NO323228B1 - En agaroseovertrukket, agarosesekretorisk celleperle, en fremgangsmate for fremstilling derav, samt en fremgangsmate for konservering av agarosesekretoriske celler. - Google Patents

Description

Opp finnelsesområde

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en agaroseovertrukket, agarosesekretorisk celleperle, en fremgangsmåte for fremstilling derav, samt en fremgangsmåte for konservering av agarosesekretoriske celler. Således omfatter oppfinnelsen makroinnkapsling av sekretoriske celler i et hydrofilt gelmateriale, terapeutiske metoder hvor de makroinnkapslede sekretoriske celler anvendes, samt konservering av de sekretoriske celler ved makroinnkapsling.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Sekretoriske celler er celler som er kjennetegnet ved at de utsondrer biologiske produkter, såsom, men ikke begrenset til, hormoner {f.eks. insulin), vekstfaktorer, cytokiner osv. Deres rolle i biologiske prosesser er velkjent og behøver ikke angis her. En rekke sykdommer og patologiske tilstander er forbundet med svikt hos de sekretoriske celler til å arbeide skikkelig, såsom en utilstrekkelig produksjon av de sekretoriske produkter, f.eks. hypotyreoidisme og kretinar dvergvekst, som begge skyldes tyreoidhormonmangel, hypofysær dvergvekst på grunn av pituitøs veksthormonmangel, Lesch-Hynan-syndrom på grunn av hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferasemangel, fulminant hepatitt på grunn av mangel på hepatotrofisk faktor, ekstracellulær matrisesykdom på grunn av kondro-cyttmangel, samt insulinavhengig diabetes på grunn av insulinmangel.

En måte å behandle slike tilstander på er å trans-plantere de sekretoriske celler inn i pasienten. Det transplanterte materiale må for å være klinisk sikkert og effektivt (1) være ikke-immunogenisk, ikke-trombogenisbio-stabilt og fullstendig ikke-toksisk overfor- celler og vev hos verten, (2) opprettholde cellelevedyktighet i lengre tidsrom, (3) muliggjøre fri passasje av næringsstoffer, sekretorer (en substans som stimulerer sekresjon), samt celleprodukter, (4) lette kirurgisk implantering og ny

celledannelse, (5) kunne lett fikseres på plass og like-

ledes fjernes.

Transplantasjon av pankreaseøyer for behandling av insulinavhengig diabetes har vært gjenstand for ny interesse på grunn av teknologiske fremskritt ved iso-

lering av Langerhans-øyer. Som bakgrunn inneholder human pankreas Langerhans-øyer (heretter benevnt "pankreatiske øyer") som er spredd gjennom den eksokrine pankreas med noen konsentrasjoner nær pankreasgangene. De pankreatiske øyer kan sammen anses for å være ett eneste endokrint organ som opptar ca. 1 volum% av pankreasen. Inne i pankreas er små øyer (opp til 160 \ im diameter) tilbøyelig til å fordeles gjennom det eksokrine vev. Disse små øyer representerer 75% av øyene i antall, men bare ca. 15% i volum. Øyer som er mer enn 250 nm i diameter utgjør bare 15% av det totale antall øyer, men 60% av volumet. Disse øyer er lokalisert nær større ganger og blodkar og er ikke omgitt av acinært vev. En menneskepankreas kan inneholde over 1 million øyer, og hver øy består typisk av atskillige tusen celler. Hver øy består av en sentral kjerne av insulinproduserende beta-celler (B-celler) og en omgivende kappe av glukagonholdige alfa-celler (A-celler), somatostatinutskillende delta-celler (D-celler) samt pankreatiske polypeptidholdige celler (PP-celler). Insulinproduserende B-celler utgjør størstedelen av

cellene og utgjør ca. 80% av øyene i et menneske.

De kliniske anvendelser av pankreatisk øytransplanta-

sjon har vært begrenset av den manglende evne til å hindre allograft-xenograft øyavvisning, dvs. en avvisning av de transplanterte pankreatiske øyer på grunn av at vertens immunsystem angriper de transplanterte pankreatiske øyer.

For å motvirke denne avvisning er de pankreatiske øyer

blitt transplantert sammen med administrering av immun-suppressive midler.

Immunsuppressiv terapi har imidlertid vist seg å være

et tveegget sverd. Selv om risikoen for avvisning redu-

seres svekker den kroppens totale immunitetsforsvar. Forskjellige metoder til å beskytte det transplanterte vev på

fra vertens immunforsvar er blitt undersøkt av mange. Som diskutert nedenfor gjenstår det ennå å oppnå effektive, langvarige metoder, selv om forbigående suksess er blitt rapportert (Lacy, Diabetes Reviews, Vol 1{1), 1993, p 76).

De fem hovedløsninger for beskyttelse av det transplanterte vev mot vertens immunforsvar involverer alle forsøk på å isolere det transplanterte vev fra vertens immunsystem. Immunisoleringsmetodene som har vært anvendt frem til i dag omfatter: ekstravaskulære diffusjonskamre, intravaskulære diffusjonskamre, intravaskulære ultra-filtreringskamre, mikroinnkapsling samt makroinnkapsling. Alle disse metoder har imidlertid sviktet på grunn av ett eller flere av de følgende problemer: en fibrotisk respons hos verten mot det implanterte materiale, ustabilitet av det implanterte materiale, begrenset næringsstoffdiffusjon gjennom semipermeable membraner, sekretor- og produkt-permeabilitet, samt diffusjonstidforsinkelse gjennom semipermeable membranbarrierer.

