CN117881788A - 表达载体、无细菌序列载体及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供表达载体、无细菌序列载体，例如ministring DNA(msDNA)，以及制备无细菌序列载体的方法，包括使用载体生产系统。本发明还提供包含所述载体的组合物、以及所述载体和组合物的用途。
Description
引用通过EFS-Web以电子方式提交的序列表
电子提交的序列表(名称：4471_007PC03_SeqListing_ST25.txt；大小：216,898字节；创建日期：2022年6月15日)的内容，通过引用的方式全部并入本文。
技术领域
本公开提供表达载体、无细菌序列载体、用于制备所述无细菌序列载体的载体生产系统，及其用途。
背景技术
基因疗法具有显著的治疗前景，但在实现其潜力方面仍然存在挑战。
大多数临床试验应用病毒递送系统，例如腺病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。尽管病毒系统已经取得了进展，但其具有变化的转导和转基因表达效率，而且仍然担心会引起炎症和免疫反应或插入诱变等不良效应。此外，病毒载体的生产、纯化和存储常常是昂贵的、高度可变的和低效的。参见，例如，Lingelbach,D.,Drug Development&Delivery20(5):50-54(2020)；Wright,J.F.,Gene Therapy 15:840-848(2008)。
非病毒载体也已作为基因治疗递送系统被研究。虽然比病毒载体更安全，但非病毒载体的有效性会因例如低的转基因表达水平和表达持久性而受到限制。参见例如Kay,M.,Nature Reviews Genetics 12：316-328(2011)。
因此，需要改进的载体，例如本文描述的改进载体。
发明概述
本发明涉及一种表达载体，其包含：(a)主链序列；(b)包含如下的序列：(i)包含目的核酸序列的表达盒，(ii)位于表达盒5'侧的用于第一重组酶的第一靶序列，(iii)位于表达盒3'侧的用于第一重组酶的第二靶序列，和(iv)用于一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列，其中所述其他靶序列整合在所述第一和第二靶序列内位于第一重组酶的非结合区中：以及(c)以下的一项或多项：(i)核酸内切酶靶序列，其整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中，其中所述核酸内切酶靶序列位于主链序列和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间，(ii)包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，其中所述合成增强子整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间，(iii)整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子的5'端之间的巨细胞病毒(CMV)增强子，(iv)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间的包含内含子的5'非翻译区(5'UTR)，(v)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子(chromatin insulator)，(vi)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，(vii)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的支架/基质附着区(S/MAR)，或(viii)整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的DNA核靶向序列(DTS)，其中所述DTS位于所述表达盒与所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。
在一些方面，表达载体包含整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的核酸内切酶靶序列，其中所述核酸内切酶靶序列位于主链序列和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列整合在第一重组酶的第一和第二靶序列内。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列用于归巢核酸内切酶(homing endonuclease)。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列是I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I,或I-Vdi141I的核酸内切酶靶序列。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列用于I-SceI。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列用于PI-SceI。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列用于Cas核酸内切酶。在一些方面，所述Cas核酸内切酶是Cas9。
在一些方面，表达载体包含合成增强子，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列，并整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一个增强子或启动子的5'端之间。在一些方面，所述合成增强子包含多个连续拷贝的与SEQID NO：12至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。在一些方面，包含与SEQ ID NO:47至少约90％同一性的核酸序列的嵌合内含子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，表达载体包含整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子的5'端之间的CMV增强子。在一些方面，所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述CMV启动子整合在CMV增强子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，表达载体包含与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38或SEQ ID NO:39至少约90％同一性的核酸序列，所述核酸序列整合在第一重组酶的第一靶序列和目的核酸序列之间。
在一些方面，表达载体包含含有内含子的5'UTR，其中所述5'UTR整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间。在一些方面，所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR还包含整合在所述内含子中的非编码序列。在一些方面，所述5'UTR包含整合在所述内含子中的两个核苷酸之间的非编码序列，其中所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO:1的位置25至55的任何两个核苷酸。在一些方面，所述非编码序列是S/MAR。在一些方面，所述S/MAR是MAR-5。在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：3至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：5至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。在一些方面，所述启动子是CMV启动子。在一些方面，所述启动子整合在CMV增强子的3'端。在一些方面，所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，表达载体包含整合在目的核酸序列的3'端的聚腺苷酸化信号。在一些方面，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，表达载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子。在一些方面，所述脊椎动物染色质绝缘子是5'-HS4鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS4)。在一些方面，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，表达载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE。在一些方面，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，表达载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR。在一些方面，所述S/MAR是MAR-5。在一些方面，所述聚腺苷酸化信号包含与SEQID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，表达载体在第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼包含增强子序列。在一些方面，表达载体在第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼包含至少两个增强子序列。在一些方面，所述增强子序列是SV40增强子序列。
在一些方面，表达载体包含整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内、位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的DTS，其中所述DTS位于所述表达盒和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。在一些方面，所述DTS是SV40增强子序列。在一些方面，所述DTS是细胞特异性的。
在一些方面，所述第一和第二靶序列以及所述一个或多个其他靶序列选自由PY54pal位点、N15telRL位点、loxP位点、 telRL位点、FRT位点，phiC31 attP位点和λattP位点组成的组。在一些方面，表达载体包含所有这些靶序列。在一些方面，表达载体包含pal位点和整合在pal位点内的telRL、loxP和FRT重组酶靶结合序列。在一些方面，第一重组酶的第一和第二靶序列各自包含SEQ ID NO:33的核酸序列。
在一些方面，表达载体用于产生无细菌序列载体。在一些方面，无细菌序列载体是环状共价闭合载体。在一些方面，无细菌序列载体是线性共价闭合载体。
本公开涉及一种载体生产系统，其包含在诱导型启动子的控制下编码重组酶的重组细胞，其中所述重组细胞包含任何上述表达载体，并且其中所述重组酶靶向所述表达载体中第一重组酶的第一和第二靶序列或一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列之一。在一些方面，重组酶是TelN、Tel、Cre或Flp。
在一些方面，重组细胞还编码在诱导型启动子控制下的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶靶向包含该核酸内切酶靶序列的表达载体中的核酸内切酶靶序列。在一些方面，所述核酸内切酶是归巢核酸内切酶。在一些方面，所述归巢核酸内切酶是I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I或I-Vdi141I。在一些方面，所述核酸内切酶是I-SceI。在一些方面，所述核酸内切酶是PI-SceI。在一些方面，重组细胞编码包含所述核酸内切酶的核酸酶基因组编辑系统。在一些方面，所述核酸酶基因组编辑系统是包含指导RNA和Cas核酸内切酶的成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)核酸酶系统。在一些方面，所述Cas核酸内切酶是Cas9。在一些方面，所述诱导型启动子是热调节型、化学调节型、IPTG调节型、葡萄糖调节型、阿拉伯糖诱导型、T7聚合酶调节型、冷激诱导型(cold-shock inducible)、pH诱导型或其组合。
