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BRPI0817233A2 - construções terapêuticas de gene de trca e bireatores para a expressão de moléculas bioterapêuticas, e usos das mesmas - Google Patents

construções terapêuticas de gene de trca e bireatores para a expressão de moléculas bioterapêuticas, e usos das mesmas Download PDF

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BRPI0817233A2
BRPI0817233A2 BRPI0817233-1A BRPI0817233A BRPI0817233A2 BR PI0817233 A2 BRPI0817233 A2 BR PI0817233A2 BR PI0817233 A BRPI0817233 A BR PI0817233A BR PI0817233 A2 BRPI0817233 A2 BR PI0817233A2
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BR
Brazil
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cells
therapeutic
disorder
disease
condition
Prior art date
Application number
BRPI0817233-1A
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English (en)
Inventor
Bethany Lynn Merenick
Robert P Beech
Thomas D Reed
Anna P Tretiakova
Richard E Peterson
Original Assignee
Intrexon Corp
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Publication date
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Abstract

CONSTRUçõES TERAPêUTICAS DE GENE DE TROCA E BIOREATORES PARA A EXPRESSãO DE MOLéCULAS BIOTERAPêUTICAS, E USOS DAS MESMAS. A presente invenção relaciona-se a métodos e composições para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um paciente por introdução em células do paciente de uma construção terapêutica de gene de troca que controla a expressão de um ou mais produtos terapêuticos.

Description

"CONSTRUÇÕES TERAPÊUTICAS DE GENE DE TROCA E BIOREATORES PARA A EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS BIOTERAPÊUTICAS, E USOS DAS MESMAS"
Antecedente da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção relaciona-se aos métodos e composições para tratamento, melhora, ou prevenção de uma doença, distúrbio, ou condição em um paciente por introdu- ção em um paciente de uma construção de gene de troca terapêutico que controla a expres- são de um ou mais produtos terapêuticos, Em uma modalidade adicional, a presente inven- ção relaciona-se a métodos e composições para tratamento, melhora, ou prevenção de uma doença, distúrbio, ou condição em um paciente pela introdução em um paciente de um "bio- reator", um implante terapêutico composto de uma célula ou células que secreta uma proteí- na terapêutica. Um bioreator pode ser imuno-isolado por encapsulação ou não- imunoisolado. Em modalidades particulares, o bioreator compreende uma construção de gene de troca.
Antecedente da Invenção
O conceito de tratamento ou prevenção de uma doença em um paciente através da introdução de um polinucleotídio codificando uma molécula terapêutica, por exemplo., um polipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico dentro de células do paciente, ou in- troduzindo no paciente células modificadas construídas para secretar a molécula terapêutica tem existido por muitos anos. Várias dificuldades em aspectos práticos do conceito têm im- pedido o progresso em direção a terapias bem sucedidas. Introdução direta do material ge- nético no paciente a ser tratado apresenta dificuldades tais como: segurança de distribuição, obtenção suficiente de níveis de expressão de produto terapêutico por um período suficiente de tempo, limitação da expressão do produto terapêutico à células desejadas, e manutenção da habilidade em modular ou pulsar a expressão do produto terapêutico, incluindo a habili- dade para parar expressão do produto terapêutico se ele não for mais necessário. Terapias baseadas em células são sujeitas a rejeição através de respostas imunes do paciente, então estratégias de imuno-isolamento tais como métodos de encapsulação de células têm sido desenvolvidos para aumentar a longevidade de células implantadas e permitir uso de células xenogênicas, isto é, células de uma espécie diferente. Terapias correntes de células encap- suladas e não-encapsuladas são projetadas para secretar a proteína terapêutica constituti- vamente. Uma vez implantada, a secreção da proteína pode não ser regulada. Para melho- rar a segurança e aplicação clínica da distribuição da proteína terapêutica do bioreator direta ou mediada por célula pode ser vantajoso ser capaz de parar a produção de proteína ou regular a taxa em qual ocorre a produção de proteína.
Então, existe a necessidade na técnica de novos métodos terapêuticos e composi- ções que provêm estas características desejadas. Resumo da Invenção
A presente invenção relata métodos e composições para tratamento, melhora, ou prevenção de uma doença, distúrbio, ou condição em uma pessoa.
Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença, distúrbio, ou condição de um paciente, compreendendo:
(a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídio codificando um gene de troca, onde o gene de troca compreende pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codificando um fator de transcrição dependente de Iigante através da associação operacionávelcom um promotor de troca terapêutico, onde o promotor de troca terapêutico é constitutivelmente ativo e (2) um segundo polinucleotídio codificando um polipeptídio tera- pêutico ou polinucleotídio terapêutico em associação operacionávelcom um promotor regu- lado por fator o qual é ativado pelo referido fator de transcrição dependente de ligante, onde o primeiro e o segundo polinucleotídios são introduzidos de forma que permita suas expres- sões na presença de ligante; e
(a) administrando ligante a um paciente para induzir expressão de polipeptídio tera- pêutico ou polinucleotídio terapêutico.
Uma modalidade adicional da invenção provê um método para expressar um poli- peptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico em uma pessoa, compreendendo:
(a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídio codificando um gene de troca, onde o gene de troca compreende pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codificando um fator de transcrição dependente de ligante através da associação operacionávelcom um promotor de troca terapêutico, onde o promotor de troca terapêutico é ativado sobre condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição a ser tratada, e (2) um segundo polinucleotídio codificando um polipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico em associação operacionávelcom um promotor de regulado por fator o qual é ativado pelo referido fator de transcrição dependente de ligante, onde o primeiro e o segun- do polinucleotídios são introduzidos de forma a permitir suas expressões no paciente sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição; e
(a) administrando ligante ao paciente para induzir expressão de polipeptídio tera- pêutico ou polinucleotídio terapêutico.
Uma modalidade adicional da invenção provê um método para expressar um poli- peptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico em um paciente, compreendendo:
(a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídio codificado um ge- ne de troca, onde o gene de troca compreende pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codificando um fator de transcrição dependente de ligante através da associação operacionávelcom um promotor de troca terapêutico, onde o promotor de troca terapêutico é ativado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição tratável pelo poli- peptídio terapêutico ou polinuceotídeo terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídio codifi- cando o poiipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico em associação operacioná- velcom um promotor de fator-regulado o qual é ativado pelo fator de transcrição dependente de ligante, em que o referido e os segundos polinucleotídio são introduzidos de forma que permita a expressão do primeiro polinucleotídio sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição; e
(a) administrando ligante ao paciente para induzir expressão de poiipeptídio tera- pêutico ou polinucleotídio terapêutico.
Nos métodos descritos acima, em uma modalidade, o primeiro polinucleotídio codi- ficando o gene de troca terapêutico e o segundo polinucleotídio codificando o poiipeptídio ou polinucleotídio terapêutico ligado a um promotor de regulado por fator são parte de um grande polinucleotídio, por exemplo, um vetor. Em outra modalidade, o primeiro polinuceotí- deo codificando o gene de troca terapêutico e o segundo polinucleotídio codificando o poii- peptídio ou polinucleotídio terapêutico ligado a um promotor regulado por fator são polinu- cleotídios separados que podem ser administrados como uma composição de ácido nucléi- co.
A invenção ainda relaciona-se a construções de gene de troca terapêutico que são úteis nos métodos revelados.
A invenção adicionalmente relaciona-se a vetores compreendendo a construção de gene de troca terapêutico da invenção.
A invenção ainda provê um método para expressar um poiipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico em um ou mãos células modificadas, compreendendo:
(a) introdução em uma célula de (1) um primeiro polinucleotídio codificando um ge- ne de troca, onde o gene de troca compreende pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codificando um fator de transcrição dependente de ligante através da associação operacionável com um promotor de troca terapêutico o qual é ativado sob condições associ- adas com a doença, distúrbio, ou condição, e (2) um segundo polinucleotídio codificando um poiipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico através de associação operacionável com um promotor de fator-regulado o qual é ativado pelo fator de transcrição dependente de ligante, assim produzindo uma célula modificada, e
(a) administração de ligante à célula modificada para induzir expressão do referido poiipeptídio terapêutico ou polinucleotídio terapêutico.
A invenção ainda relaciona-se às células modificadas compreendendo a construção de gene de troca terapêutico da invenção.
A invenção também se relaciona a dispositivos bioreatores compreendendo células modificadas da invenção também não encapsuladas, ou encapsuladas de maneira a prote- ger as células do sistema imune do paciente. Tais bioreatores podem ter a forma, por exem- pio, de células revestidas, células micro-encapsuladas, ou células macro-encapsuladas.
A invenção também se relaciona a kits para realizar os métodos da invenção, com- preendendo, por exemplo, construção de gene de troca, vetores, Iigantes etc.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 mostra uma modalidade de gene de troca terapêutico da invenção em que duas seqüências de fator de transcrição codificando duas porções separadas do complexo de fator de transcrição dependente de Iigante estão sob o controle de um único promotor. "AD" representa um domínio de transativação; "HP" representa um domínio parceiro de he- terodimerização. Os domínios AD e HP são expressos como uma fusão de proteína chama- da de "proteína de coativação" ou "CAP". "DBD" representa um domínio DNA de ligação; "LBD" representa um domínio de ligação de ligante. Os domínios DBD e LBD são expressos como uma proteína de fusão chamada "fator de transcrição dependente de ligante", ou "LTF". "Ligador Transcricional" representa um IRES (sítio de entrada ribossomal interna) ou significa a geração de dois produtos de proteínas separadas a partir de uma única estrutura de leitura aberta. "Seqüência de Produto Terapêutico" representa um polinucleotídeo codifi- cando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico; "Produto Terapêutico" representa um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico; e "TSP-1", represen- ta ou um promotor de troca terapêutico constitutivo ou um promotor de troca terapêutico ati- vado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição. CAP e LTF combi- nam para formar um complexo fator de transcrição dependente de ligante (LDTFC) que em combinação com ligante ativa um promotor regulado por fator (FRP).
Figura 2 mostra uma modalidade de gene de troca terapêutico da invenção no qual duas seqüências de fator de transcrição (CAP e LTF) codificando duas porções separadas de um complexo fator de transcrição dependente de ligante estão sob o controle de promo- tores diferentes. Os termos AD, HP, CAP, DBD, LBD, LFT, "Seqüência de Produto Terapêu- tico", "Produto Terapêutico", TSP, LDTFC, e FRP são definidos na legenda para Figura 1. "TSP-1" e "TSP-2" representam dois promotores de troca terapêuticos diferentes, cada um dos mesmos é, independentemente, ou um promotor constitutivo ou um promotor ativado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição. Em uma modalidade TSP- 1 é um promotor constitutivo e TSP-2 é um promotor ativado sob condições associadas com uma doença, distúrbio, ou condição. CAP e LFT combinam para formar um LDTFC o qual em combinação com ligante ativa um FRP.
Figura 3 mostra uma modalidade de gene de troca terapêutico da invenção em que três seqüências de fator de transcrição (CAP, LTF-1, e LTF-2), as quais podem ser combi- nadas para formar dois LDTFCs separados sob o controle de promotores diferentes. Os termos AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "Seqüência de Produto Terapêutico", "Produto Tera- pêutico", TSP, LDTFC, e FRP são definidos na legenda para Figura 1. DBD-A representa um primeiro domínio DNA de ligação o qual é fundido com um LBD para formar LTF-1, DBD- B representa um segundo domínio DNA de ligação o qual e fundido com um LBD para for- mar LTF-2. "Produto Terapêutico A" representa um primeiro polipeptídeo terapêutico ou po- linucleotídeo terapêutico; "Produto Terapêutico B" representa um segundo polipeptídeo tera- pêutico ou polinucleotídeo terapêutico; e TSP-1, TSP-2, e TSP-3 representam três promoto- res de troca terapêutica diferentes, cada um é, independentemente, também um promotor constitutivo ou um promotor ativado sob condições associadas a doença, distúrbio, ou con- dição. Em uma modalidade, TSP-1 é um promotor de troca terapêutico constitutivo e TSP-2 e TSP-3 são promotores de troca terapêutica diferentes, cada qual é independentemente ativado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição. CAP e LTF-1 com- binados para formar LDTFC-1 o qual em combinação com Iigante ativa FRP-1. ÇÃO e LTF-2 combinados para formar LDTFC-2 o qual em combinação com Iigante ativa FRP-2.
Figura 4 mostra uma modalidade de gene de troca terapêutico da invenção em que três seqüências de fator de transcrição codificando CAP e duas porções separadas de LTF de um complexo fator de transcrição depentende de Iigante estão sob controle de promoto- res diferentes. Os termos AD, HP, CAP, DBD, LBD, LTF, "Seqüência de Produto Terapêuti- co", "Produto Terapêutico", TSP, LDTFC, e FRP são definidos na legenda para Figura 1. TSP-1, TSP-2, e TSP-3 representam três diferentes promotores de troca terapêuticos, cada um é, independentemente, também um promotor constitutivo ou um promotor ativado sob condições associadas a doença, distúrbio, ou condição. Em uma modalidade, TSP-1 é um promotor constitutivo e TSP-2 e TSP-3 são promotores diferentes, cada qual é independen- temente ativado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição. Ou LTF-1 ou LTF-2 pode combinar com CAP para formar LDTFC-1 ou LDTFC-2. Ou LDTFC-1 ou LDTFC-2, em combinação com ligante, ativa FRP.
Figura 5 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figura 1,e construído para expressar o fator de crescimento de insulina 1 (IGF-1) sob condições de hipóxia tal como isquemia cardíaca.
Figura 6 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figura 2,e construído para expressar o fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) sob con- dições de hipóxias tais como isquemia cardíaca.
Figura 7 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figura 2, e construído para expressar eritropoietina (EPO) sob condições hipoxide hipóxia cas tais como isquemia cardíaca.
Figura 8 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figura 2, e projetado para expressar peptídeo natriuretico tipo B humano (BNP) sob condições de hipóxia tais como isquemia cardíaca.
Figura 9 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figura .2, e projetado para expressar tecido ativador de plasminogênio tecidual (tPA) sob condições inflamatórias tais como isquemia cardíaca.
Figura 10 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 3, e projetado para expressar relaxina sob condições inflamatórias e/ou fator de cresci- mento de hepatócito sob condições de hipóxia, ambas as condições sendo associadas com isquemia cardíaca.
Figura 11 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 2, e projetado para expressar EPO sob condições de hipóxia tais como isquemia cardíaca com expressão sendo limitada por miócitos cardíacos. Figura 12 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 4, e projetado para expressar IGF-1 sob condições tanto inflamatórias como condições de hipóxia tais como isquemia cardíaca com expressão limitada a miócitos cardíacos.
Figura 13 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 1, e projetado para expressar fator de necrose tumoral ligado a proteína 2 (Enbrel®) sob condições inflamatórias tais como artrite reumatóide.
Figura 14 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 4, e projetado para expressar fator de necrose tumoral ligado a proteína 2 (Enbrel®) ou em resposta a expressão de TNF alfa ou sob condições inflamatórias, ambas condições associadas com artrite reumatóide. Figura 15 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 3, e projetado para expressar fator de necrose tumoral ligado a proteína 2 (Enbrel®) sob condições inflamatórias e/ou sob condições de hipóxia dirigida por HlF sob EPO1 ambas condições associadas artrite reumatóide.
Figura 16 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 1, e projetado para expressar fator VIII:C humano constitutivamente.
Figura 17 é um diagrama de um vetor construído sob o esquema mostrado na Figu- ra 2, e projetado para expressar fator VIII:C humano sob condições de hipóxia associadas com hemofilia.
Descrição Detalhada da Invenção A invenção relaciona-se a métodos e composições para usar um gene de troca pa- ra expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em uma célula. Os métodos e composições podem ser usados in vitro, ex vivo ou in vivo. A invenção ainda re- laciona-se a métodos e composições para usar um gene de troca controlando expressão de um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico para o tratamento, melhora, ou prevenção de doenças, distúrbios, ou condições de um paciente. Os métodos da invenção podem ser realizados tanto ex vivo (pela introdução do gene de troca em células isoladas de um paciente ou células não autóloga, e introduzindo as células modificadas no paciente ou em um paciente diferente) ou in vivo (pela introdução do gene de troca diretamente nas cé- lulas do paciente). Os métodos da invenção envolvem o uso do gene de troca em que a ex- pressão do fator de transcrição dependente de Iigante está sob controle de um ou mais promotores de troca terapêuticos. Os métodos também incluem, sem limitação, aplicações da tecnologia de gene de troca em introdução direta no paciente a ser tratado, terapias de célula não encapsuladas e encapsuladas. Os métodos e composições descritos acima pro- vêem uma técnica terapêutica altamente especifica e fortemente regulada na qual o nível e o tempo de expressão de um produto terapêutico é controlado pela administração de Iigante para as células compreendendo o gene de troca.
As definições seguintes são providas e devem ser úteis no entendimento do objeti- vo e prática da presente invenção.
O termo "isolado" para os propósitos da presente invenção designa um material bio- lógico (célula, ácido nucléico ou proteína) que tem sido removido de seu ambiente original (o ambiente em que está naturalmente presente). Por exemplo, um polinucleotídeo presente no estado natural em uma planta ou um animal não é isolado, entretanto o mesmo polinucleotí- deo separado do ácido nucléico adjacente em que ele é naturalmente presente, é conside- rado "isolado".
O termo "purificado", como aplicado para materiais biológicos não requer que o ma- terial esteja presente em uma forma de exibição de pureza absoluta, excluído da presença de outros compostos. Isso é ainda uma definição relativa.
"Ácido nucléico", "molécula de ácido nucléico", "oligonucleotídeo", e "polinucleotí- deo" são usados de modo passível de mudança e referem-se a forma polimérica de éster de fosfato dos ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; "moléculas de RNA") ou deoxiribonucleosídeos (deoxiadenosina, deoxiguanosina, deoxitimidina, ou deoxi- citidina; "moléculas de DNA"), ou qualquer análogo fosfoéster dos mesmos, tais como fosfo- rotioatos e tioésteres, em ou forma de fita simples, ou uma hélice de fita dupla. Hélices de DNA-DNA de fita dupla, DNA-RNA e RNA-RNA são possíveis. O termo molécula de ácido nucléico, e em particular molécula de DNA ou RNA1 refere-se somente a estrutura primária e secundária da molécula, e não as limita a qualquer forma terciária particular. Então, este termo inclui DNA de fita dupla encontrado, entre outras coisas, em moléculas d DNA circular ou linear (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmídeos, DNA supercolóide e cromos- somos. Em discussão a estrutura das moléculas de DNA de fita dupla particular, seqüências podem ser descritas aqui de acordo com a convenção normal dando somente a seqüência da direção 5' para 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (isto é, a fita tendo uma seqüên- cia homóloga ao mRNA). Uma "molécula de DNA recombinante" é uma molécula de DNA que tenha sido submetida a manipulação biológica molécular. DNA inclui, mas não é limita- do a, cDNA, DNA genômico, DNA plasmídeo, DNA sintético, e DNA semi-sintético. Uma "composição de ácido nucléico" da invenção compreende um ou mais ácidos nucléicos co- mo descritos aqui.
O termo "fragmento", como aplicado para seqüências de polinucleotídeo, refere-se a uma seqüência de nucieotídeo de comprimento reduzido relativo a referência de ácido nucléico e compreendendo, além da porção comum, uma seqüência nucleotídica idêntica a referência de ácido nucléico. Tal fragmento de ácido nucléico de acordo com a invenção pode ser, onde apropriado, incluído em um polinucleotídeo maior do qual é um constituinte. Tais fragmentos compreendem, ou alternativamente consistem de, oligonucleotídeos vari- ando em comprimento de pelo menos, 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, ou mais nucleotídeos consecutivos do ácido nucléico de acordo com a invenção.
Como aqui usado, um "fragmento de ácido nucléico isolado" refere-se a um políme- ro de RNA ou DNA que tem fita dupla ou simples, opcionalmente contendo bases nucleotídi- cas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucieotídeo isolado na forma de um polímero de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
Um "gene" refere-se a um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos que codifi- cam uma molécula funcional, incluindo moléculas funcionais produzidas somente pela trans- crição (por exemplo, uma espécie de RNA bioativo) ou pela transcrição e tradução (por e- xemplo, um polipeptídio). O termo "gene" compreende cDNA e ácidos nucléicos de DNA genômico. "Gene" também se refere a um fragmento de ácido nucléico que expressa um RNA especifico, proteína ou polipeptídio, incluindo seqüências regulatórias precedentes (se- qüências não codificadas 5') e seguintes (seqüências não codificadas 3') à seqüência codifi- cada. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com suas próprias seqüências regulatória. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é gene nativo, compreendendo seqüências regulatórias e/ou codificadas que não são encontradas juntas na natureza. Conseqüentemente, um gene quimérico pode compreender seqüências regula- tórias e seqüências codificantes que são derivadas de diferentes origens, ou seqüências regulatórias e seqüências codificantes derivadas da mesma origem, mas arranjadas em ma- neira diferente que a encontrada na natureza. Um gene quimérico pode compreender se- qüências codificantes derivadas de diferentes origens e/ou seqüências regulatórias deriva- das de origens diferentes. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene "estranho" ou gene "heterólogo" refere-se a um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro pela transferência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativos inserido em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que tem sido introduzido no genoma por um procedimento de transformação.
"DNA heteroiógo" refere-se a DNA não naturalmente localizado na célula, ou em sí- tio de cromossomos da célula. O DNA heteroiógo pode incluir um gene estranho à célula.
O termo "genoma" inclui cromossomal bem como DNA ou RNA de mitocondrial, do cloroplasto e viral.
Uma molécula de ácido nucléico é "hibridizável" a outra molécula de ácido nucléico, tal como um cDNA, DNA genômico, ou RNA1 quando uma forma de de fita simples de uma molécula de ácido nucléico pode anelar a outra molécula de ácido nucléico sob condições apropriadas de temperatura e solução iônica forte. Condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook et at. em Molécular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o capítulo 11 e tabela 11.1 (inteiramente aqui incorporada por referência). As condições de temperatura e força iônica determinam a "severidade" da hibridização.
Condições de severidade podem ser ajustadas para selecionar moderadamente fragmentos similares, tais como seqüências homólogas de organismo relacionado à distân- cia, a fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. Por seleção preliminar de ácidos nucléicos homólo- gos, baixas condições de severidade de hibridização, correspondendo a Tm de 55°, pode se usado, por exemplo, 5X SSC, 0,1% SDS, leite 0,25%%, e nenhuma formamida; ou 30% de formamida, 5X SSC, 0,5% SDS. Condições de severidade moderada de hibridização cor- respondem a Tm mais alta, por exemplo, 40% de formamida, com 5X ou 6X SSC. Altas con- dições de severidade de hibridização correspondem ao mais alto Tm, por exemplo, 50% de formamida, 5X ou 6X SSC.
Hibridização requer que dois ácidos nucléicos contenham seqüências complemen- tares, embora dependendo da severidade de hibridização, erros entre bases são possíveis. O termo "complementar" é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeos que são capazes de hibridizar uma ao outra. Por exemplo, com respeito ao DNA, adenosina é complementar a timina e citosina é complementar a guanina. Conseqüentemente, a presen- te invenção também inclui fragmentos de ácidos nucléicos isolados que são complementa- res às seqüências completas como revelado ou usado aqui tão bem quanto aquelas se- qüências de ácido nucléicos substancialmente similares.
Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos são detectados pelo emprego das condições de hibridização compreendendo um passo de hibridização Tm de 55°C, e utili- zando condições conforme revelado acima. Em outras modalidades, o Tm é 60°C, 63°C ou 65°C.
Lavagens pós-hibridização também determinam condições de severidade. Um con- junto de condições usa uma série de lavagens começando com 6X SSC, 0,5% SDS e tem- peratura ambiente por 15 minutos (min), então repetida com 2X SSC1 0,5% SDS a 45°C por 30 minutos, e então repetida duas vezes com 0,2X SSC1 0,5% SDS e 50°C por 30 minutos. Um conjunto preferido de condições severas usa altas temperaturas em que as lavagens são idênticas àSquelas acima exceto pela temperatura das duas lavagens finais de 30 minu- tos em 0,2X SSC, 0,5% SDS é aumentado para 60°C. Outro conjunto preferido de condi- ções altamente severas usa duas lavagens finais em 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 65°C.
A severidade apropriada para hibridização de ácidos nucléicos depende do com- primento do ácido nucléico e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas seqüências de nucle- otídeos, maior o valor do Tm para híbridos de ácidos nucléicos tendo estas seqüências. A estabilidade relativa (correspondendo a Tm mais alta) da hibridização do ácido nucléico dimi- nui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos maiores que 100 nucleotídeos em comprimento, equações para cálculos de Tm têm sido derivadas (ver Sam- brook et ai, acima, 9,50-0,51). Para hibridização com ácido nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, as posições dos pares tornam-se mais importantes, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (veja Sambrook et ai, acima, 11,7-11,8).
Em uma modalidade da invenção, polinucleotídeos são detectados pelo emprego de condições de hibridização compreendendo um passo da hibridização em menos que 500 mM de sal a pelo menos 37°C, e um passo de lavagem em 2X SSPE em temperatura de pelo menos 63°C. Em outra modalidade, as condições de hibridização compreendem menos que 200 mM de sal a pelo menos 37°C para o passo de hibridização. Em uma modalidade adicional, as condições de hibridização compreendem 2X SSPE e 63°C para ambos os pas- sos de hibridização e lavagem.
Em outra modalidade, o comprimento para um ácido nucléico capaz de hibridizar é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preverivelmente um comprimento mínimo para um ácido nucléico ser capaz de hibridizar é pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; por exemplo, pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; por exemplo, pelo menos 30 nucleotídeos. Além dis- so, o versado na técnica reconhecerá que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavageml podem ser ajustadas como necessário de acordo com fatores tais como com- primento do padrão.
O termo "padrão" refere-se a uma molécula de ácido nucléico de fita simples que pode basear um par com um ácido nucléico alvo de fita simples complementar para formar uma molécula de fita dupla.
Como aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a um ácido nucléico curto que é capaz de hibridizar a uma molécula de DNA genômico, uma molécula de cDNA, um DNA plasmídeo ou uma molécula de mRNA. Oligonucleotídeos podem ser marcador, por exemplo, com 32P-nucleotídeos ou nucleotídeos aos quais um marcador, tal como biotina, tenha sido conjugado covalentemente. Uma oligonucleotídeo marcado pode ser usado como um padrão para detectar a presença de um ácido nucléico. Oliginucleotídeos (um ou ambos dos quais podem estar marcados) podem ser usados como iniciadores de PCR1 tanto para clonar comprimentos inteiros ou fragmentos de um ácido nucléico, para sequênciar DNA1 ou para detectar a presença de ácido nucléico. Um oligonucleotídeo pode também ser usado para formar um tripla-hélice com uma molécula de DNA. Geralmente, oligonucleotídeos são preparados sinteticamente, preferencialmente em um sintetizador de ácido nucléico. Conse- qüentemente, oligonucleotídeos podem ser preparados com ligações análogas de fosfoéster de ocorrência não natural, tal como ligação tioéster etc. Um 'Iniciadorj' refere-se a um oligonucleotídeo que hibridiza a uma seqüência de á-
cido nucléico alvo para criar uma região de ácido nucléico de fita dupla que pode servir co- mo um ponto de iniciação para síntese de DNA sob condições adequadas. Tais iniciadores podem ser usados em uma reação em cadeia de polimerase ou para sequênciamento de DNA.
"Reação em cadeia de polimerase" é abreviada como PCR e refere-se a um méto-
do in vitro para enzimaticamente ampliar seqüências de ácido nucléico específicos. PCR envolve uma série repetitiva de ciclos de temperatura com cada ciclo compreendendo três estágios: desnaturação do padrão de ácido nucléico para separar as fitas da molécula alvo, anelando um iniciador de oligonucleotide PCR de fita simples ao ácido nucléico padrão, e extensão do(s) iniciador(es) anelado(s) pela DNA polimerase. PCR provê um meio para de- tectar a presença da molécula alvo e, sob condições quantitativas ou não quantitativas, de- terminar a quantidade relativa da molécula alvo dentro do conjunto inicial de ácidos nucléi- cos.
"Reação em cadeia reversa da polimerase da transcrição" é abreviada RT-PCR e refere-se a um método in vitro para enzimaticamente produzir a molécula cDNA alvo ou mo- léculas da molécula ou moléculas de RNA, seguidas pela amplificação enzimática da se- qüência ou seqüências de ácido nucléico especificas dentro da molécula de cDNA alvo ou moléculas como descritas acima. RT-PCR também prove um meio para detectar a presença de molécula alvo e, sob condições quantitativas ou semi-quantitativas, determinar a quanti- dade relativa de molécula alvo dentro do grupo inicial de ácido nucléico inicial.
Uma "seqüência codificada" de DNA refere-se a uma seqüência de DNA dde dupla fita que codifica um polipeptídio e pode se transcrita e traduzida em um polipeptídio em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de seqüências regulatórias adequa- das. "Seqüências regulatórias adequadas" referem-se a seqüência de nucleotídeo Iocaliza- das a montante (seqüência 5' não codificada), dentro, ou a jusante (seqüência 3' não codifi- cada) da seqüência codificante, e a qual influencia a transcrição, processamento ou estabili- dade de RNA, ou tradução da seqüência codificante associada. Seqüências regulatórias podem incluir promotores, seqüências líder de tradução, introns, seqüências de reconheci- mento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA1 sítios de ligação efetores e es- truturas de "stem-loop". As fronteiras da seqüência codiifcante são determinadas pelo códon inicial na terminação 5' (amino) e uma tradução do códon de parada no 3' (carboxila) termi- nal. Uma seqüência codificante pode incluir, mas não é limitada a, seqüências procarióticas, cDNA de mRNA, seqüência de DNA genômico, e mesmo seqüências de DNA sintético. Se seqüência codificante é tencioada ser expressa em uma célula eucariótica, um sinal de poli- adenilação e seqüência de terminação de transcrição normalmente serão localizadas em 3' na seqüência codificante.
"Estrutura de leitura aberta" é abreviada ORF e refere-se a um comprimento de se- qüência de ácido nucléico, ou de DNA, cDNA ou RNA1 que compreende um sina incial de tradução ou códon de iniciação, tais como ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzida em uma seqüência polipeptídica.
O termo "cabeça a cabeça" é usado aqui para descrever a orientação de duas se- qüências polinucleotídicas em relação uma a outra. Dois polinucleotídeos são posicionados na orientação cabeça-a-cabeça quando a terminação 5' com da fita codiificante de um poli- nucleotídeo é adjacente ao terminal 5' da fita codificante do outro polinucleotídeo, segundo o qual a direção da transcrição de cada polinucleotídeo continua a partir da terminação 5' do outro polinucleotídeo. O termo cabeça-a-cabeça pode se abreviado (5')-a-(5') e pode tam- bém ser indicado pelos símbolos (<—->) ou (3'<-5'5'->3').
O termo "cauda-a-cauda" é usado aqui para descrever a orientação de duas se- qüências polinucleotíddicas em relação uma a outra. Dois polinucleotídeos são posicionados na orientação cauda-a-cauda quando a terminação 3' com a fita codificante de um polinu- cleotídeo é adjacente a terminação 3' da fita codificando o outro polinucleotídeo, segundo o qual a direção da transcrição de cada polinucleotídeo continua voltada para o outro polinu- cleotídeo. O termo "cauda-a-cauda" pode se abreviado como (3')-a-(3') e pode também ser indicado pelos símbolos (-><-) ou (5'—>3'3'<-5').
O termo "cabeça-a-cauda" é usado aqui para descrever a orientação de duas se- qüências polinucleotídicas em relação uma a outra. Dois polinucleotídeos são posicionados na orientação cabeça-a-cauda quando a terminação 5' com a margem codificante de um polinucleotídeo é adjacente a terminação 3' da margem codificada de outro polinucleotídeo, segundo o qual a direção da transcrição de cada polinucleotídeo continua com a mesma direção do outro polinucleotídeo. O termo "cabeça-a-cauda" pode se abreviado (5')-a-(3') e pode também ser indicado pelos símbolos (->->) ou (5'-3'5'->3').
O termo "a jusante" refere-se a seqüência de nucieotídeo que está localizada em 3' para uma referência de seqüência de nucieotídeo. Em particular, seqüência de nucieotídeo a jusante geralmente se relaciona a seqüência que segue o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon inicial de tradução de um gene é localizado a jusante do sítio inicial de transcrição.
O termo "a montante" refere-se a seqüência de nucleotídeo que está localizada em 5' para uma referencia de seqüência de nucleotídeo. Em particular, seqüência de nucleotí- deo a montante geralmente se relaciona a seqüência que está localizada no lado 5' da se- qüência codificante ou ponto de partida da transcrição. Por exemplo, a maioria dos promo- tores está localizada a montante do sítio inicial de transcrição.
O termo "endonuclease de restrição" e "enzima de restrição" são usados de forma passível de mudança e referem-se a uma enzima que se liga e corta dentro de uma seqüên- cia de nucleotídeos específica dentro do DNA de fita dupla.
"Recombinação homóloga" refere-se a inserção de uma seqüência de DNA estra- nho em outra molécula de DNA, por exemplo, inserção de um vetor em um cromossomo. Preferivelmente, o vetor objetiva um sítio especifico no cromossomo para recombinação homóloga. Para recombinação homóloga especifica, o vetor contem regiões suficientemente longas de homologia para seqüências de cromossomos para permitir ligação complementar e incorporação do vetor no cromossomo. Regiões mais longas de homologia, e maior nível de similaridade da seqüência, podem aumentar a eficiência da recombinação homóloga.
Vários métodos conhecidos na técnica podem ser usados para propagar um polinu- cleotídeo de acordo com a invenção. Uma vez um sistema hospedeiro adequado e condi- ções de crescimento estão estabelecidas, vetores de expressão recombinante podem ser propagados e preparados em quantidade. Como descrito aqui, os vetores de expressão que podem ser usados incluem, mas não são imitados aos seguintes vetores ou seus derivados; vírus humano ou animal tais como vírus vaccínia ou adenovírus, vírus de inseto tal como baculovírus; vetores de levedura; vetores bacteriófagos (por exemplo, lambda), e vetores de DNA cosmídeo e plasmídeo, para nomear alguns.
Um "vetor" refere-se a qualquer veículo para a clonagem e/ou transferência de um ácido nucléico em da célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicoro segmento de DNA pode ser ligado de forma a trazer a replicação do segmento ligado Uma "replicon" refere-se a qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossomo, vírus) que funciona como uma unidade autônoma de replicação de DNA in vivo, isto é, capaz de replicação sob seu próprio controle. O termo "vetor" inclui ambos, veículos viral e não viral para introdução de ácido nucleotídeo em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Um grande número de vetores conhecidos na técnica podem ser usados para manipular ácidos nucleo- tídeos, incorporar elementos de resposta e promotores em genes etc. Possíveis vetores incluem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificado incluindo, por exemplo bacteriófagos tais como derivados lambda, ou plasmídeos tais como pBR322 ou derivados plamídeo pUC, ou o vetor Bluescript. Outro exemplo de vetor que é útil na presente invenção é o Sistema de Produção UltraVector™ (Intrexon Corp., Blacksburg1 VA) como descrito em WO 2007/038276, aqui incorporado como referência. Por exemplo, a inserção de fragmento de DNA correspondente aos elementos de resposta e promotores em vetor adequado pode se realizada pela ligação de fragmentos de DNA apropriados em um vetor escolhido que tem terminal coesivo complementario. Alternativamente, a terminação das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas ou qualquer sítio pode ser produzido pela ligação de seqüências de nuceotideos (Iigadores) em um DNA terminal. Tais vetores podem ser construídos para conter genes marcadores selecionáveis que provêem para a seleção de células que têm incorporado o marcador no genoma da célula. Tais marcadores permitem a identificação e/ou seleção de células hospedeiras que incorporam e expressam as proteínas codificadas para o marcador.
Vetores virais, e particularmente vetores retrovirais, têm sido usados em uma gran- de variedade de aplicações de distribuição de genes em células, bem como em pacientes animais vivos. Vetores virais que podem ser usados incluem, mas não se limitam a, retroví- rus, vírus adeno-associado, pox, baculorvírus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr, ade- novírus, geminivírus, e vetores caulimovírus. Vetores não virais incluem plasmídeo, Iiposso- mos, lipídeos eletricamente carregados (citofetinas), complexos DNA-proteína, e biopolime- ros. Em adição ao ácido nucléico, um vetor pode também compreender uma ou mais regi- ões regulatórias, e/ou marcadores selecionáveis úteis em selecionar, medir, e monitorar re- sultados de transferência do ácido nucléico (transferir para tais tecidos, duração da expres- são etc).
O termo "plasmídeo" refere-se a um elemento extra cromossomal freqüentemente carreando um gene que não é parte do metabolismo central da célula, e normalmente na forma circular de moléculas de DNA de fita dupla. Tais elementos podem ser seqüências de replicação autônoma, seqüências de integração de genoma, seqüências fago ou de nucleo- tídeos, linear, circular, ou super-helicoidização, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivado de qualquer fonte, em que um número de seqüências de nucleotídeos têm sido unidas ou recombinadas em uma única construção a qual é capaz de introduzir um fragmen- to promotor e seqüência de DNA para um produto de gene selecionado junto com apropria- da a seqüência não traduzida 3' na célula.
Um "vetor de clonagem" refere-se ao "replicon", o qual é uma longa unidade de áci- do nucleotídeo, preferivelmente DNA, que replica sequêncialmente e que compreende uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outro segmento de ácido nucléico pode ser ligado de forma que trazer a replicação do segmento ligado. Vetores de clonagem podem ser capazes de replicação em um tipo de célula e expressão em outra ("vetor do tipo ponte"). Vetores de clonagem podem compreender uma ou mais seqüências que podem ser usadas para seleção de células compreendendo o vetor e/ou um ou mais múltiplos sítios de clonagem para inserção de seqüências de interesse.
O termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor, plasmídeo ou veiculo designado para permitir a expressão de uma seqüência de ácido nucléico inserida seguindo transfor- mação no hospedeiro. O gene clonado, isto é, a seqüência de ácido nucléico inserida, é normalmente colocada sob o controle dos elementos de controle tais como um promotor, um promotor mínimo, um aumentador, ou semelhantes. Regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para dirigir a expressão do ácido nucléico na célula hospedeira desejada são numerosas e familiares aqueles versados na técnica. Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir a expressão desses genes podem ser usados em vetor de expres- são, incluindo, mas não limado a, promotores virais, promotores bactérianos, promotores animais, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores de tecido especifico, promotor relacionado a patogênese ou doenças, promotores de desen- volvimento especifico, promotores induzíveis, promotores regulados leves; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL10, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, promotores fosfatase alcalina (úteis para expressão em Saccharomyces)] promotor AOX1 (útil para expressão em Pichiá)\ promotores β-lactamase, lac, ara, tet, trp,IPL, LPr, T7, tac, e trc (úteis para expressão em Escherichia coli)\ promotore regulado leve, semente específico, pólen específico, ovário especifico, vírus mosaico de couve-flor35S, CMV 35S mínimo, vírus mosaico de nervura de mandioca (CsVMV), proteína de ligação de clorofila a/b, ribulose 1,5-bisfofato carboxilase, broto especifico, raiz especifica, quítinase, estrêsse induzível, vírus baciliforme do tungro de arroz, promotor de super planta, Ieucina aminopeptidase de batata, nitrato reductase, manopina sintese, nopalina sintase, ubiquitina, proteína zeína, e antocia- nina (úteis para expressão em células de planta); promotores animal e mamífero conhecidos pelo versado na técnica incluindo, mas não limitados a, região promotora SV40 inicial (SV40e), o promotor contido no terminal longo 3'repetido de inicial (LTR) do vírus de sarco- ma Rous (RSV), os promotores dos genes E1A ou promotor principal tardio (MP) de adeno- víruses (Ad), promotor inicial citomegalovírus (CMV), promotor timidina quinase (TK) do ví- rus herpes simplex (HVS), um promotor IE1 de baculovírus, um promotor de alongamento do fator de 1 alfa (EF1), um promotor fofoglicerato quinase (PGK), um promotor ubiquitina (Ubc), um promotor albumina, a seqüência regulatória do promotor de metalotioneína-L de camundongo e regiões de controle transcricional, os promotores ubíquos (HPRT, vimetina, α-actina, tubulina e semelhantes), os promotores de filamentos intermediários (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP, e semelhantes), os promotores de genes terapêuticos ( de MDR, CFTR ou tipo fator VIII, e semelhantes), promotores relacionados a patogêneses ou doença, e promotores que exibem tecidos específicos e tem sido utilizados em animais trangênicos, tais como a região de controle de gene de elastase I o qual é ativo em células acinares pancreáticas, região ativa de controle de gene de insulina em células beta pancreá- ticas, região ativa de controle de gene imunoglobulina em células linfóides, região ativa de controle de vírus de tumor mamário de camundongo em células testiculares, da mama, lin- fóides e mastócitos, gene albumina, regiões de controle ativa de Apo Al e Apo All em no fígado, região ativa de controle de gene alfa-fetoproteína no fígado, região ativa de controle de gene alfa 1-antitripsina no fígado, região ativa de controle de gene da beta-globina em células mielóides, região ativa de controle de gene de proteína básica de mielina em células oligodendrócitos no cérebro, região ativa de controle de gene da cadeia-2 leve de miosina em músculo esquelético, e região ativa de controle de gene de hormônio de liberação gona- dotrópico no hipotálamo, promotor de piruvato quinase, promotor vilina, promotor de ácido graxo ligador de proteína intestinal, promotor de α-actin de células do músculo liso, e seme- lhantes. Em adição, essas seqüências de expressão podem ser modificadas pela adição de aumentadores ou seqüências regulatórias e semelhantes.
Vetores podem ser introduzidos dentro das células hospedeiras desejadas pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão de células, DEAE1 dextran, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lisossomo), uso de arma genética, ou um transportador de vetor de DNA (ver, por exemplo Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963 (1992); Wu et al., J. BioI. Chem. 263:14621 (1998); e Hartmut et at., Pedido de Patente Canadense No. 2,012,311).
Um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser introduzido in vivo pela lipo- fecção. Na década passada, tem sido aumentado o uso de liposomos por encapsulação e transfecção de ácidos nucléicos in vitro. Lipídeos catiônicos sintéticos designados para limi- tar as dificuldades e perigos encontrados com transfeção mediada por Iipossomo podem ser usados para preparar Iipossomos para transfecção in vivo de um gene codificando um mar- cador (Felgner et al,. Proc, Natl, Acad, Sei. USA. 84:7413 (1997); Mackey et al,. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:8027 (1998); e Ulmer et al., Science 259:1745 (1993)). O uso de Iipideos cationicos podem promover encapsulação de ácidos nucléicos carregados negativamente, e também promover fusão com membranas de células carregadas negativamente (Felgner et al., Science 337:387 (1989)). Particularmente, compostos de lipídeos úteis e composições para transferência de ácidos nucléicos são descritas em W095/18863, W096/17823 e U.S. 5,459,127. O uso de lipofecção para introduzir genes externos em um órgão especifico in vivo tem certas vantagens práticas. Alvo molécular de liposomos para células especificas representa uma área de beneficio. É claro que transfecção direcionada para tipos de células específicas pode ser particularmente preferida em um tecido com heterogeneidade célular, tais como pâncreas, fígado, rim, e o cérebro. Lipídeos podem ser quimicamente acoplados a outras moléculas para o alvo proposto (Mackey et al., 1998, acima). Peptídeos alvo, por e- xemplo, hormônios ou neutransmissores, e proteínas tais como antibióticos, ou moléculas não peptídeos podem ser acoplados a lipossomos quimicamente. Outras moléculas são também úteis para facilitar transfecção do ácido nucléico in vivo, tal como oligopeptideo catiônico (por exemplo, W095/21931), peptídeos derivados de proteínas ligadas a DNA (por exemplo, W096/25508), ou polímeros catiônico (por exemplo, W095/21931).
Também é possível introduzir um vetor in vivo como um plasmídeo de DNA puro (ver Patente dos EUA Nos. 5,693,622, 5,589,466 e 5,580,859). Abordagens de distribuição de DNA mediado por receptor podem também se usadas (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147 (1992); e Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429 (1987)).
O termo "transfecção" refere-se a captação de RNA ou DNA exógeno ou heterólogo pela célula. Uma célula tem sido "transfectada" pelo RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando o tal RNA ou DNA tem sido introduzido dentro da célula. Uma célula tem sido "trans- fomada" RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando o RNA ou DNA transfectado efetua uma mudança fenotípica. O RNA ou DNA transformante pode ser integrado (ligado covalen- temente) ao DNA cromossomal mudando o genoma da célula.
"Transformação" refere-se a transferência de um fragmento ácido nucléico no ge- noma do organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organis- mos hospedeiros contendo fragmentos de ácidos nucléicos transformados são referidos a um organismo "transgênico" ou "recombinante" ou "transformado"
Além disso, o vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode incluir uma ou mais origens para replicação na célula hospedeira na qual sua amplificação ou sua expressão é procurada, marcadores ou marcadores selecio- nados.
O termo "marcador selecionado" refere-se a um fator de identificação, normalmente um gene de resistência a antibiótico ou químico, que é capaz de ser selecionado por base no efeito do gene do marcador, isto é, resistência a um antibiótico, resistência a um herbici- da, marcador colorimétrico, enzimas, marcadores fluorescente, e semelhantes, em que o efeito é usado para rastrear a herança do ácido nucléico de interesse e/ou para identificar uma célula ou organismo que tem herança de ácido nucléico de interesse. Exemplos genes de marcadores selecionáveis conhecidos e usados na técnica incluem: genes provendo re- sistência a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, herbidida biala- fos, sulfonamida, e semelhantes; e genes que são usados como marcadores fenotípicos, isto é, genes reguladores de antocianina, gene isopentanil transferase, e semelhantes.
O termo "gene repórter" refere-se a um ácido nucléico codificando um fator identifi- cador que é capaz de ser identificado baseado sob o efeito do gene repórter, em que o efei- to é usado para rastrear a hereditariedade do ácido nucléico de interesse, para identificar uma célula ou organismo que tem herança de ácido nucléico de interesse, e/ou mensurar a indução ou transcrição do gene de expressão. Exemplos de genes repórteres conhecidos e usados na técnica incluem: Iuciferase (Luc)1 proteína fluoresente verde (GFP)1 cloranfenicol acetiltransferase (CAT)1 β-galatosidadde (LacZ), β-glucuronidade (gus), e semelhantes. Ge- nes marcadores seletivos podem também ser considerados genes repórteres.
"Promotor" e "seqüência promotora" são usados de forma passível de mudança e referem-se a seqüência de DNA capaz de controlar a expressão de uma seqüência de RNA codificada ou funcional. Em geral, uma seqüência codificadora é localizada em 3' para uma seqüência promotora. Promotores podem ser derivados em sua totalidade a partir do gene nativo, ou ser composto de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encon- trados na natureza, ou ainda compreender segmentos de DNA sintético. É entendido por aqueles versados na técnica que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos diferentes ou tipos de célula, ou estágios diferentes do desenvolvimen- to, ou em resposta a condições diferentes ambientais ou fisiológicas. Promotores que cau- sam expressão de um gene na maioria de tipos de células na maioria das vezes são comu- mente referidos como "promotores constitutivos". Promotores que levam um gene a ser ex- presso em um tipo especifico de célula são comumente referido como "promotores específi- cos de célula" ou "promotores específicos de tecido". Promotores que levam um gene a ser expresso em um estágio específico de desenvolvimento ou diferenciação de célula são co- mumente referidos como "promotores específicos de desenvolvimento" ou "promotores es- pecíficos de diferenciação célular". Promotores que são induzidos e levam um gene a ser expresso seguindo exposição ou tratamento de célula com um agente, molécula biológica, química, ligante, leve, ou semelhantes que induzem o promotor são comumente referidas como "promotores induzíveis" ou "promotores reguláveis". É ainda reconhecido que como na maioria dos casos as fronteiras exatas de seqüências regulatórias não foram definidas completamente, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade de promotora idêntica.
A seqüência promotora é tipicamente delimitada por terminação 3' pelo sítio de ini- ciação de transcrição e extensão a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do basal. Dentro da seqüência promotora será encontrado o sítio da transcrição inicial (conve- nientemente definido, por exemplo, pelo mapeamento com nuclease S1), bem como com domínios de ligação de proteínas (seqüências consenso) responsáveis pela ligação da RNA polimerase.
"Promotor de troca terapêutico" ("TSP") refere-se ao promotor que controla expres- são de um componente de gene de troca. Gene de troca e seus vários componentes são descritos em detalhes em outro lugar deste documento. Em certas modalidades um TSP é constitutivo, isto é, continuamente ativo. Um TSP constitutivo pode ser tanto constitutivo- ubíquo (isto é, geralmente funciona, sem a necessidade de fatores adicionais ou regulado- res, em qualquer tecido ou célula) ou tecido constitutivo ou célula especifica (isto é, geral- mente funciona, sem a necessidade de fatores adicionais ou reguladores, em um tipo de tecido ou tipo de célula especifico). Em certas modalidade um TSP da invenção e ativado sob condições associadas com uma doença, distúrbio, ou condição. Em certas modalidades da invenção onde dois ou mais TSPs são envolvidos, os promotores podem ter uma combi- nação de promotores constitutivos ou ativáveis. Como aqui utilizado, um "promotor ativado sob condições associadas com um doença, distúrbio, ou condição" inclui, sem limitação, promotores de doença-especifico, promotores responssivos a condições fisiológicas, de de- senvolvimento, diferenciação, ou patológica particulares, promotores responssivos a molé- culas biológicas especificas, e promotores específicos para um tecido particular ou tipo de célula associado com a doença, distúrbio, ou condição, por exemplo, tecido de tumor ou célula maligna. TSPs podem ompreender a seqüência de promotores de occorência natural, seqüências modificadas derivadas de promotores occorência natural, ou seqüências sintéti- cas (por exemplo, inserção de um elemento resposta na seqüência promotora mínima para alterar a responssividade do promotor).
Uma seqüência codificante está "sob controle" das seqüências de controle transcri- cional ou traducional em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a seqüência codi- ficadora em m RNA, o que passa então por "splicing" trans-RNA (se a seqüência codificado- ra contém íntrons) e traduzida na proteína codificada pela seqüência codificadora.
"Seqüências de controle translacional e transcricional" refere-se a seqüência de DNA regulatório, tal como promotores, aumentadores, terminadores, e semelhantes, que prove para a expressão da seqüência codificada em célula hospedeira. Em células eucarió- ticas, sinais poliadenilação são seqüências de controle.
O termo "elemento de resposta" ("RE") refere-se a um ou mais elementos de DNA de atuação eis os quais conferem responssividade a um promotor mediata através da inte- ração com o domínio de ligação ao DNA do fator de transcrição. Este elemento de DNA po- de ser ou palindrômico (perfeito ou imperfeito) em sua seqüência ou composto de motivos de seqüências ou metade de sítios separados por uma variedade de número de nucleotídeo. Os meio sítios podem ser similares ou idênticos e arranjados como repetições ou diretas ou invertidas ou como um meio sitio único ou mutímeros de meio sítios adjacentes em conjunto. O elemento de resposta pode compreender um promotor mínimo isolado de organismos diferentes dependendo da natureza da célula ou organismo ao qual o elemento de resposta será incorporado. O domínio de deligação do DNA do fator de transcrição se liga, em pre- sença ou ausência de um ligante, à seqüência de DNA de um elemento de resposta para iniciar ou suprimir a transcrição do gene(s) a jusante sob a regulação do elemento de res- posta. Exemplos da seqüência de DNA para elementos de resposta do receptor de eedisone natural incluem: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (SEQ ID N0:1) (ver Cherbas et al., Genes Dev. 5:120 (1991)); AGGTCAN(n)AGGTCA, onde N(n) pode ser um ou mais espaçador nucleotí- deos (SEQ ID NO: 2) (ver D1Avino et al„ Mol. Ceil. Endocrinol. 113:1 (1995)); e GGGTTGAATGAATTT (SEQ ID NO: 3) (ver Antoniewski et a!., Mol. Cell Biol. 14:4465 (1994)).
"Promotor regulado por fator" ("FRP") refere-se a um promotor compreendendo pelo menos um elemento de resposta que é reconhecido pelo domínio de ligação de DNA de um fator de transcrição dependente de Iigante codificado pelo gene de troca da invenção.
Os termos "operacionalmente ligado", "operacionalmente associado", "através de associação operacional", e semelhantes referem-se a associação da seqüência de ácido nucléico em um fragmento de ácido nucléico único de forma que a função de um é afetada pela do outro. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma seqüência codificada quando ele é capaz de afetar a expressão da seqüência codiifcante (isto é, que a seqüência codificante está sob o controle transcricional do promotor). Seqüências codifican- tes podem se operacionalmente ligadas a seqüências regulatórias em orientação senso ou antisenso.
O termo "expressão" como aqui utilizado refere-se a transcrição e acúmuio estável de RNA senso (mRNA) ou antisenso derivado de um ácido nucléico ou polinucleotídeo. Ex- pressão pode referir-se a tradução do mRNA em uma proteína ou polipeptídeo.