F.eks. ble en fremgangsmåte til mikroinnkapsling for innkapsling av levedyktige celler, vev og andre labile biologiske membraner innenfor en semipermeabel membran av Lim i 1978 (Lim, forskningsrapport til Damon Corporation, 1978). Lim anvendte mikrokapsler av alginat og poly(L-lysin) for å innkapsle Langerhans-øyene. I 1980 ble den første suksessrike anvendelse in vivo av denne nye teknikk i diabetesforskning rapportert (Lim et al., Science, Vol 210, 1990, p 908). Implanteringen av disse mikroinn-kapslede Langerhans-øyer resulterte i undertrykkelse av en euglykemisk tilstand hos diabetiske dyr. Imidlertid fant andre forskere, som gjentok disse forsøk, at alginatet forårsaket en vevreaksjon, og de var ikke i stand til å reprodusere resultatene til Lim et al. (Lamberti et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 10, 1984, p 101; Dupuy et al., Jour. Biomed. Material and Res., Vol 22, 1988, p 1061; Weber et al., Transplantation, Vol 49, 1990, p 396; og Soon-Shiong et al., Transplantation Proceedings, Vol 22, 1990, p 754). Vannløseligheten til disse polymerer anses nå for å være ansvarlig for disse mikrokapslers begrensede stabilitet og bioforenelighet (Dupuy et al., supra; Weber et al., supra; Soon-Shiong et al., supra; samt Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society, Vol 57, 1974, p 263).

Nylig anvendte Iwata et al., (Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res., Vol 26, 1992, p 967) agarose for mikroinnkapsling av allogeniske, pankreatiske øyer og iakttok at den kunne anvendes som et medium for fremstillingen av mikroperler. I undersøkelsen ble 1.500-2.000 øyer mikroinnkapslet individuelt i 5 prosentig agarose og implantert i streptozotocin-induserte, diabetiske mus. De transplanterte overlevde i et langt tidsrom og resipientene bibeholdt normalt blodsukkernivå i det uendelige.

Fremgangsmåten deres lider imidlertid av flere ulemper. Den er tungvint og unøyaktig. F.eks. bli mange perler værende delvis overtrukket, og atskillige hundre perler er tomme for agarose. Mer tid er derfor nødvendig for å separere innkapslede øyer fra tomme perler. Dessuten samles de fleste av de implanterte mikroperler i bekken-hulen, og det er nødvendig med et stort antall øyer i fullstendig overtrukne, individuelle perler for å oppnå normalt blodsukkernivå. Dessuten er de transplanterte perler vanskelige å gjenfinne, og er tilbøyelige til å være sprøe og vil lett avgi øyer ved litt skade.

En makroinnkapslingsmetode er også blitt testet. Makrokapsler av forskjellige materialer, såsom poly{2-hydroksyetyl-metakrylat), poly(vinylklorid-akrylsyre), samt celluloseacetat ble fremstilt for immunoisolereing av Langerhans-øyer (se Altman et al., Diabetes, Vol 35, 1986, p 625; Altman et al., Transplantation American Society of Artificial Internal Organs, Vol 30, 1984, p 382; Ronel et al., Jour. Biomedical Material Research, Vol 17, 1983, p 855; Klomp et al., Jour. Biomedical Material Research, Vol 17, 1983, p 865-871). Ved alle disse undersøkelser ble det bare oppnådd en forbigående normalisering av blodsukker-nivået.

Archer et al., Journal of Surgical Research, Vol 28, 1980, p 77 anvendte hulfibrer av akrylkopolymer for å hindre temporær avvisning av øyxenoplantater. De rappor-terte langvarig overlevelse av dispergerte neonatale, murine bukspyttkjerteltransplantater i hulfibrer som ble transplantert inn i hamstere med diabetes. Nylig har Lacy et al., Science, Vol 254, 1991, p 1782-1784 bekreftet deres resultater, men fant at den euglykemiske tilstand var en forbigående fase. Det viste seg at når øyene inji-seres i fiberen aggregerer de inne i det hule rør og resulterer i nekrose i den sentrale del av øyraassene. Den sentrale nekrose hindret prolongasjon av transplantatet. For å løse dette problem anvendte de alginat for å disper-gere øyene i fiberen. Ved å benytte denne metode var de i stand til å oppnå langvarig transplantatoverlevelse. Men dette forsøk er ikke blitt gjentatt i stor grad. Derfor er membranens funksjon som et øytransplantasjonsmedium i mennesker usikker.

US 4997443 omhandler fremstilling av en perle, ved å tilsette en matrisepolymer og en gelédannende polymer. Fremstillingen omfatter først en polymerisering av matrisepolymeren og den reversible gelédannende polymeren. Når dette har funnet sted, er gelpolymeren oppløst, og så fjernet. Perlen ikke omfatter agarose i noen form, og den er ikke overtrukket.

WO9324076 omhandler en perle omfattende et første lag av agarose og kationiske aminosyrer i polymer format, og et andre lag av en anionisk aminosyrepolymer {ikke agarose).