本公开涉及一种产生无细菌序列载体的方法，包括在适于表达重组酶的条件下孵育任何上述载体生产系统。在一些方面，该方法还包括在适于表达核酸内切酶的条件下孵育任何上述编码核酸内切酶的载体生产系统。在一些方面，该方法还包括在适于表达核酸酶基因组编辑系统的条件下孵育编码核酸酶基因组编辑系统的任何上述载体生产系统。在一些方面，该方法还包括收获无细菌序列载体。
本公开涉及通过任何上述产生无细菌序列载体的方法产生的无细菌序列载体。
本公开涉及一种无细菌序列载体，其包含：(a)包含目的核酸序列的表达盒，和(b)以下的一或多项：(i)位于表达盒中另一增强子或启动子5'的、包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，(ii)位于表达盒中启动子5'的CMV增强子，(iii)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间的包含内含子的5’UTR，(iv)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子，(v)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE，(vi)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR，或(vii)位于表达盒5'的DTS。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒中另一增强子或启动子5’的合成增强子，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含多个连续拷贝的与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。在一些方面，包含与SEQ ID NO:47至少约90％同一性的核酸序列的嵌合内含子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒中启动子5'的CMV增强子。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:46至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，CMV启动子整合在CMV增强子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于目的核酸序列5'的、与SEQ ID NO:35、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO：39至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间含有内含子的5'UTR。在一些方面，所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR还包含整合在所述内含子中的非编码序列。在一些方面，所述5'UTR还包含整合在所述内含子中的两个核苷酸之间的非编码序列，其中所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO:1的核苷酸位置25至55的任意两个核苷酸。在一些方面，所述非编码序列是S/MAR。在一些方面，所述S/MAR是MAR-5。在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：3至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：5至少约90％同一性的核酸序列。在一些方面，所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。在一些方面，所述启动子是CMV启动子。在一些方面，所述启动子整合在CMV增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在目的核酸序列的3'端的聚腺苷酸化信号。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子是cHS4。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR。在一些方面，S/MAR是MAR-5。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒的每一侧的侧翼的增强子序列。在一些方面，无细菌序列载体在表达盒的每一侧的侧翼包含至少两个增强子序列。在一些方面，所述增强子序列是SV40增强子序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒5'的DTS。在一些方面，DTS是SV40增强子序列。在一些方面，DTS是细胞特异的。
在一些方面，无细菌序列载体是环状共价闭合载体。
在一些方面，无细菌序列载体是线性共价闭合载体。
本公开涉及包含任何上述表达载体或任何上述无细菌序列载体的重组细胞。
本公开涉及一种组合物，其包含任何上述表达载体或任何上述无细菌序列载体。在一些方面，组合物还包含递送剂。在一些方面，递送剂是纳米颗粒。在一些方面，递送剂包含靶向配体。在一些方面，所述组合物是进一步包含药学上可接受载体的药物组合物。
本公开涉及在有需要的个体中治疗疾病或病症的方法，包括向所述个体施用任何上述表达载体、任何上述无细菌序列载体、或上述药物组合物。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:1至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:2至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:3至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:5至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:13至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:14至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
在一些方面，包含与SEQ ID NO:13-15任一至少约90％同一性的核酸序列的任何上述多核苷酸还包含位于所述核酸序列3'端的100-120个腺嘌呤核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:16至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:17至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:18至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:35至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:36至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:37至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:38至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及包含与SEQ ID NO:39至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
本公开涉及一种包含任何上述多核苷酸的表达载体。
本公开涉及一种表达载体，其包含：包含与SEQ ID NO:2、3或5中任一个至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸；以及(i)包含与SEQ ID NO:13-18中任一个至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸，或(ii)包含与SEQ ID NO:13-15中任一个至少约90％同一性的核酸序列和位于所述核酸序列3'端的100-120个腺嘌呤核苷酸的多核苷酸。
本公开涉及基因编辑方法，包括将来自任何上述表达载体、任何无细菌序列载体、或任何上述药物组合物的目的核酸序列插入用于基因编辑的靶位点。在一些方面，基因编辑是通过非同源末端连接进行的。在一些方面，基因编辑是通过同源定向修复(homology-directed repair)进行的。
附图简述
图1显示表达载体pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*的载体图谱。
图2显示表达载体pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA的载体图谱。
图3显示通过活细胞成像(live imaging)评估HEK-293细胞中的荧光的显微照片。(A)显示暴露于无质粒的lipofectamine的阴性对照细胞，(B)显示用图1的表达载体转染的细胞，(C)显示用图2的表达载体转染的细胞，(D)显示使用亲本表达载体pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*(PP-CAG-GFP)转染的阳性对照细胞，其中eGFP在CAG启动子的控制下表达。
图4显示根据图3(A)-(D)转染的细胞的相对荧光强度的条形图。图4-5中的"pGL2-SecNLuc-eGFP"表示用图1的pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*表达载体转染的细胞。图4-5中的"pcDNA-SecNLuc-eGFP"表示用图2的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA表达载体转染的细胞。
图5显示根据图3(A)-(C)转染的细胞的培养基中相对萤光素酶强度的条形图。
图6显示表达载体pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*的载体图谱。
图7显示表达载体pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*的载体图谱。
图8显示表达载体pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*的载体图谱。
图9显示，与阴性对照相比，用图1(pGL2-SecNLuc-eGFP)、图6(WPRE)、图7(5'UTR1+WPRE)和图8(5'UTR2+WPRE)的表达载体电穿孔细胞后，第2、6、10、14、17、20、27和34天的HEK-293细胞培养基中的长期萤光素酶活性的线图，其中所述萤光素酶活性通过以相对发光光度计单位(也称为相对光单位，RLU)表示的发光来指示，其中所述阴性对照为用无哺乳动物表达盒的puc57质粒电穿孔的细胞(阴性对照(无质粒))。*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001,和****＝p<0.0001。
图10显示，在如图9所述的转染和阴性对照HEK-293细胞的第1、2、3和5代的培养基中的萤光素酶活性的条形图，其中所述酶活性以RLU发光指示。
图11显示，在用图7的表达载体(2nd gen pDNA(CMV+U1+W))、自图7的表达载体产生的msDNA(2nd gen msDNA(CMV+U1+W))、或图2中含有萤光素酶转基因的表达载体(常规pcDNA)电穿孔细胞后，在第1、2、3、4、5、6和7代(分别对应于第8、15、24、31、38、45和52天)，HEK-293细胞中相对萤光素酶强度的线图。与常规pcDNA数据集相比，**＝p<0.01,***＝p<0.001,和****＝p<0.0001。
图12显示，如图9中所述，用图1或图7的表达载体转染的细胞中的荧光。(A)显示在第1、2、3和5代通过活细胞成像评估HEK-293细胞中荧光的显微照片。(B)显示在每个代次的三个活细胞荧光图像的视野中观察到的eGFP阳性(GFP+)细胞的线图；不显著(ns)＝p>0.05。(C)的点图显示在第5代的三个活细胞荧光图像中测量到的GFP+细胞的平均荧光强度(MFI)。对应于每个构建体的条形图显示了所有测量的GFP+细胞的平均MFI值。****＝p<0.0001。
