(CD3+CD8+CD56-)的数量来分析细胞分裂。为了获得细胞绝对值，将样品悬浮在恒定体积中并且在恒定预定的时间段内获得每个样品的流式细胞计数。具体的分裂细胞的数量＝(具有APC的分裂细胞的数量)–(不具有APC的分裂细胞的数量)。负值表示响应于用宿主PBMC活化的分裂细胞的数量甚至低于未用任何活化的分裂细胞的数量。
实施例1
产生并优化人抗第三方T中央型记忆(Tcm)细胞的
为了将先前提出的小鼠研究转化为临床应用，优化步骤以产生人抗第3方细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。为此，评价了不同的参数，包括用于分离CD8应答细胞的不同的试剂、刺激子的组成以及细胞因子环境(milieu)。
潜在地，如在先前提出的小鼠模型中发现的，在自体的背景中[LaskA等,Blood(ASH年会摘要),(2010)116:424]或在同种异体骨髓移植中(BMT)[OphirE等,Blood.(2010)115(10):2095-104；OphirE.,第37次EBMT年会,4月3-6,2011,Paris,France.口头报告摘要Nr:662]，用中央型记忆T细胞(Tcm)的治疗可能是有价值的。
在人类自体设置中(图1A)，抗第3方Tcm可以与自体BMT一同给予。分离出患者自身的CD8+T细胞并且针对来自同种异体供体的同种异体树突状细胞进行刺激。
在人类同种异体设置中(图1B)，抗第3方Tcm可以与同种异体T耗尽的BM细胞一起移植。将来源于同种异体BM供体的幼稚CD8+T细胞用作应答子并且将第3方供体树突状细胞作刺激子以使得能够产生宿主非反应性Tcm。为了避免GVHD，选择第3方供体以确保他的HLA-I类等位基因与宿主的HLA-I类等位基因是共用的。
而在小鼠和人类中，基本的预想方案类似地包含人CD8T细胞分离，随后通过针对第3方细胞进行刺激(图1A-B和图2A-B)，在人类方案中必须修改若干其他参数，如下表1中所示的。
考虑到自体Tcm不存在GVHD风险，产生方案的优化主要集中在实现具有中央型记忆表型的抗第3方CD8T细胞的有效扩增。
如可以从图3A中看到的，基于以下三个主要步骤开发了新的方案：a)从PBMC中选择CD8T细胞；b)在IL-21的存在下，针对同种异体树突状细胞(DC)刺激3天；和c)在无抗原的环境中用IL-7、IL-15和IL-21扩增另外的8天。
因此，在这种新开发的方案中，多个参数都与用于产生小鼠Tcm的参数不同(表1和图3A-B)。主要差异涉及用于应答子和刺激子的组织的来源(PBMC相对于脾细胞)、刺激子(树突状细胞相对于脾细胞)、以及细胞因子的组成。
表1：用于产生Tcm的自体人类方案与同源小鼠方案的比较
优化用于产生人类抗第3方Tcm的GMP级方案：
初步尝试以开发用于产生抗第3方Tcm的人类方案以Wolfl等的最近的研究为基础[WolflM等,CancerImmunolImmunother(2011)60(2):173-186]，其描述了一种用于产生具有中央型记忆表型的人类抗原特异性CD8T细胞的步骤。
本方法是以如下为基础的：在IL-21的存在下针对抗原致敏的DC的刺激3天，并且随后在IL-7和IL-15的存在下扩增另外的8天。
在这些初步实验中，使得抗第3方Tcm的令人印象深刻的扩增并且随后担当了作为进一步优化的参考，使用了下列步骤：a)通过耗尽非-CD8+细胞(即CD4+T细胞、γ/δT细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、粒细胞和红系细胞)从PBMC中富集CD8T细胞；b)通过耗尽表达CD45RO的活化的细胞富集幼稚细胞；和c)在IL-21的存在下针对同种异体树突状细胞刺激幼稚CD8T细胞3天，随后在无抗原的环境中用IL-7和IL-15扩增另外的8天。
如在图4A-图4C中所示，这些初步参考实验的结果，通过限定各参数对细胞扩增的水平及Tcm表型的表达水平影响，能够评价不同的参数在该方案中的作用(如下的详细描述)。
用第3方DC的引发的作用
考虑到通过限定自体Tcm不存在GVHD风险，所评价的第一个参数是针对第3方DC的刺激的作用。这个步骤本来旨在降低同种异体设置中GVHD的风险，其通过在不存在抗宿主克隆介异的GVHD的刺激下选择性地扩增抗第3方克隆。
如图5A-C和图6A-B所示的，在不存在通过树突状细胞的同种异体刺激的条件下用IL-21生长的幼稚CD8T细胞表现出较低的增殖水平(为参考对照组所表现出的2.7±1.1％)，表示在第7天约为第0天的0.4倍数扩增(大多数细胞在第10天前死亡)。并且保持了它们的幼稚表型(CD45RO-CD62L+，小形态)(Tcm水平仅为参考对照组的10％)。当在不存在由树突状细胞的同种异体刺激的条件下用IL-7和IL-15来维持细胞时，发现类似较差水平的分化和扩增；在这些条件下，细胞保持它们的幼稚表型(Tcm水平仅为参考对照组的7±1.6％)，尽管诱导了一些增殖(对照组数值的12±3.2％，表示在第13天约为第0天的6倍数扩增)。因此，同种异体第三方DC的作用对于诱导Tcm表型以及对于稳健的细胞扩增是非常关键的。
IL-21在抗第3方Tcm的引发和扩增阶段的作用