FR2686250 omhandler injiserbare sammensetninger som omfatter mikrokapsler bestående av atelokollagen elelr en blanding av denne med et polysakkarid. FR2686250 omfatter ikke en overtrukket perle/kapsel, og perlen innholder ikke agarose men derimot alginat.

Det foreligger således et behov for å oppnå sekretorisk celletransplantasjon, særlig overlevelse av pankreatisk øyallotransplantat og -xenotransplantat uten anvendelse av kroniske, immunosuppressive midler.

Det har i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse overraskende vist seg at makroinnkapsling av sekretoriske celler i et hydrofilt gelmateriale resulterer i en funksjonell, ikke-immunogenisk makroperle som kan transplanteres inn i dyr og lagres i lang tid. Makroinn-kapslingen av de sekretoriske celler ifølge oppfinnelsen bevirker en effektiv og håndterbar metode for transplantasjon av sekretoriske celler. Makroinnkapslingsmetoden kan også benyttes for makroinnkapsling av andre biologiske stoffer, såsom enzymer, mikroorganismer, trofiske midler som inkluderer rekombinant fremstilte trofiske midler, cytotoksiske midler samt kjemoterapeutiske midler. De makroinnkapslede biologiske midler kan administreres for å behandle tilstander som det er kjent at reagerer på det biologiske middel.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er derfor et formål med den foreliggende oppfinnelse å frembringe en sekretorisk cellemakroperle som kan transplanteres inn i dyr for å behandle tilstander forårsaket av en svekket funksjon og vertens sekretoriske celler.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å frembringe en sekretorisk cellemakroperle som kan lagres i lengre tidsrom.

For å oppnå disse og andre formål er det ifølge oppfinnelsen frembrakt en fremgangsmåte til fremstilling av en agaroseovertrukket, agarose-kollagensekretorisk celle-mikroperle, en agaroseovertrukket, gelskumsekretorisk cellemakroperle samt en agaroseovertrukket, agarosesekretorisk cellemakroperle.

Det beskrives også en fremgangsmåte til behandling av en pasient som har en tilstand som er kjennetegnet ved en mangel i et sekretorisk celleprodukt, hvorved det inn i pasienten transplanteres en terapeutisk effektiv mengde av sekretoriske cellemakroperler valgt blant agaroseovertrukne, agarose-kollagensekretoriske cellemakroperler, agaroseovertrukne, gelskumsekretoriske cellemakroperler samt agaroseovertrukne, agarosesekretoriske cellemakroperler.

Ifølge oppfinnelsen er det også frembrakt en fremgangsmåte til konservering av sekretoriske celler, kjennetegnet ved at det dannes makroperler valgt blant agaroseovertrukne, agarose-kollagensekretoriske cellemakroperler; agaroseovertrukne, gelskumsekretoriske cellemakroperler; samt agaroseovertrukne, agarosesekretoriske cellemakroperler, og at de sekretoriske cellemakroperler inkuberes.

Perlen i følge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at den er agaroseovertrukket, og omfatter agarose-sekretoriske celler.

Fremgangsmåten for fremstilling derav er i følge oppfinnelsen således kjennetegnet ved

(a) suspendering av sekretoriske celler i agarose,

(b) dannelse av en perle fra de suspenderte sekretoriske celler fra trinn (a), (c) inkubering av perlen fra trinn (b) i fuktig luft, samt (d) overtrekking av perlen fra trinn (c) med agarose for å danne en agaroseovertrukket, agarosesekretorisk celleperle. Fremgangsmåten for konservering av agarosesekretoriske celler i følge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved (a) dannelse av agaroseovertrukne, agarosesekretoriske celleperler, og (b) inkubering av de sekretoriske celleperler.

Ytterligere utførelser av oppfinnelsen er angitt i underkravene 2-5, 7, 8, 10 og 11.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 og 2 viser agaroseovertrukne, kollagen-agarosepankreatiske øymakroperler. Fig. 3 viser glukosenivåene hos diabetiske mus transplantert med agaroseovertrukne, kollagen-agarosepankreatiske øymakroperler. Fig. 4 viser glukosenivåene hos diabetiske mus transplantert med agaroseovertrukne, gelskumpankreatiske øymakroperler. Fig. 5 viser glukosenivåene hos diabetiske mus transplantert med agaroseovertrukne, agarosemakroperler. Fig. 6 viser glukosenivåene hos diabetiske mus transplantert med frie pankreatiske øyer. Fig. 7 viser glukosenivåene hos diabetiske mus transplantert med agaroseovertrukne, kollagen-agarosemakroperler og frie pankreatiske øyer. Fig. 8 viser en glukosetoleransetest for normale mus, streptozotocininduserte diabetiske mus, streptozotocin-induserte diabetiske mus som mottar allotransplantatet i nyren "{KCT-mus)", samt streptozotocininduserte diabetiske mus som mottar agaroseovertrukne, agarose-kollagenpankreatiske øymakroperler; agaroseovertrukne, gelskumpankreatiske øymakropeler samt agaroseovertrukne agarosepankreatiske øymakroperler (samlet heretter betegnet "perlemus").