图13显示，在单次流体动力学尾静脉注射50μg的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照,PSNLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(pCAGLuc)、或pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(pGSNLuc-WPRE)后，第1、3、7、10、15、22、28、42和56天从野生型小鼠收集的血浆中的RLU/mg蛋白质的线图。
图14显示，在单次流体动力学尾静脉注射50μg的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照,PSNLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(pCAGLuc)、或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(pCAGLucWPRE)后，第1、3、7、10、15、22、28、42和56天从野生型小鼠收集的血浆中的RLU/mg蛋白质的线图。
图15显示，在单次流体动力学尾静脉注射5μg的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照,pDNA CMV-U(无SSeq))、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(SSeq pDNA CAG)或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(SSeq pDNA CAG-W)后，第1、3、7、10、15、22、28、42和56天从野生型小鼠收集的血浆中的RLU/mg蛋白质的线图。
图16显示，在单次流体动力学尾静脉注射5μg的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照,无SSeq pDNA CMV-U)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(2XSSeq pDNA CAG-W)、或msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(2XSSeqmsDNA CAG-W)后，第1、3、7、10、15、22、28、42和56天从野生型小鼠收集的血浆中的RLU/mg蛋白质的线图。
图17A-D显示，来自单次流体动力学尾静脉注射5μg图16所述载体后第56天的野生型小鼠以及未注射载体的阴性对照小鼠的肝脏中，通过ELISA测定的GFP表达的条形图。(A)显示GFP浓度(以μg/mL为单位)。(B)显示相对于总蛋白μg数进行标化的μg GFP。(C)显示相对于总组织g数标化的μgGFP。(D)显示相对于对照的GFP表达水平。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
图18显示，来自单次流体动力学尾静脉注射5μg图16所述载体后第56天的野生型小鼠以及未注射载体的阴性对照小鼠的肝脏中的细胞质GFP蛋白浓度(pg/mL)的条形图。
图19显示，在小鼠中单次静脉内尾静脉注射脂质纳米颗粒(LNP)载体(运载体(对照))或如下脂质复合物(lipoplex)后，来自体内全身生物发光成像的以光子/秒为单位的总通量的条形图，其中所述脂质复合物为LNP和msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(LNP-2G msDNA-CAG-分泌型NanoLuc)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(LNP-2G ppDNA-CAG-分泌型NanoLuc)、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(LNP-2G msDNA-CMV-分泌型NanoLuc)、pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(LNP-2G ppDNA-CMV-分泌型NanoLuc)、或pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(LNP-常规pDNA-CMV-分泌型NanoLuc)的脂质复合物，其中针对各次注射，条形图从左到右显示注射后第1、3、10、30、58、92、119和174天的总通量。LNP-2G msDNA-CAG-分泌型NanoLuc注射的条形图以虚线加框。
图20显示，来自注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的小鼠的皮层、丘脑、脑干和小脑的矢状脑切片中绿色荧光蛋白(GFP)表达的显微照片。白色箭头指示转基因表达。用二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色来指示细胞核。
图21-22显示，来自注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的小鼠的皮层和丘脑(图21)以及小脑和脑干(图22)的矢状脑切片中GFP表达的显微照片。神经元用神经元标志物NeuN指示。
图23-24显示来自注射了msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的小鼠的皮层和丘脑(图23)以及小脑和脑干(图24)的矢状脑切片中GFP表达的显微照片。神经元用神经元标志物NeuN指示。
图25-26显示，在使用脂质复合物转染后3天和5天的人T细胞(Pan-T(TA+)细胞，图25)或肝细胞(Huh7细胞，图26)中、使用PBS对照处理的细胞中或未处理细胞中，与萤光素酶表达相关的发光的条形图，其中所述脂质复合物为脂质纳米颗粒运载体(LNP)与pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照,LNP-常规pDNA-CMV-分泌型NLuc),pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(LNP-ppDNA-CMV-分泌型NLuc),msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(LNP-msDNA-CMV-分泌型NLuc),pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(LNP-ppDNA-CAG-分泌型NLuc)或msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(LNP-msDNA-CAG-分泌型NLuc)的复合物。
图27A-C、图28A-C和图29A-B显示，在转染CRISPR基因编辑系统和携带侧翼为5'和3'同源臂的GOI(HDR-GOI-HDR)的常规质粒或msDNA后3天(图27A-C)、7天(图28A-C)和15天(图29A-B)，目的基因(GOI)的敲入KI)效率(Q3)的荧光激活细胞分选(FACS)散点图。图27和28中的(A)显示没有GOI的任何HDR KI的对照野生型(WT)诱导性多能干细胞(iPSC)的FACS散点图。图27-28中的(B)和图29中的(A)显示使用常规质粒(质粒DNA HDR-GOI-HDR)进行GOI的HDR KI后iPSC的FACS散点图。图27-28中的(C)和图29中的(B)显示使用msDNA(msDNAHDR-GOI-HDR)进行GOI的HDR KI后iPSC的FACS散点图。
图30显示表达载体SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图31显示表达载体SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图32显示表达载体SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图33显示表达载体SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图34显示表达载体SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图35显示表达载体SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图36显示表达载体SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图37显示表达载体SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图38显示表达载体SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*的载体图谱。
图39显示，用图2(常规pDNA CMV-U)、图30(A：CMV-U1-3'UTR)、图31(B：E1-CMV-U1-3'UTR)和图32(C：E1-CMV-U1-WPRE-3'UTR)的表达载体电穿孔细胞后第2、3、7、10、14、21和28天的HEK-293细胞培养基中以RLU发光指示的萤光素酶活性的线图。*＝p<0.05和**＝p<0.01。
图40显示，第0天用图39中所述的表达载体电穿孔细胞后每7天传代一次，在第1、2、3、4和5代的HEK-293细胞中相对萤光素酶强度的线图。*＝p<0.05和**＝p<0.01。
图41显示表达载体pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin polyA的载体图谱。
图42显示表达载体4-1pGL2-SS*-CAG[CMV增强子+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图43显示表达载体4-2pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图44显示表达载体4-3pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图45显示表达载体4-4pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图46显示表达载体4-5-pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图47显示表达载体4-6-pGL2-SS*-CMV增强子-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*的载体图谱。
图48显示，用图41(常规无SSeq pDNA CAG-W)和图42-47(分别为4-1至4-6)所示的表达载体转染后3天和6天的HEK-293细胞培养基中以RLU发光指示的萤光素酶活性的条形图。
图49显示，自限性CRISPR基因编辑系统的示例性序列图，该系统包含侧翼超级序列(Super Sequence,SSeq)、合成增强子(E1)、CMV启动子(PCMV)、具有tRNA-gRNA-PAM插入的含有优化内部内含子的合成5'UTR(UTR-tRNA-gRNA-PAM-1)、Casβ2基因、和包含人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和gRNA-PAM插入的3'UTR(HBg3'UTR-gRNA-PAM)。
图50显示，在用侧翼为同源臂的治疗性GOI对染色体DNA进行同源定向修复(HDR)期间，自图52序列的自限性Cas表达的示意图。
图51显示，使用自限性CRISPR基因编辑系统的两种基因编辑场景的示意图。在场景1中，首先转染含有人表达盒(例如治疗性GOI)的msDNA以进行瞬时表达，然后转染图42的基因编辑系统进行HDR敲入。在场景2中，HDR敲入由单个msDNA介导，该msDNA包含自限性CRISPR基因编辑系统和侧翼为同源臂的人表达盒。
发明详述
本公开提供了表达载体、无细菌序列载体(例如，ministring DNA(msDNA))、载体生产系统、制备无细菌序列载体的方法、组合物及其用途。
本文引用的所有出版物均通过引用整体并入本文，包括但不限于本文引用的所有期刊文章、书籍、手册、专利申请和专利，其并入程度就如同具体且单独地指示了每个单独的出版物通过引用并入一样。
I.术语
为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，以下术语中的每一个均应具有下述含义。其他定义在整个申请中阐述。