O termo "cassete" "expressão cassete" e "gene de expressão cassete" refere-se a um segmento de DNA que pode ser inserido no ácido nucléico ou polonucleotídeo em sítios restritos específicos ou recombinação homóloga. O segmento de DNA ompreende um poli- nucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são designados para assegurar a inserção do cassete em estrutura de leitura apropriada para transcrição e tradução. "Cassete de transformação" refere-se a um vetor especifico compre- endendo um polonucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e tendo elementos em adição de polinucleotídeos que facilitem a transformação da célula hospedeira particular. Cassetes, expressão de cassetes, genes de expressão de cassetes e cassetes de transfor- mação da invenção pode também compreender elementos que permitam a expressão au- mentada de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de interesse na célula hospedeira.
Esses elementos podem incluir, mas não são limitados a: um promotor, um promotor míni- mo, um aumentador, um elemento de resposta, uma seqüência terminadora, uma seqüência de poliadenilação, e semelhantes.
Para os propósitos da invenção, o termo "gene de troca" refere-se a combinação de um elemento de resposta associado com um promotor, e um sistema de troca baseado em fator de transcrição dependente de ligante, em presença de um ou mais ligantes, modula a expressão de um gene no qual o elemento de resposta e promotor são incorporados.
O termo "baseado em receptor de ecdisone", com respeito ao gene de troca, refe- re-se ao gene de troca compreendendo pelo menos uma parte funcional de um domínio de ligação do receptor de ecdisone de ocorrência natural ou sintética e que regula o gene de expressão em resposta ao Iigante que liga ao domínio de ligação do Iigante do receptor de ecdisone.
Como aqui utilizado, os termos "bioreator" ou "dispositivo bioreator" incluem uma
célula ou células programadas pra secretar uma proteína terapêutica ou polinucleotídeo te- rapêutico. Em certas modalidade não limitantes, o bioreator compreende células modificas como aqui descrito. Em certas, mas não todas as modalidades, células bioreatoras podem ser "imunoisoladas". Células bioreatoras são consideradas "imunoisoladas" de um paciente quando a células são tratadas tal que as células, sob introdução ou implantação no pacien- te, são protegidas do sistema imune do paciente. Por exemplo, células bioreatoras imunoi- soladas podem estar contidas detro de um sistema de barreiras ao qual se permite dissemi- nação da referida proteína terapêutica ou polinucleotídeo terapêutico, mas que previne con- tato direto das células bioreatoras com células do sistema imune do paciente. Células imu- noisoladas podem ser, por exemplo, revestidas ou encapsuladas. Métodos de imunoisola- mento incluem mas não são limitados por células de cobertura conformai, microencapsula- ção onde células são suspensas em material biocompativel e separadas em massas esféri- cas, ou macroencapsulação, onde as células são fechadas em dispositivos compostos de polímeros naturais ou sintéticos que são usados para encerras as células. Os termos "modulado" e "modulados" significam induzir, reduzir ou inibir ácido nu-
cléico ou gene de expressão, resultando na respectiva indução, redução ou inibição de pro- dução de proteína ou polipeptídeo.
Os polinucleotídeos ou vetores de acordo com a invenção pode ainda compreender pelo menos um promotor adequado para direcionar a expressão de um gene em célula mo- dificada.
Aumentadores que podem ser usados em modalidades da invenção incluem, mas não limitam a: um aumentador SV40, um aumentador citomegalovírus (CMV), um aumenta- dor de fator de alongamento 1 (EF1), aumentadores de levedura, aumentadores de gene viral, e semelhantes.
Um "reg 3"' como aqui definido, é um elemento modulador de expressão situado em3' para a região codificadora de um gene ou transcrito. Tais elementos incluem, sem limita- ção: elementos de "splicing" codificados por transcrição primária, UTR a partir do transcrito processado, sinal de poliadenilação ou domínio de terminação de Transrição codificado por DNA.
Regiões de controle de terminação, isto é, seqüências nucleotídicas terminadoras
ou poliadenilação, podem também ser derivadas de vários genes nativos do hospedeiro pre- ferido. Opcionalmente, um sitio de terminação pode ser desnecessário, entretanto, é mais preferido se incluído. Em uma modalidade da invenção, a região de controle de terminação pode ser compreendida ou ser derivada de uma seqüência sintética, sinal de poliadenilação sintético, um sinal poliadenilação tardio SV40, um sinal poliadenilação SV40, sinal poliadeni- lação de hormônio de crescimento bovino (BGH)1 seqüências de terminadores virais, ou se- melhantes.
Os termos "seqüências não codificantes 3'" ou "região não traduzida 3' (UTR)" refe- rem-se a seqüência de DNA localizada a jusante (3') de uma seqüência codificante e pode compreender seqüências de reconhecimento de poliadenilação [poli(A)] e outros sinais re- gulatórios de seqüências codificantes capazes de afetar o processamento de mRNA ou ex- pressão gênica. O sinal de poliadenilação é normalmente caracterizado pelo efeito de adi- ção do trato ácido poliadenílico para a terminação 3' do mRNA precursor.
"Região regulatória" refere-se a seqüência de ácido nucléico que regula a expres- são de uma segunda seqüência de ácido nucléico. Uma região regulátória pode incluir se- qüências que são naturalmente responsáveis pela expressão de um ácido nucléico particu- lar (uma região homóloga) ou pode incluir seqüências de origens diferentes que são respon- sáveis pela expressão de proteínas diferentes ou mesmo proteínas sintéticas (uma região heteróloga). Em particular, as seqüências podem ser seqüências de genes procarióticos, eucarióticos ou virais ou seqüências derivadas que estimulam ou reprimem a transcrição de um gene de uma maneira especifica ou não especifica e de uma maneira induzível ou não induzível. Regiões regulatórias incluem origens de replicação, sítios de junção de RNA1 promotores, aumentadores, seqüências de terminação transcricional, e seqüências de sinal que direcionam o polipeptídio no caminho secretório da célula alvo.
Uma região regulatória a partir da "origem heteróloga" refere-se a uma região regu- latória que não é associada naturalmente com a expressão de ácido nucléico. Incluído entre as regiões regulatórias heterólogas estão regiões de diferentes espécies, regiões regulató- rias de um gene diferente, seqüências regulatórias híbridas, e seqüências regulatórias que não ocorrem na natureza, mas que são designadas por por um versasdo na técnica.
"Transcrição de RNA" refere-se ao produto resultante dA polimerase de uma se- qüência de DNA. Quando o RNA transcrito é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, é referido como transcrito primário ou ele pode ser uma seqüência de RNA deriva- da de um processamento pós-transcricional do transcrito primário e é referido como RNA maduro. "RNA menssageiro (nRNA)" refere-se ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" refere-se a DNA de fita dupa que é complementar ao e derivado do mRNA. RNA "senso" refere-se ao RNA transcrito que inclui o mRNA e en- tão pode ser traduzido em proteína pela célula. "RNA antisenso" refere-se ao RNA transcrito que é complementar a todo ou parte do transcrito primário alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão do gene alvo. A complementaridade do RNA antisenso pode ser com qualquer parte do gene especifico transcrito, isto é, a seqüência não codificante 5', seqüência não codificante 3', ou a seqüência codificante. "RNA funcional" refere-se ao RNA antisenso, RNA ribozima, ou outro RNA que não é traduzido ainda tendo um efeito no processo célula.
"Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" sao usados de forma passível de mudança e referem-se ao composto polimérico compreendido de resíduos aminoácidos ligados covalen- temente.
Um "polipeptídeo isolado", "peptídeo isolado" ou "proteína isolada" referem-se a um polipeptídeo ou proteína que é substancialmente livre dos compostos que são normalmente associados com eles em seus estados naturais (por exemplo, outras proteínas ou polipeptí- deos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídios). "Isolado" não significa excluir misturas artifici- ais ou sintéticas com outros compostos, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade biológica, e que podem estar presentes, por exemplo, devido a purificação completa, adição de estabilizadores, ou compondo uma preparação farmacêutica aceitável.
Um "polipeptídio de substituição mutante" ou uma "substituição mutante" será en- tendido para significar um polipeptídio mutante compreendendo uma substituição de pelo menos um tipo aminoácido selvagem ou de ocorrência natural com um aminoácido difere- num relativo aminoácidodiferente do tte reltivo ao polipeptídeo selvagem ou de ocorrência natural. Um polipeptídio de substituição mutante pode compreender somente ums substitui- ção de aminoácido selvagem ou de ocorrência natural e pode ser referido como um polipep- tídeo "ponto mutante" ou um "ponto mutante único". Alternativamente, uma polipeptídio de substituição mutante pode compreender uma substituição de dois ou mais aminoácidos de ocorr com dois ou maicia selvagem ou de ocorrência natural com dois ou mais aminoácidos relativos ao polipeptídeo selcagem ou de ocorrência natural. De acordo com a invenção, um polipeptídeo de domínio de ligação de Iigante do receptor nuclear do Grupo H compreen- dendo uma substituição de mutação compreende uma substituição de pelo menos um ami- noácido selvagem ou ocorrência natural com um aminoácido diferente relativo ao polipeptí- deo de domínio de ligação de Iigante do receptor nuclear do Grupo H selvagem ou de ocor- rência natural.
Quando o polipeptídeo de substituição mutante compreende uma substituição de dois ou mais aminoácidos selvagens ou de ocorrência natural, essa substituição pode com- preender também um numero equivalente de aminoácidos selvagens ou de ocorrência natu- ral deletados para a substituição, isto é, aminoácidos selvagens ou de ocorrência natural substituídos com 2 aminoácidos não selvagens ou não de ocorrência natural, ou um núme- ro não equivalente de aminoácidos selvagens deletados para a substituição, isto é, 2 amino- ácidos selvagens substituídos com 1 aminoácido não selvagem (um substituição + deleção de mutação), ou 2 aminoácidos selvagens substituídos com 3 aminoácidos não selvagens (uma substituição + inserção de mutação). Substituição mutantes podes ser descritas usando um sistema de nomenclatura a- breviada para indicar o resíduo de aminoácido e número substituído dentro da seqüência de polipeptídio referente e o novo resíduo de aminoácido substituído. Por exemplo, uma substi- tuição mutante na qual o vigésimo (20°) resíduo de aminoácido de um polipeptídio é substi- tuído pode se abreviado como ux20z", onde "x"é o aminoácido a ser substituído. "20"é a po- sição do resíduo do aminoácido ou número dentro do polipeptídio, e"z"éo novo aminoácido substituído. Entretanto, uma substituição mutante abreviada de forma passível de mudança como "E20A" ou "Glu20Ala" indica que o mutante compreende um resíduo alanina (comu- mente abreviado na técnica como "AnOU "Ala") em lugar do ácido glutâmico (comumente abreviado na técnica como "E"ou "Glu") na posição 20 do polipeptídio.
Uma substituição de mutação pode ser feita por qualquer técnica para mutagênese conhecida na técnica, incluindo mas não Iimitanda a, mutagênese em sitio direcionado in vitro (Hutchinson et al„ J. Biol. Chem. 253:6551 (1978); Zoller ET AL., DNA 3:479 (1984); Oliphant ETAL., Gene 44:177 (1986); Hutchinson ETAL., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:710 (1986), uso de Iigadores TAB® (Pharmacia), digestão de enconuclease de restrição/deleção e substitução de fragmento, mutagêneses direcionada por oligonucleotídeo/mediada por PCR e semelhantes. Técnicas baseadas em PCR são preferidas para sitio de mutagênese sítio-direcionada (ver Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", em PCR Technology: Principies and Applications por DNA Amplification, H. Erlich, Ed., Stockton Press, Capitulo 6, PP. 61-70).
O termo "fragmento", como aplicado a um polipeptídio, refere-se a um polipeptídio cuja seqüência de aminoácida é mais curta que a do polipeptídio de referência e que com- preende, sobre toda a porção com esse polipeptídio de referência, uma seqüência de ami- noácido idêntica. Tais fragmentos podem, onde apropriado, ser inclusos em um grande poli- peptídio do qual eles são parte. Tais fragmentos de polipeptídio de acordo com a invenção pode ter um comprimento de pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 28, 29, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, ou 300 ou mais aminoácidos.
Uma "variante"de um polipeptídio ou proteína refere-se a qualquer análogo, frag- mento, derivado, ou mutante que é derivado do polipeptídio ou proteína e que retém pelo menos uma propriedade biológica do polipeptídio ou proteína. Diferentes variantes de poli- peptídio ou proteína podem existir na natureza. Essas variantes podem ter variações aléli- cas caracterizadas pelas diferenças na seqüência de nucleotídeo do gene estrutural codifi- cado para a proteína ou pode envolver "splicing" diferencial ou modificação pós-tradução. Um versado na técnica pode produzir variantes tendo substituição, deleção, adição, ou substituição única ou múltipla de aminoácidos. Essas variante podem incluir, entre outras coisas: (a) variantes em que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos com amionácidos conservados ou não conservados, (b) variantes em que um ou mais aminoáci- dos são adicionados ao polipeptídio ou proteína, (c) variantes em que um ou mais aminoáci- dos incluem um grupo substituto, e (d) variantes em que o polipeptídio ou proteína é fusio- nado com outro polipeptídio tal como albumina sérica. As técnicas para obter essas varian- tes, incluem técnicas genéticas (supressão, deleção, mutação etc), químicas, e enzimáti- cas, são conhecidas por pessoas versadas na técnica. Em uma modalidade, uma variante de polipeptídio compreende pelo menos 14 aminoácidos.
O termo "homologia"refere-se a porcentagem de identidade entre dois polinucleotí- deos ou duas frações de polinucleotídeos. A correspondência entre a seqüência de de uma fração para outra pode ser determinada por ténicas conhecidas na arte. Por exemplo, homo- logia pode ser determinada por uma comparação direta de informação de seqüência entre duas moléculas de polipeptídio pelo alinhamento das informações da seqüências e usando programas de computadores facilmente disponíveis. Alternativamente, homologia pode ser determinada pela hibridização de polinucleotídeos sob condições que formam duplexes es- táveis entre regiões homologas, seguido pela digestão com nucleases de fita simples espe- cifica e determinação do tamanho de fragmentos digeridos.
Como aqui utilizado, o termo "homologo" e todas suas formas gramaticais e varia- ções de escrita referem-se a relação entre proteínas que possuem um "origem evolucionária comum", incluindo proteínas de superfamílias (por exemplo, a superfamília da imunoglobuli- na) e proteínas homólogas de espécies diferentes (por exemplo, cadeia leve de miosina, etc.) (Reeck ET AL., Call 50:667 (1987)). Tais proteínas (e seus genes codificantes) têm homologia sequêncial, como refletida pelo alto grau de similaridade de seqüência. Entretan- do, em uso comum e no presente pedido, o termo "homologo" quando modificado com um advérbio tal como "altamente", pode referir a similaridade de seqüência e não uma origem evolucionaria comum.
De acordo com isso, o termo "similaridade da seqüência" e todas suas formas gra- maticais referem-se ao grau de identidade ou correspondência entre seqüências de ácido nucléico ou seqüências de aminoácidos de proteínas que podem ou não podem dividir uma origem evolucinaria comum (ver Reeck ET AL., Cell 50:667 (1987)). Em uma modalidade, duas seqüências de DNA são "substancialmente homólogas" ou "substancialmente simila- res" quando pelo menos cerca de 50% (por exemplo, pelo menos cerca de 75%, 90% ou 95%) dos nucleotídeos combinam ao longo do comprimento definido das seqüências de DNA. Seqüências que são substancilamente homólogas podem ser identificadas pela com- paração de seqüências usando programa padrão disponível em bancos de dados de se- qüência, ou em experimento de hibridização do Southern sob, por exemplo, condições seve- ras como definidas por sistemas particulares. Definição de condições de hibridização apro- priadas está dentro da habilidade de técnica (ver por exemplo Sambrook ET AL., 1989, aci- ma). Como aqui utilizado, "substancialmente similar" refere-se a fragmentos de ácidos nucléicos onde mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos resultam em substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codifi- cada pela seqüência de DNA. "Substancialmente similar" também refere-se a fragmentos de ácidos nucléicos onde mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a ha- bilidade do fragmento de ácido nucléico em mediar a alteração do gene expressão pelo anti- senso ou tecnologia de co-supressão. "Substancialmente similar"também se refere a modifi- cações dos fragmentos de ácidos nucléicos da presente invenção tais que deleção ou inser- ção de uma ou mais bases nucleotídicas que não afetam substancialmente as propriedade funcionais do do trasncrito resultante. É assim entendido que a invenção compreende mais que uma seqüência exemplar especifica. Cada uma das modificações propostas está bem dentro da rotina de um versado na técnica, como é determinação da retenção da atividade biológica de produtos codificado.
Alem disso, o versado na técnica reconhece que seqüências substancialmente si- milares compreendidas por essa invenção também são definidas por suas habilidades de hibridizar, sob condições severas (0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C e lavadas com 2X SSC, 0,1% SDS seguido por 0,1X SSC, 0,1% SDS), com as seqüências exemplificadas aqui. Fragmen- tos de ácidos nucléicos substancialmente similar na presente invenção sãoaqueles frag- mentos de ácidos nucléicos cujas seqüências de DNA são pelo menos cerca de 70%, 80%, 90% ou 95% idênticas a seqüência de DNA dos fragmentos de ácidos nucléicos relatados aqui.
Duas seqüências de aminoácidos são "substancialmente homólogas" ou "substan- cialmente similires" quando mais que aproximadamente 40% de aminoácidos são idênticos, ou mais que 60% são similares (funcionamente idênticos). Preferencialmente, as seqüências similares ou homólogas são identificadas pelo alinhamento usando, por exemplo, o progra- ma de colisão GCG (Grupo de Computadores Genéticos, Programa Manual para o pacote de GCG, versão 7, Madison, Wisconsin).
O termo "correspondendo a" é usado aqui para referir a seqüências similares ou homólogas, se a posição exata é idêntica ou diferente da molécula a qual a similaridade ou homologia é medida. Um alinhamento de seqüência de ácido nucléico ou aminoácido pode incluir espaços. Então, o termo "correspodendo a" refere-se a similaridade da seqüência, e não a numeração do resíduos de aminoácido ou bases nucleotídicas.
Uma "porção substancial" de uma seqüência aminoácida ou de nucleotídeo com- preende o suficiente da seqüência de aminoácidos de um polipeptídio ou seqüência de nu- cleotídeo de um gene para pontualmente identificar este polipeptídio ou gene, ou por avalia- ção manual da seqüência por um versado na técnica, ou comparação de seqüência por computadores automatizados e identificação usando algoritmos tais como BLAST (Ferra- menta de Pesquisa Alinhada a Base Local; Altschul ET AL., J. Mol. Biol. 215:403 (1993)); disponível em ncbi.nih.gov/BLAST/). Em geral, uma seqüência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos é necessária para identificar presumivelmente uma seqüência de polipeptídio ou de ácido nucléico como homóloga para uma proteína conheci- da ou gene. Além disso, com respeito às seqüências de nucleotídeos, padrões oligonucleo- tídicos gene-específicos compreendendo 20-30 nucleotídeo contíguos podem ser usados em métodos de sequência-dependente de identificação de gene (por exemplo, hibridização Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização de colônias bactériais ou placas de bac- teriófagos in situ). Além disso, oligonucleotídeos curtos de 12-15 bases podem ser usados como iniciadores de amplificação em PCR a fim de obter um fragmento de ácido nucléico particular compreendendo os iniciadores. De acordo com isso, um "porção substancial" de seqüências de nucleotídeos compreende suficiente da seqüência para identificar especifi- camente e/ou isolar um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência.
O termo "porcentagem da identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais seqüências de polipeptídios ou duas ou mais seqüências de polinucleo- tídeos, como determinado pela comparação da seqüência. Na técnica, "identidade" também significa o grau de seqüência relacionada entre seqüências de polipeptídio ou polinucleotí- deos, como o caso pode ser, como determinado pela combinação entre séries de tais se- qüências. "Identidade"e "similaridade"podem ser prontamente calculadas por métodos co- nhecidos, incluindo mas não limitados àqueles descritos em: Computational Molécular Bio- logy (Lesk, A. M., Ed) Oxford University Press, Nova lorque (1998); Biocomputing: Informa- tics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic Press, Nova Iorque (1993); Com- puter Analisis of Sequence Data, Part I (Griffin1 A. M., e Griffin, H. G., Eds.) Humana Press, Nova Jersey (1994); Sequence Analysis in Molécular Biology (Von Heinje, G., Ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, Μ. E Devereux, J., Eds) Stockton Press, Nova Iorque (1991). Métodos preferidos para determinar identidade são desingados para dar a melhor combinação entre as seqüências testes. Métodos para determinar identi- dade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis publicamen- te. Seqüências alinhadas e cálculos de porcentagem de identidade podem ser feitos usando programa de análise de seqüência tal como programa de bioinformática adequado para computador Megalign do LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Alinhamento múltiplo de seqüências podem ser feitos usando o método Clustal de alinhamento (Higgins ET AL., CABIOS. 5:151 (1989)) com os parâmetros padrões (Penalidade de Espaço=10, penalidade de comprimento e espaço= 10). Parâmetros padrões de alinhamento em pares usando o método Clustal podem ser selecionados: KTUPLE 1, PENALIDADE ESPAÇO=3, JANELA=5 e DIAGNÓSTIVOS SALVOS=5.
O termo "programa de analise de seqüência" refere-se a qualquer algoritmo de computador ou software de programa que é útil para análise de seqüências de nucleotídeo ou de aminoácidos. "Programa de analise de seqüência" pode se comercialmente disponível ou independentemente desenvolvido. Programa de análise de seqüência típico inclui, mas não é limitado a, programas adequados GCG (Wiscosin package Version 9,0, Genetics ComputerGroup (GCG), Madison, Wl), BLASTP, BLASTN, BLASTX (altshul ETAL., J, Mol, Biol. 215:403 (1990)), e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, Wl 53715 USA). Dentro do contexto deste pedido será entendido que onde o programa de análise de seqüência é usado para analise, os resultados da analise serão baseados nos "valores pa- drões" do programa de referência, a menos que especificado de outra forma. Como aqui utilizado "valores padrões" significarão qualquer grupo de valores ou parâmetros que origi- nalmente carreguem com o programa quando primeiro inicializado.
"Sintetizado quimicamente", como relatado a uma seqüência do DNA, significa que os componentes nucleotídeos foram reunidos in vitro. Síntese química manual de DNA pode ser realizada usando procedimentos bem estabelecidos, ou síntese química automatizada pose ser feita usando um de um numero de aparelhos disponíveis comercialmente. De a- cordo com isso, os genes podem ser customizados por uma expressão gênica ótima basea- do na otimização da seqüência de nucleotídeos para refletir o códon induzido da célula hos- pedeira. O versado na técnica aprecia a probabilidade do sucesso do gene expressão se o códon usado é tendencioso naqueles códons favorecidos pelo hopedeiro. Determinação dos códons preferidos pode ser baseada na pesquisa de genes derivados da célula hospederia onde informação da seqüência está disponível.
Como aqui utilizado, dois ou mais sistemas de regulação de genes operáveis indivi- dualmente são referido serem "ortogonais"quando; a) modulação de cada sistema dado pelo seu respectivo ligante, na concentração escolhida, resulta em uma mudança mensurável da magnitude da expressão do gene do sistema, e b) a mudança é estatisticamente significante diferente da mudança na expressão de todos os outros sistemas simultaneamente operáveis na célula, tecido, ou organismo, dependentemente da simultaneidade ou sequêncialidade da atual modulação. Preferivelmente, modulação de cada sistema de regulação de gene opera- cionável individualmente efetua uma mudança na expressão gênica de pelo menos 2 vezes mais que todos outros sistemas operacionáveis na célula, tecido, ou organismo, por exem- plo, pelo menos 5 vezes, 10 vezes, 100 vezes, ou 500 vezes mais. Idealmente, modulação de cada dado sistema pela seus respectivos Iigantes na concentração escolhida resulta em mudanças mensuráveis na magnitude da expressão do gene deste sistema e mudança não mensurável na expressão de todos os outros sistemas operacionáveis na célula, tecido, ou organismo. Em tais casos de sistema de regulação de gene induzível múltiplo é dito ser "completamente ortogonal". A presente invenção e útil para pesquisa por Iigantes ortogonais e sistemas de gene expressão baseados no receptor ortogonal tais como aqueles descritos em EUA 2002/0110861 A1, que é incorporado aqui pela referencia no sua totalidade.
O termo "gene exógeno"significa um gene estranho ao paciente, que é, um gene que é introduzido no paciente através do processo de transformação, uma versão imutável de um gene endógeno mutável ou versão mutável do gene endógeno imutável. O método de transformação não é critico nesta invenção e pode ser qualquer método adequado para o paciente conhecido na técnica. Genes exógenos podem ser ou genes naturais ou sintéticos que são introduzidos no paciente na forma do DNA ou RNA que podem funcionar através do DNA intermediário tal como pela transcriptase reversa. Tais genes podem ser introduzidos na célula alvo, diretamente introduzidos no paciente, ou indiretamente introduzidos pela tranferência de células transformadas no paciente.
Os termos "produto terapêutico" e "molécula terapêutica" como aqui utilizados refe- rem-se a um polipeptídeo terapêutico ("TP", codificado por uma "seqüência de proteínas terapêuticas" ("TPSQ")) ou polinucleotídeo terapêutico que transmite uma função benéfica do paciente a ser tratado. Polipeptídeos terapêuticos podem incluir, sem limitação, peptí- deos tão pequenos quanto três aminoácidos em comprimento, proteínas em cadeia única ou múltipla, e proteínas de fusão. Polinucleotídeos terapêuticos podem incluir, sem limitação, oliginucleotídeos antisenso, RNAs de pequenas interferências, ribozimas, e seqüência guia de RNA externo. Exemplos não Iimitantes de produtos terapêuticos são revelados aqui em outro lugar. O produto terapêutico pode compreender uma seqüência de ocorrência natural, uma seqüência sintética ou combinação de seqüências sintéticas e naturais.
O termo "complexo de fator de transcrição dependente de ligante" ou "LDTFC" refe- re-se ao fator de transcrição compreendendo uma ou mãos subunidades de proteína, na qual o complexo pode regular a expressão gênica dirigida pelo "promotor regulado por fator" como definido aqui. Um modelo LDTFC é um "complexo do receptor de ecdisone" geramen- te refere-se a um complexo de proteína heterodimérica tendo pelo menos dois membros de uma família de receptor nuclear, receptor de ecdisone ("EcR") e proteínas "ultraspiracle" ("USP") (ver Yao ET AL., Nature 366:476 (1993)); Yao ET AL., Cell 71:63 (1992). Um LDTFC funcional tal como um complexo EcR pode também incluir proteína(s) adicional(is) tal como imunofilinas. Membros adicionais da família de receptores nucleares de proteínas, conhecidos como fatores transcricíonais (tais como DHR38, betaFTZ-1 ou outros homólogos de insetos), podem também ser parceiros dependente ou independentes de Iigantes para EcR e/ou USP. Um LDTFC tal como um complexo EcR pode também ser um heterodímero da proteína EcR e o homólogo vertebrado da proteína "ultraspiracle", proteína do receptor-X- do ácido retinoico("RXR") ou quimera do USP e RXR. O s termos "LDTFC" e "complexo ErC" também compreendem complexos homodímeros da proteína EcR ou USP, bem como poli- peptídeos únicos ou trimeros, tetrâmeros, e outro multimeros servindo à mesma função.
Um LDTFC tal como um complexo EcR pode ser ativado por uma ecdisteróide ativo ou ligante não esteroidat ligado a uma das proteínas do complexo, inclusive de EcR1 mas não excluindo outras proteínas do complexo. Como aqui utilizado, o termo "ligante" como aplicado a gene de troca baseado em LDTFC, por exemplo, complexo EcD baseado no ge- ne de troca, descreve moléculas pequenas e solúveis tendo capacidade de ativar um gene de troca para estimular a expressão se um polipeptídeo aqui codificado. Exemplos de ligan- tes incluem, sem limitação, um ecdisteróide, tal como ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponas- terona A, muristerona A, e semelhantes, ácido 9-cis-retinóico, análogos sintéticos de ácidos retinóicos, N, N'-diacilidrazinas tais como aquelas colocadas na Patente dos EUA Nos. 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; e 5,378,726 e Publicação do Pedido de Patente dos EUA Nos. 2005/0209283 e 2006/0020146; oxadiazolinas como descritos no Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. 2004/0171651; dibenzilalquil cianoidrazinas tais como aquelas re- veladas no Pedido Europeu No. 461,809; N-alquil-N,N'-diaroilidrazinas tais como as revela- das na Patente Dos EUA No. 5,225,443; N-acil-N-alquilcarbonilidrazinas tais como as reve- ladas no Pedido Europeu No. 234,994; N-aroil-N-alquil-N'-aroilidrazinas tais como as descri- tas na Patente dos EUA No. 4,985,461; amidocetonas tais como as descritas no Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. 2004/0049037 ; cada qual é incorporada aqui por refe- rência e outros materiais similares incluindo 3,5-di-terc-butil-4-hidróxi-N-isobutil-benzamida, 8-O-acetilarpagida, oxiesteróies, 22(R) hidroxicolesterol, 24(S) hidroxicolesterol, 25- epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS), 7-cetocolesterol- 3-sulfato, famesol, ácidos biliares, ésteres 1,1-bifosfonato, hormônio juvenil III, e semelhan- tes. Exemplos de Iigantes diacilidrazina úteis na presente invenção incluem RG-115819 (N- (1-etil-2,2-dimetil-propil)-N'-(2-metil-3-metóxi-benzoil)-hidrazida ácido 3,5-Dimetil-benzóico), RG-115932 (N-(1-terc-butil-butyl)-N'-(2-etil-3-metóxi-benzoil)-hidrazida do ácido ((R)-3,5- dimetil-benzóico), e RG115830 (N-(1-terc-butil-butil)-N'-(2-etil-3-metóxi-benzoil)-hidrazida do ácido 3,5-dimetil-benzóico). Veja, exemplo, Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. Serial 12/155,111, e Pedido PCT No. PCT/US2008/006757, ambas as quais são incorpora- das aqui por referência em sua totalidade.
Um LDTFC tal como um complexo EcR inclui proteínas que são membros da super- família de receptor nuclear onde todos os membros sãoo caracterizados pela presença de uma ou mais subunidades polipeptídicas compreendendo um domínio de transativação ami- no terminal ("AD," "TD," ou "TA,"usados aqui de forma passível de mudança), um domínio de ligação de DNA ("DBD"), e um domínio de ligação de ligante ("LBD"). O AD pode estar pre- sente como uma fusão com um "parceiro de heterodimerização" ou "HP". Uma proteína de fusão compreendendo um AD e um HP da invenção é referida aqui como "proteína de co- ativação'!ou "CAP". O BDB e LBD podem ser expressados como uma proteína de fusão, aqui referida como um "fator de transcrição induzível por ligante ("LTF"). Os parceiros de fusão podem ser separados por um ligador, exemplo, uma região de dobradiça. Alguns membros da família LTF podem ter também outro domínio de transativação pelo lado do carbóxi-terminal do LBD. O DBD é caracterizado pela presença de duas imrpessões de zin- co-cisteína entre as quais existem dois motivos aminoácido, o P-box e o D-box, que confe- rem especificidade para os elementos de resposta ecdisona. Estes domínios podem ser tan- to nativos, modificados ou quimeras de diferentes domínios de receptores de proteínas hete- rólogos.
As seqüências de DNA que compõem o gene exógeno, o elemento de resposta, e o LDTFC, por exemplo, o complexo EcR, podem ser incorporadas em arqueobactérias, célu- las procarióticas tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis, ou outras enterobactérias, ou células eucarióticas tais como células de plantas ou animais. No entanto, já que muitas pro- teínas expressadas pelo gene sao processadas incorretamente em bactérias, células euca- rióticas sãp preferidas. As células podem ser na forma de células únicas ou organismos mul- ti-celulares. As seqüências de nucleotídeos do gene exógeno, do elemento de resposta, e do complexo receptor podem também ser incorporadas como moléculas de RNA, de prefe- rência na forma de RNAs virais funcionais tais como vírus mosáico do tabaco. Das células eucarióticas, células de vertebrados são preferíveis porque elas naturalmente não apresen- tam as moléculas que conferem respostas aos Iigantes desta invenção para o EcR. Como resultado, elas são "substancialmente insensíveis"aos Iigantes desta invenção. Portanto, os Iigantes úteis nesta invenção terão efeitos fisiológicos negligíveis ou outros efeitos nas célu- las transformadas, ou no organismo inteiro. Assim, as células podem crescer e expressar o produto desejado, substancialmente não afetadas pela presença do Iigante em si.
O termo "paciente" significa um inseto intacto, planta ou animal. Também é anteci- pado que os Iigantes funcionarao igualmente bem quando o paciente for fungo ou levedura. Quando o paciente é um animal intacto, preferivelmente o animal é um vertebrado, mais preferivelmente um mamífero.
Ligantes EcR, quando usados com um LDTFC, por exemplo, um complexo EcR, que por sua vez está ligado ao elemento de resposta ligado ao gene exógeno (por exemplo, um gene repórter), provê meios para regulação temporal externa da expressão do gene e- xógeno. A ordem na qual os vários componentes se ligam uns aos outros, isto é, Iigante pa- ra complexo receptor e complexo receptor ao elemento resposta não é critico. Tipicamente, a modulação da expressão do gene exógeno é em resposta a ligação de um LDTFC, por exemplo, um complexo EcR, para um controle específico, oo regulatório do elemento DNA. A proteína EcR1 como outros membros da família de receptor nuclear, possuem pelo menos três domínios, um AD, DBD e um LBD. Este receptor, como um subgrupo da família de re- ceptores nucleares, também possui menos regiões bem definidas responsáveis pelas pro- priedades de heterodimerização (referidas aqui como "parceiros de heterodimerização" ou ΉΡ"). A ligação do Iigante ao domínio de ligação do Iigante de um LTF1 por exemplo, uma proteína EcR1 depois de heterodimerização com um CAP incluindo, por exemplo, um AD e/ou um HP1 por exemplo, uma proteína USP ou RXR1 habilita o domínio de ligação DNA das proteínas heterodiméricas para se ligar ao elemento resposta em uma forma ativada, resultando em expressão ou supressão do gene exógeno. Este mecanismo nao exclui o potencial de ligações de Iigantes a subunidades individuais, por exemplo, LTF ou CAP, por exemplo, um EcR ou USP1 e a formação resultante de complexos homodímeros ativos (por exemplo, EcR+EcR ou USP+USP). Em uma modalidade, um ou mais dos domínios recepto- res podem ser variados, produzindo um gene de troca quimérico. Tipicamente, um ou mais dos três domínios podem ser escolhidos de uma fonte diferente da fonte dos outros domí- nios, de forma que, o receptor quimérico é otimizado na célula ou organismo hospedeiro escolhido, para atividade de transativação, ligação complementar do ligante, e reconheci- mento de um elemento de resposta especifico. Em adição, o elemento de resposta por si, pode ser modificado ou substituído por elementos de resposta para outros domínios de pro- teína de ligação DNA, tais como, a proteína GAL-4 de levedura (ver Sadowski et al., Nature .335:563 (1998) ou proteína LexA de E. coli (ver Brent et al., Cell 43:729 (1985)) para aco- modar LDTFCs quimérico, por exemplo, complexos EcR. Outra vantagem de sistemas qui- méricos é que eles permitem a escolha de um promotor usado para direcionar o gene exó- geno de acordo com o resultado final esperado. Esse controle duplo pode ser particularmen- te importante nas áreas de terapia gênica, especialmente quando proteínas citotóxicas são produzidas, porque tanto o tempo de expressão quanto as células onde a expressão ocorre podem ser controlados. Quando genes exógenos, ligados operacionalmente a um promotor adequado, são introduzidos em células do paciente, a expressão dos genes exógenos é controlada pela presença de Iigantes desta invenção. Promotores podem ser constitutiva- mente ou induzivamente regulados ou podem ser específicos de um tecido (isto é, expres- sos somente em um tipo de célula) ou específicos de certos estágios de desenvolvimente do organismo.
Numerosas seqüências genômicas e de ácido nucléico cDNA codificando para uma variedade de polipeptídeos, tais como fatores de transcrição e genes repórteres, são bem conhecidos na técnica. Aqueles versados na técnica têm acesso as informações de sequên- cias de ácidos nucléicos para virtualmente todos os genes conhecidos e podem tanto obter a molécula de ácido nucléico diretamente de um depósito publico, a instituição que publicou a seqüência, ou utilizar de métodos de rotina para preparar a molécula.
Para uso in vivo, os Iigantes descritos aqui podem ser colocados em veículos far- maceuticamente aceitáveis, tais como, por exemplo, soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pomadas, elixires, e composições injetáveis. Composições farmacêuticas podem conter entre 0.01% a 99% do ligante por peso. Composições podem ser tanto em forma de dose única ou múltiplas. A quantidade de ligante em qualquer composição farmacêutica par- ticular irá depender da dose efetiva, isto é, a dose requerida para elicitar a expressão ou supressão do gene desejada.
Vias adequadas de administração de preparações farmacêuticas, incluem oral, re- tal, tópica (incluindo dérmica, bucal e sublingual), vaginal, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal e epidural) e por tubo naso-gastrico. Será entendido por aqueles versados na técnica que a via de administração preferida irá depen- der da condição sob tratamento e pode variar devido a fatores como a condiçãodo recipien- te.
Uma modalidade da invenção compreende métodos de tratamento, melhora ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição em um paciente, compreendendo:
(a) Introdução em células do referido paciente de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que a referida seqüência de fator de transcrição pelo menos codifica um complexo de fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutico, em que o promotor é ativado durante a referida doença, dis- túrbio ou condição, e (2) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou poli- nucleotídeo terapêutico ligado a um promotor que é ativado pelo referido complexo de fator de transcrição depende de ligante, e
(b) administração do ligante ao referido paciente para induzir a expressão do referi- do polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico;
Onde o referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é expresso em nível suficiente para tratar, melhorar ou prevenir a referida doença, distúrbio ou condi- ção.
Uma modalidade da invenção compreende métodos de tratamento, melhora ou prevenção de doenças, distúrbio ou condições em um paciente, compreendendo:
(a) introdução em um paciente de (1) um primeiro nucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um comple- xo de fator de transcrição dependente de ligante através de associação operacional com um promotor de troca terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídeo codificando um polipeptí- deo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico operacionalmente associado a um promotor regulado por fator que é ativado pelo referido complexo de fator de transcrição dependente de ligante, em que os referidos primeiro e segundo polinucleotídeos são introduzidos de forma a permitir a expressão de dado complexo de fator de transcrição dependente de ligante; e
(b) administração de ligante ao referido paciente para induzir a expressão do referi- do polipeptídeo terapêutico e polinucleotídeo terapêutico. Uma modalidade da invenção compreende métodos de expressar um poiipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em um paciente, compreendendo:
(a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreende pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos um seqüência de fator de transcrição codifica um complexo de fator de transcrição dependente de ligante através da associação operacionável com um promotor de troca terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídeo codificando o referido poii- peptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico operacionalmente associado a um pro- motor regulado por fator que é ativado por um complexo de fator de transcrição dependente de ligante, em que o referido primeiro e segundo polinucleotídeos são introduzidos de forma a permitir a expressão do referido complexo de fator de transcrição dependente de ligante; e
(b) administração de ligantes para o referido paciente para induzir a expressão de dado poiipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
Em certas modalidades, o promotor de troca terapêutico descrito nos métodos é constitutivo. Em certas modalidades, o promotor de troca terapêutico é ativado sob condi- ções associadas com doenças, distúrbio ou condições, por exemplo, o promotor é ativado em resposta a uma doença, em resposta a uma condição fisiologica, de desenvolvimento, de diferenciação ou patológica, e/ou em resposta a uma ou mais moléculas biológicas es- pecificas; e/ou o promotor é ativado em tipos particulares de tecido ou célula. Em certas modalidades, a doença, distúrbio ou condição responde ao poiipeptídeo terapêutico ou poli- nucleotídeo terapêutico. Por exemplo, em certas modalidades não limitantes, o polinucleotí- deo ou poiipeptídeo terapêutico é util no tratamento, prevenção, melhora, redução de sinto- mas, prevenção de progressão, ou cura de doenças, distúrbios ou condições, mas não ne- cessita atingir qualquer um ou todas essas coisas. Em certas modalidades, o primeiro e se- gundo polinucleotídeos sao introduzidos de forma a permitir a expressão de um complexo fator de transcrição dependente de ligante sob condições associadas com uma doença, dis- túrbio ou condição. Em uma modalidade, os métodos terapêuticos são realizados tal que o poiipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é expresso e disseminado através do paciente em um nível suficiente para tratar, melhorar ou prevenir a referida doença, distúrbio ou condição. Como aqui utilizado, "disseminado" significa que o poiipeptídeo é expresso e liberado a partir da célula suficientemente modificada para ter um efeito ou atividade no pa- ciente. Disseminação pode ser sistêmica, local ou qualquer outra entre elas. Por exemplo, o poiipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico deve ser sistemicamente dissemina- do através da corrente sangüínea ou sistema linfático. Alternativamente, o poiipeptídeo tera- pêutico ou polinucleotídeo terapêutico deve ser disseminado localmente em um tecido ou órgão a ser tratado.
Em uma modalidade, os métodos terapêuticos são realizados por administração de composições da invenção, tal como o primeiro e segundo polinucleotídeos descritos acima, diretamente ao paciente a ser tratado, tal que os polinucleotídeos são tomados, in vivo, por células do paciente a ser tratado, e um ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos terapêuti- cos serão expressos por essas células sobre condições apropriadas, como descrito em de- talhes em algum lugar aqui. Polinucleotídeos podem ser diretamente distribuídos a um paci- ente a ser tratado por uma variedade de métodos incluindo, sem limitação, vetores virais, por exemplo vetores retrovirais, vetores do vírus adeno-associados, vetores do pox vírus, por exemplo, vetores do vírus vaccínia, vetores baculovírus, vetores do herpes vírus, por exemplo, vetores de herpes simplex ou vetores do vírus Epstein-Barr, vetores do adenoví- rus, vetores do geminivírus, ou vetores de caulimovírus; vetores não virais tais como plas- mídeos, que podem ser distribuídos, por exemplo, complexados com lipossomos, lipídeos eletricamente carregados (citofectinas), biopolímeros ou complexos DNA-proteína.
Em outra modalidade, os métodos terapêuticos são realizados por introdução nas composições da invenção, tal como os primeiro e segundo polinucleotídeos descritos acima, no paciente a ser tratado contida em uma ou mais células modificadas. Seguindo adminis- tração das células modificadas o um ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos terapêuticos são expressos por células modificadas sob condições apropriadas, como descrito em deta- lhe aqui em outro lugar. O termo "células modificada" refere-se a uma célula ou células em que pelo menos um primeiro e segundo polinucleotídeos como descrito acima têm sido inse- ridos. Tal como, "uma células modificada" refere-se a célula abrigando o primeiro e segundo polinucleotídeos, que pode ou não ser uma célula a partir de, ou relacionada ao paciente a ser tratado. Tais células estão incluídas na definição de "bioreatores" ou "dispositivos biorea- tores" como aqui descrito. Como aqui definido, entretanto, um "bioreator" ou "dispositivo bio- reator" não precisa ser uma célula modificada, ao invés, um bioreator ou dispositivo biorea- tor como aqui definido e qualquer célula ou células tencionadas secretar uma proteína tera- pêutica ou polinucleotídeo terapêutico se ou não a(s) célula(s) é(são) "células modificadas".
Em uma modalidade, os métodos terapêuticos são realizados por introdução das composições da invenção, tal como o primeiro ou segundo polinucleotídeos descritos acima, em células que têm sido isoladas a partir do referido paciente, isto é, células autólogas, para produzir células modificadas, e as células modificadas são re-introduzidas no referido paci- ente.
Alternativamente, células modificadas podem ser preparadas por introdução das composições da invenção, tal como o primeiro e segundo polinucleotídeos descritos acima, em células que não são isoladas a partir do paciente, isto é, elas são não autólogas relativas ao paciente, para produzir células não autólogas modificadas (MNA). Tais células MNA po- dem ser alogenêicas relativas ao paciente a ser tratado, isto é, elas são derivadas a partir de membro geneticamente não idêntico das mesmas espécies como o paciente. Por exemplo, no tratamento de um paciente humano, as células pode ser células humanas, mas não dire- tamente derivadas a partir do paciente a ser tratado. Alternativamente, células MNA podem ser xenogenêicas relativas ao paciente a ser tratado, isto é, elas são derivadas a partir das espécies diferentes que o paciente a ser tratado. Por exemplo, no tratamento de um pacien- te humano as células devem ser células de camundongo, células de macaco, ou células de porco.
Células MNA adequadas para uso na presente invenção podem ser geradas a partir de qualquer número de tipos de células, mas não limitadas a células imortalizadas, células primárias, e células capazes de diferenciação terminal. Exemplos não Iimitantes de células adequadas para geração de células modificadas MNA para a presente invenção incluem células de mioblasto de camundongo C2C12, células de rim embrionário humano HEK293, células ARPE-19, células hMSC, células da ilhota pancreática, células MDCK, célula BHK, célula de hibridoma, célula CHO, uma célula derivada de astrócito, uma célula derivada de oligodendrócito, uma célula derivada de mioblasto, uma célula derivada de paratireóide. Em uma modalidade específica onde as células da ilhota pancreática são usadas para gerar células modificadas para tratar um paciente humano, as células da ilhota pancreática podem ser xenogenêicas, por exemplo, células da ilhota porcina, ou alogenêica, por exemplo, célu- las da ilhota humana derivada de cadáveres.
Em uma modalidade, os métodos terapêuticos são realizados in vivo.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o gene de troca e o polinucleo- tídeo codificando o polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico ligado a um pro- motor são parte de um polinucleotídeo maior, por exemplo, um vetor. Em outra modalidade, o polinucleotídeo codificando o gene de troca e o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico ligado a um promotor são polinucleotídeos sepa- rados que podem ser combinados para formar uma "composição de ácido nucléico".
Em certas modalidades, um bioreator da invenção compreende células modificadas ou não modificadas circundadas por uma barreira (por exemplo, encapsulada) antes de ser introduido no paciente. Tal um bioreator pode ser usado com qualquer paciente ao invés de ter as células autólogas modificadas de cada indivíduo. Métodos de encapsulação celular têm sido usados para células imunoisoladas enquanto permitindo, ou seletivamente ou não seletivamente, liberar os materiais biológicos desejados. Pode ser desejável prover compo- sições encapsuladas e métodos para as fazer, que são capazes de prover características estruturais aumentadas e/ou proteção imune. Tais composições e métodos podem encontrar uso, onde as células encapsuladas podem resistir a destruição mecânica, química ou imune dentro do paciente a ser tratado, e pode adicionalmente prover para a livre permeabildiade a nutrientes, íons, oxigênio e outros materiais necessários para ambos manter o tecido e dar suporte a funções metabólicas normais, mas impermeáveis a bactéria, linfócitos, e grandes proteínas do tipo responsáveis para reações imunoquímicas. Barreiras adequadas para uso na presente invenção permitem disseminação de uma proteína terapêutica ou polinucleotí- deo terapêutico expressos por uma células modificadas ou não modificadas dentro da bar- reira, mas previne o contato direto das células com células do sistema imune do paciente. A barreira pode também funcionar para prevenir células não autólogas ou autólogas modifica- das ou não modificadas a partir de escape para o local de introdução, por exemplo, células perigosas que podem causar dano ao paciente se permitidas circular. Em uma modalidade a barreira é uma barreira seletivamente permeável, por exemplo, uma barreira que é permeá- vel a pequenas moléculas tais como hormônios e peptídeos pequenos mas impermeáveis a grandes polipeptídeos tais como anticorpos. Por exemplo, a barreira pode ser impermeável a moléculas com um peso molecular maior que cerca de 100.000, cerca de 50.000, cerca de 25.000, cerca de 10.000, cerca de 5.000, ou cerca de 1.000 daltons.
Qualquer número de sistemas de barreira é adequado para uso na presente inven- ção. Em uma modalidade, por exemplo, a barreira compreende um revestimento conformai que engloba uma ou mais células. Tipicamente um revestimento conformai é feito de um material polímero, por exemplo, polietileno glicol ou hidroxietil metacrilato-metil metacrilato (HEMA-MMA). Revestimentos conformais tipicamente englobam um pequeno número de células modificadas, por exemplo, 1-10 células, 1-20 células, 1-30 células, 1-50 células, 1-70 células ou 1-90 células. Ver, por exemplo, Shoichet MS, Winn SR, Adv Drug Delivery Rev 42:81-102 (2000), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
Em outras modalidades, um sistema de barreira adequada para uso na presente in- venção compreende um bioreator, que compreende células encapsuladas. Dois métodos de encapsulação não limitantes, microencapsulação e macroencapsulação, são conhecidos na técnica. Tipicamente, em microencapsulação, as células são suspensas em um material de encapsulação biologicamente compatível que é então moldado em estruturas do tipo esfe- ras, embora em macroencapsulação o dispositivo é geralmente fabricado antes da adição de células e pode ser composta de uma ou mais membranas sintéticas. Como comparado aos revestimentos conformais, sistemas de barreira compreendendo células encapsuladas tendem a ser mais uniformes em tamanho, e tendem a ter tamanho de poro uniforme permi- tindo melhor controle de disseminação de proteína. Para encapsulamento, células vivas e outros materiais sensíveis podem ser tratados sob condições suficientemente leves permi- tindo as células ou biomaterial para permanecer substancialmente não afetado pelo proces- so de encapsulamento, ainda permitindo a formação de uma cápsula de suficiente força pa- ra existir por longos períodos de tempo.
Célula(s) viva(s) pode(m) ser encapsulada(s) e a(s) céluia(s) encapsulada(s) resul- tate(s) mantém(êm) atividade in vivo de longo termo por encapsulamento das células dentro da membrana semi-permeável biocompatível. Uma via de aumentar a biocompatibilidade é adicionar uma superfície externa de material negativamente carregado biocompatível. O termo "biocompatível" como aqui utilizado refere-se coletivamente a ambos, cápsula intacta e seu conteúdo. Especificamente, ele refere-se a capacidade de célula encapsulada intacta implantada evitar efeitos detrimentais dos sistemas protetores de vários corpors, tal como sistema imune ou resposta fibrótica do sistema imune ou estranha, e permanece funcional para um período significanente de tempo.
Bioreatores compreendendo células encapsuladas que são adequadas para uso na presente invenção são especialmente úteis para a administração de células a um animal, em que a resposta imune do animal para a célula é para ser minimizada. Células que produ- zem anticorpos, enzimas, e outros materiais bioativos podem também ser administrados. O pequeno tamanho das células encapsuladas resultantes dentro do paciente da invenção facilita a administração das microcápsulas por injeção, implantação ou transplante em um paciente.
Células vivas podem ser encapsuladas em uma variedade de géis, por exemplo, al- ginato, para formar estruturas do tipo esfera implantáveis, por exemplo, micropartículas ou microesferas para isolar fisicamente as células uma vez implantadas em um paciente a ser tratado. Para prevenir a entrada de um substâncias de peso molecular menor tais como an- ticorpos e complemento (com um peso molecular de cerca de 150 kDa) nessas estruturas tipo esfera, elas podem ser revestidas com um material tais como poli-L-lisina, quitosana, um PAN-PVC, que provê um revestimento externo com um tamanho de poro controlado ou eles podem ser tratados por exemplo, por ligação cruzada, para controlar sua porosidade interna. Exemplos adicionais de materiais úteis incluem materiais biocompatíveis convencio- nais feitos de polímeros ou co-polímeros naturais ou sintéticos, tais como poli-LJisina- alginato, colágeno, gelatina, laminina, metacrilato de metila, metacrilato de hidroxietila, MATRIGEL, VIRTOGEN, polivinilálcool, agarose, polietileno glicol, hidrogéis, ácido polilático, ácido poliglicólico, poli(lático-co-glicolídeo), poliidroxibutirato-poliidroxivalerato, copolímero, poli(lático-co-caprolactona), poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poli-13-hidroxibutírico, polianidretos, tereftalato de polietileno, polietrafluoretileno, poliacrilatos (incluindo copolíme- ros acrílicos), polivinilidenos, copolímeros de cloreto de polivinil, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetato de celulose, nitrato de celulose, polisulfonas (incluindo poliéter sulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilas, e poli(acrilonitrila/cloreto de covinil).
Uma forma de encapsulação é microencapsulação, que envolve suspensão das cé- lulas em um material encapsulação líquida ou gelatinosa, que é então formada em uma ma- triz de suporte particulada, por exemplo, uma matriz hidrogel para formar uma estrutura do tipo esfera, que serve como um núcleo de um dispositivo implantável. O núcleo mantém uma distribuição própria celular, provê força, e aumenta a viabilidade celular, longevidade, e função. O núcleo pode também contribuir para imunoisolamento. Ela também protege as células internas contidas nas estruturas do tipo esfera a partir de interações célula-célula que pode elicitar uma resposta imune não desejável no paciente a ser tratado.