通常，在小鼠和人类中，在常规的T细胞扩增方案中，扩增阶段是在无抗原环境中进行的。但是，在小鼠的方案中，仅加入IL-15(图3B)，而在Wolfl等(Wolfl等，2011，出处同上)描述人类方案中，细胞扩增是在IL-7和IL-15的存在下进行的。另外，考虑到经证明如果在初步引发阶段添加IL-21是有利的，本文中评价了IL-21的作用。
有趣的是，如图7A-C和图8A-B所示出的，虽然在存在或不存在IL-21的条件下通过同种异体DC的幼稚CD8T细胞的引发对细胞组成仅具有轻微的影响(数据未示出)，但是不存在IL-21时的引发妨碍了Tcm表型(CD45RO+CD62L+)的获得(仅为参考对照组中Tcm水平的69±18％)，并且还导致降低的增殖(为参考对照组中扩增水平的76±23％)(图8A-图8B)。甚至在四个实验中的单个实验中，其中扩增未降低(参考对照组的140％)，其Tcm表型仅为参考对照组的Tcm水平的35％，表明在IL-21存在下的引发对于从幼稚CD8T细胞群体中扩增和诱导Tcm表型都是重要的。
有趣的是，在引发阶段(单独的IL-21)和在扩增阶段(与IL-7和IL-15一起)中持续存在的IL-21持续地改进中央型记忆表型的细胞的诱导(参考对照组中的Tcm水平的108±1.9％)(图7A-图7C和图8A-图8B)。连续IL-21的存在对细胞扩增的影响，虽然明显地产生更高的平均增幅(在参考对照组中发现的数值的135±47％)不是太一致，导致在三个实验中有两个轻微降低的扩增(分别为参考数值的95％和81％)，而在第三个实验中，表现出显著增强的扩增(228％)，表明在引发和扩增阶段均添加IL-21可能是可取的(图8A-B)。
第3方刺激子细胞的组成
上述的结果显示，顺序加入的IL-21、IL-7和IL-15必须伴随有由单核细胞衍生的成熟DC的同种异体刺激用于成功诱导Tcm表型和稳健的细胞扩增。
为了简化步骤，进行实验以评价是否可以由经辐射的PBMC来代替需要4天制备的单核细胞衍生的成熟DC来递送必要的同种异体刺激。
如从下表2中可以看出的，当将经纯化的幼稚CD8T细胞(分别为92％与92％)和当将未分离的CD8T细胞作为应答子时(77％与80％)，在培养的第7天，通过PBMC诱导Tcm表型的效率与单核细胞衍生的成熟DC(md-mDC)形成对照，刺激子是非常相似的。但是，在使用幼稚CD8T细胞(分别为6.75与20.5)或未分离的CD8T细胞(1.8与1.6)作为应答子时，与DC相比，PBMC刺激子不能诱出相同水平的Tcm扩增。
表2：DC作为刺激子的关键作用
MLR培养物，其中在含有IL-21的培养基中，将幼稚CD8T细胞或未分离的CD8T应答子针对单核细胞衍生的成熟DC(8:1应答子/DC比率)或PBMC(1:1应答子/PBMC比率)刺激3天，DC和PMBC来源于同一同种异体供体。此后，用IL-7和IL-15生长细胞7天而未经进一步活化。在培养的第7天，对不同的组，使用FACS分析评价Tcm百分比并且由台盼蓝拒染法评价细胞数量。
因此，与其中经辐射的脾细胞足以诱导扩增的小鼠方案不同，在人类方案中，同种异体的单核细胞衍生的成熟DC对于良好扩增Tcm细胞是至关重要的并且不能被同种异体PBMC替代。
限定用于诱导Tcm表型和细胞扩增的最佳应答子/DC比率
为了限定最佳的应答子/DC比率，使用如上所描述的MLR系统，不同之处在于测试了不同的应答子/DC比率。如在图9A-B中可以看到的，当使用4x105个应答子时，在加入50-100x103DC后达到Tcm表型的最佳获得，而扩增在最低的DC浓度下最佳。进一步研究了在较低应答子/DC比率的实验。
完全基于GMP级试剂限定最终的自体方案
在建立了用于产生抗第3方Tcm的理想自体方案之后，仅基于目前市售的GMP级试剂来进行实验以开发等同步骤，以便能够在人类患者中测试这种方法。
在塑料平皿中耗尽贴壁细胞
在优化CD8T细胞选择的过程之前，进行实验以通过去除存在于PBMC中的塑料贴壁细胞来达到显著的初始富集。该过程不仅提高所需的CD8+T细胞的浓度，而且当加工冷冻保存的人体PBMC时也是有用的，这与在小鼠模型中使用的新鲜脾细胞形成对照。这个实验显示在将解冻的细胞经受磁力富集处理之前，用10％人血清和IL-7的过夜孵育能够使得该解冻的细胞复苏(数据未示出)。
富集幼稚CD8T细胞
随后，将焦点集中在使用尽可能少的抗体使富集的幼稚CD8T细胞适应于临床级试剂。
如图10(代表一个典型的实验)所示，在耗尽贴壁细胞之后，在第0天，所需的CD8T细胞的群体占细胞的21％，而其他主要的“污染”亚群包括CD4T细胞(61％)、B细胞(7％)和NK细胞(7％)。因此，CD4细胞是最大的污染，并且先前示出与CD8T细胞存在竞争；因此需要去除这些细胞。同样地，去除已知在IL-15培养中扩增的NK细胞是重要的。相反，B细胞在这些培养条件下易于死亡。因此，在有和没有耗尽CD19+B细胞的条件下初步评价用抗-CD4和抗CD56磁珠的潜在耗尽。
另外，由在于患有B细胞恶性肿瘤的患者的PBMC中，CD8T细胞的水平比健康供体的要低，通过阳性选择CD45RA+细胞(因为其进一步减少回收的CD8T细胞的数量)进行了并行评价，以检查省略富集幼稚CD8T细胞的可能性。