应当注意，术语“一”或“一种”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“一种核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一”(或“一种”)、“一或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
本文使用的术语“和/或”应被视为具体公开了每个指定特征或组件、或其与其他指定特征或组件的组合。因此，在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，在本文中以表述“包含”来描述本发明方面的任何情况下，都同时提供了以表述“由...组成”和/或“基本上由...组成”来描述的类似方面。
术语“大约”或“基本上包含”是指，针对具体值或组成，由本领域普通技术人员确定的在可接受误差范围内的值或组成，其部分取决于用于测量或确定该值或组成的方式，即测量系统的局限性。例如，“大约”或“基本上包含”可以表示按照本领域的实践在1个或1个以上标准差的范围内。或者，“大约”或“基本上包含”可以意指不超过10％(即±10％)的范围。此外，特别是对于生物系统或方法，这些术语可以表示不超过一个数量级或不超过5倍的值。当在本申请和权利要求中提供具体值或组成时，除非另有说明，否则“大约”或“基本上包含”应当被推定为意指在该具体值或组成的可接受误差范围内。
在本文中，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比值范围或整数范围均应理解为包括所述范围内的任何整数的值、以及在适当时其分数(例如整数的十分之一和百分之一)的值。数字范围包括定义该范围的数字。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。例如，the Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,5th ed.,2013,Academic Press；and the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,2006,Oxford University Press,为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位系统(SI)接受的形式表示。
除非另有说明，否则核苷酸序列以5'至3'方向从左到右书写。氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。
本文提供的标题不是对本公开的各方面的限制，本公开的各方面可以通过参考整个说明书而获得。因此，下面紧接着定义的术语通过参考整个说明书来更全面地定义。
“氨基酸”是具有以下结构的分子，其中，中心碳原子(α-碳原子)连接氢原子、羧酸基团(其碳原子在本文中称为“羧基碳原子”)、氨基基团(其氮原子在本文中称为“氨基氮原子”)和侧链基团R。当掺入肽、多肽或蛋白质中时，在将一个氨基酸连接到另一个氨基酸的脱水反应中，氨基酸会失去其氨基酸羧基的一个或多个原子。由此，当掺入蛋白质中时，氨基酸被称为“氨基酸残基”。
“蛋白质”或“多肽”是指两个或更多个(天然或非天然)氨基酸通过肽键连接而成的任何聚合物，其中当一个氨基酸(或氨基酸残基)的与α-碳键接的羧酸基团的羧基碳原子，和相邻氨基酸的α-碳键接的氨基的氨基氮原子发生共价结合时，形成肽键。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。类似地，蛋白质和多肽的片段也在本公开的范围内并且在本文中可以被称为“蛋白质”或“多肽”。在本公开的一个方面，多肽包含两个或更多个亲本肽片段或蛋白质的嵌合体。术语“多肽”还意指并涵盖多肽的翻译后修饰(“PTM”)产物，包括但不限于，二硫键形成、糖基化、氨甲酰化、脂化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、通过非天然存在的氨基酸修饰、或任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。多肽可以来源于天然生物来源或通过重组技术产生，而不必从指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式产生，包括通过化学合成。“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指，不在其天然环境中的多肽。对具体的纯化水平并无要求。例如，分离的多肽可以仅是从其天然或自然环境中移出。为了本公开的目的，与已经通过任何合适的技术分离、分级、或部分或基本上纯化的天然或重组多肽一样，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的。
包含两种或更多种本公开的蛋白质的重组多肽(即，重组蛋白质)可以由单一编码序列编码，其中该单一编码序列包含编码每种蛋白质的多核苷酸序列。除非另有说明，否则编码各蛋白质的多核苷酸序列均是“符合读框”的，由此包含这些多核苷酸序列的单个mRNA在翻译后将产生包含每种蛋白质的单个多肽。典型地，如本文所述的重组多肽中的蛋白质可以彼此直接融合或可以通过肽接头分开。编码肽接头的各种多核苷酸序列是本领域已知的并且包括例如自切割肽。
本文中，“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸的聚合物形式。在一些情况下，多核苷酸包含如下序列，所述序列在其来源生物的天然基因组中不与编码序列直接邻接、或者与编码序列直接邻接(在5'端或在3'端)。因此，该术语包括，例如并入载体中、并入自主复制的质粒或病毒中、并入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA、或独立于其他序列作为单独的分子(例如cDNA)存在的重组DNA。本公开的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文所用的多核苷酸尤其是指单链和双链DNA、单链区和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、以及单链区和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子(其可以是单链或更典型地双链，或是单链区和双链区的混合物)。术语多核苷酸涵盖基因组DNA或RNA(取决于生物体，即病毒的RNA基因组)、以及由基因组DNA编码的mRNA和cDNA。在某些方面，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中)。“分离的”核酸或多核苷酸是指已从其天然环境中移出的核酸分子，例如DNA或RNA。例如，出于本公开的目的，包含在载体中含有编码重组多肽的多核苷酸的核酸分子被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其他实例包括：维持在异源宿主细胞中或从溶液的其他多核苷酸中(部分或基本上)纯化的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括本公开多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公开的分离的多核苷酸或核酸也包括合成产生的多核苷酸和核酸(例如，核酸分子)。
如本文所用，“编码区”或“编码序列”是指多核苷酸的一部分，其由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但可以被认为是编码区的一部分；但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。编码区的边界通常由5'末端的起始密码子和3'末端的翻译终止密码子确定，起始密码子编码所得多肽的氨基末端，翻译终止密码子编码所得多肽的羧基末端。
如本文所用，“表达盒”包含目的核酸序列(例如，用于表达多肽、DNA或RNA的核酸序列)和表达控制区。
如本文所用，“转基因”可以与“目的基因(GOI)”互换使用，并且指含有可翻译成氨基酸的密码子的多核苷酸的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但可以被认为是转基因的一部分；但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子，内含子等均不是转基因的部分。转基因的边界通常由5'末端的起始密码子和3'末端的翻译终止密码子确定，起始密码子编码所得多肽的氨基末端，翻译终止密码子编码所得多肽的羧基末端。
如本文所用，术语“表达控制区”是指，与编码区可操作地连接以指导或控制由该编码区编码的产物的表达的转录控制元件，包括例如顺式调控元件(CRM)、启动子(例如，组织特异性启动子和/或诱导型启动子)、增强子、操纵子、阻遏子、核糖体结合位点、翻译前导序列、内含子、转录后元件、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构和转录终止信号、miRNA结合位点，及其组合。表达控制区包括位于目的核酸序列的上游(5')、内部或下游(3')的核苷酸序列，其可以影响相关目的核酸序列的转录、RNA加工、稳定性或翻译。如果旨在真核细胞中表达转基因，聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于转基因的3'。
当编码区和启动子为“可操作连接”(即，“有效连接”)时，启动子功能的诱导将导致包含编码产物的编码区的mRNA的转录，并且启动子和编码区之间的连接性质不干扰启动子指导编码区表达所编码产物的能力，也不干扰DNA模板转录的能力。表达控制区包括位于编码区上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其可以影响相关编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译。如果编码区旨在于真核细胞中表达，则聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码序列的3'。
如本文所用，术语“宿主细胞”和“细胞”可以互换使用，并且可以指含有或能够含有核酸分子(例如，重组核酸分子)的任何类型的细胞或细胞群，例如原代细胞、培养的细胞、或来自细胞系的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，或者可选地，宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌细胞，例如酵母细胞，和各种动物细胞，例如昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本文中，“培养”和“培养的”是指在允许细胞生长或分裂或维持细胞处于存活状态的体外条件下孵育细胞。如本文所用，“培养的细胞”是指在体外繁殖的细胞。
“个体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物，例如哺乳动物、鸟类、宠物、农场动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、山羊、猪、鸡、狗、猫、和啮齿动物例如小鼠、大鼠和豚鼠。在优选的方面，个体是人。术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用。
“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将治疗剂物理引入到个体中。
本文所用的术语“治疗”、“治疗性”、“治疗的”或“疗法”是指，对个体进行的任何类型的干预或操作，或向个体施用活性剂，以逆转、减轻、改善、抑制或减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、病症或生化指标的进展、发展、严重程度或复发、或提高总体生存率。治疗可以针对患有疾病的个体或未患有疾病的个体(例如，用于预防，例如疫苗接种)。
术语“有效剂量”、“有效的剂量”或“有效量”定义为，足以实现或至少部分实现期望效果的活性剂的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗上有效剂量”是指，当单独使用或与其他治疗剂组合使用时，促进疾病消退的任何药物量，所述疾病消退可反映为疾病症状严重性的降低、疾病无症状期的频率和持续时间的增加、总生存期(从确诊日或开始治疗疾病的日期起，被诊断患有该疾病的患者仍然存活的时间长度)的增加、或因疾病所致的损伤或残疾的预防。药物的治疗有效量或剂量包括“预防有效量”或“预防有效剂量”，其是当药物单独或与其他治疗剂组合施用给处于患病风险或疾病复发风险中的个体时抑制疾病的发生或复发的任何药物量。治疗剂促进疾病消退或抑制疾病发生或复发的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法进行评估，例如在临床试验期间在人类个体中、在预测人用功效的动物模型系统中进行评估、或通过在体外测定试验中测定活性剂的活性进行评估。
