JPH10506011A - レセプターチロシンキナーゼ、ｔｉｅのプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願は、内皮細胞レセプターチロシンキナーゼであるＴｉｅのプロモーター配列、および治療および診断でのその使用、並びに血中および組織中でのタンパク質の産生を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 レセプターチロシンキナーゼ、ＴＩＥのプロモーター 発明の分野 本発明は、一般にレセプターチロシンキナーゼおよびそのプロモーターに関す る。 発明の背景 循環器系は、発生途上の胚において分化する最初の器官系である。Kaufman,マ ウス発生図解(The Atlas of Mouse Development)，Academic Press，（１９９２ 年）。胚および卵黄嚢血管系は、８．５日ｐ．ｃ．でマウス胚を形成し、１日後 には心臓が規則的に脈動して原始血液細胞、栄養物および代謝排泄物を循環する 。血管を覆っている内皮細胞は、血液と胚の他の組織との間に障壁を設けている 。器官が分化し、その特定の機能を果たし始めると、内皮細胞の表現系異質性が 増加する。例えば、腎臓、脳および肝臓には、それぞれ有窓性血管、接着結合を 有する無窓性血管、および洞様毛細血管が見られる。また、内皮細胞は、分化し た組織において特定の機能を果たす。例えば、これらの細胞は、血液細胞の流れ (blood cell traficking)、血液凝固、鬱血、排卵、創傷治癒、アテローム性動 脈硬化症、および腫瘍の転移に伴う脈管形成のような幾つかの生化学的および生 理学的事象に関与している。 少なくとも５種類のレセプターチロシンキナーゼ遺伝子が、内皮細胞で発現す る。これらの内、ＦＬＴ１、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１およびＦＬＴ４遺伝子のタンパ ク質生成物は、レセプターチロシンキナーゼサブクラスIII に属し、Ｔｉｅおよ びその密接に関連したＴｅｋ（Ｔｉｅ−２）はそれ自身の新規なサブクラスを形 成する(Terman et al.,Oncogene，6:1677-1683,1991，Terman et al.，Biochem ． Biophys．Res．Comm.，187：1579-1586，1992，Aprelikova，et al.，Cancer Re s.，52: 746-748，1992，De Vries，et al.，Science，255: 989-991，1992，Pa jusola，et al.,Cancer Res.,52:5738-5742，1992，Sarzani，et al.,Biochem． Biophys．Res．Comm.，186: 796-714，1992，Galland，et al.，Oncogene，8: 1 233-1240，1993，Millauer et al.，Cell，72: 835-846，1993，Oelrichs，et a l.，Oncogene，8: 11-18，1993，Schnurch and Risau，Development，119:957- 968，1993)。ヒトおよびマウスＴｉｅ ｃＤＮＡはいずれもクローニングが行わ れている(Partanen，et al.，Mol．Cel．Biol.，12：1698-1707，1992，Korhone n，et al.，Blood，80: 2548-2555，1992，Korhonen，et al.，Oncogene，8: 39 5-403，1994，Iwama，et al.，Biochem．Biophys．Res．Comm.，195:301-309，1 993，Sato，et al.,Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，90: 9355-9358,1993)。Ｔｉ ｅおよび相同遺伝子は、ウシおよびラット供給源から単離されている(Maisonpie rre，et al.，Oncogene，8: 1631-1637，1993，Sato，et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA.，90: 9355-9358，1993)。マウスＴｉｅ、およびマウスおよびヒト Ｔｉｅプロモーター領域のゲノムクローンは、クローニングされて、特性決定さ れている。 ４．４ｋｂ Ｔｉｅ−コードｍＲＮＡは、Ｎ−グリコシル化されている１２５ ｋＤａのトランスメンブランタンパク質をコードする。その細胞外ドメインでは 、Ｔｉｅは、２個の免疫グロブリン様ループ、および表皮成長因子およびフィブ ロネクチンIII 型相同領域を有し、更に、短キナーゼインサート配列およびカル ボキシル末端尾によって裂かれているチロシンキナーゼドメインに接続したトラ ンスメンブランおよびジャクスタメンブランドメインを有する(Partanen，et al .