NO325560B1 - Anvendelse av villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens for fremstilling av et medikament for behandling av kreft. - Google Patents

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen

1. Oppfinnelsens omrade

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens for fremstilling av et medikament for behandling av kreft. Kombinasjonen av DNA-ødeleggende midler med heterolog ekspresjon av et svulsthemmer-gen gir en sterk synergistisk effekt som er høyere enn effektene av de individuelle komponenter.

2. Beskrivelse av lignende kunnskap

Nåværende behandlingsmetoder for kreft, inkluderende strålingsbehandling, kirurgi og kjemoterapi har begrenset effektivitet. Lungekreft alene dreper mer enn 140.000 mennesker hvert år i USA. Nylig har alderstilpasset dødelighet fremkalt av lungekreft gått forbi dødelighet fra brystkreft hos kvinner. Selv om igangsettelse av anti-røkeprogrammer har senket hyppigheten av røking, vil dødelighet fremkalt fra lungekreft forbli høy langt inn i det 21. århundre. Rasjonell utvikling av nye behandlings-måter for lungekreft vil være avhengig av en forbedret forståelse av lungekreftens biologi på det molekylære nivå.

Det er nå klart fastslått at en rekke kreftformer forårsakes, ihvertfall delvis av genetiske feil som resulterer enten i at ett eller flere gener blir overuttrykt, eller at et unormalt eller mutant gen eller gener blir uttrykt. F.eks. er det i mange tilfeller kjent at ekspresjon av onkogener fører til utvikling av kreft. "Onkogener" er genetisk endrede gener der det muterte ekspresjonsprodukt på én eller annen måte ødelegger normal cellulærfunksjon eller kontroll (Spandidos et al., 1989).

De fleste onkogener som er blitt studert pr. idag er blitt funnet å være "aktivert" som resultat av en mutasjon, ofte en punktmutasjon, i det kodende område av et normalt cellulært gen, dvs. et "proto-onkogen", som resulterer i aminosyresubstitusjoner i det uttrykte proteinprodukt. Dette endrede ekspresjonsprodukt fremviser en unormal biologisk funksjon som igjen deltar i den neoplastiske prosess (Travali et al., 1990). De underliggende mutasjoner kan oppstå på ulike måter, som ved kjemisk mutagenese eller ioniserende bestråling. Flere onkogener og onkogenfamilier, som inkluderer ras, mye, neu, raf, erb, src, fms, jun og abl, er nå blitt identifisert og karakterisert i varierende grad (Travali et al., 1990; Bishop, 1987).

Under normal cellevekst mener man at vekst-frembringende proto-onkogener blir balansert av vekst-hindrende svulsthemmer-gener. Flere faktorer kan føre til en mangel på balanse i disse to systemer, noe som kan føre til en neoplastisk tilstand. En slik faktor representeres av mutasjoner i svulst-hemmergener (Weinberg, 1991).

Et viktig svulsthemmer-gen er genet som koder for det normale cellulære protein, p53, et 53 kD stort fosfoprotein i cellekjernen som kontrollerer celleproliferasjon. Mutasjoner i p53-genet og tap av allel på kromosom 17p hvor genet er plassert er blant de hyppigste endringer som er identifisert i ondartede sykdommer hos mennesker. p53-proteinet er sterkt konservert gjennom evolusjonen og uttrykkes i de fleste normale vev. Vill-type p53 er blitt funnet å være innblandet i å kontrollere cellesyklus (Mercer, 1992), regulering av transkripsjon (Fields et al., 1990 og Mietz et al., 1992), DNA-replikasjon (Wilcock og Lane, 1991 og Bargonetti et al., 1991), og i å fremme apoptose (Yonish-Rouach et al., 1991 og Shaw et al., 1992).

Ulike mutante p53-alleler er kjent hvor en enkel base-substitusjon resulterer i syntese av proteiner som har svært ulike vekst-regulerende evner og, i siste instans, fører til ondartet sykdom (Hollstein et al., 1991). p53-genet er faktisk blitt funnet å være det hyppigst muterte gen i vanlige humane kreftformer (Hollstein et al., 1991; Weinberg, 1991), og er spesielt tett knyttet til de kreftformer som forbindes med sigarettrøking (Hollstein et al., 1991; Zakut-Houri et al., 1985). Overekspresjon av p53 i brystsvulster er også blitt dokumentert (Casey et al., 1991) .

Adenovirusvektor konstruert for levering av gen kodende for vill-type p53 er beskrevet i Proceedings Of the American Association For Cancer Research, Vol. 35, 1994, side 692-693. I(Biochemical and Biophysical research communication, 199 (1), 1994, side 264-270) blir det angitt at resultater har vist at inaktivering eller mutasjon av p53 gjør cellene mere sensitive overfor de cytotoksiske medikamentene hvor den primære virkningsmekanismen er DNA-skade.

PNAS, Vol. 89, side 4495-4499, 1992 angir at apoptose kan være en normal del av det terminale differensieringsprogrammet til kolon epitelialceller og at deres resultater foreslår at vill-type p53 kan spille en kritisk rolle i denne prosessen.

I (Int. J. Radiat. Biol., 1988, Vol. 54, No. 4, side 567-576) er det angitt at det er mye som tyder på at apoptose involverer aktiv cellulær selv-destruksjon og det er blitt foreslått at aktivering av apotoptose kan tilveiebringe selektiv eleminering av celler med kritisk DNA-skade i bestrålt vev for derved å minimalisere propagering av genetiske abnormaliteter.

Frekvensen av apoptose etter behandling med 2 kolon karsinogener og bestrålning ble studert i kryptene til fem forskjellige deler av musetarm (Cancer research 49, 6342-6346, November 1989)

Nature, Vol. 362, April 1993, side 849-852 beskriver at p53 utøver en signifikant og doseavhengig effekt på initiering av apoptose, men kun når det blir indusert av midler som forårsaker brudd på DNA-tråden.

Involvering av p53 i den apoptotiske responsen foreslår en mekanisme hvorved tumorceller kan erverve kryss-resistens overfor anticancermidler (Cell, Vol. 74, 957-967, September 1993).

Cancer Gene T. vol 1, No. 1, 1994, side 5-13 foreslår at adenovirus er en effektiv vektor for mediering av overføring og ekspresjon av tumorsuppressorgener i humane cancerceller og at Ad5CMV-p53-virus kan bli ytterligere utviklet til et terapeutisk middel for anvendelse i cancergenterapi.

Ett av de mest utfordrende aspekter av kreftbehandling ved hjelp av gener dreier seg om å benytte svulsthemmer-gener såsom p53. Det er blitt rapportert at transfeksjon av vill-type p53 inn i visse typer av bryst- eller lungekreftceller kan gjenopprette veksthemmingskontroll i cellelinjer (Casey et al., 1991; Takahasi et al., 1992). Selv om DNA-transfeksjon ikke er en brukbar måte for å introdusere DNA inn i pasientceller, viser disse resultater at å forsyne vill-type p53 til kreftceller som har mutert p53-gen, kan være en effektiv behandlingsmetode dersom en forbedret metode for å levere p53-genet kunne bli utviklet.

Genoverføringssystemer som er appliserbare til genbehandling for svulsthemming er for tiden under aktiv utforskning og utvikling. Virus-basert genoverføringsmedier er spesielt interessante siden virus infiserer levende celler med høy grad av effektivitet gjennom en prosess der det genetiske materiale fra virus selv blir overført. Noen fremgang er blitt gjort på dette område, som f.eks. dannelsen av retrovirale vektorer modifisert for å kunne overføre en rekke ulike gener. Imidlertid er store problemer knyttet til bruk av retrovirale vektorer for genbehandling, siden deres infeksiøsitet avhenger av at målcellene har reseptorer for retrovirus, videre er de vanskelig å konsentrere og rense, og de integreres effektivt bare i replikerende celler.

Svulstcelle-motstandskraft mot kjemoterapeutiske medikamenter representerer et stort problem i klinisk onkologi. NSCLC representerer minst 80% av tilfellene av lungekreft, men pasienter med NSCLC responderer stort sett ikke på kjemoterapi (Doyle,1993).

Ett av målene av nåværende kreftforskning er å finne måter som kan øke effektiviteten av gen-utbyttingsbehandling av kreft ved å studere interaksjoner mellom genprodukt og kjemoterapeutiske medikamenter. Genet for herpes simplex-thymidinkinase (HS-tK), når det blir innført i hjernesvulster ved et retroviralt vektorsystem, induserte på en effektiv måte følsomhet overfor det antivirale medikament ganciclovir (Culver et al., 1992). HS-tK-genproduktet er et eksogent viralt enzym, mens villtype p53-proteinet er uttrykt i normale vev, noe som antyder at modulering av kjemo-resistens ved å endre vill-type p53-ekspresjonen kan være en alternativ mulighet der et endogent genetisk program blir benyttet.

Et adenovirussystem har mulige fordeler for å overføre et gen in vivo, som f.eks. evne til å produsere høy titer virus, høy infeksjonseffektivitet og evne til å infisere mange celletyper. Stabiliteten og varigheten av ekspresjonen av de introduserte gener er imidlertid fremdeles kontroversiell. Øking i nivå av p53 i celler som er følsomme overfor kjemoterapeutiske medikamenter kan oppstå innen 6 timer etter DNA-ødeleggende stimuli (Fritsche et al., 1993), Zhan et al., 1993), selv om øket p53 DNA bindings-aktivitet kan bli reversert i løpet av et tidsrom på 4 timer dersom stimulus blir fjernet (Tishler et al., 1993). Derfor kan et høyt nivå av p53-ekspresjon vedlikeholdes selv etter avslutning av medikamentell behandling. Ekspresjon av vill-type p53-proteinet fremkalt av Ad-p53 viser maksimum 3 dager etter infeksjon (14 ganger høyere enn endogen vill-type) og synker til et lavt nivå på dag 9 (Zhang et al., 1993). Dette antyder at et kortvarig høyt nivå av vill-type p53-ekspresjon er tilstrekkelig for å initiere det celle-drepende program i kreftcellen.

p53 har en viktig rolle som en determinant for kjemosens-itivitet i humane lungekreftceller. En rekke behandlingsprotokoller, som inkluderer kirurgi, kjemoterapi og stråle-behandling er blitt forsøkt for human NSCLC, men langtids-overlevelsesresultater har forblitt utilfredsstillende. Det som trenges er en kombinasjonsbehandling som benyttes alene eller som effektivt tilleggsbehandlingsregime for å hindre lokale tilbakefall etter primær kirurgisk fjernelse av svulst eller som en behandling som kunne bli gitt ved injeksjoner inn i lesjonene i medikament-resistent lungekreft av primær, metastatisk eller lokalt oppstått type. Blandinger og metoder trenges også for å utvikle, studere og forbedre klinisk brukbarhet av nye blandinger i kreftbehandling. Videre må disse metoder og blandinger vise sin verdi under realistiske in vivo-forhold.

Sammendrag av oppfinnelsen

Det er et behov for å forbedre terapeutiske midler som kan brukes for å drepe celler ved å kombinere effektene av et svulsthemmer-gen eller protein og en DNA-ødeleggende faktor eller et middel.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens for fremstilling av et medikament for behandling av kreft i en pasientgruppe som har blitt behandlet med et DNA-ødeleggende middel valgt fra: (a) midler som interfererer med DNA-replikasjon, mitose eller

kromosomal segregasjon,

(b) midler som ødelegger syntesen og påliteligheten til

nukleinsyreforløpere,

(c) stråling eller bølger,

(d) DNA-interkalerende midler, og

(e) DNA-alkylerende midler.

Oppfinnerne fant overraskende ut at bruk av medikamentet som fremstilles førte til at de kunne indusere programmet celledød, som også er kjent som apoptose, i et meget signifikant tall av målceller.

Medikamentene har en oppsiktsvekkende evne i å kontrollere cellevekst og spesielt svulst-cellevekst. Svulst-celledannelse og -vekst, noe som også er kjent som transformasjon, beskriver dannelse og proliferasjon av celler som har tapt sin evne til å kontrollere celledeling, med andre ord de er blitt kreftceller. Det antas at et antall av ulike typer av transformerte celler er mulige mål for medikamentene, slik som sarkomer, melanomer, lymfomer og en rekke av faste svulster og lignende. Selv om ethvert vev som har ondartet cellevekst kan være et mål, er lunge-og brystvev foretrukne mål. Oppfinnerne opplyser her at en rekombinant overføringsvektor som uttrykte p53 hadde evne til i betydelig grad å redusere veksthastigheten hos celler når den ble brukt sammen med et DNA-ødeleggende middel.

Medikamentene kan drepe en celle eller celler, som f.eks. ondartet celle eller celler, ved at en celle eller en populasjon av celler får kontakt med eller blir utsatt for et p53-protein eller gen og ett eller flere DNA-ødeleggende midler i en kombinert mengde som har evne til å drepe cellen eller cellene. Cellene som kan drepes inkluderer f.eks. uønskede men godartede celler slik som godartet prostata-hyperplasiceller eller overaktive skjold-brukskjertelceller; celler som er relatert til autoimmunsykdommer som B-celler som produserer antistoff som er involvert i leddgikt, lupus, myasthenia gravis, plate-epitel metaplasi, dysplasi og lignende. Medikamentene kan anvendes for å drepe alle uønskede celler, men spesielt ondartede celler. Ondartede celler blir definert som celler som har mistet evnen til å kontrollere sin celledelingssyklus, som fører til en "transformert" eller "kreft"-fenotype.

Uttrykkene og begrepene "å få kontakt med" og "bli eksponert for", når disse blir brukt om en celle, benyttes for å beskrive prosessen hvormed et svulsthemmer-gen eller protein såsom p53, blir levert til en målcelle eller plasseres i direkte nærkontakt med målcellen. For å oppnå celledød blir medikamentene overført til cellen i en mengde som er tilstrekkelig for å drepe cellen, d.v.s. å indusere programmert celledød eller apoptose. Uttrykkene og begrepene "celledød", "programmert celledød" og "apoptose", blir brukt om hverandre i denne tekst for å beskrive en serie av intra-cellulære hendelser som fører til målcelledød. Celledødprosessen involverer aktivering av intracellulære proteaser og nukleaser som fører til f.eks. cellekjerne-involusjon og fragmentering av celle-kjerne DNA. Det er ikke nødvendig med en detaljert forståelse av de nøyaktige mekanismer hvormed ulike intracellulære molekyler reagerer for å oppnå celledød for at man skal kunne benytte foreliggende oppfinnelse.

DNA-ødeleggende midler inkluderer stråling og bølger som induserer DNA-ødeleggelse, såsom y-bestråling, røntgenstråler, UV-stråling, mikrobølger, elektroniske utstrålinger og lignende. En rekke ulike kjemiske forbindelser, som også blir beskrevet som "kjemo-terapeutiske midler", funksjonerer ved å indusere DNA-ødeleggelse. Kjemo-terapeutiske midler kan inkludere f.eks. adriamycin, veiapamil og podohyllotoxin.

Enhver metode kan også brukes for å skape kontakt mellom en celle og p53-proteinet så lenge metoden gir som resultat et øket nivå av funksjonell p53-protein inne i cellen. Dette inkluderer både direkte levering av et p53-protein til cellen og levering av et gen eller DNA-segment som koder for p53, der dette gen vil lede ekspresjon og produksjon av p53 inne i cellen. Siden protein-levering blir hemmet av slike problemer som protein-nedbrytning og lavt opptak inn i cellene, forventes at bruk av en rekombinant vektor som uttrykker et p53-protein vil gi spesielle fordeler.

En rekke ulike rekombinante plasmider og vektorer kan bli produsert for å uttrykke et p53-protein og således benyttes for å overlevere p53 til en celle. Disse inkluderer f.eks. bruk av nakent DNA og p53-plasmider for direkte å overføre genetisk materiale in i cellen (Wolfe et al., 1990); formuleringer av p53-kodende DNA innelukket i liposomer (Ledley et al., 1987) eller i proteoliposomer som inneholder virushylster-reseptorproteiner (Nicolau et al., 1983); og p53-kodende DNA koblet til et polylysin-glykoprotein-bærerkompleks.

Bruk av rekombinante virus som er endret for å uttrykke p53 blir også forventet brukt. En rekke ulike virusvektorer, såsom retrovirale vektorer, herpes simplex virus (US-patent 5.288.641), cytomegalovirus og lignende kan benyttes som beskrevet av Miller (Miller, 1992); likeledes kan rekombinant adeno-assosiert virus (AAV vektorer); lik dem som er beskrevet i US-patent 5.139.941 og spesielt rekombinant adenovirale vektorer. Teknikker for å preparere replikasjons-defekte infeksiøse virus er velkjent innen fagområdet, som eksemplifisert av Ghosh-Choudhury & Graham (1987); McGrory et al., (1988), og Gluzman et al., (1982).