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen vedrører makroinnkapsling av biologiske stoffer, særlig sekretoriske celler i et hydrofilt gelmateriale, terapeutiske metoder hvor de makroinnkapslede biologiske stoffer anvendes, fortrinnsvis sekretoriske celler og konserverende biologiske midler, fortrinnsvis sekretoriske celler ved makroinnkapsling. Det hydrofile gelmateriale omfatter agarose og kombinasjoner av kollagen-agarose og gelatinsvamp-agarose. Gelatinsvamp vil heretter bli benevnt gelskum.

Termen biologisk stoff angir en levende organisme og produkter derav, f.eks. proteiner, enzymer, hormoner, polypeptider, serum, antistoffer samt antibiotika og også genetisk bearbeidete celler. Biologiske stoffer omfatter enzymer, f.eks. glukoseoksidase, laktasekompleks, mikroorganismer, f.eks. Klebsiella aerogenes, for fjerning av ammoniakk og urea, trofiske stoffer som omfatter rekombinant produsert trofiske stoffer, rekombinant fremstilt veksthormon, samt cytotoksiske stoffer.

Betegnelsen sekretorisk celler omfatter en pankreatisk øy selv om en pankreatisk øy teknisk ikke er en sekretorisk celle men for det meste en klump sekretoriske celler fordelt gjennom bukspyttkjertelen og omfattende dens endokrine del. I mennesker består de av minst fire forskjellige typer sekretoriske celler: alfa-celler som avsondrer den hyperglykemiske faktor glukagon; beta-celler som er de mest tallrike (70-80%) og avsondrer insulin; delta-celler som avsondrer somatostatin, samt polypeptid-celler som avsondrer polypeptidhormon.

Som forklart ovenfor må transplantert materiale være forenlig med verten. Agarose har en lang historie når det gjelder anvendelse i biologisk forskning, og dens kvalitet er godt kontrollert. Kollagen er det rikeligste protein i pattedyr, bevirker fast mekanisk understøttelse og funk-sjonerer som det biologiske sted for cellereplikasjon, differensiering, organogenese, individuell vekst og sår-reparasjon. Kollagen har også bioforenlighet. Gelskum er ikke-immunogenisk og har vært anvendt mye i kirurgiske prosesser. Det tolereres også godt av sekretoriske celler.

De biologiske stoffer, fortrinnsvis sekretoriske celler, isoleres først under anvendelse av velkjente prosesser. I en foretrukket utførelse dyrkes pankreatiske øyer ved enten 4°C, 24°C eller 37°C før de makroinnkapsles. Denne metode gjør det mulig å velge bare overlevende øyer etter isoleringen. Dessuten blir øyene mindre immunogenisk, noe som resulterer i beskyttelse av makroperler fra fibrose.

I en utførelsesform av oppfinnelsen suspenderes et biologisk stoff, fortrinnsvis pankreatiske øyer og mer foretrukket 50.000-700.000 pankreatiske øyer, i en vandig løsning av kollagen, fortrinnsvis 0,5-2% atellokollagen-løsning. Atellokollagen oppnås ved å behandle kollagen med pepsin, som fjerner antigeniske telopeptider som er an-svarlige for intermolekylær tverrbinding av kollagen. 0,5-5% agarose, fortrinnsvis ca. 1%, tilsettes deretter til de suspenderte pankreatiske øyer til dannelse av pankreatiske øyer suspendert i en blanding av kollagen og agarose. Blandingen som inneholder de pankreatiske øyer overføres deretter til en halvfast perle på i og for seg velkjent måte, fortrinnsvis ved å dyppe blandingen på mineralolje eller en "Teflon"-plate. Den halvfaste perle overføres deretter til et antibiotisk medium, vaskes og inkuberes deretter under standardbetingelser for å polymerisere kollagenet, fortrinnsvis ved 37°C i en fuktig, 5 prosentig C02~atmosfære, hvorved det dannes en fast kollagen-agarosemakroperle.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen spres et biologisk middel, fortrinnsvis pankreatiske øyer og mer foretrukket 50.000-700.000 pankreatiske øyer, på overflaten {3-5 cm) av en gelatinsvamp. Gelatinsvampen rulles deretter til en kule. Agarose, 3-5%, helles på kulen til dannelse av en perle.

I enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen an-bringes et biologisk middel, fortrinnsvis pankreatiske øyer og mer foretrukket 50.000-700.000 pankreatiske øyer,

i en agaroseløsning inneholdende fra 0,5 til 5% agarose, fortrinnsvis ca. 1% agarose. Blandingen omdannes deretter til en makroperle ved å bringe blandingen i kontakt med mineralolje eller Teflon. Perlen overføres deretter til et antibiotisk medium, vaskes og inkuberes natten over, fortrinnsvis ved 37°C, i en fuktig, 5 prosentig CO2-atmosfære.

I alle de ovenfor beskrevne utførelsesformer over-trekkes makroperlene jevnt med agarose, fortrinnsvis ved å rulle perlen 3-4 ganger i en Teflon-skje som inneholder 500-2.000 ul 5%-10% agarose. Tilsvarende angir betegnelsen makroperler med biologisk middel makroinnkapslede biologiske midler i form av en perle.