在以下小节中进一步详细描述本公开的各个方面。
II.用于产生无细菌序列载体的表达载体和载体生产系统
无细菌序列载体及其生产描述于美国专利号9,290,778和9,862,954；Nafissi和Slavcev,Microbial Cell Factories 11:154(2012)；以及Nafissi et al.,NucleicAcids 3(6):e165(2014)中，其全部内容通过引用并入本文。这些无细菌序列载体由表达载体(例如，质粒)产生，该表达载体包含位于表达盒两侧(即，5'和3'侧)的专门“超级序列”(“SS”或“SSeq”)位点，所述SS位点包含重组酶的靶序列，所述表达盒包含(一个或多个)目的核酸序列。具体地，每个SS都包含第一重组酶的靶序列，并具有整合在第一重组酶的非结合区中的用于一种或多种其他重组酶的其他靶序列。当表达载体存在于表达合适重组酶的重组细胞中时，含有表达盒的无细菌序列载体将从所述表达载体的主链DNA中分离出来。为了产生环状共价闭合(CCC)的无细菌序列载体，可以将所述表达载体置于表达重组酶例如Cre或Flp的重组细胞中，所述重组酶通过包含在SS中的其靶序列发挥作用。为了产生线性共价闭合(LCC)的无细菌序列载体，在本文中也称为ministring DNA(msDNA)，可以将所述表达载体置于表达重组酶例如TelN或Tel的重组细胞中，所述重组酶通过包含在SS中的其靶序列发挥作用。然后可以从细胞中纯化通过重组产生的无细菌序列载体并直接用作递送载体。参见美国专利号9,290,778和9,862,954，Nafissi和Slavcev以及Nafissi等人的文献。
具有LCC末端的msDNA载体是无扭转的，并且该msDNA载体在大肠杆菌中产生的过程中不经历旋转酶指导的负超螺旋。此外，由于其双链LCC拓扑结构，msDNA整合到细胞染色体中会导致染色体断裂，从而使该细胞自群体中被去除。因此，msDNA可以消除任何插入诱变的风险，保护接受msDNA的患者免于潜在的基因毒性和癌症(Nafissi等人)。
本公开提供了无细菌序列载体的改进生产以及改进的无细菌序列载体。在一些方面，通过去除污染性表达载体序列来改进无细菌序列载体的生产。在一些方面，对无细菌序列载体的如下方面进行改进：改进所述载体在细胞中建立的能力(即，转染效率)、改进转基因表达(例如，通过组合增强的转录和翻译来实现)、和改进在细胞中的扩增(例如，载体复制和传递到子代细胞)。
在一些方面，本公开的改进可以适用于根据本领域已知的其他方法产生的CCC或LCC载体。
A.表达载体
本文提供了一种表达载体，其包含：(a)主链序列；(b)包含如下的序列：(i)包含目的核酸序列的表达盒，(ii)位于表达盒5'侧的用于第一重组酶的第一靶序列，(iii)位于表达盒3'侧的用于第一重组酶的第二靶序列，和(iv)用于一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列，其中所述其他靶序列整合在第一和第二靶序列内，位于第一重组酶的非结合区中：以及(c)以下的一项或多项：(i)核酸内切酶靶序列，其整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中，其中所述核酸内切酶靶序列位于主链序列和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间，(ii)包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，其中所述合成增强子整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间，(iii)整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子的5'端之间的巨细胞病毒(CMV)增强子，(iv)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间的包含内含子的5'非翻译区(5'UTR)，(v)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子，(vi)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，(vii)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的支架/基质附着区(S/MAR)，或(viii)整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的DNA核靶向序列(DTS)，其中所述DTS位于所述表达盒与所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。
本文提及的“主链”序列是表达载体中位于表达盒序列和侧翼SS位点之外的序列，其中所述SS位点包含第一重组酶的第一和第二靶序列。主链序列可以包括例如用于表达载体在宿主细胞(例如大肠杆菌)中扩增和抗生素选择的序列，如本文所述。
重组酶的“非结合”区域是第一重组酶的靶序列中不被本文所述的重组酶作用(例如，不被所述重组酶结合和/或切割)的区域。
重组酶的“切割位点”是重组酶在与重组相关的DNA中引发双链断裂或单链切口的位点。
在一些方面，表达载体包含整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内位于第一重组酶和一种或多种其他重组酶的非结合区中的核酸内切酶靶序列，其中该核酸内切酶靶序列位于主链序列和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列整合在第一重组酶的第一靶序列内。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列整合在第一重组酶的第二靶序列内。在一些方面，所述核酸内切酶靶序列整合在第一重组酶的第一和第二靶序列内。在一些方面，相同的核酸内切酶靶序列整合在第一重组酶的第一和第二靶序列内。在一些方面，整合在第一重组酶的第一和第二靶序列内的核酸内切酶靶序列用于相同的核酸内切酶。在一些方面，整合在第一重组酶的第一靶序列内的核酸内切酶靶序列不同于整合在第一重组酶的第二靶序列内的核酸内切酶靶序列。在一些方面，整合在第一重组酶的第一靶序列内的核酸内切酶靶序列与整合在第一重组酶的第二靶序列内的核酸内切酶靶序列用于不同的核酸内切酶。
核酸内切酶靶序列在表达载体中位于主链序列和重组酶切割位点之间，确保了在如所描述的重组之后，核酸内切酶靶序列保持与主链序列连接，而不与无细菌序列载体连接。由此，在重组后，可以通过暴露于核酸内切酶，从含有无细菌序列载体的制备物中去除含有主链序列和核酸内切酶靶位点的序列，从而在生产无细菌序列载体的方法中减少或避免了需要去除主链序列的纯化步骤。在一些方面，核酸内切酶在如本文所述的载体生产系统的宿主细胞中在重组后表达，其中所述核酸内切酶在核酸内切酶靶位点处切割DNA，并且包含主链序列和核酸内切酶靶位点的序列被核酸外切酶(例如，核酸外切酶V)降解。
在一些方面，表达载体包含归巢核酸内切酶的核酸内切酶靶序列。在一些方面，核酸内切酶靶序列是I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I或I-Vdi141I的靶序列。在一些方面，核酸内切酶靶序列用于I-SceI。在一些方面，核酸内切酶靶序列用于PI-SceI。归巢核酸内切酶的靶序列是本领域众所周知的。
在一些方面，表达载体包含在基因组编辑中使用的核酸内切酶(包括作为核酸酶基因组编辑系统的一部分的核酸内切酶)的核酸内切酶靶序列。在一些方面，核酸酶基因组编辑系统是成簇规则间隔短回文重复序列-Cas(CRISPR-Cas)系统、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)系统、锌指核酸酶(ZFN)系统或大范围核酸酶系统。
在一些方面，表达载体包含Cas核酸内切酶的核酸内切酶靶序列。在一些方面，Cas核酸内切酶是Cas9(例如，化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)Cas9(SaCas9)、新杀弗朗西斯菌(Francisellanovicida)Cas9(FnCas9)或脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)Cas9(NmCas9))、Cas9变体(例如，Cas9β2,xCas9,SpCas9-NG,SpCas9-NRRH,SpCas9-NRCH,SpCas9-NRTH,SpG,SpRY)、Cas3,Cas12(例如,Cas12a,Cas12b,Cas12c,Cas12d,或Cas12e),Cas13(例如Cas13a,Cas13b,Cas13c,或Cas13d),或Cas14。在一些方面，本文所用的Cas核酸内切酶的核酸内切酶靶序列与指导RNA(gRNA)靶向序列同源，并且包括Cas核酸内切酶所识别的原型间隔子相邻基序(PAM)。可以基于熟知的CRISPR系统，常规设计与gRNA靶向序列同源的带有PAM位点的序列。该gRNA可以包含靶向RNA(crRNA)序列和反式激活RNA(tracrRNA)序列的融合物，其相互作用并发挥作用，将Cas核酸内切酶引导至所述核酸内切酶靶位点并催化切割。
在一些方面，表达载体包含合成增强子，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列，并整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间。在一些方面，表达载体包含合成增强子，该合成增强子包含SEQ ID NO:12的核酸序列，并整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的多个连续拷贝，例如1、2、3、4、5或更多个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的3个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含SEQ ID NO：46的核酸序列。在一些方面，合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。在一些方面，包含与SEQ ID NO:47至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列的嵌合内含子，整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。在一些方面，包含SEQ ID NO:47的核酸序列的嵌合内含子，整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，表达载体包含整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3‘端和启动子的5’端之间的CMV增强子。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3‘端，该合成增强子包含与SEQ ID NO：12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3’端，该合成增强子包含SEQ ID NO：12的核酸序列。在一些方面，CMV增强子整合在所述合成增强子的多个连续拷贝的3‘端，例如，在所述合成增强子的1、2、3、4、5或更多个连续拷贝的3’端。在某些方面，CMV增强子整合在所述合成增强子的3个连续拷贝的3‘端。在某些方面，CMV增强子整合在与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的核酸序列的3‘端。在某些方面，CMV增强子整合在SEQ ID NO：46的核酸序列的3‘端。在某些方面，CMV启动子整合在CMV增强子的3‘端以及目的核酸序列的5’。
