DE69534180T2

DE69534180T2 - Promotor der tie rezeptor protein kinase

Info

Publication number: DE69534180T2
Application number: DE69534180T
Authority: DE
Inventors: Kari Alitalo
Original assignee: Licentia Oy
Current assignee: Licentia Oy
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2015-09-23
Also published as: JPH10506011A; AU3474895A; AU701568B2; DE69534180D1; NO971341D0; ATE294236T1; EP0783572B1; NO971341L; EP0783572A1; US5877020A; WO1996009381A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Rezeptortyrosinkinasen und Promotoren davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Kreislaufsystem ist das erste Organsystem, das sich in dem sich entwickelnden Embryo differenziert. Kaufmann, The Atlas of Mouse Development, Academic Press (1992). Vaskuläre embryonische und Dottersack-Systeme bilden sich in einem Mausembryo 8,5 Tage p.c. und einen Tag später schlägt das Herz regelmäßig, wobei es primitive Blutzellen, Nährstoffe und metabolische Abfallprodukte transportiert. Endothelzellen, die Blutgefäße bedecken, stellen eine Barriere zwischen Blut und anderen Geweben des Embryos dar. Wenn sich die Organe differenzieren und beginnen, ihre spezifischen Funktionen auszuführen, nimmt die phänotypische Heterogenität endothelialer Zellen zu. Fenestrierte Gefäße, nicht-fenestrierte Gefäße mit engen Verbindungen und sinusoidale Gefäße werden zum Beispiel in der Niere, im Gehirn bzw. in der Leber gefunden. Zusätzlich üben endotheliale Zellen spezifische Funktionen in differenziertem Gewebe aus. Solche Zellen haben zum Beispiel Anteil an verschiedenen biochemischen und physiologischen Abläufen wie dem Blutzell-Trafficking, der Blutkoagulation, Hämostase, Ovulation, Wundheilung, Atherosclerose und der Angiogenese, die mit der Tumormetastase in Verbindung steht.
Mindestens fünf Rezeptortyrosinkinase-Gene werden in endothelialen Zellen exprimiert. Von diesen gehören die Proteinprodukte der FLT1-, KDR/FLK-1- und FLT4-Gene zur Rezeptortyrosinkinase-Unterklasse III; wohingegen Tie und sein naher Verwandter Tek (Tie-2) eine neue eigene Unterklasse bilden (Terman, et al., Oncogene, 6: 1677–1683, 1991, Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 187: 1579–1586, 1992, Aprelikova, et al., Cancer Res., 52: 746–748, 1992, DeVries, et al., Science, 255: 989–991, 1992, Pajusola, et al., Cancer Res., 52. 5738–5742, 1992, Sarzani, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 186: 706–714, 1992, Galland, et al., Oncogene, 8: 1233–1240, 1993, Millauer, et al., Cell, 72: 835–846; 1993, Oelrichs, et al., Oncogene, 8: 11–18, 1993, Schnurch und Risau, Development, 119: 957–968, 1993). Sowohl menschliche als auch Mäuse-Tie-cDNAs wurden cloniert (Partanen, et al., Mol. Cel. Biol., 12: 1698–1707, 1992, Korhonen, et al., Blood, 80: 2548–2555, 1992, Korhonen, et al., Oncogene, 8: 395–403, 1994, Iwama, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 195: 301–309, 1993, Sato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 9355–9358, 1993). Tie- und homologe Gene wurden von Rinder- und Ratten-Quellen (Maisonpierre, et al., Oncogene, 8: 1631–1637, 1993, Sato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 9355–9358, 1993) isoliert. Genomische Clone für Maus-Tie- und sowohl Maus- als auch menschliche Tie-Promotorregionen wurden cloniert und charakterisiert.
Die 4,4 kb lange Tie-codierende mRNA codiert ein Transmembranprotein von 125 kDa, das N-glycosyliert ist. In seiner extrazellulären Domäne enthält Tie zwei Immunglobulin-ähnliche Schleifen und drei zu epidermalem Wachstumsfaktor- und Finbronectin vom Typ III homologe Regionen, gefolgt von Trans- und Juxtamembran-Domänen, die mit einer Tyrosinkinasedomäne verbunden sind, die durch eine kurze Kinase-Insertionssequenz gespalten ist, und einem carboxylterminalen Schwanz (Partanen, et al., Mol. Cell. Biol., 12: 1698–1707, 1992, Korhonen, et al., Oncogene, 8: 395–403, 1994, Sato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90: 9355–9358, 1993). Sowohl Tie als auch TEK wurden am Maus-Chromosom 4 im Abstand von 12,2 cm voneinander lokalisiert. Solche Rezeptoren werden während der Embryonalentwicklung in Endothelzellen verschiedener Blutgefäße einheitlich exprimiert, obwohl die Expression von Tek-mRNA 0,5 Tage früher als die Expression von Tie zu beginnen scheint. In adulten Mäusen persistiert die Expression von Tie-mRNA in Gefäßen der Lunge, wohingegen sie im Herz und im Gehirn abzunehmen scheint. Korhonen, et al., Oncogene, 8: 395–403, (1994). Die Herstellung von Tie-mRNA wird während der Ovulation und der Wundheilung in menschlichen Glioblastomen verstärkt (Korhonen, et al., Blood, 80: 2548–2555, 1992).