Um sistema de barreira pode conter camadas múltiplas, por exemplo, onde cada camada serve a um propósito diferente (por exemplo, suporte, controle de permeabilidade). Barreiras podem compreender agentes de contraste ou outras propriedades que rendem a representável barreira (por exemplo, raio X, sonografia etc) para garantir o posicionament próprio das células implantadas. Exemplos de sistemas de barreira úteis para implantação celular são descritos na Patente dos EUA Nos. 7.226.978, EW39.542 (agarose), 6.960.351, .6.916.640, 6.911.227 (polietileno glicol), 6.818.018, 6.808.705, 6.783.964, 6.762.959, .6.727.322, 6.610.668 (poli—14-N-acetilglicosamina (p-GIcNAc) polissacarídeo), 6.558.665, RE38.027, 6.495.161, 6.368.612, 6.365.385, 6.337.008, 6.306.454 (polialquileno), .6.303.355, 6.287.558 (matriz de super gel), 6.281.015, 6.264.941, 6.258.870, 6.180.007, .6.126.936 (ácido poliamínico), 6.123.700, 6.083.523, 6.020.200, 5.916.790, 5.912.005, .5.908.623, 5.902.745, 5.858.746, 5.846.530 (polissacarídeos), 5.843.743, 5.837.747, .5.837.234, 5.834.274, 5.834.001, 5.801.033, 5.800.829, 5.800.828, 5.798.113, 5.788.988, .5.786.216, 5.759.578, 5.700.848, 5.656.481, 5.653.975, 5.648.099, 5.550.178, 5.550.050, .4.806.355, 4.689.293, 4.680.174, 4.673.566, 4.409.331, 4.352.883 e Publicações de Pedido de Patente dos EUA 2006/0263405 (alginato/polímero) e 2004/0005302 (alginsto-poli-L- lisina), cada uma é aqui incorporada por referências em sua totalidade. Em certas modalidades, um sistema barreira adequado para uso na presente in- venção compreende células microencapsuladas. Microencapsulação gera aproximadamente estruturas do tipo esferas esféricas e relativamente uniformes compreendendo células en- capsuladas, onde as estruturas tipo esfera tem cerca de 100-700 μηι em diâmetro, por e- xemplo, cerca de 100, 200, 300, 400, 500, 600 ou 700 μηι em diâmetro. Células microen- capsuladas da invenção podem ser produzidas usando uma variedade de materiais de en- capsulação como descrito acima. Em uma modalidade, o material de encapsulação compre- ende um hidrogel. Em outra modalidade o materai! de encapsulação compreende um polí- mero. Polímeros adequados incluem, sem limitação, celulose, por exemplo, sulfato de celu- lose e alginato. Por exemplo, uma microcápsula da invenção compreende alginato polianiô- nico e um polímero po!i-catiônico para interagir e formar uma barreira de membrana perme- ável seletiva física. Um método alternativo de microencapsulação compreende a formação de ácido poli(L-lático) (PLLA) ou microesferas de poli-L-ornitina (PLO) alginato. Ver, por e- xemplo, Darrabie, M.D. et al. Biomaterials 26:6846-6852 (2005) e Blasi, P. et al, Int. J Pharm. 324:27-36 (2006). Materiais de microencapsulação baseados em alginato podem ainda conter polímeros de ultra alta viscosidade (UHV)1 que podem também ser biodegradá- veis. Ver, por exemplo, Zimmermann, U. et al, Ann N Y Acad. Sei. 944:199-215 (2001).
Bioreatores da presente invenção compreendendo células microencapsuladas tipi- camente compreendem pelo menos cerca de 1000 células por "esfera", por exemplo, células modificadas e não modificadas tencionadas secretar um polipeptídeo ou polinucleotídeo terapêutico desejado como aqui descrito. Por exemplo, um bioreator da invenção que com- preende células microencapsuladas podem resultar em pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 400, pelo menos 500, pelo menos 800 a cerca de 1000 ou mais células por "esfera".
Em certas modalidades, um bioreator adequado para uso na presente invenção compreende células colocadas em um dispositivo de macroencapsulação. Como comparado aos bioreatores compreendendo células microencapsuladas, bioreatores compreendendo dispositivos de macroencapsulação são tipicamente maiores e sempre entidades celulares encapsladas não esféricas, e podem ser compostas de uma ou mais membranas sintéticas, por exemplo, um, dois, três, quatro, 8, 10 ou mais membranas, que podem ter a mesma composição de diferentes composições. Como denotado pelo nome, dispositivos de célula macroencapsulada são de um tamanho tal que entidades individuais podem ser facilmente manipulados. Por exemplo, um dispositivo de macroencapsulação típico pode ter uma forma retangular, cerca de 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm ou mais compri- dos e cerca de 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm ou 5 mm ou mais em diâmetro. Um dispositivo de macroencapsulamento não Iimitante exemplar da invenção é cerca de comprimenro e cerca de 1 mm em diâmetro.
Em certas modalidades um dispositivo de macroencapsulamento adequado para uso na presente invenção compreende duas ou mais membranas sintéticas, onde as mem- branas sintéticas têm diferentes tamanhos de poro de forma a regular o trânsito de molécu- las terapêuticas através do dispositivo e sua disseminação no ambiente. Em certas modali- dades, um dispositivo de macroencapsulação da invenção compreende uma membrana ex- terna de polímero semi-permeável e uma plataforma interna para sustentar as células. Em exemplos não limitantes, a membrana externa compreende poros de cerca de 15 nm para permitir a troca de nutrientes de moléculas terapêuticas. A plataforma interna pode compre- ender qualquer número de materais. Em um exemplo não Iimitante o scaffold compreende fio poli(tereftalato de etileno) (disponível de Neurotech (www.neurotechusa.com).
Em outro exemplo não limitante, um dispositivo de macroencapsulação adequado para uso na invenção compreende uma bicamada de membrana polimérica, onde a bicama- da compreende uma camada externa de 5 μητι de membrana laminada de po- li(tetrafluoretileno) (PTFE) em um poro mais justo interno de 0,45 μΜ de camada imunobar- reira PTFE (disponível de Theracyte (www.theracyte.com)). Tal dispositivo de macroencap- sulamento pode ainda compreender uma camada externa de tecido poli trançado para a referida bicamada membrana polimérica. Em ainda outro exemplo não limitante, um disposi- tivo de macroencapsulamento adequado para uso na invenção é composto de fibras vazias de polietersulfona (PES). Ver, por exemplo, Li, Y. et al, J. Membrane Sei. 245:53-60 (2004).
Dispositivos de macroencapsulamento adequados para uso na presente invenção podem opcionalmente ter estruturas adicionais para permitir implantação conveniente em e retorno a partir de um paciente a ser tratado. Por exemplo, um dispositivo de macroencapsu- lamento pode compreender, sem limitação, um clipe de sutura, um porta de carregamento, uma corda, ou outra estrutura para facilitar o uso.
O espaço interior de dispositivos de macroencapsulamento da invenção é tipica- mente adequado para compreender pelo menos uma a cerca de 105 células, por exemplo, células modificadas e não modificadas tencionam secretar um polipeptídeo ou polinucleotí- deo terapêutico desejado. Por exemplo, um dispositivo de macroencapsulamento da inven- ção pode compreender pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2000, pelo menos 4000, pelo menos 5000, pelo menos 8000 a cerca de 10000 ou mais células.
Alguns dispositivos bioreatores, por exemplo, células modificadas ou não modifica- das encapsuladas ou revestidas da presente invenção tencionam secretar um polipeptídeo ou polinucleotídeo terapêutico desejado, por ainda compreender células protetoras, por e- xemplo, dentro da barreira oi cápsula, onde as células protetoras são capazes de prover proteção às células modificadas ou não modificadas tencionadas a secretar um polipeptídeo ou polinucleotídeo terapêutico desejado. Exemplos não Iimitantes de tais células protetoras incluem células de sertoli e eritrócitos não modificados. Adicionalmente, alguns dispositivos de bioreator, por exemplo, células modificadas ou não modificadas encapsuladas ou reves- tidas da presente invenção tencionadas secretar um polipeptídeo ou polinucleotídeo tera- pêutico desejado, por ainda compreender um revestimento externo capaz de criar um mi- croambiente mais compatível ou protetor. Microambientes não Iimitantes exemplares que podem ser criados incluem um microambiente antiinflamatório e um microambiente pró- angiogênico.
Em ainda outras modalidades, dispositivos bioreatores da presente invenção po- dem incluir células modificadas com um mecanismo "interrompimento de seguraça". Por exemplo, células modificadas contidas em um dispositivo bioreator pode compreender um gene suicida regulado que codifica um polipeptídeo letal onde o gene, sob ativação, pode induzir destruição da célula modificada por si mesma. Por exemplo, uma célula modificada pode ser programada para morrer se ela escapa de um sistema de barreira, ou se ela passa por conversão oncogênica. Exemplos não Iimitantes de polipeptídeos letais adequados na presente invenção são descritos em mais detalhes abaixo.
O paciente em cujos métodos terapêuticos são realizados pode ser qualquer paci- ente para o qual o tratamento ou prevenção é desejado. Por exemplo, o paciente pode ser um que exibe um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição. O paciente pode também ser um que é pré-disposto a uma doença, distúrbio ou condição, por exemplo, devi- do a genética, história familiar ou exposição ambiente. O paciente pode ser um membro do público geral, por exemplo, como parte de uma imunização preventiva contra uma doença, distúrbio ou condição em uma população.
A doença, distúrbio ou condição a ser tratada ou prevenida pelos métodos da in- venção pode ser qualquer doença, distúrbio o condição para a qual um ou mais promotores de troca terapêuticas é disponível. Exemplos de doenças ou distúrbios que podem ser trata- das ou prevenidas pelos métodos da invenção incluem, sem limitação, doenças, distúrbios ou condições hiperproliferativas (por exemplo, câncer), doenças, distúrbios ou condições cardiovasculares, doenças, distúrbios ou condições neurais, doenças, distúrbios ou condi- ções autoimunes, doenças, distúrbios ou condições ósseas, doenças, distúrbios ou condi- ções gastrointestinais, doenças, distúrbios ou condições sangüíneas, doenças, distúrbios ou condições metabólicas, doenças, distúrbios ou condições inflamatórias e doenças, distúrbios ou condições infecciosas.
Os promotores de troca terapêuticos da invenção podem ser qualquer promotor que é útil para tratar, melhorar ou prevenir uma doenças, distúrbios ou condições específica. Exemplos incluem, sem limitação, promotores de genes que exibem expressão aumentada somente durante uma doença, distúrbio ou condição específicas e promotores de genes que exibem expressão aumentada sob condições celulares específicas (por exemplo, prolifera- ção, apoptose, mudança de pH, estado de oxidação, nível de oxigênio). Em algumas moda- lidades onde o gene de troca compreende mais que uma seqüência de fator de transcrição, a especificidade dos métodos terapêuticos pode ser aumentada por combinação de um promotor de doença ou condição específica com um promotor tipo tecidual ou celular espe- cífico para limitar os tecidos em que o produto terapêutico é expresso. Então, promotores tecido ou célula específico são compreendidos dentro da definição do promotor de troca terapêutico.
Como um exemplo de promotores doença-específico, promotoes úteis para tratar câncer inclui os promotores de oncogenes. Exemplos de classes de oncogenes incluem, mas não são limitados a fatores de crescimento, receptores de fator de crescimento, proteí- nas quinases, reguladores de morte celular programada e fatores de transcrição. Exemplos específicos de oncogenes incluem, mas não são limitados a sis, erb B, erb B-2, ras, abi, myc e bcl-2 e TERT. Exemplos de outros genes relacionados a câncer incluem genes de antíge- no associado a tumor e outros genes que são super-expressos em células neoplásticas (por exemplo, MAGE-1, antígeno carcinoembriônicos, tirosinase, antígeno específico prostático, antígeno de membrana específica prostática, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-1/neu, T/Tn, MART-1, gp100, GM2, Tn, sTn, e antígeno Thompson-Friedenreich (TF)).
Exemplos de seequências promotoras e outros elementos regulatórios (por exem- plo, aumentadores) que são conhecidos na técnica e são úteis como promotores de troca terapêutica na presente invenção são revelados as referências listadas nas Tabelas 1 e 2, junto com a doença/distúrbio (Tabela 1) ou especificidade tissular (Tabels 2) associada com cada promotor. As seqüências de promotor reveladas nessas referências são aqui incorpo- radas por referência em sua totalidade.
Tabela 1
<table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table> <table>table see original document page 47</column></row><table> <table>table see original document page 48</column></row><table>
Outros genes que exibem mudanças nos níveis de expressão durante as doenças e distúrbios específicos e assim podem prover promotores que são úteis na presente invenção incluem, sem limitação, os genes Qunto com a doença/distúrbio associada) listada na Tabela 3.
Tabela 3
<table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> <table>table see original document page 55</column></row><table> <table>table see original document page 56</column></row><table> <table>table see original document page 57</column></row><table> <table>table see original document page 58</column></row><table>
Uma vez um gene com um padrão de expressão que é modulada durante uma do- ença, distúrbio ou condição é identificado, o promotor do gene pode ser usado no gene de troca da invenção. A seqüência de muitos genes, incluindo a região de promotor, é conheci- do na técnica e disponível em bases de dados públicos, por exemplo, GenBank. Então, uma vez um gene apropriado é identificado, a seqüência promotora pode ser facilmente identifi- cado e obtido. Outro aspecto da presente invenção é direcionado a identificação de genes adequados cujo promotor pode ser isolado e colocado em um gene de troca. A identidade do gene, além disso, pode não ser crítica a modalidades espcíficas da presente invenção, provido que o promotor pode ser isolado e usado em configurações ou ambientes subse- quentes. A invenção corrente então inclui o uso de promotores a partir de genes que são ainda a ser identificados. Uma vez genes adequados são identificados, é uma matéria de habilidade de rotina ou experimentação para determinar as seqüências genéticas em neces- sidade para função promotora. De fato, vários protocolos comerciais ajudam na determina- ção da região promotora de genes de interesse. Por meio de exemplo, Ding et al, recente- mente elucidou a seqüência promotora do novo gene Sprouty4 (Am. J. Physiol. Lung CeII. Mol. Physiol. 287:L52 (2004), que e incorporada por referência) por progressiva deleção da seqüência flanqueadora 5'do gene Sprouty4 humano. Brevemente, uma vez que os sítio de iniciação de transcrição foi determinado, fragmentos de PCR foram gerados usando inicia- dores de PCR comuns para clonar segmentos do segmento flanqueador 5' em uma forma unidirecional. Os segmentos gerados foram clonados em um vetor repórter de Iuciferase e atividade Iuciferase foi medida para determinar a região promotora do gene Sprouty4 huma- no.
Outro exemplo de um protocolo para aquisição e validação dos promotores gênicos incluem os seguintes passos: (1) amostras de doença adquirida e célula/tecido não doente do tipo tecidual igual/similar; (2) RNA total ou mRNA isolado das amostras; (3) análise de microarray de desempenho diferencial do RNA doente e não doente; (4) identificar transcri- tos específicos da doença do candidato; (5) identificar seqüências genômicas com os trans- critos específicos da doença; (6) a montante e a jusante de sequênai de DNA adquirida ou sintetizada do sítio de inicialização da transcrição predita do transcrito específico da doença; (7) desenho e produção de vetores repórter do promotor usando comprimenros diferentes de DNA do passo 6; e (8) vetores repórter do promotor teste em tecidos/células doentes e não doentes, bem como em tecidos/células não relacionados.
A fonte do promotor que é inserida no gene de troca pode ser natural ou sintética, e a fonte do promotor pode não limitar o objetivo da invenção descrita aqui. Em outras pala- vras, o promotor pode ser diretamnte clonado a partir de células, ou promotor podem ter sido previamente clonados a partir de fonte diferente, ou o promoto pode ter sido sintetizado.
Sistemas de Gene de Troca
O gene de troca pode ser qualquer gene de troca que regula a expressão gênica pela adição ou remoção de um Iigante específico. Em uma modalidade, o gene de troca é um em que o nível da expressão gênica é dependente do nível de Iigante que está presente. Exemplos de complexos fator de transcrição dependente de Iigante que podem ser usados nos genes de troca da invenção incluem, sem limitação, membros da superfamília do recep- tor nuclear ativados pelos respectivos Iigantes (por exempllo, glicocorticóides, estrogênio, progestina, retinóide, ecdisona, e análogos e miméticos dos mesmos) e rTTA ativado por tetraciclina. Em um aspecto da invenção, o gene de troca é um gene de troca baseado em EcR. Exemplos de tais sistemas incluem, sem limitação, os sistemas descritos na Patente dos EUA Nos. 6.258.603, 7.045.315, Pedido de Patente Publicado Nos. 2006/0014711, 2007/0161086, e Pedido Internacional Publicado No. W001/70816. Exemplos de sistemas de receptor de ecdisona químérico são descritos na Patente dos EUA No. 7.091.138, Pedido de Patente dos EUA Publicado Nos. 2002/0110861, 2004/0033600, 2004/0096942, 2005/0266457, e 2006/0100416, e Pedido Internacional Publicado Nos. W001/70816, W002/066612, W002/066613, W002/066614, W002/066615, W002/29075, e W02005/108617, cada uma dos quais é incorporado por referência em sua totalidade. Um exemplo de um sistema regulado por ecdisona não esteroidal é o Sistema de Expressão Induzível de Mamífero RheoSwitch® (New England Biolabs, Ipswich1 MA). Em outro aspecto da invenção, o gene de troca é baseado na heterodimerização da proteína de ligação FK506 (FKBP) com proteína associada de rapamicina FKBP (FRAP) e é regulada através de rapa- micina ou seus análogos não imunossupressores. Exemplos de tais sistemas, incluem, sem limitação, a Tecnologia Transcricional ARGENT® (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA) e os sistemas descritos na Patente dos EUA Nos. 6.015.709, 6.117.680, 6.379.653, 6.187.757, e 6.649.595.
Em uma modalidade, o gene de troca compreende uma seqüência de fator de transcrição única codificando um complexo fator de transcrição dependente de ligante sob o controle de um promotor de troca terapêutica. A seqüência de fator de transcrição pode co- dificar um complexo fator de transcrição dependente de ligante que é complexo fator de transcrição dependente de Iigante artificial e de ocorrência natural. Um fator de transcrição artificial é um em que a seqüência natural do fator de transcrição tenhs sido alterado, por exemplo, por mutação da seqüência ou por combinação de domínios a partir de fatores de transcrição diferentes. Em uma modalidade, o fator de transcrição compreende um domínio de ligação de Iigante do receptor nuclear do Grupo H. Em uma modalidade, o domínio de ligação de Iigante do receptor nuclear do Grupo H é a partir de um receptor de ecdisona, um receptor de ubiquitina (UR), um receptor órfão 1 (OR-1), um receptor nuclear de hormônio esteróide (NER-1), um receptor X de retinóide interagindo com a proteína 15 (RIP-15), um receptor X hepático β (LXRP), receptor de hormônio esteróide do tipo proteína (RLD-1), um receptor X hepático (LXR)1 um receptor X hepático α (LXRa)1 um receptor X farnesóide (FXR), uma proteína 14 de interação com receptor (RIP-14), ou um receptor farnesol (HRR- 1). Em outra modalidade, o receptor nuclear do grupo H LBD é partir do receptor de ecdiso- na.
A.Gene de Troca baseado em Ecdisona
O EcR e os outros receptores nucleares do Grupo H são membros da superfamília do receptor nuclear em que todos os membros são geralmente caracterizados pela presen- ça de um domínio de transativação amino-terminal (AD, também referido de forma passível de mudança como "TA" ou "TD"), opcionalmente fusionado a um parceiro de heterodimeri- zação (HP) para formar uma proteína de coativação (CAP), um domínio de ligação de DNA (DBD)1 e um LBD fusionado ap DBD através de uma região de dobradiça para formar um fator de transcrição dependente de ligante (LTF). Como aqui utilizado, o termo "domínio de ligação de DNA" compreende uma seqüência de polipeptídeo mínima de uma proteína de ligação de DNA, até o comprimento inteiro de uma proteína de ligação de DNA, contanto que o domínio de ligação de DNA funciona para associar com um elemento de resposta par- ticular. Membros da superfamília do receptor nuclear são também caracterizados pela pre- sença de quatro ou cinco domínios: A/B, C, D, E e em alguns membros F (ver, EUA 4.981.784 e Evans1 Science 240:889 (1988)). O domínio "A/B" corresponde ao domínio de transativação, "C"corresponde ao domínio de ligação de DNA, "D" correspodende a região de dobradiça, e Έ" corresponde ao domínio de ligação de ligante. Alguns membros da famí- lia pode também ter outro domínio de transativação do lado carbóxi-terminal do LBD corres- pondente a "F".
A seqüência polipeptídico seguinte foi relatada como uma seqüência polipeptídica do receptor de Ecdisona (receptor Ecdiesteróide) (receptor 20-hidróxi-ecdisona) (receptor 20E) (EcRH) (subfamília receptor nuclear 1 membro do grupo H 1) e tem o número de aces- so P34021 em GenBank.
Receptor Ecdisona (878aa) a partir de Drosophila melanogaster (mosca da fruta) (SEQ ID NO:5)
1 mkrrwsnngg fmrlpeesss evtsssnglv lpsgvnmsps sldshdycdq dlwlcgnesg 61 afggsnghgl sqqqqsvitl amhgcsstlp aqttiiping nangnggstn gqyvpgatnl 121 galangmlng gfngmqqqiq nghglinstt pstpttplhl qqnlggaggg giggmgilhh 181 angtpnglig wgggggvgl gvggggvggl gmqhtprsds vnsissgrdd lspssslngy 241 sanescdakk skkgpaprvq eelclvcgdr asgyhynalt cegckgffrr avtksavycc 301 kfgracemdm ymrrkcqecr lkkclavgmr pecwpenqc amkrrekkaq kekdkmttsp 361 asqhggngsl asgggqdfvk keildlmtce ppqhatipll pdeilakcqa rnipsltynq 421 laviykliwy qdgyeqpsee dlrrimsqpd enesqtdvsf rhiteitilt vqlivefakg 481 lpaftkipqe dqitllkacs sevnunlrmar rydhssdsif fannrsytrd sykmagmadn 541 iedllhfcrq mfsmkvdnve yalltaivif sdrpglekaq lveaiqsyyi dtlriyilnr 601 hcgdsmslvf yakllsilte lrtlgnqnae mcfslklknr klpkfleeiw dvhaippsvq 661 shlqitqeen erleraermr asvggaitag idcdsastsa aaaaaqhqpq pqpqpqpssl 721 tqndsqhqtq pqlqpqlppq lqgqlqpqlq pqlqtqlqpq iqpqpqllpv sapvpasvta 781 pgslsavsts seymggsaai gpitpattss itaavtasst tsavpmgngv gvgvgvggnv 841 3myanaqtam almgvalhsh qeqliggvav ksehstta
O DBD é caracterizado pela presença de dois dedos de cisteína zinco entre os quais dois motivos de aminoácidos, o P-box e o D-box, que confere especifidade para ele- mentos resposta. Esses domínios podem ser ou nativos, modificados ou quimeras de dife- rentes domínios das proteínas do receptor heterólogo. O EcR1 tipo um subgrupo da família do receptor nuclear, também possui menos regiões bem definidas responsáveis por proprie- dades de heterodimerização. Porque os domínios de receptores nucleares são modulares em natureza, o LBD, DBD e AD podem ser passíveis de mudança.
Em outra modalidade, o fator de transcrição compreende um AD1 um DBD que re- conhece um elemento de resposta associado com a proteína terapêutica ou polinucleotídeo terapêutico cuja expressão é para ser modulada; e um receptor nuclear do grupo H LBD. Em certas modalidades, o receptor nuclear do Grupo H LBD compreende uma mutação de substituição.
Em outra modalidde, o gene de troca compreende uma primeira seqüência de fator de transcrição, por exemplo, um CAP, sob o controle de um primeiro promotor de troca tera- pêutico (TSP-1) e uma segunda seqüência de fator de transcrição, por exemplo, um LTF1 sob o controle de um segundo promotor de troca terapêutico (TSP-2), em que as proteínas codificadas pela referida seqüência fator de transcrição e a referida segunda seqüência fator de transcrição interage para formar um complexo protéico (LDTFC), isto é, um gene de troca baseada em "dupla troca" ou "duas hibridização". O primeiro e segundo TSPs podem ser os mesmos ou diferentes. Nesta modalidade, a presença de dois TSPs diferentes no gene de troca que são requeridos para expressãod e molécula terapêutica aumenta a especificidade do método terapêutico (ver Figura 2). Figura 2 também demonstra a habilidade de modificar o gene terapêutico de troca para tratar qualquer doença, distúrbio ou condição simplesmen- te por inserção dos TSPs apropriados.
Em uma modalidade adicional, ambos a primeira e a segunda seqüência de fator de transcrição, por exemplo, um CAP ou um LTF, estão sob controle de um promotor de troca terapêutico único (por exemplo, TSP-1 na Figura 1). Ativação deste promotor gerará ambos, CAP e LTF com uma estrutura de leitura aberta única. Isso pode ser alcançado com o uso de um Iigador transcricional tal como um IRES (sitio de entrada de ribossomo interno). Nes- sa modalidade, ambas as porções complexo de fator de transcrição dependente de Iigante serão sintetizadas sob ativação de TSP-1. TSP-1 pode ser um promotor constitutivo ou so- mente ativado sob condições associadas com a doença, distúrbio, ou condição.
Em uma modalidade adicional, uma seqüência de fator de transcrição, por exemplo, um LTF, está sob controle de um promotor de troca terapêutico somente ativado sob condi- ções associadas com a doença, distúrbio, ou condição (por exemplo, TSP-2 ou TSP-3 na Figura 4) e a outra seqüência de fator de transcrição, por exemplo, CAP, está sob controle de um promotor de troca terapêutico constitutivo (por exemplo, TSP-1 na Figura 4). Nessa modalidade, uma porção do fator complexo de transcrição de Iigante dependente será apre- sentada constitutivamente enquanto a segunda porção será somente sintetizada sob condi- ções associadas com a doença, distúrbio, ou condição.
Em outra modalidade, uma seqüência de fator de transcrição, por exemplo, CAP, está sob controle de um primeiro TSP (por exemplo, TSP-1 na Figura 3) e duas ou mais di- ferentes segundas seqüências de fator de transcrição, por exemplo, LTF-1 e LTF-2 estão sob controle de diferentes TSPs (por exemplo, TSP-2 e TSP-3 na Figura 3). Nessa modali- dade, cada um dos LTFs podem ter diferentes DBD que reconhecem uma seqüência de promotor regulado por fator diferente (por exemplo, DBD-A se liga a um elemento de respos- ta associado com promotor regulado por fator 1 (FRP-1) e DBD-B se liga a um elemento de resposta associado com promotor regulado por fator 2 (FRP-2). Cada um dos promotores regulados por fator podem ser operacionalmente ligados a um gene terapêutico diferente. Dessa maneira, tratamentos múltiplos podem se providos simultaneamente.
Em uma modalidade, a primeira seqüência de fator de transcrição codifica um poli- peptídio compreendendo um AD1 um DBD que reconhece um elemento de resposta associ- ado com a seqüência de produto terapêutica de quem a expressão é para ser modulada; e um receptor nuclear LBD do Grupo H, e a segunda seqüência de fator de transcrição codifi- ca um fator de transcrição compreendendo um receptor nuclear LBD selecionado do grupo consistindo de um receptor X retinóide vertebrado (RXR)1 um invertebrado RXR, uma prote- ína "ultraspiracle" (USP), ou um receptor nuclear quimérico compreendendo pelo menos dois diferentes fragmentos de polipeptídio do domínio de ligação de ligante do receptor nu- clear selecionado do grupo consistindo de um RXR vertebrado, um invertebrado RXR1 e um USP (ver WO 01/70816 A2 e US 2004/0096942 A1). O domínio de ligação ligante do recep- tor nuclear "parceiro" pode ainda compreender uma mutação truncada, uma mutação de deleção, mutação de substituição, ou outra modificação.
Em outra modalidade, o gene de troca compreende uma primeira seqüência de fa- tor de transcrição codificando um primeiro polipeptídio compreendendo um receptor nuclear LBD e um DBD que reconhece um elemento de resposta associado com a seqüência de produto terapêutico de quem expressão é para ser modulada, e a segunda seqüência de fator de transcrição codificando um segundo polipeptídio compreendendo um AD e um re- ceptor nuclear LBD1 em que um dos receptores nucleares LBDs é um receptor nuclear LBD do Grupo H. Em uma modalidade preferida, o primeiro polipeptídio é substancialmente livre de um AD e o segundo polipeptídio é substancialmente livre de um DBD. Para propósitos da invenção, "substancialmente livre" significa que a proteína em questão não contém uma se- qüência suficiente de um domínio em questão para prover ativação ou atividade de ligação.
Um outro aspecto da invenção, a primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro de heterodimerizaçao e um AD (um "CAP") e a segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um DBD e um LBD (um "LTF").
Quando somente um receptor nuclear LBD é um LBD do Grupo Η, o outro receptor LBD pode ser qualquer outro receptor nuclear que forma um dímero com o LBD do Grupo H. Por exemplo, quando o receptor nuclear LBD do Grupo H é um LBD EcR, o outro receptor nuclear LBD "parceiro" pode ser de um EcR, um vertebrado RXR, um invertebrado RXR, uma proteína "ultraspiracle" (USP), ou um receptor nuclear quimérico compreendendo pelo menos dois fragmentos de polipeptídio dos receptores nucleares LBD diferente selecionados a partir do grupo consistindo de um vertebrado RXR, um invertebrado RXR, e um USP (ver WO 01/70816 A2, Pedido de Patente Internacional No. PCT/US02/05235 e EUA 2004/0096042 A1, incorporado aqui pela referência em sua totalidade). O domínio de liga- ção de Iigante do receptor nuclear "parceiro" pode ainda compreender uma mutação trunca- da, uma mutação de deleção, uma mutação de substituição, ou outra modificação.
Em uma modalidade, o LBS RXR vertebrado é de um humano Homo sapiens, ca- mundongo Mus musculus, rato Rattus norvegicus, galinha Gallus gallus, porco Sus scrofa domstica, sapo Xenopus Iaevis1 peixe zebra Danio rerio, tunicata Poliandrocarpa misakien- sis, ou água viva Tripedalia cysophora RXR.
Em uma modalidade, o domínio de ligação Iigante RXR invertebrado é um polipep- tídio "ultraspiracíe" de um gafanhoto Locusta migratória ("LmUSP"), um carrapato ixodídio Amblyomma americanum de RXR homólogo 1 ("AmaRXRI"), um carrapato ixodídio Ambl- yomma americanum RXR homólogo 2 ("AmaRXR2"), um caranguejo trapaceiro Celuca pugi- lator RXR homólogo ("CpRXR"), um escaravelho Tenebrio molitor RXR homólogo ("TmR- XR"), uma abelha Apis mellifera RXR homóloga ("AmRXR"), um afídeo Myzus persicae RXR homólogo ("MpRXR"), ou um não-díptero/não-lepidóptero RXR homólogo.
Em uma modalidade, o LBD RXR quimérico compreende pelo menos dois fragmen- tos de polipeptídeo selecionados do grupo consistindo de um fragmento de polipeptídeo RXR de espécie vertebrada, um fragmento de polipeptídeo RXR de espécie invertebrada, e um fragmento de polipeptídeo homólogo RXR de espécie invertebrada de não-díptero/não- lepidóptero. Um domínio de ligação Iigante RXR quimérico para uso na presente invenção pode compreender pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo RXR de espécies diferen- tes, ou quando as espécies são as mesmas, os dois ou mais fragmentos de polípeptídios podem ser de duas ou mais isoformas diferentes da espécie do fragmento de polipeptídio RXR.
Em uma modalidade, o domínio de ligação Iigante RXR quimérico compreende pelo menos um fragmento de polipeptídeo RXR de espécie vertebrada e um fragmento de poli- peptídeo RXR de espécie invertebrada.
Em outra modalidade, o domínio de ligação Iigante RXR quimérico compreende pe- lo menos um fragmento de polipeptídeo RXR de espécie vertebrada e um fragmento de po- lipeptídeo homólogo RXR de espécie invertebrada não-díptero/não-lepidóptero.
O ligante, quando combinado com o LBD do receptor nuclear(s), o qual é limitado ao redor por elemento de resposta de FRP associado com uma seqüência de produto tera- pêutico, prove regulação temporal externa de expressão de seqüência de produto terapêuti- co. O mecanismo de ligação ou outro no qual vários componentes dessa invenção se ligam a cada um, isto é, por exemplo, ligando a LBD, DBD a elemento de resposta, AD a promotor etc, não é crítico.
Em um exemplo especifico, ligação de ligante do LBD ao receptor nuclear do Grupo H e seu receptor nuclear LBD parceiro permite expressão da seqüência de produto terapêu- tico. Este mecanismo não exclui o potencial de ligação de Iigantes ao receptor nuclear do Grupo H (GHNR) ou seu parceiro, e a formação resultante de complexos homodímeros ati- vos (por exemplo, GHNR + GHNR ou parceiros + parceiros). Preferivelmente, um ou mais domínios de receptores são variados produzindo um gene de troca híbrido. Tipicamente, um ou mais de três domínios, DBD, LBD e AD, podem ser escolhidos de uma fonte diferente que a fonte do outro domínio de forma que os genes híbridos e as proteínas híbridas resul- tantes são otimizadas na escolha da célula hospedeira ou organismo para atividade de tran- sativação, ligante de ligação complementar, e reconhecimento de um elemento de resposta especifico. Além disso, o próprio elemento de resposta pode ser modificado ou substituído com elementos de reposta de outros domínios de proteínas de ligação de DNA tal com a proteína GAL-4 de levedura (ver Sadowski et ai., Nature 335:563 (1998)) ou proteína LexA da Escherichia coli (ver Brent et al., Cell 43:729 (1985), ou elementos de resposta sintéticos específicos para atingir interação com proteínas designadas, modificadas, e seletivas para tal interações especificas (ver, por exemplo, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:3616 (1997)) para acomodar receptores híbridos. Outra vantagem de dois sistemas híbridos é que eles permitem escolha do promotor usado para direcionar a expressão gênica de acordo com o fim desejado. Tal controle duplo pode ser particularmente importante em áreas de terapia gênica, especialmente quando proteínas citotóxicas são produzidas, porque ambos, o tempo de expressão bem como as células em que a expressão ocorre podem ser contro- lados. Quando genes, operacionalmente ligados a um promotor adequado, são introduzidos em células do paciente, expressão de genes exógenos é controlada pela presença do sis- tema desta invenção. Promotores podem ser constitutivamente ou induzivelmente regulados ou podem ser tecido-específico (isto é, expressos somente em um tipo particular de células) ou específico para certos estágios de desenvolvimento do organismo.
O domínio de ligação do DNA da primera protéina híbrida se liga, em presença ou ausência de ligante, à seqüência de DNA de um elemento resposta para iniciar ou suprimir a transcrição do(s) gene(s) a jusante sobre a regulação deste elemento resposta.
O LDTGC funcional, por exemplo, um complexo de EcR, pode também incluir prote- ína(s) adicional(is) tal como imunofilinas. Membros adicionais da família do receptor nuclear de proteínas, conhecidas como fatores de transcrição (tais como DHR38 ou betaFTZ-1), pode também ser parceiros dependente ou independente de ligante para EcR, USP, e/ou RXR. Adicionalmente, outros co-fatores podem ser requeridos tais como proteínas geral- mente ocnhecidas commo co-ativadores (também denominadas adaptadores ou mediado- res). Essas proteínas não se ligam especificamente a seqüência de DNA e não são envolvi- das em transcrição basal. Eles podem ser exercer seu efeito na ativação da transcrição a- través de vários mecanismos, incluindo estimulação de ligante DNA de ativadores, por afetar estrutura da cromatina, ou por mediar interações do complexo ativador-iniação. Exemplos de tais co-ativadores incluem RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NcoA-1, TIF2/GRIP/NcoA-2, ACTR/AIB1 /RAC3/ pCIP bem como a proteína de ligação elemento B em resposta ao co-ativador C promíscuo, CBP/p300 (para revisão, ver Glass et al, Curr. O- pin. Cell Biol. 9:222 (1997)). Também, co-fatores de proteína geralmente conhecidos como co-repressores (também conhecidos como repressores, silenciadores, ou mediadores de silenciadores) podem ser requeridos para efetivamente inibir a ativação transcricional em ausência de ligante. Esses co-repressores podem interagir com o EcR não ligado para si- lenciar a atividade na resposta do elemento. Evidências correnntes sugerem que a ligação do Iigante muda a conformação do receptor, que resulta em liberação do co-repressor e re- crutamento dos co-ativadores acima descritos, assim abolindo sua atividade silenciadora. Exemplos de tais co-repressores incluem N-CoR e SMRT (para revisão, ver Horwitz et al, Mol Endocrinol. 10:1167 (1996)). Esses cofatores podem ou ser endógenos dentro da célula ou organismo, ou podem ser adicionados exogenamente como transgenes para serem ex- pressos de forma ou regulada ou não regulada.
B. Gene de troca baseada em rapamicina
A presente invenção ainda provê um sistema de troca de genes que utiliza uma pro- teína Iigadora FK506 como o complexo fator de transcrição dependente de Iigante e rapami- cina como o ligante. Em uma modalidade, a construção codificando o gene de troca com- preende
(a) um primeiro polinucleotídeo codificando uma primeira proteína quimérica que se liga a rapamicina ou um análogo do mesmo e que compreende pelo menos um domínio da proteína ligante de FK506 (FKBP) e pelo menos um domínio de proteína heterólogo do
mesmo, em que o domínio FKBP compreende uma seqüência peptídica selecionada de:
(1) um FKBP de ocorrência natural
(2) uma variante de um FKBP de ocorrência natural em que até 10 resíduos amino- ácidos têm sido deletados, inseridos, ou substituídos com aminoácidos substitutos, e
(3) um FKBP codificado por uma seqüência de DNA que seletivamente hibridiza a uma seqüência de DNA codificando um FKBP de (1) ou (2);
(b) um segundo polinucleotídeo codificando uma segunda proteína quimérica que forma um complexo com ambas (rapamicina) ou um análogo de rapamicina e (b) a primeira protéina quimérica, que compreende pelo menos um domínio ligante FKBP:rapamicina (FRB) e pelo menos um domínio de proteína heterólogo do mesmo, em que o domínio FRB
compreende uma seqüência peptídica selecionada de:
(4) um domínio FRB de ocorrência natural,
(5) um varinate de domínio FRB de ocorrência natural em que até 10 resíduos ami- noácidos tenha sido deletado, inseridoou substituído com aminoácidos substitutos, e
(6) Um domínio FRB codificado por uma seqüência de DNA que seletivamente hi- bridiza a uma seqüência de DNA codificando um FRB de (4) ou (5).
Neste sistema de gene de troca, cada do primeiro polinucleotídeo e o segundo poli- nucleotídeo estão sobre o controle de um ou mais promotores de troca terapêutica como descrito aqui em outro lugar. Além disso, em certas modalidades, pelo menos um domínio de proteína heterólogo aos domínios FKBP e/ou FRB na primeira e segunda proteína quimé- rica podem ser um ou mais domínio de "ação" ou "efetores". Domínios efetores podem ser selecionados a partir de uma variedade ampla de domínios de proteína incluindo domínios de ligação de DNA, domínios de ativação de transcrição, domínios de localização celular e domínios de sinalização (isto é, domínios que são capazes de agrupamento ou multimeriza- ção, de indução de crescimento celular, proliferação, diferenciação, apoptose, trascrição gênica etc).
Em certas modalidades, uma proteína de fusão contém pelo menos um domínio de ligação de DNA (por exemplo, um domínio de ligação de DNA GAL4 ou ZFHD1) e outra pro- teína de fusão contém pelo menos um domínio de ativação de transcrição (por exemplo, um domínio de ativação de transcrição VP16 ou p65). Associação mediada por Iigante das pro- teína de fusão representa a formação de um complexo fator de transcrição e leva a iniciação da transcrição de um gene alvo ligado a uma seqüência de DNA reconhecida por (isto é, capaz de ligar com) o domínio Iigador de DNA em uma das proteínas de fusão. Informação em relação ao sistema de expressão gênica bem como o Iigante é revelada na Patente dos EUA Nos. 6.187,757 B1, 6.649.595 B1, 6.509.152 B1, 6.479.653 B1, e 6.117.680 B1.
Em outras modalidades, a presente invenção provê um sistema de gene de troca que compreende polinucleotídeos codificando duas proteínas de fusão que se auto-agregam em ausência de um ligante, em que (a) a primeira proteína de fusão compreende um domí- nio de agregação condicional que se liga a um ligante selecionado e um domínio de ativação de transcrição e (b) a segunda proteína de fusão compreendendo um domínio de agregação condicional que se liga a um ligante selecionado e um domíinio de ligação de DNA1 e (c) na ausência de ligante, as células expressam um gene operacionalmente ligado a DNA regula- tório ao qual o referido domínio de ligação ao DNA se liga. Células modificadas compreen- dendo o sistema de gene de troca são expandidas em presença do ligante em uma quanti- dade suficiente para repressão do gene. Remoção de ligante induz expressão da proteína codificada que causa morte celular. Os ácidos nucléicos coficando as duas proteínas de fusão estão sobre o controle de pelo menos um promotor condicional. O sistema de expres- são gênica utilizando domínio sde agregação condicional é revelada na Publicação EUA No.2002/0048792.
C. Repressor.Operador Procariótico baseado em Sistema de Gene de Troca
Em uma modalidade, a presente invenção provê sistema de troca de gene compre- endendo (a) um primeiro polinucleotídeo codificando para uma proteína de fusão transativa- dora compreendendo um repressor tetraciclina procariótico ("tet") e um domínio de proteína atívadora transcrícional eucariótica; e (b) um segundo polinucleotídeo codificando para uma proteína terapêutica ou polipeptídeo terapêutico, em que o referido segundo polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor mínimo e pelo menos uma seqüência operadora tet. O primeiro polinucleotídeo codificando para uma proteína de fusão transativadora pode compreender promotor de troca terapêutico como descrito aqui em outro lugar. A expressão da proteína letal é super-regulada em ausência de tetraciclina (ver, por exemplo, Gossen et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89: 5547-5551; Gossen et al (1993) TIBS 18: 471-475; Furth et al (1994) Proc. Nati Acad. Sei. 91:9302-9306; e Schocket et al (1995) Proc. NatL Acad. Sei. 92:6522-6526). O sistema de expressão TetO é revelado na Patente dos EUA No. 5.464.758 B1.
Em outra modalidade, o sistema de troca de gene compreende os sistemas repres- sor-operador de Iactose ("Lac") a partir de bactéria Escherichia coli. O sistema de gene de troca da presente invenção pode também compreender (a) um primeiro polinucleotídeo codi- ficando para a proteína de fusão transativadora compreendendo um repressor Iac I procarió- tico e um domínio de proteína ativadora transcricional eucariótica; e (b) um segundo polinu- cleotídeo codificando para uma proteína terapêutica ou polipeptídeo terapêutico, em que o referido segundo polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêu- tico. No sistema Lac1 um operon Iac é inativado em ausência de lactose, ou análogos sintéti- cos tal como isopropil-b-D-tiogalactosídeo.
Sistemas de gene de troca adicionais incluem aqueles descritos nas seguintes EUA 7.091.038; W02004078924; EP1266015; EUA20010044151; EUA20020110861 EUA20020119521; EUA20040033600; EUA20040197861; EUA20040235097; EUA20060020146; EUA20040049437; EUA20040096942; EUA20050228016; EUA20050266457; EUA2006100416; EUA20040096942; EUA20050228016; EUA20050266457; EUA20060100416; W02001/70816; W02002/29075; W02002/066612; W02002/066613; W02002/066614; W02002/066615; W02005/108617; EUA 6.258.603; EUA20050209283; EUA20050228016; EUA20060020146; EP0965644; EUA 7.304.162; EUA 7.304.161; MX234742; KR10-0563143; AU765306; AU2002-248500; e AU2002- 306550.
D. Combinação dos Sistemas de Gene de Troca
A presente invenção provê composições de ácido nucléico, células modificadas, e bioreatores compreendendo dois ou mais sistemas de gene de troca compreendendo dife- rentes complexos fator de transcrição dependente de Iigante que são ativados por uma quantidade efetiva de um ou mais ligantes, em que os dois ou mais sistemas de gene de troca compreendem um primeiro gene de troca e um segundo gene de troca, ambos os quais seletivamente induzem expressão de um ou mais polipeptídeos terapêuticos ou poli- nucleotídeos terapêuticos, sobre ligação a um ou mais ligantes. Dentro do objetivo da pre- sente invenção são quaisquer números de e/ou combinações de sistemas de troca de gene.
Em uma modalidade, a presente invenção provê uma composição de ácido nucléico compreendendo:
(c) um primeiro sistema de troca de gene que compreende:
i. um primeiro cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotídeo co- dificando um primeiro polipeptídeo híbrido que compreende:
1. um domínio de transativação, que ativa um promotor regulador por fator opera- cionalmerite associado com um polionucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico; e
2. um domínio parceiro heterodímero,
ii. um segundo cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídeo híbrido que compreende:
1.um domínio Iigante de DNA, que reconhece um promotor regulador por fator ope- racionalmente associado com um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico; e
2. um domínio ligante; e
iii. um terceiro cassete de expressão gênico compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico compreendendo:
1. um promotor regulado por fator, que é ativado pelo domínio de transativação do segundo polipeptídeo híbrido; e,
2. um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo te- rapêutico, e
b. um segundo sistema de expressão que compreende:
i. um primeiro gene cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotí- deo codificando um primeiro polipeptídeo híbrido que compreende:
1. um domínio de transativação, que ativa um promotor regulado por fator operacio- nalmente associado com um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico; e
2. um domínio parceiro heterodímero,
ii. um cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotídeo codificando um segundo polipeptídeo híbrido que compreende:
1. um domínio de ligação de DNA, que reconhece um promotor regulado por fator operacionalmente associado com um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêuti- co ou polinucleotídeo terapêutico; e
2. um domínio de ligação de ligante; e
iii. um terceiro cassete de expressão gênica compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico compreendendo:
1. um promotor regulado por fator, que é ativado pelo domínio de transativação do segundo polipeptídeo híbrido; e,
2. um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo te- rapêutico.
Os múltiplos sistemas de expressão de gene induzível provêem a expressão de um dado polinucleotídeo terapêutico ou polipeptídeo terapêutico sobre condições associadas com doenças, distúrbios ou condições diferentes, ou expressão de múltiplos polipeptídeos terapêuticos ou polinucleotídeos terapêuticos ou sobre as mesmas condições associadas com a mesma doença, distúrbios ou condições.
Em certas modalidades, a combinação de dois ou mais sistemas de troca de genes podem ser (1) um receptor de ecdisona de dupla-troca baseado no sistema de expressão gênica e (2) um receptor de ecdisona de única troca baseado no gene de troca. Em outras modalidade, a combinação pode ser (1) um receptor de ecdisona de única ou dupla troca e (2) um gene de troca baseado em rapamicina. Alternativamente, a combinação de sistemas de gene de troca podem ser dois sistemas de gene de troca baseados em rapamicina idên- ticos revelados acima. Quaisquer combinações possíveis de sistemas de gene de troca es- tão dentro do objetivo da invenção.
Ligantes
O ligante para um complexo fator de transcrição dependente de ligante da invenção se liga ao complexo de proteína compreendendo um ou mais domínios de ligação ao ligante, o domínio parceiro heterodímero, o domínio de ligação do DNA, e o domínio de transativa- ção. A escolha do ligante para ativar o complexo fator de transcrição dependente de ligante depende do tipo do gene de troca utilizado.
Por exemplo, um ligante para o receptor de edisona baseado no gene de troca po- de ser selecionado a partir de quaisquer Iigantes adequados. Ambos, análogos ecdisona ou ecdison de ocorrência natural (por exemplo, 20-hidroxiecdisona, muristerona A, ponasterona A, ponasterona B, ponasterona C, 26-iodoponasterona A, inocosterona ou 26- mesilinocosterona) e indutores não esteróides podem ser usados como um ligante para ge- ne de troca da presente invenção. Patente dos EUA No. 6.379.945 B1, descreve um recep- tor esteróide de inseto isolado a partir de Heliothis virescens ("HRcR") que é capaz de agir como um gene de troca responssivo a ambos, indutores esteróides e certos não esteodais. Indutores não estereodais têm uma vantagem distinta sob os esteróides, neste e muitos ou- tros sistemas que são responssivos a ambos, indutores esteróides e não esteróides, por um número de razões incluindo, por exemplo: custo de fabricação menor, estabilidade metabólí- ca, ausência em insetos, plantas, ou mamíferos e aceitabilidade ambiental. Patente dos EUA No. 6.379.945 B1 descreve a utilidade de dois dibenzoilidrazinas, 1,2-dibenzoil-1-tert- butil-hidrazina e tebufenozida (N-(4-etilbenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)-N'-tert-butil-hidrazina) como ligantes para um gene de troca baseado em ecdisona. Também incluído na presente invenção como um ligante estão outras dibenzoilidrazinas, tais como aquelas reveladas na Pat. dos EUA No. 5.117.057 B1. Uso de tebufenozida como um ligante químico para o re- ceptor de ecdisona a partir de Drosophila melanogaster é também revelado na Patente dos EUA No. 6.147.282. Em adição, exemplos não limitantes de Iigantes ecdisona são 3,5-di- terc-butil-4-hidróxi-N-isobutil-benzamida, 8-O-acetiiarpagida, uma 1,2-diacil hidrazina, uma hidrazina N'-substituída,N,N'-disubstituída, uma dibenzoilalquila cianoidrazina, uma N- substituída-N-alquil-N,N-diaroil hidrazina, uma N-substituída-N-acil-N-alquila, carbonil hidra- ziria ou uma N-aroil-W-alquil-NT-aroil hidrazina (Ver Patente dos EUA No. 6.723.531).
Em uma modalidade, o ligante para um sistema de gene de troca baseado em ecdi- sona é um ligante diacilidrazina ou ligante diacilidrazina quiral. O ligante usado no sistema de gene de troca pode ser os compostos de Fórmula I. <formula>formula see original document page 71</formula> Em que
A é alcóxi, arilalquilóxi ou arilóxi;
B é opcionalmente arila substituída ou opcionalmente heteroarila substituída; e
R1 e R2 são independentemente alquila opcionalmente substituída, arilalquila, hi- droxialquila, haloalquila, cicloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substituída, alquinila opcionalmente substituída, heterociclo opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída;
Ou sais, hidratos, formas cristalinas ou formas amorfas farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos.
Em outra modalidade, o ligante pode ser compostos enantiomericamente enriqueci- dos de Fórmula Il <formula>formula see original document page 71</formula> Em que
A é alcóxi, arilalquilóxi, arilóxi, arilalquila, arila opcionalmente substituída ou hetero- arila opcionalmente substituída;
B é arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; e
R1 e R2 são independentemente alquila, arilalquila, hidroxialquila opcionalmente substituída,
Haloalquila, cicloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substi- tuída, alquinila opcionalmente substituída, heterociclo opcionalmente substituído, arila op- cionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; Com a condição que R1 não seja igual a R2;
Em que a configuração absoluta no átomo de carbono assimétrico dando R1 e R2 é predominantemente S;
Ou sais, hidratros, formas cristalinas ou formas amorfas farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos.
Em certas modalidades, o Iigante pode ser compostos enantiomericamente enri- quecidos de Fórmula Ill
<formula>formula see original document page 72</formula> Formula Ill
Em que
A é alcóxi, arilalquilóxi, arilóxi, arilalquila, arila opcionalmente substituída ou hetero- arila opcionalmente substituída;
B é arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; e
R1 e R2 são independentemente alquila opcionalmente substituída, arilaquila, hidro- xialquila, haloalquila, cicloalquila opcionalmente substituída, alquenila opcionalmente substi- tuída, alquinila opcionalmente substituída, heterociclo opcionalmente substituído, arila op- cionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída;
Com a condição que R1 não é igual a R2;
Em que a configuração absoluta no átomo de carbono assimétrico dando R1 e R2 e predominantemente R;
Ou sais, hidratos, formas cristalinas ou formas amorfas farmaceuticamente aceitá- veis dos mesmos.
Em uma modalidade, um Iigante pode ser N-(1-terc-butil-butil)-N'-(2-eti!-3-metóxi- benzoil)-hidrazida do ácido (R)-3,5-dimetil-benzóico tendo um excesso enantiomérico de pelo menos 95% ou um sal, hidrato, forma cristalina ou forma amorfa farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Os Iigantes diacilidrazina de Fórmula I e Iigantes diacilidrazina quirais de Fórmula Il ou III, quando usados com o sistema de gene de troca baseado em ecdisona, provê os mei- os para regulação temporal externa de expressão de um polipeptídeo terapêutico ou polinu- cleotídeo terapêutico da presente invenção.
Os Iigantes usados na presente invenção podem formar sais. O termo "sal(s)" como usados aqui denotam sais acídicos e/ou básicos formados com ácidos e bases inorgânicos e/ou orgânicos. Em adição, quando um composto de Fórmula I, Il ou Ill contêm ambos uma fração básica e uma fração acídica, anfóteros ("sais internos") podem ser formados e são incluídos dentro do termo usal(s)" como aqui utilizado. Sais farmaceuticamente aceitáveis (isto é, não tóxicos, fisiologicamente aceitáveis) são usados, embora outros sais sejam tam- bém úteis, por exemplo, em passos de isolamento ou purificação que podem ser emprega- dos durante a preparação. Sais dos compostos de Fórmula I, Il ou Ill podem ser formados, por exemplo, pela reação de um composto com uma quantidade de ácido ou base, tal como uma quantidade equivalente, em um meio tal como um em que o sal precipita ou em um meio aquoso seguido pela liofilização.