因此，在-1天，首先通过在专门设计用于去除贴壁髓细胞的greiner-bio-one(格雷纳-生物-1)CELLSTAR组织培养板(GreinerBio-OneLtd.,StonehouseUK)中从供体PBMC中耗尽贴壁细胞，并且在第0天，将非贴壁细胞分成四个实验组，每个实验组接受不同的磁力分选方案。在培养的第0、7、10和14天，通过FACS分析评价细胞的细胞组成和Tcm表型，并且通过基于台盼蓝拒染法的活细胞计数评价扩增。
如在图10中可以看出的，仅使用抗-CD4和抗-CD56珠的最小磁力细胞分选分别将CD4T和NK细胞的百分比从61％和7％降低至12％和1％，使得CD8T细胞从23％富集至60％。但是，这个步骤相关地将B细胞的水平从7％富集到了24％。向耗尽混合物(cocktail)中添加抗CD19完全耗尽B细胞，获得CD8T细胞的改善的富集(90％)。添加用抗-CD45RA阳性富集幼稚细胞的第二步，在两个组中都将幼稚细胞(CD45RO-CD45RA+，在CD3+CD8+上选通)的百分比从磁力分选之前的53％提高到了91％。但是，这个步骤没有显著的影响CD8T细胞的最终水平，当使用抗-CD4和抗-CD56时其从60％提高到66％，或当阴性选择步骤也包括抗-CD19时，其从90％提高至94％。
在磁力细胞分选之后，在IL-21的存在下用同种异体树突状细胞引发全部四个组3天，此后，在无抗原环境中在IL-21、IL-7和IL-15的存在下扩增细胞直至第14天。作为非扩增细胞的对照组，仅在IL-7的存在下，将通过使用抗-CD4、抗-CD56和抗-CD19的耗尽步骤以及使用抗-CD45RA的阳性富集步骤所富集的幼稚CD8T细胞维持在无抗原的环境中直至第14天。
有趣的是，当在第0天时，使用或不使用抗-CD19处理的组表现出显著不同水平的CD8T细胞，这种差异在早至第7天时被清除(abolish)(图11)，并且当在第14天测试时也是如此(图12)，可能是由于培养物中B细胞的选择性死亡。类似地，在初步CD8T细胞纯化之后阳性选择CD45RA+只能勉强促进具有Tcm表型的CD8+T细胞的最终富集。因此，所有四组都显示类似水平的所需细胞，其中两组还通过抗CD45RA富集了幼稚细胞而具有轻微的优势。
通过将在暴露至最佳的细胞分离试剂("CD4-CD56-CD19-,CD45RA+")的对照组中获得的平均结果与其中尝试排除使用抗-CD19或抗CD45RA的其他组进行比较，从而进一步分析了以上显示的典型实验中的这种初步结果。
因此，当将所有实验组中的CD8T细胞的平均百分比(图13A)以及更重要的Tcm百分比(图13B)计算为在最佳对照组中获得的水平的百分比时，它们非常相似。
相反，当在培养的第10天测试时，在各细胞制备物的平均扩增中发现了显著的差异，范围为65.6±0.5％至105.2±6.8％(图14A)。但是，扩增容量的差异被与第二个纯化步骤相关的降低产率所抵消(图14B)。
如可以在图14C中看出的，示出在第10天的Tcm的最终计算产率，加入用抗-CD45RA对幼稚细胞进行阳性富集的第二步骤仅降低了Tcm细胞的终产率，当用以抗-CD4和抗CD-56的初步耗尽时从141％降低至123％，或当用还包括抗-CD19的阴性选择步骤时从157％降低至100％。
总起来说，这些结果提示，以最少使用用于分离CD8T细胞的试剂为基础的方案，即使用抗-CD4和抗-CD56的阴性选择，在自体设置中能够满足临床应用。
实施例2
使用GMP级试剂在塑料袋中大规模制备人类抗第3方Tcm
为了模拟当使用患者自身的PBMC用于产生自体Tcm所预期的条件，首先进行两个大规模的从两个正常供体的白细胞分离步骤，并且将大量单核细胞冷冻保存(cryopreserved)(分成多个批次)。每个批次用于一次大规模实验。在第一个实验中，遇到了几个技术问题，包括根据Wurzburg方案从冷冻袋中产生DC方面的困难以及生物活性不清楚的新的GMP级IL-15的来源。这些问题导致非常差的CD8T细胞扩增(约3倍)，其在随后的实验中通过使用目前所描述的用于DC的方案(如上所描述的)并且通过使用适合浓度的IL-15(即300U/ml)而被纠正。
如在图15中可以看出的，当在两次大规模实验中针对两个不同的第3方DC产生同一供体的PBMC时，在第11天获得了类似的CD8T细胞扩增，范围为从26.8至31.0倍。考虑到在这一天细胞表现出线性增长，很可能在稍后的时间点可以获得进一步的扩增。但是，这个水平的扩增是令人满意的，因为其允许上达至3x107个细胞每Kg体重的给予潜能。有趣的是，虽然在第0天发现白细胞分离制剂大量的污染有CD14+单核细胞和CD20B细胞，但是这些细胞在细胞培养后消失并且在第12天的最终细胞组成中分别包含94％和98％CD8+CD3+T细胞(图16A-B)。
重要的是，在针对不同DC的两个培养中获得的Tcm表型处于小规模实验的范围内，尽管产生了一些变化性(图17A-图17B)。因此，虽然在第5天，在两个实验中均发现高水平的Tcm表型(分别为77％和71％)，但是在针对第2个DC供体的培养中，该水平在第9天(65％与46％)和第12天(62％与35％)下降得更加显著。这种变化性在小规模实验中未显著地观察到，其可以部分地解释为在第5天去除DC相对较困难，因为与在小规模实验中使用的板的粘附相比，它们较不可能粘附至塑料袋上。因此，用DC较长时间的存在和刺激可以导致更加明显的Tcm表型向Teff表型转变。