For å drepe en celle, ville man vanligvis plassere cellen i kontakt med et p53-protein eller gen i en mengde som er tilstrekkelig til å drepe cellen.

Et antall in vitro parametere kan benyttes for å bestemme effekten som blir produsert ved anvendelse av de fremstilte medikamentene. Disse parametere inkluderer f.eks. observasjon av netto celleantall før og etter eksponering til de blandinger som er beskrevet her, samt størrelsen på de multi-cellulære tumorkulene som formes såsom koloniene dannet i vevs-kultur. In vitro celledreping er spesielt vist i eks. 7 i denne fremstilling.

Som alternativ kan man måle parametere som antyder

at en celle gjennomgår programmert celledød, slik som fragmentering av cellulært genomisk DNA til nukleosom-størrelsesfragmenter, vanligvis identifisert ved å separere fragmentene ved agarosegel-elektroforese, deretter farve DNA og sammenligne DNA til en standard DNA størrelsesstige. Nukleosom-størrelsesfragmenter blir identifisert som en progredierende såkalt stige av monomerer og multimerer som har en basal størrelse på ca. 200 basepar.

Tilsvarende er en "terapeutisk effektiv mengde" en mengde av p53-protein eller gen som når det tilføres et dyr i kombinasjon er effektiv til å drepe celler innen dette dyret. Dette er spesielt tydelig i anledning avliving av kreftceller, slik som lunge, bryst eller tykktarm-kreftceller, i et dyr eller person som har en svulst.

Analyse av visse in vivo og ex vivo parametere som gjengir celledød er derfor også effektive metoder som kan benyttes for å estimere hvor effektive medikamentene er. F.eks. observere effekter på hemming av tumordannelse, slik som målt ved TdT-ekspresjon på frysesnitt eller ved å bruke andre farvemetoder og andre mål-antigener som er kjent av kompetente patologer. Naturligvis kan andre metoder for å avgjøre svulst-masse, vekst og levedyktighet bli benyttet for å estimere avliving av målceller. Spesielt gjelder det at man kan estimere effekten i ulike dyremodellsystemer av kreft, inkludert dem hvor humane kreftceller blir plassert inne i dyret. Dyremodeller av kreft, i motsetning til modeller for AIDS, er kjent for å gi god kunnskap som er relevant til behandlingsmetoder hos mennesker (Roth et al., ed.

(1989)). Ett eksempel på en prediktiv dyremodell er den der humane små-celle lungekreftceller (H358-celler) blir tillatt å vokse subkutant. Ved å bruke dette system har oppfinnerne vist at p53-holdige adenovirus som blir innført inn i svulsten sammen med en felles tilførsel av et kjemoterapeutisk middel, gir en overraskende effektiv reduksjon av svulsten.

En spesielt foretrukket metode for å overlevere et p53-protein til en celle er å kontakte cellen med et rekombinant adeno-virusvirion eller partikkel som inkluderer en rekombinant adenoviral vektor som omfatter en p53-ekspresjonsregion som er plassert under kontroll av en promoter som har evne til å dirigere ekspresjon av p53 i den spesifikke celletype. p53-ekspresjonsregionen i vektoren kan inneholde en genomisk sekvens, men for letthets skyld, blir det generelt foretrukket å bruke en p53 komplementær DNA (cDNA)-sekvens, siden disse er lett tilgjengelige og kan manipuleres enklere. I tillegg til å inneholde en p53-ekspresjonsenhet og en promoter-region vil vektoren også vanligvis omfatte et polyadenyleringssignal, f.eks. et SV40 tidlig gen, eller et protamin-gen, polyadenyleringssignal eller lignende.

I foretrukne utførelser blir det vurdert som fordelaktig å plassere p53-ekspresjonsregionen under kontroll av en sterk, konstitutiv promoter slik som en CMV-promoter, virus LTR, RSV eller SV40-promoter, eller en promoter som er assosiert med gener som blir uttrykt i et høyt nivå i pattedyrceller, slik som "elongation factor-1" eller promoter for proteinet actin. For tiden er en cytomegalovirus (CMV) IE-promoter den spesifikt foretrukne. p53-genet eller cDNA kan bli introdusert i et rekombinant adenovirus ved direkte å innføre eller tilsette p53-kodingssekvensen inn i et virusgenom. Imidlertid vil de foretrukne adenovirus være replikasjonsdefekte virus der et gen som er essensielt for replikasjon og/eller for viruspakking er blitt fjernet fra adenovirus-vektorkonstruksjonen, noe som tillater at man introduserer p53-ekspresjons-regionen istedenfor i denne ledige plass. Ethvert gen,, enten det er essensielt (f .eks. EIA, ElB, E2 og E4) eller ikke-essensielt (f.eks. E3) for replikasjon kan bli fjernet og byttet ut med p53. Spesielt foretrukne er de vektorer og virioner hvor EIA- og ElB-regionene i adenovirusvektoren er blitt fjernet og p53-ekspresjonsregionen blitt introdusert i deres plass som vist i eksemplet med genomstrukturen i fig. 1. Teknikker som tillater å preparere replikasjons-defekte adenovirus er velkjent på fagområdet, som eksemplifisert i referansene av Ghosh-Choudhury og Graham (1987), McGrory et al., (1988), og Gluzman et al. Det er også godt kjent at ulike cellelinjer kan brukes for å dyrke opp rekombinante adenovirus, så lenge cellene kan komplementere enhver replikasjonsdefekt som kan være til stede. En foretrukken celle-linje er den humane 293-cellelinje, men enhver annen cellelinje som er permissiv for replikasjon, d.v.s. i det foretrukne tilfelle celler som uttrykker EIA og ElB, kan brukes. Videre kan cellene bli videre dyrket enten på plastskåler eller i suspensjonskultur, for å skape virusstammer av dette.

Andre kombinasjoner av virus og vertsceller som kompiementerer hverandre kan også anvendes. Virus som mangler funksjonelt E2, og celler som uttrykker E2 kan brukes, og også virus som mangler funksjonelt E4 og celler som uttrykker E4 og lignende. Hvor et gen som ikke er essensielt for replikasjon blir fjernet og byttet ut, som f.eks. E3-genet, vil denne effekt ikke behøve å bli spesifikt komplementert av vertscellen.

Utenom kravet om at adenovirusvektorene må modifiseres for å uttrykke p53 er typen av det initiale adenovirus ikke antatt å være kritisk. Adeno-viruset kan være enhver av de 42 forskjellige kjente serotypene eller undergruppene A-F. Adenovirus type 5 fra undergruppe C er det foretrukne startmateriale som benyttes for å fremskaffe den betingede replikasjons-defekte adenovirusvektor som brukes i metoden i denne oppfinnelse. Dette er forårsaket av at Adenovirus type 5 er et humant adenovirus som man vet meget om både på biokjemisk og genetisk område, og som historisk er blitt benyttet for de fleste konstruksjoner som benytter adenovirus som

vektor.

Medikamentene passer like bra for å drepe en celle eller celler både in vitro og in vivo. Når cellene som skal drepes er lokalisert inne i et dyr, f.eks. lunge, bryst eller tykktarm-kreftceller eller andre celler som har en p53-mutasjon, vil både p53-proteinet eller genet bli tilført til dyret i en farmakologisk akseptabel form. Begrepet "farmakologisk akseptabel form", som benyttes her, henviser både til formen av enhver sammensetning som kan tilføres et dyr, og også formen av hvormed man kontakter et dyr med betråling, d.v.s. måten hvormed et område av dyrets kropp blir bestrålt. Dette kan bestå av y- hestråling, røntgenstråler, UV-stråling, mikrobølger, elektroniske utstrålinger og lignende. Bruk av DNA-ødeleggende bestråling og bølger er velkjent for fagfolk på området strålingsterapi.

Medikamentene kan anvendes for å behandle kreft som rent generelt omfatter å tilføre til et dyr eller til en pasient med kreft terapeutisk effektivt p53-protein eller gen. Dette kan oppnås ved bruk av et rekombinant virus, spesielt et adenovirus, som har en vektor som har evne til å uttrykke p53 i svulstcellene. Blandingen som leverer p53-genet vil vanligvis bli tilført dyret, ofte i nær kontakt med svulsten, i form av en farmasøytisk akseptabel blanding. Direkte injeksjon inn i lesjonene av en terapeutisk effektiv mengde av et p53-gen, slik som finnes innen et rekombinant virus, inn i en svulst er én fore-trukket metode. Imidlertid kan også andre parenterale tilførsels-ruter, f.eks. intravenøs, perkutant, endoskopisk eller subkutan injeksjon vurderes.

Under behandling av kreft kan man i tillegg til p53-proteinet eller genet også tilføre tumor-cellene et DNA-ødeleggende middel. Dette kan oppnås ved bestråling av det begrensede svulstområde med DNA-ødeleggende bestråling slik som røntgenstråler, UV-stråler, y-stråler eller til og med mikrobølger. Som alternativ kan svulstcellene få kontakt med det DNA-ødeleggende middel ved at det til dyret tilføres en terapeutisk effektiv mengde av en farmasøytisk blanding som omfatter et DNA-ødeleggende middel, f.eks. adriamycin, 5-fluoruracil, etoposid, camptothecin, actino-mycin-D eller mitomycin C.

Den overraskende suksess funnet i den foreliggende oppfinnelse kan bekreftes ved hjelp av funnet at bruk av Ad5CMV-p53-virus i kombinasjon med cisplatin ga gode resultater i studier hvor man brukte en nakenmus-modell. Bruk av det kombinerte virus-DNA ødeleggelses-terapisystemet hemmet tumor-dannelsen av H358-celler signifikant, og dette er en celletype som normalt produserer en betydelig tumormengde. Tumorgenisiteten hos lungekreftcellene ble hemmet gjennom behandling med Ad5CMV-p53, men ikke av kontrollvirus som uttrykte luciferase. Dette indikerer at p53-proteinet i kombinasjon med et DNA-ødeleggende middel har høy terapeutisk effektivitet.

En rekke metoder for å overføre kjemoterapeutiske formuleringer, inklusive DNA-ekspresjonskonstruksjoner, inn i eukaryote celler er kjent for fagmannen på området. I lys av denne opp-lysning vil en øvet fagmann kunne levere både DNA-ødeleggende midler og p53-proteiner eller gener til celler på mange ulike men effektive måter.

For levering av DNA in vivo, ser oppfinnerne for seg bruk av ethvert overføringssystem for gener, slik som virus- og liposom-mediert transfeksjon. Som benyttet her, er uttrykket "transfeksjon", brukt for å beskrive den målrettede levering av DNA til eukaryote celler under bruk av overføringssystemer såsom adenovirus, AAV, retrovirus eller plasmid og gen-overføringsmetoder. Spesifisiteten hos viral genoverføring kan velges slik at man preferensielt sender genet til en spesiell målcelle, f.eks. ved å bruke virus som har evne til å infisere spesielle celletyper. Ulike virus-vert-typer vil naturligvis diktere hvilket virus som skal velges for genoverføring, like mye som det sannsynlige svulsthemmer-gen som skal bli uttrykt for å drepe en spesiell malign celletype.

Det blir også antatt at man kan overføre det DNA-ødeleggende kjemoterapeutiske middel via en rekke metoder, f.eks. ved å benytte parenterale leveringsmetoder som f.eks. intravenøs eller subkutan injeksjon og lignende. Slike metoder er velkjente for fagfolk som er øvet i medikamenttilførsel, og blir beskrevet i mer detalj her i seksjonene som omhandler farmasøytiske preparater og behandling.

For å tilføre gener in vitro, kan en rekke metoder brukes, f.eks. kalsiumfosfat- eller dekstransulfat-mediert transfeksjon, elektroporering, glassprosjektil-målretting og lignende. Disse metoder er kjent for fagfolk på området, med de eksakte sammensetninger og utførelse klarlagt i lys av denne oppfinnelse.

Andre utførelser vedrører blandinger, inklusive farmasøytiske formuleringer, som omfatter et p53-protein eller gen i kombinasjon med et DNA-ødeleggende middel, f.eks. cisplatin. I slike blandinger kan p53-genet være i form av et DNA-segment, en rekombinant vektor eller rekombinant virus som har evnen å uttrykke et p53-protein i en dyrecelle. Disse sammensetninger, deri inkludert dem som inneholder et rekombinant virus-gen-overf©ringssystem slik som en adenoviruspartikkel, kan bli formulert til in vivo administrering ved å bli dispersert i en farmakologisk akseptabel løsning eller buffer. Foretrukne farmakologisk akseptable løsninger inkluderer nøytrale saltvannsløsninger bufret med fosfat, laktat, Tris og lignende.

Ved bruk av virusoverføringssystemer vil man selvfølgelig ønske å rense virionet tilstrekkelig til at man har det stort sett fritt for uønskede kontaminanter slik som defekte interfererende viruspartikler, eller endotoksiner og andre pyrogener, slik at det ikke vil føre til noen uønskede reaksjoner i cellen, dyret eller individet som mottar vektorkonstruksjonen. En foretrukket metode for å rense vektoren benytter tetthetsgradienter, slik som cesium-kloridgradient-sentrifugering.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som interfererer med DNA-replikasjon, mitose eller kromosomal segregasjon og som er valgt fra adriamycin, etoposid, verapamil og po dophy11o toxin.

Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som ødelegger syntesen og påliteligheten til nukleinsyreforløpere og/eller som er en nukleinsyreforløper.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 5, hvor kreftcellen var behandlet med 5-fluoruracil, stråling, bølger og et DNA-interkalerende middel.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 1, hvor en rekombinant vektor uttrykker villtype p53-kodende sekvens, er et nakent DNA-plasmid, et plasmid inne i et liposom, en retroviral vektor, en AAV-vektor; eller en rekombinant adenoviral vektor.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 12, hvor en rekombinant adenoviral vektor omfatter villtype p53-kodende sekvens posisjonert under kontroll av cytomegalovirus iE-promoter, en cytomegalovirus IE-promoter og et SV40-tidlig polyadenyleringssignal.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 12, hvor i det minste ett gen vesentlig for adenovirus replikasjon er deletert fra nevnte rekombinante adenovirusvektor og villtype p53-kodende sekvens introduseres på dens plass.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse ifølge krav 15, hvor EIA- og EIB-områder av adenovirus er deletert og villtype p53-kodende sekvens introduseres på deres plass.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 1, hvor medikamentet er formulert i en farmasøytisk akseptabel formulering.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 17, hvor medikamentet er formulert for intratumoral injeksjon.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle er en human celle eller en malign celle. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte celle er en lungekreftcelle eller en brystkreftcelle.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle har en mutasjon i p53-genet, hvor nevnte celle er lokalisert i et dyr og nevnte villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens administreres til dyret i en farmasøytisk akseptabel form og hvor cellen tidligere var behandlet med i det minste to kurer av et DNA-ødeleggende middel.

Kort beskrivelse av tegningene

De følgende tegninger danner en del av den herværende spesifikasjon og er inkludert for videre å vise spesielle aspekter av den foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen kan bli bedre forstått ved henvisning til én eller flere av disse tegninger sammen med den detaljerte beskrivelse av spesifikke utførelser som presenteres her.

Fig. 1. Skjema for dannelse av rekombinant p53 adenovirus. p53-ekspresjonskassetten ble satt inn mellom Xbal og Clal-setene på pXCJL.l. p53-ekspresjonsvektoren (pEC53) og det rekombinante plasmid pJMl7 ble kotransfektert inn i 293-celler. De transfekterte celler ble vedlikeholdt i medium til begynnelsen av den cytopatiske effekt kunne observeres. Identifikasjon av nydannet p53 rekombinant adenovirus (Ad5CMV-p53) ved hjelp av PCR (polymerasekjedereaksjon)-analyse av DNA, med bruk av DNA-templater preparert fra CPE-supernatanter behandlet med proteinase K og fenolekstråksjon.