Os ligantes que contêm uma fração básica podem formar sais com uma variedade de ácidos orgânicos e inorgânicos. Sais de adição ácida exemplares incluem acetatos (tais como aqueles formados com ácido acético ou ácido trialoacético, por exemplo, ácido trifluo- racético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, benzenosulfonatos, bisul- fatos, boratos, butiratos, citratos, canforatos, canforsulfonatos, ciclopentanopropionatos, di- gluconatos, dodecilsuifonatos, etanosulfonatos, fumaratos, glicoeptanoatos, glicerofosfona- tos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, cloridratos (formados com ácido clorídrico), bromidrato (formado com brometo de hidrogênio), iodrato, 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, maleatos (formado com ácido maléico), metanosulfonatos (formado com ácido metanosulfô- nico), 2-naftalenosuifonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3- fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (tal como aqueles formados com ácido sulfúrico), sulfonatos (tais como aqueles aqui men- cionados), tartaratos, tiocianatos, toluenosulfonatos tais como tosilatos, undecanoatos e se- melhantes.
Os Iigantes que contêm uma fração acídica podem formar sais com uma variedade de bases orgânicas e inorgânicas. Sais básicos exemplares incluem sais amônio, sais me- tais alcalinos tais como sais de sódio, lítio e potássio, sais metais alcalinos terrosos tais co- mo sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas (por exemplo, aminas orgânicas) tais como benzatinas, dicicloexilaminas, hidrabaminas (formadas com N,N- bis(deidroabietil)etiienodiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butil ami- nas, e sais com aminoácidos tais como arginina, Iisina e semelhantes.
Exemplos não Iimitantes dos Iignates para o sistema de expressão gênica induzível utilizando o domínio de ligação FK506 são FK506, Ciclosporina A, ou rapamicina. FK506, rapamicina, e seus análogos são revelados na Patente dos EUA Nos. 6.649.595 B2 e 6.187.757. Ver também Patente dos EUA Nos. 7.276.498 e 7.273.874.
Os ligantes aqui descritos podem ser administrados sozinhos ou como parte de uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica está na forma de soluções, suspensões, comprimidos, cápsulas, pomadas, elixires ou composições injetáveis. Composições Farmacêuticas
Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem enchimentos como sacarídeos, por exemplo, Iactose ou sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo, fosfato de tricálcio ou fosfato de hidrogênio de cálcio, bem como Iigado- res tal como pasta de amido, usando, por exemplo, amido de maizena, amido de trigo, ami- do de arroz, amido de batata, gelatina, tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, e/ou polivinil pirrolidona. Se desejado, agentes desintegrantes podem ser adicionados tal como os amidos acima mencionados e também carboximetil- amido, polivinil pirrolidona de ligação cruzada, ágar, ou ácido algínico ou um sal do mesmo, tal como alginatode sódio. Auxiliares são agentes reguladores de fluxo e lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico ou sais dos mesmos, tais como estearato de magné- sio ou estearato de cálcio, e/ou polietileno glicol. Em uma modalidade, núcleos de grágea são providos com revestimentos adequados que, se desejado, são resistentes ao suco gás- trico. Para este propósito, soluções de sacarídeo concentradas podem ser usadas, que po- dem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções Iaca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. A fim de produzir revestimentos resistentes ao suco gástrico, soluções de preparações de celulose adequadas tais como ftalato de acetilcelulose ou ftalato de hidroxipropilmetil- celulose, são usados. Tais corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágeas, por exemplo, para identificação ou a fim de caracterizar com- binações de doses de compostos ativos.
Outras preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente incluem cáp- sulas ajustáveis feitas de gelatina, bem como, cápsulas moles seladas feitas de gelatina e um plastificador tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas ajustáveis podem conter os com- postos ativos na forma de grânulos ou nanopartículas que podem opcionalmente ser mistu- radas com enchimentos tais como lactose, Iigadores tais como amidos, e/ou lubrificantes tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em uma moda- lidade, elas são dissolvidas ou suspensas em líquidos adequados, tais como óleos graxos, ou parafina líquida, opcionalmente com estabilizantes.
Óleos graxos podem compreender mono-, di- ou triglicerídeos. Mono-, di- e triglice- rídeos incluem aqueles que são derivados de ácidos C6, C8, C10, C12, C14, C16, C18, C20 e C22. Diglicerídeos exemplares incluem, em particular, dioleína, dipalmitoleína, e diglicerídeos caprilin-caprina. Triglicerídeos incluem óleos vegetais, óleos de peixe, óleos animais, óleos vegetais hidrogenados, óleos vegetais parcialmente hidrogenados, triglicerídeos sintéticos, triglicerídeos modificados, triglicerídeos fracionados, triglicerídeos de cadeia média e longa, triglicerídeos estruturados, e msituras dos mesmos. Triglicerídeos exemplares incluem: óleo de amêndoa, óleo babassu, óleo de semente de cassis, óleo de canola, óleo castor, óleo de côco, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de semente de uva, óleo de amendo- im, óleo de semente de mostarda, óleo de oliva, óleo de semente de palma, óleo de rapes- sed, óleo de açafroa, óleo de gergelim, óleo de fígado de tubarão, óleo de soja, óleo de gi- rassol, óleo castor hidrogenado, óleo de côco hidrogenado, óleo de palma hidrogenado, óleo de soja hidrogenado, óleo vegeral hidrogenado, óleo de semente de algodão hidrogenado e óleo de rícino hidrogenado, óleo de soja parcialmente hidrogenado, óleo de soja e semente de algodão parcialmente hidrogenado, ticaproato de glicerila, tricaprilato de glicerila, trica- prato de glicerila, triundecanoato de glicerila, trilaurato de glicerila, trioleato de glicerila, trili- noleato de glicerila, trilinolenato de glicerila, tricaprilato/caprato de glicerila, tricaprila- to/caprato/laurato de glicerila, tricaprilato/caprato/linoleato de glicerila, e tricaprila- to/caprato/estearato de glicerila.
Em uma modalidade, o triglicerídeo é o triglicerídeo de cadeia média disponível so- bre a marca registrada de LABRAFAC CC. Outros triglicerídeos incluem óleos neutros, por exemplo, óleos de planta neutros, em particular óleos de côco fracionadas tal como conhe- cido e comercialmente disponível sobre a marca registrada MIGLYOL, incluindo os produtos: MIGLYOL 810, MIGLYOL 812, MIGLYOL 818, e CAPTEX 355. Outros triglicerídeos são tri- glicerídeos de ácido caprílico-cáprico tal como o conhecido e comercialmente disponível sobre a marca registada MYRITOL, incluindo o produto MYROTOL 813. Triglicerídeos adi- cionais desta classe são CAPMUL MCT, CAPTEX 200, CAPTEX 300, CAPTEX 800, NEOBEE M5 e MAZOL 1400.
Composições farmacêuticas compreendendo triglicerídeos podem ainda compreen- der tensoativos lipofílicos e/ou hidrofílicos que podem formar soluções claras sobre dissolu- ção com um solvnete aquoso. Outro tal tensoativo é succinato de tocoferil polietileno glicol 1000 (vitamina E TPGS). Exemplos de tais composições são descritas na Patente dos EUA 6.267.985.
Em outra modalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende LABRASOL (Gattefosse SA), que é glicerídeos PEG-8 caprílico/cáprico. Em outra modalida- de, o veículo farmaceuticamente aceitável compreende PL90G, vitamina E TPGS, e Miglyol 812N.
Preparações farmacêuticas possíveis que podem ser usadas retalmente incluem, por exemplo, supositórios, que consistem de uma combinação de um ou mais ligantes com uma base supositória. Bases supositórias adequadas são, por exemplo, triglicerídeos natu- rais ou sintéticos, ou hidrocarbonetos parafina. Em adição, ele é também possível para uso de cápsulas de gelatina retal que consiste de uma combinação do ligante com uma base. Materiais base possíveis incluem, por exemplo, triglicerídeos líquidos, polietileno glicóis, ou hidrocarbonos parafina.
Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções aquosas do Iigante em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água e soluções alcali- na. Em adição, suspensões do Iigante como suspensões de injeção oleosa apropriada po- dem ser administradas. Solventes ou veículos liofílicos adequados incluem óleos graxos, por exemplo, óleo de sésamo, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, por exemplo, oleat de etila ou triglicerídeos ou polietileno glicol-400. Suspensões de injeção aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluem, por exemplo, carboximetil celulose de sódio, sorbitol, e/ou dextran Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizadores.
As composições tópicas podem ser formuladas como óleos, cremes, loções, poma- das e semelhantes pela escolhe de veículos apropriados. Veículos apropriados incluem ó- Ieos begetais ou minerais, petrolato branco (parafina mole branca), gorduras ou óleos de cadeia ramificada, gorduras animais e álcool de alto peso molecular (maior que C12). Emulsi- ficantes, estabilizadores, umectantes e antioxidantes podem também ser incluídos, bem co- mo agentes dando cor ou fragrância, se desejado. Adicionalmente, aumentadores de pene- tração transdérmica podem ser empregados nessas formulações tópicas. Exemplos de tais aumentadores podem ser encontrados na Patente dos EUA Nos. 3.989.816 e 4.444.762.
Cremes podem ser formulados a partir de uma mistura de óleo mineral, cera de a- belha auto-emulsificante e água em que Iigante dissolvido em uma pequena quantidade de um óleo tal como um óleo de amêndoa, é misturado. Um exemplo típico de tal creme é um que inclui cerca de 40 partes de água, cerca de 20 partes de cera de abelha, cerca de 40 partes de óleo mineral e cerca de 1 parte de óleo de amêndoa.
Pomadas podem ser formuladas por mistura de uma suspensão do Iigante em um óleo vegetal tal como óleo de amêndoa com parafina mole quente e permitindo a msitura arrefecer. Um exemplo típico de tal pomada é uma que inclui cerca de 30% de óleo de a- mêndoa e cerca de 70% de parafina mole branca por peso.
Loções podem ser convenientemente preparadas por preparação de uma suspen- são do Iigante em um álcool de alto peso molecular adequado tal como propileno glicol ou polietileno glicol.
Exemplos de antioxidantes que podem ser adicionados às composições farmacêu- ticas incluem BHA e BHT.
Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende 30 mg de Iigante por ml_ LABRASOL em uma cápsula de gelatina sólida. Em outra modalidade, a cápsula contém 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 mg de ligante.
Composições farmacêuticas podem conter de 0,01% a 99% por peso do ligante. Composições podem ser ou na forma de dose única ou múltipla. A quantidade de ligante em qualquer composição farmacêutica particular dependerá da dose efetiva, que é, a dose re- querida para elicitar a expressão ou supressão gênica desejada. Em uma modalidade, 0,1 a 7,5 mg/kg é administrada ao paciente. Em outra modalidade, 0,1 a 3 mg/kg é administrada ao paciente. Em outra modalidade, 0,1 a 3 mg/kg é administrado.
Vias adequadas de administração das composições farmacêuticas incluem oral, re- tal, tópica (incluindo dérmica, bucal e sublingual), vaginal, parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal, intra-tumoral, e epidural) e tubo naso- gástrico. Será entendido pelos versados na técnica que a via de administração dependerá da condição a ser tratada e pode variar com fatores tal como a condição do recipiente. As composições farmacêuticas podem ser administradas um ou mais vezes diariamente.
Moléculas Terapêuticas
A molécula terapêutica, por exemplo, o polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico pode ser qualquer seqüência que codifica um po- lipetpídeo ou polinucleotídeo que é útil para o tratamento, melhora, ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição. Polipeptídeos terapêuticos podem ser qualquer polipeptídeo conhecido para ser efetivo para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença, distúrbio ou con- dição. Exemplos de classes de polipeptídeos terapêuticos que podem ser usados na inven- ção incluem, sem limitação, citocinas, quimiocinas, hormônios, antibióticos, moléculas tipo imunoglobulina construída, anticorpos de cadeia única, proteínas de fusão, enzimas, molé- culas imuno co-estimulatórias, moléculas imunomodulatórias, mutantes negativos transdo- minantes de proteínas alvo, toxinas, toxinas condicionais, antígenos, proteínas supressoras de tumor, fatores de crescimento, proteínas de membrana, proteínas vasoativas e peptí- deos, proteínas anti-virais ou variantes dos mesmos. Polinucleotídeos terapêuticos incluem, sem limitação, seqüências antisenso, pequenos RNAs interferentes, ribozimas, e seqüên- cias guias de RNA externo. Polinucleotídeos terapêuticos podem ser alvos a qualquer trans- crito associados com uma doença, distúrbio ou condição particular e para a qual é desejado diminuir ou eliminar a expressão. Genes numerosos exibindo elevada expressão durante uma doença, distúrbio ou condição são conhecidos na técnica, incluindo os genes listados nas Tabelas 1-3 acima.
O polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo tera- pêutico é operacionalmente ligado a ou operacionalmente associado com um promotor regu- lado por fator compreendendo pelo menos um elemento resposta que é reconhecido pelo DBD do complexo fato de transcrição dependente de ligante codificado pelo gene de troca. Em uma modalidade, o promotor compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais cópias do elemento resposta. Promotores compreendendo os elementos resposta desejados podem 35 ser promotores de ocorrência natural ou promotores aritificiais criados usando técnicas que são bem conhecidas na técnica, por exemplo, um ou mais elementos respostas operacio- nalmente ligados a um promotor mínimo. Polipeptídeos terapêuticos específicos que podem ser expressos usando um gene de troca terapêutico incluem, mas não são limitados a anticorpos, incluindo anticorpos mo- noclonais, anticorpos mínimos, proteínas de fusão, proteínas miméticas endógenas, enzi- mas, hormônios, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, e fragmentos, variantes ou derivados de qualquer tais polipeptídeos. Moléculas terapêuticas representativas não Iimi- tantes são descritas abaixo. Todas as referências a essas moléculas, incluindo publicações de patente, literatura científica, e números de acesso a seqüência polinucleotídica e polipep- tídica, são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
Anticorpos Monoclonais
Construções de gene de troca terapêuticas da presente invenção podem ser usa-
das para expressar anticorpos monoclonais terapêuticos, ou fragmentos, variantes ou aná- logos dos mesmos (coletivamente "anticorpos monoclonais"). Tais anticorpos monoclonais são úteis para tratamento de doenças e distúrbios incluindo, se limitação, câncer, doenças autoimunes (por exemplo, MS, doença de Crohn1 artrite reumatóide), câncer, doenças infec- ciosas, doenças inflamatórias, alergias, doenças cardíacas, e rejeição de transplante. Anti- corpos para uso na presente invenção incluem quaisquer anticorpos monoclonais terapêuti- cos conhecidos incluindo, mas não limitados àqueles listados abaixo, anticorpos monoclo- nais que se ligam ao mesmo epítopo ou alvo como quaisquer anticorpos monoclonais co- nhecidos. Construções de anticorpo monoclonal para expressão através de construções de gene de troca terapêutico incluem anticorpos multiespecíficos, humanos, humanizados, pri- matizados, ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, por exemplo, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs1 Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia úni- ca, Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), e fragmentos compreendendo ou um domínio VL ou VH. Moléculas ScFv são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA 5.892.019. Moléculas de imunoglobulina ou anticorpo da invenção podem ser de qual- quer tipo (por exemplo, IgG1 IgE, IgM1 IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Fragmentos de anti- corpo, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variá- veis) sozinha(s) ou em combinação com a totalidade ou uma porção do seguinte: uma re- gião de de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3. Também incluído na invenção estão os fragmentos de ligação de antígeno também compreendendo qualquer combinação da regi- ão(ões) variável(is) com uma reigão de dobradiça, domínios CH1, CH2 e CH3.
Em certas modalidades, a presente invenção inclui construções de gene de troca terapêutico que codificam anticorpos monoclonais contra antígenos incluindo, mas não Iimi- tados a CTLA4, CD25, HER-2/neu (ErbB2), CD20, TNFa, EGFR1 e VEGF.
Anticorpos anti-CTLA4 empregados na presente invenção, e métodos de produção dos mesmos, são descritos no Pedido Internacional No. PCT/EUA99/30895, publicado em 29 de Junho de 2000 como W000/37504 (por exemplo, ticilimumab, também conhecido co- mo 11.2.1 e CP-675.206), Pedido de Patente Européia No. EP 1262193 A1, publicado em 12 de Abril de 2002, Pedido de Patente dos EUA No. 09/472.087, agora editado como Pa- tente dos EUA nO. 6.682.736, Pedido de Patente dso EUA No. 09/948.939, agora publicado como Pub. de Pedido de Patente dos EUA No. 2002/0086014 (por exemplo, ipilimumab, também conhecido como 10D1 e MDX-010, Medarex1 Princeton, NJ).
Anticorpos anti-CD25 empregáveis na presente invenção incluem, sem limitação, Daclizumab. Ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.530.101. Daclizumab (nome comer- cial: Zenapax®, comercializado pela Roche) é um anticorpo monoclonal IgGI humanizado direcionado contra CD25 (receptores de IL-2). Funcionando como um antagonista do recep- tor de IL-2, ele se liga com alta afinidade a subunidade Tac do complexo do receptor de II-2 de alta afinidade. Daclizumab é indicado para a profilaxia de rejeição aguda de órgão em pacientes de transplante renal quando usado em combinação com ciclosporina e corticoste- róides.
Anticorpos anti-HER-2/neu (ErbB2) empregáveis na invenção incluem, sem limita- ção, Trastuzumab. Ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.677.171. Trastuzumab (nome comercial: Herceptin®, comercializado por Genentech) é um anticorpo monoclonal humani- zado com alvo contra o domínio extracelular da proteína c-erbB2/HER2/neu, uma proteína dereceptor transmembrana (estruturalmente relacionado ao receptor de Fator de Crescimen- to Epidermal) que é superexpresso em certos tipos de câncer de mama. Como um mediador de citotoxidade celular dependente de anticorpo, trastuzumab é preferivelmente tóxico às células de câncer expressando HER2.
Anticorpos anti-CD20 empregáveis na invenção incluem, sem limitação, rituximab (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.736.137). Rituximab nome comercial: Rituxan®, comercializado por Biogen Idec e Genentech) é um anticorpo quimérico (murino/humano) monoclonal IgGIκ. Rituximab foi inicialmente desenhado e licenciado para tratamento de não Iinfoma de Hodgkin, e mais recentemente tem sido licenciado para tratamento de anti- TNF em artrite reumatóide refratária.
Anticorpos anti-TNFa empregáveis na invenção incluem, sem limitação, Adalimu- mab (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 7.223.394), e Infliximab (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 7138118). Adalimumab, (nome comercial: Humira®, comercializado por Abbott) é um anticorpo monoclonal IgGlK humano recombinante que se liga especifica- mente a TNFa1 assim bloqueando a interação de TNFa com receptores de TNF de superfí- cie p55 e p75. Adalimumab é licenciado para uso em artrite reumatóide, e artrite idiopática juvenil. Indicações adicionais para adalimumab incluem doença de Crohn1 placa psoriática, artrite psoriática, e espondilite anquilosante. Infliximab (nome comercial: Remicade1 comer- cializado por Centocor) é um anticorpo monoclonal IgGlK quimérico recombinante que se liga especificamente ao TNFα, assim bloqueando a interação de TNFa com receptores de TNF de superfície p55 e p75. Infliximab é licenciado para uso na doença de Crohn. Indica- ções adicionais incluem artrite reumatóide, artrite psoriática, placa psoriática crônica severa, e espondilite anquilosante.
Anticorpos anti EGFR (Receptor de Fator de Crescimento Epidermal) empregáveis na invenção incluem, sem limitação, Cetuximab (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 6.217.866). Cetuximab (nome comercial: Erbitux®, comercializado por Imclone e Bristol- Meyers Squibb (América do Norte) e por Merck KgaA (outras áreas) foi um anticorpo mono- clonal quimérico que se liga especificamente ao EGFR. Cetuximab é indicado para câncer coloretal metastático; e câncer de cabeça e pescoço.
Anticorpos anti VEGF empregáveis na invenção incluem, sem limitação, Bevacizu- mab (ver, por exemplo, Patente dos EUA No. 6.383.496). Bevacizumab (nome comercial: Avastin®, comercializado por Genentech) foi um anticorpo monoclonal humano que inibe a função do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), então inibindo neoangiogênese tumoral. Bevacizumab é indicado para tratamento em combinaçao com outros quimioterápi- cos anti-câncer para a primeira e segunda linha de tratamento de pacientes com câncer co- loretal metastático e tratamento de primeira linha de pacientes com câncer de pulmão de célula não pequena não escamosa recorrente ou metastático (NSCLC).
Fusão de Proteínas
Construções de gene de troca terapêuticas da presente invenção podem ser usa- das para expressar protéinas de fusão terapêuticas, tal como uma proteína 2 de ligação a TNFa quimérico. Proteína 2 Iigadora de fator de necrose tumoral (EnbreI) é produzida a par- tir da forma de membrana por processamento proteolítico. Enbrel é uma protéina de fusão recombinante consistindo de dois receptores solúveis de TNF unidos por um fragmento Fc de uma molécula IgGI humana. Ela se liga ao TNF-alfa e bloqueia a interação TBF-alfa com seu receptor. Enbrel é usado para tratar artrite reumatóide moderada a severa. A seqüência aminoácida codificando para Enbrel é disponível a partir da base de dados pública como número de acesso P20333.
As seqüências polinucleotídicas de Enbrel são disponíveis a partir de bases de da- dos públicas como números de acesso DD292498 e DD292499, seqüências das quais são incorporadas aqui por referência.
Enzimas
Construções de gene de troca terapêutica da presente invenção podem ser usada para expressar enzimas terapêuticas, incluindo ativador de plasminogênio tissular. Ativador de plasminogênio, isoforma 3 da preproproteína (tPA) do tipo tissular é uma serino-protease secretada que converte a pró-enzima plasminogênio a plasmina, uma enzima fibrinolítica. Esta enzima desempenha um papel na migração celular e remodelamento tissular. As se- quências aminoácidas codificando para tPA são disponíveis a partir de bases de dados pú- blicas com números de acesso NP_127509 e NP_000921 (ambos humanos), seqüências das quais são incorporadas por referência aqui.
As seqüências polinucleotídicas codificando para tPA estão disponíveis a partir de bases de dados públicas com número de acesso NM_033011 e NM_000930 (ambos huma- nos), seqüências das quais são incorporadas aqui por referência.
Proteínas endógenas miméticas
Construções de gene de troca terapêuticas da presente invenção podem ser usa- das para expressar miméticos terapêuticos de proteínas endógenas, tal como as seguintes.
Alfanato (fator de coagulação III), junto com cálcio e fosfolipídeo atua como um co- fator para o fator IXa quando ele converte o fator X para a forma ativada do fator Xa. Alfana- to é Fator Vlll purificado (também conhecido como fator Anti-hemolítico) e fator de von Wil- lebrand. Alfanato é aprovado para a prevenção e controle de sangramento em pacientes com deficiênca em Fator Vlll devido a hemofolia A ou deficiência de Fator Vlli adquirida. As seqüências aminoácidas codificando para o fator Vlll são disponíveis a partir de bases de dados públicas com números de acesso AAA52485 (humano); e AAA37385 (camundongo), seqüências das quais são incorporadas aqui por referência.
As seqüências polinucleotídicas codificando para o fator Vlll são disponíveis a partir de bases de dados públicas com números de acesso M14113 (humano); e L055573 (ca- mundongo), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
Seqüências de aminoácidos Aralast (inibidor da proteinase alfa-1) são disponíveis a partir de bases de dados com números de acesso AAB59375 (1-antitripsina alfa humanaO; AAC28869 (inibidor de protease alfa-1 de camundongo); e AAA40788 (alfa-1-antitripsina de rato), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
Seqüências polinucleotídicas codificando para inibidor de proteinase alfa-1 são dis- poníveis a partir das bases de dados com números de acesso K01396 (humano); M75721 (camundongo); e M32247 (rato), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
Nesiritida (Natrecor®) é uma forma recombinante de peptídeo natriurético tipo B humano (hBNP) que tem sido aprovado para o tratamento intravenoso de pacientes com falência cardíaca congestiva descompensada aguda (CHF) que tem dispnéia em repouso ou com atividade mínima. A seqüência aminoácida codificando para peptídeo natriurético Cere- bral é disponível a partir da base de dado pública como número de acesso NP_002512, se- qüência das quais é aqui incorporada por referência.
A seqüência polinucleotídica codificando para peptídico natriurético cerebral está disponível em bases de dados públicas com número de acesso NM_002521, seqüência da qual é aqui incorporadas por referência.
A seqüência aminoácida codificando insulina humana é disponível a partir da base de dados pública com número de acesso AAH05255, seqüência da qual é aqui incorporada por referência.
A seqüência polinucleotídica codificando insulina humana é disponível a partir da base de dados pública com número de acesso BC005255, seqüência da qual é aqui incor- porada por referência.
Fator estimulane de colônia de granulócito/macrófago (GM-CSF) é uma citocina que funciona como um fator de crescimento de célula sangüínea branca, estimula células tronco a produzirem granulócitos (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e monócitos. As se- qüências aminoácidas codificando para fator estimulante de colônia granulócito/macrófago (GM-CSF) são disponíveis em bases de dados públicas com números de acesso AAA52122 (humano); NP_034099 (camundongo); NP_001032749 (rato Csf2ra); e NP_598239 (Csf2rb), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
As seqüências aminoácidas codificando para eritropoietina são disponíveis a partir de bases de dados públicas com número de acesso AAH93628 (humano); AA119266 (ca- mundongo); e BAA01593 (rato), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
As seqüências aminoácidas codificando para eritropoietina são disponíveis a partir de bases de dados públicas com número de acesso BC093628 (humano); BC119265 (ca- mundongo); e D10763 (rato), seqüências das quais são aqui incorporadas por referência.
As seqüências aminoácidas codificando para hormônio de crescimento são dispo- níveis a partir de bases de dados públicas com número de acesso AAA98618 (humano); NP_032143 (camundongo); e NP_00103020 (rato), seqüências das quais são aqui incorpo- radas por referência.
As seqüências aminoácidas codificando para hormônio de crescimento são dispo- níveis a partir de bases de dados públicas com número de acesso M13438 (humano); NM_008117 (camundongo); e NM_001034848 (rato), seqüências das quais são aqui incor- poradas por referência.
Proteína Recombinante
Construções de gene de troca terapêuticas da presente invenção podem ser usa- das para expressar proteínas recombinantes terapêuticas, tal como a toxina botulínica. A toxina botulínica inibe a liberação do neurotransmissor acetilcolina nos terminais nervosos, e está disponível sobre o nome BOTOX para o tratamento de estrabismo e blefaroespasmos associados com distonia e distonia cervical. BOTOX é também usado para o tratamento espasmos hemifaciais e um número de outros distúrbios neurológicos caracterizados por contrações musculares anormais. A seqüência aminoácida codificando o precursor da neu- rotoxina botulínica tipo A (BoNT/A) (BontoxiIisin-A) (BOTOX) está disponível em bases de dados com número de acesso P10845.
Tratamento de Doenças Cardiovasculares A presente invenção é ainda direcionada a um método de tratar, melhorar ou pre- venir doença cardiovascular, compreendendo administração a um paciente em necessidade de tal tratamento de um produto de gene terapêutico que melhora, previne ou trata doenças cardiovasculares relacionadas sobre controle de proteínas de troca referenciadas anterior- mente. Tal tratamento pode ser distribuído diretamente ao paciente a ser tratado, ou através de um bioreator contendo células modificadas geneticamente ou não modificadas não en- capsuladas ou encapsuladas que secretam uma ou mais proteínas terapêuticas ou polipep- tídeos terapêuticos como descrito aqui em outro lugar. De acordo com esta modalidade, a célula expressará um ou mais produtos gênicos terapêuticos efetivos no tratamento de do- ença cardiovascular quando transplantado em um paciente, por exemplo, em uma zona de infarto de um paciente com doença cardiovascular. Em certas modalidades, uma célula ge- neticamente modificada da presente invenção expressa um ou mais produtos gênicos tera- pêuticos constitutivamente, isto é, um ou mais produtos gênicos terapêuticos heterólogos são expressos na célula continuamente. Alternativamente, expressão de um, dois, três ou mais produtos gênicos terapêuticos heterólogos expressos pela célula é controlado por um gene de troca terapêutico. Em certos aspectos, bioreatores para tratamento, melhora, ou prevenção de doença cardiovascular compreende células encapsuladas, por exemplo, as células são escapsuladas em uma formulação baseada em alginato. Exemplos e métodos de encapsulamento celular, para prover, por exemplo, uma barreira física ou imunológica a partir de um paciente sendo tratado, são descritos em detalhes em aqui em outro lugar.
A invenção ainda provê uma composição de ácido nucléico compreendendo um ou mais polinucleotídeos que expressam produtos gênicos terapêuticos, por exemplo, polipep- tídeos terapêuticos e/ou polinucleotídeos terapêuticos, úteis para o tratamento, melhora ou prevenção, melhora ou prevenção de doença cardiovascular através de associação operável com um promotor. Em certas modalidades um promotor controlando a expressão de um produto gênico terapêutico é ativado por commplexo fator de transcrição dependente de ligante, onde pelo menos uma porção do fato de transcrição é expresso através de ligação operável a um ou mais promotores de troca terapêuticos, onde a atividade dos promotores de troca terapêuticos é constitutiva e/ou é modulada sobre condições associadas com um tipo de tecido ou associado com uma doença, distúrbio ou condição. Em modalidades rela- cionadas ao tratamento, melhora ou prevenção de doença cardiovascular, um promotor de troca terapêutica pode ser, por exemplo, um promotor específico cardíaco, ou um promotor que é ativado durante condições tais como falência cardíaca congestiva, doença vascular periférica e eventos cardíacos isquêmicos, por exemplo, infarto do miocárdio, ataque cardía- co, falência cardíaca, arritmia, ruptura miocárdica, pericardite e choque cardiogênico. Pro- motores exemplares são apresentados nas Tabelas 1-3. Promotores adicionais são descri- tos aqui em outro lugar, por exemplo, nos Exemplo 1-8. Promotores adicionais podem tam- bém ser facilmente identificados através de métodos aqui descritos.
Exemplos de promotores de troca terapêuticas úteis para expressão de troca gêni- ca regulada em células cardíacas ou sobre condições relacionadas a doenças, distúrbios ou condições cardíacas incluem, sem limitação: o promotor S100A6, que é tecido-específico para miócitos cardíacos (Tsoporis et al, J. Biol. Chem. (2008) (Publicação eletrônica de im- pressão; PMID: 18753141)); promotor da fator Naturético atrial (ANF)1 promotor de cadeia pesada alfa-miosina, promotor c-fos, promotor BNP1 ou promotor de alfa actinas, todos os quais são tecido-específico para cardiomiócitos (Nelson et al, J. Mol. Cell. Cardiol. 39(3):479 (2005)); promotor Eritropoietina1 que é ativado em miocárdio sobre condições isquêmicas (Su et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 99(14):9480 (2002)); promotor AIfaB-CristaIino (CRYAB) incluindo, por exemplo, elemento de resposta BRG1, que é tecido-específico para cristalino de olho vertebrado (Duncan Β. E Zhao K. DNA Cell. Biol. 26(10):745 (2007)); pro- motor AIfaB-CristaIina (CRYAB) com elementos regulatórios atuando em eis, por exemplo, alfa BE-1, alfa BE-2, alfa BE-3, e MRF, que é tecido-específico para músculo esquelético (Gopal-Srivastava et al, J. Mol. Cell. Biol. 15(12):7081 (1995)); promotor NCX1, que é tecido- específico para cardiomiócitos (Xu et al, J. Biol. Chem. 281(45):34430 (2006)); promotor de cadeia pesada beta-miosina, que é tecido-específico para cardiomiócitos (Nelson et al, J. Mol. Cell Cardiol. 39(3):479 (2005), Ross et al, Development. 122(6): 1799 (1996), e Lee et al, Mol. Cell Biol. 14(2):1220 (1994)), promoter ventricular da cadeia leve 2 de miosina inclu- indo um element combinatorial HF-1a/HF-1 b/MEF-2 (Ross et al, Development. 122(6): 1799 (1996)) ou elemento HF-1a/HF-1b e um elemento regulatório HF-3, (Lee et al, Mol. Cell. Biol.14 (2):1220 (1994)), que é tecido específico para ventrículos cardíacos; promotores de ca- deia leve miosina, por exemplo, MLC1F e MLC3F, que são diferencialmente ativados duran- te o desenvolvimento muscular esquelético (Kelly et al, J. Cell. Biol. 129(2):383 (1995)); promotor da cadeia leve 2v da miosina (MLC-2v), que é tecido-específico para músculos cardíacos (Su et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 101 (46): 16280 (2004)); e promotor da tropo- nina I cardíaca (TnIc)1 que é tecido-específica e desenvolvimento estágio-específico em músculos cardíacos (Bhavsar et al, J. Mol. Cell Cardiol. 32(1 ):95 (2000)).
A invenção ainda prove um ou mais vetores compreendendo a composição de áci- do nucléico acima mencionada, e uma ou mais células geneticamente modificadas compre- endendo tais vetores. Tais células podem ser aolgenêicas, autólogas ou xenogenêicas rela- tivas ao paciente a ser tratado. A invenção ainda provê uma ou mais metodologias de en- capsulamento para o tratamento, melhora, ou prevenção de doença cardiovascular compre- endendo as células modificadas acima mencionadas onde as células têm sido tratadas em de tal forma a serm protegidas a partir do sistema imune do paciente sobre introdução no paciente. Tais tratamentos incluem, sem limitação, provisão de um revestimento conformai, microencapsulação ou macroencapsulação. Doenças cardiovasculares incluem, mas não são limitadas a falência cardíaca con- gestiva, doença cardíaca isquêmica, doença cardíaca hipertensiva, doença da artéria coro- nária, doença vascular periférica e eventos cardíacos isquêmicos, por exemplo, infarto do miocárdio, ataque cardíaco, falência coronária, ruptura miocárdica, pericardite, e choque cardiogênico. Causas de tais eventos incluem, sem limitação, trombose, embolismo, atero- esclerose, e estenose. Populações predispostas incluem, sem limitação, fumantes, pessoas com diabetes, hipertensão ou dislipidemia.
Moléculas terapêuticas adequadas para o tratamento, melhora ou prevenção de doença cardiovascular incluem, sem limitação, fatores pró-angiogênicos, fatores cardioprote- toras, e fatores cardiodegenerativos.
As moléculas terapêuticas úteis para a presente invenção para prevenir, tratar, ou melhorar doenças cardiovasculares incluem, sem limitação, o fator natriurético atrial (ANF), carperitida, fator natriurético cerebral (BNP)1 nesiritida, relaxina, fator de crescimento endo- telial vascular (VEGF165), fator de crescimento de hepatócito (HGF), angiopoietin-1 (Ang-1), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF-4), fator de crescimento do tipo insulina 1 (IGF-1), fator induzível de hipóxia 1 - alfa (HIF1-alfa), eritropoietina, ativador de plasminogênio tissular (tPA), hormônio de crescimen- to, Fator derivado de estroma 1 (SDF-1), Ca2+-ATPase do retículo sarco-plasmático (SERCA2a), adenilciclase do tipo Vl (AC6), S100A1, parvalbumina, inibidor da fosfatase 2, e inibidor de fosfatase 1. Essas moléculas são conhecidas por exercer os efeitos em tecidos cardíacos através de vários mecanismos, por exemplo, hemodinâmicos, angiogênese, rege- neração cardíaca, anti-fibrose, e/ou reparo cardíaco. Essas moléculas terpêuticas podem prover múltiplas ações terapêuticas e podem ser usadas em combinação com cada outra ou outras moléculas que são conhecidas do púlbico.
Em uma modalidade, testes clínicos de terapia gênica pró-angiogênica para o tra- tamento, melhora ou prevenção de doença cardiovascular estão correntemente sendo feitos usando proteínas terapêuticas úteis para promoção de neo-vascularização. Esses incluem, sem limitação, fatores pró-angiogênicos tais como VEGF, HGF, bFGF, Ang-1, FGF-4, IGF— 1, e HIF1-alfa bem como fragmentos, variantes e derivados dos mesmos, identificação de moléculas adequadas para promoção de neo-vascularização estão bem dentro das capaci- dades de um versado na técnica. Tais fatores pró-angiogênicos estimulam a neo- angiogênese para suprir oxigênio e nutrientes dentro da zona de infarto. Isto irá limitar a ex- pansão da zona de infarto e sustentar qualquer progenitor cardíaco que migre para o infarto.
De fato, fator pró-angiogênico VEGF165 é conhecido por induzir neovascularização (Benest et al, Microcirculation. 13(6):423(2006); Riley et al, Biomaterials. 27(35):5935 (2006); Shyu et al, Life Sei. 3(5):563 (2003); Arsic et al, Mol Ther. 7(4):450 (2003); Ye et al, J. Heart Lung Transplant. 24(9): 1393 (2005); Lubiatowski et al, Plast. Reconstr. Surg. 110(1): 149 (2002) (Errata em: Plast. Reconstr. Surg. 111(3): 1380 (2003)); Kim et al, Ann. Thorac. Surg. 83(2):640 (2007) (Comentário em: Ann. Thorac. Surg. 83(2):646 (2007)); Thurson G., J. Anat. 200(6):575 (2002); Ryu et ai, Mol. Ther. 13(4):705 (2006); Chae et al, Arterioscier. Thromb. Vasc. Biol. 20(12):2573 (2000); e Chen et al, Acta. Pharmacol. Sin.
28(4):493 (2007)). Os shortcomings dos testes clínicos preliminaries em neovascularização terapêutica têm sido parcialmente atribuídos a administração única de altas doses de fator de crescimento. Ver, Zacchigna et al, Hum. Gene Ther. 18(6):515 (2007) e Yla-Herttuala et al, J. Am. Coll. Cardiol. 49(10):1015 (2007) (Comentário em: J. Am. Coll Cardiol. 50(2):186 (2007)). Desde então, dados pré-clínicos na expressão e liberação de VEGF tem sugerido que exposição prolongada resulta em formação de vasos estáveis, embora distribuição de curto tempo meramente produz vazamentos dos vasos que regride facilmente. Altas concen- trações locais causadas, por exemplo, por produção de VEGF-A por mioblastos resulta em vazamento e vasos anormais, embora quantidades moderadas do fator de crescomento ini- ciaram o crescimento de vasos saudáveis. Ver Arsic et al, Mol. Ther 7(4):450 (2003); Benest et al, Microcirculation. 13(6):423 (2006); Yamauchi et al, J Gene Med. 5(11):994 (2003); Ji- ang et al, Acta Cardiol. 61 (2): 145 (2006); Ozawa et al, J. Clin Invest 113(4):516 (2004). Adi- cionalmente, a combinação de VEGF (iniciação de angiogênese) e Ang-1 (maturação de vasos) tem sido mostrada resultar em crescimento vascular mais estável. Ver Thurston G., J Anat. 200(6):575 (2002); Jiang et al, Acta Cardiol. 61(2):145 (2006); Benest et al, Microcircu- lation 13(6):423 (2006); Zhou et al, Gene Ther. 12(3):196 (2005) (Errata em: Gene Ther. 12(6):552 (2005); Liu et al, Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007); Shyu et al, Life Sei. 73(5):563 (2003); Yamauehi et al, J Gene Med 5(11):994 (2003); Arsic et al, Mo! Ther 7(4):450 (2003); Ye et al, J. Heart Lung Transplant. 24(9): 1393 (2005); Ye et al, Eur J Heart Fail. 9(1): 15 (2007); Lubiatowski et al, Plast Reconstr Surg 110(1): 149 (2002) (Errata em: Plast Reconstr Surg 111 (3): 1380 (2003)); Ryu et al, Mol Ther. 13(4):705 (2006); Chen et al, Eur J Pharmacol 568(1-3):222 (2007); Chae et al, Arterioscier Throm Vasc Biol. 20(12):2573 (2000); e Chen et al, Acta Pharmacol Sin. 28(4):493 (2007).
Além disso, fator pró-angiogênico VEGF165 é conhecido por prevenir, tratar ou me- lhorar várias doenças cardiovasculares (Yamauchi et ai, Gene Med. 5(11):994 (2003) e Xu et al, Cytotherapy 6(3):204 (2004) (Comentário em: Cytotherapy 7(1):74 (2005)) incluindo, sem limitação, infarto do miocársio (Zhou et al, gene Ther. 12(3): 196 (2005) (Errata em: Ge- ne Ther. 12(6):552 (2005); Ye et al, Circulation 116(Suplem. 11):I113 (2007); Liu et al, Scand Cardiovasc J. 41(2):95 (2007); Ye et al, Eur. J. Heart. Fail. 7(6):945 (2005); Zhang et al, Cell Transplant. 14(10):787 (2005); Bonaros et al, Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg. 7(2);249 (2008); Shyu et al, J. Biomed. Sei. 13(1):47 (2006); Ventura et al, J. Biol. Chem. 282(19): 14243 (2007); Sugimoto et al, Jpn1 J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 51 (5): 192 (2003); Yau et al, Ann, Thorac. Surg. 83(3):1110 (2007) (Comentário em: Ann Thorac Surg 83(3):1119 (2007)); Rong et al, Chin1 Med. J. (EngI) 121(4):347 (2008); Yang et al, Cardiol- ogy 107(1): 17 (2007); Wang et al, J. Mol. Cell Cardiol. 40(5):736 (2006); Chen et ai, Eur J Ciin Invest. 35(11):677 (2005); Suzuki et al, Circulation 104 (12 Suplem 1):I207 (2001); Ye et al, Ann. Acad. Med. Singapore 32(Supiem 5):S21 (2003); e Haider et al, J Mol Med.
82(8):539 (2004) (Comentário em: J Mol Med. 82(8):485 (2004)) ou isquemia ou injúria de reperfusão (Becker et ai, Int J Cardiol. 113(3):348 (2006); Gao et al, Can J Cardiol 23(11):891 (2007); Ye et al, Eur J Heart Fail. 9(1):15 (2007); Chen et al, Eur. J. Pharmacol. 568(1-3):222 (2007); e Jiang et al, Acta Cardiol. 61 (2): 145 (2006)).
Além disso, outro fator pró-angiogênico HGF (No de acesso da seqüência nucleotí- fica humana: NP_000592.3), que provê ações multipotentes, são úteis para a presente in- venção. HGF, mediada pelo receptor c-Met, provê um efeito pró-angiogênico através da ati- vidade mitogênica em células endoteliais, um efeito anti-apoptótico cardioprotetor em cardi- omiócitos, um efeito anti-fibrótico através da supressão de sinalização de TGF-beta1, e é um fator regenetativo de colágeno do tipo I através da mobilização de células tronco CD117(+)/c-Met(+)no miocárdio isquêmico. Ver Li et al, Chin Med J (EngI) 121(4):336 (2008); Guo et al, Arch. Med. Res. 39(2): 179 (2008); Ventura et al, J. Biol. Chem. 282(19):14243 (2007); Yang et al, Gene Ther 13(22):1564 (2006); Tambara et al, Circulation 112(Suplem 9):I129 (2005); Zhang et al, Tissue Eng. Part A 14(6):1025 (2008); e Sakaguchi et al, Ann. Thorac. Surg. 79(5): 1627 (2005).
Similarmente, bFGF (No. de acesso da seqüência aminoácida NP_001997) tem si- do mostrado ter o efeito adicional de cardioproteção por promover a angiogênese, neovas- cularização e regeneração tissular. (Doi et al, Heart Vessels, 22(2): 104 (2007); Fujita et al, J. Surg. Res. 126(1):27 (2005); Fujita et al, Wound Repair Regen. 15(1):58 (2007); Hosaka et al, Circulation 110(21):3322 (2004); Iwakura et al, Heart Vessels. 18(2):93 (2003); Lai et al, Tissue Eng. 12(9):2499 (2006); Nakajima et al, J. Artif. Organs 7(2):58 (2004); Perets et al, J. Biomed. Mater. Res. A. 65(4):489 (2003); Pike et al, Biomaterials 27(30):5242 (2006); sa- kakibara et al, J. Thorac Cardiovasc Surg. 124(1):50 (2002); Sakakibara et al, Eur J. Cardio- thorac Surg 24(1): 105 (2003); Shao et al Circ. J. 70(4):471 (2006); Tabata Y. e Ikada Y. Biomaterials 20(22):2169 (1999); Yamamoto et al, Artif. Organs. 27(2):181 (2003); Yama- moto et al, Jpn, Circ. J. 65(5):439 (2001); Yang et al, Ophthalmic Res. 32(1): 19 (2000); e Zhu et al, Chin. Med. Sei. J. 15(4):210 (2000)). Em certas modalidades, bFGF pode ser usa- do para prevenir, tartar, ou melhorar osteoartrite. Ver Inoue et al, Arthritis Rheum. 54(1):264 (2006);
IGF-1 (No de acesso a seqüência aminoácida humana: NP_001104753.1) é tam- bém conhecido exercer função multipotente de proteção de cardiomiócitos a partir de apop- tose e aumento de neovascularização (Su et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284(4):H1429 (2003); Chao et al, J. Gene Med. (4):277 (2003); Rabinovky E.D. e Draghia- Akli R., Mol. Ther. 9(1):46 (2004); e Barton et al, Circulation. 112(Suplem 9):I46 (2005)) e pode ser usado na presente invenção.
Em adição, FGF-4 pode ser usado como uma molécula terapêutica para prevenir, tratar ou melhorar doença cardíaca isquêmica crnica por indução angio-arteriogênese mio- cárdica (Kapur N.K. e Rade J.J., Trends Cardiovasc. Med. 18(4):133 (2008); Henry et al, J. Am. Coll. Cardiol. 50(11):1038 (2007); Grines et al, Am. J. Cardiol. 92(9B):24N (2003); (ne- nhum autor listado) BioDrugs 16(1):75 (2002)).
Além disso, terapia gênica HIF1-alfa, por exemplo, HIF1-alfa (aa 1-390)/VP16 (aa 413-490). É conhecida por tratar, prevenir ou melhorar doença isquêmica por aumentar a expressão do gene BNP (Rajagopalan et al, Circulation 115(10): 1234 (2007) (Comentário em: Circulation 115(10):1180 (2007)); Wilhide M.E. e Jones W.K. Mol. Pharmacol. 69(6): 1773 (2006) (Comentário em: Mol. Pharmacol. 69(6): 1953 (2006)); Luo et al, Mol. Pharmacol. 69(6):1953 (2006) (Comentário em: Mol. Pharmacol. 69(6):1773 (2006)) ou au- mentar a angiogênese em infarto do miocárdio (Shyu et al, Cardiovasc. Res 54(3):576 (2002); Vicent et al, Circulation 102(18):2255 (2000)).
Em certas modalidades, fatores cardioprotetores para o tratamento, melhora ou prevenção de doenças cardiovasculares são providos, ou sozinhos ou em combinação com fatores angiogênicos e/ou fatores cardioregenerativos. Moléculas cardioprotetoras provêem sinal anti-fibrótico e anti-apoptótico para cardiomiócitos residentes, limitam a zona de infarto e fornecem dinais de sobrevivência para células tronco migrantes. Em certas modalidades, o fator cardioprotetor é eritropoietina alfa (EPO) (no. de acesso do aminoácido humano: CAA26095.1), por exemplo, eritropoietina alfa humana ou EPOGEN®, fabricada por Amgen. Eritropoietina tem sido mostrada ter efeitos cardioprotetores, angiogênicos e neuroprotetores (ben-Dor et al, Cardiovasc. Drugs Ther. 21(5):339 (2007); Lin et al, Circ. J. 71(1):132 (2007); Prunier et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(1 ):H522 (2007)).
Outros hormônios cardioprotetores demonstraram ser protetores contra injúria is- quemia-referfuão miocárdica experimental, sem limitação, adrenomedulina, bradicinina, re- laxina, ANF, também conhecida como peptídeo natriurético atrial (ANP, No. de acesso da seqüência nucleotídica humana: NM_006172, No. de acesso da sequÊncia aminoácida hu- mana: NP_006163), BNP, também conhecido como peptídeo natriurético tipo B ou GC-B (No. de acesso da seqüência aminoácida humana: NP_002512.1; No. de acesso da se- qüência nucleotídica humana: M25296), peptídeo natriurético tipo C (CNP), carperitido, ati- vador de plasminogênio tecidual (tPA) e urocortinas. Muitos também tem sido mostrado re- duzir fibrose ou mediar a hemodinâmica. Nesiritida (nome comercial Natrecor®, comerciali- zado por Seios), uma forma recombinante do peptídeo natriurético do tipo B humano, ANF, e Carperitido são usados no tratamento, melhora ou prevenção de falência cardíaca descom- pensada aguda, e pode também ser usada na presente invenção (Burnett J.C. Jr. J. Cardiol. 48(5):235 (2006)).
Relaxina (No. de acesso do aminoácido humano: NP_604390.1), conhecida por seus efeitos no sistema reprodutor feminino, é também um potente vasodilatador da circula- ção sistêmica e coronária por um mecanismo de ácão envolvendo óxido nítrico, e influências da taxa de batimento cardíaco. Relaxina é também conhecida como uma droga cardiovascu- lar que pode prevenir, tratar ou melhorar doença cardíaca isquêmica (infarto do miocárdio agudo ou crônico), fibrose cardíaca, e doença arterial periférica obliterativa e restauração da função cardíaca no transplante celular (Nistri et al, Pharmacol. Res. 57(1 ):43 (2008); Samuel et al, Adv. Exp. Med. Biol. 612:88 (2007); du Xj1 J. Cell. Mol. Med. 11 (5): 1101 (2007); For- migli et al, J. Cell. Mol. Med. 11 (5): 1087 (2007); Bathgate et al, Mol. Cell. Endocrinol. 280(1- 2):30 (2008); Nistri et al, Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. 5(2): 101 (2007); Moore et al, Endocrinology 148(4):1582 (2007); Lekgabe et al, Endocrinology 147(12):5575 (2006); Samuel et al, Pharmacol. Ther. 112(2):529 (2006); Zhang et al, Peptides. 26(9): 1632 (2005); Perna et al, Ann. N.Y. Acad. Sei. 1041:431 (2005); Perna et al, FASEB J. 19(11): 1525 (2005); Samuel et al, Endocrinology 145(9):4125 (2004); Masini et al, Br J Pharmacol 137(3):337 (2002); Ndisang et al, Inflamm. Res. 50 Suplem 2:S122-3 (2001); Dschietzig et al, FASEB J. 15(12):2187 (2001); Bani et al, Am. J. Pathol. 152(5):1367 (1998); e Masini et al, Inflamm. Res. 45 Suplem 1:S27 (1996)).
Em certas modalidades, proteínas terapêuticas da invenção úteis para o tratamen- to, melhora ou prevenção de doenças cardiovasculares têm benefícios terapêuticos múlti- plos. Por exemplo, na fase inicial após infarto do miocárdio, níveis elevados de SDF-1 (No. de acesso da seqüência nucleotídica humana: U16752, No. de acesso da seqüência amino- ácida humana: NP_954637) têm sido reportado na zona de infarto. Isto provê o estímulo requerido para mobilização de células tronco de nichos da MO para o sítio danifiicado como parte de um processo de reparo natural. SDF-1 recruta células tronco hematopoiéticas da medula óssea (primariamente células CD31+, C-kit+ e CD34+) para o coração infartado resul- tando em ambos, atividades neoangiogênicas e cardioprotetoras. Além disso, SDF-1 ativa o fator de sobrevivência celular proteína quinase B (PKB/Akt) através do receptor acoplado a protéina G CXCR4 de fatores regenerativos. Ver também Pub. Pedido de Patente dos EUA No. 20060111290 A1; Elmadbouh et al, J. Mol. Cell. Cardiol. 42(4):792 (2007); Bonaros et al, Interact Cardiovasc. Thorac. Surg. &(2):249 (2008); Zhang et al. J Mol. Cell Cardiol. 44(2):281 (2008); Ma et al, Basic Res Cardiol 100(3):217 (2005); e Zhang et al, Tissue Eng. 13(8):2063 (2007).
Em adição, tPA (No. de acesso do aminoácido humano: 28274638), por exemplo, Ativador de Plasminogênio Tecidual humano ou Retavase®, fabricado por PDL BioPharma1 Inc. É conhecido por prevenir, tratar ou melhorar complicações de transplante cardíaco por inibição de enxertos ateroscleróticos (Scholl et al, J Heart Lung Transplant. 20(3):322 (2001); Dunn et al, Circulation. 93(7):1439 (1996) (Comentário em: Circulation 93(7):1319 (1996));e Gong et al, Gene Ther. 14(21): 1537 (2007)); Além disso, o hormônio de cresci- mento é também conhecido por prevenir, tratar ou melhorar doença cardiovascular e pode ser usado na presente invenção (Isgaard J. e Bergh C.H., BioDrugs 12(4):245 (1999); Fazio et al, J. Clin. Endocrinol. Metab. 92(11):4218 (2007); Climent et al. Curr. Med Chem .14(13):1399 (2007); Perez-Berbel et al, Int. J. Cardiol. 124(3);393 (2008) (Comentário em: Int. J. Cardiol 110(3):313 (2006)); e Le Corvoisier et al, J Clin Endocrinol Metab. 92(1): 180 (2007)) por promoção de angiogênese e apoptise atenuada (Rong et al, Chin Med J (EngI) .121(4):347 (2008)).