，Mol．Cel．Biol.，12: 1698-1707，1992，Korhonen et al.，Oncogene，8: 3 95-403，1994，Sato et al.，Proc．Natl．Acad．USA.，90: 9355-9358，1993) 。ＴｉｅおよびＴＥＫはいずれも、マウス染色体４に対して互いに１２．２ｃｍ の 距離に局在化されている。このようなレセプターは、胚発生の際に各種の血管の 内皮細胞で均一に発現するが、Ｔｅｋ ｍＲＮＡの発現は、Ｔｉｅの発現より０ ．５日早く始まると思われる。成体マウスでは、Ｔｉｅ ｍＲＮＡの発現は肺の 血管で持続しているが、心臓および脳では減少すると思われる(Korhonen，et al .，Oncogene，8: 395-403(1994)。Ｔｉｅ ｍＲＮＡの産生は、排卵および創傷 の治癒の際およびヒト膠芽細胞腫では増大する(Korhonen，et al.，Blood，80: 2548-2555，1992)。 内皮細胞は、内皮細胞および血管が関わる疾患に対する遺伝子治療において、 新生血管形成の確立または脈管形成の抑制、および白血球の炎症伝達の制御のよ うな重要な役割を果たす。血管系疾患の治療の一つの方法は、この疾患をin sit u で改善することができる循環における特定の部位で遺伝子を発現することであ る。内皮細胞は疾患部位に見いだされているため、それらは抗凝固薬、血管拡張 薬、脈管形成または成長因子などの治療薬を運ぶ論理的キャリヤーと同等である 。従って、内皮細胞の遺伝学的修飾は、高血圧、アテローム性動脈硬化症および 再狭窄のような多くの血管障害の治療を目的とする治療法である。例えば、成長 抑制タンパク質を発現する内皮細胞を、カテーテルを介して血管形成部位に導入 して、局部的な内膜過形成および臨床的再狭窄を防止することができる。血管移 植片の管腔表面も、遺伝学的に修飾した内皮細胞でライニングして、血栓症を防 止しまたはリポピュレーション(repopulation)を促進する治療タンパク質を産生 することもできる(Nabel，et al.，J．Am．Coll．Cardiol.，17，189B-194B，19 91)。 血管をライニングする内皮細胞は、リポソーム、アデノウイルスベクターおよ びレトロウイルスベクターを用いる方法によって容易にトランスフェクションさ れる(Nabel，et al.，J．Am．Coll．Cardiol.，17，189B-194B)。内皮細胞も血 液と血液と直接接触するので、所望なタンパク質またはペプチドを血流中に産生 して分泌する最適な供給源である。例えば、ファクターVIII遺伝子が十分な量で 発現されるならば、このタンパク質を内皮細胞特異性プロモーターの下で内皮細 胞に導入して、血友病を修正することができる。一方、内皮細胞は、その中で発 現したペプチドまたはタンパク質を組織中に運ぶのにも用いられる。これに関し ては、血管管腔に面している細胞表面積のほとんどが微細血管の内皮細胞から成 ると仮定すれば、微細血管系（毛細血管）の内皮細胞で特定の遺伝子制御要素が 選択的に発現することが極めて有用である。 内皮細胞特異性プロモーターの制御要素は、当該技術分野で標準的な方法に従 って、機能的要素および単位に更に細分して、分析することができる。Ｔｉｅタ ンパク質は、ある種の内皮細胞およびヒト骨髄細胞の約０．９％で発現する。従 って、Ｔｉｅプロモーターは、幾つかの増血細胞でも活性であると思われる。し かしながら、増血細胞でのＴｉｅプロモーターの発現は、内皮細胞特異性要素と は識別される要素によって制御することができ、プロモーターの内皮細胞特異性 を保持したまま分離することができる。 本発明は、治療および診断手続きに用いられるＴｉｅレセプターチロシンキナ ーゼをコードする遺伝子に関連した新規プロモーターを提供する。また、このプ ロモーターは、動物の血液または組織に対して所望なタンパク質の産生に用いら れることがある。 発明の概要 本発明は、一般にレセプターチロシンキナーゼＴｉｅのプロモーター配列に関 する。本発明の好ましい態様では、配列番号１に示される配列を有するマウスＴ ｉｅプロモーターが提供される。また、好ましい態様では、配列番号２に示され る配列を有するヒトＴｉｅプロモーターが提供される。本発明によるプロモータ ーは、内皮細胞レセプターチロシンキナーゼ、特にレセプターチロシンキナーゼ 、Ｔｉｅの発現を行う。 