Fig. 2A. Kart anvendt for strukturell analyse av Ad5CMV-p53 DNA. Et kart av Ad5CMV-p53 genomisk DNA, med plassering-ene av p53-ekspresjonskassetten, PCR-primerne, og restriksjonssetene. Genomstørrelsen er ca. 35,4 kb, oppdelt i 100 kartenheter (1 kart-enhet, m.u. = 0,35 kb). p53-ekspresjonskassetten erstattet El-regionen (1,3-9,2 m.u.) av Ad5-genomet. Primer 1 er lokalisert i det første intron nedstrøms for den humane CMV hoved-IE genpromoter. Primer 2 er lokalisert i SV40 tidlig polyadenylerings-signalet. Begge disse primere, som er plassert 15-20 bp vekk fra p53 cDNA i begge ender, definerer et 1,40 kb PCR-produkt. Primerne 3 og 4 er lokalisert i henholdsvis 11 m.u. og 13,4 m.u. fra Ad5-genomet resp., som definerer et 0,86 kb virusgenom-spesifikt PCR-produkt . Fig. 2B. Agarosegelanalyse av PCR-produkter. To par primere som definerer 1,4-kb (p53) og 0,86-kb (Ad5) DNA-fragmenter ble anvendt i hver reaksjon. DNA-templater anvendt i hver reaksjon var pEC53-plasmid (spor 1), Ad5/RSV/Gl2 DNA (spor 2), intet DNA (spor 3), og Ad5CMV-p53 DNA (spor 4). Sporet merket (M) representerer molekylstørrelsesmarkører. Fig. 2C. Restriksjonskartlegging av Ad5CMV-p53 DNA. CsCl-gradient-rensede Ad5CMV-p53 DNA-prøver ble spaltet med henholdsvis intet enzym (U), HindiII (H), BamHI (B), EcoRI (E), og Clal (C), og analysert på 1% agarosegel. Sporene merket (M) er molekyl-størrelsesmarkører . Fig. 3A, 3B, 3C og 3D. Observasjon av cytopatiske effekter på 293 fremkalt av rekombinant adenovirus. Fig. 3A, 3B, 3C og 3D er en serie fase-kontrastbilder (x400) av 293-celler. Fig. 3A, 3B, 3C og 3D er fire paneler av en enkel sidefigur. Fig. 2A, før transfeksjon; fig. 3B, negativ kontroll på dag 12 etter transf eks jon ,-fig. 3C, start av CPE på dag 12 etter transfeksjon; Fig. 3D, ferdig utvikling av CPE på dag 14 etter transfeksjon. Fig. 4A, 4b, 4C og 4D. Immunhistologisk analyse av celler infisert med rekombinant adenovirus. Fig. 4A, 4B, 4C og 4D er en serie av immunhistologiske bilder av H358-celler. Fig. 4A, 4B, 4C og 4D er fire paneler av en enkel sidefigur. Infeksiøsitet av Ad5CMV-p53 i H358-celler. H358-celler ble infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 ved 50 PFU/celle i 24 timer. Medium alene ble anvendt som kontroll, narreinfeksjon. De infiserte celler ble analysert ved immunfarving. Fig. 4A er en kontrollinfeksjon testet med anti-p53-antistoff. Fig. 4B er celler infisert med Ad5/RSV/GL2-kontroll, og testet med anti-p53 antistoff. Fig. 4C er Ad5CMV-p53-infiserte celler, testet med et ikke-beslektet antistoff (MOPC-21). Fig. 4D er celler infisert med Ad5CMV-p53, testet med anti-p53 antistoff. Det anvendte anti-p53 antistoff var Pab 1801, og avidin/biotin-metoden ble benyttet for farvefremkalling. Fig. 5A. En SDS-PAGE (natriumlaurylsulfat/polyakrylamid-gel-elektrofores) farvet med Coomassie-blått som sammenligner relative nivåer av ekspresjon av eksogent p53 i H358-celler. H358-celleprøver som ble infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 ved 30 PFU/celle ble fremstilt 24 og 72 timer etter infeksjon. Coomassie-blått farving av en SDS-PAGE-analyse viser relative mengder av påsatte proteinprøver. Sporene 1 og 4 inneholder prøvene av de Ad5/RSV/GL2-infiserte celler. Sporene 2 og 3 inneholder prøvene av cellene infisert med to individuelle stammer av Ad5CMV-p53, 24 timer etter infeksjon. Sporene 5 og 6 er Ad5CMV-p53-infiserte celleprøver oppsamlet 72 timer etter infeksjon. Spor 7 er narre-infisert H358-prøve, 72 timer etter infeksjon. Spor M er prefarvede molekylvektmarkører i kDa (GIBCO-BRL). Fig. 5B. Western blot-analyse av proteiner separert på gel identisk med SDS-PAGE vist i fig. 5A. De relative nivåer av p53-ekspresjon ble analysert ved Western blotting, under anvendelse av anti-p53 antistoff. Primære antistoffer som ble anvendt var monoklonale antistoffer rettet mot p53-protein (PAb 1801, Oncogene Science Inc.) og (3-aktin (Amersham Inc.). HRP-konjugerte sekundære antistoff og ECL-utvikler var fra Amersham Inc. Virus-infiserte

H358-celler analysert ved Western blotting. Western blot i fig. 5B har et tilsvarende oppsett og rekkefølge av spor som dem i fig. 5A.

Fig. 6. Tidsavhengighet for p53-ekspresjon, bestemt ved Western blotting. Flere plater med H358-celler ble infisert med Ad5CMV-p53 ved 10 PFU/celle. Cellelysater ble fremstilt ved de angitte tidspunkter etter infeksjon. Western blotting ble analysert med anti-p53 og anti-aktin antistoffer samtidig. Sporene betegnet "C" representerer negative kontroller. Histogrammet representerer de relative mengder av p53 som bestemt ved densitometri. Fig. 7A. Vekstkurve for virus-infiserte humane 1unge-kreftceller i cellelinjene H358. Cellene ble inokulert ved 10te celler pr. plate (60 mm) og 6 plater pr. cellelinje. Etter 24 timer ble cellene infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 ved 10 m.o.i. (Infeksjonsmultiplisitet, d.v.s. PFU/celle). Etter infeksjon ble cellene tellet daglig i 6 dager. Vekstkurvene representerer data oppnådd fra 4 separate studier. Fig. 7B. Vekstkurve av virus-infiserte humane lungekreftceller fra cellelinjen H322. Cellene ble inokulert med 10 celler pr. plate (60 mm) og 6 plater pr. cellelinje. Etter 24 timer ble cellene infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 ved 10 m.o.i.

(Infeksjonsmultiplisitet, d.v.s. PFU/celle). Etter infeksjon ble cellene tellet daglig i 6 dager. Vekstkurvene representerer data fra 4 separate studier.

Fig. 7C. Vekstkurve fra virus-infiserte humane lungekreftceller fra cellelinje H460. Celler ble inokulert ved 10 5 celler pr. skål (60 mm) og 6 skåler pr. cellelinje. Etter 24 timer ble cellene infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 ved 10 m.o.i.

(Infeksjonsmultiplisitet, d.v.s. PFU/celle). Etter infeksjon ble cellene tellet daglig i 6 dager. Vekstkurvene representerer data oppnådd fra 4 separate studier. Fig. 8. Oversiktskart over tester for Ad5CMV-p53 i ortotopisk lungekreftmodell. Doser og behandlingstidspunkt brukt på nakne mus som var inokulert med H226Br-celler og virus er sammen-fattet på kartet. Fig. 9A, 9B, 9C og 9D. Eksempler på dissekert lunge- og mediastinum fra behandlede og kontrollmus. Fig. 9A, 9B, 9C og 9D

er fire paneler av en enkel figur. Musene ble avlivet ved slutten av 6-ukers postbehandlingsperioden. Lunge- og mediastinum-vev ble dissekert for å evaluere dannelse av svulster. Fig. 9A er en prøve av mediastinumblokken fra en normal naken mus; Fig. 9B er mediastinumblokken fra kontroll (PBS)-behandlede mus; Fig. 9C er media-stinumblokkprøve fra mus behandlet med Ad5CMV-p53; Fig. 9D er

mediastinumblokkprøve fra mus behandlet med Ad5//RSV/GL2. Piler indikerer tumor-massene. Fig. 10A. Veksthastigheter av foreldregenerasjon H358-celler, Ad-Luc-infiserte og Ad-p53-infiserte H358-celler under vedvarende behandling med CDDP. H358-celler (1,5 x IO<5> celler/brønn) ble sådd ut i duplikat på en 24 brønns plate. Etter 24 timer ble 100 ul av medium, Ad-Lue virusstamme (10 PFU/ml) eller Ad-p53 virusstamme (10 o PFU/ml) tilsatt. Etter en ytterligere 24 timers inkubering ble mediet som inneholdt virus byttet ut med ferskt medium som inneholdt 10 ug/ml CDDP. Fig. 10B. Effekt av 24 timers behandling med CDDP på veksthastigheten hos foreldregenerasjon, Ad-Luc-infisert og Ad-p53-infiserte H358-celler. Celler ble usatt for CDDD+ (fig. 10A) kontinuerlig eller (fig. 10B) i 24 timer, etterfulgt av behandling i medium uten medikament. Celler som overlevde som fastsittende monolag ble estimert med hensyn til levedyktighet i en 5 dagers periode ved å måle opptak av trypan blått. Gjennomsnitt +/standardfeil er vist. Celleantall på dag 5 i Ad-p53:CDDP-gruppen skiller seg signifikant fra alle andre grupper både for A og B (p<0,05 ved Studenfs t-test) . Fig. 10C. Levedyktighet av Ad-p53-infiserte H358-celler som funksjon av ulike konsentrasjoner av CDDP. Etter en 24 timers eksponering til Ad-Luc eller Ad-p53-virus ble celler behandlet med 0, 10 eller 100 ug/ml CDDP i 24 timer, og deretter analysert med henblikk på levedyktighet. Fig. 11A. Nukleosomal DNA-fragmentering i Ad-p53-infiserte H358-celler eksponert til CDDP. Celler ble infisert og behandlet med CDDP i 24 timer, som beskrevet i Fig. 10. Fig. 11B, 11C, 11D, 11E, 11F og fig. 11G. H358-celler som ble dyrket på objektglass, infisert med Ad-p53 i 24 timer, behandlet med CDDP i ytterligere 24 timer og deretter fiksert for in situ merking av DNA-fragmentering. Bilder vist er foreldregenerasjon H358-celler (B) uten eller (C) med CDDP; Ad-Luc-infiserte celler (D) uten eller (E) med CDDP; og Ad-p53-infiserte celler (F) uten eller (G) med CDDP. Pilhodet viser et eksempel på mørkt farvet

kjernefragmenter. Størrelsesmarkør = 100 ym.

Fig. 12A. Effekt av kombinasjonen av Ad-p53-infeksjon med CDDP-behandling på H358 svulstklumper. Multicellulære svulstklumper med H358-celler ble preparert som tidligere beskrevet (Takahashi et al., (1989)). På dag 0 ble klumper med diameter på 150 til 200 pm plassert i agar-dekket plate med 24 brønner og behandlet med Ad-p53 eller Ad-Lue i 24 timer. På dag 1, ble medium med 10 ug/ml CDDP tilsatt etter at man fjernet det virusholdige medium. På dag 2, etter en 24 timers inkubering, ble det tilsatte medium byttet med 1 ml ferskt medikament-fritt medium. De lodd-rette diametere ble målt med et invertert mikroskop. Den relative endring i volum ble kalkulert ifølge formelen a 2 x b / a^ 2 x b^,

hvor a og b er de minste og største diameterne av kulen, resp., og a-, og b^ er diameterne på dag 1. Bare det relative volum av AD-p53/CDDP-kulene er signifikant mindre (p<0,05 ved Studenfs t-test) enn kontrollgruppen (Ctl).

Fig. 12B, 12C, 12D og 12E. In situ dUTP-merking med TdT for å oppdage apoptose. H358-klumper ble fiksert på dag 3 og farvet som beskrevet i materialer og metoder i eks. 7. (B) kontroll, ubehandlet celleklump, (C) celleklump behandlet med CDDP, (D) Ad-p53-infisert celleklump og (E) Ad-p53-infisert celleklump behandlet med CDDP. Størrelsesmarkør = 100 um. Fig. 13A. Induksjon av apoptose fremkalt av CDDP etter in vivo infeksjon med Ad-p53, målt som svulstvolum-endringer. H358-celler (5 x IO<6>) i 0,1 ml Hank's balanserte saltløsning ble injisert subkutant i høyre flanke i BALB/c hunn nu/nu mus. 30 dager senere ble 200 ul medium alene, eller medium inneholdende Ad-Luc (IO<8>PFU/ml) eller Ad-p53 (IO<8>PFU/ml) injisert inn i svulster med en diameter på 5-6 mm. Injeksjon i tumor (100 ul) og injeksjon nær tumor på to steder lokalisert overfor hverandre (50 ul hver) ble utført. CDDP (3 mg/kg) eller kontroll fysiologisk saltvann ble gitt intraperitonealt. Svulstene ble målt i to vertikalt plasserte diametere uten kunnskap om behandlingsgrupper, og et svulstvolum ble kalkulert ved å anta en kuleform med gjennomsnitt svulstdiameter kalkulert som kvadratrot av produktet av kryss-snitt-diameterne. Fem mus ble brukt for hver behandlingsgruppe, og gjennomsnitt +/- standardfeil vises. Data ble analysert med Studenfs t-test. Pilen viser behandlingsdag.

To uavhengige bestemmelser vises, p < 0,05 fra dag 5 i test 1;

p < 0,05 fra dag 7 i test 2. (B-E)

Fig. 13B, 13C, 13D og 13E. Histologisk analyse med TdT-mediert biotin-dUTP-merkingteknikken. Svulster ble høstet 5 dager etter påbegynnelse av behandling og umiddelbart innleiret i 0. C. T. forbindelse. Frysesnitt ble skåret i en kryostat med 5 um tykkelse. Snittene ble behandlet med 1 ug/ml proteinase K og farvet som beskrevet i figurtekst i fig. 12. Det vises H358-svulster behandlet med (B) CDDP alene, (C) Ad-p53 alene, eller (D, E) Ad-p53 i kombinasjon med CDDP. Størrelsemarkører er 0,5 mm. All forsøksdyr-behandling var i overensstemmelse med komiteen for UT M.D. Anderson Institutional Animal Care and Use.

DETALJERT BESKRIVELSE AV DE FORETRUKNE UTFØRELSER

A. Molekylære hendelBer i utvikling av lungekreft

Forskningsstudier utført av de herværende oppfinnere har identifisert kritiske molekylære hendelser som fører til utvikling og progresjon av kreft. Dette tillot oppfinnerne å utvikle nye metoder for å gjenopprette visse normale proteinfunksjoner slik at den ondartede fenotype kan bli undertrykket in vivo.

De vanligste lungekrefthistologier (80%) blir gruppert under beskrivelsen ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) og inkluderer platecelle, adenokarsinom og stor-celle udifferensiert. Mange av de nåværende data omhandlende molekylærbiologien i lungekreft kommer fra analyse av de mer uvanlige små-celle lungekreft-typer (SCLC). SCLC kan bli adskilt fra NSCLC ved hjelp av de neuro-endokrine egenskaper hos cellene, SCLC er meget responsivt overfor kjemoterapi, men gir raskt tilbakefall etter behandling. NSCLC kan også tjene som modell for andre karsinogen-induserte epitel kreftformer. Tilnærmingsmetoder og obervasjoner som er utviklet i denne studie kan appliseres til andre typer av epiteliale kreftformer .

En stor mengde kunnskap er nå akkumulert som viser at den ondartede transformasjonsprosess er mediert av et genetisk system.

De viktigste lesjoner som finnes i kreftceller forekommer i dominante onkogener og i svulst-hemmende gener. Dominante onkogener har endringer i en genklasse som kalles proto-onkogener, disse deltar i kritiske normale cellefunksjoner, som inkluderer signaloverføring og transkripsjon. Primære modifikasjoner i de dominante onkogener som gir evnen til å transformere inkluderer punktmutasjoner, translokasjoner, rearrangeringer og amplifika-sjoner. Svulsthemmer-gener synes å behøve homozygot funksjonstap, fremkalt av mutasjon, delesjon eller en blanding av disse for at transformasjon kan forekomme. Noen svulsthemmende gener synes å spille en rolle i regulering av proliferasjon ved å regulere transkripsjon. Modifikasjon av ekspresjon av dominante og svulsthemmende onkogener vil sannsynligvis influere på visse cellekarakteristika som medvirker til den ondartede fenotype.

Til tross for økende kunnskap om mekanismer som er involvert i onkogen-mediert transformasjon, har det vært ubetydelige fremskritt i å utvikle terapeutiske strategier som spesifikt går på onkogener og deres produkter. I begynnelsen var forskning på dette område fokusert på de dominante onkogener, siden disse var de første som ble karakterisert. DNA-mediert genoverføringsstudier viste at normale celler mottok ondartet malign fenotype etter overføring av DNA fra ondartede humane svulster.