Em outras modalidades, as moléculas terapêuticas que restauram a função cardía- ca estão incluídas na presente invenção. Moléculas de reparo cardíaco incluem, mas não são limitados a, SERCA2a, AC6, S100A1, parvalbumina, inibidor da fosfatase 2 e inibidor da fosfatase 1. Por exemplo, SERCA2a é conhecido por aumentar a contratilidade cardíaca in vivo e in vitro e função cardíaca na falência cardíaca (Asahi et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA .101(25):9199 (2004); Cavagna et al, J. Physiol. 528 Pt 1:53 (2000); Chaudhri et al, Mol Cell Biochem 251 (1-2): 103 (2003); Davia et al, J. Mol. Cell Cardiol 33(5): 1005 (2001); del Monte et al, Circulation 100(23):2308 (1999) (Comentário em : Circutalion 100(23):2303 (1999); del Monte et al, Circulation 104(12):1424 (2001); Hajjar et al, Cir Res 81(2):145 (1997) (Comen- tário em: Circ. Res. 88(4):373 (2001) e Circulation 101(7):790 (2000)); Kawase et al, J. Am. Coll. Cardiol. 51(11):1112 (2008); Maier et al, Cardiovasc Res. 67(4):636 (2005) (Comentário em: Carfdiovasc Res. 67(4):581 (2005); Meyer M. e Dillmann W.H., Cardiovasc. Res. .37(2):360 (1998); Miyamoto et al, Proc. Natl Acad Sci EUA 97(2):793 (2000); Muller et al, Cardiovasc Res. 59(2):380 (2003); Sakata et al, J. Mol. Cell Cardiol 42(4):852 (2007); Sa- kata et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 292(2):H1204 ; Schmidt et al, Circulation .101(7):790 (2000) (Comentário em: Circulation 101(7):738 (2000). Circ Res. 81 (2): 145 (1997), Circ Res. 83(9):889 (1998), e Circulation 95(2):423 (1997)) Suarez et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(5):H2164 (2004); Terracciano et al, Cell Calcium 31(6):299 (2002); Trost et al, Diabetes 51 (4): 1166 (2002); e Vetter et al, FASEBJ 16(12): 1657 (2002).
Além disso, AC6 é conhecido por restaurar a afinidade da SERCA2a ao cálcio e ve- Iocidade máxima de captação de cálcio cardíaca pelo retículo sarcoplasmático em cardiomi- opatia (Gao et al, Proc. Natl. Acad. Sci EUA 95(3): 1038 (1998); Roth et al, Circulatiom .99(24):3099 (1999); Lai et al, Circulation 102(19):2396 (2000); Roth et al, Circulation .105(16)1989 (2002) (Comentário em: Circulation 105(16)1876 (2002)); Gao et al, Cardiovasc Res. 56(2): 197 (2002) (Comentário em: Cardiovasc Res. 56(2): 181 (2002)); Roth et al, Basic Res Cardiol 98(6):380 (2003); Roth et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 287(1 ):H172; Gao et al, J Biol Chem. 279(37):38797 (2004); Tang et al, Am J Physiol Heart Cire Physiol. .287(5):H1906 (2004); Lai et al, Circulation. 110(3):330 (2004) (Comentário em: Circulation 110(3):242 (2004); Roth et al, Hum Gene Ther 15(10):989 (2004); Timofeyev et al, J. Mol. Cell Cardiol. 41(1): 170 (2006) (Comentário em: J Mol Cell Cardiol 41(3):424 (2006); Takaha- shi et al, Circulation. 114(5):388 (2006) (Errata em: Circulation 114(11):e497 (2006); Comentário em: Circulation 114 (5):365 (2006); Sastry et al, J Am Coll Cardiol 48(3):559 (2006); Rebolledo et al, HumGeneTher. 17(10):1043 (2006); Hammond H.K., Ann N Y Acad Sei. 1080:426 (2006); Phan et al, Trends Cardiovasc Med. 17(7):215 (2007); Tang et al, Cir- culation 117(1):61 (2008); e Lai et al, J Am Coll Cardiol. 51(15):1490 (2008)).
Em certas modalidade, a protein Iigadora de Ca2+ S100A1 pode restaurar a função cardíaca e assim ser usada na presente invenção. S100A1 é conhecida por aumentar a con- tração miocárdica in vivo e reduzir a propensão a falência cardíaca após infarto do miocár- dio. (Most et al, J Clin Invest. 114(11): 1550 (2004); Most et al, Circulation 114(12): 1258 (2006); Pleger et al, Mol Ther 12(6): 1120 (2005); Pleger et al, Eur J Med Res 11(10):418 (2006); Remppis et al, J Gene Med. 6(4):387 (2004(; Most et al, Am J Physiol regul Intergr Comp Physiol 293(2):R568 (2007); Remppis et ai, Basic Res Cardiol. 97 Suplem 1:156 (2002); Pleger et al, Circulation 115(19):2506 (2007); e Most et al, J Biol Chem. 278(36):33809 (2003)). Outros exemplos não Iimitantes das moléculas terapêuticas que au- mentam ou restauram a função cardíaca são: paralbumina (Hirsch et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286(6):H2314 (2004); Michele et al, Mol Ther 10(2):399 (2004); e Sakata et al, J Mol Cell Cardiol. 42(4):852 (2007), inibidor da fosfatase 2 (Yamada et al, FASEB J. 20(8): 1197 (2006); Gupta et al, Mol Cell Biochem. 269 (1-2):49 (2005); e Kirchhefer et al, Cardiovasc Res. 68(1 ):98 (2005)) e inibidor da fosfatase 1 (Gupta et al, Mol Cell Biochem. 269(1-2):49 (2005) e Gupta et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol 285 (6):H2373 (2003)).
Moléculas terapêuticas adicionais que podem ser úteis para a presente invenção para prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou distúrbio incluem, mas não são limitadas a, anticorpos monoclonais (por exemplo HERCEPTIN®-HC, HERCEPTlN®-LC, TICILIMUMABO-HC, TICILIMUMAB®-LC, ZENAPAX®-HC, ZENAPAX®-LC, HUMIRA®-HC, HUMIRA®-LC, RITUXAN®-HC, RITUXAN®-LC, IPILIMIMAB®-HC, IPILIMUMAB®-LC, AVASTIN®-HC, AVASTIN®-LC, Eritux®-HC e ERBITUX®-LC), enzimas recombinantes (por exemplo, RETAVASE®, ACTRAPID®-cadeia A, ACTRAPID®-cadeia B, NEULASTA®, pré- pró-insulina, EPOGEN®, e NORDITROPIN®), proteína de fusão (por exemplo, ENBREL®), ou quaisquer proteínas purificadas (por exemplo, ALPHANATE® e ARALAST®). Em adição, identificação de moléculas terapêuticas para prevenção, tratamento ou melhora de uma doença ou distúrbio particular é bem conhecida dentro das capacidades de um versado na técnica.
Vetores e Células Hospedeiras
Para introduzir os poünucleotídeos nas células, um vetor pode ser usado. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor plasmídeo ou um vetor viral de RNA ou DNA de fita simples ou dupla. Tais vetores podem ser introduzidos em células por técnicas bem conhecidas para introduçãod e DNA e RNA em células. Vetores virais podem ter replicação competente ou replicação defeituosa. No último caso, propagação viral geralmente ocorrerá somente célu- las competentes virais complementares.
Então, no mínimo, os vetores devem incluir os polinucleotídeos da invenção. Outros componentes do vetor pode incluir, mas não serem limitados por, marcadores selecionáveis, domínios de modificação de cromatina, promotores adicionais dirigindo a expressão de ou- tros polipeptídeos que podem també estar presentes no vetor (por exemplo, polipeptídeo letal), sítios de integração genômica, sítios de recombinação, e pivôs de inserção molecular. Os vetores podem compreender qualquer número desses elementos adicionais, dentro ou não dos polinucleotídeos, tal que o vetor pode ser feito para objetivos específicos dos méto- dos terapêuticos desejados.
Em uma modalidade da presente invenção, os vetores que são introduzidos nas cé- lulas ainda compreendem um "gene marcador selecionável" que, quando expresso, indica que a construção de gene de troca terapêutico da presente invenção tem sido integrado no genoma da célual modificada. Desta forma, o gene seletor pode ser um marcador positivo para a integração genômica. Enquanto não crítico aos métodos da presente invenção, a presença de um gene marcador selecionável permite o prático selecionar uma população de células vivas onde a construção do vetor tem sido integrada no genoma das células. Então, certas modalidades da presente invenção compreendem células selecionadas ondeo o vetor tem sido integrado com sucesso. Como aqui utilizado, o termo "selecionar" ou variações dos mesmos, quando usado em conjunto com células, é tencionado significar métodos bem co- nhecidos, padrões para escolhad e células com um perfil genético específico ou fenótipo. Métodos típicos incluem, mas não são limitados a, cultura de células em presença de antibi- oóticos, tais como G418, neomicina e ampicilina. Outros exempos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, genes que conferem resistência a diidrofo- lato redutase, higromicina, ou ácido micofenólico. Outros métodos de seleção incluem, mas não são limitados a, um gene marcador selecionável que permite o uso de timidina quinse, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase ou adenina fosforibosiltransferase como agentes de seleção. Células compreendendo uma contrução de vetor compreendendo um gene ou genes de resistência a antibiótico podem então ser capazes de tolerar o antibiótico em cultu- ra. Assim, células não compreendendo uma construção vetor compreendendo um gene ou genes de resistência ao antibiótico podem não ser capazes de tolerar o antibiótico em cultu- ra.
Como aqui utilizado, um "domínio de modificação de cromatina" (CMD) refere-se a seqüências nucleotídicas que interagem com uma variedade de proteínas associadas com manutenção e/ou alteração da estrutura da cormatina, tal como, mas não limitado a, isolan- tes de DNA. Ver Ciavatta et ai, Proc. Nat'l Acad. Sei. EUA 103:9958 (2006), que é aqui in- corporado por referência. Exemplos de CMDs incluem, mas não são limitados a, isolante de β-globulina de galinha e sítio hipersensível 4 de galinha (cHS4). O uso de seqüências CMD diferentes entre um ou mais programas gênicos (isto é, um promotor, seqüência codificante, e região regulatória 3'), por exemplo, pode facilitar o uso de seqüências de DNA CMD dife- rencial como "mini braços de homologia" em combinação com vários microorganismos ou tecnologias de recombinação in vitro para programas gênicos "de troca" entre vetores de ponte de existência multigênica ou monogênica. Outros exemplos de domínios de modifica- ção de cromatina são conhecidos na técnica ou pode ser facilmente identificados.
Vetores particulares para uso com a presente invenção são vetores de expressão que codificam polipeptídeos ou polinucleotídeos. Geralmente, tais vetores compreendem regiões de controle de cis-actina efetivos para expressão em uma célula modificada, opera- cionalmente ligado ao polinucleotídeo a ser expresso. Fatores trans-ação apropriados são fornecidos pela célula modificada, fornecidos por um vetor de complementaridade ou forne- cido pelo vetor sozinho sobre introdução na célula.
Uma grande variedade de vetores de expressão podem ser usados para expressar polipeptídeos ou polinucleotídeos. Tais vetores incluem vetores cromossomais, episomais ou derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, a partir de bacteriófago, a partir de episomas de levedura, a partir de elementos cromossomais de levedura, a partir de vírus tais como vírus adeno-associado, lentivírus, baculovírus, papova vírus, tal como SV40, vírus vaccínia, adenovírus, vírus fowlpox (varíola aviária), vírus da pseudo -raiva e retrovírus, e vetores derivados a partir de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados do plasmídeo e elementos genéticos bacteriófago, tais como cos- mídeos e fagemídeos. Todos podem ser usados para expressão de acordo com este aspec- to da presente invenção. Geralmente, qualquer vetor adequado para manter, propagar ou expressar polinucleotídeos ou polipeptídeos em uma célula pode ser usado para expressão neste sentido.
A seqüência polinucleotídica no vetor de expressão é operacionalmente ligada a(s) sequência(s) controle(s) de expressão apropriadas incluindo, por exemplo, um promotor para direcionar a transcrição do RNAm. Representativos de promotores adicionais incluem, mas não são limitados a promotores constitutivos e promotores tecido-específico ou induzí- veis. Exemplos de promotores eucarióticos constitutivos incluem, mas não são limitados ao promotor do gene da metanotioneína I de camundongo (Hamer et al, J. Mo. Appl. Gen. 1:273 (1982)); o promotor TK do vírus da Herpes (McKnight, Cell 31:355 (1982)); e promotor inicial SV40 (Benoist e tal, Nature 290:304 (1981)); e o promotor do vírus vaccinia.
Todas as referências listadas acima são aqui incorporadas por referência. Exem- plos adicionais dos promotores que podem ser usados para dirigir a expressão de uma pro- teína ou poiinucleotídeo incluem, mas não são limitados a, promotores tecido-específicos e outros promotores endógenos para proteínas específicas, tais como promotor albumina (he- patócitos), um promotor de pró-insulina (céluulas beta pancreáticas) e semelhantes. Em ge- ral, contruções de expressão conterão sítios para transcrição, iniciação e terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossomo para tradução. A porção codificadora dos transcritos maduros expressos pelas construções podem incluir uma tradução iniciando em AUG no começo e um códon de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicio- nado no fim do polipeptídeo a ser traduzido.
Em adição, as construções podem conter regiões de controle que regulam, bem como produzir a expressão. Geralmente, tais regiões operarão por controle da transcrição, tal como sítios de ligação repressores e aumentadores, entre outros.
Exemplos de vetores eucarióticos incluem, mas não são limitados a, pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 e pSG diponível de Strategene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL dis- poníveis de Amersham Pharmacia Biotech; e pCMVDsRed2-expresso, plRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, e pCMV-EGFP disponível de Clontech. Muitos outros vetores são bem co- nhecidos e comercialmente disponíveis.
Vetores particularmente úteis, que compreendem pivôs da inserção molecular para rápida inserção e remoção de elementos de programas gênicos são descritos na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2004/0185556, Pedido de Patente dos Esta- dos Unidos No. 11/233.246, e Pedido de Publicação Internacional Nos. W02005/040336 e WO 2005/116231, todas as quais são aqui incorporadas por referência. Um exemplo de tais vetores é o Sistema de Produção UltraVector® (Intrexon Corp., Blacksburg, VA), como des- crito na WO 2007/038276, aqui incorporado por referência. Como aqui utilizado, um "pro- grama gênico" é uma combinação de elementos genéticos compreendendo um promotor (P), uma seqüência de expressão (E) e uma seqüência regulatória 3'(3), tal que "PE3" é um programa gênico. Os elementos dentro do programa gênico podem ser facilmente trocados entre pivôs moleculares que flaqueiam cada um dos elementos do programa gênico. Um pivô molecular, como aqui utilizado, é definido como um poiinucleotídeo compreendendo pelo menos dois sítios de restrição raros ou incomuns não variáveis arranjados em uma forma linear. Em uma modalidade, o pivô molecular compreende pelo menos sítios de restri- ção raros ou incomuns não variáveis arranjados em uma forma linear. Tipicamente, qualquer um pivô molecular pode não incluir um sítio de restrição raro ou incomun de qualquer outro pivô molecular dentro do mesmo programa gênico. Seqüências cognatas de mais que 6 nu- cleotídeos sobre os quais uma dada enzima de restrição atua são referidos como sítios de restrição "raros". Existem, entretanto, sítios de restrição de 6 pb que ocorrem mais infre- quentemente que podem ser estatisticamente preditos, e esses sítios e as endonucleases que os clivam são referidos commo sítios de restrição "incomuns". Exemplos de enzimas de restrição raras ou incomuns incluem, mas não são limitada a AsiS I, Pac I1 Sbf I, Fse I, Asc I1 Mlu I1 SnaB I1 Not I1 Sal I, Swa I, Rsr II, BsiW I, Sfo I, SgrAI1 Afllll1 Pvu I1 Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I1 Srf I, e Sse8781 I.
O vetor pode também compreender sítios de restrição para uma segunda classe de enzimas de restrição chamadas enzimas endonucleases de orientação Çhoming") (HE). En- zimas HE têm grandes sítios de restrição assimétricos (12-40 pares de base), e seus sítios de restrição são infrequentes na natureza. Por exemplo, o HE conhecido como I-Scel tem um sítio de restrição de 18 pb (5TAGGGATAACAGGGTAAT3' (SEQ ID NO:4)), predita o- correr uma vez a cada 7x1010 pares de bases de seqüência aleatória. Esta taxa de ocorrên- cia é equivalente a somente um sítio em um genoma que é 20 vezes o tamanho de um ge- noma mamífero. A natureza rara dos sístios HE grandemente aumentam a probabilidade de um engenheiro genético poder cortar um programa gênico sem romper a integridade do pro- gram gênico se sítios HE foram incluídos em locais apropriados em um plasmídeo vetor de clonagem.
Seleção de vetores apropriados e promotores para expressão em uma célula hos- pedeira é um procedimento bem conhecido, e as técnicas requisitadas para construção do vetor e introdução em uma célula hospedeira, bem como sua expressão na célula hospedei- ra são rotinas versadas na técnica.
A introdução dos polinucleotídeos nas células podem ser uma transfecção transien- te, transfecção estável, ou podem ser uma inserção locus-específica do vetor. Transfecção transiente e estável dos vetores na célula hospedeira pode ser efetuada por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em muitos manuais padrões de laboratório, tais como Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology (1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185:527-37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor La- boratory Press, N.I., que são aqui incorporados por referência. Esses métodos de transfec- ção estáveis resultam em inserção aleatória do vetor no genoma da célula. Ainda, o número de cópias e orientação dos vetores são também, geralmente falando, aleatórios.
Em outra modalidade, inserção locus-específica pode ser realizada por inserção gênica sítio específico de recombinase. Brevemente, enzimas recombinase bacteriana, tal como, mas não limitada a, PhiC31 integrase pode atuar nos sítios de recombinação "pseu- do" dentro do genoma humano. Esses sítios de recombinação pseudo podem ser alvos para inserção locus-específica usando as recombinases. Inserção gênica sítio-específica de re- combinase é descrita em Thyagarajan et al, Mol. Cell Biol. 21:3926 (2001), qie é aqui incor- porada por referência. Outros exemplos de recombinases e seus respectivos sítios que po- dem ser usados para inserção gênica sítio-específica de recombinase, mas não são limita- das a, serina recombinases tais como R4 e TP901-1 e recombinases descritas em WO 2006/083253, aqui incorporada por referência.
A fim de integrar estavelmente o um ou mais sistemas de expressão gênica no ge- noma de uma célula modificada, quaisquer métodos conhecidos de integração podem ser usados para o propósito desta invenção. Em uma modalidade, inserção locus-específica pode ser realizada por inserção gênica sítio específica de recombinase. Brevemente, enzi- mas recombinase bacterianas, tais como mas não limitadas a, PhiC31 integrase podem atu- ar nos sítios de recombinação "pseudo" dentro do genoma humano. Ver Publicação dos EUA No. 2004/0003420 A1; Groth et al, Proc. Natl. Acad. Science, 97, 5995-6000 (2000). Esses sítios de pseudo recombinação podem ser alvos para inserção locus-específica u- sando as recombinases. Inserção gênica sítio-específica de recombinase é descrita em Th- yagarajan, B. et al, Mol. Cell Biol. 21(12):3926-34 (2001).
Em certas modalidades, o primeiro sistema de expressão gênico induzível ainda compreende uma integrase, que será estavelmente integrada no primeiro sistema de gene de troca nos pseudos-sítios dentro do genoma das células alvo. Um segundo sistema de gene de troca pode também compreender uma integrase, que irá integrar o segundo siste- ma de gene de troca nos pseudo-sítios dentro do genoma das células alvo. O primeiro sis- tema de gene de troca pode ainda compreender um sítios aceptor de integrase, que pode permitir integração do segundo sistema de gene de troca induzível no sítio aceptor pré- posicionado dentro do genoma das células alvo.
A seqüência polipeptídica seguinte foi reportada como uma seqüência polipeptídica codificando a seqüência polipeptídica integrase de fase PhiC31 de Streptomyces e tem o número de acesso NPJ347874 no GenBank.
Fago Streptomyces phiC31 integrase (605 aa) (SEQ ID NO:6)
1 mdtyagaydr qsrerenssa aspatqrsan edkaadlqre verdggrfrf vghfseapgt 61 safgtaerpe ferilnecra grlnmiivyd vsrfsrlkvm daipivsell algvtivstq 121 egvfrqgnvm dlihlimrld ashkesslks akildtknlq relggyvggk apygfelvse 181 tkeitrngrm vnwinklah sttpltgpfe fepdvirwww reikthkhlp fkpgsqaaih 241 pgsitglckr mdadavptrg etigkktass awdpatvmri lrdpriagfa aeviykkkpd 301 gtpttkiegy riqrdpitlr pveldcgpii epaewyelqa wldgrgrgkg lsrgqailsa 361 mdklycecga vmtskrgees ikdsyrcrrr kwdpsapgq hegtcnvsma aldkfvaeri 421 fnkirhaegd eetlallwea arrfgkltea peksgeranl vaeradalna leelyedraa 481 gaydgpvgrk hfrkqqaalt lrqqgaeerl aeleaaeapk lpldqwfped adadptgpks 541 wwgrasvddk rvfvglfvdk iwtksttgr gqgtpiekra sitwakpptd ddeddaqdgt 601 edvaa
Outros exemplos de recombinases e seus respectivos sítios que podem ser usados para inserção do gene sítio-específico de recombinase inclui, mas não são limitados a seri- no-recombinases tais como R4 e TP901-1. Recombinases sítio-específicas (SSRs), tal como a Cre recombinase derivada de bacteriófago P1 reconhecem seqüências de DNA específi- cas ("sitos de reconhecimento", "seqüências de reconhecimento", ou "sítio aceptor de inte- grase") e catalisam recombinação entre dois sítios de reconhecimento. Cre recombinase, por exemplo, reconhece o motivo IoxP de 34 pares de base (pb) (Austin et al, Cell 25,729- 736 (1981)). Se dois sítios são localizados na mesma molécula de DNA na mesma orienta- ção, a seqüência de DNA interveniente é cortada pela recombinase a partir da molécula pa- rental como um círculo fechado, deixando um sítio de reconhecimento em cada dos produ- tos de reação. Se dois sítios estão na orienação invertida, a região flanqueada do sítio de reconhecimento é invertida através de recombinação mediada por recombinase. Alternati- vamente, se os dois sítios de reconhecimento estão localizados nas moléculas diferentes, recombinação mediada por recombinase liderará a integração de uma molécula circular ou translocação entre duas moléculas lineares.
Em adição ao Cre, umas poucas recombinases têm sido mostradas exibir alguma atividade em células mamíferas. Os melhores exemplos caracterizados são a FLP derivada de levedura e Kw recombinases, que exibem atividade ótima a 30°C e são instáveis a 37°C (Buchholz et al, Nature Biotech., 16, 657-662 (1998); Ringrose et al, Eur. J. Biochem., 248, 903-912). Outras recombinases que mostram alguma atividade em células mamíferas inclu- em uma integrase mutante do fago lambda, as integrases do fago HK022, mutante gama delta-resolvase e beta-recombinase (Lorbach et al, J. Mol. Biol., 296, 1175-81 (2000); Kolot et al, Moi. Biol. Rep. 26,207-213 (1999); Schwikardi et al, FEBS Lett., 471, 147-150 (2000); Diaz et al, J. Biol. Chem., 274, 6634-6640 (1999)). Além disso, uma versão melhorada da integrase phiC31 tem sido desenvolvida. Esta C31-lnt modificada (C31-lnt (CNLS)) carreia um sinal de localização C-terminal nuclear (NLS) e mostra uma eficiência de recombinação em células mamíferas que é significantemente aumentada comparada a forma selvagem e é comparável àquela da Cre recombinase (EP 1205490; Publicação dos Estados Unidos No. 2004/0003420 A1). Isto faz o C31-lnt uma ferramenta valiosa para modificação de genoma mamífero.
Em uma modalidade da invenção, o vetor é inserido em um sítio bio-neutro no ge- noma. Um sítio bio-neutro é um sítio do genoma onde a inserção dos polinucleotídeos inter- fere muito pouco, se interferir, com a função normal da célula. Sítios bio-neutros podem ser analisados usando bioinformática disponível. Muitos sítios bio-neutros são conhecidos na técnica, por exemplo, Iocus ROSA-equivalente. Outros sítios bio-neutros podem ser identifi- cados usando técnicas de rotina bem conhecidas na técnica. Caracterização do(s) sítio(s) de inserção genômica é feita usando métodos conhecidos na técnica. Para controlar a loca- ção, número de cópia e/ou inserção dos polinucleotídeos quando introduzindo o vetor nas células, métodos de inserção locus-específica podem ser usados. Métodos de inserção Io- cus-específica são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a recombi- nação homóloga e inserção de genoma mediada por recombinase. Claro, se métodos de inserção locus-específica são para ser usados nos métodos da presente invenção, os veto- res podem compreender elementos que ajudam nesta inserção locus-específica, tal como, mas não limitada a recombinação homóloga. Por exemplo, os vetores podem compreender um, dois, três, quatro ou mais sítios de integração genômica (GISs). Como aqui utilizado, um "sítio de integração genômica" é definido como uma porção da seqüência de vetor cuja se- qüência nucleotídica é idêntica ou quase idêntica a porções do genoma dentro das células que permitam a inserção do vetor no genoma. Em particular, o vetor pode compreender dois sítios de inserção genômica que flanqueia pelo menos os polinucleotídeos. Claro, os GISs podem flanquear elementos adicionais, ou mesmo todos os elementos presentes no vetor.
Em uma modalidade adicional, o vetor pode compreender um gene quimio- resistente, por exemplo, o gene de resistência a múltiplas drogas mdr1, diidrofolato reduta- se, ou 06-alquilguanina-DNA alquiltransferase. O gene da quimio-resistência pode estar so- bre o controle de um promotor constitutivo (por exemplo, CMV) ou induzível (por exemplo, RheoSwitch®). Nesta modalidade, se é desejado tratar uma doença em um paciente en- quanto mantendo as células modificadas dentro do paciente, um médico pode aplicar um agente quimioterápico para destruir células doentes enquanto as células modificadas podem ser protegidas a partir do agente devido a expressão de um gene quimio-resistente e pode continuar a ser usada para tratamento, melhora ou prevenção de uma doença, distúrbio ou condição. Colocando o gene quimio-resistente sobre um promotor induzível, a expressão desnecessária do gene da quimio-resistência pode ser evitado, ainda ele irá estar disponível em caso do tratamento continuado ser necessário. Se as células modificadas por si mesmas se tornar doentes, elas podem ainda ser destruídas por indução da expressão de um poii- peptídeo letal como descrito abaixo.
Os métodos da invenção são realizados por introdução de polinucleotídeos codifi- cando o gene de troca e o polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em célu- las de um paciente. Qualquer método conhecido para introdução de um polinucleotídeo em uma célula conhecido na técnica, tal como aqueles descritos acima, podem ser usados.
Quando os polinucleotídeos estão para ser introduzidos em células ex vivo, as célu- las podem ser obtidas a partir de um paciente por qualquer técnica conhecida na arte, inclu- indo, mas não limitada a, biópsias, raspagens, e remoção cirúrgica de tecido. As células isoladas podem ser cultivadas por uma quantidade suficiente de tempo para permitir os poli- nucleotídeos serem introduzidos nas células, por exemplo, 2, 4, 6, 8, 10, 13, 18, 24, 36, 48 horas ou mais. Métodos para cultura primária de células por curtos períodos de tempo são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, células podem ser cultivadas em placas (por e- xemplo, em placas de micropoços) ou aderidas ou em suspensão.
Para métodos terapêuticos ex vivo, células são isoladas a partir de um paciente e cultivadas sobre condições adequadas para introdução dos polinucleotídeos nas células. Uma vez os polinucleotídeos tenham sido introduzidos nas células, as células são incubadas por um período de tempo suficiente para permitir o complexo fator de transcrição dependen- te de ligante ser expresso, por exemplo, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 ou 24 horas ou mais. Em algum ponto depois a introdução dos polinucleotídeos nas células (ou antes ou após os níveis significantes do complexo fator de transcrição dependente de ligante é ex- presso), as células são introduzidas de volta ao paciente. Reintrodução pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, infusão intravenosa ou injeção di- reta em um tecido ou cavidade. Em uma modalidade, a presença dos polinucleotídeos nas células é determinada antes da introdução das células de volta ao paciente. Em outra moda- lidade, células contendo os polinucleotídeos são selecionadas (por exemplo, baseadas na presença de um marcador selecionável nos polinucleotídeos) e somente essas células con- tendo os polinucleotídeos são re-introduzidas no paciente. Após as células serem reintrodu- zidas ao paciente, ligante é administrado ao paciente para induzir expressão do polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico. Em uma modalidade alternativa, o ligante pode ser adicionado às células mesmo antes das células serem reintroduzidas ao paciente tal que o polipeptíeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é expresso antes da reintrodução das células. O ligante pode ser administrado por qualquer método adequado, ou sistemica- mente (por exemplo, oralmente, intravenosamente) ou localmente (por exemplo, intraperito- nealmente, intratecalmente, intraventricularmente, injeção direta no tecido ou órgão onde as células foram reintroduzidas). O tempo ótimo de administração de ligante pode ser determi- nado para cada tipo de célula e doença, distúrbio ou condição usando somente técnicas de rotina.
Em uma modalidade diferente, os métodos terapêuticos ex vivo podem ser realiza- dos usando células não autólogas, por exemplo, células que são alogenêicas ou xenogenêi- cas ao paciente, ao invés de células autólogas do paciente. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos nas células não autólogas ex vivo para produzir células modificadas e as célu- las modificadas pode então ser introduzidas no paciente. As células não autólogas pode ser quaisquer células que são viáveis após transplante em um paciente, incluindo, sem limita- ção, células tronco (tal como células tronco embrionárias ou células tronco hematopoiéticas) e fibroblastos.
Os métodos terapêuticos in vivo da invenção envolvem introdução in vivo direta dos polinucleotídeos nas células do paciente. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos no paciente sistemicamente ou localmente (por exemplo, no sítio da doença, distúrbio ou con- dição). Uma vez os polinucleotídeos têm sido introduzidos no paciente, o ligante pode ser adminsitrado para induzir expressão do polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêu- tico. O ligante pode ser administrado por qualquer método adequado, ou sistemicamente (por exemplo, oralmente, intravenosamente) ou localmente (por exemplo, intraperitoneal- mente, intratecalmente, intraventricularmente, injeção direta no tecido ou órgão onde a do- ença, distúrbio ou condição está ocorrendo). O tempo ótimo de administração de ligante pode ser determinada para cada tipo de célula e doença, distúrbio ou condição usando so- mente técnicas de rotina.
Em uma modalidade, o Iigante pode ser administrado ao paciente continuamente ou intermitentemente, e o padrão de administração de Iigante pode ser alterado como necessá- rio dependendo do condição da doença, distúrbio ou condição. O nível de expressão do po- lipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico pode ser modulado pelo esquema de administração do Iigante e a quantidade do Iigante que é administrada, permitindo o controle cuidadoso do tratamento terapêutico.
Os métodos terapêuticos da invenção podem também ser acoplados com tecnolo- gias diagnosticas a fim de aumentar o resultado do tratamento em várias abordagens que são conhecidas na técnica como farmacodiagnósticos ou teranósticos. Por exemplo, admi- nistração do Iigante pode ser coordenada com monitorando do estado ou progressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade, os polinucleotídeos da invenção são introduzidas em uma célula junto com um ou mais polinucleotídeos designados para diag- nóstico ou monitorar uma doença, distúrbio ou condição. Em outra modalidade, os polinu- cleotídeos diagnósticos estão presentes no mesmo vetor compreendendo os polinucleotí- deos da invenção. Nesta modalidade, o tratamento terapêutico e o teste diagnóstico para monitorar a efetividade do tratamento são administrados juntos em uma unidade, garantindo que todas as células que receberam o tratamento também receberam o teste diagnóstico. Em uma modalidade, os polinucleotídeos diagnósticos compreendem um promotor de troca diagnóstico (isto é, um promotor cuja atividade é modulado durante uma doença, distúrbio ou condição) operacionalmente ligado a um gene repórter, e monitorando o estado da doen- ça, distúrbio ou condição envolve detecção do nível de expressão do gene repórter.
Em outra modalidade teranóstica da invenção, o nível de expressão de um polipep- tídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é monitorado através da detecção do nível de expressão de um gene repórter, em que o nível de expressão do repórter diretamente correlaciona-se com o nível de expressão do polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico. Por exemplo, o nível de expressão de uma proteína terapêutica tal como inter- Ieucina 12 pode ser monitorado não invasivamente em vários tecidos através de um repórter bioneutro tal como o receptor de somatostatina do tipo 2 humano, que pode ser visto com um análogo da somatostatina radiomarcada (ver, por exemplo, Zinn et al, J. Nucl. Med.41:887-895 (2000)). O repórter pode estar ligado ao mesmo promotor como o polipeptídeo ou polinucleotídeo terapêutico, ou pode estar colocado sobre um promotor diferente que é modulado pelo polipeptídeo ou polinucleotídeo terapêutico. Uma modalidade adicional da invenção relaciona-se aos métodos para expressar
um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em um paciente, compreenden- do: (a)introdução em células do referido paciente de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que a pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um complexo fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutica, em que o promotor é ativado durante a referida doença, dis- túrbio ou condição, e (2) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou poli- nucleotídeo terapêutico ligado a um promotor que é ativado pelo complexo fator de trancri- ção dependente de ligante, para produzir células modificadas; e
(b) administração do ligante ao referido paciente para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
Em uma modalidade, os métodos para expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em um paciente pode ser realizado usando animais de laborató- rio (por exemplo, camundongos, ratos, gatos, cachorros, macacos) ou animais de fazenda (por exemplo, porcos, ovelhas e vacas). Por exemplo, métodos de expressão de produtos terapêuticos em animais podem ser realizados para propósitos de pesquisa ou para uma produção em grande escala de polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
Uma modalidade adicional da invenção relaciona-se a métodos para expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em uma célula, compreendendo:
(a) introdução na referida célula de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um comple- xo fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutica, em que o promotor é ativado durante a referida doença, distúrbio ou con- dição, e (2) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico ligado a um promotor que é ativado pelo complexo fator de trancrição dependen- te de ligante, para produzir células modificadas; e
(b) administração do ligante à referida célula modificada para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
Outra modalidade da invenção é um método para expressar um polipeptídeo tera- pêutico ou polinucleotídeo terapêutico em uma ou mais células modificadas, compreenden- do:
(a) introdução em uma célula de (1) um primeiro polinucleotídeo codificando um ge- ne de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que a pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um complexo fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promo- tor de troca terapêutica, em que o referido promotor de troca terapêutico é ativado sobre condições associadas com uma doença, distúrbio ou condição, e (2) um segundo polinu- cleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico operavel- mente associado com um promotor regulado por fator que é ativado pelo referido complexo fator de trancrição dependente de ligante, assim produzindo uma célula modificada; e
(b) administração do ligante à referida células modificada para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
Em uma modalidade, os métodos para expressão de um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico em uma célula pode ser realizado in vitro, por exemplo, em células em cultura. Por exemplo, métodos in vitro de expressão do produto terapêutico pode ser realizado para uso de pesquisa ou para produção de larga escala de polipeptídeo tera- pêuticos ou polinucleotídeos terapêuticos.
Em quaisquer modalidades descritas aqui, os polinucleotídeos ou vetor compreen- dendo os polinucleotídeos podem compreender uma seqüência codificando um polipeptídeo letal que pode ser mudado para expressar um produto que matará uma célula contendo os polinucleotídeos ou vetor. Expressão do polipeptídeo letal pode ser usada para eliminar as células modificadas a partir de um paciente, ou por causa do tratamento não é mais neces- sário ou por causa de um problema com as células modificadas (por exemplo, hiperprolife- ração ou toxidade). Um polipeptídeo letal, como aqui utilizado, é um polipeptídeo que, quan- do expresso, é letal para a célula que expressa o polipeptídeo, ou porque o polipeptídeo por si mesmo é letal ou o polipeptíideo produz um composto que é letal. Como aqui utilizado, um polipeptídeo letal inclui polipeptídeos que induzem morte celular em qualquer modo, incluin- do mas não limitado a necrose, apoptose e citotoxidade. Exemplos de polipeptídeos letais incluem, mas não limitados a, apoptose induzindo genes supressores de tumor tais como, mas não limitados a p53, Rb e BRCA-1, toxinas tais como toxina diftérica (DTA), neurotoxina de shigella, toxina botulínica, toxina tetânica, toxina da cólera, CSE-V2 e outros variantes das toxinas da proteína de escorpião para nomear umas poucas, genes suicidas tais como citosina deaminase e timidina quinase, e genes citotóxicos, por exemplo, fator de necrose tumoral, interferon-alfa. A presente invenção não é limitada pela identidade do polipeptídeo letal, provido que o polipeptídeo é capaz de ser letal para a célula em que ele é expresso. Se as células modificadas são células de curta viva (por exemplo, células com uma expecta- tiva de vida (por exemplo, cerca de 10 duas ou mesno, tal como células descríticas), isto pode não ser necessário para incluir um polipeptídeo letal nos polinucleotídeos ou vetor co- mo as células serão naturalmente removidas em um curto período de tempo.
Para cada um dos métodos descritos acima, em uma modalidade, o polinucleotídeo codificando o gene de troca e o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico ligado a um promotor são parte de um polinucleotídeo maior, por exemplo, um vetor. Em outra modalidade, o polinucleotídeo codificando o gene de troca e o polinucleotídeo codificando o polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico ligado a um promotor são polinucleotídeos separados, que podem ser combinados para formar "composição ácido nucléico".
Em um aspecto, a invenção relaciona-se aos polinucleotídeos que podem ser usa- dos nos métodos da invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo codifica um gene de troca, o gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrução, em que pelo uma seqüência do fator de transcrição codifica um complexo fator de transcri- ção depedente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutico, em que a atividade do promotor é modulado durante a referida doença, distúrbio ou condição. Em outra modalidade, o polinucleotídeo ainda codiifca um polipeptídeo terapêutico ou poli- nucleotídeo terapêutico ligado a um promotor regulado por fator que é ativado pelo referido complexo fato de transcrição dependente de ligante. Em uma modalidade, o gene de troca é um gene de troca baseado em EcR. Em outra modalidade, o gene de troca copreende uma primeira seqüência do fator de transcrição sobre o controle de um primeiro promotor de tro- ca terapêutica e uma segunda sequênica de fator de transcrição sobre o controle de um se- gundo promotor de troca terapêutica, em que as proteínas codificadas pela referida seqüên- cia de fator de transcrição e a referida seqüência de fator de transcrição interage para for- mar um complexo de proteína que funciona como um complexo fator de transcrição depen- dente de ligante. Em uma modalidade, o primeiro promotor de troca terapêutica e o segundo promotor de troca terapêutica são diferentes. Em outra modalidade, o primeiro promotor de troca terapêutico e o segundo promotor de troca terapêutico são os mesmos. Em outra mo- dalidade, a primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro heterodímero e um domínio de transativação e a segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um do- mínio de ligação de ligante. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo também codifi- ca um polipeptídeo letal operacionalmente ligado a um promotor induzível.
Outro aspecto da invenção relaciona-se aos vetores compreendendo qualquer dos polinucleotídeos descritos acima. Em uma modalidade, o vetor é um vetor plasmídeo ou um vetor víral.
Em outro aspecto, a inveção provê kits que podem ser usados em conjunção com métodos da invenção. Kits de acordo com este aspecto da invenção podem compreender um ou mais recipiente, que podem conter um ou mais componentes selecionados a partir do grupo consistindo de uma ou mais moléculas de ácido nucléico, enzimas de restrição e uma ou mais células compreendendo tais moléculas ácido nucléicos. Kits da invenção podem ainda compreender um ou mais recipientes contendo suporte de células adequados para suporte de célula da invenção em cultura, um ou mais recipientes contendo meio de cultura celular adequado para cultivo de células da invenção, um ou mais recipientes contendo anti- bióticos adequados para uso em cultura de células da invenção, um ou mais recipientes contendo tampões, um ou mais recipientes contendo reagentes de transfecção, um ou mais recipientes contendo substratos para reações enzimáticas, e/ou um ou mais Iigantes para ativação de gene de troca.
Kits da invenção podem conter uma ampla variedade de moléculas de ácido nucléi- co que podem ser usadas dentro da invenção. Exemplos de moléculas de ácido nucléico que podem ser fornecidas em kits da invenção incluem aqueles que contêm promotores, seqüências codificando genes de trocas, aumentadores, repressores, marcadores de sele- ção, sinais de transcrição, sinais de tradução, sítios de hibridização iniciador (por exemplo, para sequenciamento ou PCR), sítios de recombinação, sítios de restrição e poliligadores, sítios que suprimem a terminação de tradução em presença de um tRNA supressor, se- qüências codificando tRNA supressor, seqüências que codificam domínios e/ou regiões, origens de replicação, telômeros, centrômeros, e semelhantes. Em uma modalidade, kits podem compreender um polinucleotídeo compreendendo um gene de troca sem qualquer promotor de troca, o polinucleotídeo sendo adequado para inserção de qualquer promotores de troca terapêuticos de interesse. Moléculas de ácido nucléico da invenção podem com- preender qualquer uma ou mais dessas características em adição a polinucleotídeos como descrito acima.
Kits da invenção podem compreender recipientes contendo uma ou mais proteínas de recombinação. Proteínas de reconbinação adequadas incluem, mas não são limitados a, Cre, Int1 IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, Cin, Tn3 resolvase, Φ031, TndX1 XerC e XerD. Outros sítios de recombinação adequados e proteínas são aqueles associados com a Tecnologia de Clonagem GATEWAY® disponível de Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, e descrito no pro- duto da literatura da Tecnologia de Clonagem GATEWAY® (versão E,22 de setembro de 2003), a inteira revelação das quais são aqui incorporadas por referência. Kits da invenção podem também ser fornecidos com iniciadores. Esses iniciadores irão geralmente ser designados para anelar à moléculas tendo seqüências de nucleotídeo específicas. Por exemplo, esses iniciadores podem ser designados para uso no PCR para amplificar uma molécula de ácido nucléico particular. Iniciadores de sequenciadores podem também ser fornecidos com o kit. Um ou mais tampões (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, oito, dez e quinze) podem ser fornecidos em kits da invenção. Esses tampões podem ser fornecidos nas con- centrações de trabalho ou podem ser fornecidos na forma concentrada e então diluída para as concentrações de trabalho. Esses tampões sempre contêm sais, íons metais, co-fatores, íons metais, agentes quelantes etc, para o aumento das atividades ou estabilização de ou do tampão por si mesmo ou moléculas no tampão. Ainda, esses tampões podem ser forne- cidos em formas secas ou aquosas. Quando tampões são fornecidos em uma forma seca, eles geralmente serão dissolvidos em água antes do uso. Kits da invenção podem conter virtualmente qualquer combinação dos componen- tes revelados acima ou descritos em outro lugar aqui. Como um versado na técnica pode reconhecer, os componentes fornecidos com kits da invenção variarão com. o uso tenciona- do para os kits. Então, kits podem ser designados para fazer várias funções Teveladas neste pedido e os componentes de tais kits variarão de acordo.
EXEMPLOS
Os exemplos que seguem adiante ilustram a invenção, mas não del/em ser contruí- dos para limitar o objetivo da invenção em qualquer forma. A prática da presente invenção, incluindo os seguintes exemplos empregarão, a menos que de outra forma indicada, técni- cas convencionais da biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia trangênica, microbiologia, e DNA recombinante, que estão dentro da técnica. Tais técnibas são explica- das completamente na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laborator Manual (grupo Volume 3), J. Sambrook, D. W. Russell, Cols Spring Harbor Laboratory Press (2001); Genes VIII, B. Lwein, Prentice Hall (2003); PCR Primer, C. W. Dieffenbach e G.S. Dveksler, CSHL Press (2003); DNA Cloning, D.N. Glover ed., Volumes I e Il (1985); Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications (Methods in Molecular Biology), P. Herdewjn (Ed.), Humana Press (2004); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniqué, 4a edição, R.l. Freshney, Wiley-Liss (2000); Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait (Ed.), (1984); Mullis et al Pat. EUA No: 4.683.195; NucIeicAcid Hybridization, B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984); Nucleie Acid Hybridization, M.L.M. Anderson, Springer (1999); Animal Cell Culture and Technology, 2a edição, M. Butler, BIOS Scientifie Publishers (2004); Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (Practical Approach Series), J. Woodward, IRL Press (1992); Transcription and Translation, B.D. Hames & S.J. Higgins (Eds.) (1984); Culture of Animal Cells, R.l. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); A Practical Guide To Molecular Clon- ing, 3a edição, B. Perbal, John Wiley & Sons Inc. (1988); Gene Transfer Vectors for Mam- malian Cells, J.H. Miller e M.P. Celos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu et al (Eds.); Immunochemical Methods in Cell and Mo- lecular Biology, Mayer e Walker (Eds.), Academic Press, Londres (1987); e em Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Filhos, Baltimore, Maryland (1989). Exemplo 1
Este exemplo descreve um vetor de terapia gênica útil para o tratamento de doença isquêmica cardíada através da promoção de angiogênese. Fator de crescimento tipo insuli- na 1 é um hormônio que pode ser útil no tratamento de doença isquêmica cardíaca. (IGF-1, GenBank No de Acesso: NP_001104753.1, SEQ ID N0:20). Uso de IGF-1 em modelos pré- clínicos é associado com função cardíaca aumentada, anti-apoptose, neo-vascularização e regeneração do músculo cardíaco (revisado em Santini, M.P. et al, Novartis Found Symp. .274:228-38 (2006); discussão 239-43, 272-6; e Saetrum Opgaard, O., e Wang, P.H. Growth Horm IGF Res. 15:89-94 (2005)). Para este propósito, um exemplo da expressão de IGF-1 induzível, em resposta a isquemia e/ou inflamação é dado. Um sistema de expressão indu- zível para a expressão se IGF-1 sob administração de ligante, sobre condições hipóxicas que ocorrem no tecido isquêmico é mostrado na Fig. 5.
SEQ ID N0:20
MGKISSLPTQLFKCCTCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETLCGAELVD ALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSAR SVRAQRHTDMPKTQKYQPPSTNKNTKSQRRKGSTFEERK
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Fig. 5 é apresentada como SEQ ID NO:7. O nucleotídeo coordenados para elementos salientes da construção são mostrados na Tabela 4.
TABELA 4
<table>table see original document page 106</column></row><table>
O vetor mostardo na Fig. 5 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca mostrado na Fig. 1. Sobre este sistema, ambos, a subunidade CAP e a subunidade LTF do complexo fator de transcrição dependente de ligante (LDTFC) são expressos através da associação operável com um promotor de troca terapêutico único (TSP-1) através do uso de um sítio de entrada ribossomal interno (IRES). O promotor utilizado neste sistema é um promotor induzível de hipóxia sintético UV-conformado. A região codificante para o produto terapêutico, IGF-1, é operacionalmente associ- ado com um promotor regulado por fator (FRP) que é ativado sob contato com o LDTFC na presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 5 é inserida em um sistema de vetor adequado, por exemplo, um vetor viral, para distribuição a um paciente em necessidade de tratamento para doença isquêmica cardíaca.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuída diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de vetores de te- rapia gênica são bem conhecidos na técnica. Sob distribuição do vetor serão tomadas as células, por exemplo, células cardíacas, e o fator de transcrição pode ser expresso sobre as condições fisiológicas apropriadas. O LTF codificada pelo vetor será expresso sobre condi- ções hipóxicas associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será administrado ao paciente para ser tratado que combinará com o LDTFA expresso para dirigir a expressão do IGF-1 sobre controle do promotor regulado por fator. Expressão de IGF-1 por sua vez promove angiogênese alvo no tecido isquêmico.
Exemplo 1
Este exemplos descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento da doença isquêmica cardiovascular através da promoção de angiogênese e cardioprote- ção. O vetor, mostado na Fig. 6, conferirá expressão de fator de crescimento de fibroblasto humano básico (bFGF, No de Acesso no GenBank: NP_001997, SEQ ID NO:21) sob admi- nistração do ligante, sobre condições hipóxicas que ocorrem no tecido isquêmico.
SEQ ID NO:21:
MVGVGGGDVEDVTPRPGGCQISGRGARGCNGIPGAAAWEAALPRRRPRRHPSVNPRSR AAGSPRTRGRRTEERPSGSRLGDRGRGRALPGGRLGGRGRGRAPERVGGRGRGRGTAA PRAAP AARGSRPGPAGTMAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRI HPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGWSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDEC FFFERLESNbTVWYRSRKYTSWYVALKRTGgYKLGSKTGPGOKAILFLPMSAKS
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 6 é apresen- tada como SEQ ID NO:8. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 5.
Tabela 5
<table>table see original document page 107</column></row><table> <table>table see original document page 108</column></row><table> O vetor monstrado na Fig. 6 é mod elado de acordo com o sistema d e troca gênica
mostrado na Fig. 2. Sob esse sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expresso através da associação operável com o primeiro promotor de troca terapêutico constitutivo, TSP-1, e a subunidade LTF do LDTFC é expresso através da associácão operável com um segundo promotor de troca terapêutico induzível (TSP-2). O promotor usado nesta construção é o promotor controle induzível por hipóxia -1.
A região codificante para o produto terapêutico, bFGF, é operacionalmente associ- ado com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 6 pode ser preparada em um vetor adequado por in- trodução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas do paciente a ser tratado ou células alogenêicos não autólogos ou xenogênicos, ou as células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultura. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção, ou eletroporação para produzir células modificadas. Seguindo a in- trodução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsuladas de forma prover imunoisolamento. As células modificadas irão então ser formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade do tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através
da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou loca! de terapias base- adas em células são bem conhecidas na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LTF codificado pelo vetor será expresso sob condições de hipóxia associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será admi- nistrado ao paciente a ser tratado que irá combinar com o LDTFC expresso para dirigir a expressão do bFGF sobre controle de FRP. Expressão de bFGF por sua vez promove angi- ogênese alvo e/ou cardioproteção no tecido isquêmico.
Exemplo 3
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento da doença cardiovascular isquêmica através da promoção da cardioproteção. O vetor, mos- trado na Fig. 7, conferirá a expressão de eritropoietina humana (EPO, No de Acesso do GenBank: CAA26095.1, SEQ ID NO: 22) sob administração do ligante, sob condições de hipóxia que ocorrem no tecido isquêmico. Eritropoietina tem sido mostrada funcionar em cardioproteção e anti-remodelamento, em resposta a isquemia.
SEQ ID NO:22.
MGVHECP AWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLQRYLLEAKEAEN1TTGCAEHC SLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEA1SPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLR GKLK.LYTGEACRTGDR
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 7 é apresen- tada como SEQ ID NO:9. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 6.
Tabela 6
<table>table see original document page 109</column></row><table> <table>table see original document page 110</column></row><table> O vetor monstrado na Fig. 7 é mod elado de acordo com o sistema c e troca gênica
mostrado na Fig. 2. Sob esse sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expresso através da associação operávei com o primeiro promotor de troca terapêutico constitutivo, TSP-1, e a subunidade LTF do LDTFC é expresso através da associácão operávei com um segundo promotor de troca terapêutico induzível (TSP-2). O promotor usado nesta construção é o promotor controle induzível por hipóxia -1.
A região codificante para o produto terapêutico, EPO1 é operacionalmente associa- do com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 7 pode ser preparada em um vetor adequado por in- tradução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas do paciente a ser tratado ou células alogenêicos não autólogos ou xenogênicos, ou as células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultura. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção, ou eletroporação para produzir células modificadas. Seguindo a in- tradução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsuladas de forma prover imunoisolamento. As células modificadas irão então ser formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade do tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através
da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de terapias base- adas em células são bem conhecidas na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LTF codificado pelo vetor será expresso sob condições de hipóxia associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será admi- nistrado ao paciente a ser tratado que irá combinar com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de EPO sobre controle de FRP. Expressão de EPO por sua vez promove angio- gênese alvo e/ou cardioproteção no tecido isquêmico.
Exemplo 4
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento
de doença cardiovascular isquêmica através da promoção da angiogênese e hemodinâmica. O vetor, mostrado na Fig. 8, conferirá a expressão do fator natriurético cerebral humano (BNP, No de Acesso GenBank: NP_002512, SEQ ID NO: 23) sob administração do ligante, sobre condições de hipóxia que ocorrem no tecido isquêmico. BNP, bem como outros peptí- deos natriuréticos, tais como relaxina, ANF, CNP1 e adrenomodulina, tem sido mostrado para função em cardioproteção, vasodiltação e anti-remodelamento, no coração. Para este propósito, um exemplo de expressão induzível de BNP1 em resposta a esquemia é dado.
SEQ ID NO:23.
MDPQT APSRALLLLLFLHLAFLGGRSHPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVE
QTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPRSPKJVÍVQGSGCFGRKMD
RISSSSGLGCKVLRRH
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 8 é apresen- tada como SEQ ID NO: 10. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 7.
Tabela 7
<table>table see original document page 111</column></row><table> O vetor monstrado na Fig. 8 é modelado de acordo com o sistema de troca gênica mostrado na Fig. 2. Sob esse sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expresso através da associação operável com o primeiro promotor de troca terapêutico constitutivo, TSP-1, e a subunidade LTF do LDTFC é expresso através da associácão operável com um segundo promotor de troca terapêutico induzível (TSP-2). O promotor usado nesta construção é o promotor controle induzível por hipóxia -1.