Makroperlene kan brukes som en vehikkel for avgivelse av det biologiske middel til kroppen hvor midlet vil utføre sin kjente funksjon. Mer enn én type biologisk middel kan innkapsles i en perle. F.eks. kan en mikroperle inneholde flere enzymer, såsom hemoglobin og glukoseoksidase. En slik perle kan administreres for fjerning av bilirubin. Disse perler kan anvendes enten for oral administrering av fordøyelsesenzymer (laktasekompleks) eller for selektiv fjerning av uønskede aminosyrer fra kroppen. Innkapsling av enzymene vil også hindre ned-brytning av enzymet i lumen. Dessuten kan rekombinante genprodukter sikkert avgis under anvendelse av innkapsling som medium. Genet K. aerogenes kan f.eks. makroinnkapsles i makroperler for fjerning av urea og ammoniakk. Når det biologiske middel er immunogent overfor verten muliggjør makroperlen administrering av det biologiske middel uten anvendelse av immunsuppressiv eller med nedsatte mengder immunsuppressiv.

De sekretoriske makroperler kan brukes for å behandle tilstander forårsaket av en svekket funksjon hos de sekretoriske celler i individet, f.eks. insulinavhengig diabetes, vekstfaktorforstyrrelse samt hormonelle forstyr-relser, ved transplantering av de sekretoriske cellemakroperler inn i individet. Makroperlene kan innføres på passende sted for den spesielle behandling. F.eks. kan makroperler som inneholder hepatocytter implanteres i bukhulen for å behandle sykdommer relatert til manglende leverfunksjon. En bruk av transplantering av 5-10 pankreatiske øymakroperler som hver inneholder 50.000-700.000 pankreatiske øyer, inn i en pasient for behandling av insulinavhengig diabetes. Makroperlene kan innføres i bukhulen.

De sekretoriske cellemakroperler kan transplanteres i en pasient i en mengde som er tilstrekkelig til å behandle tilstanden. En mengde som er tilstrekkelig til å oppnå dette defineres som en "terapeutisk effektiv mengde" eller "effektiv mengde". Mengder som er effektive for denne anvendelse vil avhenge av hvor alvorlig tilstanden er, pasi-entens generelle tilstand, administreringsmåte, plasser-ingen av makroperlene og om de sekretoriske cellemakroperler administreres i kombinasjon med andre legemidler.

De sekretoriske makroperler kan anvendes for allo-genisk og xenogenisk transplantasjon i kombinasjon med immunsuppressiva, eller uten immunsuppressiva. Pasienter kan behandles som har kronisk eller akutt insulinavhengig diabetes ved xenotransplantering av animalske, pankreatiske øyer, f.eks. fra gris, storfe, mus, rotte, hakkespette eller vilkårlig annen egnet art inn i pasienten uten anvendelse av immunsuppressiva. De sekretoriske cellemakroperler kan også administreres i kombinasjon med andre terapeutiske midler, f.eks. den vanlig anvendte trippellegemiddelterapi {cyklosporin, azatioprin og hydrokortison), rapamycin, deoksypergualin eller antistoffer, for behandling av tilstanden.

Makroperlene kan også anvendes som en innretning for lagring av de biologiske midler, fortrinnsvis sekretoriske celler, i lengre tidsrom. For å opprettholde levedyktig-heten til de biologiske midler, fortrinnsvis sekretoriske celler, inkuberes de biologiske midler, fortrinnsvis de sekretoriske cellemakroperler, inntil de transplanteres inn i dyret.

Når de sekretoriske celler er pankreatiske øyer inkuberes de pankreatiske øymakroperler ved en temperatur på fra 24°C til 37°C.

EKSEMPLER

Eksempel I

Isolering av pankreatiske øyer

Pankreatiske øyer ble isolert fra rotter ved modifi-sering av metoden som er beskrevet av Gotoh et al., Transplantation, Vol 40, 1985, p 437.

Kollagenaseløsning (kolllagenasetype XI, Sigma Chemical, St. Louis, MO; 1 mg/ml inneholdende 2 mg/ml av Sigma, type V, storfeserumalbumin og 1 mg/ml CaC^) injisert inn i bukspyttkjertelen via den vanlige gallegang (Gotoh et al., Transplantation, Vol 40, 1985, p 437, se ovenfor). Bukspyttkjertelen ble fjernet og oppsamlet i en kolbe som ble holdt på is. Etter at bukspyttkjertler fra 4 rotter var blitt oppsamlet ble kolben anbrakt i et vannbad ved 38°C i 30 minutter. Det resulterende oppløste vev ble vasket fire ganger i kald (8*0 HBSS (Hank's løsning med balanserte salter). ;Uoppløst vev, store lymfeknuter og annet fremmed materiale ble fjernet ved gjentatt mobilisering av vevet etterfulgt av fjerning av supernatanten. Rensede øyer ble isolert på diskontinuerlig Ficoll-gradient bestående av 25%, 23%, 21% og 11% Ficoll-lag fremstilt i Euro-Collins-løsning (Frescenius AG, Gluchen Steinweg, Homburg V.D.H.) og sentrifugert ved 2.000 omdr./min. i 16 minutter. Øyene ble oppsamlet fra grenseflaten mellom 11% og 21% og grenseflaten mellom 21% og 23% Ficoll-sjiktene. Øyer fra hver fraksjon ble oppsamlet og vasket fire ganger i HBSS-løsning inneholdende 10% kalvefosterserum. ;De oppsamlede øyceller ble overført til petriskåler inneholdende RPMI komplett medium, dvs. kaldt RPMI 1640-medium (GIBCO, Grand Island, NY) supplert med 25 mM HEPES, varmeinaktivert storfefosterserum (10%) og antibiotisk-antimykotisk løsning (1 ml/100 ml) som inneholdt: 100 ug;/ ml penicillin, 100 (ig/ml streptomycinsulfat og 25 u<q>/ml amfotericin B. Eventuelt gjenværende acinært, vaskulært, duktulært eller lymfeknuteformet vev som ikke inneholdt øyer ble identifisert ved hjelp av et mikroskop og ble fjernet ved hjelp av en steril pipette med tynn tupp. Sluttrenhet ble bestemt ved farging av øypreparatet med difenyltiokarbazon. ;Etter isolering ble øyene inkubert i bakteriologiske plastskåler (100 mm), som inneholdt 10 ml RPMI-medium ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CC*2 i 4 dager. Mediet ble skiftet hver dag, og øyene ble deretter enten transplantert direkte eller makroinnkapslet.