实施例3
人抗第3方Tcm抵抗已建立的细胞系的GVL潜能
考虑到在自体设置中，抗第3方Tcm的潜在应用仅用于根除残留的肿瘤细胞(在同种异体设置中，其还用于增加BM细胞的移植)，因此开发细胞毒性能力的体外简单检测是重要的，在将Tcm输注至患者之前，其可以用于质量控制。为此，基于Lask等的示范使用TCR非依赖性检测[LaskA等,JImmunol.(2011)187(4):2006-14]，该示范指出，由于MHC突变而不能被TCR识别的MHC突变细胞系仍然可以通过它们的TCR非依赖性杀灭机制而被抗第3方CTL杀灭。明显地，如果也可以适用于人类Tcm，这种杀灭模式可以用来区分Tcm杀灭与由NK细胞表现出的杀灭。
为了解决这个问题，用靶向B细胞淋巴瘤和浆细胞性白血病细胞系的抗第3方Tcm进行混合淋巴细胞反应(MLR)，并且在22小时之后测量％细胞凋亡。如在代表典型实验的图17C中可以看到的，Tcm表现出显著的GVL反应性。
在不同的实验中，首先使用磁力珠分选通过广泛地耗尽非CD8T细胞(即CD4+T细胞、γ/δT细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、粒细胞和红系细胞)富集CD8T细胞。如在代表典型实验的图18中可以看到的，对于测试的所有四个组，污染NK和NKT细胞的百分比非常低(NK细胞低于0.1％，且NKT细胞低于1.9％)。
然后用以下两种类型的细胞来孵育高度纯化的CD8T细胞：a)H.MyC1RHLA-A2K66A突变细胞系(K66A)以证明TCR非依赖性杀灭；和b)H.MyC1R(Neo)，其为一种缺乏表面HLAA和B抗原并从而对通过以下机制的Tcm的杀灭不敏感的B-细胞淋巴母细胞系，该机制需要CD8分子对Tcm以及α3结构域对靶白血病细胞的MHC之间的相互作用。
如图19A-图19D中所示的，与MHC-I-deficientH.MyC1R(Neo)细胞相比，抗第3方Tcm表现出显著地杀灭K66A突变靶细胞。因此，类似于人类的抗第3方CTL，人类Tcm通过TCR非依赖性杀灭机制可以杀灭B细胞肿瘤细胞，这与需要在靶细胞上MHC表达的NK介导的杀灭相反。
最重要的是，当通过将在暴露至最佳细胞分离试剂("CD4-CD56-CD19-,CD45RA+")的对照组中获得的平均结果与其中使用减少了抗-CD19或抗CD45RA的其他组比较而进行进一步分析时(图19A-图19D)，示出在所有实验组中的H.MyC1RHLA-A2K66A突变细胞系的百分比TCR非依赖性杀灭(计算为在最佳对照组中获得的水平的百分比)非常相似(图20)(当将所有三个测试组与参考对照组进行比较时，P>0.05)。
总的来说，这些结果显示，由以最少使用用于分离CD8T细胞的试剂分离的细胞表现出的GVL反应性，并不比与更广泛的分离方案相关的GVL反应性差。
使用先前用来论证通过抗第3方CTL的这种B-CLL杀灭的Hu/SCID模型，通过Tcm在体内进行了自体B-CLL肿瘤细胞的杀灭。
实施例4
产生同种异体人类抗第3方Tcm细胞
启用新GMB级途径以最小化当使用同种异体抗第3方Tcm时的GVHD风险
如先前在小鼠模型中证实的，抗第3方Tcm在同种异体BMT中诱导耐受方面可能非常有用[OphirE.等.Blood.(2010)115(10):2095-104]。在这种情况下，将源自于同种异体BM供体的幼稚CD8+T细胞用作应答子，并且将第3方供体树突状细胞(DC)用作刺激子以使得能够产生宿主非反应性Tcm细胞。为了避免GVHD，选择第3方供体以确保所有他的HLA-I类等位基因都未与宿主的HLA-I类等位基因存在共用。
尽管如此，考虑到人类患者可能比近交系小鼠更容易出现GVHD，因此这种方法的临床转化必须谨慎进行。为了进一步降低GVHD风险，在抗第三方同种异体刺激期结束时，可以需要另外的同种异体耗尽步骤，如光耗尽或选择活化细胞。
修改自体人类方案(用于同种异体方案)
如图21-图22所示出的，用于产生用于同种异体设置的Tcm的方案与用于自体设置的方案的不同之处在于以下两个主要步骤：
a)在分离CD8T细胞之后选择CD45RA+细胞。记忆T细胞具有比幼稚T细胞更低的活化阈值，这可以导致非特异性细胞因子驱动的记忆T细胞部分的扩增。这些细胞可能包括与宿主抗原交叉反应的克隆，从而增加GVHD诱发的风险。为了最小化由不同人类供体之间的幼稚T细胞百分比的差异所导致的影响，以及为了降低GVHD的风险，使用幼稚CD8T(CD45RA+CD8+)作为用于产生Tcm细胞的来源。
b)在培养结束时，通过耗尽CD137+活化的CD8T细胞来去除潜在的宿主反应性T细胞。
延长IL-7和IL-15匮乏期(deprivationperiod)
如对于自体培养所描述的(上文)，本发明者们已经观察到暴露至IL-7和IL-15的幼稚CD8T细胞以抗原非依赖性方式增殖。另一方面，暴露至IL-21的幼稚CD8T细胞在没有同种异体刺激的情况下不增殖并且甚至不能存活超过培养的第7天。因此，将IL-7和IL-15的添加从第3天延迟到第7天可以潜在地使得选择性耗尽不响应第3方刺激子的抗-宿主克隆。