本発明によるベクターは、本発明によるプロモーターを取り込むのに好適な任 意のベクターでよく、１９９４年９月２０日にアメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション(American Type Culture Collection)、１２３０１パークローン ・ドライブ、ロックビル、メリーランド州２０８５２、に登録番号７５８９２と して寄託された5.0hpromSDKLacZ ベクターであるのが好ましい。本発明による宿 主細胞は、本発明によるプロモーターまたはこのプロモーターを含むベクターを 収容することができる任意の宿主細胞でよい。本発明による宿主細胞の例は、Ｌ ＥＩＩ内皮細胞である。 本発明の他の利点および用途は、下記の本発明の詳細な説明を考察することに よって明らかになるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は、マウスプロモーター遺伝子およびプロモーターの模式図である。 第２図は、マウスおよびヒトＴｉｅプロモーター配列を比較したものである。 第３図は、Ｔｉｅプロモーター活性の分析結果を示す。 第４Ａ図は、８．５日目のマウス胚の発生途上の心内膜および頭部間葉(head mesenchyme)におけるＴｉｅプロモーターの発現パターンを示す。 第４Ｂ図は、８．５日目の胚の卵黄嚢血島におけるマウスＴｉｅプロモーター 構築物の発現を示す。 第５Ａおよび５Ｂ図は、９．５日目の胚におけるマウスＴｉｅプロモーターの 発現パターンを示す。 第５Ｃおよび５Ｄ図は、１１．５日目の胚におけるマウスＴｉｅプロモーター の発現パターンを示す。 第６Ａ図は、９．５日目の胚心組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示す 。 第６Ｂ図は、１１．５日目の胚肺組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第６Ｃ図は、１５．５日目の肺脳組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第６Ｄ図は、１５．５日目の胚肝組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第６Ｅ図は、発生途上の海綿質におけるＴｉｅプロモーターの発現を示す。 第６Ｆ図は、発生途上の腎組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示す。 第７Ａ図は、８週齢のマウスにおける肺の肺胞間毛細血管におけるＴｉｅプロ モーターの発現を示す。 第７Ｂ図は、８週齢のマウスにおける骨髄の内皮網様構造におけるＴｉｅプロ モーターの発現を示す。 第７Ｃ図は、８週齢のマウスの腎組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第７Ｄ図は、８週齢のマウスの心組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第７Ｅ図は、８週齢のマウスの肝組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 第７Ｆ図は、８週齢のマウスの脳組織におけるＴｉｅプロモーターの発現を示 す。 発明の詳細な説明 本発明は、内皮細胞における組換えＤＮＡ配列の発現を指示することができる プロモーター配列を提供する。特に、本発明は、マウス組織の内皮細胞における β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子の発現を指示するプロモーター配列、内 皮細胞、血液および組織中への抗凝固薬、血栓または再狭窄の血管拡張薬抑制薬 として作用するタンパク質およびペプチドの生産のためのプロモーター、を提供 する。本発明によるプロモーターは、ヒトの遺伝子治療用のタンパク質およびペ プチド、内皮細胞標識に用いられる抗原およびマーカー、およびイン・ビボおよ びイン・ビトロに内皮細胞に用いられるアンチセンスＲＮＡ構築物の発現を指示 するのに有用である。本発明によるプロモーター、ベクターおよび宿主細胞は、 各種の成長因子またはレセプターまたはそのドメインの発現を促進するための遺 伝子治療にも用いられる。更に、本発明によるプロモーターの類似物は、例えば 腫瘍形成の際の脈管形成の阻害のような好ましくない内皮細胞増殖を抑制するの に有用である。 実施例Ｉ ゲノムＴｉｅ ＤＮＡのクローニングおよび特性決定 Ａ． マウスゲノムＴｉｅ マウスゲノムＴｉｅ遺伝子のゲノム構成を特性決定するため、３×１０⁶個の プラークをスクリーニングした。これらのプラークは、表皮成長因子ホモロジー ドメインをコードするマウス１ＣＩＤ ｃＤＮＡ断片(Korhonen，et al.，Blood .