B. p53 og p53 mutasjoner i kreft

p53 er for øyeblikket kjent som et svulst-hemmende gen (Montenarh, 1992) . Høye nivåer er blitt funnet i mange celler som har vært transformert av kjemisk karsinogenese, ultrafiolett stråling og mange virustyper, inkluderende SV40. p53-genet er et hyppig mål for mutasjonsinaktivering i en lang rekke humane svulster, og er allerede dokumentert å være det hyppigste muterte gen i vanlige humane kreftformer (Mercer, 1992). Det er mutert i mer enn 50% av human NSCLC (Hollstein et al., 1991) og i et bredt spekter av andre svulster.

p53-genet koder for et 375-aminosyre-fosfoprotein som kan danne komplekser med vertsproteiner slik som stort-T-antigen og ElB. Proteinet finnes i normale vev og celler, men i konsentrasjoner som er meget små sammenlignet med transformerte celler eller svulstvev. Interessant nok synes vill-type p53 å være viktig i å regulere cellevekst og celledeling. Overekspresjon av vill-type p53 er blitt vist i noen tilfeller å være antiproliferativ i humane

svulstcellelinjer. p53 kan således virke som en negativ regulator i cellevekst (Weinberg, 1991) og kan direkte undertrykke ukontrol-lert cellevekst eller indirekte aktivere gener som undertrykker denne vekst. Fravær eller inaktivering av vill-type p53 kan således stimulere transformasjon. Imidlertid indikerer noen studier at tilstedeværelse av mutant p53 kan være nødvendig for fullstendig å uttrykke transformerende potensiale av dette gen.

Selv om vill-type p53 må aksepteres som en sentralt viktig vekstregulator i mange celletyper synes dets genetiske og biokjemiske egenskaper også å ha en rolle. Mis-sens-mutasjoner er vanlige i p53-genet og er essensielle for å uttrykke transforma-sjonsevnen til onkogenet. En enkel genetisk endring fremmet av punktmutasjoner kan fremkalle karsinogent p53. I kontrast med andre onkogener er imidlertid punktmutasjoner i p53 vist å forekomme i minst 3 0 ulike kodoner, noe som ofte skaper dominante alleler som produserer endringer i celle-fenotype uten å reduseres til homozygositet. I tillegg synes mange av disse dominant negative alleler å bli tolerert i organismen og introdusert inn i germinalcellelinjen. Ulike mutante alleler synes å strekke seg fra minimalt dysfunksjonen til sterkt penetrerende, dominant negative alleler (Weinberg, 1991) .

Casey og kolleger har rapportert at transfeksjon med DNA som koder for vill-type p53 inn i to humane brystkreft-cellelinjer gjenoppretter veksthemmingskontroll i disse celler (Casey et al., 1991). En lignende virkning er også blitt vist med transfeksjon av vill-type, men ikke mutant p53 inn i humane lungekreft-cellelinjer (Takahasi et al., 1992). p53 synes å dominere over det mutante gen, og vil selektere mot proliferasjon når det blir transfektert inn i celler med det mutante gen. Vanlig normal ekspresjon av det transfekterte p53-gen affiserer ikke vekst hos celler med endogent p53. Således kan slike konstruksjoner bli tatt opp av normale celler uten bivirkninger.

Det er således mulig at behandling av p53-assosierte krefttyper med vill-type p53 kan redusere antallet ondartede celler. Imidlertid er studier lik dem som er sitert ovenfor langt vekk fra å oppnå et slikt mål, ikke minst siden DNA-transfeksjon ikke kan benyttes for å introdusere DNA inn i kreftceller inne i en pasientkropp.

C. Genbehandlingsteknikk

En rekke eksperimentelle tilnærminger til genterapi er blitt foreslått pr. idag, men hver av disse lider av spesielle problemer (Mulligan, 1993). Som beskrevet ovenfor finnes grunnleggende transfeksjonsmetoder hvor DNA som inneholder det interessante gen blir introdusert inn i celler ved ikke-biologiske metoder, f.eks. ved å permeabilisere cellemembranen fysisk eller kjemisk. Denne . metode er naturligvis begrenset til celler som i en kort periode kan fjernes fra kroppen og kan tåle de celletoksiske effekter av behandling, d.v.s. lymfocytter. Liposomer eller proteinkonjugater dannet med visse lipider og amfofile peptider kan brukes for transfeksjon, men gen-integrasjonseffektiviteten er fremdeles meget lav, i størrelsesorden én integrasjon pr. 1.000 til 100.000 celler, og ekspresjon av det overførte gen blir ofte begrenset til dager i prolifererende celler eller uker i ikke-prolifererende celler. DNA-transfeksjon er derfor tydeligvis ikke en passende metode for kreftbehandling.

En annen metode utnytter den naturlige evne som virus har til å komme inn i celler medbringende deres eget genetiske materiale. Retrovirus har vist løfter som genoverføringsvektorer, basert på deres evne til å integrere deres gener inn i vertens genom, deres evne i å overføre en stor mengde av fremmed genetisk materiale, evne til å infisere et bredt spekter av arter og celletyper og evne til å bli pakket i spesielle cellelinjer. Imidlertid hindrer tre hovedproblemer at retrovirusvektorer kan praktisk benyttes. For det første avhenger retrovirus infeksiøsitet av at det er virus-reseptorer til stede på måloverflaten. For det andre integrerer retrovirus kun effektivt inn i celler som undergår replikasjon. Til slutt er retrovirus vanskelig å konsentrere og rense.

D. Adenovirus-konstruksjoner til bruk i genterapi

Humane adenovirus er dobbelt-kjedet DNA tumorvirus med genomstørrelse på ca. 3 6 kb (Tooza, 1981) . Adenovirus er blitt grundig studert og karakterisert som et modellsystem for eukaryot genekspresjon, noe som glør dem til et attraktivt system for å utvikle adenovirus som et genoverføringssystem. Denne virusgruppe er lett å få til å vokse og manipulere, og det kan brukes mange vertstyper både in vitro og in vivo. I infiserte celler som går i oppløsning kan adenovirus stoppe vertens proteinsyntese, dirigere cellulært maskineri til å syntetisere store mengder virusproteiner og derved produsere store mengder virus.

El-regionen av genomet inkluderer EIA og ElB som koder for proteiner som er ansvarlige for transkripsjonsregulering av virusgenomet, i tillegg til et par cellulære gener. E2-ekspresjon, som inkluderer E2A og E2B, tillater syntese av virus replikasjons-funksjoner, f.eks. ved et DNA-bindende protein, DNA polymerase, og et terminalt protein som forbereder replikasjon. E3-genprodukter hindrer celleoppløsning fremkalt av cytotoksiske T-celler og tumor-nekrosefaktor, og synes å være viktig for propagering av virus. Funksjoner knyttet til E4-proteinene inkluderer DNA-replikasjon, ekspresjon av sene gener, og avslutning av vertscellefunksjoner. De sene genprodukter inkluderer flesteparten av virion capsid-proteinene, og disse uttrykkes kun etter at mesteparten av prosessering av et enkelt primært transkript fra den viktigste sene promoter har foregått. Den viktige sene promoter (MLP) viser høy effektivitet i den sene fase av infeksjonen (Stratford-Perricaudet og Perricaudet, 1991a).

Siden bare en liten del av virusgenomet synes å være nødvendig in cis (Tooza,1981), tilbyr adenovirus-avledede vektorer en utmerket mulighet for å substituere store DNA-fragmenter når de benyttes i forbindelse med cellelinjer slik som 293-celler. Ad5-transformerte humane embryonale nyre-cellelinjer (Graham et al., 1977) er blitt utviklet for å frembringe de essensielle virusproteiner in trans. Oppfinnerne resonnerte således at adenovirus og deres karakteristika var gode kandidater for bruk i å treffe kreftceller in vivo (Grunhaus & Horwitz, 1992) .

Spesielle fordeler ved bruk av et adenovirussystem for å levere fremmede proteiner til en celle inkluderer (i) evne til å bytte ut relativt store stykker av virus DNA med fremmed DNA,

(ii) strukturell stabilitet av de rekombinante adenovirus,

(iii) trygghet ved å tilføre adenovirus til mennesker, og

(iv) fravær av enhver kjent forbindelse mellom adenovirusinfeksjon og kreft eller ondartet sykdom, (v) evnen til å få høye titere med rekombinant virus, og (vi) den høye infeksiøsitet hos

adenovirus.

Ytterligere fordeler med adenovirusvektorer i forhold til retrovirus inkluderer det høyere nivå av genekspresjon. I tillegg er adenovirusreplikasjon uavhengig av vertens genreplikasjon, i motsetning til retrovirussekvenser. Siden adenovirus-transformerende gener i El-regionen enkelt kan bli fjernet og fremdeles gi effektive ekspresjonsvektorer mener man at onkogen risiko fra adenovirusvektorer er minimal (Grunhaus & Horwitz, 1992) .

Rent generelt er adenovirus genoverføringssystemer basert på rekombinante, endrede adenovirus som er gjort replikasjons-inkompetente ved at deler av genomet er fjernet, slik som El, men at virus fremdeles beholder sin evne til infeksjon. Relativt store fremmede proteiner kan bli uttrykt når ytterligere delesjoner blir gjort i adenovirusgenomet. F.eks. har adenovirus hvor deler av både El- og E3-regionene er blitt fjernet, fremdeles evnen til å bære opp til 10 kb av fremmed DNA og de kan dyrkes til høye titere i 293-celler (Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991a). Overraskende vedvarende ekspresjon av transgener etter adenovirusinfeksjon er også blitt rapportert.

Adenovirus-mediert genoverføring har nylig blitt studert som en metode for å mediere genoverføring inn i eukaryote celler og inn i hele dyr. F.eks. ble det funnet under behandling av mus med den sjeldne recessive genetiske sykdom

ornithine transcarbamylase (OTC)-mangel at adenoviruskonstruksjoner kunne benyttes for å innføre det normale OTC-enzymet. Uheldigvis ble ekspresjon av normale nivåer av OTC kun oppnådd i 4 av 17 tilfeller (Stratford-Perricaudet et al., 1991b). Derfor var defekten bare delvis korrigert hos de fleste mus, og førte ikke til fysiologisk eller fenotypisk endring. Disse typer av resultater gir derfor lite håp for bruk av adenovirusvektorer i kreftbehandling.

Forsøk på å bruke adenovirus for å overføre genet for cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (CFTR) inn i lunge-epitelet hos "cotton rats" har også vært delvis vellykkede, selv om det ikke har vært mulig å estimere den biologiske aktivitet av det overførte gen i epitelet hos disse dyr (Rosenfeld et al., 1992). Disse studier viste igjen genoverføring og ekspresjon av CFTR-proteinet i lunge/luftvei-celler, men viste ingen fysiologisk effekt. I 1991-artikkelen Science, viste Rosenfeld et al., lungeekspresjon av al-antitrypsin-protein, men viste igjen ingen fysiologisk effekt. Forfatterne estimerte faktisk at nivået av ekspresjon som de observerte bare var ca. 2% av nivået som var nødvendig for å beskytte lungevevet hos mennesker, d.v.s. langt under det som er nødvendig for en fysiologisk effekt.

Genet som koder for humant al-antitrypsin er blitt introdusert inn i lever hos normale rotter ved en intraportal injeksjon, der det ble uttrykt og resulterte i sekresjon av det introduserte humane protein inn i blodplasma hos disse rotter (Jaffe et al., 1992) . Imidlertid og skuffende nok var nivåene som ble oppnådd ikke høye nok til å være av terapeutisk verdi.

Disse typer av resultater viser ikke at adenovirus har evne til å dirigere ekspresjon av tilstrekkelig protein i rekombinante celler slik at man kan oppnå en fysiologisk relevant effekt, og de antyder derfor ikke at adenvirussysternet er brukbart til bruk i forbindelse med kreftbehandling. Videre, før den foreliggende oppfinnelse, ble det trodd at p53 ikke kunne bli inkorporert inn i en opplagrende celle, slik som disse benyttet for å lave adenovirus, siden dette ville være toksisk. Siden ElB-genet hos adenovirus binder til p53 mente man at dette var en videre begrunnelse for at adenovirus og p53-teknologi ikke kunne bli kombinert.

E. p53-adenoviruskonBtruksjoner og svulsthemming

Kreft-genterapi med en ny og mer effektiv svulsthemmende vektor. Dette rekombinante virus benytter fordelene ved adenovirusvektorer, slik som høy titer, bred mål-spesifisitet, effektiv transduksjon og manglende integrasjon i målceller. En replikasjon-defektiv, hjelper-uavhengig type adenovirus blir produsert, denne utvikler vill-type p53 (Ad5CMV-p53) under kontroll av den humane cytomegaloviruspromoter.

Kontrollfunksjoner på ekspresjonsvektorer blir ofte fremskaffet fra virus når ekspresjon ønskes i pattedyrceller. F.eks. er vanlig brukte typer av promotere fra polyoma, adenovirus 2 og simian virus 40 (SV40). De tidlige og sene promotere i SV40-virus er spesielt brukbare siden begge lett kan skaffes fra virus som et fragment som også inneholder SV40 virus replikasjonsbegynnelse. Mindre eller større SV40-fragmenter kan også brukes dersom den ca. 250 bp sekvens er inkludert som strekker seg fra Hindlll-setet mot Bgll-setet som er lokalisert i replikasjonsbegynnelsen hos virus. Videre er det også mulig og ofte ønskelig å benytte promotere eller kontrollsekvenser som vanligvis er tilknyttet den inkluderte gensekvens, dersom slike kontrollsekvenser er kompatible med vertscelle-systernene.

En replikasjonsbegynnelse kan fremskaffes ved å konstruere vektoren slik at den inkluderer en ytre begynnelse, som kan komme fra SV40 eller andre viruskilder (f.eks. polyoma, adeno, VSV, BPV), eller den kan komme fra vertscellens egen kromosom-replikasjons-mekanisme. Dersom vektoren er integrert i vertscellens kromosom er det siste ofte tilstrekkelig.

Oppbygging og videreføring av det foretrukne p53 adenovirus er diagrammatisk fremstilt i fig. 1. I forbindelse med dette har en forbedret protokoll blitt utviklet for å videreføre og identifisere rekombinant adenovirus (diskutert nedenfor). Etter identifikasjon ble p53 rekombinant adenovirus strukturelt identifisert ved PCR-analyse, som vist i fig. 2. Etter isolering og bekreftelse av strukturen ble p53 adeno-viruset benyttet til å infisere den humane lungekreft-cellelinjen H358, som har en homozygot delesjon av p53-genet. Western blot analyse viste at det eksogene p53-protein ble produsert i store mengder (fig. 4 og 5), med en topp 3 dager etter infeksjon (fig. 6).

Det ble også vist i H322, en p53 punktmutasjons-cellelinje at det mutante p53 ble nedregulert ved ekspresjon av det eksogene p53.

Som en eksperimentell kontroll ble et virion (Ad5/RSV/GL2) som hadde en strukturell likhet til Ad5CMV/p53 benyttet. Dette virion inneholdt et luciferase CDNA som ble drevet av Rous sarcomvirus LTR promoter i ekspresjonskassetten til virionet. Hverken p53-ekspresjon eller noen endring i aktin ekspresjon ble funnet i celler som var infisert av virionet Ad5/RSV/GL2. Vekst av H358-celler som var infisert med Ad5CMV-p53 var betydelig hemmet, i motsetning til vekst av ikke-infiserte celler eller celler infisert med kontroll-virionet (fig. 7A). Vekst av H322-celler var også betydelig hemmet av p53-virionet (fig. 7B), mens vekst av human lungekreft H460-celler som inneholdt vill-type p53 var mindre affisert (fig. 7C).

Ad5CMV-p53 medierte en sterk hemmende virkning på vekst av lungekreftceller in vitro. Vekshemming var ikke så tydelig når cellene ble infisert med Ad5CMV-p53 ved MOI lavere enn 1 PFU/celle, mens det ved MOI høyere enn 100 PFU/celle, kunne observeres cytotoksisitet også med kontrollvirus Ad5/RSV/Gl2. I våre analyser var den optimale dose for veksthastighets-studier 10-50 PFU/celle.

Innen dette doseområde var inhibering av cellevekst forårsaket av det uttrykte p53-protein.

Forsøk med nakne mus viste at tumorgenisitet hos de Ad5CMV-p53-behandlede H358-celler var sterkt hemmet. I en muse-modell av ortotopisk human lungekreft ble de tumorigene H22 6Br-celler med en punktmutasjon i p53 inokulert i luftrøret 3 dager før virusbehandling. Tilførsel i luftrøret av Ad5CMV-p53 forhindret svulstdannelse i dette modellsystem, noe som antyder at det modifiserte adenovirus er en effektiv vektor for å mediere overføring og ekspresjon av svulsthemmende gener i humane kreftceller, og at Ad5CMV-p53-viruset kan bli videre utviklet til et terapeutisk middel som kan brukes i kreft-genterapi.