为了确定添加关于(vis-à-vis)同种异体反应性耗尽的细胞因子的最佳时机，在存在或不存在IL-21的条件下，用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率刺激幼稚CD8T细胞7天。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15(图23B)、IL-15和IL-21(图23C)或单独的IL-15(图23D)扩增直到第13天；将所获得的细胞群体与根据参考对照组依照所描述的自体设置进行扩增而培养的幼稚CD8T细胞(在第(0-3)天用IL-21和DC进行孵育；在第(3-13)天添加IL7+IL15(图23A))进行比较。
使用与参考对照组相同的细胞因子添加顺序但是以不同的时机(即将IL-21的添加从3天延长至7天，并且在第7天而非在第3天添加IL-7和IL-15)阻碍了细胞的扩增(图24A)(增殖仅为参考对照组所表现出的54±7％)。但是，诱导的中央型记忆表型是相似的(图24B)(为参考对照组所显示的99±14.8％)。
如同所示的，去除IL-7并且将IL-21的添加延长至培养结束时，减少了细胞的扩增(图24A)(为参考对照组所表现出的增殖的60±13％)，并且降低了中央型记忆表型的获取(为参考对照组所表现出的Tcm水平的82±6.8％，图24B)。
使用7天细胞因子匮乏引发幼稚CD8T细胞，随后从第7天起仅加入IL-15，大幅地降低了细胞的扩增潜能(仅为参考对照组所表现出的增殖的5±1.3％)，并且也降低了中央型记忆表型的获取(图24B)(为参考对照组所表现出的Tcm水平的68±26％)。
还检查了最关键的参数，即耗尽宿主反应性克隆(用适合的供体进行测试，该供体在I类HLA上完全不同于用于刺激的第3方细胞)。也进行了进一步的实验以优化细胞因子匮乏期。
基于CD137活化标志物，用于耗尽同种异体反应性的两阶段磁力分选方法
可以通过两阶段分选技术来实现基于第3方概念耗尽抗-宿主克隆的简洁方式，包括下列CD137选择步骤：
a.在培养开始时阳性选择抗第3方特异性克隆；
b.在接近培养结束时耗尽抗-宿主特异性克隆。
最近，CD137已经被描述为用于抗原特异性活化人类CD8+T细胞的适合标志物，因为在休眠的CD8+T细胞上不表达CD137并且在刺激24小时后其表达被可靠地诱导。
为了评价这种方法，在IL-21的存在下使用经辐射的同种异体第3方DC刺激幼稚CD8T细胞。在活化14小时后，通过磁力分选阳性地选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下用经辐射的第3方DC重新刺激CD137+细胞直到第3天。此后，用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天，并且然后在IL-7和IL-15的存在下用经辐射的宿主PBMC进行活化。活化24小时后，通过磁力分选耗尽CD137+细胞。使用IL-7和IL-15重新接种CD137耗尽的细胞并且培养直至第14天。在选定的天数，通过台盼蓝拒染法评价细胞的细胞数并且使用FACS分析评价CD8T细胞群体中的Tcm(CD62L+CD45RO+)的百分比。针对第3方或宿主经辐射的PBMC通过CFSE检测评价抗第3方和抗宿主同种异体反应性细胞的频率。将这些结果与在IL-21的存在下刺激3天并且此后用IL-7和IL-15扩增的对照组(“参考对照组”)中获得的那些进行比较。
因此，如在图25中可以看出的，虽然在紧接着富集幼稚CD8T细胞之后(第0天)，仅有0.7％的总CD8T细胞表达CD137+，但是在IL-21的存在下针对第3方DC活化14小时之后，来自总CD8T细胞区室(compartment)的表达CD137+的CD8T细胞的百分比增加至8.3％，与不存在DC刺激的2.5％形成对比。这种活化细胞的亚群的磁力分选使得C137+细胞显著富集(分别为85％)，并且总CD8T细胞区室中的CD62L+CD8T细胞的水平从84％大幅地减少至14％(数据未示出)。
如下表5中所示的，这种阳性选择与降低的细胞回收相关联。因此，在第0天，在富集幼稚CD8T细胞之后，来自耗尽了贴壁细胞的PBMC的收率为7.6％，并且在第1天，在阳性选择CD137+之后，收率降低至0.25％(7.6％的3.3％)。当在培养的第7天评价时，经受过阳性选择CD137+细胞的CD8T细胞的测试组在Tcm细胞的百分比方面与参考对照组高度相似(分别为67％与70％)，并且在培养的第10天也维持了这种组之间在百分比Tcm方面的相似性(分别为54％与52％)(图26)。
表5：增殖和最终细胞数的比较
在IL-21的存在下用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率刺激幼稚CD8T细胞3天。此后细胞未接受进一步活化而用IL-7和IL-15扩增直至第14天(“参考对照组”)。可替代地，在IL-21的存在下用经辐射的同种异体第3方DC以5.7:1的比率刺激幼稚CD8T细胞。活化14小时后，通过磁力分选阳性选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下用经辐射的第3方DC以4:1的比率重新刺激CD137+细胞直至第3天。此后，用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天。在第10天，在IL-7和IL-15的存在下(以1至2的比率)用经辐射的宿主PBMC进行活化。24小时之后，通过磁力分选耗尽CD137+细胞。用IL-7和IL-15重新接种D137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第3方D137+和抗宿主CD137-”)。在指定的天数，通过台盼蓝拒染法计数细胞。