在一些方面，表达载体包含与SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQID NO：38或SEQ ID NO：39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的核酸序列，该序列整合在第一重组酶的第一靶序列与目的核酸序列之间。在一些方面，表达载体包含整合在第一重组酶的第一靶序列和目的核酸序列之间的SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ IDNO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39的核酸序列。在一些方面，与SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的核酸序列，或SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、或SEQ ID NO：39的核酸序列，包含了表达盒中位于目的核酸序列5‘的所有调节元件。
在一些方面，表达载体包含含有内含子的5’UTR，其中该5’UTR(即，包含内含子的5’UTR)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，与缺少该5'UTR的相同表达载体或无细菌序列载体相比，所述5’UTR改善自表达载体或自表达载体所产生的无细菌序列载体的转基因转录物的剪接和翻译。
在一些方面，所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述内含子包含SEQ ID NO：1的核酸序列。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:2至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列，其中SEQ ID NO:2是具有内部最小内含子的优化5'UTR，本文中也称为“5'UTR1”。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：2的核酸序列。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：4的核酸序列。
在一些方面，所述5'UTR还包含整合于所述内含子中的非编码序列。
在一些方面，所述内含子与SEQ ID NO:1具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性，或包含SEQ ID NO:1，并且所述非编码序列整合在内含子中的两个核苷酸之间，所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO：1的位置25至55的任意两个核苷酸。
在一些方面，所述非编码序列是非原核和非病毒的。在一些方面，所述非编码序列是真核序列。在一些方面，所述非编码序列包含内含子、遍在染色质开放元件(ubiquitouschromatin opening element，UCOE)、S/MAR、SV40增强子序列(例如，一个或一个以上SV40增强子序列，例如两个、三个、四个、五个或更多个SV40增强子序列)、脊椎动物染色质绝缘子(例如，cHS4)、WPRE或其任何组合。
在一些方面，所述非编码序列包含S/MAR。在一些方面，S/MAR是MAR-5，在本文中作为SEQ ID NO:9提供。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:3至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO:3。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO:5。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中位于鸡β-肌动蛋白启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中位于CMV启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间，其中启动子整合在CMV增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ IDNO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，CMV增强子整合在包含SEQ ID NO:12的核酸序列的合成增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在所述合成增强子的多个连续拷贝的3'端，例如，整合在1、2、3、4、5或更多个连续拷贝的所述合成增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在所述合成增强子的3个连续拷贝的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在与SEQ ID NO：46具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在SEQ ID NO：46的核酸序列的3'端。
在一些方面，表达载体包含整合在目的核酸序列3'端的聚腺苷酸化信号。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含非洲爪蟾(Xenopus leavis)β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、或杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含多个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、或杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如1、2、3、4或5个拷贝。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核酸序列。在一些方面，聚腺苷酸尾(即，poly(A)尾)位于聚腺苷酸化信号的3'端。在一些方面，poly(A)尾是100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120或更多个残基长度。在一些方面，包含聚腺苷酸化信号和poly(A)尾的序列，与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18具有至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性。在一些方面，包含聚腺苷酸化信号和poly(A)尾的该序列包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含脊椎动物染色质绝缘子。在一些方面，所述脊椎动物染色质绝缘子是5'-HS4鸡-β-珠蛋白绝缘子(cHS4)。参见，例如，Benabdellah etal.,PLoS ONE 9(1):e84268(2014)；Lu et al.,FEBS Open Bio 10:644-656(2020)；Hanawa et al.,Mol.Ther.17(4):667-674(2009)；Walters et al.,Mol.Cell.Biol.19(5):3714-3726(1999)。在一些方面，所述脊椎动物染色质绝缘子整合在表达盒中，位于目的核酸和如本文所述的聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，所述脊椎动物染色质绝缘子整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子包含与SEQ ID NO:8至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子包含SEQ IDNO:8。
在一些方面，与缺乏脊椎动物染色质绝缘子的相同表达载体或无细菌序列载体相比，脊椎动物染色质绝缘子改善表达载体或由该表达载体产生的无细菌序列载体的建立(即，转染效率)。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含WPRE。参见例如Higashimoto et al.,GeneTherapy 14:1298-1304(2007)。在一些方面，WPRE整合在表达盒中，位于目的核酸和如本文所述的聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，WPRE整合在表达盒中，位于本文所述的S/MAR的3'端和本文所述的聚腺苷酸化信号的5'端。在一些方面，WPRE整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，WPRE包含与SEQ ID NO：11至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，WPRE包含SEQ ID NO：11。
在一些方面，与缺乏WPRE的相同表达载体或无细菌序列载体相比，WPRE改善自表达载体或自表达载体产生的无细菌序列载体的转基因表达。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含S/MAR。参见例如Martens et al.,Mol.Cell.Biol.22(8):2598-2606(2002)；Narwade et al.,Nucleic Acids Res.47(14):7247-7261(2019)。在一些方面，S/MAR整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，S/MAR整合在表达盒中位于目的核酸序列的3'端和本文所述WPRE的5'端。在一些方面，S/MAR整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，S/MAR是MAR-3、MAR-4或MAR-5，其是人β-干扰素MAR的片段。参见，例如，Wang et al.,Mol.Biol.Cell 30:2761-2770(2019)。在一些方面，S/MAR包含与SEQ IDNO：9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，S/MAR包含SEQ ID NO:9。
在一些方面，S/MAR是人细胞毒性丝氨酸蛋白酶-B(CSP-B)MAR或CSP-C MAR。参见，例如，Hanson and Ley,Blood 79(3):610-618(1992)；Klein et al.,Tissue Antigens 35(5):220-228(1990)。在一些方面，S/MAR包含与SEQ ID NO：10至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，S/MAR包含SEQ ID NO:10。
在一些方面，与缺乏S/MAR的相同表达载体或无细菌序列载体相比，S/MAR改善表达载体或(由表达载体产生的)无细菌序列载体的表达水平、稳定性和/或持久性(例如，通过附加体维持和复制，例如载体的扩增和向子代细胞的分配，和/或通过防止表观遗传沉默)。
在一些方面，包含如上所述的(c)(i)-(c)(vii)中的任一项或多项(即，没有DTS)的表达载体还包含位于第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼的增强子序列。在一些方面，所述位于第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼的增强子序列为，位于第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼的至少两个增强子序列。在一些方面，所述增强子序列是SV40增强子序列。
在一些方面，表达载体包含DTS。在一些方面，DTS整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列中的第一重组酶和一种或多种其他重组酶的非结合区中，其中所述DTS位于表达盒和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。在一些方面，所述DTS是SV40增强子序列。在一些方面，所述DTS是细胞特异的。在一些方面，所述DTS是平滑肌细胞、胚胎干细胞、II型肺细胞、内皮细胞或成骨细胞特异的。