Ad5CMV-p53 medierte et høyt ekspresjonsnivå av p53-genet i humane lungekreftceller, som demonstrert ved Western blot analyse.

Eksogent p53-protein var til stede i omtrent 14 ganger høyere konsentrasjon enn det endogene vill-type p53 i H460-celler, og omtrent to til fire ganger høyere enn den interne kontroll (3-aktin i H3 58-celler. Det høye ekspresjonsnivå kan tilskrives (1) meget effektiv genoverføring, (2) sterk CMV promoter som driver p53 CDNA, og (3) adenovirus El- forsterker som forsterker p53 CDNA-transkripsjonen. Varigheten av p53-ekspresjon etter infeksjon strakte seg over mer enn 15 dager i H358-celler. Det var imidlertid en rask nedgang i ekspresjon 5 dager etter infeksjon. PCR-analyse av DNA-prøvene fra de infiserte H358-celler viste en nedgang i virus ved DNA-nivå sammen med det senkede protein-nivå, noe som indikerer tap av virus DNA under den kontinuerlige vekst av kreftceller in vitro.

Nedgang i p53-ekspresjon kan også ha vært resultat av cellulær svekkelse av CMV-promoteren som kontrollerer p53-ekspresjon, siden vertscelle-mediert CMV-promoter stopp-fenomenet er blitt rapportert tidligere (Dai et al., 1992). Adenovirusvektorer er ikke-integrerende genoverføringsvektorer, og avhengigheten av gen-ekspresjon avhenger derfor av en rekke faktorer, som inkluderer vertscellene, genene som er overført, og den relevante promoter. Crystal og medarbeidere viste et lavt ekspresjonsnivå av cystisk fibrose transmembran-konduktans-regulatorgenenet i "cotton rat" epitelceller som kunne observeres 6 uker etter infeksjon (Rosenfeld et al., 1992). Perricaudet<1>s laboratorium viste minimal ekspresjon av minidystrofin-genet i mdx musemuskel som varte i mer enn 3 måneder etter infeksjon. Kortvarig høyt ekspresjonsnivå av vill-type p53-proteinet som er funnet i det herværende arbeid kan ha en positiv effekt i å redusere mulige bivirkninger på normale celler etter in vivo behandling med Ad5CMV-p53.

Studiene som rapporteres her indikerer at p53 rekombinant adenovirus har egenskaper som svulsthemmer, som synes å virke ved å gjenopprette p53-proteinfunksjonen i svulstceller. Disse resultater gir støtte til bruk av Ad5CMV-p53-virionet som et terapeutisk middel for kreftbehandling.

F. DNA-ødeleggende midler

En rekke DNA-ødeleggende midler kan benyttes, slik som midler som direkte kryssbinder DNA, midler som plasseres inne i DNA-molekylet og midler som fører til kromosom- og mitose-abnormaliteter ved å applisere nukleinsyresyntese.

Midler som direkte kryssbinder nukleinsyrer, spesifikt DNA, antas og vises her å føre til DNA-skade, noe som fører til en synergistisk antineoplastisk kombinasjon. Midler som cisplatin og andre DNA-alkylerende midler kan benyttes. Cisplatin har i utstrakt grad blitt benyttet for å behandle kreft, med effektive doser benyttet i kliniske applikasjoner på 20 mg/m tilført i 5 dager hver 3. uke, over totalt tre behandlingskurer. Cisplatin blir ikke absorbert ved pr. oral tilførsel og må derfor bli tilført via injeksjon, enten intravenøst, subkutant, direkte i svulst eller intraperitonealt.

Midler som skader DNA inkluderer også forbindelser som interfererer med DNA-replikasjon, mitose og segregering av kromosomene. Eksempler på disse forbindelser inkluderer adriamycin, også kjent som doxorubicin, etoposid, verapamil, podophyllotoxin og lignende. Med utstrakt bruk innen klinisk behandling av neoplasmer, blir disse forbindelser tilført gjennom intravenøs injeksjon av hele dosen, med doser som strekker seg fra 25-75 mg/m og med 21 dagers intervaller hva angår adriamycm, til 35-50 mg/m 2hva angår etoposid intravenøst eller dobbel intravenøs dose gitt oralt.

Midler som avbryter syntese og forlikelighet hos nuklein-syrenes forløpere, og subenheter, fører også til skade på DNA. En rekke nukleinsyreforløpere er blitt utviklet som dette. Spesielt effektive er midler som har blitt gjenstand for utstrakt testing og er lett tilgjengelige. Spesielt midler slik som 5-fluoruracil (5-FU) blir fortrinnsvis benyttet av neoplastisk vev, noe som gjør dette middel spesielt fordelaktig for målrettet tilførsel til neoplastiske celler. Selv om det er relativt giftig, kan 5-FU benyttes i en stor gruppe bærere, inkluderende lokal applikasjon, men intravenøs tilførsel med doser fra 3 til 15 mg/kg/dag er vanlig å bruke.

Andre faktorer som fremkaller DNA-skade og som er blitt benyttet i utstrakt grad inkluderer det som er generelt kjent som y-stråler, røntgenstråler og/eller dirigert tilførsel av radioisotoper til svulstceller. Andre former av faktorer som skader DNA blir også vurdert, f.eks. mikrobølger og ultrafiolett bestråling. Det er mest trolig at alle disse faktorer fremkaller mange typer skade på DNA-forløpere, replikasjon og reparasjon av DNA, og sammensetning og vedlikehold av kromosomer. Doseområder av røntgenstråler varierer fra daglige doser på 50 til 2 00 røntgen i lengre perioder (3 til 4 uker), til enkeltdoser på 2.000 til 6.000 røntgen. Dosering av radioisotoper varierer meget og er avhengig av isotopens levetid samt styrke og type bestråling og opptak av de neoplastiske celler.

En person som er øvet i faget henvises til "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. utg., kapittel 33, spesielt sidene 624-652. En del variasjon i dose vil om nødvendig opptre, avhengig av tilstanden hos det behandlede individ. Personen som er ansvarlig for tilførsel vil i alle tilfeller bestemme den korrekte dose for individet. I tilfellet tilførsel til mennesker må preparatene i tillegg møte standarder for sterilitet, pyrogenisitet, generell sikkerhet og renhet, som krevet av FDA Office of Biologics standards.

6. p53 og cisplatin-behandling

I et forsøk på å bestemme effektivitet av en kombinasjon av genutbyttingsterapi og kjemoterapi i human kreft undersøkte oppfinnerne om sekvensiell tilførsel av Ad-p53 og CDDP kunne indusere apoptose in vivo. Etter 3 dager med direkte injeksjon i svulsten av Ad-p53 eller intraperitoneal tilførsel av CDDP, viste H358-svulster som var implantert subkutant i nu/nu mus en moderat hemming av vekst. Dersom imidlertid Ad-p53 og CDDP ble tilført samtidig gikk svulstene delvis tilbake og svulststørrelsen forble statistisk signifikant mindre enn den som ble sett i noen andre behandlingsgrupper. Den veksthemmende effekt var enda mer utpreget etter to behandlingssykluser (fig. 13A). Histologisk undersøkelse viste en massiv destruksjon av svulstceller i området der Ad-p53 var injisert i mus som var behandlet med CDDP. In situ farving viste mange apoptotiske celler rundt cellefrie områder (fig. 13B-E). I motsetning til dette viste svulster som var behandlet med CDDP alene eller Ad-p53 hverken manglende celleinnhold eller apoptotiske områder.

En strategi for human genterapi kombinert med konvensjonell kjemoterapi der et DNA-kryssbindende middel benyttes er beskrevet.

Svulstcellemotstand mot kjemo-terapeutiske medikamenter representerer et stort problem i klinisk onkologi. NSCLC utgjør minst 80% av lungekreft-tilfeller, pasienter med NSCLC er imidlertid vanligvis ikke responsive overfor kjemoterapi (Doyle, 1993) . Ett mål for kreftforskning idag er å finne måter som forbedrer effektiviteten av genutbyttingsterapi i kreft ved å studere interaksjoner mellom genproduktet og kjemo-terapeutiske medikamenter. Herpes simplex-thymidin-kinase (HS-tK)-genet tilført hjerne- svulster ved hjelp av et retrovirus-vektorsystem induserte med hell følsomhet overfor det antivirale middel ganciclovir (Culver et al., 1992). Genproduktet fra HS-tK-genet er et eksogent virus-enzym, mens vill-type p53-proteinet uttrykkes i normale vev, noe som antyder at modulering av kjemoresistans ved å endre vill-type p53-ekspresjon kunne være en alternativ tilnærming som benytter en reaksjonsvei som medieres av et endogent genetisk program.

Et adenovirussystem har potensielle fordeler for å levere gener in vivo, som effektiv produksjon av høy titervirus, høy infeksjonseffektivitet og evne til å infisere mange typer celler. Stabilitet og varighet av den introduserte genekspresjon er imidlertid fremdeles kontroversiell. Hva angår kjemo-genterapi kan ekspresjonsnivå og den høye infeksiøsitet være mer betydningsfull enn varigheten av ekspresjonen, siden medikamenter kan drepe infiserte celler innen noen få dager. Økning i p53-nivå i celler som er følsomme overfor kjemoterapeutiske medikamenter kan forekomme innen 6 timer etter DNA-ødeleggende stimuli (Fritsche et al., 1993, Zhan et al., 1993), selv om øket p53 DNA-bindende aktivitet kan reverseres innen et tidsrom på 4 timer dersom stimulus blir fjernet (Tishler at al., 1993). I den herværende modell blir ekspresjon av vill-type p53-genet drevet uavhengig av cytomegalovirus -promoteren som finnes i en Ad-p53-vektor. Derfor kan et høyt nivå av p53-ekspresjon vedlikeholdes selv etter avslutning av medikamentbehandling. Ekspresjon av vill-type p53-protein mediert av Ad-p53 når maksimum på dag 3 etter infeksjon (14 ganger høyere enn endogen vill-type) og synker til et lavt nivå på dag 9 (Zhang et al., 1993). Dette antyder at et kortvarig høyt nivå av vill-type p53-ekspresjon er tilstrekkelig for å påbegynne det cytotoksiske program i kreftcellen.

H. Pasienter og behandlingsprotokoller

Oppfinnerne foreslår at region-begrenset levering av adenovirus-p53 genkonstruksjoner til lungekreftceller i pasienter med p53-relatert kreft slik som inoperable obstruerende endo-bronkiale krefttyper, vil være en meget effektiv metode for å levere et terapeutisk effektivt gen for å motvirke den kliniske sykdom. Levering av p53-genet skal forekomme i kombinasjon med midler eller faktorer som fører til DNA-skade. Denne kombinerte tilnærming er en signifikant forbedring på nåværende kreft-behandlinger, f.eks. tap av følsomhet overfor cispaltin alene som avhenger av forsøk på å drepe eller fjerne den siste kreftcelle ved å indusere DNA-ødeleggelse. Siden svulstceller kan være i dvale, noe som er et velkjent fenomen, kan effektiv avgivning av kreftceller synes usannsynlig.

Det forutsees at opptaket av adenoviruskonstruktene inn i NSCLC-celler vil senke proliferasjonshastigheten hos disse celler, imidlertid viser de her presenterte eksempler at den kombinerte bruk av et DNA-ødeleggende middel eller faktor sammen med p53-adnoviruset fører til en betydelig nedgang i cellevekst og svulst-størrelse som ikke finnes med de enkelte faktorer når disse brukes alene. Sammensetningene og metodene som oppgis her antyder klart at man kan forvente en økning i den tidsperiode hvor den affiserte lunge ville forbli ekspandert, motvirke fornyet vekst av svulst og fornyet deling av svulstceller, og føre til forlengelse av pasientens overlevelse.

Pasienter med fornyet vekst av inoperabel endobronkial svulst som delvis eller komplett gjenlukker luftveien og som ikke kan motta ekstern strålingsbehandling vil bli vurdert for denne kombinerte protokoll. Nåværende behandlinger for denne tilstand tilbyr kun korttids symptomlindring. De fleste pasienter har tilbakefall til tross for ytre stålebehandling. Det kan være mulig å innføre et "brachytherapi"-kateter og tilføre ytterligere stålingsbehandling, samt intravenøs tilførsel av DNA-ødeleggende midler. Pasienter som mottar nåværende behandlinger har en median overlevelse på 6 måneder. Pasienter som ikke kan motta brachytherapy ville også være kandidater for å motta genterapi. Svulsten kan fjernes fra luftveiene ved hjelp av laser eller en biopsitang. Dette kan bli gjort samtidig med injeksjon av adenoviruskonstruktene, noe som senker volumet som må bli injisert.

Tilførsel av viruskonstruktene ville ikke være til hinder for at pasienten kunne motta andre symptom-lindrende behandlinger dersom svulsten progredierer.

I. Andre genoverføringsteknikker

Vellykket genterapi krever vanligvis integrering av et gen som har evne til å korrigere den genetiske svikt inn i verts-genomet, der genet ville eksistere sammen med og replikere sammen med vertens DNA og føre til genekspresjon på et nivå som kompenserer for det sviktende gen. Ideelt burde sykdommen bli kurert etter én eller kun få behandlinger med ingen alvorlige bivirkninger. Pr. idag har en rekke tilnærminger til genbehandling blitt foreslått, som kan benyttes her.

En første tilnærming er å transfektere DNA som inneholder det relevante gen inn i celler, f.eks. ved å permeabilisere cellemembranen enten kjemisk eller fysisk. Denne tilnærming er generelt begrenset til celler som kan fjernes fra kroppen for en kort periode og kan tåle cytotoksisiteten i behandlingen (d.v.s. lymfocytter). Liposomer eller proteinkonjugater som er dannet med visse lipider og amfofile peptider kan benyttes til in vivo transfeksjon (Stewart et al., 1992; Torchilin et al., 1992; Zhu et al., 1993), men nåværende effektivitet av gen-integrasjon er meget lav. Det estimeres at det relevante gen integrerer inn i genomet hos ikke mer enn én celle av 1.000 til 100.000 celler. I fravær av integrasjon begrenses ekspresjon av det transfekterte gen til noen dager hos prolifererende celler eller noen uker hos ikke-prolifererende celler, forårsaket av degradering av det ikke-integrerte DNA.

En annen tilnærming benytter seg av den naturlige evne som virus har til å trenge inn i celler medbringende deres eget genetiske materiale. Retrovirus har potensiale som vektorer for å levere gener som er forårsaket av deres evne til å integrere deres gener inn i vertens genom, deres evne til å overføre en stor mengde av fremmed genetisk materiale, og infisere et bredt spektrum av art- og celletyper og evne til å bli pakket i spesielle cellelinjer (Miller 1992).

En tredje metode bruker andre virus, slik som adenovirus, herpes simplex virus (HSV), cytomegalovirus (CMV) og adeno-assosiert virus (AAV), som endres for å kunne tjene som vektorer for genoverføring. Selv om noen virus som kan akseptere fremmed genetisk materiale er begrenset i antall nukleotider som de kan tilpasse seg og i celletypen som de kan infisere har det blitt vist at disse virus effektivt kan fremkalle gen-ekspresjon. Imidlertid integrerer ikke adenovirus deres genetiske materiale inn i verts-genomet og de krever derfor ikke replikasjon av vertscelle for å fremkalle genekspresjon, noe som gjør dem godt tilpasset til en rask, effektiv heterolog genekspresjon.

Eksempel 1

Konstruksjon av p53-ekspresjonsvektor

Dette eksempel beskriver konstruksjon av en p53-ekspresjons-vektor. Denne vektor blir konstruert som beskrevet, og benyttes til å bytte ut El-regionen (1,3-9,2 m.u.), i adenovirus type Ad5-genom og benyttet til å konstruere adenovirus-virionet beskrevet i eks. 2.

p53-ekspresjonskassetten vist i fig. 1, som inneholder humant cytomegalovirus (CMV)-promoteren (Boshart et al., 1985), p53 cDNA, og SV40 tidlig polyadenyleringssignal, ble plassert inn mellom Xbal og Clal-setene og pXCJLl (fremskaffet av Dr. Frank L. Graham, McMaster University, Kanada).

Genomstørrelsen er omtrent 35,4 kb, som er delt i 100 kartenheter (1 m.u. = 0,35 kb). p53-ekspresjonskassetten overtok El-området (1,3-9,2 m.u.) i Ad5-genomet.