a＝在富集幼稚CD8T细胞之后的收率(表示为PBMC–贴壁细胞的起始数量的百分比)。
b＝在用第3方DC活化并且富集CD137+CD8T细胞之后的收率(表示为PBMC–贴壁细胞的起始数量的百分比)。
c＝在第13天，从第0天起的倍数扩增；
d＝在第14天，从第0天起的倍数扩增；
e＝最终细胞数＝(收率)x(从第9天起的倍数扩增)(表示为PBMC–贴壁细胞的起始数量的百分比)。
另外，当在培养第7天和第10天评价细胞组成(％CD8T细胞、％NK细胞和％NKT细胞)时，经受阳性选择CD137+细胞的CD8T细胞的测试组在其细胞组成方面高度相似于参考对照组(表6，如下)。
表6：通过阳性选择CD137+细胞富集抗-第3方特异性CD8T细胞不会大幅度地改变细胞组成
在IL-21的存在下，用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率刺激幼稚CD8T细胞3天。此后，细胞未接受进一步的活化而用IL-7和IL-15扩增直至第10天(“参考对照组”)。可替代地，在IL-21的存在，用经辐射的同种异体第3方DC以5.7:1的比率刺激幼稚CD8T细胞。在活化14小时之后，通过磁力分选阳性选择CD137+细胞。然后在IL-21的存在下，用经辐射的同种异体第3方DC以4:1的比率再刺激CD137+细胞直至第3天。此后，用IL-7和IL-15扩增细胞直至第10天。通过FACS分析来评价细胞的细胞组成。
另一方面，如图27所示，与参考对照组相比，经受了阳性选择CD137+细胞的CD8T细胞的测试组在两个时间点上都表现出更加优越的扩增潜力(在第7天，从第0天起的倍数扩增分别为35与7，并且在第10天，从第0天起的倍数扩增分别为119与34)。在第10天，将经受了阳性选择CD137+细胞的CD8T细胞的组分成两个测试组。在第一组中，用IL-7和IL-15继续扩增细胞直至第14天(“抗第3方CD137+”)，而在IL-7和IL-15的存在下用经辐射的宿主PBMC活化第二测试组中的细胞。在活化24小时之后，通过磁力分选耗尽CD137+细胞。然后用IL-7和IL-15重新接种CD137耗尽的细胞并且培养直至第14天(“抗第3方CD137+和抗宿主CD137-”)。
当在第13天评价时，与参考对照组相比，来自经受了阳性选择CD137+细胞的测试组的CD8T细胞在两个时间点继续表现出更优越的扩增潜力(分别为134与61倍扩增)。相反，当在第14天进行评价时，来自经受了抗第3方阳性选择CD137+以及耗尽抗宿主CD137+细胞的测试组的CD8T细胞表现出较低的扩增潜力(72倍扩增)(图27)，表明在第11天至第14天之间的细胞扩增不能补偿由于CD137+抗宿主特异性同种异体反应性T细胞的耗尽所引起的损失。
如图28所示，当在第10天评价CD137表达时，在经受了阳性选择CD137+细胞的CD8T细胞中的总CD8T细胞区室中，仅有0.5％表达CD137+。因此，这个组中的CD8T细胞相当程度地下调CD137的表达(从第1天的85％下调至第10天的仅0.5％)。
然而，在用经辐射的宿主PBMC活化24小时之后(以1至2的比率，有利于宿主PBMC)，来自总CD8T细胞区室的表达CD137+的CD8T细胞的百分比增加至16％。通过磁力分选耗尽这些CD137+细胞的降低了总CD8T细胞区室的表达CD137的CD8T细胞的百分比，从16％至3％。
在第14天，通过将针对宿主PBMC刺激之后的CFSE保留细胞的水平与在IL-7存在下针对第3方PBMC刺激之后的CFSE保留细胞的水平进行比较，进行剩余抗宿主同种异体反应性的最终分析。
如图29所示，在经受了基于CD137的阳性及阴性选择的组中，用第3方PBMC刺激之后的细胞特异性分裂的数量比参考对照组高约3倍(分别为2259与741个分裂细胞)。最重要的是，在培养结束时除去CD137+细胞完全防止了响应于宿主PBMC的增殖，与表现出可检测增殖的参考对照组(134个分裂细胞)相反。有趣地是，经历了针对第3方活化的细胞的阳性选择而在培养结束时未去除抗-宿主克隆的组，表现出比对照组更高水平的宿主反应性细胞，表明在宿主的MHC同种异型(allotypes)与第3方刺激子之间的潜在交叉反应性(虽然通过HLA分型故意地进行了错配)。因此，虽然清楚地表明了在培养结束时的抗宿主耗尽步骤的重要性，但是需要进一步研究以评价抗第3方活化细胞的第一阳性选择的潜在作用。
然而，如上表5所示的，通过两阶段基于CD137的磁力分选成功耗尽抗宿主特异性克隆，在培养结束时提供了整体上较低的细胞回收(分别为18％与463％，表示为从PBMC-贴壁细胞的输入数的百分比)。