Eksempel II

A. Fremstilling av agaroseovertrukne, agarose- kollagen-pankreatiske øymakroperler

1.000 pankreatiske øyer oppnådd ved fremgangsmåten i eksempel I ble vasket fire ganger i komplett RPMI-medium som beskrevet i eksempel I, men uten kalvefosterserum. De pankreatiske øyer ble deretter tilsatt til et rør som

inneholdt 50 ul av 1 prosentig atelokollagen-løsning i fosfatbufret salt for suspendering av de pankreatiske øyer. 100 ul av 1 prosentig, lavviskøs agaroseløsning (Sigma type XII) fremstilt enten i RPMI eller i MEM (mini-malt essensielt medium), holdt på 60°C, ble deretter tilsatt til suspensjonen av kollagen-pankreatiske øyer. Innholdet i røret ble deretter umiddelbart overført som én eneste stor dråpe, enten på sterilisert mineralolje som ble holdt på romtemperatur, eller på en "Teflon"-plate. Etter 1 minutt ble dråpen en halvfast mikroperle som deretter ble overført til et antibiotisk RPMI-medium ved 37°C. Makroperlene ble deretter vasket tre "ganger med det samme medium for fjerning av all olje. Til slutt ble de skyllet to ganger med komplett medium (37°C) og inkubert natten over ved 37°C i en fuktig atmosfære som inneholdt 5% CO2. I dette tidsrom polymeriserte kollagenet, og de pankreatiske øyer hvilte på kollagenfiberen.

Neste dag ble de faste makroperler overført til en "Teflon"-skje som inneholdt ca. 1 ml 5% agarose i RPMI-eller MEM-medium. De faste makroperler ble deretter rullet i denne løsning 2-3 ganger for å overtrekke dem jevnt. Før agarosen størknet ble makroperlene overført til mineralolje i en "Teflon"-skål for å oppnå makroperler med glatt overflate. Etter 60 sekunder ble makroperlene fjernet fra mineraloljen og vasket tre ganger med antibiotisk RPMI-medium og deretter to ganger med det komplette RPMI-medium. De ble deretter inkubert natten over ved 37°C i en fuktig atmosfære som inneholdt 5% CO2. Agaroseovertrukne, agarose-kollagenpankreatiske øymakroperler er vist i fig.

1 og 2.

B. Fremstilling av agaroseovertrukne gelatinsvamp-pankreatiske øymakroperler

Et lite stykke gelatinsvamp (gelskum), 3 mm^, ble først neddykket i komplett RPMI-medium. Mediet ble klemt ut, og gelskummet ble hensatt i 1 minutt. 1.000 pankreatiske øyer, som var fremstilt ifølge eksempel I, ble vasket fire ganger med antibiotisk RPMI-medium. De ble deretter suspendert i 10 ul antibiotisk RPMI-medium. De ble ved hjelp av en plastpipette med tynn tupp overført og spredd på overflaten av gelskummet. Etter 20 sekunder ble gelskummet rullet til en liten kule. 50 ul 5% agarose ble helt på overflaten av kulen for å danne en pankreatisk øymakrokule.

For å dekke makrokulen jevnt med 5% agarose ble 500 ul 5% agarose tilsatt til makroperlen i en "Teflon"-skje og rullet 3-4 ganger. Før agarosen størknet ble makroperlen overført til mineralolje, og skålen ble rotert for å oppnå en glatt overflate på makroperlen. Makroperlen ble vasket 3-4 ganger i antibiotisk RPMI-medium og deretter skyllet to ganger med komplett RPMI-medium. Den ble inkubert natten over før den ble anvendt til transplantasjon.

C. Fremstilling av agaroseovertrukne agarosepankreatiske øymakroperler

1.000 pankreatiske øyer oppnådd ved fremgangsmåten i eksempel I ble først vasket fire ganger i antibiotisk RPMI-medium. De pankreatiske øyer ble overført til et rør som inneholdt 50 ul antibiotisk RPMI-medium og suspendert i dette. 100 ul 1 prosentig agaroseløsning ble deretter tilsatt til røret. Hele innholdet i røret ble umiddelbart overført, som én eneste stor dråpe, til enten sterilisert mineralolje eller en "Teflon"-plate. Etter 1 minutt størknet dråpen til en makroperle. Makroperlen ble over-ført til antibiotisk RPMI-medium som ble holdt på 37°C.