Endothelzellen spielen bei der Gentherapie, die auf Krankheiten ausgerichtet ist, bei denen Endothelzellen und Blutgefäße beteiligt sind, wie der Einrichtung der Neovaskularisierung oder der Hemmung der Angiogenese und der Kontrolle von entzündlichem Trafficking von Leukocyten, eine Schlüsselrolle. Ein Ansatz der Behandlung von vaskulären Krankheiten ist es, Gene an spezifischen Stellen im Kreislauf zu exprimieren, was die Krankheit in situ verbessern könnte. Da Endothelzellen an erkrankten Stellen gefunden werden, stellen sie logische Träger für den Transport von therapeutischen Mitteln dar, die Antikoagulantien, Vasodilatoren, angiogene oder Wachstumsfaktoren umfassen könnten. Entsprechend stellt die genetische Modifikation von Endothelzellen einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung vieler vaskulärer Krankheiten, einschließlich Hypertonie, Atherosklerose und Restenose, dar. Zum Beispiel könnten Endothelzellen, die wachstumshemmende Proteine exprimieren, über einen Katheter in die angioplastische Stelle eingeführt werden, um örtliche innere Hyperplasie und klinische Restenose zu verhindern. Die luminale Oberfläche vaskulärer Transplantate könnte auch mit genetisch modifizierten Endothelzellen ausgekleidet werden, die therapeutische Proteine herstellen, die eine Thrombose verhindern oder eine erneute Besiedelung fördern (Nabel, et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17, 189B–194B, 1991).
Endothelzellen, die Blutgefäße auskleiden, werden leicht mit Verfahren transfiziert, bei denen Liposomen, Adenovirusvektoren und retrovirale Vektoren verwendet werden (Nabel, et al., J. Am. Coll. Cardiol. 17: 189B–94B). Endothelzellen sind ebenfalls in direktem Kontakt mit Blut und sind deshalb optimale Quellen für die Herstellung und Sekretion von gewünschten Proteinen oder Peptiden in den Blutstrom. Zum Beispiel kann das Faktor VIII-Gen unter einem endothelialen zellspezifischen Promotor in Endothelzellen eingeführt werden, was eine Verbesserung der Hämophilie ergibt, wenn das Protein in ausreichender Menge exprimiert wird. Auf der anderen Seite sind Endothelzellen auch für den Transport von Peptiden oder Proteinen, die in ihnen exprimiert werden, in das Gewebe, nützlich. In dieser Hinsicht ist eine selektive Expression eines regulatorischen Elements für ein bestimmtes Gen in Endothelzellen des Mikrogefäßsystems (Kapillaren) extrem nützlich, vorausgesetzt, dass ein Großteil des Zelloberflächenbereichs, der zum vaskulären Lumen liegt, aus mikrovaskulären Endothelzellen besteht.
Kontrollelemente der spezifischen Promotoren von Endothelzellen können nach fachspezifischen Standardverfahren weiter in funktionelle Elemente und Einheiten unterteilt und abgetrennt werden. Das Tie-Protein wird in bestimmten Endothelzellen und in etwa 0,9% der menschlichen Knochenmarkszellen exprimiert. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass der Tie-Promotor auch in einigen hämatopoetischen Zellen aktiv ist. Die Expression des Tie-Promotors in hämatopoetischen Zellen kann jedoch durch Elemente kontrolliert werden, die von endothelialen zellspezifischen Elementen unterscheidbar sind und weggeschnitten werden können, wobei die endotheliale Zellspezifität des Promotors erhalten bleibt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Promotor, der mit dem Gen in Verbindung steht, das die Tie-Rezeptortyrosinkinase codiert, zur Verwendung in therapeutischen und diagnostischen Verfahren zur Verfügung. Zusätzlich kann sich der Promotor bei der Herstellung von für das Blut oder Gewebe von Tieren erwünschten Proteinen als nützlich erweisen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Promotorsequenzen für die Rezeptortyrosinkinase Tie. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Maus-Tie-Promotor bereitgestellt, der die Sequenz umfasst, die in SEQ ID NR: 1 gezeigt ist. Ebenfalls in einer bevorzugten Ausführungsform wird ein menschlicher Tie-Promotor bereitgestellt, der die Sequenz umfasst, die in SEQ ID NR: 2 gezeigt ist. Ein Promotor gemäß der Erfindung steuert die Expression von Endothelzell-Rezeptortyrosinkinasen und insbesondere der Rezeptortyrosinkinase Tie.
Ein Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung kann jeder Vektor sein, der für den Einschluss eines Promotors gemäß der Erfindung geeignet ist und kann vorzugsweise der 0,73mTIEpromGL2-Vektor sein, der am 19. September 1994 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 als Zugangsnummer 75892 hinterlegt wurde. Wirtszellen gemäß der Erfindung kann jede Wirtszelle sein, die in der Lage ist, den Promotor oder einen Vektor, der den Promotor gemäß der Erfindung enthält, zu beherbergen. Beispiele für Wirtszellen gemäß der Erfindung sind LEII-Endothelzellen.