总起来说，这个初步实验表明，通过基于CD137活化标志物的两阶段磁力分选耗尽同种异体反应性是可行的，并且可以并入至用于产生宿主非反应性同种异体Tcm细胞的本方案中。所显示的令人鼓舞的属性是：1)由在阳性选择之后的同种异体活化所诱导的高表达水平在第10天完全被下调，允许针对宿主抗原的另一个同种异体活化；2)基于CD137活化标志物的磁力分选没有大幅度地影响细胞组成和Tcm细胞的百分比；3)在培养结束时去除CD137+细胞完全防止了响应于宿主PBMC的增殖，这与表现出可检测增殖的参考对照组(134个分裂细胞)相反。目前的研究包括：1)在阳性选择步骤之前使用FcR阻断；2)在培养结束时使用宿主DC代替PBMC以更加有效地检测宿主反应性细胞；3)向耗尽步骤中加入更多临床上可利用的活化标志物，如CD25或IFNγ俘获物。
结论：
在Tcm产生结束时使用CD137耗尽可以提供一种可行的方法以进一步耗尽这些同种异体反应性细胞。
探索尝试了继续细化CD137耗尽与CD25耗尽的结合应用，这两种都可用作GMP试剂。
另外，通过使用仅携带有一个HLA-I等位基因的人工APC进行了实验以尽量减少潜在的交叉反应性。
虽然已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但明显的是，许多替换、修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。因此，本发明旨在包含落入随附权利要求的精神及宽范围内的所有此类替换、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此都通过引用以它们的全部内容并入到本说明书中，其程度如同每个单独的出版物、专利和专利申请被具体且单独地指明通过引用并入本文。此外，本申请中任何参考文献的引用或标识都不应被解释为承认此类参考文献可以作为本发明的现有技术。在一定程度上使用了章节标题，但是它们不应被解释为必要的限制。
Claims (28)
1.一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的非-GVHD诱导性抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有抗疾病活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括：
（a）用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理外周血单核细胞（PBMC），以便获得CD8+T细胞；
（b）在IL-21的存在下，使所述CD8+T细胞与一种或多种第三方抗原接触，以便富集抗原反应性细胞；和
（c）在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤（b）的所述细胞，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的细胞，从而产生所述细胞的分离群体。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在步骤（a）之前，从所述PBMC中耗尽贴壁细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：在步骤(a)之后且在步骤（b）之前，从所述PBMC中选择CD45RA+和/或CD45RO-细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PBMC包含CD8+T细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在步骤（b）之后且在步骤（c）之前，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用一种或多种第三方抗原培养获自步骤（b）的所述细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种第三方抗原包括树突状细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述树突状细胞是经辐射的树突状细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种第三方抗原选自由以下组成的组：第三方细胞、细胞抗原、病毒抗原、细菌抗原、蛋白质提取物、纯化的蛋白质以及由自体呈递细胞、非自体呈递细胞呈递的或在人工载体或人工抗原呈递细胞上呈递的合成肽。
9.一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的非-GVHD诱导性抗第三方细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞是耐受性诱导细胞和/或赋有移植物抗白血病（GVL）活性，并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括：
（a）用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁外周血单核细胞（PBMC），以便获得CD8+T细胞；