，80: 2548-2555，1992)［ＧＣＶＫＤＣＰＧＣＬＨＧＧＶＣＨＤＨＤＧＣＶＣ ＰＰＧＦＴＧＴＲＣＥＱＡＣＲＥＧＲＦＧＱＳＣＱＥＱＣＰＧＴＡＧＣＲＧＬＴ ＦＣＬＰＤＰＹＧＣＳＣＧＳＧＷＲＧＳＱＣＱＥＡＣＡＰＤＨＦＧＡＤＣＲＬＱ ＣＱＣＱＮＧＧＴＣＤＲＦＳＧＣＶＣＰＳＧＷＨＧＶＨＣＥＫＳＤＲＩＰＱＩＬ ：配列番号３］をプローブとして用いて成体ＳＶ１２９マウス肝細胞(Clontech) のＤＮＡから作成したゲノムライブラリーから得た。３種類の個別のクローン、 ＳＶ１、ＳＶ２およびｍＴｉｅをこれによって得て、それぞれをｐＧＥＭ ３Ｚ ｆ（＋）(Promega)にサブクローニングし、部分ジデオキシ鎖末端配列決定およ び制限酵素分析によって特性決定した。マウスＴｉｅ遺伝子およびそのプロモー ターの模式的構造を、第１図に示す。この図において、イントロンの位置を矢印 で示して、それらの長さを示している。制限マッピング、ＰＣＲ、およびヌクレ オチド配列分析により、Ｔｉｅ遺伝子が約１９ｋｂのゲノムＤＮＡであることを 示 した。Ｔｉｅを２３個のエキソンによってコードした。細胞外部分の別の構造ド メインは、それぞれ第一の免疫グロブリン様ループ、表皮成長因子ホモロジード メイン１−３、およびフィブロネクチン様ドメイン２および３を含んでなる１個 のエキソンによってコードするか、または第二の免疫グロブリン様ループおよび 第一のフィブロネクチン様ドメインを含んでなる２個のエキソンによってコード する。トランスメンブラン領域は別個のエキソンによってコードされ、キナーゼ インサートを含むチロシンキナーゼドメインは、第一のエキソンがジャクスタメ ンブラン領域をコードする８個のエキソンによってコードされる。イントロンの 長さは、８０ｂｐから２．６ｋｂまで変動する。 Ｂ． ヒトゲノムＴｉｅ ３種類のヒトＴｉｅクローンを、Partanen，et al.，Mol．Cell．Biol.，12: 1698-1707(1992)（この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用さ れる）に示されるように、ＥＭＢＬ−３ベクター系(Clontech)におけるヒト胎盤 ｃＤＮＡライブラリーから単離した。これらのヒトＴｉｅクローンを得るため、 Ｔｉｅシグナル配列をコードＰＣＲ断片をプライマー、５′−ＣＣＣＡＣＡＴＧ ＡＧＡＡＧＣＣ−３′（配列番号４）および５′−ＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＧＡＧ ＴＡＴＧＧＴＣＴＧＧＣＧＧＧＴＧＣＣＣ−３′（配列番号５）、を用いてヒト Ｔｉｅ ｃＤＮＡから増幅して、上記ライブラリーをプローブするのに用いた。 最長のインサートを含む生成するポジティブクローンをプラーク精製し、約７ｋ ｂのＳａｃＩ断片をｐＧＥＭ ３Ｚｆ（＋）でサブクローニングして、特性決定 した。生成するヒトＴｉｅプロモーター配列を、第２図に示す。この図において 、転写開始部位は、星印を付けている（下記のプライマー拡張およびＲＮアーゼ 保護実験を参照されたい）。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位は、太線で示され る。 マウスおよびヒトＴｉｅプロモーターのゲノムＤＮＡ配列の比較も、第２図に 示す。この図において、マウス配列は、第一のエキソンの３′末端からＡＴＧコ ドンの約７７２ｂｐ上流のＡｆＩＩＩ部位まで伸張している。マウス配列におい てのみ見られるＣＡ反復は、第２図において太線で強調している。 実施例II ヒトＴｉｅ遺伝子における転写開始部位の決定 Ｔｉｅコード核酸のプライマー伸張分析のため、プライマーを製造業者の指示 に従って標識した(Promega、米国)。次いで、１０ピコモルのプライマーの一部 を、１０×フォワード交換緩衝液(forward exchange buffer)（Promega）、１０ ｍＣｉ／ｍｌの［ｇ−３２ｐ］−ＡＴＰ、および１０単位のＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼと共に３７℃で１時間インキュベーションした。次に、キナーゼを９ ０℃で２分間加熱することによって不活性化し、標識したプライマーをエタノー ル沈澱した。 次に、ポリ（Ａ＋）ＲＮＡ（２０ｍｇ）および５×１０⁵ｃｐｍの標識プライ マーを、ハイブリダイゼーション緩衝液（４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、 １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、０．４Ｍ ＮａＣｌおよびホルムアミド）中で ９５℃で１２分間加熱することによってアニールした。次いで、試料を徐冷して 、エタノール沈澱を行った。生成する乾燥したアニーリング混合物をプライマー 伸張緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂、１０ｍＭ ＤＴＴ、デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシＧＴＰ およびデオキシＴＴＰをそれぞれ２ｍＭ、０．