所述DTS在表达载体中位于表达盒和重组酶的切割位点之间的位置，确保了在如本文所述的重组后，DTS保持与无细菌序列载体连接，而不是与主链序列连接。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含UCOE。参见，例如，Müller-Kuller et al.,Nucleic Acids Res.43(3):1577-1592(2015)；Skipper et al.,BMC Biotechnol.19:75(2019)；Rudina et al.,bioRxiv,doi.org/10.1101/626713(2019)；Neville et al.,Biotechnol.Adv.35(5):557-564(2017)。在一些方面，UCOE在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子或任何增强子的5'端之间。在一些方面，UCOE整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在某些方面，UCOE是A2UCOE。在某些方面，UCOE包含与SEQ ID NO：6至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，UCOE是SEQ ID NO:6。
在一些方面，UCOE是SRF-UCOE。参见例如国际公开号WO2020223160。在一些方面，UCOE包含与SEQ ID NO：7至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，UCOE是SEQ ID NO：7。
在一些方面，与缺乏UCOE的相同表达载体或无细菌序列载体相比，UCOE改善自表达载体或自表达载体产生的无细菌序列载体的转基因表达。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含增强子-1。在一些方面，增强子-1整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端与启动子或任何其他增强子的5'端之间。在一些方面，增强子-1整合在UCOE的3'端和CMV增强子的5'端之间。在一些方面，增强子-1包含与SEQ ID NO：12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，增强子-1是SEQ ID NO：12。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含CMV、EFl、SV40、CAG、Rho、VDM2、HCR或HLP启动子或其变体。在一些方面，表达载体在表达盒中包含CMV启动子变体。参见例如国际公开号WO2012099540；Xu et al.,Bioengineered 10(1):548-560,DOI:10.1080/21655979.2019.1684863(2019)。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含EFl-α启动子。在一些方面，表达载体在表达盒中包含CMV增强子和EF1-α启动子。
在一些方面，表达载体在表达盒中包含3'UTR，所述3'UTR包含两个拷贝的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR整合在目的核酸序列和第一重组酶的第二靶序列的5'端之间。
在一些方面，3'UTR包含两个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：13至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：13。
在一些方面，3'UTR包含两个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：14至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：14。
在一些方面，3'UTR包含一个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和一个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：15至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：15。
在一些方面，3’UTR还包含poly(A)尾(即，在3’UTR的3’端)，其包含100至120个腺嘌呤核苷酸，即100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个腺嘌呤核苷酸。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：16至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：16。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：17至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：17。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：18至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：18。
表达载体可以包含对本文所述的第一和/或第二靶序列和/或表达盒的上述修饰的任意组合。在一些方面，所述组合提供协同效应。
在一些方面，第一重组酶的第一和第二靶序列以及一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列选自：PY54 pal位点、N15 telRL位点、loxP位点、 telRL位点、FRT位点、phiC31 attP位点和λattP位点。在一些方面，表达载体包含所有这些靶序列。在一些方面，表达载体包含pal位点和整合在pal位点中的telRL、loxP和FRT重组酶靶结合序列。在一些方面，第一重组酶的第一和第二靶序列各自包含SEQ ID NO:33的核酸序列。
在一些方面，在本文所述的任何表达盒中，目的核酸序列可以包含编码以下的序列：多肽、RNA(信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA))、小发夹RNA(shRNA)、核酶或反义RNA)或非编码DNA(例如反义寡核苷酸)。在一些方面，目的核酸序列是包含内含子和/或外显子的基因组DNA序列。在一些方面，目的核酸序列包含编码以下的序列：抗癌剂、肿瘤抑制剂、细胞凋亡剂、抗血管生成剂、酶、细胞毒性剂、自杀基因、细胞因子、干扰素、白介素、免疫调节剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、趋化因子、用于刺激抗原呈递细胞的抗原、抗体(例如抗体的重链和/或轻链，例如单克隆、嵌合、人源化或人抗体，或其抗原结合片段)、基因组编辑系统或其部分(例如，CRISPR-Cas、TALEN、ZFN、或大范围核酸酶系统或其部分，例如Cas核酸内切酶或gRNA)，或免疫原性剂(例如，作为VLP和/或疫苗)。在一些方面，目的核酸序列包含编码多肽的序列，当该核酸序列在细胞内表达时，该多肽能够形成VLP。
示例性治疗靶标和适应症包括：与单基因病症(包括例如肝脏、血液或眼的病症)相关的基因，半乳糖苷酶α(GLA，例如用于治疗Fabry病)，钠电压门控通道α亚基1(SCN1A，例如用于治疗Dravet氏综合征)，ATP结合盒A亚家族成员4(ABCA4，例如用于治疗Stargardt病)，表面活性蛋白B(SP-B，例如用于治疗表面活性物质功能障碍)，表面活性蛋白C(SP-C，例如用于治疗表面活性物质功能障碍)，ATP结合盒A亚家族成员3(ABCA3，例如用于治疗表面活性物质功能障碍)、溶质载体家族34成员2(SLC34A2，例如用于治疗肺泡微结石和/或睾丸微结石)、囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR，例如用于治疗囊性纤维化)、谷氨酸脱羧酶(GAD，例如，GAD65或GAD67，例如用于治疗帕金森氏病)，天冬氨酸酰化酶基因(ASPA，也称为氨基酰化酶(AAC)，例如用于治疗Canavan病)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC，例如用于治疗帕金森氏病和/或用于治疗AADC缺乏症)、Neurturin(NRTN，例如用于治疗帕金森病)、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF，例如用于治疗帕金森氏病)、神经生长因子(NGF，例如用于治疗阿尔茨海默病)、三肽基肽酶I(TPP1，也称为神经元蜡样脂褐质沉积症2型(CLN2)，例如用于治疗Batten病，例如CLN2病)，芳基硫酸酯酶A(ARSA，例如用于治疗异染性脑白质营养不良)，N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH，例如用于治疗Sanfilippo综合征，A型)，硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1，例如，用于治疗Sanfilippo综合征，A型)，N-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU，例如，用于治疗Sanfilippo综合征，B型)，运动神经元存活1(SMN1，例如，用于治疗脊肌萎缩症1)，视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65，也称为类视黄醇异构水解酶，例如用于治疗Leber先天性黑矇病)，Rab护送蛋白1(REP1，例如，用于治疗无脉络膜血症)，视网膜劈裂蛋白1(Retinoschisin，Rs1，例如，用于治疗X连锁青少年视网膜劈裂)、α-1抗胰蛋白酶(AAT，例如，用于治疗遗传性肺气肿或AAT缺乏症)、mini-dystrophin(例如，用于治疗杜氏肌营养不良)、α-肌聚糖(αSG，例如，用于治疗杜氏肌营养不良或肢带型肌营养不良症2型)、β-肌聚糖(βSG)、γ-肌聚糖(γSG，例如，用于治疗肢带型肌营养不良症2型)、δ-肌聚糖(γSG)、脂蛋白脂酶(LPL，例如，用于治疗家族性LPL缺乏症)、酸性α-葡糖苷酶(GAA，例如用于治疗庞贝病)、肿瘤坏死因子受体:Fc(TNFR:Fc，例如用于治疗关节炎，例如炎症性关节炎)，肌浆/内质网Ca(2+)ATPase 2a(SERCA2a，例如用于治疗充血性心力衰竭)、因子VIII或因子IX(FVIII或FIX，例如用于治疗血友病B)、胆色素原脱氨酶基因(PBGD，例如用于治疗急性间歇性卟啉病)、可溶性FMS样酪氨酸激酶-1(sFlt1，例如用于治疗年龄相关黄斑变性或癌症，例如卵巢癌)、包含VEGFR-1和VEGF-R2结构域的可溶性嵌合血管内皮生长因子(VEGF)受体(例如。用于治疗癌症，例如黑色素瘤或结肠癌)，可溶性VEGFR3(例如，用于治疗癌症，例如子宫内膜癌)、可溶性VEGF-C诱饵受体(sVEGFR3-Fc，例如用于治疗癌症，例如黑色素瘤、肾细胞癌或前列腺癌)、色素上皮衍生生长因子(PEDF，例如用于治疗癌症，例如Lewis肺癌)、针对VEGFR2的中和性单抗(例如，DC101，例如用于治疗癌症，例如黑色素瘤或胶质母细胞瘤)、内皮抑素(例如，用于治疗癌症，例如膀胱癌或胰腺癌)、血管抑素(angiostatin，例如，用于治疗癌症，例如肝癌)、内皮抑素和血管抑素两者(即，作为双顺反子序列，例如用于治疗癌症，例如卵巢癌或前列腺癌)，内皮抑素突变体(即，P1254A-内皮抑素，例如用于治疗癌症，例如卵巢癌)、TSP-1的抗血管生成结构域(3TSR，例如用于治疗癌症，例如胰腺癌)、组织因子途径抑制剂-2(TFPI-2，例如用于治疗癌症，例如胶质母细胞瘤)、纤溶酶原片段(例如，Kringle 5，例如用于治疗癌症，例如卵巢癌)、纤溶酶原kringle 