A região codificante para o produto terapêutico, BNP, é operacionalmente associa- do com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante. A construção mostrada na Fig. 8 pode ser preparada em um vetor adequado por in- trodução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas do paciente a ser tratado ou células alogenêicos não autólogos ou xenogênicos, ou as células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultura. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção, ou eletroporação para produzir células modificadas. Seguindo a in- trodução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsuladas de forma prover imunoisolamento. As células modificadas irão então ser formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade do tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de terapias base- adas em células são bem conhecidas na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LTF codificado pelo vetor será expresso sob condições de hipóxia associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será admi- nistrado ao paciente a ser tratado que irá combinar com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de BNP sobre controle de FRP. Expressão de BNP por sua vez promove cardio- proteção alvo, vasodilatação e anti-remodelamento no tecido isquêmico.
Exemplo 5
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento de doença cardiovascular isquêmica através da quebra de deposição de fibrina no coração. O vetor, mostrado na Fig. 9, conferirá expressão de ativador de plasminogênio tecidual hu- mano (tPA, No de Acesso GenBank: AA034406, SEQ ID NO:24) sob administração de li- gante, sob condições inflamatórias que ocorrem no tecido isquêmico. Ativador de plasmino- gênio tissular é uma serino-protease que catalisa a conversão do plasminogênio para a en- zima plasmina ativada, que degrada fibrina. O uso do tPA recombinante tem sido provado efetivo como um trombolítico, para a quebra de coágulos de fibrina, em doenças tais como embolismo pulmonar, infarto do miocárdio e derrame. Em adição a formação de coágulo, excesso de depósito de fibrina no coração e vasculatura é associada com a diabetes de re- sistência a insulina, aterosclerose e infarto do miocárdio em resposta a inflamação. Para este propósito, um exemplo de de expressão induzível de tPA, em resposta a isquemia é dado.
SEQ ID NO:24. MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQEIHARFRRGARSYQVICRDEKTQMIYQQHQSWLR PVLRSNR VEYCWCNSGRAQCHSVPVKSCSEPRCFNGGTCQQALYFSDFVCQCPEGFAG KCCEROTRATCYEDQGISYRGTWSTAESGAECTNWNSSALAQKPYSGRRPDAIRLGLGN HNYCRNPDRJDSKPWCYVFKAGKYSSEFCSTPACSEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGA SCLPWSMILIGNVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAXPWCHVLKNRRLTWEYC DVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWIL SAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRWPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLK SDSSRCAQESSWRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPS SRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGN SWGLGCGQKJ3VPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 9 é apresen- tada como SEQ ID NO:11. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8
<table>table see original document page 113</column></row><table>
O vetor mostrado na Fig. 9 é modelado de acordo com o sistema de troca gênica mostrado na Fig. 2. Sob esse sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expresso através da associação operável com o primeiro promotor de troca terapêutico constitutivo, TSP-1, e a subunidade LTF do LDTFC é expresso através da associácão operável com um segundo promotor de troca terapêutico induzível (TSP-2). O promotor de troca terapêutica usado nes- te vetor é o promotor Plexin D1 humano.
A região codificante para o produto terapêutico, tPA, é operacionalmente associado com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 9 pode ser preparada em um vetor adequado por in- tradução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas do paciente a ser tratado ou células alogenêicos não autólogos ou xenogênicos, ou as células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultura. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção, ou eletroporação para produzir células modificadas. Seguindo a in- trodução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsuladas de forma prover imunoisolamento. As células modificadas irão então ser formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade do tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de terapias base- adas em células são bem conhecidas na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LTF codificado pelo vetor será expresso sob condições de hipóxia associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será admi- nistradoao paciente a ser tratado que irá combinar com o LDTFC expresso para dirigir a ex- pressão de tPA sobre controle de FRP. Expressão de tPA por sua vez promove quebra alvo de deposição de fibrina no tecido isquêmico.
Exemplo 6
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento de doença cardiovascular isquêmica através da promoção de cardioproteção, angiogênese e hemodinâmica. O vetor, mostrado na Fig. 10, conferirá a expressão de dois polipeptídeos terapêuticos, relaxina humana (HGF, No de Acesso GenBank: NP_000592.3, SEQ ID NO:26) sob administração de ligante, sob condições inflamatórias e/ou hipóxia, respectiva- mente, ambos dos quais ocorrem o tecido isquêmico. Relaxina é um potente vasodilatador da circulação sistêmica e coronária por um mecanismo de ação envolvendo oxido nítrico, e influencia a taxa de batimento cardíaco. HGF provê um efeito pró-angiogênico, um efeito anti-apoptótico cardioprotetor, um efeito anti-fibrótico, e é um fator regenerativo de colágeno do tipo I na isquemia do miocárdio. Para este propósito, em exemplo de expressão induzível controlada separadamente de relaxina e HGF em resposta a isquemia é dada.
SEQ ID NO:25. MPRLFFFHLLGVCLLLNQFSRAVADSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLSQ EDAPQTPRPVAEIVPSFINKDTETINMMSEFVANLPQELKLTLSEMQPALPQLQQHVPVL KDSSLLFEEFKXLIRNRQSEAADSSPSELKYLGLDTOSRJCKRQLYSALANKCCHVGCTKR SLARFC
SEQ ID NO:26. MWVTKLLPALLLQHVLLHLLLLPIAIPYAEGQRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKT
KKVNTADQCANRCTRNKGLPFrCKJ^VFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLY
ENKDYIRNCnGKGRSYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNP
RGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQCSEVECMTCNGESYRGLMDHTESGKICQRWDHQ
TPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGQPRPWCYTLDPHTRWEYCA1KTCADNTMNDT
DVPLETTECIQGQGEGYRGTVNTIWNGIPCQRWDSQYPHEHDMTPENFKCKDLRENYC
RNPDGSESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPNCDMSHGQDCYRGNGKNYMGNLSQTRSGLTCS
MWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNENYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISRCE
GDTTPTIV^DHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNIGWNWSLRYRNKHICGGSLIKESWVL
TARQCFPSRDLKDYEAWLGIHDVHGRGDEKCKQVLNVSQLVYGPEGSDLVLMKLARP
AVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTSCSVYGWGYTGLINYDGLLRVAHLYIMGNEKCSQHH
RGKVTLNESEICAGAEKIGSGPCEGDYGGPLVCEQHKMRMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIF
VRVAYY AKWIHKIILTYKVPQS
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 10 é apre- sentada como SEQ ID NO: 13. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da cons- trução são mostrados na Tabela 9. Tabela 9
<table>table see original document page 115</column></row><table> <table>table see original document page 116</column></row><table> O vetor mostrado na Fig. 10 é modelado de acordo com o sistema de troca gênica mostrado na Fig. 3. Sob esse sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expresso através da associação operável com o primeiro promotor de troca terapêutico constitutivo, (TSP-1), e a primeira subunidade LTF (LTF-1) é expressa através da associação operável com um se- gundo promotor de troca terapêutico induzível (TSP-2), e uma segunda subunidade LTF (LTF-2) através da associação com um terceiro promotor de troca terapêutico induzível (TSP-3). TSP-2 neste vetor é o promotor Plexina D1 humano e TSP-3 neste vetor é o pro- motor controle induzível por hipóxia 1.
A região codificante para o primeiro produto terapêutico, relaxina, é operacional- mente associada com um primeiro FRP (FRP-1) tendo elementos de resposta que reconhe- ce o primeiro domínio de ligação de DNA DBD-A de LTF-1, e a região codificante para o segundo terapêutico segundo, HGF, é operacionalmente associado com um segundo FRP (FRP-2) tendo os elementos respostas que reconhecem o segundo domínio de ligação de DNA (DBD-B) do LTF-2. Ambos FRPs são ativados sob contato com o LDTFC respectivo em presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 10 pode ser preparada em um vetor adequado por introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas do paciente a ser tratado ou células alogenêicos não autólogos ou xenogênicos, ou as células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultura. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção, ou eletroporação para produzir células modificadas. Seguindo a in- trodução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsuladas de forma prover imunoisolamento. As células modificadas irão então ser formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade do tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de terapias base- adas em células são bem conhecidas na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LTF-1 e/ou LTF-2 serão expressos no evento de uma resposta inflamatória e/ou hipóxia associada com, por exemplo, isquemia cardíaca. Um ou mais Iigantes serão administrados ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC(s) expresso para dirigir a expressão de relaxina e/ou HGF sob controle de FRPs.
Exemplo 7
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento da doença cardiovascular isquêmica através da promoção do reparo cardíaco e cardioprote- ção. O vetor, mostrado na Fig. 11, conferirá expressão de EPO (ver Exemplo 3) sob admi- nistração de ligante, sob condições de hipóxia que ocorrem no tecido isquêmico. EPO tem sido mostrado funcionar na cardioproteção e anti-remodelamento, em reposta a isquemia. Neste exemplo, expressão de EPO é especificamente limitada ao tecido cardíaco.
O vetor mostrado na Fig. 11 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca mostrado na Fig. 2. Sob este sistema, a subunidade CAP é expresso através da associação operacionável com um promotor que é específico para o tecido cardíaco (promotor específi- co de cardiomiócito Nxcl), e a subunidade LTF é expressã através da associação operacio- nável com o promotor controle induzível por hipóxia 1.
A região codificante para o produto terapêutico, EPO, é operacionalmente associa- do com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 11 é apre- sentada como SEQ ID NO: 12. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da con- trução são mostrado na Tabela 10.
<table>table see original document page 117</column></row><table> <table>table see original document page 118</column></row><table>
A construção mostrada na Fig. 11 é inserida em um sistema vetor adequado, por exemplo, um vetor viral, para distribuição a um paciente em necessidade de tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de vetores de te- rapia gênica são bem conhecidos na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LDTFC codificado pelo vetor serão expressos especificamente em cardiomiócitos sob condições de hipóxia associadas com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de EPO sob controle de FRPs. Expressão de EPO por sua vez promove cardioproteção alvo no tecido isquêmico.
Exemplo 8
Este exemplo descreve um vetor de terapia gênica útil para o tratamento de isque- mia cardíaca através da promoção de reparo cardíado e angiogênese. O vetor, mostrado na Fig. 12, conferirá expressão de IGF-1 humano (ver Exemplo 1) sob administração de ligante, ou sob condições hipóxicas em uma resposta inflamatória, ambos os quais podem ocorrer em tecido isquêmico. Para este propósito, um exemplo de expressão de IGF-1 induzível, em resposta a hipóxia e/ou resposta inflamatória é dada. Neste exemplo, expressão induzível de IGF-1 é especificamente limitada aos cardiomiócitos.
O vetor mostrado na Fig. 12 é modelado de acordo com o sistema de troca gênica mostrado na Fig. 4. Sob este sistema, a subunidade CAP é expressa através de associácão operacionável com um promotor que é específico para tecido cardíaco (promotor específico para cardiomiócito Nxcl), e subunidade LTF (LTF-1 e LTF-2) do LDTFC são expressos atra- vés ambos dos dois TSPs induzíveis, o primeiro através de associação operacionável com o promotor controle induzível de hipóxia 1, e o segundo através de associação operacionável com o promotor de plexina D1 humana.
A região codicante para o produto terapêutico, IGF-1, é operacionalmente associa- do com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 12 é apre- sentada como SEQ ID NO: 14. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da cons- trução são mostrados na Tabela 11. Tabela 11.
<table>table see original document page 119</column></row><table> A construção mostrada na Fig. 12 é inserida em um sistema vetor adequado, por exemplo, um vetor viral, para distribuição a um paciente em necessidade de tratamento para doença cardíaca isquêmica.
O vetor pode ser distribuído a um paciente sistemicamente, por exemplo, através da infusão intravenosa, ou pode ser distribuído diretamente ao tecido cardíaco, por exemplo, através de angioplastia. Métodos para administração sistêmica e/ou local de vetores de te- rapia gênica são bem conhecidos na técnica. Sob distribuição o vetor será tomado pelas células, por exemplo, células cardíacas, e o LDTFC pode ser expresso sob as condições fisiológicas apropriadas. O LDTFC codificado pelo vetor será expresso especificamente em cardiomiócitos sob condições de hipóxia, e/ou no evento de uma resposta inflamatória, as- sociado com, por exemplo, isquemia cardíaca. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o fator de transcrição expresso para dirigir a expressão do IGF-1 sob controle de FRP. Expressão de IGF-1 por sua vez promove angiogênese alvo no tecido isquêmico.
Exemplo 9
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento de artrite reumatóide, espondilite anquilosante ativa ou placa psoriática ou para inibição do dano estrutural pela artrite ativa ("AR ou doenças relacionadas"). Tratamento convencional de AR e doenças relacionadas incluem Drogas Anti-Reumáticas Modificadoras de Doença (DMARDs) bem como DMARDs biológicos tais como etanercept, infliximab, e adalimumab. Por exemplo, etanercept (Enbrel®), fabricado por Amgen, é uma proteína de fusão que con- tém dois domínios extracelulares do receptor de TNF-alfa 2 humano para uma porção Fc pelo peptídeo de dobradiça. Ver Patente dos EUA No. 7.276.477 (aqui incorporado por refe- rência em sua totalidade). Etanercept deve ser administrado s.c. uma ou duas vezes pode semana. Uso de sistema de troca gênica etanercept utilizando promotores de resposta a inflamação ou citocina pode assim aumentar a conveniência e segurança por limitação de qualquer produção de etanercept em ausência de ativação de TNF.
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Figura 13 é apre- sentada como SEQ ID NO: 16. O nucleotídeo coordenado para elementos salientes da cons- trução são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12.
<table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table> O vetor mostrado na Fig. 13 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca mostrado na Fig. 1. Sob este sistema, ambas a subunidade CAP e a subunidade LTF da LDTFC são expressas através da associação operacionável com um TSP-1 único através do uso de um sítio de entrada ribossomal interna (IRES). O promotor utilizado neste sistema é um promotor de molécula de adesão celular vascular (VCAM1), que é ativado por TNF- alfa. Outro exemplo de promotores regulados por TNF-alfa que pode ser usado para a in- venção é promotor de pentraxin humano 3(PTX3), que é responssível ao TNF-alfa ou Inter- Ieucina(IL)-I beta. Ver Basile et al, J. Biol. Chem. 272(13):8172 (1997).
A região codificante para o produto terapêutico, etanercept, é operacionalmente as- sociado com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC na presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 13 pode ser preparada em um vetor adequado para introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas a partir do paciente a ser tratado ou células alogenéicas não autólogas ou xenogenêicos, ou células primárias ou Iinahgens celulares mantidas em cultu- ra. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção ou eletroporação para produzir células modificadas. Se- guindo introdução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsu- ladas de forma a prover imunoisolamento. As células modificadas serão então formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade de tratamento para AR.
As células podem ser distribuídas a um paciente sistemicamente, por exemplo, a- través da infusão intravenosa, ou podem ser distribuídas diretamente às juntas. Administra- ção sistêmica e/ou local de células de terapia gênica é bem conhecida na técnica. Sob dis- tribuição das células, o LDTFC pode ser expresso sob as condições fisiológicas apropriadas. O LDTFC codificado pelo vetor será expresso em presença de TNF-alfa associado com, por exemplo, AR. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de etanercept sob controle do promotor regulado por TNF-alfa. Expressão de etanercept por sua vez captura TNF-alfa e reduz a concentra- ção de TNF-alfa nos tecidos.
Exemplo 10
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento de AR e doença relacionada através da redução do nível de TNF alfa. O vetor mostrado η Fig. 14 conferirá expressão de etanercept sob administração de ligante, sob ou a presença de TNF-alfa e/ou inflamação severa, ambas as quais podem ocorrer em AR ou doenças re- lacionadas. Para este propósito, um exemplo de expressão de etanercept induzível, em res- posta a presença de TNF-alfa e/ou resposta inflamatória é dada.
O vetor mostrado na Fig. 14 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca mostrada na Fig. 4. Sob este sistema, a subunidade CAP é expressa através da associação operacionável com um promotor constitutivo (TSP-1), e uma subunidade LTF de um LDTFC é expressa por ambos de dois cassetes de transcrição induzíveis, o primeiro (LTF-1) através da associácão operacionável com um promotor de inibidor do ativador de plasminogênio humano tipo 2 (PAI2) (TSP-2), e o segundo (LTF-2) através da associação operacionável com o promotor amilóide sérico humano A1 (SAA1) (TSP-3). O promotor PAI2 humano é ativado em presença de TNF alfa. Ver Mahony et al Eur. J. Biochem. 263(3) (1999) e Ma- tsuo et al, Biochem. J. 405:605 (2007). O promoter SAA1 é super regulado não diretamente por citocinas pró-inflamatórias tal como TNF-alfa, mas por outros sinais inflamatórios agudos tal como glicocorticóide. Ver Kumon et alm, Scandinavian J. Immunol. 56:504 (2002).
A região codificante para o produto terapêutico, etanercept, é operacionalmente as- sociado com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A sequcia nucleotídica completa da construção mostrada na Fig. 14 é apresentada como SEQ ID NO: 15. O nucleotídeo coordenados para elementos salientes da construção são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13. <table>table see original document page 123</column></row><table> A construção mostrada na Fig. 14 pode ser preparada em um vetor adequado para introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas a partir do paciente a ser tratado ou células alogenêicas não autólogas ou xenogenêicas, ou células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultu- ra. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção ou eletroporação para produzir células modificadas. Se- guindo introdução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsu- ladas de forma a prover imunoisolamento. As células modificadas serão então formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade de tratamento para AR.
As células podem ser distribuídas a um paciente sistemicamente, por exemplo, a- través da infusão intravenosa, ou podem ser distribuídas diretamente às juntas. Métodos para administração sistêmica e/ou local de células de terapia gênica são bem conhecidos na técnica. Sob distribuição das células, o LDTFC codificado pelo veotor serã especificamente expresso nas células administradas sob a presença de TNF-alfa e/ou inflamação severa. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de etanercept sob controle do FRP. Expressão de etanercept por sua vez captura TNF-alfa e reduz a concentração de TNF-alfa nos tecidos.
Exemplo 11
Este exemplo escreve um bioretar/vetor de terapia celular útil para o tratamento de AR. O vetor conferirá a expressão de dois polipeptídeos terapêuticos, etanercept e eritropoi- etina humana (EPO) sob administração de ligante, sob a presença de condições inflamató- rias e/ou TNF-EPO, respectivamente, ambos os quais ocorrem em pacientes AR. EPO induz eritrogênese em pacientes AR anêmicos. Ver Mercuriali et al. Transfusion 34(6):501 (2003). Para este propósito, um exemplo de expressão induzível controlada de etanercept e EPO em resposta a AR e anemia, respectivamente, é dado.
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Fig. 15 é apresenta- da como SEQ ID NO: 17. O nucleotídeo coordenados para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14.
<table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table> O vetor mostrado na Fig. 15 é modeladpo de acordo com o sistema de gene de tro- ca mostrado na Fig. 3. Sob este sistema, a subunidade CAP do LDTFC é expressa através da associação operacionável com um primeiro, TSP-1 constitutivo, uma primeira subunidade LTF de um LDTFC (LTF-1) é expresso através da associação operacionável com um se- gundo, TSP-2 induzível, e uma segunda subunidade LTF de um LDTFC (LTF-2) é expresso através da associação operacionável com um terceiro TSP-3 induzível. O segundo TSP-2 induzível usado neste vetor é o promotor amilóide sérico A1 humano (SAA1) e o terceiro TSP-3 induzível neste vetor é o promotor controle induzível por hipóxia 1.
A região codificante para o primeiro produto terapêutico, etanercept, é operacional- mente associado com um primeiro FPR-1 tendo os elementos resposta que reconhecem o primeiro domínio de ligação de DNA (DBD-A) associado com LTF-1, e a região codificante para o segundo produto terapêutico que reconhece o segundo domínio de ligação DNA (DBD-B associado com LTF-2. Ambos os promotores regulados por fator são ativados sob contato com o respectivo LDTFC em presença de ligante. A construção mostrada na Fig. 15 pode ser preparada em um vetor adequado para introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas a partir do paciente a ser tratado ou células alogenêicas não autólogas ou xenogenêicas, ou células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultu- ra. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção ou eletroporação para produzir células modificadas. Se- guindo introdução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsu- ladas de forma a prover imunoisolamento. As células modificadas serão então formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade de tratamento para AR.
As células podem ser distribuídas a um paciente sistemicamente, por exemplo, a- través da infusão intravenosa, ou podem ser distribuídas diretamente às juntas. Métodos para administração sistêmica e/ou local de células de terapia gênica são bem conhecidos na técnica. Sob distribuição das células, o(s) LDTFC(s) podem ser expressos sob a condição apropriada. Um ou mais Iigantes serão administrados ao paciente a ser tratado que combi- nará com o(s) LDTFC(s) para dirigir a expressão de etanercept e/ou EPO sob controle de FRP-1 ou FRP-2. Expressão de etanercept por sua vez captura o TNF-alfa e reduz a con- centração de TNF-alfa em tecidos, e expressão de EPO induz eritrogênese e melhora a a- nemia.
Exemplo 12
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de terapia celular útil para o tratamento de hemofilia. Hemofilia é causada por ausência de ou Fator Vlll ou Fator IX. Deficiência de Fator Vlll é chamada de hemofilia A, e deficiência de Fator IX é chamada hemofilia B. He- mofilia A ou B pode ser tratada por administração de Fator Vlll ou IX recombinantemente produzido, respectivamente. Ver Garcia-Martin et al, J. Gene Med. 4(2):215 (2002). Por e- xemplo, Fator Vlll recombinantemente produzido que pode ser usado na presente invenção inclui, sem limitação, Fator Vlll de comprimento completo tal como RECOMBINATE® (co- mercializado por Bacter), BIOCLATE® (comercializado por Aventis), KOGΕΝΑΤΕ® (comer- cializado por Bayer), HELIXATE® (comercializado por Aventis), ou ADVATE® (comerciali- zado por Baxter), Fator Vlll deletado por domínio B tais como REFACTO® e XYNTHA® (ambos comercializados por Genetics Institute e Wyeth), ou completo fator Vlll e Fator von Wiilebrand tal como ALPHANATE® (comercializado por Grifols Biologicals, Inc.). Para este propósito, um exemplo de expressão de ALPHANATE® induzível para um bioreator/terapia celular em resposta a administração do Iigante é mostrado na Fig. 16. Uso de biorea- tor/terapia celular melhora problemas de estabilidade e infusão contínua. Ver Pipe S.W., J. Thromb. Haemost. 3(8): 1692 (2005).
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Fig. 16 é apresenta- da como SEQ ID NO:18. O nucleotídeo coordenados para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 15.
Tabela 15.
<table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table>
O vetor mostrado na Fig. 16 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca mostrado na Fig. 2. Sob este sistema, a subunidade CAP é expressa através da associação operacionável com um primeiro, promotor constitutivo (TSP-1), e a subunidade LTF de um LDTFC é expressa através da associação operacionável com um segundo, promotor consti- tutivo (TSP-2). O promotor utilizado para o primeiro promotor constitutivo é promotor UbC (curto), e o promotor utilizado para o segundo promotor constitutivo é promotor UbB (curto).
A região codificante para o primeiro produto terapêutico, ALPHANATE®, é opera- cionalmente associado com um primeiro FPR que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A construção mostrada na Fig. 16 pode ser preparada em um vetor adequado para introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas a partir do paciente a ser tratado ou células alogenéicas não autólogas ou xenogenêicas, ou células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultu- ra. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção ou eletroporação para produzir células modificadas. Se- guindo introdução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsu- Iadas de forma a prover imunoisolamento. As células modificadas serão então formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade de tratamento para hemofilia.
As células podem ser distribuídas a um paciente sistemicamente, por exemplo, a- través da infusão intravenosa. Administração sistêmica e/ou local de células de terapia gêni- ca é bem conhecida na técnica. Sob distribuição das células, o LDTFC pode ser expressa constitutivamente. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de ALPHANATE® sob controle do promotor regu- lado. Expressão de ALPHANATE® por sua vez trata os sintomas de hemofilia.
Exemplo 13
Este exemplo descreve um bioreator/vetor de bioreator celular útil para o tratamento de hemofilia. O vetor mostrado na Fig. 17 é modelado de acordo com o sistema de gene de troca (TSP-1) através do uso de um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). O promo- tor constitutivo é promotor UbC (curto).
A região codificante par ao produto terapêutico, ALPHANATE®, é operacionalmen- te associada com um FRP que é ativado sob contato com o LDTFC em presença de ligante.
A seqüência nucleotídica completa da construção mostrada na Fig. 17 é apresenta- da como SEQ ID NO: 19. O nucleotídeo coordenados para elementos salientes da constru- ção são mostrados na Tabela 16.
Tabela 16 (MOD 8361)
<table>table see original document page 128</column></row><table> A construção mostrada na Fig. 17 pode ser preparada em um vetor adequado para introdução em células antes da introdução no paciente a ser tratado. As células podem ser células autólogas removidas a partir do paciente a ser tratado ou células alogenêicas não autólogas ou xenogenêicas, ou células primárias ou linhagens celulares mantidas em cultu- ra. O vetor é introduzido nas células através de qualquer método padrão, por exemplo, transfecção, transdução, lipofecção ou eletroporação para produzir células modificadas. Se- guindo introdução do vetor, as células modificadas podem opcionalmente ser tratadas para produzir um sistema de barreira, por exemplo, as células podem ser revestidas ou encapsu- ladas de forma a prover imunoisolamento. As células modificadas serão então formuladas como um bioreator para administração a um paciente em necessidade de tratamento para hemofilia.
As células podem ser distribuídas a um paciente sistemicamente, por exemplo, a- través da infusão intravenosa. Administração sistêmica e/ou local de células de terapia gêni- ca é bem conhecida na técnica. Sob distribuição das células, o LDTFC pode ser expressa constitutivamente. Ligante será administrado ao paciente a ser tratado que combinará com o LDTFC expresso para dirigir a expressão de ALPHANATE® sob controle do promotor regu- lado. Expressão de ALPHANATE® por sua vez trata os sintomas de hemofilia.
Modalidades adicionais da invenção incluem as seguintes:
E1.Método para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou distúrbio em um paci- ente, compreendendo:
(a)introdução em células do referido paciente de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutica, em que o promotor é ativado durante a referida doença ou distúrbio, e (2) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou polinucletídeo terapêutico ligado a um pro- motor que é ativado pelo referido fator de transcrição dependente de ligante, para produzir células modificadas; e
(b) adminsitração de ligante ao referido paciente para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico;
Em que o referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é expres- so em um nível suficiente para tratar, melhorar ou prevenir a referida doença ou distúrbio.
E2. Método para expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêu- tico em um paciente, compreendendo:
(a) introdução em células do referido paciente de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutica, em que o promotor é ativado durante a referida doença ou distúrbio, e (2) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo ou polinucletídeo terapêutico ligado a um pro- motor que é ativado pelo referido fator de transcrição dependente de ligante, para produzir células modificadas; e
(b) adminsitração de Iigante ao referido paciente para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico;
E3. Método de E1 e E2, em que os referidos polinucleotídeos são introduzidos em células que tenham sido isoladas a partir do referido paciente para produzir células modifi- cadas, e as células modificadas são re-introduzidas do referido paciente.
E4. Método de E1 ou E2, em que o referido método é realizado in vivo.
E5. Método E1 ou E2, em que o referido gene de troca é um gene de troca baseado em receptor de ecdisona (EcR).
E6. Método de E5, em que o referido ligante se liga ao domínio de ligação do Iigan- te EcR.
E7. Método de E6, em que o referido ligante é uma diacilidrazina.
E8. Método de E7, em que o referido ligante é selecionado a partir do grupo consis- tindo de RG-115819, RG-115932, e RG-115830.
E9. Método de E6, em que o referido ligante é uma amidocetona ou oxadiazolina.
E10. Método de E1 ou E2, em que o referido gene de troca compreende uma pri- meira seqüência de fator de transcrição sob o controle de um primeiro promotor de troca terapêutico e uma segunda seqüência de fator de transcrição sob o controle de um segundo promotor de troca terapêutica, em que as proteínas codificadas pela referida seqüência de fator de transcrição e a referida segunda seqüência de fator de transcrição interage para formar um complexo proteíco que funciona como um fator de transcrição dependente de ligante.
E11. Me'todo de E10, em que o referido primeiro promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutica são diferentes.
E12. Método de E10, em que o referido primeiro promotor de troca terapêutica e o referido segundo promotor de troca terapêutica são os mesmos.
E13. Método de E10, em que a referida primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro heterodímero e um domínio de transati- vação.
E14. Método de E10, em que a referida segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um domínio de li- gação de ligante.
E15. Método de E1 ou E2, em que um dos polinucleotídeos ainda codifica um poli- peptídeo letal operacionalmente ligado a um promotor induzível.
E16. Método para expressão de um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo te- rapêutico em uma célula, compreendendo:
(a) introdução na referida célula de (1) um polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêu- tica, em que o promotor é ativado durante a referida doença ou distúrbio, e (2) um polinucle- otídeo codificando um polipeptídeo ou polinucletídeo terapêutico ligado a um promotor que é ativado pelo referido fator de transcrição dependente de ligante, para produzir células modi- ficadas; e
(b) adminsitração de ligante à referida célula modificada para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico;
E17. Método de E16, em que o referido método é realizado in vitro.
E18. Método de E16, em que o referido método é realizado ex vivo em uma célula que tenha sido isolada a partir de um paciente.
E19. Método de E16, em que o referido método é realizado in vivo.
E20. Método de E16, em que o referido gene de troca é um gene de troca baseado
em EcR.
E21. Método de E20, em que o referido ligante se liga ao domínio de ligação de li- gante a EcR.
E22. Método de E21, em que o referido ligante é uma diacilidrazina.
E23. Método de E22, em que o referido ligante é selecionado a partir do grupo con-
sistindo de RG-115819, RG-115932 e RG-115830.
E24. Método de E21, em que o referido ligante é uma amidocetona ou oxadiazolina.
E25. Método de E16, em que o referido gene de troca compreende uma primeira seqüência de fator de transcrição sob o controle de um primeiro promotor de troca terapêuti- ca e uma segunda seqüência de fator de transcrição sob o controle de um segundo promo- tor de troca terapêutico, em que as proteínas codificadas pela referida seqüência de fator de transcrição e a referida seqüência de fator de transcrição interage para formar um complexo de proteína que funciona como um fator de transcrição dependente de ligante.
E26. Método de E25, em que o referido primeiro promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são diferentes.
E27. Método de E25, em que o referido primeiro promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são os mesmos.
E28. Método de E25, em que a referida primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro heterodímero e um domínio de transati- vação.
E29. Método de E25, em que a referida segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um domínio de li- gação de ligante. Ε30. Método de E16, em que um dos referidos polinucleotídeos ainda codifica um polipeptídeo Ietai operacionalmente ligado a um promotor induzível.
E31. Polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca com- preendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma seqüência de fator de transcrição codifica um fator de transcrição dependente de ligante, operacionalmente ligado a um promotor de troca terapêutico, em que a atividade do promo- tor é modulado durante a referida doença ou distúrbio.
E32. Polinucleotídeo de E31, ainda codificando um gene repórter ligado a um pro- motor que é ativado pelo fator de transcrição dependente de ligante.
E33. Polinucleotídeo de E31, em que o reerido gene de troca é um gene de troca baseado em EcR.
E34. Polinucleotídeo de E31, em que o referido de gene de troca compreende uma primeira seqüência de fator de transcrição sob o controle de um primeiro promotor de troca terapêutico e uma segunda seqüência de fator de transcrição sob o controle de um segundo promotor de troca terapêutico, em que as proteínas codificadas pela referida seqüência de fator de transcrição e a referida seqüência de fator de transcrição interage para formar um complexo protéico que funciona como um fator de transcrição dependente de ligante.
E35. Polinucleotídeo de E34, em que o referido primeiro promotor de troca terapêu- tico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são diferentes.
E36. Polinucleotídeo de E34, em que o referido primeiro promotor de troca terapêu- tico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são os mesmos.
E37. Polinucleotídeo de E34, em que a referida primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro heterodímero e um domínio de transativação.
E38. Polinucleotídeo de E34, em que a referida segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um do- mínio de ligação de ligante.
E39. Polinucleotídeo de E31, em que o referido polinucleotídeo ainda codifica um polipeptídeo letal operacionalmente ligado a um promotor induzível.
E40. Vetor compreendendo o polinucleotídeo de E31.
E41. Vetor de E40, que é um vetor plasmídeo.
E42. Vetor de E40, que é um vetor viral.
E43. Kit compreendendo o polinucleotídeo de E31.
E44. Kit compreendendo o vetor de E42.
A presente invenção ainda relaciona-se a instruções para desempenhar um ou mais métodos da invenção. Tais instruções podem instruir um usuário de condições adequadas para desempenhar métodos da invenção. Instruções da invenção podem ser em uma forma tangível, por exemplo, isntruções escritas (por exemplo, digitadas em papel), ou podem ser em uma forma intangível, por exemplo, acessível via um disco de computador ou pela inter- net.
Será reconhecido que um texto inteiro de instruções para desempenhar um método da invenção ou, onde as instruções são incluídas com um kit, para uso do kit, não precisa ser provido. Um exemplo de uma situação em que um kit da invenção, por exemplo, pode não conter tais instruções de comprimento inteiro é onde as direções providas informam um usuário dos kits onde para obter instruções para praticar os métodos para os quais o kit po- de ser usado. Então, instruções para fazer métodos da invenção podem ser obtidas a partir de páginas da internet, separadamente vendidos ou manuais distribuídos ou outro produto de literatura etc. A invenção então inclui kits que direcionam um usuário do kit para um ou mais locais onde as instruções não diretamente colocadas e/ou distribuídas com os kits po- dem ser encontradas. Tais instruções podem estar em qualquer forma incluindo, mas não limitadas a, formas eletrônicas ou impressas.
Tendo agora descrito completamente a invenção, será entendido por aqueles ver- sados na técnica que a mesma pode ser feita dentro de uma grande e equivalentes varia- ções de condições, formulações e outros parâmetros sem afetar o objetivo da invenção ou qualquer modalidade da mesma. Todas as patentes, pedidos de patentes e publicações ci- tadas aqui são completamente incorporadas aqui por referência em sua totalidade. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> INTREXON CORPORATION MERENICK, Bethany Lynn BEECH, Robert P. REED1 Thomas D. TRETIAKOVA, Anna P. PETERSON, Richard E.
<120> CONSTRUÇÕES TERAPÊUTICAS DE GENE DE TROCA E BIOREATORES PARA A EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS BIOTERAPÊUTICAS, E USOS DAS MESMAS
<130> 2584.014PC02
<140> PCT/US2008/011270 <141 > 2008-09-29
<150> US 60/047,899 <151> 2008-04-25
<150> US 60/975,986 <151> 2007-09-28
<160> 26
<170> Patentln versão 3.3
<210> 1 <211> 17 <212> DNA
<213> seqüência artificial <220>
<223> Elemento de resposta de receptor de ecdisone sintético
<220> <221 > misc_característica <222> (9)..(9) <223> n é a, c, g, ou t
<400> 1 rrggttcant gacacyy 17
<210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220> <223> Elemento de resposta de receptor de ecdisone sintético
<220> <221 > misc_característica <222> (7)..(7) <223> n é um ou mais nucleotídeos espaçadores
<400> 2 aggtcanagg tca 13
<210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220> <223> Elemento de resposta de receptor de ecdisone sintético
<400> 3
gggttgaatg aattt 15
<210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Sítio de restrição de homing endonuclease I-Scel sintético <400> 4
tagggataac agggtaat 18
<210> 5 <211> 878 <212> PRT
<213> Drosophilamelanogaster <220>
<223> Receptor de ecdisone <400> 5
Met Lys Arg Arg Trp Ser Asn Asn Gly Gly Phe Met Arg Leu Pro Glu 1 5 10 15
Glu Ser Ser Ser Glu Val Thr Ser Ser Ser Asn Gly Leu Val Leu Pro 20 25 30
Ser Gly Val Asn Met Ser Pro Ser Ser Leu Asp Ser His Asp Tyr Cys 35 40 45
Asp Gln Asp Leu Trp Leu Cys Gly Asn Glu Ser Gly Ser Phe Gly Gly 50 55 60
Ser Asn Gly His Gly Leu Ser Gln Gln Gln Gln Ser Val l!e Thr Leu 65 70 75 80
Ala Met His Gly Cys Ser Ser Thr Leu Pro Ala Gln Thr Thr Ile Ile 85 90 95 Pro Ile Asn Gly Asn Ala Asn Gly Asn Gly Gly Ser Thr Asn Gly Gln 100 105 110
Tyr Val Pro Gly Ala Thr Asn Leu Gly Ala Leu Ala Asn Gly Met Leu 115 120 125
Asn Gly Gly Phe Asn Gly Met Gln Gln Gln Ile Gln Asn Gly His Gly 130 135 140
Leu Ile Asn Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Thr Thr Pro Leu His Leu 145 150 155 160
Gln Gln Asn Leu Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ile Gly Gly Met Gly 165 170 175
Ile Leu His His Ala Asn Gly Thr Pro Asn Gly Leu Ile Gly Val Val 180 185 190
Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Leu Gly Val Gly Gly Gly Gly Val Gly 195 200 205
Gly Leu Gly Met Gln His Thr Pro Arg Ser Asp Ser Val Asn Ser Ile 210 215 220
Ser Ser Gly Arg Asp Asp Leu Ser Pro Ser Ser Ser Leu Asn Gly Tyr 225 230 235 240
Ser Ala Asn Glu Ser Cys Asp Ala Lys Lys Ser Lys Lys Gly Pro Ala 245 250 255
Pro Arg Val Gln Glu Glu Leu Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser 260 265 270
Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe 275 280 285
Arg Arg Ser Val Thr Lys Ser Ala Val Tyr Cys Cys Lys Phe Gly Arg Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg
Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Arg Pro Glu Cys Val Val Pro
Glu Asn Gln Cys Ala Met Lys Arg Arg Glu Lys Lys Ala Gln Lys Glu
Lys Asp Lys Met Thr Thr Ser Pro Ser Ser Gln His Gly Gly Asn Gly
Ser Leu Ala Ser Gly Gly Gly Gln Asp Phe Val Lys Lys Glu Ile Leu
Asp Leu Met Thr Cys Glu Pro Pro Gln His Ala Thr Ile Pro Leu Leu
Pro Asp Glu Ile Leu Ala Lys Cys Gln Ala Arg Asn Ile Pro Ser Leu
Thr Tyr Asn Gln Leu Ala Val Ile Tyr Lys Leu Ile Trp Tyr Gln Asp
Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Glu Glu Asp Leu Arg Arg Ile Met Ser Gln
Pro Asp Glu Asn Glu Ser Gln Thr Asp Val Ser Phe Arg His Ile Thr
Glu Ile Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu Phe Ala Lys Gly
Leu Pro Ala Phe Thr Lys Ile Pro Gln Glu Asp Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Met Ala Arg Arg Tyr 500 505 510
Asp His Ser Ser Asp Ser Ile Phe Phe Ala Asn Asn Arg Ser Tyr Thr 515 520 525
Arg Asp Ser Tyr Lys Met Ala Gly Met Ala Asp Asn Ile Glu Asp Leu 530 535 540
Leu His Phe Cys Arg Gln Met Phe Ser Met Lys Val Asp Asn Val Glu 545 550 555 560
Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Ile Val Ile Phe Ser Asp Arg Pro Gly Leu 565 570 575
Glu Lys Ala Gln Leu Val Glu Ala Ile Gln Ser Tyr Tyr Ile Asp Thr 580 585 590
Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Arg His Cys Gly Asp Ser Met Ser Leu 595 600 605
Val Phe Tyr Ala Lys Leu Leu Ser Ile Leu Thr Glu Leu Arg Thr Leu 610 615 620
Gly Asn Gln Asn Ala Glu Met Cys Phe Ser Leu Lys Leu Lys Asn Arg 625 630 635 640
Lys Leu Pro Lys Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val His Ala Ile Pro 645 650 655
Pro Ser Val Gln Ser His Leu Gln Ile Thr Gln Glu Glu Asn Glu Arg 660 665 670
Leu Glu Arg Ala Glu Arg Met Arg Ala Ser Val Gly Gly Ala Ile Thr 675 680 685 Ala Gly Ile Asp Cys Asp Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala 690 695 700
Ala Gln His Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Ser Ser Leu 705 710 715 720
Thr Gln Asn Asp Ser Gln His Gln Thr Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln 725 730 735
Leu Pro Pro Gln Leu Gln Gly Gln Leu Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln 740 745 750
Leu Gln Thr Gln Leu Gln Pro Gln Ile Gln Pro Gln Pro Gln Leu Leu 755 760 765
Pro Val Ser Ala Pro Val Pro Ala Ser Val Thr Ala Pro Gly Ser Leu 770 775 780
Ser Ala Val Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Met Gly Gly Ser Ala Ala Ile 785 790 795 800
Gly Pro Ile Thr Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile Thr Ala Ala Val Thr 805 810 815
Ala Ser Ser Thr Thr SerAIa Val Pro Met Gly Asn Gly Val Gly Val 820 825 830
Gly Val Gly Val Gly Gly Asn Val Ser Met Tyr Ala Asn Ala Gln Thr 835 840 845
Ala Met Ala Leu Met Gly Val Ala Leu His Ser His Gln Glu Gln Leu 850 855 860
Ile Gly Gly Val Ala Val Lys Ser Glu His Ser Thr Thr Ala 865 870 875
<210> 6 <211> 605 <212> PRT <213> Streptomyces
<220> <223> Fago Streptomyces phiC31 integrase
<400> 6
Met Asp Thr Tyr Ala Gly Ala Tyr Asp Arg Gln Ser Arg Glu Arg Glu 1 5 10 15
Asn Ser Ser Ala Ala Ser Pro Ala Thr Gln Arg Ser Ala Asn Glu Asp 20 25 30
Lys Ala Ala Asp Leu Gln Arg Glu Val Glu Arg Asp Gly Gly Arg Phe 35 40 45
Arg Phe Val Gly His Phe Ser Glu Ala Pro Gly Thr Ser Ala Phe Gly 50 55 60
ThrAIa Glu Arg Pro Glu Phe Glu Arg Ile Leu Asn Glu Cys Arg Ala 65 70 75 80
Gly Arg Leu Asn Met Ile Ile Val Tyr Asp Val Ser Arg Phe Ser Arg 85 90 95
Leu Lys Val Met Asp Ala Ile Pro Ile Val Ser Glu Leu Leu Ala Leu 100 105 110
Gly Val Thr Ile Val Ser Thr Gln Glu Gly Val Phe Arg Gln Gly Asn 115 120 125
Val Met Asp Leu Ile His Leu Ile Met Arg Leu Asp Ala Ser His Lys 130 135 140
Glu Ser Ser Leu Lys SerAIa Lys Ile Leu Asp Thr Lys Asn Leu Gln 145 150 155 160
Arg Glu Leu Gly Gly Tyr Val Gly Gly Lys Ala Pro Tyr Gly Phe Glu 165 170 175
Leu Val Ser Glu Thr Lys Glu Ile Thr Arg Asn Gly Arg Met Val Asn 180 185 190
Val Val Ile Asn Lys Leu Ala His Ser Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro 195 200 205
Phe Glu Phe Glu Pro Asp Val Ile Arg Trp Trp Trp Arg Glu Ile Lys 210 215 220
Thr His Lys His Leu Pro Phe Lys Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ile His 225 230 235 240
Pro Gly Ser Ile Thr Gly Leu Cys Lys Arg Met Asp Ala Asp Ala Val 245 250 255
Pro ThrArg Gly Glu Thr Ile Gly Lys Lys ThrAIa Ser SerAIa Trp 260 265 270
Asp Pro Ala Thr Val Met Arg Ile Leu Arg Asp Pro Arg Ile Ala Gly 275 280 285
Phe Ala Ala Glu Val Ile Tyr Lys Lys Lys Pro Asp Gly Thr Pro Thr 290 295 300
Thr Lys Ile Glu Gly TyrArg Ile Gln Arg Asp Pro Ile Thr Leu Arg 305 310 315 320
Pro Val Glu Leu Asp Cys Gly Pro Ile Ile Glu Pro Ala Glu Trp Tyr 325 330 335
Glu Leu Gln Ala Trp Leu Asp Gly Arg Gly Arg Gly Lys Gly Leu Ser 340 345 350 Arg Gly Gln Ala Ile Leu Ser Ala Met Asp Lys Leu Tyr Cys Glu Cys 355 360 365
Gly Ala Val Met Thr Ser Lys Arg Gly Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ser 370 375 380
Tyr Arg Cys Arg Arg Arg Lys Val Val Asp Pro Ser Ala Pro Gly Gln 385 390 395 400
His Glu Gly Thr Cys Asn Val Ser Met Ala Ala Leu Asp Lys Phe Val 405 410 415
Ala Glu Arg Ile Phe Asn Lys Ile Arg His Ala Glu Gly Asp Glu Glu 420 425 430
Thr Leu Ala Leu Leu Trp Glu Ala Ala Arg Arg Phe Gly Lys Leu Thr 435 440 445
Glu Ala Pro Glu Lys Ser Gly Glu Arg Ala Asn Leu Val Ala Glu Arg 450 455 460
Ala Asp Ala Leu Asn Ala Leu Glu Glu Leu Tyr Glu Asp Arg Ala Ala 465 470 475 480
Gly Ala Tyr Asp Gly Pro Val Gly Arg Lys His Phe Arg Lys Gln Gln 485 490 495
Ala Ala Leu Thr Leu Arg Gln Gln Gly Ala Glu Glu Arg Leu Ala Glu 500 505 510
Leu Glu Ala Ala Glu Ala Pro Lys Leu Pro Leu Asp Gln Trp Phe Pro 515 520 525
Glu Asp Ala Asp Ala Asp Pro Thr Gly Pro Lys Ser Trp Trp Gly Arg 530 535 540
Ala Ser Val Asp Asp Lys Arg Val Phe Val Gly Leu Phe Val Asp Lys 545 550 555 560
Ile Val Val Thr Lys Ser Thr Thr Gly Arg Gly Gln Gly Thr Pro Ile 565 570 575
Glu Lys Arg Ala Ser Ile Thr Trp Ala Lys Pro Pro Thr Asp Asp Asp 580 585 590
Glu Asp Asp Ala Gln Asp Gly Thr Glu Asp Val Ala Ala 595 600 605
<210> 7 <211> 9861 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Construção de gene de troca induzível por hipóxia expressando IGF-1
<400> 7
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180 cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240 ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300 cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360 tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420 gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc 480 agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag 540 cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc 600 tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt 660 tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct 720 ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg 780 tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg 840 tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata 900 gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg 960 cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca 1020 gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt 1080 tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac 1140 agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac 1200 agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg 1260 gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact 1320 gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag 1380 ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg 1440 tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1500 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1560 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1620 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1680 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1740 acgccagggt tttcccagtc acgacgtígt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1800 gggaggtttt ataaatccga cígtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1860 aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta 1920 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1980 attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 2040 atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt 2100 ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagctíc ctgttcttca 2160 gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga 2220 tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga 2280 tgtagatcct cagggtgttc aggtagtacc tctggatctc ctccaccagc tggggctgct 2340 ccaggccggg cctgtcgctg aagaícacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt 2400 ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca 2460 tgccagcctt cctgtagttg tccctggtgt aagcctggtt gttggcgaac aggatgctgt 2520 cgctggcggc gtcgtacctc ctggccaccc tcagcatcat cacctcgctg ctgcaagcct 2580 tcagcagggt gatctggtcg ggctggctga tcttggcgaa tccgggcagg cccttggcga 2640 actccacgat cagcígcacg gtcaggatgg tcatctcggt gaíctgcctg aagggggtgt 2700 cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760 cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820 ggttggcggt cagctggggg atgttcttct gcctgttggt caccagcagc ttgtcgctca 2880 ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940 tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000 tctgggcctt cttcíccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060 gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120 cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180 ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240 cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300 ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360 tcaggtgggc cctggtcagg 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<210> 8 <211> 10823 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220>
<223> Construção de gene de troca promotor induzível por hipoxia ubíqua sintética expressando bFGF
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<220> <223> Construção de gene de troca induzível por hipóxia ubíqua sintética espressando EPO
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taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180 acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240 aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300 ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360 gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420 ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480 ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540 cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600 cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660 gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720 ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780 ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840 tggcatacgt gctttcaggc 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<210> 10 <211> 10361 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Construção de gene de troca induzível por hipóxia ubíqua sintética expressando BNP
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<213> Seqüência artificial <220>
<223> Construção de gene de troca induzível por hipóxia promotora de cardomiocito Nxcl sintética expressando EPO
<400> 12
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180 acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240 aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300 ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360 gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420 ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480 ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540 cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600 cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660 gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720 ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780 ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840 tggcatacgt gctttcaggc 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tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580 gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640 cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700 ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760 cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820 cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880 cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940 ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000 attgcccccc cccccccccg catgccccag tatgatgcct tctctaaatt taccagaaag 3060 aaaggacctg ggatgcttgt cctttaagtg tctctaaaca tggtttgcat agctggatct 3120 cagcttatct gtgcctttcg gctttcgctt ccatacatgg atctgttccc aacagtaact 3180 ccaagctgtc gaaaagaagc tatctggcag ctctctgctt catccaacac atggatgata 3240 aaaatacaca tatagcgatt cttccctcga gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc 3300 tcttccaaaa atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg 3360 ctacaaacta cgaacgatca 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caggatggtc atctcggtga tctgcctgaa gggggtgtcg 4260 ctctcctcgt tctcgtcgtc ggcctgctgc caggtctggg tgatcctttt caggtcctcg 4320 tcgctgggct gctcgtagcc gtcctgatac cagatcagcc tggcgatcag gaactgctgg 4380 ttggcggtca gctgggggat gttcttctgc ctgttggtca ccagcagctt gtcgctcagg 4440 aacctgggca cgacctcgtg aatcctggcg gcctcggggg gggggggctc gcactgcatg 4500 atggggggca tgtggtcatc gacggtggtg gtgctcacgg gcagcttgtc cttctccttc 4560 tgggccttct tctccttcct tttcatggcg cacígggtct cgggcaccac gcactcgggc 4620 ctgatcccgg gaaactcggg gctcacggtc agctgcctct ggcccttgtt gctgctctcc 4680 tcgctgctgc tggtggcgct gatcctgtgc tgcctcaggg tcaggggcat gtcggtctcc 4740 acgctggcca gcctgtcggt cacggcgtcc ttgttcacgt tgtcctgcac gaacaggccg 4800 gtcagcaggg ccttgatgtc ttgcaggctg tccatcttca ggatcatgtc caggtcctcc 4860 ctggggaaga tcagcaggaa cagctgctcc agcctctcca gcctgctctc cacctcggtc 4920 aggtgggccc tggtcagggg gctcctcttg gtcttggggc tgtatctgca ctcccagttg 4980 ttcttcaggc acttggcgca cttgggcttc tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg 5040 cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc 5100 ccccccccgc atgcacagga agatgagctc acacaccagc taaggcaccc attatatacc 5160 ctctaggtct tcgcggacgt gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc 5220 ccgcacgcac tcagcgtcgc tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt 5280 gtcacgtcgc ggacgtgcgg gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc 5340 acgcactcag cgtcgctctg gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca 5400 cgtcgcggac gtgcgggaac ccacgtgggg gctccgtcac gtactccgag tcccgcacgc 5460 % actcagcgtc gctctggggc cccacgtccg gccctgacgt gcggcttcgt ttgtcacgtc 5520