Andere Vorteile und Verwendungen der Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden Detaillierten Beschreibung davon offensichtlich.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein schematisches Diagramm des Maus-Tie-Gens und -Promotors.
2 ist ein Vergleich von Maus- und menschlichen Tie-Promotorsequenzen. (SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2).
3 zeigt die Ergebnisse einer Analyse der Tie-Promotor-Aktivität.
4A zeigt die Expressionsmuster des Tie-Promotors in dem sich entwickelnden Endocardium und dem Kopf-Mesenchym eines 8,5 Tage alten Maus-Embryos.
4B zeigt die Expression eines Maus-Tie-Promotor-Konstrukts in Dottersack-Blutinseln in 8,5 Tage alten Maus-Embryonen.
5A und 5B zeigen das Expressionsmuster von Maus-Tie-Promotor in 9,5 Tage alten Embryonen.
5C und 5D zeigen das Expressionsmuster von Maus-Tie-Promotor in 11,5 Tage alten Embryonen.
6A zeigt die Expression des Tie-Promotors in 9,5 Tage altem embryonalem Herzgewebe.
6B zeigt die Expression des Tie-Promotors in 11,5 Tage altem embryonalem Lungengewebe.
6C zeigt die Expression des Tie-Promotors in 15,5 Tage altem embryonalem Hirngewebe.
6D zeigt die Expression des Tie-Promotors in 15,5 Tage altem embryonalem Lebergewebe.
6E zeigt die Expression des Tie-Promotors in sich entwickelnden Knochenbälkchen.
6F zeigt die Expression des Tie-Promotors in sich entwickelndem Nierengewebe.
7A zeigt die Expression des Tie-Promotors in den interalveolaren Kapillaren der Lunge in einer 8 Wochen alten Maus.
7B zeigt die Expression des Tie-Promotors in dem endothelialen Netzwerk des Knochenmarks in einer 8 Wochen alten Maus.
7C zeigt die Expression des Tie-Promotors im Nierengewebe einer 8 Wochen alten Maus.
7D zeigt die Expression des Tie-Promotors im Herzgewebe einer 8 Wochen alten Maus.
7E zeigt die Expression des Tie-Promotors im Lebergewebe einer 8 Wochen alten Maus.
7F zeigt die Expression des Tie-Promotors im Hirngewebe einer 8 Wochen alten Maus.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Promotorsequenzen zur Verfügung, die in der Lage sind, die Expression rekombinanter DNA-Sequenzen in Endothelzellen zu steuern. Insbesondere stellt die Erfindung Promotorsequenzen zur Verfügung, die die Expression des beta-Galactosidase-Reportergens in Endothelzellen von Mausgeweben steuern. Promotoren für die Herstellung von Proteinen und Peptiden, die als Anticoagulantien und Vasodilator-Inhibitoren von Thrombose oder Restenose in Endothelzellen, Blut und Gewebe wirken. Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung sind für die Steuerung der Expression von Proteinen und Peptiden für die menschliche Gentherapie, von Antigenen und Markern, die bei der Markierung von Endothelzellen nützlich sind, und von Antisense-RNA-Konstruktionen zur Verwendung bei Endothelzellen in vivo und in vitro von Nutzen. Promotoren, Vektoren und Wirtszellen gemäß der Erfindung sind auch bei der Gentherapie zur Förderung der Expression verschiedener Wachstumsfaktoren oder Rezeptoren oder ihrer Domänen von Nutzen. Darüber hinaus sind Analoga von Promotoren gemäß der Erfindung bei der Hemmung unerwünschter Endothelzellvermehrung wie zum Beispiel der Hemmung der Angiogenese während der Tumorbildung nützlich.
Beispiel I
Clonierung und Charakterisierung der genomischen Tie-DNAs.