５ｍＭスペルミジン、ｐＨ８．３ 、４２℃）に懸濁し、２０単位のＲＮＡｓｉｎおよび４０単位のＡＭＶ逆転写酵 素を加えた。２時間インキュベーションを行った後、鋳型ＲＮＡを１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、３７ ℃に２０ｍｇ／ｍｌＲＮアーゼＡを添加して１５分間消化した。生成する混合物 をフェノール抽出して、エタノール沈澱を行った。次いで、ペレットを負荷染料 （９８％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％キシレンシアノール、１ ％ブロモフェノールブルー）に再懸濁し、９％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素ゲ ルに加えた。電気泳動の後、乾燥したゲルをＸ線フィルムに２日間暴露した。 ＲＮアーゼ保護は、７５４ｂｐのＡｆＩＩＩ−ＢａｍＨＩおよび１．１ｋｂの ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩマウスＴｉｅプロモーターＤＮＡインサートを含む線 形化したプラスミドから生成した２９１ｂｐおよび２３９ｂｐのマウスＲＮＡア ンチセンスプローブを用いて行った。５６８ｂｐのヒトＲＮＡプローブは、Ａｃ ｃＩ−ＡｌｗＮＩヒトＴｉｅプロモーターＤＮＡインサートを含む線状化したｐ ＧＥＭ ３Ｚｆ（＋）プラスミドから生成させた。他のヒトの２６６ｂｐＲＮＡ プローブの鋳型は、ＡｃｃＩ−ＡｌｗＮＩプラスミドからＰＣＲ増幅によって得 た。Ｍ１３ＦｏｒｗａｒｄおよびＴｉｅ２１６８プライマー（第２図において印 をつけたもの）を、増幅に用いた。これらのプローブは、Ｔ７ポリメラーゼおよ び［ｇ−３２Ｐ］−ＵＴＰを用いて標識した。ポリＡ（＋）ＲＮＡ、１０ｇを、 標識したプローブと共に５０℃で一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼ ーションしていないＲＮＡを、ＲＮアーゼＡ（１０単位／ｍｌ）およびＴ１（１ ｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃、ｐＨ７．５で１時間消化した。ＲＮアーゼを３７ ℃でプロテイナーゼＫで１５分間消化することによって不活性化し、試料を８％ 配列決定ゲル中で分析した。 プライマー伸張およびＲＮアーゼ保護生成物は、マウスおよびヒトＴｉｅプロ モーターでは、それぞれＡＴＧコドンから１０１ｂｐおよび１１６ｂｐ上流の位 置で終止した（第２図の星印を参照されたい）。酵母ｔＲＮＡおよびＮＩＨ３Ｔ ３ ＲＮＡは、特異的なバンドを示さなかった。結果を第２図に示し、上記のプ ライマーの配列に下線を付している。 実施例III プラスミドの構築 Ｔｉｅプロモーター／ルシフェラーゼ遺伝子構築物は、deWet，et al.，Mol． Cell．Biol.，7: 725-737(1987)（この文献の内容は、その開示の一部として本 明細書に引用される）によって記載されたプロモーターレス塩基性ｐＧＬ２ベク ター(Stratagene)に対して第一のエキソンにおけるＡｐａＩ制限部位の上流に配 置された５′隣接７３５ｂｐゲノムＡｆＩＩＩ−ＡｐａＩ断片をサブクローニン グすることによって得て、プラスミド０．７３ｍｐｒｏｍＧＬ２を生じた。 トランスジェニックマウスでの実験のため、７３５ｂｐのＡｆＩＩＩ−Ａｐａ Ｉプロモーター断片（第２図に示した）をLogan，et al.，Development，117: 9 05-916(1993)（この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される ）に記載の方法でＳＤＫ−ＬａｃＺ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの平滑化し たユニークＨｉｎｄＩＩＩ部位に平滑末端連結し、ベクター０．７３ｍｒｏｍＳ ＤＫ−ＬａｃＺを生成した。同様に、第２図に示したヒトＴｉｅプロモーターの ５ｋｂのＡｌｗＮＩ断片を同じベクター中に平滑末端連結して、プラスミド５． ０ｈＴＩＥｐｒｏｍＳＤＫ−ＬａｃＺを生成し、アメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクシヨン(American Type Culture Collection)、１２３０１パークロー ン・ドライブ、ロックビル、メリーランド州２０８５２、に登録番号７５８９３ として寄託した。 実施例ＩＶ ＤＮＡトランスフェクションおよび細胞溶解物の製造 上記の０．