gcggacgtgc gggaacccac gtgggggctc cgtcacgtac tccgagtccc gcacgcactc 5580 agcgtcgctc tggggcccca cgtccggccc tgacgtgcgg cttcgtttgt cacgtcgcgg 5640 acgtgcggga acccacgtgg gggctccgtc acgtactccg agtcccgcac gcactcagcg 5700 tcgctctggg gccccacgtc cggccctgac gtgcggcttc gtttgtcacg tcgcggacgt 5760 gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc ccgcacgcac tcagcgtcgc 5820 tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt gtcacgtcgc ggacgtgcgg 5880 gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc acgcactcag cgtcgctctg 5940 gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca cgtcctcgag tggtaataca 6000 atggccggtt cccatggacc tgcatcgtgg tgtaactata acggtcctaa ggtagcgacc 6060 gcggagacta ggtgtattta tctaagcgat cgcttaatta aggccggccg ccgcaataaa 6120 atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatccat agtactaaca 6180 tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 6240 gcaagtccag gtgccagaac atttctctat ccataatgca ggggtaccgg gtgatgacgg 6300 tgaaaacctc caattgcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt 6360 actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 6420 gtcctccgag cggagagícc ccggggacct agagggtata taatgggtgc cttagctggi 6480 gtgtgacctc atcttcctgt acgcccctgc aggggcgcgc cacgcgtcga agaaggtgag 6540 taatcttaac atgctctttt tttttttttt tgctaatccc ttttgtgtgc tgatgttagg 6600 atgacattta caacaaatgt ttgttcctga caggaaaaac cttgctgggt accttcgttg 6660 ccggacactt cttgtcctct actttggaaa aaaggaattg agagccgcta gcgccaccat 6720 gggggtgcat gaatgtcctg cctggctgtg gcttctcctg tccctgctgt cgctccctct 6780 gggcctccca gtcctgggcg ctccaccacg cctcatctgt gacagccgag tcctggagag 6840 atacctgttg gaggccaagg aagccgagaa tatcacgacg ggctgtgctg aacactgctc 6900 cttgaatgag aatatcactg tcccagacac caaagttaat ttctatgcct ggaagcggat 6960 ggaggtcggg cagcaggccg tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt cggaagctgt 7020 cctgcggggc caggccctgt tggtcaacag cagccagccg tgggagcccc tgcaactgca 7080 tgtggataaa gccgtcagtg gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg ctctgcgagc 7140 ccagaaggaa gccatctccc ctccagatgc ggccagcgcc gctccactcc gaacaatcac 7200 tgctgacact ttccgcaaac tgttccgagt ctactccaat ttcctccggg gaaagctgaa 7260 gctgtacaca ggggaggctt gcaggacagg ggacagatga atcgattgcg caaagctttc 7320 gcgataggcg agaccaatgg gtgtgtacgt agcggccgcg tcgacgatag cttgatgggt 7380 ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc 7440 ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct 7500 ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct 7560 gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca 7620 ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg 7680 gattccaggc atgcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt 7740 tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc 7800 ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttctgattt 7860 taaaataact ataccagcag gaggacgtcc agacacagca taggctacct ggccatgccc 7920 aaccggtggg acatttgagt tgcttgcttg gcactgtcct ctcatgcgtt gggtccactc 7980 agtagatgcc tgttgaattc tgatttaaat cggtccgcgt acggcgtggt aggtccgaac 8040 gaatccatgg attaccctgt tatccctact caaggacatc atccctttag tgagggttaa 8100 ttcacgcagt gggtacggaa ctaaaggcag cacacatcgt gtaatcatgg tcatagctgt 8160 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctacgtc tctcccccgc agtaagggct agattaactc 8220 gtctcgtgaa tatccggaac tccctttagt gagggttaat tgcgttgcgc tcactgcccg 8280 ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc ttaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 8340 aaattgttat ccgctaccgg aaacgcttcc ttcatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 8400 aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 8460 catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 8520 caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 8580 ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 8640 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 8700 gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgíc ttgagtccaa cccggtaaga 8760 cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 8820 ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 8880 tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 8940 tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 9000 cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 9060 tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgatct atgtcgggtg cggagaaaga 9120 ggtaatgaaa tggcatacga gtaaacttgg tctgacaccg ctgcatgaga ttatcaaaaa 9180 ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 9240 atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 9300 tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 9360 gggagggctt accatctggc cccagtgcíg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 9420 ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagcgc cgagcgcaga agtggtcctg 9480 caactttatc cgcctccatc cagtctatta actgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 9540
cgccagttaa tagtttgcgg agcgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 9600
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cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 10080
caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catacgcttc ctttttcaat 10140
agtattgaag catttatcag ggttattgtc tcgggagcga atacatattt gaatgtattt 10200
agaaaaa 10207
<210> 13 <211> 16979 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> ubíquo sintético + hPlexin D1 + construção de gene de troca induzível por ipóxia expressando relaxina HGF
<400> 13
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180 cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240 ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300 cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360 tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420 gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga tttagaagaa ctcgtcaaga 480 aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggggcggcga taccgtaaag gacgaggaag 540 cggtcagccc attcgccgcc aagttcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 600 tgatagcggt cggccacacc cagccgtcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 660 tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccgtgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 720 ggcatcctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcctcg 780 tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 840 tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcatgta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 900 gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 960 cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcacg 1020 gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gícctggagt 1080 tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 1140 agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 1200 agcctctcca cccaagcggc cggagaacca gcgtgcaatc catcttgttc aatggccgat 1260 cccatggtgg ccaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat 1320 gcggctgact gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg 1380 catgcggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1440 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1500 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1560 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1620 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1680 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1740 gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat tgttgttaaa tcacacaaaa aaccaacaca 1800 cagatgtaat gaaaataaag atattttatt atcgattcag ctgtcgctgg ggctctccag 1860 catctccatc aggaaggtgt cgatgggcac gtcgccgatc agcctgaaga agaacaggtg 1920 ctccaggcac ttcaggccga tgctcctcag gctgggcagc ctcagcagca gcttggcgaa 1980 tctgccgggc tcgtcggggt gggtggtcct ggtgtactcc tccagggcgg cgtacacctt 2040 ctccctcagc agctccacct cctgggcgct tttcaggccc ctcacctcgg ggttgaacag 2100 gatgatggcc ctcaggcagc ccagctcggt cttgtccatc ctcatgtccc tcatcttgct 2160 caccagctcg gtcagcaccc tgtcgaagat ggcgcccact ccggcgctgt gggcgctgtt 2220 cctatggacg tgcaggccgg tggccagcag gatgccgtcc ctcacgtcga tgctcctgtg 2280 gctgaagctg gcgatcagca gctcgttcca tccggccctc agcaggatca cctggtcgtc 2340 caggggcagg ctgctgaagt ggggaatcct cttggcccac tccaccaggg tgaacagctg 2400 cttgtcggcg gcctggcaga tgttggícac ggggtcgttg gggctgctgc cgctgccgcc 2460 ggttccgccg gggccctcca cgccctggtc gcttttctgc tccacggcga gttcggcctc 2520 cagaatcctg tccacgggca 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gcccgcggga ggcgccaaaa cccggcgcgg aggccctcga 3420 gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc tcttccaaaa atttaggtga cactataggg 3480 caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg cíacaaacta cgaacgatca ttctagatac 3540 cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca catctccccc tgaacctgaa 3600 acataaaatg aatgcaaatg ttttattaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa 3660 ttaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat taagcatttt tttcactgca ttctagttgt 3720 ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctaat cgattcacag gttggtgggg 3780 ctctccagga tggggggggg ctgggtgtgg ctcatgtcgg ccacgtccca aatctcctcc 3840 aggaaggggg gcagcttcct gttcttcagc ttcaggctga tacacatatt gctgttctgc 3900 attcccaggg tcctcagctc gctcaggatg ctcaggatct tgccgtagat cacgctgctc 3960 ctggcgctgc cgctcagctg gttcaggatg tagatcctca gggtgttcag gtagtacctc 4020 tggatctcct ccaccagctg gggctgctcc aggccgggcc tgtcgctgaa gatcaccacg 4080 gcggtcagca gggcgtagtg gatgttgtcc agggccatgc tgtacataca tctgcagaag 4140 tgcaggaggt cctcgatcac ctcggccatg ccagccttcc tgtagttgtc cctggtgtaa 4200 gcctggttgt tggcgaacag gatgctgtcg ctggcggcgt cgtacctcct ggccaccctc 4260 agcatcatca cctcgctgct gcaagccttc agcagggtga tctggtcggg ctggctgatc 4320 ttggcgaatc cgggcaggcc cttggcgaac tccacgatca gctgcacggt caggatggtc 4380 atctcggtga tctgcctgaa gggggtgtcg ctctcctcgt tctcgtcgtc ggcctgctgc 4440 caggtctggg tgatcctttt caggtcctcg tcgctgggct gctcgtagcc gtcctgatac 4500 cagatcagcc tggcgatcag gaactgctgg ttggcggtca gctgggggat gttcttctgc 4560 ctgttggtca ccagcagctt gtcgctcagg aacctgggca cgacctcgtg aatcctggcg 4620 gcctcggggg gggggggctc gcactgcatg atggggggca tgtggtcatc gacggtggtg 4680 gtgctcacgg gcagcttgtc cttctccttc tgggccttct tctccttcct tttcatggcg 4740 cactgggtct cgggcaccac gcactcgggc ctgatcccgg gaaactcggg gctcacggtc 4800 agctgcctct ggcccttgtt gctgctctcc tcgctgctgc tggtggcgct gatcctgtgc 4860 tgcctcaggg tcaggggcat gtcggtctcc acgctggcca gcctgtcggt cacggcgtcc 4920 ttgttcacgt tgtcctgcac gaacaggccg gtcagcaggg ccttgatgtc ttgcaggctg 4980 tccatcttca ggatcatgtc caggtcctcc ctggggaaga tcagcaggaa cagctgctcc 5040 agcctctcca gcctgctctc cacctcggtc aggtgggccc tggtcagggg gctcctcttg 5100 gtcttggggc tgtatctgca ctcccagttg ttcttcaggc acttggcgca cttgggcttc 5160 tccttgctgc acttcagctt cttcagcctg cagatgtcgc aagcctgctc gatgctgctc 5220 agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc ccccccccgc atgccccgga ggcggcggga 5280 ggcggggggc gggtccgggc cacgatgcgc ttcctgcccg cgccagccgc ccccgacccc 5340 ggcgtccggg cccggatcag cctcgccgcg cagtccgggg gcggggcggg ggcggctccg 5400 ctgcggacac gccctcactc cccgccccgg ccccgcccgc ccccggaacc cccgcctgcc 5460 cctggccgcc ctgggccacg ccccgccgtc cgcgggtccc gccgcccgcg ccctccagga 5520 cccgcccgcg gccccagggt ccctccccgt agccgccgcc gccgtcgctc gctctcctcg 5580 ctctttcctc ccacttggcc gcttggcctg cctcgctcgc gcctgttttc tcttttccgc 5640 cctctccccc accccgcctc tccctctctc tgtgtctctc ggtctctgcg cctctccgcc 5700 tctgtcccca ccccaaactc cgcgcgtgtg gcgcttctcc gggttctgcc tctgcttctc 5760 cttctccctc cgactccgct tcgctctcca gtccctggca gccccgcccc cggccctttc 5820 tagtctcctt ctctctcctg ctccgttttt ccgtccctga cgctcgctcc ctctctccgt 5880 ggctccctct gcctccccct 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cttcgttgcc ggacacttct tgtcctctac tttggaaaaa 6780 aggaattgag agccgctagc gccaccatgc ctcgcctgtt ttttttccac ctgttgggag 6840 tctgtttact actgaaccaa ttttccagag cagtcgcgga ctcatggatg gaggaagtta 6900 tcaagttatg cggcagagaa ttagttcgcg cgcagattgc catttgcggc atgagcacct 6960 ggagcaaaag gtctctgagc caggaagatg ctcctcagac acctagacca gtggcagaaa 7020 ttgtgccatc cttcatcaac aaagatacag aaaccataaa tatgatgtca gaatttgttg 7080 ctaatttgcc acaggagctg aagctgaccc tgtctgagat gcagccagca ttaccacagc 7140 tacaacagca cgtccctgtg ctgaaggatt ccagcctgct gtttgaagaa tttaagaaac 7200 ttattcgcaa tagacaaagt gaagccgcag acagcagtcc ttcagagctg aagtacctgg 7260 gcttggatac tcattctcga aaaaagagac aactctacag tgcattggct aacaagtgtt 7320 gccatgttgg ttgtaccaaa agaagccttg ctagattttg ctgaatcgat tgcgcaaagc 7380 tttcgcgata ggcgagacca atgggtgtgt acgtagcggc cgcgtcgacg atagcttgat 7440 gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 7500 gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 7560 ttctataata ttatggggtg 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tgaaaacctc caattgtgct gtatataaaa ccagtggtta 8460 tatgtacagt actgctgtat ataaaaccag tggttatatg tacagtacgt cgactgctgt 8520 atataaaacc agtggttata tgtacagtac tgctgtatat aaaaccagtg gttatatgta 8580 cagtaccccg gggacctaga gggtatataa tgggtgcctt agctggtgtg tgacctcatc 8640 ttcctgtacg cccctgcagg ggcgcgccac gcgtcgaaga aggtgagtaa tcttaacatg 8700 ctcttttttt ttttttttgc taatcccttt tgtgtgctga tgttaggatg acatttacaa 8760 caaatgtttg ttcctgacag gaaaaacctt gctgggtacc ttcgttgccg gacacttctt 8820 gtcctctact ttggaaaaaa ggaattgaga gccgctagcg ccaccatgtg ggtgaccaaa 8880 ctcctgccag ccctgctgct ccagcacgtc ctcctgcatc tcctcctgct ccccatcgcc 8940 atcccctatg cagagggaca aaggaaaaga agaaatacaa ttcatgagtt caaaaaatca 9000 gcaaagacta ccctaatcaa aatagatcca gcactgaaga taaaaaccaa aaaagtgaat 9060 accgccgacc aatgtgctaa tagatgtact aggaacaaag gacttccatt cacttgcaag 9120 gcttttgttt ttgataaagc aagaaaacaa tgcctctggt tccccttcaa tagcatgtca 9180 agtggagtga aaaaagaatt tggccatgaa tttgacctct atgaaaacaa agactacatt 9240 agaaactgca tcattggtaa aggacgcagc tacaagggaa cagtatctat cactaagagt 9300 ggcatcaaat gtcagccctg gagttccatg ataccacacg aacacagctt tttgccttcg 9360 agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac tactgtcgaa atcccagagg cgaagaaggg 9420 ggaccctggt gtttcacaag caatccagag gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag 9480 tgttcagaag ttgagtgcat gacctgtaat ggggagagtt atcgaggtct catggatcat 9540 acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg gatcaicaga caccacaccg gcacaaattc 9600 ttgcctgaaa gataccccga caagggcttt gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc 9660 cagccgaggc cctggtgcta tactcttgac cctcacaccc gctgggagta ttgcgcaatc 9720 aagacatgcg ctgacaatac tatgaatgac actgatgttc ctttggaaac aactgagtgc 9780 atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc actgtcaata ccatttggaa tggcatcccc 9840 tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag 9900 tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt 9960 tttaccactg atccaaacat ccgagttggc tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg 10020 tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa 10080 acaagaagcg gactaacctg ttcaatgtgg gacaagaaca tggaggactt acatcgtcat 10140 atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat 10200 gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga aatccactca ttccttggga ttattgccct 10260 atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct acaatagtca atttagacca tcccgtaata 10320 tcttgtgcca aaacgaaaca gctgcgagtt gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata 10380 ggatggatgg ttagtttgag atacagaaac aagcatatct gcggaggatc attgataaag 10440 gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt ttccctagca gagacttgaa agattatgag 10500 gcttggcttg gcatccacga tgtccacggc agaggcgatg agaaatgcaa acaggttctc 10560 aatgtttccc agctggtata tggccctgaa ggaagcgacc tggtgctgat gaagctggcc 10620 agacccgctg tcctggatga ttttgttagt acgattgatt tacctaatta tggatgcaca 10680 attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat ggctggggct acactggact gattaactat 10740 gatggcctat tacgagtggc acatctctat ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat 10800 catcgaggga aggtgactct gaatgagtct gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga 10860 tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga 10920 atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt 10980 tttgtccgag tagcctacta cgccaaatgg atacacaaaa ttattttaac atataaggtg 11040 ccccagtcat agatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat gggtgtgtac 11100 gtagcggccg ctcgagaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 11160 catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 11220 actcatcaat gtatcttatc atgtctcgta cggcgtggta ggtccgaacg aatccatgga 11280 ttaccctgtt atccctactc atcttcgtcg gacgcgccgt taatatttga tcagccattc 11340 tctgtatgag tactaacgaa cgtgacgcgg tgttactggt aactatgact ctcttaaggt 11400 agccaaatac atcatccctt tagtgagggt taattcacgc agtgccgcgg cgtgtagaaa 11460 atacctatca gctcgaggac gtgacaaacg aagccgcacg tcagggccgg acgtggggcc 11520 ccagagcgac gctgagtgcg tgcgggactc ggagtacgtg acggagcccc cacgtgggtt 11580 cccgcacgtc cgcgacgtga caaacgaagc cgcacgtcag ggccggacgt ggggccccag 11640 agcgacgctg agtgcgtgcg ggactcggag tacgtgacgg agcccccacg tgggttcccg 11700 cacgtccgcg acgtgacaaa cgaagccgca cgtcagggcc ggacgtgggg ccccagagcg 11760 acgcígagtg cgtgcgggac tcggagtacg tgacggagcc cccacgtggg ttcccgcacg 11820 tccgcgacgt gacaaacgaa gccgcacgtc agggccggac gtggggcccc agagcgacgc 11880 tgagtgcgtg cgggactcgg agtacgtgac ggagccccca cgtgggttcc cgcacgtccg 11940 cgacgtgaca aacgaagccg cacgtcaggg ccggacgtgg ggccccagag cgacgctgag 12000 tgcgtgcggg actcggagta cgtgacggag cccccacgtg ggttcccgca cgtccgcgac 12060 gtgacaaacg aagccgcacg tcagggccgg acgtggggcc ccagagcgac gctgagtgcg 12120 tgcgggactc ggagtacgtg acggagcccc cacgtgggtt cccgcacgtc cgcgacgtga 12180 caaacgaagc cgcacgtcag ggccggacgt ggggccccag agcgacgctg agtgcgtgcg 12240 ggactcggag tacgtgacgg agcccccacg tgggttcccg cacgtccgcg aagacctaga 12300 gggtatataa tgggtgcctt agctggtgtg tgagctcatc ttcctgtgca tgcggggggg 12360 ggggggggca attggccacc atgaaagccc tcaccgctag acaacaggaa gtgtttgacc 12420 tcatcaggga ccatatctcc cagacaggaa tgccccctac cagggccgaa atcgctcaga 12480 ggctgggatt caggagccct aacgctgccg aagaacatct gaaagccctc gccaggaagg 12540 gagtgattga gattgtgtcc ggcgcttcca ggggcattag actcctgcaa 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atctagcacc aggtcttgta cagagcaggt 14280 gcccaataaa tggttgaatg aatatatgaa aagtagaggc agagggctgg gcacagtggc 14340 tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggtggg tggatcactt gaggtcagga 14400 gttcgagacc agcttggcca acatggctaa acctcatctc tattaaaaat acaaaaatta 14460 gctgggctgg tgcctgtaat cccagctact caggaggctg aggcaggaga atcacttgaa 14520 cccaggagga ggagtttgca gtgagccgag atcgcaccat tgcactccag cctgggcgat 14580 aggagcaaaa ctccatctca aaaacaaaaa acaaaacaaa acaaaaagaa aaaagaaaag 14640 taggggcaga gatgtggggc aggagaggtg actcgggctc agctgcatgg tcctgctctg 14700 cttctttttt cttggagttt gtccgttgga tgacaatgat agtggtgaac aggtatggag 14760 ggcttactaa gtaccaggtg tctagacgag gacgctcggg cttggaccca tggcacatcg 14820 tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctacgt ctctcccccg 14880 cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa ctccctttag tgagggttaa 14940 ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag cttaatcatg 15000 gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg gaaacgcttc cttcatgtga 15060 gcaaaaggcc agcaaaaggc 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gagtaaactt ggtctgacac cgctgcatga gattatcaaa aaggatcttc 15960 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 16020 acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 16080
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 16140
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 16200
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tccgccícca tccagtctat taactgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 16320
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ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 16440
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatgg ttgtcagaag taagttggcc 16500
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 16560
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtat tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 16620
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 16680
actttaaaag tgctcatcat tgggaagcgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 16740
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc acacgagcac ccaactgatc ttcagcatct 16800
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 16860
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatacgct tcctttttca atagtattga 16920
agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa 16979
<210> 14
<211> 13188
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> Cardiomicito sintético + induzível por hipóxia + construção de gene de troca constante induzível por hPlexin Dl condificando IGF-1
<400> 14
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180 acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240 aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300 ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360 gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420 ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480 ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540 cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600 cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660 gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720 ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780 ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840 tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900 gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960 gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020 agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080 gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140 agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200 ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260 cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320 cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380 ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440 tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500 gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560 gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860 cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920 cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980 acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040 gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100 gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160 atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220 tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280 ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340 tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400 tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460 ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520 ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580 gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640 cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700 ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760 cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820 cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880 cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940 ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000 attgcccccc cccccccccg catgccccag tatgatgcct tctctaaatt taccagaaag 3060 aaaggacctg ggatgcttgt cctttaagtg tctctaaaca tggtttgcat agctggatct 3120 cagcttatct gtgcctttcg gctttcgctt ccatacatgg atctgttccc aacagtaact 3180 ccaagctgtc gaaaagaagc tatctggcag ctctctgctt catccaacac atggatgata 3240 aaaatacaca tatagcgatt cttccctcga gtaggcgaga ccaatgggtg cgccatgggc 3300 tcttccaaaa atttaggtga cactataggg caccgctcgc acctgcgcac aggcccgcgg 3360 ctacaaacta cgaacgatca 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gatgctgctc agcagcttca tggtggccaa ttgccccccc 5100 ccccccccgc atgcacagga agatgagctc acacaccagc taaggcaccc attatatacc 5160 ctctaggtct tcgcggacgt gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc 5220 ccgcacgcac tcagcgtcgc tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt 5280 gtcacgtcgc ggacgtgcgg gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc 5340 acgcactcag cgtcgctctg gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca 5400 cgtcgcggac gtgcgggaac ccacgtgggg gctccgtcac gtactccgag tcccgcacgc 5460 actcagcgtc gctctggggc cccacgtccg gccctgacgt gcggcttcgt ttgtcacgtc 5520 gcggacgtgc gggaacccac gtgggggctc cgtcacgtac tccgagtccc gcacgcactc 5580 agcgtcgctc tggggcccca cgtccggccc tgacgtgcgg cttcgtttgt cacgtcgcgg 5640 acgtgcggga acccacgtgg gggctccgtc acgtactccg agtcccgcac gcactcagcg 5700 tcgctctggg gccccacgtc cggccctgac gtgcggcttc gtttgtcacg tcgcggacgt 5760 gcgggaaccc acgtgggggc tccgtcacgt actccgagtc ccgcacgcac tcagcgtcgc 5820 tctggggccc cacgtccggc cctgacgtgc ggcttcgttt gtcacgtcgc ggacgtgcgg 5880 gaacccacgt gggggctccg tcacgtactc cgagtcccgc acgcactcag cgtcgctctg 5940 gggccccacg tccggccctg acgtgcggct tcgtttgtca cgtcctcgag tggtaataca 6000 atggccggtt cccatggacc tgcatcgtgg tgtaactata acggtcctaa ggtagcgacc 6060 gcggagacta ggtgtattta tctaagcgat cgcttaatta aggccggccg ccgcaataaa 6120 atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatccat agtactaaca 6180 tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc tgtccccagt 6240 gcaagtccag gtgccagaac atttctctat ccataatgca ggggtaccgg gtgatgacgg 6300 tgaaaacctc caattgcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt 6360 actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact 6420 gtcctccgag cggagagtcc ccggggacct agagggtata taatgggtgc cttagctggt 6480 gtgtgacctc atcttcctgt acgcccctgc aggggcgcgc cacgcgtcga agaaggtgag 6540 taatcttaac atgctctttt tttttttttt tgctaatccc ítttgtgtgc tgatgttagg 6600 atgacattta caacaaatgt ttgttcctga caggaaaaac cttgctgggt accttcgttg 6660 ccggacactt cttgtcctct actttggaaa aaaggaattg agagccgcta gcgccaccat 6720 gggaaaaatc agcagcctgc ccacccaatt atttaagtgc tgcttttgtg atttcttgaa 6780 ggtgaagatg cacaccatgt cctcctcgca tctgttctac ctggcgctgt gcctgctgac 6840 cttcaccagc tctgccacgg ctggaccgga gaccctctgc ggggccgagc tggtggatgc 6900 cctgcaattc gtgtgtggag acaggggctt ctacttcaac aagcccacag ggtatggctc 6960 cagcagtcgg agagcccccc agacaggcat cgtggatgag tgctgcttca gaagctgtga 7020 tctaaggagg ctggagatgt attgcgcacc cctcaagcct gccaagtcag ctcgctctgt 7080 ccgtgcccag cgccacaccg acatgcccaa gacccagaag tatcagcccc catctaccaa 7140 caagaacacg aagtctcaga gaaggaaagg aagtacattt gaagaacgca agtagatcga 7200 ttgcgcaaag ctttcgcgat aggcgagacc aatgggtgtg tacgtagcgg ccgcgtcgac 7260 gatagcttga tgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt gcctctcctg gccctggaag 7320 ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt aagttgcatc attttgtctg 7380 actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag 7440 ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga accaagctgg agtgcagtgg 7500 cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc 7560 ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt 7620 ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga 7680 tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc 7740 ctgtccttct gattttaaaa taactatacc agcaggagga cgtccagaca cagcataggc 7800 tacctggcca tgcccaaccg gtgggacatt tgagttgctt gcttggcact gtcctctcat 7860 gcgttgggtc cactcagtag atgcctgttg aattctgatt taaatcggtc cgcgtacggc 7920 gtggtaggtc cgaacgaatc catggattac cctgttatcc ctactcaagg acatcatccc 7980 tttagtgagg gttaattcac gcagtgccgc ggcgtgtaga aaatacctat cagctcgagg 8040 agcgaaggcc tggacagtgc ctgagaaagg tggtggaggg aggctgagtg tggaggggag 8100 acacagggtt cgggaaggca gagggagaag gaaaggggag ctcagaggga ccgagagagg 8160 gacggagggt ccgaggggga ggcagaggga gccacggaga gagggagcga gcgtcaggga 8220 cggaaaaacg gagcaggaga gagaaggaga ctagaaaggg ccgggggcgg ggctgccagg 8280 gactggagag cgaagcggag tcggagggag aaggagaagc agaggcagaa cccggagaag 8340 cgccacacgc gcggagtttg gggtggggac agaggcggag aggcgcagag accgagagac 8400 acagagagag ggagaggcgg ggtgggggag agggcggaaa agagaaaaca ggcgcgagcg 8460 aggcaggcca agcggccaag tgggaggaaa gagcgaggag agcgagcgac ggcggcggcg 8520 gctacgggga gggaccctgg ggccgcgggc gggtcctgga gggcgcgggc ggcgggaccc 8580 gcggacggcg gggcgtggcc cagggcggcc aggggcaggc gggggttccg ggggcgggcg 8640 gggccggggc ggggagtgag ggcgtgtccg cagcggagcc gcccccgccc cgcccccgga 8700 ctgcgcggcg aggctgatcc gggcccggac gccggggtcg ggggcggctg gcgcgggcag 8760 gaagcgcatc gtggcccgga cccgcccccc gcctcccgcc gcctccgggg catgcggggg 8820 gggggggggg caattggcca ccatgaagct cctgtccagc attgagcaag cctgtgacat 8880 ttgcaggctg aaaaagctca agtgtagcaa agagaaaccc aaatgcgcta agtgtctgaa 8940 aaacaactgg gaatgcagat actcccccaa aaccaaaaga tcccccctca ccagggccca 9000 tctgacagag gtcgagtcca gactcgaaag gctggaacag ctctttctcc tgattttccc 9060 tagagaagac ctcgacatga tcctcaagat ggactccctg caagacatta aggctctgct 9120 caccggactg tttgtgcaag acaatgtgaa taaggatgcc gtcaccgata gactcgcctc 9180 cgtggaaacc gatatgcctc tgacactgag gcagcataga attagcgcta cctccagctc 9240 cgaggaaagc tccaacaaag gccaaagaca actgacagtg tcccccgagt tccccgggat 9300 tagacctgag tgtgtggtcc ccgaaaccca atgcgctatg aaaagaaaag agaaaaaggc 9360 tcagaaagag aaagacaaac tgcctgtgtc caccacaacc gtcgatgatc acatgccccc 9420 tatcatgcag tgtgagcctc cccctcccga agccgctaga atccacgaag tcgtccccag 9480 gttcctctcc gataagctcc tggaaaccaa tagacaaaag aatatccctc aactcaccgc 9540 taaccaacag tttctgattg ccaggctgat ttggtatcag gatggctatg agcaaccctc 9600 cgacgaagac ctcaagagga tcacacagac atggcaacag gctgacgatg agaatgagga 9660 aagcgatacc cctttcaggc agattaccga aatgacaatc ctcaccgtcc agctcatcgt 9720 cgagtttgcc aaaggactcc ccggattcgc taagattagc caacccgatc agattaccct 9780 cctgaaagcc tgtagctccg aggtcatgat gctgagagtg gctagaaggt acgatgccgc 9840 ttccgatagc gtcctgtttg ccaataacca agcctatacc agggacaatt acaggaaggc 9900 tggcatggcc tatgtgattg aggatgtgct ccacttttgc agatgtatgt actccatggc 9960 tctcgataac attcactatg ccctcctgac agccgtcgtg attttctccg acaggcccgg 10020 actggaacag cctcaactcg tggaagaaat tcagaggtac tatctgaata ccctcagaat 10080 ttacattctg aatcagctct ccggcagcgc tagatccagc gtcatctatg gcaaaatcct 10140 ctccattctg tccgagctga gaacactggg aatgcaaaac tccaatatgt gcattagcct 10200 caagctcaag aatagaaaac tgcctccctt tctggaagaa atttgggatg tggctgacat 10260 gagccatacc caaccccctc ccattctgga aagccctacc aatctgtaaa tcgatagccg 10320 cctggctgag atggggtggg cagggcagag ctgatcaggg ccgagcagaa ccgcactctt 10380 cccaaataaa gcttcctcct tgaaacacaa atgtttctta cttacacccc atcctgattt 10440 cttttcttga gaccagagag tgggaaagct ctctcttgac ctgaggatgg atctgaaaat 10500 tatgagcccc ttgaggacag ggaatgttat tcatctttga attccgcagc atctagcacc 10560 aggtcttgta cagagcaggt gcccaataaa tggttgaatg aatatatgaa aagtagaggc 10620 agagggctgg gcacagtggc tcacgcctgt aatcctagca ctttgggagg ctgaggtggg 10680 tggatcactt gaggtcagga gttcgagacc agcttggcca acatggctaa acctcatctc 10740 tattaaaaat acaaaaatta gctgggctgg tgcctgtaat cccagctact caggaggctg 10800 aggcaggaga atcacttgaa cccaggagga ggagtttgca gtgagccgag atcgcaccat 10860 tgcactccag cctgggcgat aggagcaaaa ctccatctca aaaacaaaaa acaaaacaaa 10920 acaaaaagaa aaaagaaaag taggggcaga gatgtggggc aggagaggtg actcgggctc 10980 agctgcatgg tcctgctctg cttctttttt cttggagttt gtccgttgga tgacaatgat 11040 agtggtgaac aggtatggag ggcttactaa gtaccaggtg tctagacgag gacgctcggg 11100 cttggaccca tggcacaícg tgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta 11160 tccgctacgt ctctcccccg cagtaagggc tagattaact cgtctcgtga atatccggaa 11220 ctccctttag tgagggttaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 11280 gtcgtgccag cttaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctaccg 11340 gaaacgcttc cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 11400 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 11460 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 11520 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 11580 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 11640 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 11700 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 11760 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 11820 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc 11880 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 11940 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 12000 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 12060 aagggatttt ggtcatgatc tatgtcgggt gcggagaaag aggtaatgaa atggcatacg 12120 agtaaacttg gtctgacacc gctgcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 12180 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 12240 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 12300 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 12360 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 12420 aaaccagcca gccggaagcg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 12480 ccagtctatt aactgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 12540 gagcgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 12600 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 12660 agcggttagc tccttcggtc ctccgatggt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 12720 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 12780 ttctgtgact ggtgagtatt caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 12840 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 12900 gctcatcatt gggaagcgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 12960 atccagttcg atgtaaccca cacgagcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 13020 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 13080 gacacggaaa tgttgaatac tcatacgctt cctttttcaa tagtattgaa gcatttatca 13140 gggttattgt ctcgggagcg aatacatatt tgaatgtatt tagaaaaa 13188
<210> 15 <211> 13314 <212> DNA <213> Seqüência artificial
<220> <223> Constitutivo sintético + TNF + gene de troca promotor induzível condificando etanercept <400> 15
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gccctaggac gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat 180 acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt 240 aaaaataatc aatgtcctca gcggggtgtc ggggatttag gtgacactat aggctgagcg 300 ccgcacaggc atctagaggc tatggcaggg cctgccgccc cgacgttggc tgcgagccct 360 gggccttcac ccgaacttgg ggggtggggt ggggaaaagg aagaaacgcg ggcgtattgg 420 ccccaatggg gtctcggtgg ggtatcgaca gagtgccagc cctgggaccg aaccccgcgt 480 ttatgaacaa acgacccaac accgtgcgtt ttattctgtc tttttattgc cgtcatagcg 540 cgggttcctt ccggtattgt ctccttccgt gtttcaatcg attcaaaaga actcgtccag 600 cagacggtaa aaagcaatgc gttgagaatc cggtgcagca atgccataca gcaccagaaa 660 gcgatcagcc cattcaccgc ccagttcttc agcaatgtca cgggttgcca gtgcgatgtc 720 ctgatagcga tcagccacgc ccaggcgacc gcagtcgata aagccggaga aacggccgtt 780 ttccaccata atgtttggca gacaagcatc gccgtgggtc acaaccaggt cctcgccatc 840 tggcatacgt gctttcaggc gtgcgaacag ttctgccggt gccagaccct gatgttcctc 900 gtccaggtca tcctgatcaa ccaggccagc ttccatgcga gtgcgtgcgc gctcgatacg 960 gtgtttagct tggtgatcga atgggcaagt agctgggtcc agggtatgca gacggcgcat 1020 agcatcagcc atgatggaaa ccttttctgc cggtgccaga tgagaggaca gcagatcctg 1080 gcctggaacc tcgcccagca gcagccagtc gcggccagcc tcggtcacaa catccagcac 1140 agctgcgcat ggaacgccgg tagtagccag ccaggacaga cgagctgctt catcttgcag 1200 ttcgttcagt gcgccggaca gatcggtctt aacaaacagc accggacggc cttgagcgga 1260 cagacggaac acagctgcgt cggagcaacc gatagtctgt tgagcccagt catagccaaa 1320 cagacgttcc acccaagcag ccggagaacc agcgtgcaga ccgtcttgtt caatcatggt 1380 ggcaattggg tgtctgagcg atgtggctcg gctggcgacg caaaagaaga tgcggctgac 1440 tgtcgaacag gaggagcaga gagcgaagcg ggaggctgcg ggctcaattt gcatgcttta 1500 gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 1560 gtatacggaa tagctctgag gccgaggcag cttcggcctc tgcataaata aaaaaaatta 1620 gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag 1680 ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgctt gctttgcata cttctgcctg 1740 ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta attgagatgc ttgctttgca 1800 tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc taacctcgag gccatcgtgg 1860 cacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg gccagtgctc ttctcccccg 1920 cgggaggttt tataaatccg actgtctaga ttgttgttaa atcacacaaa aaaccaacac 1980 acagatgtaa tgaaaataaa gatattttat tatcgattca gctgtcgctg gggctctcca 2040 gcatctccat caggaaggtg tcgatgggca cgtcgccgat cagcctgaag aagaacaggt 2100 gctccaggca cttcaggccg atgctcctca ggctgggcag cctcagcagc agcttggcga 2160 atctgccggg ctcgtcgggg tgggtggtcc tggtgtactc ctccagggcg gcgtacacct 2220 tctccctcag cagctccacc tcctgggcgc ttttcaggcc cctcacctcg gggttgaaca 2280 ggatgatggc cctcaggcag cccagctcgg tcttgtccat cctcatgtcc ctcatcttgc 2340 tcaccagctc ggtcagcacc ctgtcgaaga tggcgcccac tccggcgctg tgggcgctgt 2400 tcctatggac gtgcaggccg gtggccagca ggatgccgtc cctcacgtcg atgctcctgt 2460 ggctgaagct ggcgatcagc agctcgttcc atccggccct cagcaggatc acctggtcgt 2520 ccaggggcag gctgctgaag tggggaatcc tcttggccca ctccaccagg gtgaacagct 2580 gcttgtcggc ggcctggcag atgttggtca cggggtcgtt ggggctgctg ccgctgccgc 2640 cggttccgcc ggggccctcc acgccctggt cgcttttctg ctccacggcg agttcggcct 2700 ccagaatcct gtccacgggc atctccatat ggccgccgta ctcgtcgatg cccagggcgt 2760 cggtgaacat ctgctcgaac tcgaagtcgg ccatgtccag ggcgccgtag ggggcgctgt 2820 cgtggggggt gaagccgggg ccggggctgt cgccgtcgcc cagcatgtcc aggtcgaagt 2880 cgtccagggc gtcggcgtgg gccatggcca cgtcctcgcc gtccaggtgc agctcgtcgc 2940 ccaggctcac gtcggtgggg ggggccacct tccttttctt cttggggccc atggtggcca 3000 attgcccccc cccccccccg catgccgtct aacaaaaaag ccaaaaacgg ccagaattta 3060 gcggacaatt tactagtcta acactgaaaa ttacatattg acccaaatga ttacatttca 3120 aaaggtgcct aaaaaacttc acaaaacaca ctcgccaacc ccgagcgcac gtacccagcc 3180 cagcagcccg ctactcacca agtgacgatc acagcgatcc acaaacaaga accgcgaccc 3240 aaatcccggc tgcgacggaa ctagctgtgc cacacccggc gcgtccttat ataatcatcg 3300 gcgttcaccg ccccacggag atccctccgc agaatcgccg agaagggact acttttcctc 3360 gcctgttccg ctctctggaa agaaaaccag tgccctagag tcacccaagt cccgtcctaa 3420 aatgtccttc tgctgatact ggggttctaa ggccgagtct tatgagcagc gggccgctgt 3480 cctgagcgtc cgggcggaag gatcaggacg ctcgctgcgc ccttcgtctg acgtggcagc 3540 gctcgccgtg aggagggggg cgcccgcggg aggcgccaaa acccggcgcg gaggccctcg 3600 agtaggcgag accaatgggt gcgccatggg ctcttccaaa aatttaggtg acactatagg 3660 gcaccgctcg cacctgcgca caggcccgcg gctacaaact acgaacgatc attctagata 3720 ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acatctcccc ctgaacctga 3780 aacataaaat gaatgcaaat gttttattaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3840 attaagcaat agcatcacaa atttcacaaa ttaagcattt ttttcactgc attctagttg 3900 tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctaa tcgattcaca ggttggtggg 3960 gctctccagg atgggggggg gctgggtgtg gctcatgtcg gccacgtccc aaatctcctc 4020 caggaagggg ggcagcttcc tgttcttcag cttcaggctg atacacatat tgctgttctg 4080 cattcccagg gtcctcagct cgctcaggat gctcaggatc ttgccgtaga tcacgctgct 4140 cctggcgctg ccgctcagct ggttcaggat gtagatcctc agggtgttca ggtagtacct 4200 cíggatctcc tccaccagct ggggctgctc caggccgggc ctgtcgctga agatcaccac 4260 ggcggtcagc agggcgtagt ggatgttgtc cagggccatg ctgtacatac atctgcagaa 4320 gtgcaggagg tcctcgatca cctcggccat gccagccttc ctgtagttgt ccctggtgta 4380 agcctggttg ttggcgaaca ggatgctgtc gctggcggcg tcgtacctcc tggccaccct 4440 cagcatcatc acctcgctgc tgcaagcctt cagcagggtg atctggtcgg gctggctgat 4500 cttggcgaat ccgggcaggc ccttggcgaa ctccacgatc agctgcacgg tcaggatggt 4560 catctcggtg atctgcctga agggggtgtc gctctcctcg ttctcgtcgt cggcctgctg 4620 ccaggtctgg gtgatccttt tcaggtcctc gtcgctgggc tgctcgtagc cgtcctgata 4680 ccagatcagc ctggcgatca ggaactgctg gttggcggtc agctggggga tgttcttctg 4740 cctgttggtc accagcagct tgtcgctcag gaacctgggc acgacctcgt gaatcctggc 4800 ggcctcgggg ggggggggct cgcactgcat gatggggggc atgtggtcat cgacggtggt 4860 ggtgctcacg ggcagcttgt ccttctcctt ctgggccttc ttctccttcc ttttcatggc 4920 gcactgggtc tcgggcacca cgcactcggg cctgatcccg ggaaactcgg ggctcacggt 4980 cagctgcctc tggcccttgt tgctgctctc ctcgctgctg ctggtggcgc tgatcctgtg 5040 ctgcctcagg gtcaggggca tgtcggtctc cacgctggcc agcctgtcgg tcacggcgtc 5100 cttgttcacg ttgtcctgca cgaacaggcc ggtcagcagg gccttgatgt cttgcaggct 5160 gtccatcttc aggatcatgt ccaggtcctc cctggggaag atcagcagga acagctgctc 5220 cagcctctcc agcctgctct ccacctcggt caggtgggcc ctggtcaggg ggctcctctt 5280 ggtcttgggg ctgtatctgc actcccagtt gttcttcagg cacttggcgc acttgggctt 5340 ctccttgctg cacttcagct tcttcagcct gcagatgtcg caagcctgct cgatgctgct 5400 cagcagcttc atggtggcca attgcccccc cccccccccg catgcctgtc tgacgggcaa 5460 tgctcctctg agagttgtta cagttcagac atggtaatga ctggttttat acagctttgc 5520 ccctcccaca tggcattttt ttttctccct ctgtcttttg atctgtgtcc tttgagtgat 5580 tcaacatttt actcaggaag acatcattag aatagaaata cttgtttgta aaggcatggt 5640 ttaagaaatt ttgggggagg atgaggtcac tctgaaactt aagaatttgt caatatcctc 5700 gagtggtaat acaatggccg gttcccatgg acctgcatcg tggtgtaact ataacggtcc 5760 taaggtagcg accgcggaga ctaggtgtat ttatctaagc gatcgcttaa ttaaggccgg 5820 ccgccgcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 5880 catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 5940 ggctgtcccc agtgcaagíc caggtgccag aacatttctc tatccataat gcaggggtac 6000 cgggtgatga cggtgaaaac ctccaattgc ggagtacígt cctccgagcg gagtactgtc 6060 ctccgagcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc 6120 cgagcggagt actgtcctcc gagcggagag tccccgggga cctagagggt atataatggg 6180 tgccttagct ggtgtgtgac ctcatcttcc tgtacgcccc tgcaggggcg cgccacgcgt 6240 cgaagaaggt gagtaatctt aacatgctct tttttttttt ttttgctaat cccttttgtg 6300 tgctgatgtt aggatgacat ttacaacaaa tgtttgttcc tgacaggaaa aaccttgctg 6360 ggtaccttcg ttgccggaca cttcttgtcc tctactttgg aaaaaaggaa ttgagagccg 6420 ctagcgccac catgctgccc gcccaggtcg ccttcacccc ctacgccccc gagcccggca 6480 gcacctgtag actgagagag tattacgacc agaccgccca gatgtgctgc tccaagtgca 6540 gccccggcca gcacgccaag gtgttctgca ccaagaccag cgacaccgtc tgcgacagct 6600 gcgaggacag cacctacacc cagctgtgga actgggtgcc cgagtgcctg agctgcggca 6660 gcagatgtag cagcgaccag gtggagaccc aggcttgcac cagagagcag aacagaatct 6720 gcacctgtag acccggctgg tactgcgccc tgagcaagca ggagggctgc cgcctgtgcg 6780 cccccctgag aaagtgcaga cccggcttcg gcgtggccag acccggcacc gagaccagcg 6840 acgttgtgtg caagccctgt gcccccggca ccttcagcaa caccaccagc agcaccgaca 6900 tctgccgccc ccaccagatt tgcaacgtgg tggccatccc cggcaacgcc agcatggacg 6960 ccgtgtgtac cagcaccagc cccacccgca gcatggcccc cggcgctgtc cacctccccc 7020 agcccgtgag caccagaagc cagcacaccc agcccacccc cgagcccagc accgccccca 7080 gcaccagctt cctgctgcct atgggaccca gcccccccgc cgagggcagc accggcgacg 7140 agcccaagag ctgcgacaag acccacacct gtcccccctg ccccgccccc gagctgctgg 7200 gcggccccag cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atctccagaa 7260 cccccgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga ggacccccag gtgaagttca 7320 actggtacgt ggacggcgtg caagtgcata acgccaagac caagcccaga gagcagcagt 7380 acaacagcac ctacagagtg gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccagaac tggctggacg 7440 gcaaggagta caagtgcaag gtgtccaaca aggccctgcc cgcccccatc gagaaaacca 7500 tcagcaaggc caagggccag cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cccagcagag 7560 aggagatgac caagaaccag gtgtccctga cctgtctggt gaagggcttc taccccagcg 7620 acatcgccgt ggagtgggag agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc 7680 ccgtgctgga cagcgacggc agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca 7740 gatggcagca gggcaacgtg ttcagctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact 7800 acacccagaa gtccctgagc ctgagccccg gcaagtgaat cgattgcgca aagctttcgc 7860 gataggcgag accaatgggt gtgtacgtag cggccgcgtc gacgatagct tgatgggtgg 7920 catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac tccagtgccc 7980 accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt gtccttctat 8040 aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa gacaacctgt 8100 agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc ttggctcact 8160 gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga gttgttggga 8220 ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag acggggtttc 8280 accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc accttggcct 8340 cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct tctgatttta 8400 aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgg ccatgcccaa 8460 ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg gtccactcag 8520 tagatgcctg ttgaattctg atttaaatcg gtccgcgtac ggcgtggtag gtccgaacga 8580 atccatggat taccctgtta tccctactca aggacatcat ccctttagtg agggttaatt 8640 cacgcagtgc cgcggcgtgt agaaaatacc tatcagctcg agcacggggc tcccactctc 8700 aactccgcag cctcagcccc ctcaatgctg aggagcagag ctggtctcct gccctgacag 8760 ctgccaggca catcttgttc cctcaggttg cacaactggg ataaatgacc cgggatgaag 8820 aaaccactgg catccaggaa cttgtcttag accgttttgt aggggaaatg acctgcaggg 8880 actttcccca gggaccacat ccagcttttc ttcgctccca agaaaccagc agggagcatg 8940 cggggggggg ggggggcaat tggccaccat gaagctcctg tccagcattg agcaagcctg 9000 tgacatttgc aggctgaaaa agctcaagtg tagcaaagag aaacccaaat gcgctaagtg 9060 tctgaaaaac aactgggaat gcagatactc ccccaaaacc aaaagatccc ccctcaccag 9120 ggcccatctg acagaggtcg agtccagact cgaaaggctg gaacagctct ttctcctgat 9180 tttccctaga gaagacctcg acatgatcct caagatggac tccctgcaag acattaaggc 9240 tctgctcacc ggactgtttg tgcaagacaa tgtgaataag gatgccgtca ccgatagact 9300 cgcctccgtg gaaaccgata tgcctctgac actgaggcag catagaatta gcgctacctc 9360 cagctccgag gaaagctcca acaaaggcca aagacaactg acagtgtccc ccgagttccc 9420 cgggattaga cctgagtgtg tggtccccga aacccaatgc gctatgaaaa gaaaagagaa 9480 aaaggctcag aaagagaaag acaaactgcc tgtgtccacc acaaccgtcg atgatcacat 9540 gccccctatc atgcagtgtg agcctccccc tcccgaagcc gctagaatcc acgaagtcgt 9600 ccccaggttc ctctccgata agctcctgga aaccaataga caaaagaata tccctcaact 9660 caccgctaac caacagtttc tgattgccag gctgatttgg tatcaggatg gctatgagca 9720 accctccgac gaagacctca agaggatcac acagacatgg caacaggctg acgatgagaa 9780 tgaggaaagc gatacccctt tcaggcagat taccgaaatg acaatcctca ccgtccagct 9840 catcgtcgag tttgccaaag gactccccgg attcgctaag attagccaac ccgatcagat 9900 taccctcctg aaagcctgta gctccgaggt catgatgctg agagtggcta gaaggtacga 9960 tgccgcttcc gatagcgtcc tgtttgccaa taaccaagcc tataccaggg acaattacag 10020 gaaggctggc atggcctatg tgattgagga tgtgctccac ttttgcagat gtatgtactc 10080 catggctctc gataacattc actatgccct cctgacagcc gtcgtgattt tctccgacag 10140 gcccggactg gaacagcctc aactcgtgga agaaattcag aggtactatc tgaataccct 10200 cagaatttac attctgaatc agctctccgg cagcgctaga tccagcgtca tctatggcaa 10260 aatcctctcc attctgtccg agctgagaac actgggaatg caaaactcca atatgtgcat 10320 tagcctcaag ctcaagaata gaaaactgcc tccctttctg gaagaaattt gggatgtggc 10380 tgacatgagc catacccaac cccctcccat tctggaaagc cctaccaatc tgtaaatcga 10440 tagccgcctg gctgagatgg ggtgggcagg gcagagctga tcagggccga gcagaaccgc 10500 actcttccca aataaagctt cctccttgaa acacaaatgt ttcttactta caccccatcc 10560 tgatttcttt tcttgagacc agagagtggg aaagctctct cttgacctga ggatggatct 10620 gaaaattatg agccccttga ggacagggaa tgttattcat ctttgaattc cgcagcatct 10680 agcaccaggt cttgtacaga gcaggtgccc aataaatggt tgaatgaata tatgaaaagt 10740 agaggcagag ggctgggcac agtggctcac gcctgtaatc ctagcacttt gggaggctga 10800 ggtgggtgga tcacttgagg tcaggagttc gagaccagct tggccaacat ggctaaacct 10860 catctctatt aaaaatacaa aaattagctg ggctggtgcc tgtaatccca gctactcagg 10920 aggctgaggc aggagaatca cttgaaccca ggaggaggag tttgcagtga gccgagatcg 10980 caccattgca ctccagcctg ggcgatagga gcaaaactcc atctcaaaaa caaaaaacaa 11040 aacaaaacaa aaagaaaaaa gaaaagtagg ggcagagatg tggggcagga gaggtgactc 11100 gggctcagct gcatggtcct gctctgcttc ttttttcttg gagtttgtcc gttggatgac 11160 aatgatagtg gtgaacaggt atggagggct tactaagtac caggtgtcta gacgaggacg 11220 ctcgggcttg gacccatggc acatcgtgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 11280 ttgttatccg ctacgtctct cccccgcagt aagggctaga ttaactcgtc tcgtgaatat 11340 ccggaactcc ctttagtgag ggttaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 11400 aaacctgtcg tgccagctta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 11460 ctaccggaaa cgcttccttc atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 11520 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 11580 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 11640 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 11700 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 11760 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 11820 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 11880 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 11940 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 12000 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 12060 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 12120 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 12180 cacgttaagg gattttggtc atgatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg 12240 catacgagta aacttggtct gacaccgctg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 12300 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 12360 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 12420 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 12480 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 12540
agcaataaac cagccagccg gaagcgccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 12600
ctccatccag tctattaact gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 12660
tttgcggagc gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 12720
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 12780
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatggttgtc agaagtaagt tggccgcagt 12840
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 12900
atgcttttct gtgactggtg agíattcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 12960
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 13020
aaaagtgctc atcattggga agcgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 13080
gttgagatcc agttcgatgt aacccacacg agcacccaac tgatcttcag catcttttac 13140
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 13200
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat acgcttcctt tttcaatagt attgaagcat 13260
ttatcagggt tattgtctcg ggagcgaata catatttgaa tgtatttaga aaaa 13314
<210> 16 <211> 11013 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Construção de genee de troca promotora induzível por TNF sintética expressando etanercept <400> 16
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180 cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240 ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300 cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360 tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420 gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga ttcaaaagaa ctcgtccagc 480 agacggtaaa aagcaatgcg ttgagaatcc ggtgcagcaa tgccatacag caccagaaag 540 cgatcagccc attcaccgcc cagttcttca gcaatgtcac gggttgccag tgcgatgtcc 600 tgatagcgat cagccacgcc caggcgaccg cagtcgataa agccggagaa acggccgttt 660 tccaccataa tgtttggcag acaagcatcg ccgtgggtca caaccaggtc ctcgccatct 720 ggcatacgtg ctttcaggcg tgcgaacagt tctgccggtg ccagaccctg atgttcctcg 780 tccaggtcat cctgatcaac caggccagct tccatgcgag tgcgtgcgcg ctcgatacgg 840 tgtttagctt ggtgatcgaa tgggcaagta gctgggtcca gggtatgcag acggcgcata 900 gcatcagcca tgatggaaac cttttctgcc ggtgccagat gagaggacag cagatcctgg 960 cctggaacct cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca 1020 gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt 1080 tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac 1140 agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac 1200 agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg 1260 gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact 1320 gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag 1380 ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg 1440 tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1500 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1560 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1620 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1680 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1740 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1800 gggaggtttt ataaatccga ctgtctagat accacatttg tagaggtttt acttgcttta 1860 aaaaacctcc cacatctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaaa tgttttatta 1920 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aattaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 1980 attaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 2040 atcatgtcta atcgattcac aggttggtgg ggctctccag gatggggggg ggctgggtgt 2100 ggctcatgtc ggccacgtcc caaatctcct ccaggaaggg gggcagcttc ctgttcttca 2160 gcttcaggct gatacacata ttgctgttct gcattcccag ggtcctcagc tcgctcagga 2220 tgctcaggat cttgccgtag atcacgctgc tcctggcgct gccgctcagc tggttcagga 2280 tgtagatcct cagggtgttc aggtagtacc tctggatctc ctccaccagc tggggctgct 2340 ccaggccggg cctgtcgctg aagatcacca cggcggtcag cagggcgtag tggatgttgt 2400 ccagggccat gctgtacata catctgcaga agtgcaggag gtcctcgatc acctcggcca 2460 tgccagcctt cctgtagttg tccctggtgt aagcctggtt gttggcgaac aggatgctgt 2520 cgctggcggc gtcgtacctc ctggccaccc tcagcatcat cacctcgctg ctgcaagcct 2580 tcagcagggt gatctggtcg ggctggctga tcttggcgaa tccgggcagg cccttggcga 2640 actccacgat cagctgcacg gtcaggatgg tcatctcggt gatctgcctg aagggggtgt 2700 cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760 cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820 ggttggcggt cagctggggg atgttcttct gcctgttggt caccagcagc ttgtcgctca 2880 ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940 tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000 tctgggcctt cttctccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060 gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120 cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180 ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240 cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300 ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360 tcaggtgggc cctggtcagg gggctcctct tggtcttggg gctgtatctg cactcccagt 3420 tgttcttcag gcacttggcg cacttgggct tctccttgct gcacttcagc ttcttcagcc 3480 tgcagatgtc gcaagcctgc tcgatgctgc tcagcagctt catggtggca gatctggtcg 3540 cgggaggctg ctggttttcc actacccgaa aaaaatccag cgtctaagca gctgcaagga 3600 gagcctttca gagaagcggg tcctggcagc ggcggggaag tgtccccaaa tgggcagaat 3660 agcctccccg cgtcgggaga gtcgcgtcct tgctcgggtg ttgtaagttc cagtgcaaag 3720 tgcccgcccg ctgctatggg caaagtttcg tggatgcggc tagggttgcg caccgctggc 3780 tgggggatca gcgggagggc tgggccagag gcgaagcccc ctattcgctc cggatctccc 3840 ttcccaggac gcccgcagcg cagctctgct cgccgggctc ctccacccta gcccgccgcc 3900 cgctcgctcc ctctgcctct cgctggaatt actacagcga gttgccggct cagctgtcgc 3960 tggggctctc cagcatctcc atcaggaagg tgtcgatggg cacgtcgccg atcagcctga 4020 agaagaacag gtgctccagg cacttcaggc cgatgctcct caggctgggc agcctcagca 4080 gcagcttggc gaatctgccg ggctcgtcgg ggtgggtggt cctggtgtac tcctccaggg 4140 cggcgtacac cttctccctc agcagctcca cctcctgggc gcttttcagg cccctcacct 4200 cggggttgaa caggatgatg gccctcaggc agcccagctc ggtcttgtcc atcctcatgt 4260 ccctcatctt gctcaccagc tcggtcagca ccctgtcgaa gatggcgccc actccggcgc 4320 tgtgggcgct gttcctatgg acgtgcaggc cggtggccag caggatgccg tccctcacgt 4380 cgatgctcct gtggctgaag ctggcgatca gcagctcgtt ccatccggcc ctcagcagga 4440 tcacctggtc gtccaggggc aggctgctga agtggggaat cctcttggcc cactccacca 4500 gggtgaacag ctgcttgtcg gcggcctggc agatgttggt cacggggtcg ttggggctgc 4560 tgccgctgcc gccggttccg ccggggccct ccacgccctg gtcgcttttc tgctccacgg 4620 cgagttcggc ctccagaatc ctgtccacgg gcatctccat atggccgccg tactcgtcga 4680 tgcccagggc gtcggtgaac atctgctcga actcgaagtc ggccatgtcc agggcgccgt 4740 agggggcgct gtcgtggggg gtgaagccgg ggccggggct gtcgccgtcg cccagcatgt 4800 ccaggtcgaa gtcgtccagg gcgtcggcgt gggccatggc cacgtcctcg ccgtccaggt 4860 gcagctcgtc gcccaggctc acgtcggtgg ggggggccac cttccttttc ttcttggggc 4920 ccatggtggc caattgcccc cccccccccc cgcatgcagc tcctgaagcc agtgaggccc 4980 gatgcagata ccgcggagtg aaatagaaag tctgtgcttt ataaagggtc ttgttgcaga 5040 ggcggaggga aatcccttca 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aggtagcgac cgcggagact aggtgtattt atctaagcga 5940 tcgcttaatt aaggccggcc gccgcaataa aatatcttta ttttcattac atctgtgtgt 6000 tggttttttg tgtgaatcca tagtactaac atacgctctc catcaaaaca aaacgaaaca 6060 aaacaaacta gcaaaatagg ctgtccccag tgcaagtcca ggtgccagaa catttctcta 6120 tccataatgc aggggtaccg ggtgatgacg gtgaaaacct ccaattgcgg agtactgtcc 6180 tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc 6240 gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagagtc cccggggacc 6300 tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgacct catcttcctg tacgcccctg 6360 caggggcgcg ccacgcgtcg aagaaggtga gtaatcttaa catgctcttt tttttttttt 6420 ttgctaatcc cttttgtgtg ctgatgttag gatgacattt acaacaaatg tttgttcctg 6480 acaggaaaaa ccttgctggg taccttcgtt gccggacact tcttgtcctc tactttggaa 6540 aaaaggaatt gagagccgct agcgccacca tgctgcccgc ccaggtcgcc ttcaccccct 6600 acgcccccga gcccggcagc acctgtagac tgagagagta ttacgaccag accgcccaga 6660 tgtgctgctc caagtgcagc cccggccagc acgccaaggt gttctgcacc aagaccagcg 6720 acaccgtctg cgacagctgc gaggacagca cctacaccca gctgtggaac tgggtgcccg 6780 agtgcctgag ctgcggcagc agatgtagca gcgaccaggt ggagacccag gcttgcacca 6840 gagagcagaa cagaatctgc acctgtagac ccggctggta ctgcgccctg agcaagcagg 6900 agggctgccg cctgtgcgcc cccctgagaa agtgcagacc cggcttcggc gtggccagac 6960 ccggcaccga gaccagcgac gttgtgtgca agccctgtgc ccccggcacc ttcagcaaca 7020 ccaccagcag caccgacatc tgccgccccc accagatttg caacgtggtg gccatccccg 7080 gcaacgccag catggacgcc gtgtgtacca gcaccagccc cacccgcagc atggcccccg 7140 gcgctgtcca cctcccccag cccgtgagca ccagaagcca gcacacccag cccacccccg 7200 agcccagcac cgcccccagc accagcttcc tgctgcctat gggacccagc ccccccgccg 7260 agggcagcac cggcgacgag cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc 7320 ccgcccccga gctgctgggc ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca 7380 ccctgatgat ctccagaacc cccgaggtga catgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg 7440 acccccaggt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgca agtgcataac gccaagacca 7500 agcccagaga gcagcagtac aacagcacct acagagtggt gagcgtgctg accgtgctgc 7560 accagaactg gctggacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcccg 7620 cccccatcga gaaaaccatc agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca 7680 ccctgccccc cagcagagag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga 7740 agggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca 7800 actacaagac cacccccccc gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc 7860 tgaccgtgga caagagcaga tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg 7920 aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aagtgaatcg 7980 attgcgcaaa gctttcgcga taggcgagac caatgggtgt gtacgtagcg gccgcgtcga 8040 cgatagcttg atgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa 8100 gttgccactc cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct 8160 gactaggtgt ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa 8220 gttgggaaga caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg 8280 gcacaatctt ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag 8340 cctcccgagt tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt 8400 tggtagagac ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg 8460 atctacccac cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc 8520 cctgtccttc tgattttaaa ataactatac cagcaggagg acgtccagac acagcatagg 8580 ctacctggcc atgcccaacc ggtgggacat ttgagttgct tgcttggcac tgtcctctca 8640 tgcgttgggt ccactcagta gatgcctgtt gaattctgat ttaaatcggt ccgcgtacgg 8700 cgtggtaggt ccgaacgaat ccatggatta ccctgttatc cctactcaag gacatcatcc 8760 ctttagtgag ggttaattca cgcagtgggt acggaactaa aggcagcaca catcgtgtaa 8820 tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tacgtctctc ccccgcagta 8880 agggctagat taactcgtct cgtgaatatc cggaactccc tttagtgagg gttaattgcg 8940 ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagcttaa tcatggtcat 9000 agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc taccggaaac gcttccttca tgtgagcaaa 9060 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 9120 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 9180 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 9240 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 9300 tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 9360 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 9420 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 9480 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 9540 cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 9600 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 9660 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 9720 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcctaggac 9780 gaaaggaggt cgtgaaatgg ataaaaaaat acagcgtttt tcatgtacaa ctatactagt 9840 tgtagtgcct aaataatgct tttaaaactt aaaaataatc tatgtcgggt gcggagaaag 9900 aggtaatgaa atggcaaatc aatgtcctca gcgaaatggc atacgagtaa acttggtctg 9960 acaccgctgc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 10020 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 10080 aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 10140 ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 10200 gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 10260
aagcgccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaactg 10320
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcggagcg ttgttgccat 10380
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 10440
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 10500
cggtcctccg atggttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 10560
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 10620
gtattcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 10680
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acccacacga gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 10860
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 10920
aatactcata cgcttccttt ttcaatagta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcgg 10980
gagcgaatac atatttgaat gtatttagaa aaa 11013
<210> 17 <211> 15706 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Inflamação promotora dual sintética + construção de gene de troca induzível por hipóxia codificando etanercept e EPO <400> 17
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggatttagg tgacactata ggctgagcgc 180 cgcacaggca tctagaggct atggcagggc ctgccgcccc gacgttggct gcgagccctg 240 ggccttcacc cgaacttggg gggtggggtg gggaaaagga agaaacgcgg gcgtattggc 300 cccaatgggg tctcggtggg gtatcgacag agtgccagcc ctgggaccga accccgcgtt 360 tatgaacaaa cgacccaaca ccgtgcgttt tattctgtct ttttattgcc gtcatagcgc 420 gggttccttc cggtattgtc tccttccgtg tttcaatcga tttagaagaa ctcgtcaaga 480 aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggggcggcga taccgtaaag gacgaggaag 540 cggtcagccc attcgccgcc aagttcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 600 tgatagcggt cggccacacc cagccgtcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 660 tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccgtgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 720 ggcatcctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcctcg 780 tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 840 tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcatgta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 900 gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 960 cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcacg 1020 gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctggagt 1080 tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 1140 agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 1200 agcctctcca cccaagcggc cggagaacca gcgtgcaatc catcttgttc aatggccgat 1260 cccatggtgg ccaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat 1320 gcggctgact gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg 1380 catgcggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1440 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1500 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1560 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1620 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1680 acgccagggt tttcccagtc 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tctccatatg gccgccgtac tcgtcgatgc ccagggcgtc 2580 ggtgaacatc tgctcgaact cgaagtcggc catgtccagg gcgccgtagg gggcgctgtc 2640 gtggggggtg aagccggggc cggggctgtc gccgtcgccc agcatgtcca ggtcgaagtc 2700 gtccagggcg tcggcgtggg ccatggccac gtcctcgccg tccaggtgca gctcgtcgcc 2760 caggctcacg tcggtggggg gggccacctt ccttttcttc ttggggccca tggtggccaa 2820 ttgccccccc ccccccccgc atgccgtcta acaaaaaagc caaaaacggc cagaatttag 2880 cggacaattt actagtctaa cactgaaaat tacatattga cccaaatgat tacatttcaa 2940 aaggtgccta aaaaacttca caaaacacac tcgccaaccc cgagcgcacg tacccagccc 3000 agcagcccgc tactcaccaa gtgacgatca cagcgatcca caaacaagaa ccgcgaccca 3060 aatcccggct gcgacggaac tagctgtgcc acacccggcg cgtccttata taatcatcgg 3120 cgttcaccgc cccacggaga tccctccgca gaatcgccga gaagggacta cttttcctcg 3180 cctgttccgc tctctggaaa gaaaaccagt gccctagagt cacccaagtc ccgtcctaaa 3240 atgtccttct gctgatactg gggttctaag gccgagtctt atgagcagcg ggccgctgtc 3300 ctgagcgtcc gggcggaagg atcaggacgc tcgctgcgcc cttcgtctga cgtggcagcg 3360 ctcgccgtga ggaggggggc 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gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 15600
cacggaaatg ttgaatactc atacgcttcc tttttcaata gtattgaagc atttatcagg 15660
gttattgtct cgggagcgaa tacatatttg aatgtattta gaaaaa 15706
<210> 18
<211> 17505
<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> <223> Construção de gene de troca promotora dual sintética codificando fator humano VIIIrC
<400> 18
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ccagccagcc ggaagcgccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 16800 gtctattaac tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcggag 16860 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 16920 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 16980
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ttattgtctc gggagcgaat acatatttga atgtatttag aaaaa 17505
<210> 19 <211> 16379 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Construção de gene de troca promotora única sintética codificando o fator humano VIIirC
<400> 19
taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tactgaggac 60 gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtagcagac aagcccgtca 120
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cgcccagcag cagccagtcg cggccagcct cggtcacaac atccagcaca 1020 gctgcgcatg gaacgccggt agtagccagc caggacagac gagctgcttc atcttgcagt 1080 tcgttcagtg cgccggacag atcggtctta acaaacagca ccggacggcc ttgagcggac 1140 agacggaaca cagctgcgtc ggagcaaccg atagtctgtt gagcccagtc atagccaaac 1200 agacgttcca cccaagcagc cggagaacca gcgtgcagac cgtcttgttc aatcatggtg 1260 gcaattgggt gtctgagcga tgtggctcgg ctggcgacgc aaaagaagat gcggctgact 1320 gtcgaacagg aggagcagag agcgaagcgg gaggctgcgg gctcaatttg catgctttag 1380 ttcctcacct tgtcgtatta tactatgccg atatactatg ccgatgatta attgtcaacg 1440 tatacggaat agctctgagg ccgaggcagc ttcggcctct gcataaataa aaaaaattag 1500 tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt aggggcggga tgggcggagt 1560 taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcttg ctttgcatac ttctgcctgc 1620 tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa ttgagatgct tgctttgcat 1680 acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct aacctcgagg ccatcgtggc 1740 acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgctct tctcccccgc 1800 gggaggtttt 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cagctgcacg gtcaggatgg tcatctcggt gatctgcctg aagggggtgt 2700 cgctctcctc gttctcgtcg tcggcctgct gccaggtctg ggtgatcctt ttcaggtcct 2760 cgtcgctggg ctgctcgtag ccgtcctgat accagatcag cctggcgatc aggaactgct 2820 ggttggcggt cagctggggg atgttcttct gcctgttggt caccagcagc ttgtcgctca 2880 ggaacctggg cacgacctcg tgaatcctgg cggcctcggg gggggggggc tcgcactgca 2940 tgatgggggg catgtggtca tcgacggtgg tggtgctcac gggcagcttg tccttctcct 3000 tctgggcctt cttctccttc cttttcatgg cgcactgggt ctcgggcacc acgcactcgg 3060 gcctgatccc gggaaactcg gggctcacgg tcagctgcct ctggcccttg ttgctgctct 3120 cctcgctgct gctggtggcg ctgatcctgt gctgcctcag ggtcaggggc atgtcggtct 3180 ccacgctggc cagcctgtcg gtcacggcgt ccttgttcac gttgtcctgc acgaacaggc 3240 cggtcagcag ggccttgatg tcttgcaggc tgtccatctt caggatcatg tccaggtcct 3300 ccctggggaa gatcagcagg aacagctgct ccagcctctc cagcctgctc tccacctcgg 3360 tcaggtgggc cctggtcagg gggctcctct tggtcttggg gctgtatctg cactcccagt 3420 tgttcttcag gcacttggcg cacttgggct tctccttgct gcacttcagc ttcttcagcc 3480 tgcagatgtc 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ggccctctgc tctacggaga ggtcggcgat accctcctga ttatctttaa 7740 gaatcaggcc agtaggccct ataacattta ccctcacgga atcacagatg tgagacctct 7800 gtatagcagg agactcccca aaggcgtcaa gcatctgaaa gactttccca ttctgcctgg 7860 cgaaatcttt aagtataagt ggaccgtcac cgtcgaggat ggccctacca aaagcgatcc 7920 caggtgcctc accaggtact atagctcctt cgtcaacatg gagagggacc tcgcctccgg 7980 cctcatcgga cccctcctga tttgctataa ggaaagcgtc gatcaaagag gaaaccaaat 8040 catgagcgat aagaggaacg tcatcttgtt ctccgtgttt gacgaaaaca ggagctggta 8100 cttgaccgaa aacattcaga ggttcctccc caatcccgct ggcgtccagc ttgaggaccc 8160 tgagtttcaa gcctccaaca ttatgcacag cattaacgga tacgttttcg atagcctcca 8220 gctgtccgtc tgcctccacg aggtcgctta ctggtacatt ctgtccatcg gagcccaaac 8280 cgatttcctg agcgtctttt ttagcggata cacattcaaa cacaaaatgg tctacgagga 8340 tacactgaca ctgtttccct ttagcggaga gacagtgttt atgagcatgg agaaccctgg 8400 cctctggatt ctgggatgcc ataactccga ctttagaaat agaggaatga cagccctcct 8460 gaaagtgtcc agctgtgaca aaaacacagg cgattactat gaggatagct atgaggacat 8520 ttccgcctat ctgctgtcaa aaaacaatgc cattgagcct agatccttct cccagaatag 8580 caggcaccct agcacaagac aaaagcaatt caatgccaca accattcccg aaaacgacat 8640 cgaaaagaca gacccttggt ttgcccatag aacacccatg cccaaaatcc aaaacgtcag 8700 ctccagcgat ctgctcatgc tcctgaggca gtcccccaca ccccacggcc tgagcctgtc 8760 cgatctgcaa gaggctaagt atgagacatt ctccgacgat ccctcccccg gagccattga 8820 ctccaacaat agcctgagcg aaatgacaca ctttagaccc cagctgcacc atagcggaga 8880 catggtgttt acccctgagt ccggcctcca gctcagactc aacgaaaagc tcggcacaac 8940 cgctgccaca gagctgaaga aactggattt caaagtgtcc agcacaagca ataacctcat 9000 ctccaccatt ccctccgaca atctggctgc cggaaccgat aacacaagct ccctgggacc 9060 cccttccatg cccgtccact atgactccca gctcgacaca accctttttg gaaagaaaag 9120 ctcccccctc accgaaagcg gaggccctct gtccctgtcc gaggaaaaca atgacagcaa 9180 gctgctggag agcggactga tgaactccca ggaaagctcc tggggaaaga atgtgtccag 9240 cacagagtcc ggcaggctgt ttaagggaaa gagagcccac ggccctgccc tcctgacaaa 9300 ggataacgct ctgtttaagg tcagcattag cctcctgaaa accaataaga caagcaataa 9360 ctccgccaca aacagaaaga cccacattga cggaccctcc ctgctcatcg aaaactcccc 9420 ctccgtgtgg cagaatatcc tcgaatccga cacagagttt aagaaagtga cacccctcat 9480 ccatgacagg atgctcatgg ataagaatgc cacagccctc agactcaacc acatgagcaa 9540 caaaaccaca agcagcaaga acatggagat ggtccagcaa aagaaagagg gacccattcc 9600 ccctgacgct cagaatcccg atatgtcctt ctttaagatg ctgtttctgc ctgagtccgc 9660 caggtggatt cagaggaccc acggcaaaaa ctccctgaat agcggacagg gaccctcccc 9720 caaacagctc gtgtccctgg gacccgaaaa gtccgtggaa ggccaaaact ttctgtccga 9780 gaaaaacaaa gtggtcgtgg gaaagggaga gtttaccaag gacgttggcc tgaaggaaat 9840 ggtgtttcct agctccagaa atctgtttct gacaaacctc gacaatctgc atgagaataa 9900 cacacacaat caggaaaaga aaatccaaga ggaaatcgaa aagaaagaga cactgattca 9960 ggaaaacgtc gtgctccccc aaatccatac cgtcaccgga accaaaaact ttatgaaaaa 10020 ccttttcctc ctgtccacca ggcagaatgt ggaaggctcc tacgatggcg cttacgctcc 10080 cgtcctgcaa gactttagat ccctgaatga ctccaccaat agaacaaaga aacacacagc 10140 ccatttctcc aagaaaggcg aggaggaaaa cctggaagga ctgggaaacc aaaccaaaca 10200 gattgtggaa aagtatgcct gtaccacaag aattagccct aacacaagcc aacagaattt 10260 cgtcacccaa agatccaaga gagccctgaa gcaattcagg ctgcctctgg aagaaacaga 10320 gctggagaaa agaattatcg tggatgatac ctccacccaa tggtccaaga atatgaaaca 10380 cctcacccct agcacactga cacagattga ctataacgaa aaggaaaagg gagccattac 10440 ccaaagccct ctgtccgact gtctgacaag atcccactcc atccctcagg ctaacaggag 10500 ccctctgcct atcgctaagg tcagctcctt ccctagcatt agacctatct atctgacaag 10560 agtcctgttt caggataact ccagccatct gcctgccgcc tcttatagaa aaaaggatag 10620 cggagtgcaa gagtccagcc atttcctcca gggagccaaa aagaataacc tgagcctcgc 10680 cattctgaca ctggaaatga caggcgatca gagggaggtc ggctccctgg gaacctccgc 10740 cacaaactcc gtgacataca aaaaggtcga gaataccgtc ctgcctaagc ctgacctccc 10800 caaaacctcc ggcaaagtgg aactgctccc caaagtgcat atctatcaga aagacctctt 10860 tcctaccgaa acctccaacg gaagccccgg ccacctggat ctggtcgagg gaagcctcct 10920 gcaaggcaca gagggagcca ttaagtggaa cgaagccaat agacctggca aagtgccttt 10980 cctcagagtc gccacagagt ccagcgctaa gacacccagc aagctgctgg accccctcgc 11040 ctgggacaat cactatggca cacagattcc caaagaggaa tggaaaagcc aagagaaaag 11100 ccctgagaaa accgctttca aaaagaaaga cacaatcctg agcctcaacg cttgcgaaag 11160 caatcacgct atcgctgcca ttaacgaagg ccaaaacaaa cccgaaatcg aagtgacatg 11220 ggccaagcag ggcaggaccg aaagactctg ctcccagaat ccccctgtgc tcaagaggca 11280 ccaaagagaa atcacaagaa caaccctcca gtccgaccaa gaggaaatcg actacgatga 11340 cacaatctcc gtggaaatga aaaaggagga ctttgacatt tacgatgagg atgagaatca 11400 gtcccccagg agctttcaga aaaagacaag acattacttt atcgctgccg tcgagaggct 11460 gtgggactat ggcatgagca gcagccctca cgtcctgagg aacagagccc agagcggaag 11520 cgtcccccaa ttcaaaaagg tcgtgtttca ggagttcaca gacggcagct tcacccaacc 11580 cctctacagg ggcgaactga atgagcatct gggactgctc ggcccttaca ttagagccga 11640 ggtggaggat aacattatgg tcacctttag aaatcaggcc agcaggccct atagctttta 11700 ctccagcctc atctcctacg aggaagatca gaggcaggga gccgaaccca ggaagaattt 11760 cgtcaagcct aacgaaacca aaacctattt ctggaaggtc cagcatcaca tggcccctac 11820 caaagacgaa tttgattgca aagcctgggc ctatttctcc gacgttgacc tggagaaaga 11880 cgtgcattcc ggcctcatcg gacccctcct ggtctgccat accaataccc tcaaccctgc 11940 ccacggcaga caggtgaccg tccaggagtt tgctctgttt ttcacaatct ttgacgaaac 12000 caaaagctgg tactttaccg aaaacatgga gaggaactgt agagccccct gtaacattca 12060 gatggaggac cccacattca aagagaatta caggttccat gccattaacg gatacattat 12120 ggataccctc cccggactgg tcatggctca ggatcagagg atcaggtggt atctgctgtc 12180 tatgggctcc aacgaaaaca ttcactccat ccatttctcc ggccatgtgt ttaccgtcag 12240 aaaaaaggag gagtataaga tggccctcta caatctgtat cccggagtgt ttgagacagt 12300 ggaaatgctc ccctccaagg ctggcatttg gagggtggaa tgcctcatcg gagagcatct 12360 gcacgccgga atgtccaccc tgtttctcgt gtatagcaat aagtgtcaga cacccctcgg 12420 catggcctcc ggccatatca gggactttca gattaccgcc agcggacagt atggccaatg 12480 ggctcccaaa ctggctagac tccactatag cggaagcatt aacgcttggt ccaccaaaga 12540 gcctttctcc tggattaagg tggacctcct ggctcccatg attatccacg gaatcaaaac 12600 ccaaggcgct agacaaaagt ttagctccct gtatatctcc cagtttatca ttatgtatag 12660 cctcgacgga aagaaatggc aaacctatag aggaaactcc accggaaccc tcatggtgtt 12720 ctttggcaat gtggatagct ccggcattaa gcataacatt ttcaatcccc ctatcattgc 12780 caggtacatt agactccacc ctacccatta ctccatcagg agcacactga ggatggaact 12840 gatgggctgt gacctcaact cctgctccat gcccctcggc atggaaagca aagccattag 12900 cgatgcccaa atcacagcct ccagctattt cacaaatatg ttcgctacct ggagccctag 12960 caaagccagg ctgcatctgc aaggcaggag caatgcctgg agacctcagg tcaacaatcc 13020 caaagagtgg ctgcaagtgg atttccaaaa gacaatgaaa gtgacaggcg tcaccacaca 13080 gggagtgaaa agcctcctga caagcatgta cgtcaaggag ttcctcatct ccagctccca 13140 ggatggccat cagtggaccc tgttctttca gaatggcaaa gtgaaagtgt ttcagggaaa 13200 ccaagactcc ttcacacccg tcgtgaatag cctcgaccct cccctcctga caagatacct 13260 gagaatccac ccccaaagct gggtgcatca gattgccctc agaatggagg tcctgggatg 13320 cgaagcccaa gacctctact aaatcgattg cgcaaagctt tcgcgatagg cgagaccaat 13380 gggtgtgtac gtagcggccg cgtcgacgaí agcttgatgg gtggcatccc tgtgacccct 13440 ccccagtgcc tctcctggcc ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa 13500 taaaattaag ttgcatcatt ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga 13560 ggggggtggt atggagcaag gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct 13620 attgggaacc aagctggagt gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct 13680 gggttcaagc gattctcctg cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga 13740 ccaggctcag ctaatttttg tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc 13800 tggtctccaa ctcctaatct caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat 13860 tacaggcgtg aaccactgct cccttccctg tccttctgat tttaaaataa ctataccagc 13920 aggaggacgt ccagacacag cataggctac ctggccatgc ccaaccggtg ggacatttga 13980 gttgcttgct tggcactgtc ctctcatgcg ttgggtccac tcagtagatg cctgttgaat 14040 tctgatttaa atcggtccgc gtacggcgtg gtaggtccga acgaatccat ggattaccct 14100 gttatcccta ctcaaggaca tcatcccttt agtgagggtt aattcacgca gtgggtacgg 14160 aactaaaggc agcacacatc gtgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 14220 atccgctacg tctctccccc gcagtaaggg ctagattaac tcgtctcgtg aatatccgga 14280 actcccttta gtgagggtta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 14340 tgtcgtgcca gcttaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctacc 14400 ggaaacgctt ccttcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 14460 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 14520 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 14580 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 14640 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 14700 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 14760 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 14820 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 14880 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 14940 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 15000 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 15060 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 15120 taagggattt tggtcatgcc taggacgaaa ggaggtcgtg aaatggataa aaaaatacag 15180 cgtttttcat gtacaactat actagttgta gtgcctaaat aatgctttta aaacttaaaa 15240 ataatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg caaatcaatg tcctcagcga 15300 aatggcatac gagtaaactt ggtctgacac cgctgcatga gattatcaaa aaggatcttc 15360 acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 15420 acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 15480 tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 15540 ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 15600 ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagc gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 15660 tccgcctcca tccagtctat taactgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 15720 aatagtttgc ggagcgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 15780 ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 15840 ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatgg ttgtcagaag taagttggcc 15900 gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 15960 gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtat tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 16020 cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 16080 actttaaaag tgctcatcat tgggaagcgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 16140 ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc acacgagcac ccaactgatc ttcagcatct 16200 tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 16260
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatacgct tcctttttca atagtattga 16320
agcatttatc agggttattg tctcgggagc gaatacatat ttgaatgtat ttagaaaaa 16379
<210> 20
<211> 158
<212> PRT
<213> Homosapiens
<220>
<223> fator de crescimento do tipo insulina (IGF-1) <400> 20
Met Gly Lys Ile Ser Ser Leu Pro Thr Gln Leu Phe Lys Cys Cys Phe 15 10 15
Cys Asp Phe Leu Lys Val Lys Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu 20 25 30
Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ala Thr Ala 35 40 45
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe 50 55 60
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly 65 70 75 80
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys 85 90 95
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu 100 105 110 Lys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp 115 120 125
Met Pro Lys Thr Gln Lys Tyr Gln Pro Pro Ser ThrAsn Lys Asn Thr 130 135 140
Lys Ser Gln Arg Arg Lys Gly Ser Thr Phe Glu Glu Arg Lys 145 150 155
<210> 21 <211> 288 <212> PRT <213> Homosapiens
<220> <223> fator de crescimento de fibroblasto básico humano(bFGF)
<400> 21
Met Val Gly Val Gly Gly Gly Asp Val Glu Asp Val Thr Pro Arg Pro 1 5 10 15
Gly Gly Cys Gln Ile Ser Gly Arg Gly Ala Arg Gly Cys Asn Gly Ile 20 25 30
Pro Gly Ala Ala Ala Trp Glu Ala Ala Leu Pro Arg Arg Arg Pro Arg 35 40 45
Arg His Pro Ser Val Asn Pro Arg Ser Arg Ala Ala Gly Ser Pro Arg 50 55 60
Thr Arg Gly Arg Arg Thr Glu Glu Arg Pro Ser Gly Ser Arg Leu Gly 65 70 75 80
Asp Arg Gly Arg Gly Arg Ala Leu Pro Gly Gly Arg Leu Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Arg Gly Arg Ala Pro Glu Arg Val Gly Gly Arg Gly Arg Gly Arg 100 105 110
Gly Thr Ala Ala Pro Arg Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Ser Arg Pro 115 120 125
Gly Pro Ala Gly Thr Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala 130 135 140
Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys 145 150 155 160
Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile 165 170 175
His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His 180 185 190
Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys 195 200 205
Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu 210 215 220
Leu Ala Ser Lys Cys Val ThrAsp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu 225 230 235 240
Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp 245 250 255
Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr 260 265 270
Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 275 280 285
<210> 22 <211> 193 <212> PRT <213> Homosapiens
<220> <223> eritropoetina humana
<400> 22
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 180 185 190
Arg
<210> 23
<211> 134
<212> PRT
<213> Homosapiens
<220>
<223> BNPhumana <400> 23
Met Asp Pro Gln Thr Ala Pro Ser Arg Ala Leu Leu Leu Leu Leu Phe 15 10 15
Leu His Leu Ala Phe Leu Gly Gly Arg Ser His Pro Leu Gly Ser Pro 20 25 30
Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn 35 40 45
His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu 50 55 60
Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg 65 70 75 80
Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr 85 90 95 Thr Leu Arg Ala Pro Arg Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys 100 105 110
Phe Gly Arg Lys Met Asp Arg Ile Ser Ser Ser Ser Gly Leu Gly Cys 115 120 125
Lys Val Leu Arg Arg His 130
<210> 24
<211> 562
<212> PRT
<213> Homosapiens
<220>
<223> tPA humana <400> 24
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 20 25 30
Gly Ala Arg Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met 35 40 45
Ile Tyr Gln Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn 50 55 60
Arg Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser 65 70 75 80
Val Pro Val Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr 85 90 95 Cys GIn Gln Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu 100 105 110
Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr 115 120 125
Glu Asp Gln Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser 130 135 140
Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro 145 150 155 160
Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His 165 170 175
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val 180 185 190
Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys 195 200 205
Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg 210 215 220
Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn 225 230 235 240
Ser Met Ile Leu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala 245 250 255
Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly 260 265 270
Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp 275 280 285
Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr 290 295 300
Ser Gln Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala 305 310 315 320
Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro 325 330 335
Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile 340 345 350
Leu SerAIa Aia His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu 355 360 365
Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Giy Glu Giu Glu 370 375 380
Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Giu Phe Asp Asp 385 390 395 400
Asp Thr Tyr Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser 405 410 415
SerArg Cys Ala Gln Glu Ser SerVaI Val Arg ThrVaI Cys Leu Pro 420 425 430
Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly 435 440 445
Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys 450 455 460
Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His 465 470 475 480
Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr 485 490 495 Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp 500 505 510
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val 515 520 525
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly 530 535 540
Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met 545 550 555 560
Arg Pro
<210> 25
<211> 185
<212> PRT
<213> Homosapiens
<220>
<223> Relaxina humana <400> 25
Met Pro Arg Leu Phe Phe Phe His Leu Leu Gly Val Cys Leu Leu Leu 15 10 15
Asn Gln Phe Ser Arg Ala Val Ala Asp Ser Trp Met Glu Glu Val Ile 20 25 30
Lys Leu Cys Gly Arg Glu Leu Val Arg Ala Gln Ile Ala Ile Cys Gly 35 40 45
Met Ser Thr Trp Ser Lys Arg Ser Leu Ser Gln Glu Asp Ala Pro Gln 50 55 60 Thr Pro Arg Pro Val Ala Glu Ile Val Pro Ser Phe ile Asn Lys Asp 65 70 75 80
Thr Glu Thr Ile Asn Met Met Ser Glu Phe Val Ala Asn Leu Pro Gln 85 90 95
Glu Leu Lys Leu Thr Leu Ser Glu Met Gln Pro Ala Leu Pro Gln Leu 100 105 110
Gln Gln His Val Pro Val Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Phe Glu Glu 115 120 125
Phe Lys Lys Leu Ile Arg Asn Arg Gln Ser Glu Ala Ala Asp Ser Ser 130 135 140
Pro Ser Glu Leu Lys Tyr Leu Gly Leu Asp Thr His Ser Arg Lys Lys 145 150 155 160
Arg Gln Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Asn Lys Cys Cys His Val Gly Cys 165 170 175
Thr Lys Arg Ser Leu Ala Arg Phe Cys 180 185
<210> 26
<211> 728
<212> PRT
<213> Homosapiens
<220>
<223> Fator de crescimento de hepatócito humano (HGF) <400> 26
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Giy Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu 290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile 305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu 325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg 500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys 545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

Claims (142)

1. Método para tratar, melhorar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição em um paciente CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma das referidas seqüências de fator de transcrição codifica um complexo fator de transcrição dependente de Iigante (CFTDL) através da asso- ciação operável com um promotor de troca terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polipeptídeo terapêutico operacionalmente asso- ciado com um promotor fator-regulado que é ativado pelo referido complexo fator de trans- crição dependente de ligante, em que os referidos primeiro e segundo polinucleotídeos são introduzidos de forma a permitir a expressão do referido complexo fator de transcrição de- pendente de ligante; e (b) administração do ligante ao referido paciente para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
2. Método para expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêuti- co em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) introdução em um paciente de (1) um primeiro polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que pelo menos uma das referidas seqüências de fator de transcrição codifica um complexo fator de transcrição dependente de ligante através da associação ope- rável com um promotor de troca terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polipeptídeo terapêutico operacionalmente associado com um promotor fator-regulado que é ativado pelo referido complexo fator de transcrição de- pendente de ligante, em que os referidos primeiro e segundo polinucleotídeos são introduzi- dos de forma a permitir a expressão do referido complexo fator de transcrição dependente de ligante; e (b) administração do ligante ao referido paciente para induzir expressão do referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico é constitutivo.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico é ativado sobre condições associa- das com uma doença, distúrbio, ou condição de forma a permitir a expressão do referido complexo fator de transcrição dependente de ligante sobre condições associadas com a referida doença, distúrbio ou condição.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença, distúrbio ou condição é responssiva ao referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico é expres- so e disseminado em um nível suficiente para tratar, melhorar, ou prevenir a referida doen- ça, distúrbio ou condição.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido gene de troca é um gene de troca baseado no receptor de ecdi- sona (EcR).
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido Iigante se liga ao domínio Iigador do Iigante de EcR.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido Iigante é uma diacilidrazina.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido Iigante é selecionado a partir do grupo consistindo de RG-115819, RG-115932, e RG-115830.
11. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido Iigante é uma amidocetona ou oxadiazolina.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido gene de troca compreende uma primeira se- qüência de fator de transcrição sobre o controle de um primeiro promotor de troca terapêuti- co e uma segunda seqüência de fator de transcrição sobre o controle de um segundo pro- motor de troca terapêutico, em que as proteínas codificadas pela referida primeira seqüência de fator de transcrição e a referida segunda seqüência de fator de transcrição interagem para formar um complexo protéico que funciona como um complexo fator de transcrição de- pendente de ligante.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são diferentes.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são os mesmos.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um par- ceiro heterodímero e um domínio de transativação.
16. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante.
17. Método, de acordo com a reinvidicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro e segundo polinucleotídeos são introduzidos no referido paciente em uma ou mais células modificadas.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são preparadas pela introdução dos referidos primeiro e segundo polinucleotídeos em células que têm sido isoladas a partir do referido paciente para produzir as células autólogas modificadas, que são então re-introduzidas no referido pacien- te.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são células não autólogas modificadas (MNA) dentro das quais os referidos primeiro e segundo polinucleotídeos têm sido incorporados.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células MNA são alogênicas ao referido paciente.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que as células são xenogênicas ao referido paciente.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que as células MNA são geradas a partir de um tipo de'célula selecionada a partir do grupo con- sistindo de células imortalizadas e células primárias capazes de diferenciação terminal.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células MNA são geradas a partir de um tipo celular selecionado a partir do gru- po consistindo de células de mioblasto de camundongo C2C12, células de rim embrionário humano HEK293, células ARPE-19, células hMSC, células da ilhota pancreática, célula MDCK, uma célula CHO, uma célula derivada de astrócito, uma célula derivada de oligo- dendrócito, e uma célula derivada de mioblasto.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células da ilhota pancreática são células da ilhota porcina.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as células da ilhota pancreática são células da ilhota humana derivadas de cadáveres.
26. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas têm sido tratadas tal que as referidas células, sob introdu- ção no referido paciente, são protegidas a partir do sistema imune do paciente.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são contidas dentro de um sistema de barreira que permite disseminação da referida proteína terapêutica ou polinucleotídeo terapêutico, mas que pre- vine contato direto das referidas células modificadas com células do sistema imune do paci- ente.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira compreende células modificadas com um revestimento cofor- macional.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido revestimento conformai compreende um polímero.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polímero é selecionado a partir do grupo consistindo de polietileno glicol, e hidro- ximetil metacrilato-metil metacrilato (HEMA-MMA).
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira compreende células modificadas encapsuladas.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas estão contidas em um dispositivo de macroencapsulação.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma ou mais membranas sintéti- cas.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende duas ou mais membranas sintéti- cas, as referidas membranas sintéticas compreendem diferentes tamanhos de poros de for- ma a regular o trânsito de massa através do referido dispositivo de macroencapsulação.
35. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma membrana externa de polí- mero semi-permeável e uma plataforma interna que dá suporte às células.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação tem cerca de 6 mm de comprimento e cerca de 1 mm em diâmetro.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida membrana externa compreende poros de cerca de 15 nm.
38. Método, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida plataforma interna compreende fio de poli(etileno tereftalato).
39. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o espaço interior do referido dispositivo de macroencapsulação compreende pelo menos uma a cerca de 105 células modificadas.
40. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma bicamada de membrana po- limérica, a referida bicamada compreendendo uma camada externa de 5 μm de membrana de PTFE laminada em uma camada imunobarreira de PFTE de 0,45 μΜ de poro interno es- treito.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação ainda compreende uma camada exterior poli- malha não trançada à referida bicamada de membrana polimérica.
42. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende um dispositivo de PES-fibra vazio.
43. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação ainda compreende um clipe de sutura.
44. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação é implantável e recuperável.
45. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são microencapsuladas.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são suspensas em um material de encapsulação biologi- camente compatível que é então moldado em estruturas tipo esfera.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido material de encapsulação compreende um hidrogel.
48. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido material de encapsulação compreende um polímero selecionado a partir do grupo consistindo de celulose, e alginato.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polímero compreende alginato polianiônico e polímero poli-catiônico para interagir e formar uma barreira de membrana física permeável seletiva.
50. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que cada das referidas estruturas tipo esferas compreendem pelo menos uma a cerca de 103 células modificadas.
51. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas estruturas tipo esferas compreendem microesferas de alginato de ácido poli(L- lático).
52. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas estruturas tipo esferas ainda compreende um revestimento de alginato de poli- L-ornitina (PLO).
53. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido material de encapsulação compreende um alginato baseado em biopolímero de ultra alta viscosidade (UHV).
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido alginato baseado em polímero-UHV é biodegradável.
55. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas estruturas tipo esferas são aproximadamente esféricas e têm cerca de 500 μπι em diâmetro.
56. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira compreende células protetoras capazes de prover a proteção às referidas células modificadas, em que as referidas células protetoras são selecionadas a partir do grupo consistindo de célulasjde sertoli e eritrócitos.
57. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira ainda compreende um revestimento externo capaz de criar um mícroambiente protetor.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido mícroambiente protetor é antiinflamatório. - ·
59. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido mícroambiente protetor é pró-angiogênico.
60. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas compreendem um gene suicida regulado que, sob ativação, induzirá destruição_das referidas células modificadas.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido gene suicida é ativado no evento de escape a partir do sistema de barreira ou conversão oncogênica.
62. Método para expressar um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêu- tico em uma ou mais células modificadas, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) introdução em uma célula de (1) um primeiro polinucleotídeo codificando um ge- ne de troca, o referido gene de troca compreendendo pelo menos uma seqüência do fator de transcrição, em que pelo menos uma referida seqüência do fator de transcrição codifica um complexo de fator de transcrição dependente de Iigante através da associação operável com um promotor de troca terapêutico, e (2) um segundo polinucleotídeo codificando um polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico operacionalmente associado com um promotor fator-regulado que é ativado pelo referido complexo fator de transcrição dependen- te de ligante, assim produzindo uma célula modificada; e (b) administrar a ligação a referida célula modificada para induzir expressão do refe- rido polipeptídeo terapêutico ou polinucleotídeo terapêutico.
63. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico é constitutivo.
64. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico é ativado sobre condições associadas com uma doença, distúrbio, ou condição de forma a permitir expressão do referido complexo fator de transcrição dependente de ligante sobre condições associadas com a referida doença, dis- túrbio ou condição.
65. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método é realizado in vitro.
66. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado ex vivo em uma célula que tem sido isolada de um paciente.
67. Método, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método é realizado in vivo.
68. Composição de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um primeiro polinucleotídeo codificando um gene de troca, o referido gene de troca compre- endendo pelo menos uma seqüência de fator de transcrição, em que a pelo menos uma da referida seqüência de fator de transcrição codifica um complexo fator dê transcrição depen- dente de Iigante através da associação operável a um promotor de troca terapêutica.
69. Composição de ácido nucléico, de acordo com' a reivindicação 68, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutica é constitutivo.
70. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico é ativado sobre condições associadas com uma doença, distúrbio, ou condição de forma a permitir a ex- pressão do referido complexo fator de transcrição dependente de Iigante sobre condições associadas com a referida doença, distúrbio ou condição.
71. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda compreender um segundo polinucleotídeo codifi- cando um polipeptídeo ou polinucleotídeo associado com uma doença, distúrbio, ou condi- ção através da associação operável com um promotor que é ativado pelo referido complexo fator de transcrição dependente de ligante.
72. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 71, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido polipeptídeo ou polinucleotídeo associado com uma doença, distúrbio ou condição compreende um polipeptídeo terapêutico ou um polinucleotídeo terapêutico capaz de tratar, melhorar ou prevenir uma doença, distúrbio ou condição.
73. Composição de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma da reivindicações -68-72, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido gene de troca é um gene de troca ba- seado em EcR.
74. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ligante se liga ao domínio de ligação do Iigan- te de EcR.
75. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido ligante é uma diazilidrazina.
76. Composição de ácido nucléioo, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido Iigante é selecionado a partir do grupo con- sistindo de RG-115819, RG-115932, e RG-115830.
77. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 74, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido Iigante é uma amidocetona ou oxadiazolina.
78. Composição de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das reivindicações68-72, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido gene de troca compreende uma pri- meira seqüência de fator de transcrição sobre o controle de um primeiro promotor de troca terapêutico e uma segunda seqüência de fator de transcrição sobre o controle de um se- gundo promotor de troca terapêutico, em que as proteínas codificadas pela referida primeira seqüência de fator de transcrição e a referida segunda seqüência "3% fatorOe transcrição interagem para formar um complexo de proteína que funciona como um complexo fator de transcrição dependente de ligante.
79. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido primeiro promotor de troca terapêutico e o segundo promotor de troca terapêutico são diferentes.
80. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido promotor de troca terapêutico e o referido segundo promotor de troca terapêutico são os mesmos.
81. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um parceiro heterodímero e um domínio de transativação.
82. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida segunda seqüência de fator de transcrição codifica uma proteína compreendendo um domínio de ligação de DNA e um domínio de li- gação de ligante.
83. Composição de ácido nucléico, de acordo com a reivindicação 71, CARACTERIZADA pelo fato de ainda compreender um terceiro polinucleotídeo condifican- do um polipeptídeo letal operacionalmente ligado a um promotor induzível.
84. Vetor, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a composição de ácido nucléico conforme descrito na reivindicação 71.
85. Vetor, de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de ser um vetor plasmídeo.
86. Vetor, de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de ser um vetor viral.
87. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a composição de ácido nu- cléico conforme descrito na reivindicação 71.
88. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o vetor conforme descrito na reivindicação 84.
89. Método de produção de uma célula modificada, CARACTERIZADO pelo fato de compreender introdução em uma célula a composição de ácido nucléico conforme descrito em qualquer uma da reivindicação 71.
90. Método de produção de uma célula modificada, CARACTERIZADO pelo fato de compreender introdução em uma célula o fator conforme descrito na reivindicação 84.
91. Célula modificada, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a composição de ácido nucléico conforme descrito em qualquer uma da reivindicação 71.
92. Célula modificada, CARACTERIZADA pelo fato de compreender o vetor con- forme descrito na reivindicação 84.
93. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADA pelo fato de ser uma célula autóloga modificada derivada a partir de células isoladas a partir de um paciente em necessidade do referido polipeptídeo ou polinucleotídeo, em que a referida célula modificada é adequada para re-introdução no referido paciente.
94. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADA pelo fato de ser derivada a partir de um tipo celular selecionado a partir do grupo consistindo de células imortalizadas e células primárias capazes de diferenciação terminal.
95. Células modificada, de acordo com a reivindicação 94, CARACTERIZADA pelo fato de ser derivada a partir de um tipo celular selecionado a partir do grupo consistindo de células de mioblasto de camundongo C2C12, células de rim embrionários humanas HEK293, células ARPE-19, células hMSC, células da ilhota pancreática, célula MDCK, uma célula CHO, uma célula derivada de astrócito, uma célula derivada de oligodendrócito, e uma célula derivada de mioblasto.
96. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 95, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula da ilhota pancreática é uma célula da ilhota porcina.
97. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 95, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula da ilhota pancreática é uma célula da ilhota humana derivada de cadáveres.
98. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 91, CARACTERIZADA pelo fato de compreender um gene suicida regulado que, sobre ativação, induzirá destruição da referida célula modificada.
99. Célula modificada, de acordo com a reivindicação 98, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene suicida é ativado no evento de escape a partir de um sistema de barreira ou conversão oncogênica.
100. Dispositivo biorreator, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou mais células modificadas como recitado conforme descrito em qualquer uma das reivindica- ções 91-99.
101. Dispositivo biorreator, de acordo com a reivindicação 100, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas têm sido tratadas tal que as referidas célu- las, sob introdução em um paciente, são protegidas do sistema imune do paciente.
102. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 100, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são combinadas dentro de um sistema de barreira que permite disseminação do referido polipeptídeo ou polinucleotídeo, mas que pre- vine contato direto das referidas células modificadas com células do sistema imune do paci- ente.
103. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira cõmpreeTítie células modificadas com um revestimento conformai.
104. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido revestimento conformai compreende um polímero.
105. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 104, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polímero é selecionado a partir do grupo consistindo de polietile- no glicol, e hidroxietil metacrilato-metil metacrilato (HEMA-MNA).
106. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira compreende células modificadas encapsula- das.
107. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas estão contidas em um dispositivo de ma- croencapsulação.
108. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma ou mais membranas sintéticas.
109. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 108, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroeneapsulação compreende duas ou mais membranas sintéticas, as referidas membranas sintéticas compreendendo diferentes tama- nhos de poros de forma regular o trânsito de massa através do referido dispositivo de ma- croencapsulação.
110. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma membrana externa de polímero semi-permeável e uma plataforma interna que dá suporte às células.
111. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação tem cerca de 6 mm de com- primento e cerca de 1 mm em diâmetro.
112. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida membrana externa compreende poros de cerca de 15 nm.
113. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 110, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida plataforma interna compreende fio de poli(etileno tereftalato).
114. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o espaço interior do referido dispositivo de macroencapsulação compreen- de pelo menos uma a cerca de 105 células modificadas.
115. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende uma bicamada de membrana polimérica, a referida bicamada compreendendo uma camada externa de 5 μm de membrana de PTFE laminada errTuma camada imunobarreira de PFTE de 0,45 μΜ de poro interno estreito.
116. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 115, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação ainda compreende uma ca- mada exterior poli-malha não trançada exterior a referida bicamada de membrana poliméri- ca.
117. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação compreende um dispositivo de fibra PES vazio.
118. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação ainda compreende um clipe de sutura.
119. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido dispositivo de macroencapsulação é implantável e recuperável.
120. Método, de acordo com a reivindicação 106, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são microencapsuladas.
121. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 120, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas células modificadas são suspensas em um material de encap- sulação biologicamente compatível que é então moldado em estruturas tipo esfera.
122. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido material de encapsulação compreende um hidrogel.
123. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido material de encapsulação compreende um polímero selecionado a partir do grupo consistindo de celulose, e alginato.
124. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 123, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polímero compreende alginato polianiônico e polímero poli- catiônico para interagir e formar uma barreira de membrana física permeável seletiva.
125. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que cada das referidas estruturas tipo esferas compreendem pelo menos uma a cerca de 103 células modificadas.
126. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas estruturas tipo esferas compreendem microesferas de alginato de ácido poli(L-lático) (PLLA).
127. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que as referidas estruturas tipo esferas ainda compreende um revestimento de alginato de poli-L-ornitina (PLO).
128. Dispositivo bioreator, de acord© com a reivindicação 123, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido matêFial de Sficapsulação compreende um alginato baseado em biopolímero de ultra alta viscosidade (UHV).
129. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 128, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido alginato baseado em polímero-UHV é biodegradável.
130. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 121, CARACTERIZADO pelo fato de que as estruturas tipo esferas são aproximadamente esféricas e têm cerca de -500 μm em diâmetro.
131. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira ainda compreende células protetoras dentro da referida cápsula capazes de prover a proteção às referidas células modificadas, em que as referidas células protetoras são selecionadas a partir do grupo consistindo de células de sertoli e eritrócitos.
132. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 102, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido sistema de barreira ainda compreende um revestimento externo capaz de criar um microambiente protetor.
133. Dispositivo bioreator, de acordo com a reivindicação 132, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido microambiente protetor é antiinflamatório.
134. Dispositivo bioreator·,-de acordo com a reivindicação 132, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido microambiente protetor é pró-angiogênico.
135. Uso da composição de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 68-83, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição.
136. Uso vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84-86, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condi- ção.
137. Uso da célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91- -99, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de uma doença, distúrbio ou con- dição.
138. Uso do dispositivo bioreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 100-134, CARACTERIZADO pelo fato de ser para o tratamento de uma doença, distúrbio ou condição.
139. Uso da composição de ácido nucléico, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 68-83, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medica- mento para o tratamento de uma doença, distúrbio, ou condição selecionada a partir do gru- po consistindo de uma doença, distúrbio ou condição hiperproliferativa, uma doença, distúr- bio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição neural, uma doença, distúrbio ou condição autoimune, uma doença, distúrbio ou condição óssea, uma doença, distúrbio ou condição gastrointestinal, uma doença, distúrbio ou condição sangüínea, uma doença, distúrbio ou condição metabólica, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória e uma doença, distúrbio ou condição infecciosa.
140. Uso do vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 84-86, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o trata- mento de uma doença, distúrbio, ou condição selecionada a partir do grupo consistindo de uma doença, distúrbio ou condição hiperproliferativa, uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição neural, uma doença, distúrbio ou condi- ção autoimune, uma doença, distúrbio ou condição óssea, uma doença, distúrbio ou condi- ção gastrointestinal, uma doença, distúrbio ou condição sangüínea, uma doença, distúrbio ou condição metabólica, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória e uma doença, dis- túrbio ou condição infecciosa.
141. Uso da célula modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 91-99, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tra- tamento de uma doença, distúrbio, ou condição selecionada a partir do grupo consistindo de uma doença, distúrbio ou condição hiperproliferativa, uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição neural, uma doença, distúrbio ou condi- ção autoimune, uma doença, distúrbio ou condição óssea, uma doença, distúrbio ou condi- ção gastrointestinal, uma doença, distúrbio ou condição sangüínea, uma doença, distúrbio ou condição metabólica, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória e uma doença, dis- túrbio ou condição infecciosa.
142. Uso do dispositivo bioreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações100-134, CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença, distúrbio, ou condição selecionada a partir do grupo consistindo de uma doença, distúrbio ou condição hiperproliferativa, uma doença, distúrbio ou condição cardiovascular, uma doença, distúrbio ou condição neural, uma doença, distúrbio ou condi- ção autoimune, uma doença, distúrbio ou condição óssea, uma doença, distúrbio ou condi- ção gastrointestinal, uma doença, distúrbio ou condição sangüínea, uma doença, distúrbio ou condição metabólica, uma doença, distúrbio ou condição inflamatória e uma doença, dis- túrbio ou condição infecciosa.
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