A. Genomisches Maus-Tie
Um die genomische Organisation des Maus-Tie-Gens zu charakterisieren, wurden etwa 3 × 10⁶ Plaques abgesucht. Die Plaques wurden von einer Ganbank erhalten, die aus der DNA von adulten SV129-Mäuseleberzellen (Clontech) gemacht wurde, wobei als Sonde ein Mäuse-1C1D-Fragment (Korhonen, et al., Blood., 80: 2548–2555, 1992) verwendet wurde, das die Homologie-Domänen des epidermalen Wachstumsfaktors codiert [GCVKDCPGCLHGGVCHDHDGCVCPPGFTGTRCEQACREGRFGQSCQEQCPGT AGCRGLTFCLPDPYGCSCGSGWRGSQCQEACAPDHFGADCRLQCQCQNGGTCD RFSGCVCPSGWHGVHCEKSDRIPQIL: SEQ ID NR: 3]. Drei getrennte Clone, SV1, SV2 und mTie, wurden dadurch erhalten und jeder wurde in pGEM 3Zf(+) (Promega) subcloniert und durch partielle Didesoxy-Kettenabbruchsequenzierung und Restriktionsenzym-Analyse charakterisiert. Eine schematische Struktur des Maus-Tie-Gens und seines Promotors ist in 1 gezeigt. In dieser Figur sind die Positionen von Introns durch Pfeile angegeben und ihre Längen sind angegeben. Restriktions-Kartierung, PCR und die Nucleotid-Sequenzanalyse zeigten, dass das Tie-Gen etwa 19 kb genomischer Basen umspannt. Tie wird durch 23 Exons codiert. Die unterschiedlichen strukturellen Domänen des extrazellulären Abschnitts sind entweder durch jeweils ein Exon codiert und umfassen die erste Immunglobulinähnliche Schleife, die Homologie-Domänen 1–3 des epidermalen Wachstumsfaktors und die Fibronectin-ähnlichen Domänen 2 und 3 oder durch zwei Exons, umfassend die zweite Immunglobulin-ähnliche Schleife und die erste Fibronectin-ähnliche Domäne. Die Transmembran-Region wird durch ein anderes Exon codiert; während die Tyrosinkinase-Domäne, die die Kinase-Insertion enthält, von acht Exons codiert wird, von denen das erste die benachbarte Membranregion codiert. Die Längen der Introns variieren von 80 bp bis zu 2,6 kb.
B. Genomisches menschliches Tie
Drei menschliche Tie-Clone wurden von einer menschlichen plazentalen genomischen DNA-Bank im EMBL-3-Vektor-System (Clontech) isoliert, wie in Partanen, et al., Mol. Cell. Biol., 12: 1698–1707 (1992), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, gezeigt. Um die menschlichen Tie-Clone zu erhalten, wurde ein PCR-Fragment, das die Tie-Signalsequenz codiert, von menschlicher Tie-cDNA unter Verwendung der Primer 5'-CCCACATGAGAAGCC-3' (SEQ ID NR: 4) und 5'-TGAGATCTTGGAGTATGGTCTGGCGGGTGCCC-3' (SEQ ID NR: 5) amplifiziert und verwendet, um die vorstehend erwähnte Bank zu sondieren. Der erhaltene positive Clon, der die längste Insertion enthielt, wurde plaque-gereinigt und ein SacI-Fragment von etwa 7 kb wurde in pGEM 3Zf(+) subcloniert und charakterisiert. Die erhaltene menschliche Tie-Promotorsequenz ist in 2 gezeigt. In dieser Figur sind die Transkriptions-Initiationsstellen mit einem Sternchen markiert (vgl. nachstehende Primerverlängerungs- und RNAse-Protektionsversuche). Die hierin erörterten Restriktions-Ensonuclease-Spaltungsstellen sind fett markiert.
Ein Vergleich der genomischen DNA-Sequenzen von Maus- und menschlichen Tie-Promotoren ist auch in 2 gezeigt. In dieser Figur erstreckt sich die Maus-Sequenz vom 3'-Ende des ersten Exons zur AflII-Stelle, die sich 821 bp stromaufwärts vom ATG-Codon befindet. Eine CA-Wiederholung, die nur in der Maus-Sequenz gefunden wurde, ist in 2 fett markiert.
Beispiel II
Bestimmung der Transkriptions-Initiationsstelle im menschlichen Tie-Gen
Für die Primer-Verlängerungsanalyse Tie-codierender Nucleinsäuren wurde der Primer gemäß der Anleitung des Herstellers (Promega, USA), markiert. Ein Aliquot von 10 pMol Primer wurde dann mit 10 × Vorwärts-Austauschpuffer (Promega), 10 μCi/ml [γ-³²P]-ATP und 10 U T4-Polynucleotidkinase bei 37°C eine Stunde inkubiert. Die Kinase wurde dann durch 2-minütiges Erhitzen bei 90°C inaktiviert und der markierte Primer wurde mit Ethanol präzipitiert.