７３ｍｐｒｏｍＧＬ２プラスミド１５μｇを、Schrieber，et al. ，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，82: 6138-6142（1985）（上記文献の内容は 、その開示の一部として本明細書に引用される）に記載のＬＥ ＩＩマウス肺内 皮細胞またはWeissman，et al.，Cell，32: 599-606(1983)（上記文献の内容は 、その開示の一部として本明細書に引用される）に記載のＭＫ−２細胞にトラン スフェクションした。トランスフェクションは、Sambrook，et al.（監修），「 分子クローニング：実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」（ １ ９８９年）（上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される） に記載の改良リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション法を用 いて行った。ＤＮＡを、０．２５Ｍ ＣａＣｌ₂および等容の５０ｍＭ Ｎ，Ｎ −ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸で緩衝した塩水 と混合した。コンデンサーを室温で１５分間インキュベーションした後、成長細 胞の単層に滴加した。 生成する培養物を１２時間インキュベーションした後、５％グリセロール／Ｐ ＢＳ（リン酸緩衝塩水）を３０秒間加えて、ＰＢＳを２回代えて洗浄した。次に 、新鮮な培地を加えた。更に２４時間インキュベーションした後、細胞を０．５ ｍｌリーシス緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＰＯ４、２ｍＭジチオトレイトール （ＤＴＴ）、２ｍＭ １，２−ジアミノ−シクロヘキサン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′ −四酢酸、１０％グリセロール、１％Triton X-100、ｐＨ７．８）で溶解した。 生成する溶解物を遠心分離して、上清を集め、更に分析を行うまで７０℃で保存 した。トランスフェクション効率に対するルシフェラーゼ値の規格化は、MacGre gor およびCaskey，Nucl．Acids．Res.，17: 2365(1989)（上記文献の内容は、 その開示の一部として本明細書に引用される）に記載のＣＭＶ−ｂ−ＧＡＬベク ターの同時トランスフェクションによって行った。 β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼの分析は、トランスフェクション した細胞で行った。β−ガラクトシダーゼ分析のため、上記細胞溶解物３０ｍｌ を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（４ｍｇ／ｍｌ）を０． １Ｍリン酸ナトリウム１００ｍｌに溶解したもの、ｐＨ７．５、３３ｍｌ中で、 ３７℃で３０分間インキュベーションした。４１４ｎｍでの光学密度を測定した 。 ルシフェラーゼ分析は、FlyLightモニターキット（102-100、BioTools、フィ ンランド）を用いて、製造業者のプロトコールに従って行った。簡単には、細胞 溶解物２０ｍｌを１００ｍｌ反応混合物中でインキュベーションし、Bio-Orbit1 253ルミノメーターを用いて光強度を測定した。 培養細胞中のＴｉｅプロモーターの活性は、上記のＴｉｅプロモーター−ルシ フェラーゼ構築物を用いて測定した。Ｔｉｅプロモーター−ルシフェラーゼ構築 物を、ＬＥＩＩ内皮細胞またはＭＫ−２表皮細胞にトランスフェクションした。 プロモーター活性は、ルシフェラーゼ対β−ガラクトシダーゼ活性の比として測 定した。これらの活性を、ポジティブコントロールベクターＰＳＶ−ｌｕｃ（Ａ ＴＣＣ）のプロモーター活性と比較した。 本質的に発現した同時トランスフェクションしたコントロールプロモーターと して用いたＣＭＶ−ｂ−ｇａｌに対する０．７３ｍｐｒｏｍＧＬ２プラスミド（ ７３５）の活性を、高度に発現したＲＳＶ−ｌｕｃプロモーターについての値と 共に第３図に示す。４６０ｂｐマウスＴｉｅプロモーター断片を、ネガティブコ ントロール（リバース）として逆の方向で用いた。第３図に示されるように、Ｔ ｉｅプロモーターはＬＥＩＩ細胞では高活性を示したが、表皮細胞ＭＫ−２では 活性を示さなかった。これらの結果は、単離したＴｉｅプロモーターが血管内皮 細胞に特異的であり、コントロールと比較してこれらの細胞中でリポーターの発 現を効率的に促進することを示唆している。 実施例Ｖ トランスジェニックマウスの産生 Ｔｉｅを含むトランスジーンを、ＳａｌＩで消化することによってベクター配 列から分離し、アガロースゲルで電気泳動により精製し、ガラスビーズ(Gene Cl ean II，Bio 101 Inc.