Primer 1 har sekvensen 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEKV ID

nr. 1) og er plassert i det første intron nedstrøms fra det humane CMV hoved IE-genpromoter (Boshart et al., 1985). Primer 2 har sekvensen 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEKV ID nr. 2) og er plassert i SV40 tidlig polyadenyleringssignal. Begge disse primere, 15-20 bp vekk fra p53 cDNA-innskuddet i begge ender definerer et- 1,40 kb PCR-produkt. Primer 3 har sekvensen 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3'

(SEKV ID nr. 4) og primer 4 har sekvensen 5'CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3'

(SEKV ID nr. 4) og er lokalisert ved 11 m.u. og 13,4 m.u. i Ad5-genomet, resp., noe som definerer et 0,86 kb virus-genom spesifikt PCR-produkt.

Eksempel 2

Dannelse og propagering av rekombinant p53 adenovirus

Dette eksempel beskriver en metode som passer for å danne hjelper-uavhengig rekombinant adenovirus som uttrykker p53. Den molekylære strategi benyttet for å produsere rekombinant adenovirus baseres på den faktum at den begrensende pakke-evne til adenovirus medfører at pJMl7 ikke kan danne virus selv. Derfor fører homolog rekombinering mellom p53-ekspresjonsvektorplasmidet og pJMl7 innen en transfektert celle til et levedyktig virus som kan pakkes bare i celler som uttrykker de nødvendige adenovirusproteiner.

Metoden i dette eksempel benytter 293-celler som vertsceller for å videreføre virus som inneholder substitusjoner bestående av heterologe DNA-ekspresjonskassetter i El- eller E3-regionene. Denne prosess krever kotransfeksjon av DNA inn i 293-celler. Transfeksjonen bestemmer i hovedsak effektiviteten av virus-videreføringen. Metoden benyttet for DNA-transfeksjon inn i 293-celler før denne oppfinnelse var vanligvis kalsiumfosfat/DNA-kopresipitering (Graham og van der Eb, 1973). Denne metode sammen med plakk-analyse er imidlertid relativt vanskelig og gir i typiske tilfeller viruspropagasjon av lav effektivitet. Som illustrert i dette eksempel ble transfeksjon og etterfølgende identifikasjon av infiserte celler tydelig forbedret ved å bruke liposom-mediert transfeksjon når transfekterte celler ble identifisert ved cytopatisk effekt (CPE).

293-cellelinjen ble vedlikeholdt i Dulbecco's modifiserte minimale essensielle medium, forsterket med 10% varme-inaktivert hesteserum. p53-ekspresjonsvektoren og plasmidet pJMl7 (McGrory et al., 1988) benyttet til homolog rekombinasjon ble kotransfektert inn i 293-celler ved hjelp av DOTAP-mediert transfeksjon ifølge produsentens protokoll (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992) . Dette er skjematisk vist i fig. 1.

293-cellene (passasje nr. 35, 60% konfluens) ble inokulert

24 timer før transfeksjonen i enten 60 mm skåler eller 24-brønners plater. Cellene i hver brønn ble transfektert med: 30 ul DOTAP, 2 ug av p53-ekspresjonsvektor og 3 ug plasmid pJM17. Etter transfeksjon ble cellene foret med det minimale essensielle medium hver 2. eller 3. dag inntil CPE begynte.

Eksempel 3

Bekreftelse av identitet av rekombinant adenovirus

Dette eksempel illustrerer et nytt polymerase kjedereaksjon (PCR)-analysesystem for å bekrefte identiteten av rekombinante virioner som følger kotransfeksjon av de passende cellelinjer. Prøver av cellekultursupernatanter (50 til 37 0 ul) ble samlet fra prøveplatene, behandlet med proteinase K (50 ug/ml med 0,5% SDS og 20 mM EDTA) i 1 time ved 56°C, deretter ekstrahert med fenol/ kloroform, og nukleinsyrene ble utfelt med etanol. DNA-bunnfallene ble resuspendert i 20 pl destillert vann og brukt som templat for forsterkning ved PCR. De relative plasseringer av PCR-primerne og deres sekvenser er vist i fig. 1, og er SEKV ID nr. 1, 2, 3 og 4, resp. De cDNA insert-spesifikke primere definerer et 1,4 kb PCR-produkt, og de virusgenom-spesifikke primere definerer et 0,86 kb PCR-produkt. PCR-reaksjonene ble utført i et 50 ul volum som inneholdt 4 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1% triton X-100, 200 uM hver av dNTP, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), 2 uM av hver primer, og 1,0 enhet av Taq-polymerase (Promega). Reaksjonene foregikk ved 94°C i 1/2 min., 56°C i 1/2 min., og 72°C i 1 min. i 30 sykluser.

For å forenkle identifikasjonsprosedyren av de første propagerte rekombinante virus, ble et direkte PCR-analysesystem på DNA-prøver fra cellekultursupernatanter utviklet. Prøver (50 eller 370 yl) fra cellemediet-supernatanten med CPE ble behandlet med proteinase K og fenol/kloroform-ekstraksjon. Etter etanolutfelling ble DNA-prøvene analysert med PCR som benyttet to par med primere for å forsterke de insert-spesifikke og virusgenom-spesifikke sekvenser. PCR-primermålene og deres sekvenser vises i fig. 1. Primere 1, 2, 3 og 4 representeres av SEKV ID nr. 1, 2, 3 og 4, resp.

Som et resultat ble et 1,4 kb cDNA innsatt stykke og et 0,86 kb virusgenom-fragment forsterket fra ekspresjonsvektoren (positiv kontroll) og fra DNA-prøvene fra den positive cellekultur (fig. 2B, resp. spor 1 og 4). Bare 0,86 kb fragmentet ble forsterket fra DNA-prøven fra Ad5/RSV/GL2-virus (negativ kontroll, spor 2). Ingen forsterkede bånd kom fra PCR-reaksjonene som brukte den ubehandlede positive cellekultur-mediumsupernatant (spor 3).

Disse resultater indikerte at adenovirus frisatt inn i cellekulturmedium kan oppdages med PCR, når man benytter så lite som 50 yl av cellekulturmedium-supernatant for å lave DNA-templater. Disse resultater vil tillate utvikling av en kvantitativ metode som tillater å bruke denne teknikk for å bestemme adenovirus titere, som tradisjonelt har blitt gjort med plakk-analyser.

Vi11-type-sekvensen av p53 cDNA i Ad5CMV-p53-virus ble bekreftet ved hjelp av dideoksy DNA-sekvensering av virus DNA renset på CsCl-gradient. Kontrollvirus Ad5/RSV/GL2, produsert på lignende måte, som har en struktur lignende den til Ad5CMV-p53 med unntak av en Rous sarcom viruspromoter og luciferase cDNA benyttet i ekspresjonskassetten. Det rekombinante adenovirus som bærer et E. coli (J-galaktosidasegen (LacZ) , Ad5CMV-LacZ, har også en struktur lignende den til Ad5CMV-p53, og kan skaffes som opplyst i Zhang et al., og fra Dr. Frank L. Graham (se Graham et al., 1991).

Virus-stamme, titer og infeksjon. Individuelle kloner av Ad5CMV-p53, Ad5/RSV/GL2, og Ad5CMV-LacZ-virus ble fremskaffet ved plakk-rensing ifølge metoden til Graham og Prevec (1991). Individuelle viruskloner ble propagert i 293-celler. Kulturmedium fra 293-cellene som viste den fullførte cytopatiske effekt ble samlet og sentrifugert ved 1000 x g i 10 min. De sammenslåtte supernatanter ble fordelt og lagret ved -20°C som virusstammer. Virustiter ble bestemt med plakk-analyse (Graham og Prevec, 1991) .

Infeksjon av cellelinjene ble utført ved tilsetning av virus-løsningene (0,5 ml pr. 60 mm skål) til enkelt-cellelag og inkubering ved romtemperatur i 30 min. med kortvarig agitering hvert 5. min. Dette ble fulgt med tilsetning av kulturmedium og tilbakeplassering av de infiserte celler i en inkubator ved 37°C.

Effektivitet av genoverføring fra de rekombinante adenovirus ble også evaluert ved å bruke Ad5CMV-LacZ i en rekke cellelinjer slik som H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 og Vero. Ved hjelp av X-gal-farving ble 97-100% av alle cellelinjer farvet blå etter infeksjon med Ad5CMV-LacZ ved en MOI av 3 0 PFU/celle.

Eksempel 4

Ad5CMV-p53-dirigert p53-genekspresjon i

humane lungekreftceller

Dette eksempel beskriver bruk av rekombinant p53-adenovirus for å infisere humane lungekreftceller med en homozygot p53-gendelesjon. Resultatene viser at vekst av disse celler og ekspresjon av mutant p53 var hemmet, noe som indikerer potensiale hos Ad5CMV-p53-virionet som et nyttig middel for å kontrollere metastatiske celler.

Immunhistokjemi ble utført på infiserte celle-enkeltlag som var fiksert i 3,8% formalin og behandlet med 3% hydrogenperoksyd i metanol i 5 min. Immunhistokjemisk analyse ble utført med Vectastain Elite kit (Vector, Burlingame, CA). Det primære antistoff som ble brukt var anti-p53-antistoff PAb 1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY), mens MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) ble brukt som en negativ kontroll. Det sekundære antistoff var et avidin-merket anti-mus IgG (Vector). Biotinylert pepperrotperoksydase ABC-kompleks reagens ble bruk for å påvise antigen/antistoff-komplekset. Cellene ble til slutt motfarvet med Harris hematoxylin (Sigma) og montert med Cytoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

Immunhistokjemisk analyse av de infiserte cellelinjer ble utført for å studere in situ-ekspresjonen av p53-ekspresjon som var drevet av CMV-promoteren fra Ad5CMV-p53-viruset. I H358-cellelinjen, som har en homozygot delesjon av p53, var p53-genet overført med 97-100% effektivitet, som funnet ved histokjemisk analyse når cellene var infisert med Ad5CMV-p53 i en serie infeksjoner av 30-50 plakk-dannende enheter (PFU)/celle (fig. 4).

Den høye overføringseffektivitet av rekombinant adenovirus ble bekreftet med Ad5CMV-LacZ, et virus som bærer LacZ-genet transkribert av den humane CMV IE-promoteren. Ved en MOI på 30-50 PFU/celle, var alle cellene som ble studert, inkluderende HeLa, Hep G2, LM2 og den humane NSCLC kreftcellelinje 97-100% positive for p-galaktosidaseaktivitet, vist ved X-gal farving. Disse resultater indikerer at adenovirusvektorer representerer en effektiv bærer for genoverføring inn i humane kreftceller.

Western blot-analyse ble utført på totale cellelysater som ble preparert ved å oppløse enkeltcellelag i skåler med SDS-PAGE prøve-buffer (0,5 ml pr. 60 mm skål) etter at cellene var renset med fosfatbufret saltvann (PBS). SDS-PAGE-analyse ble utført ved at sporene ble fylt opp av cellelysater tilsvarende 5x10^ celler (10-15 ml). Proteinene i gelen ble overført til Hybond TM-ECL membran (Amersham, Arlington Heights, IL). Membranene ble blokkert med 0,5% tørrmelt i PBS, og testet med de primære antistoff: mus anti-humant p53 monoklonalt antistoff PAb 1801 og mus anti-humant |3-actin monoklonalt antistoff (Amersham) , vasket og testet med det sekundære antistoff: pepperrotperoksydase-konjugert kanin anti-mus IgG (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Membranene ble utviklet ifølge Amersham's forsterkede kjemiluminescens-protokoll. Relative mengder av det eksogene p53 som var uttrykt ble bestemt ved hjelp av densitometri (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA).

Western blot analyse viste at det eksogene p53-protein var uttrykt til et høyt nivå (fig. 5A, spor 2, 3 og 5, 6). Proteinet viste en topp på dag 3 etter infeksjon (fig. 6, insert, 0,5 til 3 dager). Som kontroll ble et virion med en struktur lignende den til det rekombinante Ad5CMV-p53 fra eks. 1 konstruert. Dette virion inneholder en luciferase CDNA som blir drevet av Rous sarkom-virus LTR promoter i ekspresjonskassetten til virionet. Hverken p53-ekspresjon eller endring i aktin-ekspresjon ble observert i cellene som var infisert av virionet Ad5/RSV/GL2.

Det rekombinante p53-adenovirus ble brukt for å infisere tre humane lunge NSCLC-cellelinjer: cellelinje H358 som har en homozygot delesjon av p53-genet, cellelinje H322 som har en punktmutasjon av p53-genet ved kodon 248 (G til T), og cellelinje H460 som har et vill-type p53-gen. Veksthastigheten til de humane NSCLC-celler ble bestemt ved å følge inokulasjon av H322 og H460 (lxlO<5>) eller H358 (2xl0<5>) i 60 mm kulturskåler 24 timer før virusinfeksjon. Cellene ble infisert med virus ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 10 PFU/celle. Kulturmedium ble brukt for narreinfeksjonskontroll. Kulturer i triplikat fra hver cellelinje med ulike behandlinger ble tellet hver dag på dagene 1-6 etter infeksjon.

Vekst av H3 58-cellene infisert med Ad5CMV-p53 var sterkt hemmet, i motsetning til de ikke-infiserte celler eller cellene infisert med kontrollvirionet (fig. 7A). Vekst av H322-celler var også sterkt hemmet av p53-virionet (fig. 7B), mens veksten til humane lungekreft H460-celler som inneholdt vill-type p53 ble vesentlig mindre affisert (fig. 7C). Vekst av de Ad5CMV-p53 virus-infiserte H358-celler ble hemmet med 79%, mens veksten til ikke-infiserte celler eller celler infisert med kontrollvirus ikke ble hemmet. Vekst av cellelinje H322, som har en punktmutasjon i p53, ble hemmet med 72% av Ad5CMV-p53, mens veksten til cellelinje H460 som inneholder vill-type p53 var mindre affisert (28% hemming).

Resultatene indikerer at p53 rekombinant adenovirus har egenskaper som svulsthemmer, og at effekten foregår via restaurering av p53-proteinfunksjonen i svulstceller.

Eksempel 5

Ad5CMV-p53 i behandling av celler som mangler p53

Dette eksempel dreier seg om bruk av rekombinant p53 adenovirus for å gjenopprette veksthemming av svulstceller in vitro, og således behandling av ondartede eller metastatisk vekst av celler.

Eksemplet beskriver noen måter hvormed foreliggende oppfinnelse kan tenkes å bli benyttet i behandling av kreft via adenovirus-mediert genterapi.

H358-celler ble infisert med Ad5CMV-p53 og Ad5/RSV/GL2 ved en MOI på 10 PFU/celle. Den samme mengde celler ble behandlet med medium som en narreinfeksjon. 24 timer etter infeksjon ble de behandlede celler høstet og renset to ganger med PBS. I hver behandling ble 3 millioner (3xl0<6>) celler i et volum på 0,1 ml injisert subkutant i hver naken mus (Harlan Co., Houston, TX). Fem mus ble benyttet for hver behandling. Mus ble bestrålt (3 00 cGy, <6>(^Co) før injeksjon og studert hver uke etter injeksjon. Svulstdannelse ble evaluert ved slutten av en 6 ukers periode og svulstvolum ble kalkulert ved å anta en kuleform med den gjennomsnittlige svulstdiameter kalkulert som kvadratrot av produktet av kryss-snitt diametere.

For å bestemme den hemmende effekt på tumordannelse som var mediert av Ad5CMV-p53 ble nakne mus injisert subkutant med H3 58-celler (en human NSCLC type celle) for å indusere neoplastisk vekst. Hver mus mottok én injeksjon av celler som var blitt infisert med Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 i en mengde på 10 PFU/ celle i 24 timer. H358-celler behandlet med medium alene ble benyttet som narre-infiserte kontroller. Svulster som først var mulig å føle på dag 14 etter injeksjon ble kun indusert av de narre-infiserte eller kontroll virus-infiserte celler som vist i tabell I:

aDe behandlede H358-celler ble injisert s.c. i en mengde på 2

x IO<6> celler/mus. Svulststørrelse ble bestemt på slutten av en 6-ukers periode.

Som vist i tabell I utviklet mus som mottok Ad5CMV-p53-behandlede celler ikke svulster. Svulstene ved slutten av en 6 ukers periode var 4-10 mm i diameter. Denne studie ble påbegynt med fem mus pr. gruppe, én mus hver i Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2-gruppene fullførte ikke studiet. Disse forsøksdyrs tidlige død var trolig forårsaket av nosocomiale infeksjoner.