（b）在IL-21的存在下，使所述CD8+T细胞与第三方树突状细胞接触12小时至5天，以便允许富集抗原反应性细胞；
（c）在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用所述第三方树突状细胞培养获自步骤（b）的所述细胞12小时至3天；和
（d）在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养由步骤（c）获得的所述细胞5至20天，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的细胞，从而产生所述细胞的分离群体。
10.一种产生包含具有中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的非-GVHD诱导性抗第三细胞的细胞的分离群体的方法，所述细胞赋有抗疾病活性并且在移植之后能够归巢至淋巴结，所述方法包括：
（a）用能够耗尽CD4+和/或CD56+细胞的试剂处理非贴壁外周血单核细胞（PBMC），以便获得CD8+T细胞；
（b）在IL-21的存在下，使所述CD8+T细胞与非同源的树突状细胞接触12小时至5天，以便允许富集抗原反应性细胞；
（c）在IL-21、IL-15和IL-7的存在下用所述非同源的树突状细胞培养获自步骤（b）的所述细胞12小时至3天；和
（d）在无抗原的环境中，在IL-21、IL-15和IL-7的存在下，培养获自步骤（c）的所述细胞5至20天，以便允许增殖包含所述中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）表型的细胞，从而产生所述细胞的分离群体。
11.根据权利要求9或10所述的方法，进一步包括在步骤（a）之后且在步骤（b）之前从所述PBMC中选择CD45RA+和/或CD45RO-细胞。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述CD8+T细胞包含幼稚CD8+T细胞。
13.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述树突状细胞包括体外扩增的树突状细胞或经辐射的树突状细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行12小时至5天。
15.根据权利要求1、9或10所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行2至3天。
16.根据权利要求1、9或10所述的方法，其中，在所述IL-21的存在下的所述接触进行3天。
17.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在步骤（a）之后且在步骤（b）之前选择经活化的细胞。
18.根据权利要求9所述的方法，进一步包括：在步骤（b）之后且在步骤（c）之前，选择经活化的细胞。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述选择经活化的细胞是通过选择CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
20.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述选择经活化的细胞在所述接触之后进行12至72小时。
21.根据权利要求5所述的方法，其中，在所述IL-21、IL-15和IL-7的存在下，用所述一种或多种第三方抗原的所述培养进行12小时至3天。
22.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述无抗原的环境中，在所述IL-21、IL-15和IL-7的存在下的所述培养进行5至20天。
23.根据权利要求1、9或10所述的方法，其中，在所述无抗原的环境中，在所述IL-21、IL-15和IL-7的存在下的所述培养进行7至11天。
24.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：在步聚（c）之后，耗尽同种异体反应性细胞。
25.根据权利要求9所述的方法，进一步包括：在步聚（d）之后，耗尽同种异体反应性细胞。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中，所述耗尽所述同种异体反应性细胞是在使所述包含所述中央型记忆T淋巴细胞（Tcm）的细胞与宿主抗原呈递细胞（APC）接触之后通过耗尽CD137+和/或CD25+细胞来进行的。
27.根据权利要求1、9或10所述的方法，其中，所述具有T中央型记忆表型的抗第三方细胞包含CD3+、CD8+、CD62L+、CD45RA-、CD45RO+标记。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述细胞的分离群体的至少50%是CD3+CD8+细胞，所述CD3+CD8+细胞的至少50%具有所述标记。
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