，ラ・ヨラ、カリフォルニア)上で製造業者の指示に従っ て吸収することによって回収した。トランスジェニックマウスは、Hogan，et al .,マウス胚の操作(Manipulating the mouse embryo)（Cold Spring Harbor，１ ９８６年）（上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される） に記載の標準的微量注入法よって産生した。微量注入の接合体は、ＣＤ２Ｆ１雄 マウスと交尾した過剰排卵した（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ ＤＢＡ／２）Ｆ１ハイブリ ッド雌マウス（ＣＤ２Ｆ１）から得た。或いは、注入に用いた卵は、無作為に飼 育した過剰排卵したＣＤ１雌からのものであった。微量注入の後、接合体を１ま たは２細胞段階で、偽妊娠した里親母体（ＣＤ２Ｆ１マウス）の卵管に移した。 尾試料を３週齢の子マウスから採取し、ＤＮＡをMiller，et al.，Nucl．Acids Res.，16: 1215（1988）（上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に 引用される）の塩沈殿法によってこの試料から単離した。ポリメラーゼ連鎖反応 を用いて、２００ｎｇＤＮＡ（尾）、１０×緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）、２ ５０ｎＭ Primer 2040、２５０ｎＭ Primer 1986、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 、０．０２単位Dynazyme（Finnzymes、フィンランド）および５０ｍｌ蒸留水に ５０ｍｌ鉱油(M-3516、Sigma、米国)を含んでなる反応混合物を用いて、マウス プロモーター特異プライマー、５′−ＣＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧ Ｇ３−３′［配列番号６］；ｌａｃＺベクタープライマー、５′−ＧＣＴＣＴＡ ＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣ−３′［配列番号７］；ヒトプロモーター特異プラ イマー、５′−ＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡ−３′［配列番号８ ］；およびｌａｃＺベクタープライマー、５′−ＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＣＴＣＣ ＡＧＣＣＡＧ−３′［配列番号９］を用いて、トランスジーンの発現を確認した 。PCR Program は、９６℃での２分間の高温で開始し、９６℃１分、５０℃２分 、７２℃３分のサイクルで３４回行い、最後の段階は１０分間かけることからな った。 実施例VI Ｔｉｅを含む組織の分析 全マウス胚を得て、β−ガラクトシダーゼ活性を調べるため染色した。組織を ４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に移し、緩やかに攪拌しなが ら４℃で２０分間インキュベーションした。次いで、組織をＰＢＳで洗浄し、新 鮮なＸ−Ｇａｌ反応混合物［１ｍｇ／ｍｌ ４−クロロ−５−ブロモ−３−イン ドリル−β−ガラクトシド、４ｍＭ Ｋ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆×３Ｈ₂Ｏ、２ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂／ＰＢＳ］中で３０℃で１〜２日間インキュベーションした。次いで、 試料をＰＢＳ中で５時間洗浄し、３０％スクロースに移して、保存した。 次に、試料をTissue Tek（Miles、米国）に埋設して、シラン処理したスライ ド上で１５μｍ切片に切断した。切片を４％パラホルムアルデヒド中で５分間後 固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、蒸留水で１回洗浄した。核ファースト・レッドを あ、後染色として適用した。 結果を第５および６図に示す。第５Ａ〜５Ｄ図は、性交後９．５（第５Ａおよ び５Ｂ図）および１１．５（第５Ｃおよび５Ｄ図）日マウス胚におけるマウスＴ ｉｅプロモーターの発現を示す。図に示されるように、β−ガラクトシダーゼリ ポーター遺伝子の活性が、性交後９．５日胚の発生途上の心臓（ｈ）、エラ管(b ranchial vessels)（ｂａ）、背側大動脈（ｄａ）、卵黄動脈（ｖ）、臍動脈（ ｕ）および毛細血管（ｃ）に見られた。