Poly(A+)-RNA (20 μg) und 5 × 105 CpM markierter Primer wurden dann in Hybridisierungspuffer (40 mM PIPES, pH 6,4, 1 mM EDTA, pH 8,0, 0,4 M NaCl und 80% Formamid) durch 12-minütiges Erhitzen bei 95°C anneliert. Die Proben wurden dann langsam abgekühlt und mit Ethanol präzipitiert. Das erhaltene getrocknete Annelierungsgemisch wurde in Primer-Verlängerungspuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, jeweils 2 mM Desoxy-ATP, Desoxy-CTP, Desoxy-GTP und Desoxy-TTP, 0,5 mM Spermidin, pH 8,3, bei 42°C] suspendiert und 20 U RNAsin und 40 U reverse AMV-Transkriptase wurden zugesetzt. Nach 2 Stunden der Inkubation wurde Matrizen-RNA durch Zusetzen von 20 μg/ml RNAse A in 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4, 37°C 15 Minuten lang gespalten. Das erhaltene Gemisch wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde dann in Auftrags-Färbelösung (98% Formamid, 10 mM EDTA, 0,1% Xylen-Cyanol, 1% Bromphenolblau) resuspendiert und auf ein 9% Polyacrylamid/7M Harnstoffgel geladen. Nach der Elektrophorese wurden die getrockneten Gele 2 Tage lang einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die RNAse-Protektion wurde unter Verwendung von Maus-Antisense-RNA-Sonden von 291 bp und 239 bp durchgeführt, die aus linearisierten Plasmiden erzeugt wurden, die die Maus-Tie-Promotor-DNA-Insertionen AflII-BamHI mit 842 bp und HindIII-ApaI mit 1,1 kb enthielten. Die menschliche RNA-Sonde mit 568 bp wurde aus linearisiertem pGEM 3Zf(+)-Plasmid (Promega, USA) erzeugt, das eine menschliche AccI-AlwNI-Tie-Promotor-DNA-Insertion enthielt. Die Matrize für die andere menschliche RNA-Sonde mit 266 bp wurde durch PCR-Amplifikation aus dem AccI-AlwNI-Plasmid erzeugt. M13-Vorwärts- und Tie-2168-Primer (in 2 markiert) wurden für die Amplifikation verwendet. Die Sonden wurden unter Verwendung von T7-Polymerase und [γ-³²P]-UTP markiert. 10 μg PolyA(+)-RNA wurden mit markierter Sonde bei 50°C über Nacht inkubiert. Nicht-hybridisierte RNA wurde mit RNAse A (10 U/ml) und T1 (1 μg/ml) bei 37°C, pH 7,5 eine Stunde lange gespalten. Die RNAsen wurden 15 Minuten bei 37°C durch Proteinase K-Spaltung inaktiviert und die Proben wurden in 8% Sequenzierungsgelen analysiert.
Die Primerverlängerungs- und RNAse-Protektions-Produkte endeten in Maus- und menschlichen Tie-Promotoren an den Positionen 101 bp beziehungsweise 116 bp stromaufwärts des ATG-Codons (vgl. Sternchen in 2). Hefe-tRNA oder NIH 3T3-RNA zeigten keine spezifischen Banden. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt, worin die Sequenzen der oben aufgeführten Primer unterstrichen sind.
Beispiel III
Herstellung von Plasmiden
Tie-Promotor/Luciferase-Genkonstruktionen wurden durch Subclonierung des 5'-flankierenden genomischen AflII-ApaI-Fragments hergestellt, das stromaufwärts der ApaI-Restriktionsstelle im ersten Exon bis zu dem promotorlosen pGL2-Grundvektor (Stratagene) lokalisiert ist, wie durch deWet, et al., Mol. Cell. Biol., 7: 725–737 (1987), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben, was ein 0,73mTiepromGL2-Plasmid ergibt.
Für Versuche in transgenen Mäusen wurde das AflII-ApaI-Promotor-Fragment mit 788 bp (gezeigt in 2) mit stumpfem Ende in eine stumpf endende, einzigartige HindIII-Stelle im SDK-LacZ-Bluescript-Vektor (Stratagene) ligiert, wie in Logan, et al., Development, 117: 905–916 (1993), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben, was den 0,73mpromSDK-LacZ-Vektor ergibt. Ähnlich wurde das AlwNI-Fragment des menschlichen Tie-Promotors mit 5kb, gezeigt in 2, mit stumpfem Ende in denselben Vektor ligiert, was ein 5,0hTIEpromSDK-LacZ-Plasmid ergab, das bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 als Zugangsnummer 75893 hinterlegt ist.
Beispiel IV
DNA-Transfektion und Herstellung von Zelllysaten
15 μg des vorstehend beschriebenen 0,73mTiepromGL2-Plasmids wurden entweder in endotheliale Maus-LEII-Lungenzellen, die in Schrieber, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 6138–6142 (1985), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben sind, oder in MK-2-Zellen, die von Weissmann, et al., Cell, 32: 599–606 (1983), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben sind, transfiziert. Die Transfektion wurde unter Verwendung des modifizierten Calciumphosphatvermittelten Transfektionsverfahrens, von dem in Sambrook, et al., (Hrsg.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, durchgeführt. Die DNAs wurden mit 0,25 M CaCl₂ und einem gleichen Volumen von 50 mM N,N-bis(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure- gepufferte Kochsalzlösung gemischt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann tropfenweise auf wachsende einzellige Schichten zugesetzt.
Die entstehenden Kulturen wurden 12 Stunden inkubiert, wonach 5% Gylcerin in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 30 Sekunden zugesetzt wurde und unter zweimaligem Austauschen von PBS abgewaschen wurde. Dann wurde frisches Medium zugesetzt. Nach weiterer Inkubation über 24 Stunden wurden die Zellen in 0,5 ml Lysepuffer (25 mM Tris-PO₄, 2 mM Dithiothreit (DTT), 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan, N,N,N'N'-Tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X-100, pH7,8) lysiert. Die entstandenen Lysate wurden zentrifugiert und die Überstände wurden aufgefangen und bei 70°C gelagert, bevor sie weiter getestet wurden. Eine Normalisierung der Luciferase-Werte relativ zur Transfektions-Effizienz wurde durch Cotransfektion eines CMV-β-Gal-Vektors, beschrieben in MacGregor und Caskey, Nucl. Acids. Res., 17: 2365 (1989), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, erreicht.