Oljen ble deretter fjernet ved vasking av makroperlene tre ganger med samme medium og deretter skylling to ganger med komplett RPMI-medium. Perlene ble inkubert natten over ved 37°C i en fuktig atmosfære som inneholdt 5% C02-

Neste dag ble disse perler overført til en "Teflon"-skje som inneholdt 1 ml 5% agarose i enten RPMI- eller i MEM-medium for å overtrekke makroperlene jevnt med agarose. Perlene ble deretter rullet forsiktig 2-3 ganger i agarose. De ble deretter overført til mineralolje i en "Teflon"-skål før agarosen størknet. Etter 60 sekunder ble perlene fjernet fra mineraloljen og vasket tre ganger i antibiotisk RPMI-medium og to ganger i komplett RPMI-medium. Perlene ble deretter inkubert natten over.

Eksempel III - Transplantasjon av pankreatiske øymakroperler i mus

A. Resipientmus og donorrotter

Det ble anvendt hannmus av stammene C57BL/6 og BALB/c. Resipientmusene ble gjort diabetiske ved hjelp av én eneste intravenøs injeksjon av streptozotocin (170-200 mg/kg).

Plasmaglukosenivåer på fastende hjerte ble bestemt før frembringelse av diabetes. Alle blodsukkernivåer i resipientmusene ble overvåket ved hjelp av blodprøver fra haleblodåren med en ExacTech Pen Sensor. Bare de mus som hadde serumglukosenivåer på over 400 mg/dl på transplanta-sjonsdagen ble anvendt.

Wistar Furth-rotter ble anvendt som donorer for xeno-transplantasj on.

B. Xenotransplantasjon av pankreatiske øymakroperler inn i bukhulen

På tidspunktet for xenotransplantasjon ble pankreatiske øymakroperler fra henholdsvis eksempel II(A), II(B) og II(C) overført forsiktig til separate plater som inneholdt antibiotisk RPMI-medium. For å fjerne alle serum-proteiner ble mediet forandret tre ganger. Diabetiske resipientmus ble bedøvet med avertin. Et midtlinjeinnsnitt ble utført for innføring av én eneste pankreatisk øymakro-perle i den frie bukhule. En to-lags lukking av snittet ble utført med en absorberende sutur. Kontrollmus mottok enten en tom makroperle intraperitonealt, frie pankreatiske øyer intraperitonealt eller en tom makroperle sammen med frie pankreatiske donorøyer.

Etter transplantasjon ble hver resipients blodglukose kontrollert daglig eller hver annen dag inntil den nådde det normale område. Deretter ble blodglukosen kontrollert bare 2-3 ganger per uke. Transplantater ble ansett for å være teknisk vellykkede dersom serumglukosen var under 200 mg/dl ble værende der etter tre på hverandre følgende blødninger. Et transplantat ble ansett for å være blitt avvist dersom serumglukosekonsentrasjonen steg til over 200 mg/dl etter en periode med transient normalt blodsukkerinnhold. Transplantater ble ansett for å ha sviktet eller å ha blitt "primært ikke-funksjonelle" dersom blod-sukkernivået aldri ble normalt {dvs. konstant ble værende over 200 mg/dl).

C. Intraperitoneal qlukosetoleransetest

Ca. 70-84 dager etter implantering ble det utført glukosetoleransetester. Glukoseløsning {1,0 g/kg kropps-vekt) ble injisert intraperitonealt i mus som hadde fastet i 6 timer (fra 9.00 til 15.00). Både før og etter injeksjon (0, 30, 60 og 120 minutter) ble det tatt blodprøver for å bestemme plasmaglukosenivåer under anvendelse av ExacTech Pen Sensoren.

For sammenligningens skyld ble det utført glukosetoleransetester på normale C57BL/6 og BALB/c mus, på C57BL/6 og BALB/c mus tilført streptozotocin, hvori det ikke var blitt transplantert pankreatiske øyer, samt på diabetiske BALB/c mus tilført streptozotocin hvortil det var transplantert frie pankreatiske øyer i nyren ("KCT"-mus) .

Kontrollforsøk ble utført for å sikre at den euglykemiske tilstand i diabetiske mus var blitt oppnådd via de makroinnkapslede pankreatiske øyer og ikke av makroperlene selv. Tomme agaroseovertrukne, agarose-kollagenmakroperler og agaroseovertrukne gelskummakroperler ble derfor fremstilt på samme måte som perlene i eksemplene II(A) og (B).

D. Resultater av testene vedrørende intraperitoneal xenotransplantasjon og glukosetoleranse

Ved implantering av pankreatiske øymakroperler er forandringene som ble iakttatt i det ikke-fastende plasma-glukosenivå hos STZ-diabetiske C57BL/6 mus tilført streptozotocin vist i fig. 3 og 4. Resipientene av agaroseovertrukne, agarose-kollagenpankreatiske øymakroperler og agaroseovertrukne, gelskumpankreatiske øymakroperler beholdt en tilstand med normalt blodsukkerinnhold i mer enn 60 dager, og i løpet av dette tidsrom økte kropps-vekten til disse mus gjennomsnittlig 3 g. Når agarose-dekkede, agarosepankreatiske øymakroperler ble transplantert oppnådde fra 2-6 dyr normalt blodsukkerinnhold etter 21-33 dager etter transplantasjon (fig. 5) og ble deretter euglykemiske. Alle øvrige transplanterte dyr oppnådd ikke en euglykemisk tilstand. Tomme makroperler (n=6) påvirket ikke blodglukose.