Eksempel 6

Ad5CMV-p53 i behandling av lungekreft

Dette eksempel dreier seg om bruk av rekombinant p53-adenovirus for å gjenopprette veksthemming av svulstceller in vivo og således å behandle kreft hos dyr. Eksemplet beskriver noen av de måter hvormed foreliggende oppfinnelse kan tenkes å bli brukt i behandling av kreft via adenovirus-mediert genterapi.

Den effektivitet som Ad5CMV-p53 viser i å hemme tumordannelse ble videre evaluert i musemodellen av ortotopisk human lungekreft.

Siden H358 og H322-celler ikke produserte svulster i denne modell ble cellelinjen H226Br benyttet. Denne cellelinje nedstammer fra plate-epitel lungekreft og sprer seg fra lunge til hjerne. H226Br har en punktmutasjon (ATC til GTC) ved ekson 7, kodon 254 i p53-genet og er tumordannende hos mus.

Prosedyren for å teste i musemodellen av ortotopiask human lungekreft er blitt beskrevet tidligere (Georges et al., 1993). I korthet ble nakne mus som var behandlet med bestråling (300 cGy, ^ ® Co) inokulert med H226Br-celler ved hjelp av instillasjon i luftrøret. Hver mus mottok 2 x IO<6> celler i et volum av 0,1 ml PBS. 3 dager etter inokulasjon ble 10 mus pr. gruppe behandlet med 0,1 ml av virus eller bærer (PBS) ved installasjon i luftrøret én gang daglig i 2 dager. Virusdosen som ble benyttet var 5 x 10<7 >Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 pr. mus. Musene ble avlivet på slutten av en 6 ukers periode. Svulstdannelse ble evaluert ved å dissekere lungen og mediastinumvev samt å måle svulststørrelsen. Svulstene ble bekreftet ved hjelp av histologisk analyse av snitt tatt fra svulstmassen.

De bestrålte nakne mus ble inokulert med 2 x IO<6> H226Br celler/mus ved instillasjon i luftrøret. 3 dager etter inokulasjon ble hver av musene (8-10 mus pr. gruppe) behandlet med 0,1 ml av enten Ad5CMV-p53 eller Ad5/RSV/GL2 eller bærer (PBS) ved installasjon i luftrøret én gang om dagen i 2 dager. Virusdosen som ble benyttet var 5 x 10 7 PFU/mus. Svulstdannelse ble evaluert på slutten av en 6 ukers periode ved å dissekere lungen og mediastinum og måling av svulststørrelse. Et kart av prosedyren blir vist i fig. 7, med representative prøver av disseksjon demonstrert i fig. 8. De observerte svulster ble bekreftet ved histologisk analyse. Resultatene av svulstmålingene er sammen-fattet i tabell II.

Bare 25% av mus behandlet med Ad5CMV-p53 dannet svulster, mens 70-80% av de behandlede mus i bærermediet eller Ad5/RSV/GL2 kontrollgruppene dannet svulster. Den gjennomsnittlige størrelse av svulster i Ad5CMV-p53-gruppen var signifikant mindre enn de i kontrollgruppene. Disse resultater indikerer at Ad5CMV-p53 kan hindre H22 6Br-cellene fra å danne svulster i musemodellen av ortotopisk human lungekreft.

Eksempel 7

Synergisme mellom p53 og DNA-øedeleggelse

De biokjemiske karakteristika av programmert celledød (apoptose) viser et karakteristisk mønster av DNA-fragmentering som er et resultat av oppklipping av kjerne-DNA. Nylige studier har vist at induksjon av apoptose fremkalt av kjemoterapeutiske medikamenter eller ioniserende betråling kan være relatert til p53-genets tilstand, og at DNA-ødeleggende stimuli kan øke intra-cellulært p53-protein-nivå i celler som er i apoptoseprosessen

(Lowe et al., 1993, Clarke et al., 1993, Fritsche et al., 1993, Harper et al., 1993, El-Deiry et al., 1993). Hemming av cellesyklus i G^-fasen fremkalt av økte nivåer av vill-type p53 (wt-p53)-protein tillater mere tid for reparasjon av DNA, dersom optimal reparasjon ikke er mulig kan p53 initiere programmert celledød. Således kan p53 bidra til å indusere apoptotisk svulstcelledød fremkalt av kjemoterapeutiske midler.

Inaktivering av p53-genet ved missens mutasjon eller delesjon er den vanligste genetiske endring i humane kreftformer (Levine et al., 1991, Hollstein et al., 1991). Tap av p53-funksjon er blitt rapportert å øke den cellulære motstand mot en rekke ulike kjemo-terapeutiske midler (Lowe et al., 1993). Oppfinnernes studier viste at human ikke-små-celle lungekreft (NSCLC) H358-celler, der begge p53-alleler er fjernet, var resistente mot kjemoterapeutiske medikamenter, mens cellelinjen WTH226b, som har endogen vill-type p53, raskt viste apoptotisk celledød 16 timer etter behandling med cisplatin (CDDP) og etoposid (VP-16) (T. Fujiwara, E. A. Grimm,

T. Mukhopadhyay, J.A. Roth, upubliserte resultater). Derfor prøvde oppfinnerne å bestemme om introduksjon av vill-type p53-genet inn i H358-celler ved hjelp av en adenovirusvektor kunne øke cellens følsomhet til CDDP, et DNA kryssbindende middel, in vitro og in vivo.

Materialer og metoder

H358-celler ble gitt av A. Gazdar og J. Minna (Takahashi et al., 1989).

Adenoviru svekt orer

Konstruksjon og identifikasjon av en rekombinant adenovirusvektor som inneholder cDNA som koder for human vill-type p53 (Ad-p53) eller luciferase (Ad-Lue) ble tidligere beskrevet (Zhang et al., 1993). I korthet ble p53-ekspresjonskassetten som inneholder human cytomegalovirus-promoter, vill-type p53 cDNA og SV40 tidlig polyadenyleringssignal innsatt mellom Xbal og Clal-setene på pXCJL.l. p53-pendlevektoren og det rekombinante plasmid pJM17 ble kotransfektert inn i 293-celler (Ad5-transformerte humane embryonale nyrecellelinjer) ved hjelp av en liposom-mediert teknikk. Kultur-supernatanten til 293-celler som viste den komplette cytopatiske effekt ble samlet og brukt for videre infeksjoner. Kontroll Ad-Luc-virus ble dannet på en tilsvarende måte. Ad-p53 og Ad-Luc-virus ble propagert i 293-celler. Tilstedeværelse av replikasjons-kompetent virus ble utelukket ved hjelp av HeLa-celletester. Virus-titere ble bestemt ved hjelp av plakk-analyse (Graham et al., 1991).

Deteksjon av nukleosomal DNA-fragmentering

DNA ble isolert fra foreldregenerasjon, Ad-Luc-infisert og Ad-p53-infiserte celler som var behandlet eller ikke med CDDP ved å inkubere cellene ved 55°C i 6 timer i oppløsningsbuffer (50 mM Tris-HC1, pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS og 50 ug/ml proteinase K). DNA ble ekstrahert to ganger med like volumer av fenol og én gang med kloroform-isoamyl-alkohol (24:1) og deretter felt ut i etanol. Prøvene ble analysert ved elektroforese på en 1,5% agarosegel, og DNA ble visualisert ved ethidiumbromid-farving.

TdT-mediert dUTP "nick"-endemerking ble utført ifølge prosedyren som tidligere er blitt beskrevet (Gavrieli et al., 1992). Enkeltlags-celler ble behandlet med 0,01% NP-40. Glassene ble dyppet i TdT-buffer (3 0 mM Tris-HCl, pH 7,2, 140 mM natrium-cacodylat, 1 mM koboltklorid) og inkubert med biotinylert dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) og TdT ved 37°C i 45 min. Glassene ble dekket med 2% bovint serumalbumin i 10 min. og inkubert med avidin/biotin-komplekset (Vectastain Elite Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 30 min. Kolorimetrisk deteksjon ble utført ved å bruke diamino-benzidin.

Resultater

H358-celler ble transdusert in vitro med humant vill-type p53 cDNA ved å eksponere cellene til Ad-p53. Western blot analyse viste et høyt nivå av vill-type p53-proteinekspresjon så tidlig som 24 timer etter infeksjon med Ad-p53, men vill-type p53 ble ikke funnet i foreldregenerasjon (ikke infiserte)-celler eller kontrollceller infisert med Ad-Luc (resultater ikke vist).

Samtidig immunhistokjemisk evaluering viste vill-type p53-protein i mer enn 80% av de infiserte celler, noe som antydet at overføring og ekspresjon av p53 forårsaket av Ad-p53 var meget effektivt (resultater ikke vist).

Kontinuerlig behandling av Ad5-p53-infiserte H358-celler med CDDP reduserte deres levedyktighet meget hurtig, mens tydelig celledød i foreldregenerasjonsceller og i Ad-Luc-infiserte celler kun forekom etter 72 timers behandling med CDDP (fig. 10A). Tap av levedyktighet var sterkt forøket i celler som var transdusert med Ad-p53. Videre kunne reduksjon i levedyktighet bli observert selv når cellene ble vedlikeholdt i medikament-fritt medium etter 24 timers behandling, noe som antydet at dødelig skade kunne bli indusert innen 24 timer (fig.IOB). Følsomheten hos vill-type p53-transduserte H358-celler overfor CDDP var dose-avhengig (fig. 10C).

En internukleosomal DNA-side, som indikerte at DNA var blitt fragmentert, var tidlig til stede i celler som uttrykte vill-type p53 etter 24 timers behandling med CDDP, i motsetning viste foreldregenerasjon og Ad-Luc-infiserte celler ingen DNA-fragmentering (fig. 11A). Terminal deoksynukleotidyl-transferase (TdT)-mediert 2'-deoksyuridin-5'-trifosfat (dUTP)-biotin nick endemerking, som viser DNA-fragmentering som er typisk for apoptose in situ, demonstrerte mange apoptotiske celler i Ad-p53-infiserte celler som var behandlet med CDDP i 24 timer som vist i fig. 11G, som viser mørkt farvede cellekjerner og cellekjernefragmenter som ikke er til stede i fig. 11B-F.

Introduksjon av vill-type p53 er kjent å kunne indusere apoptose i noen typer svulstcellelinjer med deletert eller mutert p53 (Yonish-Rouach et al., 1991, Shaw et al., 1992, Ramqvist et al., 1993). Imidlertid kunne overekspresjon av vill-type p53 alene ikke fremme DNA-fragmentering i p53-negative H358-cellelinjen (fig. 11), selv om deres vekst var hemmet av Ad-p53 (fig. 10). Dette er i overensstemmelse med de tidligere observasjoner gjort av oppfinnerne som viste at stabile H358-kloner kunne fremskaffes etter en retrovirus-mediert vill-type p53-overføring, og at klonene vokste mer langsomt enn for foreldregenerasjonscellene (Cai et al., 1993) .

Den potensielle terapeutiske effektivitet av kombinasjonen av Ad-p53 og CDDP ble evaluert som relativ endring i volumet av H358-celleklumper. Modellen som bruker den multicellulære svulstklump viser in vitro en histologisk struktur som er lik den man finner i primære svulster og mikrometastaser. Behandling med CDDP forårsaket en reduksjon av det relative volum i Ad-p53-infiserte H358-celleklumper, men hadde ingen tydelig effekt på foreldre-generasjons celler eller Ad-Luc-infiserte celleklumper (fig.l2A). In situ TdT-mediert dUTP-merking viste mange celler i apoptose-prosessen på overflaten av Ad-p53-infiserte celleklumper, mens ingen apoptotiske celler ble funnet på celleklumper som ikke var infisert med Ad-p53 (fig. 12B-E). Oppfinnerne har tidligere rapportert at retrovirus-mediert vill-type p53-ekspresjon hemmet vekst av H322a celleklumper som var indusert av transformerende vekstfaktor a (TGF-a) (Fujiwara et al., 1993). Den retrovirale vektor kunne ikke infisere H358-celleklumper siden cellene i disse celleklumper ikke prolifererte raskt som respons til eksogent tilsatt TGF-a. Observasjonen at behandling med CDDP reduserte størrelsen av H358-celleklumper infisert med Ad-p53 ved å indusere apoptose på overflaten antyder at Ad-p53 infiserer ikke-prolifererende celler og at CDDP initierer apoptose-prosessen i hvilende celler.

Eksempel 8

Bruk av p53 og DNA-ødeleggende midler i behandlings-

regimer

En dyremodell er blitt benyttet som del av de prekliniske utprøvninger, som beskrevet nedenfor og i eksemplene 5, 6 og 7. Pasienter hvor den medisinske indikasjon for adenovirus-mediert genoverføringsbehandling er blitt fastlagt, kan bli testet med hensyn på tilstedeværelse av antistoff rettet mot adenovirus. Dersom antistoff er til stede og pasienten har en sykehistorie med allergi mot enten farmakologiske eller naturlig forekommende substanser vil applikasjon av en testdose av størrelsesorden 10 til IO<6> rekombinant adenovirus, under nær klinisk observasjon, være indisert.

For behandling av kreft ved bruk av Ad5CMV-p53, ville rekombinant adenovirus som uttrykte p53, under kontroll av passende promoter/forsterker-elementer, slik som CMV-promoteren, bli preparert og renset ifølge en metode som ville være akseptabel for Food and Drug Administration (FDA) for tilførsel til humane individer. Slike metoder inkluderer, men er ikke begrenset til, cesiumklorid-tetthetsgradient-sentrifugeringer etterfulgt av analyse av effektivitet og renhet.

To grunnleggende metoder blir vurdert som passende for p53-adenovirus-behandlingsmetoder, en direkte eller lokal tilførsel og en mer generell tilførsel. De nåværende metoder passer for behandling av enhver rekke ulike kreftformer som man vet er forbundet med p53-mutasjoner. Hva angår generell tilførsel har en enkel intravenøs injeksjon av adenovirus funnet å være tilstrekkelig for å resultere i virusinfeksjon av vev lokalisert langt fra injeksjonsstedet (Stratford-Perricaudet et al., 1991b), og er derfor passende for behandling av alle p53-assosierte ondartede sykdommer. Virus kan tilføres pasienter ved hjelp av intravenøs tilførsel i enhver farmakologisk akseptabel løsning, eller som en infusjon over en viss tidsperiode. Rent generelt er det antatt at det effektive antall funksjonelle viruspartikler som må tilføres ville være i området fra 1 x 10 10 til 5 x 10 12.

I tillegg, særlig hvor lungekreft er i bildet, kunne mer direkte fysikalsk målrettet tlførsel av rekombinante adenovirus bli benyttet hvis så ønsket, på en måte som svarer til tilførsel i luftrøret av den cystisk fibrose transmembran konduktans regulator (Rosenfeld et al., 1992). Dette ville resultere i at rekombinant p53-adenovirus ville leveres nærmere stedet hvor målcellene befinner seg.

Metoder

In situ dUTP-merking med TdT for deteksjon av apoptose. H358-celleklumper ble fiksert på dag 3 og farvet som beskrevet i eks. 7. I korthet ble merkede TdT-prober bragt i kontakt med glass som var dyppet i TdT-buffer og inkubert med biotinylert med dUTP og TdT ved 37°C i 45 min. Glassene ble dekket med 2% bovint serumalbumin i 10 min. og inkubert med avidin/biotin-kompleks i 3 0 min. Kolorimetrisk deteksjon ble utført med diamino-benzidin. Induksjon av apoptose med CDDP etter in vivo infeksjon med Ad-p53. H358-celler (5 x IO<6>) i 0,1 ml Hank's balanserte saltløsning ble injisert subkutant i høyre flanke i BALB/c hunn nu/nu mus. 30 dager senere ble 200 yl av medium alene eller medium som inneholdt Ad-Luc (IO<8>PFU/ml) eller Ad-p53 (IO<8>PFU/ml) injisert i svulster med diameter 5-6 mm. Injeksjon inn i svulst (100 yl) og injeksjon rundt svulster i to motsatte steder (50 yl hver) ble utført. CDDP (3 mg/kg) eller kontroll fysiologisk saltvann ble gitt intraperitonealt. (A) Svulstvolumendringer. Svulstene ble målt i to perpendikulært orienterte diametere uten kunnskap om behandlingsgruppen, og et svulstvolum ble kalkulert ved å anta en kuleform med den gjennomsnittlige svulstdiameter kalkulert som kvadratrot av produktet av kryss-snitt diameterene. Fem mus ble brukt for hver behandlingsgruppe og gjennomsnitt +/standardfeil blir vist. Data ble analysert ved hjelp av Student's t-test. Pilen viser behandlingsdag. To uavhengige bestemmelser blir vist. p < 0,05 fra dag 5 i test 1; p < 0,05 fra dag 7 i test 2. Histologisk analyse anvender TdT-mediert biotin-dUTP-merkingsteknikk. Svulster ble høstet 5 dager etter begynnelse av behandling og umiddelbart innleiret i 0. C. T. forbindelse. Frysesnitt ble kuttet på en kryostat med 5 ym tykkelse. Snittene ble behandlet med 1 yg/ml proteinase K og farvet som beskrevet ovenfor. Forsøksdyrbehandling var ifølge retningslinjer fra UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.