Tests auf β-Galactosidase und Luciferase wurden auf transfizierten Zellen durchgeführt. Für den β-Galactosidase-Test wurden 30 ml des vorstehend beschriebenen Zelllysats in 33 ml o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (4 mg/ml) inkubiert, gelöst in 100 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5 über 30 Minuten bei 37°C. Die optische Dichte wurde bei 414 nm gemessen.
Luciferasetests wurden unter Verwendung eines FlyLight-Überwachungs-Kits (102-100, BioTools, Finnland) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz, 20 ml Zelllysat wurden in 100 ml Reaktionsgemisch inkubiert und ein Bio-Orbit 1253-Luminometer wurde verwendet, um die Lichtintensität zu bestimmen.
Die Aktivität des Tie-Promotors in gezüchteten Zellen wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Tie-Promotor-Luciferase-Konstruktionen gemessen. Die Tie-Promotor-Luciferase-Konstruktionen wurden entweder in LEII-Endothelzellen oder in MK-2-Epithelzellen transfiziert. Die Promotoraktivität wurde als das Verhältnis der Luciferase- zur β-Galactosidase-Aktivität bestimmt. Diese Aktivitäten wurden mit der Promotoraktivität des positiven Kontrollvektors RSV-luc (ATCC) verglichen.
Die Aktivität des 0,73mpromGL2-Plasmids im Verhältnis zu CMV-β-Gal, verwendet als ein konstitutiv exprimierter cotransfizierter Kontroll-Promotor, wird in 3 zusammen mit Werten für den stark exprimierten RSV-luc-Promotor gezeigt. Ein Maus-Tie-Promotor-Fragment von 460 bp wurde in umgekehrter Ausrichtung als negative Kontrolle (revers) verwendet. Wie in 3 gezeigt war der Tie-Promotor in LEII-Zellen stark aktiv, jedoch nicht in den Epithelzellen MK-2. Diese Ergebnisse zeigen an, dass der isolierte Tie-Promotor für vaskuläre Endothelzellen spezifisch ist und die Expression des Reporters in diesen Zellen im Vergleich zur Kontrolle wirksam fördert.
Beispiel V
Herstellung transgener Mäuse
Das Tie-enthaltende Transgen wurde durch Spaltung mit SalI von der Vektorsequenz getrennt, durch Elektrophorese durch ein Agarosegel gereinigt und durch Absorption auf Glaskügelchen (Gene Clean II, Bio 101 Inc., La Jolla, CA) nach den Anweisungen des Herstellers wieder gewonnen. Transgene Mäuse wurden durch das Standard-Microinjektionsverfahren hergestellt, von dem in Hogan et al., Manipulating the mouse embryo (Cold Spring Harbor, 1986), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, berichtet wird. Zygoten für Microinjektionen wurden von weiblichen superovulierten hybriden (BALB/c X DBA/2)-F1-Mäusen (CD2F1), die mit CD2F1-Männchen verpaart wurden, erhalten. Alternativ waren die Eier, die für die Injektion verwendet wurden, von zufällig gezüchteten superovulierten CD1-Weibchen. Nach der Mikroinjektion wurden die Zygoten im Ein- oder Zwei-Zellstadium in die Eileiter von pseudoträchtigen Ziehmüttern (CD2F1-Mäusen) überführt. Schwanz-Proben wurden von drei Wochen alten Mäusejungen genommen, und die DNA wurde von den Proben durch das Salz-Präzipitationsverfahren von Miller et al., Nucl. Acids. Res., 16: 1215 (1988), das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, isoliert. Die Polymerase-Kettenreaktion wurde verwendet, um die Gegenwart des Transgens unter Verwendung des Mäuse-Promotor-spezifischen Primers 5'-CTATTGAGAAGGTTTGGAGG3-3' [SEQ ID NR: 6], des lacZ-Vektor-Primers 5'-GCTCTAGAACTAGTGGATC-3' [SEQ ID NR: 7], des menschlichen Promotor-spezifischen Primers 5'-GAGACAGGGGATGGGAAAAA-3' [SEQ ID NR: 8] und des lacZ-Vektor-Primers, 5'-GAAGATCGCACTCCAGCCAG-3' [SEQ ID NR: 9] zu bestätigen, wobei ein Reaktionsgemisch verwendet wurde, das 200 ng DNA (Schwanz), 10 × Puffer (2mM MgCl₂), 250 nM Primer 2040, 250 nM Primer 1986, 0,2 mM dNTP-Gemisch, 0,02 U Dynazyme (Finnzymes, Finnland) und 50 ml destilliertes Wasser plus 50 ml Mineralöl (M-3516; Sigma, USA) umfasst. Das PCR-Programm bestand aus einem Heissstart bei 96°C über 2 Minuten, mit folgenden Zyklen: 96°C, 1 Minute, 50°C, 2 Minuten, 72°C, 3 Minuten, über 34 Zyklen, wobei der letzte Schritt 10 Minuten verzögert war.