２日後（第５Ｃおよび５Ｄ図）に、同様 なパターンが、染色を添加することにより中腎（ｍ）および肝臓（ｌ）の静脈で も見られる。 第６Ａ〜６Ｆ図は、性交後９．５、１１．５および１３．５日胚でのＴｉｅプ ロモーター活性を示す。心臓領域の総ての内皮細胞を染色すると、プロモーター の制御下での発現が認められる。染色は肺で見られるが、気管支では陰性である 。第６Ｄ図は、プロモーターが肝臓の静脈で発現することを示しており、第６Ｅ 図は、発生途上の海綿質での染色を示している。腎臓の発生途上皮質は染色を示 しており、発現は糸球体で最も顕著である。 発生中のプロモーター活性を検討するため、０．７３ｍｐｒｏｍＳＤＫ−Ｌａ ｃＺおよび５．０ｈｐｒｏｍＳＤＫ−ＬａｃＺ ＤＮＡを、受精したマウス卵母 細胞に注入した。６匹のトランスジェニックマウスを得て、トランスジェニック 雄を野生型ＮＭＲＩ雌と交尾させ、子マウス（７３５ｂｐ断片に対して８６およ び５．０ｋｂ断片に対して５７）を発生の７．５〜１７．５日目に分析した。Ｆ １子孫の内、４０％はＬａｃＺ染色で陽性であったが、胚は反応色の強度に変動 を示した。性交後７．５日胚では染色は見られなかったが、性交後８．５日胚で は、背側大動脈および形成途上の心臓の内皮細胞は陽性が強かった。頭間葉のあ る種の細胞、恐らくは分化途上の血管芽細胞は微かな徴候を示し、胚外組織、例 えば尿膜、卵黄嚢は、陽性血管を含んでいた。 血管系の複雑さは発生途上の胚で急速に増加し、性交後９．５日胚では、プロ モーター活性は上記血管並びに体節間動脈(intersomitic arteries)で見られた 。特に強い染色は、発生途上の心室で見られた。性交後１１．５日胚では、毛細 血管系が十分に発達しているので、胚および心内膜の大型血管に関する染色は、 青色に染色した毛再血管の密集した網状組織によって極めて微かに見分けられた だけであった。血管系の詳細は、性交後１１．５日および１５．５日胚の組織の 高倍率で一層良好に認められた。この染色パターンは、in situでのハイブリダ イゼーションで得られる発現パターンに相当する。第４Ａおよび４Ｂ図に示され るように、心臓の内膜、頭間葉の静脈および動脈は、ＬａｃＺシグナルを示した 。マウス７５３ｂｐおよびヒト５．０ｋｂプロモーター断片で得られた染色パタ ーンでは、有意差は見られなかった。 ７３５ｂｐマウス断片のプロモーター活性が成体組織のＴｉｅ ｍＲＮＡの発 現と相関するかどうかを決定するため、８週齢のトランスジェニックマウスから 得た各種の組織をβ−ガラクトシダーゼ活性について染色した。第７Ａおよび７ Ｂ図に示されるように、強い染色が肺（第７Ａ図）および骨髄（第７Ｂ図でｂｍ と表示）で認められた。第７Ｂ図は、毛包（第７Ｂ図で矢印により表示）に関す る毛細血管での染色も示している。若干弱い染色は腎糸球体（第７Ｃ図、「ｇ」 と表示）および細管の回りの血管（第７Ｃ図、矢じりで表示）で認められた。第 ７Ｄ図は、内膜での染色を示す。大型の肝臓の血管（第７Ｅ図でｖ）または洞様 毛細血管（図示せず）はいずれも、成体マウスではＬａｃＺで染色しなかった。 しかしながら、静脈を取り囲んでいる小さな血管は、染色した［第７（Ｅ）図に 矢印）。第７（Ｆ）図に示されるように、脳の介在毛細血管は染色された［第７ （Ｆ）図で矢じり］。同様な結果は、トランスジェニックマウスが５ｋｂヒトＴ ｉｅプロモーターを発現したときにも得られた。 本発明を、その好ましい態様に関して説明した。従って、本発明は、添付の請 求の範囲によってのみ制限されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． マウスＴｉｅレセプターチロシンキナーゼのプロモーターであって、配 列番号１に示される核酸配列を含んでなる、プロモーター。 ２． 内皮細胞レセプターチロシンキナーゼの発現を促進することができる、 請求の範囲第１項に記載のプロモーターの一部。 ３． ヒトＴｉｅレセプターチロシンキナーゼのプロモーターであって、配列 番号２に示される核酸配列を含んでなる、プロモーター。 ４． 内皮細胞レセプターチロシンキナーゼの発現を促進することができる、 請求の範囲第３項に記載のプロモーターの一部。 ５． 請求の範囲第１項に記載のプロモーターを含んでなる、ベクター。 ６． 請求の範囲第２項に記載のプロモーターを含んでなる、ベクター。 ７． 請求の範囲第３項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。 ８． 請求の範囲第４項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。 ９． 請求の範囲第５項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。