Resultater

For å demonstrere in vivo effektivitet av metodene og

effektivitet av blandingene i en kombinasjon av genutbyttingsterapi og kjemoterapi i human kreft, undersøkte oppfinnerne om sekvensiell tilførsel av Ad-p53 og CDDP kunne indusere apoptose in vivo. Etter 3 dager med direkte injeksjon i svulst av Ad-p53 eller

intraperitoneal tilførsel av CDDP, viste H358-svulster som var implantert subkutant i nu/nu mus en moderat veksthemming. Dersom imidlertid Ad-p53 og CDDP ble tilført samtidig, viste svulstene en delvis tilbakevekst og svulststørrelsen forble statistisk signifikant mindre enn de størrelser observert i noen av de andre behandlingsgrupper. Den veksthemmende effekt var enda mer uttalt

etter to behandlingssykluser (Fig. 13A). Histologisk undersøkelse viste en massiv ødeleggelse av svulstceller i området der Ad-p53 var injisert i mus behandlet med CDDP. In situ farving viste mange apoptotiske celler rundt celle-fattige områder (fig. 13B-E). I motsetning viste svulster behandlet med CDDP alene eller Ad-p53 alene hverken cellefattighet eller apoptotiske områder.

Mer detaljert kan foretrukne behandlingsprotokoller bli utviklet som følger. Pasienter kan først bli undersøkt med bronkoskopi for å vurdere grad av obstruksjon. Så mye av tumormengde som mulig skulle bli fjernet ved hjelp av endoskopet. Pasienter burde fortrinnsvis bli utsatt for bronkoskopi under lokal eller generell anestesi. En Stifcor TM transbronkial aspirasjonsnål (21 g) vil bli ført gjennom biopsikanalen i bronkoskopet. Det gjenværende svulststed ville så kunne bli injisert med p53-adenovirus i et lite volum, f.eks. ca. 10 ml eller mindre.

I alle tilfeller, siden adenoviruset som blir benyttet vil være replikasjons-inkompetent, vil man ikke forvente noen ødeleggende effekt fremkalt av viruset selv på pasientens helsetilstand. Pasienter ville imidlertid forbli hospitalisert under behandlingen i minst 48 timer for å følge akutte og forsinkede bivirkninger. Sikkerhets-relaterte vurderinger vedrørende bruk av replikasjons-inkompetente adenovirus som et genoverføringsmedium hos mennesket er blitt diskutert tidligere (Rosenfeld et al., 1992, Jaffe et al., 1992), men dosen av adenovirus som ville tilføres bør bli fulgt på tilstrekkelig måte slik at man videre kan minimalisere sjansen for ubehagelige bivirkninger.

Det er ulike kriterier som man kan vurdere som frembyr eksistens av et behov for respons eller eksistens av toksisitet. For å hjelpe på å avgjøre toksisitet burde svulstcellen bli fotografert før man påbegynner terapi. Den lengste diameter og den perpendikulære diameter vil bli målt. Størrelse vil bli rapportert som produktet av disse diametere. Fra disse resultater kan man kalkulere hastigheten hvormed svulsten vokser tilbake.

Progresjonstid kan også bli målt fra den første observasjon med reduksjon i svulststørrelse inntil det er klar evidens for progresjon i sykdommen. Progresjon i sykdom blir definert som en økning på > 25% i sum av produktene av diameterne av den målte lesjon. Pasienter må ha mottatt minst to terapikurer før progresjon er beskrevet. Pasientoverlevelse vil bli målt etter innføring i protokoll.

Oppfølgings-undersøkelser ville inkludere alle under-søkelser som vanligvis brukes i kreftbehandling, dette inkluderer å følge kliniske tegn og å ta biopsier for standard og molekylær-biologiske analyser hvor ekspresjonsmønsteret av ulike p53-gener kunne bli studert. Dette ville også gi informasjon om antall celler som har tatt opp det overførte gen og om den relative styrke som promoteren har in vivo. Basert på resultater som oppnås kan justeringer av behandlingen være ønskelig. Disse justeringer kan inkludere adenovirus-konstruksjoner som bruker andre promotere eller en endring i antall av pfu injisert for å sikre at flere eller alle svulstceller blir infisert uten ufysiologisk overekspresjon av de rekombinante gener.

Det forventes at ekspresjon av eksogene gener overført in vivo ved hjelp av adenovirus kan overleve i lengre tidsperioder. Terapeutisk effektiv langtidsekspresjon av virus-overførte eksogene gener vil måtte studeres fra kasus til kasus. Markørgener har begrenset brukbarhet under forsøkene på å bestemme terapeutisk relevant vedvarende genekspresjon, siden ekspresjonsnivåene som kreves for forbedring av enhver gitt genetisk sykdom kan være svært forskjellig fra nivået som kreves for totalt å kurere en annen sykdom.

Selv om blandingene og metodene i denne oppfinnelse er blitt beskrevet som foretrukne utførelser, vil det være klart for personer som er øvet i faget at variasjoner kan benyttes i blandingen, metodene og i trinnene eller sekvensen av ulike trinn i metoden som beskrives her uten at man fjerner seg fra konseptet, ånden og området til oppfinnelsen. Mer spesifikt vil det være klart at visse midler som er både kjemisk og fysiologisk relatert kan substitueres for de midler som er beskrevet her, mens de samme eller lignende resultater ville bli oppnådd. Alle slike lignende substitutter og modifikasjoner som er klare for personer som er øvet i faget, vurderes å høre til innen ånden, området og ideen til oppfinnelsen som definert av de vedlagte krav. Alle de krevede metoder og materialer kan bli laget og utført uten unødvendig eksperimentering.

Referanser

Bargonetti, et al. (1991) Cell 65:1083-1091.

Bishop (1987) Science 235:305-311.

Boehringer Mannheim Biochemicals (1992). DOTAP for high efficiency transfections, BMBiochemica 9(1):17.

Boshart, M. et al. (1985). A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.

Cell, 41:521-530.

Cai, D.W., Mukhopadhyay, T., Liu, T., Fujiwara, T., and Roth,

J.A. Stable expression of the wild-type p53 gene in human lung cancer cells after retrovirus-mediated gene transfer. Human Gene Ther, 4: 617-624, 1993.

Culver, K.W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E.H., and Blaese, R.M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science, 256: 1550-1552, 1992.

Casey, G. Lo-Hueh, M., Lopez, M. E., Vogelstein, B., and Stanbridge, E. J. (1991). Growth suppression of human breast cancer cells by the introduction of wild-type p53 gene. Oncogene 6:1791-1797.

Clarke, A.R., Purdie, C.A., Harrison, D.J., Morris, R.G., Bird, CC, Hooper, M.L., and Wyllie, A.H. Thymocyte apoptosis induced by p53-dependent and independent pathways. Nature, 362: 849-852, 1993.

Dai, et al. (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. 89:10892-10895.

Doyle, L.A. Mechanisms of drug resistance in human lung cancer cells. Semin Oncol, 20: 326-337, 1993.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu.V.E., Levy, D.B., Parsons, R., Trent, J.M., Lin, D., Mercer, E., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. WAFl, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell, 75: 817-825, 1993.

Fritsche, M., Haessler, C, and Brandner, G. Induction of nuclear accumulation of the tumor-suppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene, 8: 307-318, 1993.

Fields et al. (1990) Science 249:1046-1049.

Fujiwara, T., Grimm, E.A., Mukhopadhyay, T., Cai, D.W., Owen-Schaub, L.B., and Roth, J.A. A retroviral wild-type p53 expression vector penetrates human lung cancer spheroids and inhibits growth by inducing apoptosis. Cancer Res, 53: 4129-4133, 1993.

Gavrieli, Y., Sherman, Y., and Ben-Sasson, S.A. Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 119: 493-502, 1992.

Georges et al. (1993) Cancer Res 53:1743-1746.

Ghosh-Choudhury and Graham (1987). Biochem. Biophys. Res. Comm. 147:964-973.

Gluzman et al., (1982) in Eukaryotic Viral Vectors (Gluzman, Y., Ed.) pp. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York.

Graham, F.L. and A.J. van der Eb. (1973) . A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52:456-467 .

Graham, F.L. and Prevec, L. Manipulation of adenovirus vectors. In: Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128. New Jersey: The Humana Press Inc, 1991.

Graham, F.L., J. Smiley, W.C. Russell and R. Nairn (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen Virol. 36:59-72.

Grunhaus, A. and Horwitx, M.S. (1992). Adenoviruses as cloning vectors. Semin. Virology 3:237-2542.

Harper, J.E., Adami, G.R., Wei, N., Keyomarsi, K., and

Elledge, S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of Gl cyclin-dependent kinases. Cell, 75: 805-816, 1993.

Hollstein, M., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Harris, C.

(1991). p53 mutations in human cancers. Science 253:49-53.

Jaffe et al., (1992) Nature Genetics 1:372-378.

Le Gal et al., (1993) Science 259:988-990.

Ledley, J. (1987). J. Pediatrics 110, 1.

Levine, A.J., Momand, J., and Finlay, CA. The p53 tumour suppressor gene. Nature, 351: 453-456, 1991.

Lowe, S.W., Ruley, H.E., Jacks, T., and Housman, D.E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell, 74: 957-967, 1993.

Lowe, S.W., Schmitt, E.M., Smith, S.W., Osborne, B.A., and Jacks, T. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature, 362: 847-849, 1993.

McGrory, W.J. et al. (1988). A simple technique for the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus type 5. Virology 163:614-617.

Mercer, W.E. (1992) . Cell cycle regulation and the p53 tumor suppressor protein. Critic. Rev. Eukar. Gene Express. 2:251-263.

Mietz, et al. (1992) EMBO 11:5013-5020.

Miller 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:1

Montenarch, M. (1992) . Biochemical, immunological, and functional aspects of the growth-suppressor/oncoprotein p53. Critic. Rev. Onco. 3:233-256.

Mulligan, (1993), Science 260:926.

Nicolau, C, et al. (1983). Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 80, 1068.

Ragot et al., (1993) Nature, 361:647-650.

Ramqvist, T., Magnusson, K.P., Wang, Y., Szekeley, L., and Klein, G. Wild-type p53 induces apoptosis in a Burkitt lymphoma (BL) line that carries mutant p53. Oncogene, 8: 1495-1500, 1993.

Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143-155.

Rosenfeld et al., (1991) Science, 232:431-434.

Roth, J., Ruckdeschel, Weisenburger, Editors, Thoracic Oncology, First Edition, Chapter 49, pgs 711-721, Sanders, New York, 1989.

Shaw, P., Bovey, R., Tardy, S., Sahli, R., Sordat, B., and Costa, J. Induction of apoptosis by wild-type 53 in a human colon tumor-derived cell line. Proe Nati Acad Sei USA, 89: 4495-4499, 1992.

Spandidos, et al. (1989), J. Pathol., 157:1-10.

Stewart et al., (1992), Hum. Gene Ther. 3:267

Stratford-Perricaudet, L. and M. Perricaudet. (1991a). Gene transfer into animals: the promise of adenovirus. p. 51-61, In 0. Cohen-Haguenauer and M. Boiron (Eds.), Human Gene Transfer,

Editions John Libbey Eurotext, France.

Stratford-Perricaudet et al., (1991b) Hum. Gene. Ther. 1:241-256

Takahashi, T., Nau, M.M., Chiba, I., Birrer, M.J., Rosenberg, R.K., Vinocour, M., Levitt, M., Pass, H., Gazdar, A.F., and Minna, J.D. p53: a frequent target for genetic abnormalities in lung cancer. Science, 246:491-494, 1989.

Takahashi, T., Carbone, D., Takahashi, T., Nau, M.M., Hida, T., Linnoila, I., Ueda. R., and Minna, J.D. (1992). Wild-type but not mutant p53 suppresses the growth of human lung cancer cells bearing multiple genetic lesions. 1992. Cancer Res. 52:2340-2342.

Tishler, R.B., Calderwood, S.K., Coleman, C.N., and Price., B.D. Increases in sequence specific DNA binding by p53 following treatment with chemotherapeutic and DNA damaging agents. Cancer Res, 53: 2212-2216, 1993.

Tooza, J. (1981) . Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Torchilin et al., 1992, Faseb J. 6:2716

Travali, et al. (1990), FASEB, 4:3209-3214.

Weinberg, R.A. (1991) . Tumor suppressor gene. Science 254:1138-1145.

Wilcock, et al. (1991) Nature 349:429-431.

Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A., and Felgner, P.L. (1990) Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science 247:1465-1468.

Yonish-Rouach, E., Resnitzky, D., Rotem, J., Sachs, L.,

Kimchi, A., and Oren, M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibited by interleukin-6. Nature, 352: 345-347, 1991.

Zakut-Houri et al. (1985), EMBO J., 4:1251-1255.

Zahn, Q., Carrier, F., and Fornace Jr., A.J. Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth

arrest. Mol Cell Biol, 13: 4242-4250, 1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Branch, C.D., Mazur, W., French, B.A., and Roth, J.A. Generations and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis. BioTechniques, 1993.

Zhang, W.W., Fang, X., Mazur, W., French, B.A., Georges, R.N. and Roth, J.A. High-efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus. Cancer Gene Therapy, 1993.

Zhu, et al., 1993, Science 261:209-211.

Claims (25)

1. Anvendelse av villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens for fremstilling av et medikament for behandling av kreft i en pasientgruppe som har blitt behandlet med et DNA-ødeleggende middel valgt fra : (a) midler som interfererer med DNA-replikasjon, mitose eller kromosomal segregasjon, (b) midler som ødelegger syntesen og påliteligheten til nukleinsyreforløpere, (c) stråling eller bølger, (d) DNA-interkalerende midler, og (e) DNA-alkylerende midler.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som interfererer med DNA-replikasjon, mitose eller kromosomal segregasjon.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som interfererer med DNA-replikasjon, mitose eller kromosomal segregasjon valgt fra : adriamycin, etoposid, verapamil og podophyllotoxin.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som ødelegger syntesen og påliteligheten til nukleinsyreforløpere.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor kreftcellen var behandlet med et middel som ødelegger syntesen og påliteligheten til nukleinsyreforløpere, er en nukleinsyreforløper.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor kreftcellen var behandlet med 5-fluoruracil.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med stråling.

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med bølger.

9. Anvendelse ifølge krav 1, hvor kreftcellen var behandlet med et DNA-interkalerende middel.

10. Anvendelse ifølge krav 1, hvor en rekombinant vektor uttrykker villtype p53-kodende sekvens.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvor en rekombinant vektor er et nakent DNA-plasmid, et plasmid inne i et liposom, en retroviral vektor, en AAV-vektor eller en rekombinant adenoviral vektor.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor en rekombinant vektor er en rekombinant adenoviral vektor.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor en rekombinant adenoviral vektor omfatter villtype p53-kodende sekvens posisjonert under kontroll av cytomegalovirus IE-promoter.

14. Anvendelse ifølge krav 12, hvor en rekombinant adenoviral vektor omfatter villtype p53-kodende sekvens, en cytomegalovirus IE-promoter og et SV40-tidlig polyadenyleringssignal.

15. Anvendelse ifølge krav 12, hvor i det minste ett gen vesentlig for adenovirus replikasjon er deletert fra nevnte rekombinante adenovirusvektor og villtype p53-kodende sekvens introduseres på dens plass.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor EIA- og ElB-områder av adenovirus er deletert og villtype p53-kodende sekvens introduseres på deres plass.

17. Anvendelse ifølge krav 1, hvor medikamentet er formulert i en farmasøytisk akseptabel formulering.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvor medikamentet er formulert for intratumoral injeksjon.

19. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle er en human celle.

20. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle er en malign celle.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte celle er en lungekreftcelle.

22. Anvendelse ifølge krav 20, hvor nevnte celle er en brystkreftcelle.

23. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle har en mutasjon i p53-genet.

24. Anvendelse ifølge krav 1, hvor nevnte celle er lokalisert i et dyr og nevnte villtype p53-protein eller p53-kodende sekvens administreres til dyret i en farmasøytisk akseptabel form.

25. Anvendelse i følge krav 1, hvor cellen tidligere var behandlet med i det minste to kurer av et DNA-ødeleggende middel.