Beispiel VI
Analyse von Tie-enthaltendem Gewebe
Ganze Maus-Embryonen wurden erhalten und auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Gewebe wurde in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) überführt und bei 4°C 20 Minuten bei leichtem Rühren inkubiert. Das Gewebe wurde dann mit PBS gewaschen und in frischem X-Gal-Reaktionsgemisch [1 mg/ml 4-Chlor-5-brom-3-indolyl-β-Galactosid, 4 mM K₄Fe(CN) 6 × 3 H2O, 2 mM MgCl₂ in PBS] bei 30°C 1 bis 2 Tage inkubiert. Dann wurden die Proben 5 Stunden in PBS gewaschen und für die Lagerung in 30% Saccharose überführt.
Die Proben wurden dann in Tissue Tek (Miles, USA) eingebettet und 15 μm-Schnitte wurden auf mit Silan behandelten Objektträgern geschnitten. Die Schnitte wurden 5 Minuten in 4% Paraformaldehyd nachfixiert und zweimal in PBS und einmal in destilliertem Wasser gewaschen. Kernechtrot wurde als Gegenfärbung aufgebracht.
Die Ergebnisse sind in den 5 und 6 bereitgestellt. Die 5A–5D zeigen die Expression des Maus-Tie-Promotors bei Maus-Embryonen 9,5 (5A und 5B) und 11,5 (5C und 5D) Tage post Coitum. Wie in den Figuren zu sehen, wird eine Aktivität des β-Galactosidase-Reportergens im sich entwickelnden Herzen (h), in branchialen Gefäßen (ba), der gepaarten dorsalen Aorta (da), der Dotter-Arterie (v), der Nabelarterie (u) und in Kapillaren von Embryonen 9,5 Tage post Coitum gefunden. Zwei Tage später (5C und 5D) wird ein ähnliches Muster beim Zusetzen einer Färbung im Mesonephros (m) und in den Venen der Leber (I) gefunden.
Die 6A bis 6F zeigen die Tie-Promotor-Aktivität bei Embryonen 9,5, 11,5, und 13,5 Tage post Coitum. Alle Endothelzellen der Herzregion sind gefärbt, was eine Expression unter Kontrolle des Promotors anzeigt. Eine Färbung wird in der Lunge beobachtet, jedoch sind die Bronchien negativ. Das Hirngewebe von 15,5 Tage alten Embryonen zeigt ebenfalls eine Färbung. 6D zeigt, dass der Promotor in den Venen der Leber exprimiert wird, und 6E zeigt eine Färbung in den sich entwickelnden Knochenbälkchen. Die sich entwickelnde Rinde der Niere zeigt eine Färbung, wobei die Expression in den Glomeruli am deutlichsten ist.
Um die Promotoraktivität während der Entwicklung zu untersuchen, wurden die 0,73mpromSDK-LacZ- und 5,0hpromSDK-LacZ-DNAs in befruchtete Mäuse- Eizellen injiziert. Sechs transgene Mäuse wurden erhalten, die transgenen Männchen wurden mit Wildtyp-NMRI-Weibchen verpaart, und die Nachkommen (86 auf das 735 bp-Fragment und 57 auf das 5,0 kb-Fragment) wurden am 7,5.–17,5. Tag der Entwicklung analysiert. Von den F1-Nachkommen waren 40% bei der LacZ-Färbung positiv, obwohl die Embryonen eine unterschiedliche Intensität der Färbungsreaktion zeigten. Keine Färbung wurde in Embryonen 7,5 Tage post Coitum beobachtet, wohingegen die Endothelzellen der dorsalen Aorta und des sich bildenden Herzens bei Embryonen 8,5 Tage post Coitum stark positiv waren. Bestimmte Zellen des Kopf-Mesenchyms, wahrscheinlich differenzierende Angioblasten, zeigten ein schwaches Signal, und die Gewebe außerhalb des Embryos wie die Allantois und der Dottersack enthielten positive Gefäße.
Die Komplexität des vaskulären Systems nimmt in dem sich entwickelnden Embryo schnell zu, und in Embryonen 9,5 Tage post Coitum wurde in den vorstehend erwähnten Gefäßen sowie in den Arterien zwischen den Ursegmenten eine Promotoraktivität beobachtet. Eine besonders intensive Färbung wurde in den sich entwickelnden Ventrikeln des Herzens beobachtet. Bei Embryonen 11,5 Tage post Coitum ist das Kapillarsystem gut entwickelt und deshalb war die Färbung, die mit großen Gefäßen des Embryos und dem Endocardium in Zusammenhang stand, durch das dichte Netzwerk aus blaugefärbten Kapillaren nur schwach zu unterscheiden. Die Details des vaskulären Systems wurden bei einer starken Vergrößerung von Geweben von Embryonen 11,5 und 15,5 Tage post Coitum besser sichtbar gemacht. Dieses Färbungsmuster entspricht dem Expressionsmuster, das bei der in situ-Hybridisierung erhalten wurde. Wie in den 4A und 4B gezeigt, zeigten das Endocardium des Herzens, die Venen und Arterien des Kopf-Mesenchyms ein LacZ-Signal. Keine signifikanten Unterschiede wurden in den Färbungsmustern gesehen, die mit Maus-Promotorfragmenten von 788 bp und menschlichen Promotorfragmenten von 5,0 kb erhalten wurden.