Når frie pankreatiske øyer ble transplantert intraperitonealt oppnådd 6 av 7 transplanterte dyr normalt blodsukkerinnhold 1 dag etter transplantasjon. Men de opprettholdt denne tilstand i bare 3-10 dager (fig. 6). Når frie pankreatiske øyer ble transplantert med tunge perler fremstilt av agaroseovertrukne, agarose-kollagenmakroperler eller agaroseovertrukne gelskummakroperier oppnådde alle dyr normalt blodsukkerinnhold innen 24 timer og ble værende slik i mer enn 12 dager (fig. 7). Deretter ble alle dyr hyperglykemiske. Dyr som bare inneholdt tomme makroperler oppviste ingen vevreaksjon i de 90 dager de ble fulgt.

Resultatene som ble oppnådd etter utførelse av glukosetoleransetestene er vist i fig. 8. I normale BALB/c-mus og C57BL/6-mus samt i "KCT"-mus nådde plasma-glukoseinnholdet en topp etter 30 minutter og vendte tilbake til grunnlinjenivåene etter 120 minutter.

Lignende resultater ble oppnådd når makroinnkapslede pankreatiske øyer og ikke-innkapslede pankreatiske øyer som var transplantert i nyren ble testet.

Resultatene av disse forsøk viser at de agaroseovertrukne, agarose-kollagenøymakroperler, de agaroseovertrukne, agarose-gelskumpankreatiske øymakroperler samt de agaroseovertrukne agarosemakroperler har de egenskaper som er nødvendige for et hybrid kunstig organ. Selv om alle tre typer avsondrer insulin med suksess er agaroseovertrukne, agarose-kollagenmakroperler og agaroseovertrukne, agarose-gelskummakroperier mer egnet som biohybride kunstige organer på grunn av jevnheten i resultater som oppnås i det minste antall transplanterte dyr. Dessuten viste alle tre typer perler ingen skadelige virkninger. Makroperlene ble værende frie i bukhulen og viste hverken vevreaksjon eller vedheft til noe organ. Følgelig utfører disse biohybride pankreatiske øyer sin funksjon så effektivt i de makroinnkapslede perler som i sitt natur-lige voksested, bukspyttkjertelen.

I alle musene nådde plasmaglukosenivået en topp etter 30 minutter og vendte tilbake til grunnlinjenivåene etter 120 minutter.

Eksempel IV

Langvarig laqringslevetid for pankreatiske øyer

Makroinnkapslede perler fremstilt ifølge eksemplene I(A), (B) og (C), som var inkubert i 4 uker ved 37°C i komplett RPMI-medium, ble testet for sine langtidskonser-verende egenskaper in vivo og in vitro. Det viste seg at de makroinnkapslede pankreatiske øyer som var inkubert i 4 uker funksjonelt tilsvarte de som var inkubert i 1 dag.

Dette eksempel viser at fremgangsmåten til makroinnkapsling ifølge oppfinnelsen kan benyttes for konservering av sekretoriske celler, fortrinnsvis konservering av pankreatiske øyer.

Claims (11)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en agaroseovertrukket, agarosesekretorisk celleperle, karakterisert ved(a) suspendering av sekretoriske celler i agarose, (b) dannelse åv en perle fra de suspenderte sekretoriske celler fra trinn (a), (c) inkubering av perlen fra trinn (b) i fuktig luft, samt (d) overtrekking av perlen fra trinn (c) med agarose for å danne en agaroseovertrukket, agarosesekretorisk celleperle.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at trinn (e) omfatter rulling av den faste perle fra trinn (c) i 5% agarose, bringing av den rulte, faste perle i kontakt med mineralolje, samt vasking av den rulte perle for å danne den agaroseovertrukne, agarose-sekretoriske celleperle.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at de sekretoriske celler er pankreatiske øyer.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at de pankreatiske øyer er pankreatiske øyer fra menneske, storfe eller svin.

5. Fremgangsmåte i samsvar med krav 3, karakterisert ved at perlen inneholder fra 50.000 til 700.000 pankreatiske øyer.

6. Perle, karakterisert ved at den er agaroseovertrukket, og omfatter agarosesekretoriske celler.

7. Perle i samsvar med krav 6, karakterisert ved at de sekretoriske celler er pankreatiske øyer.

8. Perle i samsvar med krav 7, karakterisert ved at de pankreatiske øyer er pankreatisk øyer fra menneske, storfe eller svin.

9. Fremgangsmåte for konservering av agarosesekretoriske celler, karakterisert ved(a) dannelse av agaroseovertrukne, agarosesekretoriske celleperler, og (b) inkubering av de sekretoriske celleperler.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at de agarosesekretoriske cellene er pankreatiske øyer.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 10, karakterisert ved at de pankreatiske øyene inkuberes ved fra 24°C til 37°C.