Um zu bestimmen, ob die Promotoraktivität des Maus-Fragments von 788 bp mit der Expression von Tie-mRNA in adulten Geweben korreliert, wurden verschiedene Gewebetypen, die von 8-Wochen alten transgenen Mäusen erhalten wurden, auf β-Galactosidase-Aktivität gefärbt. Wie in den 7A und 7B gezeigt, wurde eine intensive Färbung in der Lunge (7A) und im Knochenmark (in 7B als bm bezeichnet) beobachtet. 7B zeigt auch eine Färbung in Kapillaren, die mit Haarfollikeln in Verbindung stehen (durch den Pfeil in 7B bezeichnet). Eine leicht geringere Färbung wurde in den Nieren-Glomeruli (7C, bezeichnet als „g") und den Gefäßen, die die Tubuli umgeben (7C, bezeichnet durch die Pfeilspitze) beobachtet. 7D zeigt die Färbung im Endocardium. Weder große Lebergefäße (v in 7E), noch sinusoidale Kapillaren (nicht gezeigt) färbten sich in adulten Mäusen mit LacZ. Kleine Gefäße, die die Venen umgaben, färbten sich jedoch [Pfeile in 7(E)]. Wie in 7(F) gezeigt, wurden interstitielle Kapillaren des Gehirns gefärbt [Pfeilspitzen in 7(F)]. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn transgene Mäuse den menschlichen Tie-Promotor von 5 kb exprimierten.
Die vorliegende Erfindung wurde hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Entsprechend sollte die Erfindung nur durch das Ziel der angehängten Patentansprüche begrenzt sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Promotorsequenz für eine Maus-Tie-Rezeptor-Tyrosinkinase, wobei die Promotorsequenz eine Nucleinsäuresequenz wie in SEQ ID NR: 1 gezeigt umfasst.
Promotorsequenz für eine Maus Tie-Rezeptor-Tyrosinkinase, wobei die Promotorsequenz ein Teil der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz ist, welche die Expression einer Endothelzell-Rezeptor-Tyrosinkinase fördern kann.
Promotorsequenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Promotorsequenz die Transkription eines Markergens fördern kann, das für die Endothelzell-Markierung in eine transfizierte Endothelzelle nützlich ist.
Promotorsequenz nach Anspruch 1, wobei die Promotorsequenz eine Tie-Promotorinsertion umfasst, die das in 2 gezeigte AflII-ApaI-Fragment des Plasmids 0.73mTIEpromGL2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75892 ist.
Promotorsequenz nach Anspruch 4, wobei die Tie-Promotorinsertion die Transkription einer Protein-codierenden DNA zur Herstellung von Proteinen und Peptiden in Endothelzellen fördern kann, die als Antikoagulans oder Vasodilatator-Inhibitor bei Thrombose oder Restenose wirken.
Promotorsequenz für eine menschliche Tie-Rezeptor-Tyrosinkinase, wobei die Promotorsequenz eine in SEQ ID NR: 2 gezeigte Nucleinsäuresequenz umfasst.
Promotorsequenz für eine menschliche Tie-Rezeptor-Tyrosinkinase, wobei die Promotorsequenz ein Teil der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Nucleinsäuresequenz ist, welche die Expression einer Endothelzellen-Rezeptor-Tyrosinkinase fördern kann.
Promotorsequenz nach Anspruch 6, wobei die Promotorsequenz eine Tie-Promotorinsertion umfasst, welche das in 2 dargestellte 5kb-AlwNI-Fragment des menschlichen Tie-Promotors des Plasmids 5.0hTIEpromSDK-LacZ mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75893 ist.
Promotorsequenz nach Anspruch 8, wobei die Tie-Promotorinsertion die Transkription einer Protein-codierenden DNA zur Herstellung von Proteinen und Peptiden in Endothelzellen fördern kann, die als Antikoagulans oder Vasodilatator-Inhibitor bei Thrombose oder Restenose wirken.
Promotorsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Promotorsequenz die Transkription eines Antisense-RNA-Konstruktes fördern kann, zur Verwendung in Endothelzellen.
Promotorsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Promotorsequenz die Transkription eines β-Galactosidase-Reportergens in Endothelzellen vom Mausgewebe fördern kann.
Promotorsequenz nach Anspruch 10, wobei die Promotorsequenz ein Promotor für eine menschliche Tie-Rezeptor-Tyrosinkinase ist.
Vektor, der eine isolierte und gereinigte Promotorsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.
Vektor 0.73mTIEpromGL2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75892.
Vektor 5.0hTIEpromSDK-LacZ mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75893.
Wirtszelle, die mit einer Promotorsequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 12 transfiziert ist.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 15 transfiziert ist.