1-5(例如，用于治疗癌症，例如黑色素瘤或肺癌)，针对未折叠蛋白反应蛋白的siRNA(UPR；例如IRE1α、XBP-1或ATF6，例如用于治疗癌症，例如乳腺癌)、Vasostatin(例如，用于治疗癌症，例如肺癌)、单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV-TK，例如用于治疗癌症，例如乳腺癌)、sc39TK(例如，用于治疗癌症，例如宫颈癌)、白喉毒素A(DTA，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌或骨髓瘤)，p53上调的细胞凋亡调节剂(PUMA，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌或骨髓瘤)，肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(TRAIL，用于治疗癌症，例如，淋巴瘤、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌(即，头颈部癌)或胶质母细胞瘤)、可溶性TRAIL(例如，用于治疗癌症，例如，肝癌或肺腺癌)、IFN-β(例如，用于治疗癌症，例如，结直肠癌、肺癌、神经母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤)、IFN-α(例如，用于治疗癌症，例如转移性黑色素瘤)、CD-40配体(CD40L)或CD40L突变体(例如用于治疗癌症，例如肺癌)、黑色素瘤分化相关基因-7和白介素24(MDA-7和IL24，例如用于治疗癌症，例如艾氏腹水瘤)、凋亡素(apoptotin)和IL24(例如用于治疗癌症，例如肝癌)、IL24(例如用于治疗癌症，例如混合谱系白血病(MLL)/AF4阳性急性淋巴母细胞白血病(ALL))，IL15(例如用于治疗癌症，例如转移性肝细胞癌)、次级淋巴组织趋化因子(SLC，例如用于治疗癌症，例如肝癌)、NK4(肝细胞生长因子(HGF)的N端发夹和随后的四个kringle结构域，例如用于治疗癌症，例如转移性Lewis肺癌)，肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14，也称为LIGHT，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，例如用于治疗癌症)、TNF-α(例如用于治疗癌症，例如胶质瘤)、Survivin的显性负突变体(例如C84A或T34A，例如用于治疗癌症，例如结肠癌或胃癌)、人类端粒酶逆转录酶的C端片段(hTERTC27，例如用于治疗癌症，例如多形性胶质母细胞瘤)、maspin(例如用于治疗癌症，例如前列腺癌)、nm23H1(例如用于治疗癌症，例如，转移性卵巢癌)、人肝细胞生长因子的Kringle1结构域(HGFK1，例如，用于治疗癌症，例如，结直肠癌)、抗降钙素核酶(例如，用于治疗癌症，例如，前列腺癌)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1，例如，用于治疗癌症，例如，肺癌)，C-X-C基序趋化因子受体2(CXCR2)C-尾序列(例如，用于治疗癌症，例如胰腺癌)、α-生育酚相关蛋白(TAP，例如，用于治疗癌症，例如前列腺癌)、天花粉蛋白(Trichosanthin，例如，用于治疗癌症，例如，肝细胞癌)、核心蛋白聚糖(decorin，例如，用于治疗癌症，例如，多形性胶质母细胞瘤)、Cathelicidin(例如，用于治疗癌症，例如，结肠癌)，Niemann-Pcik型C2(NPC2，例如，用于治疗癌症，例如，肝细胞癌)，Mullerian抑制物质(MISs，例如，用于治疗癌症，例如卵巢癌)，P53(例如，用于治疗癌症，例如细支气管肺泡癌)，针对癌症高表达蛋白1的shRNA(Hec1，例如，用于治疗癌症，例如胶质瘤)，针对Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白-1的shRNA(EBV LMP-1，例如用于治疗癌症，例如鼻咽癌)，针对人乳头瘤病毒16E7癌基因的反义RNA(HPV16-E7，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌)，针对雄激素受体的shRNA(AR，例如用于治疗癌症，例如前列腺癌)，针对Snail的siRNA(也称为SNA1，例如用于治疗癌症，例如胰腺癌)，针对Slug的siRNA(即，SNAI2的蛋白质产物，例如用于治疗癌症，例如胆管癌(肝癌))，针对四个半LIM-Only蛋白2的shRNA(FHL2，例如用于治疗癌症，例如结肠癌)、miR-26a(例如，用于治疗癌症，例如肝细胞癌)、HPV16结构蛋白L1(HPV16-L1，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌)、HPV16E5、E6和E7癌基因(HPV16 E5/E6/E7，例如用于治疗癌症，例如宫颈癌)，B细胞白血病/淋巴瘤1(BLC1)独特型(例如，用于治疗癌症，例如，B细胞白血病/淋巴瘤1)，EBV LMP1和LMP2融合到热休克蛋白(EBV LMP2/1-HSP，例如用于治疗癌症，例如鼻咽癌)，癌胚抗原(CEA，例如用于治疗癌症，例如结肠癌)、B/T淋巴细胞弱化因子的可溶形式与热休克蛋白的组合(BTLA和HSP70，例如用于治疗癌症，例如黑色素瘤肺转移)、HPV16-L1/E7(例如，用于治疗癌症，例如宫颈癌)、HPV16-L1(例如，用于治疗癌症，例如宫颈癌)、抗EGFR抗体(例如，14D1，例如，用于治疗癌症，例如，外阴癌)、抗死亡受体5(DR5)抗体(例如，adximab,用于治疗癌症，例如，肝癌或结肠癌)、抗烯醇化酶1(ENOI1)抗体(例如，用于治疗癌症，例如，胰腺导管腺癌)、抗VEGFA抗体(例如，贝伐单抗，例如，用于治疗癌症，例如，转移性肺癌或卵巢癌)、粘蛋白1(MUC1)抗原(例如，用于治疗癌症(例如，胃癌)或水通道蛋白(例如，hAQP1，例如用于治疗辐射诱导的腮腺唾液腺功能减退，即口干症)。
在一些方面，目的核酸序列用于基因编辑(例如，基因治疗，包括遗传缺陷、病症或疾病的治疗)。
在一些方面，目的核酸序列用于插入基因编辑的靶位点(即，作为基因编辑的靶标的DNA或RNA序列内的位点)。基因编辑的靶位点可以包括任何遗传元件，例如任何顺式元件。在一些方面，基因编辑的靶位点位于基因的外显子、基因的内含子或基因的调节元件中。
在一些方面，基因编辑包含核酸内切酶。在一些方面，核酸内切酶与基因组编辑系统相关。在一些方面，核酸内切酶是例如归巢核酸内切酶、位点特异性核酸酶、结构引导的核酸酶或RNA引导的核酸酶(例如，转座子编码的RNA引导的核酸酶)。
在一些方面，基因编辑包含基因组编辑系统，其在基因编辑的靶位点内产生双链断裂。在一些方面，基因组编辑系统是CRISPR-Cas、TALEN、ZFN或大范围核酸酶基因编辑系统。
在一些方面，通过在双链断裂处的非同源末端连接，将目的核酸序列插入到基因编辑的靶位点中。在一些方面，双链断裂由CRISPR-Cas系统产生。在一些方面，本文所述的表达载体包含位于第一重组酶的第一和第二靶序列与目的核酸序列之间(即，5'超级序列和目的核酸序列之间以及3'超级序列和目的核酸序列之间)的Cas核酸内切酶靶序列(即，与gRNA靶向序列同源的序列)，其中基因编辑的靶位点(例如，染色体中的靶位点)包含相同的Cas核酸内切酶靶序列。例如，对表达载体产生的无细菌序列载体(例如msDNA)中位于核酸序列侧翼的Cas核酸内切酶靶序列进行加工，将导致超级序列的去除，从而使线性共价闭合的无细菌序列载体例如msDNA成为线性且末端开放的，具有适于非同源末端连接事件的反应性末端。
在一些方面，目的核酸序列通过同源定向修复被插入到基因编辑的靶位点，其中通过双链断裂位点侧翼的序列与目的核酸序列所连接的同源序列之间的重组，实现所述插入。
在一些方面，目的核酸序列与双链断裂位点侧翼的序列具有足够的同源性以支持同源定向修复。
在一些方面，目的核酸序列的侧翼为5’和3’同源臂(即，与双链断裂位点侧翼的序列具有足够同源性以介导同源定向修复的序列)。
在一些方面，足以介导同源定向修复的同源性包括在目的核酸序列与双链断裂位点侧翼的序列之间或者在目的核酸序列的同源臂与双链断裂位点侧翼的序列之间至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的同源性。在一些方面，双链断裂位点侧翼的序列在双链断裂位点的约100个碱基、约90个碱基、约80个碱基、约70个碱基、约60个碱基、约50个碱基、约45个碱基、约40个碱基、约35个碱基，约30个碱基、约25个碱基、约20个碱基、约15个碱基、约10个碱基或约5个碱基内，或在双链断裂位点的紧邻侧翼。
在一些方面，同源定向修复通过CRISPR-Cas系统进行。在一些方面，本文所述的表达载体包含CRISPR-Cas系统。在一些方面，表达载体包含位于编码Cas核酸内切酶(例如，免疫沉默的Cas9-β2)的序列之每一侧的侧翼的tRNA-gRNA多顺反子。一个示例性的方面如图49所示。在一些方面，表达载体包含如本文所述的5’UTR(例如，5’UTR1)，其在内含子中包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，表达载体包含本文所述的嵌合内含子，其包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，本文所述的EF1-α启动子在固有的内含子中包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，本文所述的聚腺苷酸化信号或3'UTR包含tRNA-gRNA多顺反子。例如，当Cas核酸内切酶从包含侧翼tRNA-gRNA多顺反子的载体(即，从表达载体或无细菌序列载体(例如，msDNA))表达时，gRNA将被切出成为游离RNA并指导Cas核酸内切酶靶向至基因编辑的靶位点(例如染色体中的靶位点)以及载体上的该侧翼gRNA位点。这将导致Cas核酸内切酶的自我限制，限制Cas核酸内切酶自载体的进一步表达。该方法的示意图如图50所示，该图还显示了由分开的载体上侧翼具有同源臂的目的核酸(即目的基因，GOI)介导的同源定向修复。在一些方面，如本文所述的表达载体包含侧翼有同源臂的目的核酸序列，例如图51的场景1中所示。在一些方面，目的核酸序列和如本文所述的自限性CRISPR-Cas系统位于如本文所述的单个表达载体上，如图51的场景2所示。在后面的方面中，包含自限性CRISPR-Cas系统的序列可以位于包含侧翼为同源臂的目的核酸序列的序列的5'。
在一些方面，目的核酸序列与基因编辑的靶位点同源，并且与靶位点相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失、倒置或重排。在一些方面，目的核酸是用于替换靶位点处的同源序列的基因组序列、编码区、外显子、内含子或其任何部分。
在一些方面，目的核酸序列与基因编辑的靶位点非同源。
在一些方面，目的核酸序列恢复缺失的功能、纠正异常的功能、或提供与基因编辑的靶位点相关的其他功能。
在一些方面，目的核酸序列用于敲除与基因编辑的靶位点相关的基因表达(即，基因沉默)。
在一些方面，目的核酸序列用于体内基因编辑。
在一些方面，目的核酸序列用于体外基因编辑。
在一些方面，目的核酸序列用于离体基因编辑(例如，细胞疗法，诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法)。
在一些方面，基因编辑包括表观遗传修饰，并且本文所述的表达载体包含表观遗传效应分子作为目的核酸。在一些方面，表观遗传效应分子介导例如乙酰化或脱乙酰化、甲基化或去甲基化、或者磷酸化或去磷酸化。在一些方面，表观遗传效应分子抑制乙酰化或脱乙酰化、甲基化或去甲基化、或者磷酸化或去磷酸化。在一些方面，表观遗传修饰是组蛋白修饰。在一些方面，组蛋白修饰是组蛋白乙酰化并且目的核酸是组蛋白乙酰转移酶。在一些方面，组蛋白修饰是组蛋白脱乙酰化并且目的核酸是组蛋白脱乙酰酶。在一些方面，表观遗传修饰是DNA修饰。在一些方面，DNA修饰是DNA甲基化并且目的核酸是DNA甲基化酶。在一些方面，DNA修饰是DNA去甲基化并且目的核酸是DNA去甲基化酶。在一些方面，表观遗传效应分子与靶向分子，例如DNA结合分子融合，以使所述效应分子靶向染色体上的位置。
在一些方面，表达盒是多基因的，即，表达盒包含分别编码两种或更多种多肽的两种或更多种目的核酸序列。
在一些方面，表达盒包含单个开放阅读框，其包含位于编码多肽的每个核酸序列之间的编码自切割肽的核酸序列，由此使得表达盒的翻译产物在细胞内可以被切割成两个或更多个多肽。在一些方面，自切割肽是2A自切割肽。在一些方面，2A自切割肽是来自猪捷申病毒-1(Porcine teschovirus-1)的P2A。在一些方面，2A自切割肽是来自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)2A的T2A。在一些方面，自切割肽包含2A、P2A和T2A中的任意一种或多种。在一些方面，自切割肽包含P2A和T2A。
在一些方面，表达盒还包含编码基因表达标记物的核酸序列。在一些方面，基因表达的标记物是荧光报告基因，例如绿色荧光蛋白(GFP，例如增强型GFP(eGFP))、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或近红外荧光蛋白(iRFP)；生物发光报告基因，例如萤光素酶(例如，纳米萤光素酶，即(NLuc)，England et al.,Bioconjug.Chem.27(5):1175-1187(2016),Promega Corporation)；可选择的抗生素标记；或LacZ。在一些方面，表达盒包含在编码基因表达标记物的核酸序列和编码多肽的任何其他核酸序列之间的编码自切割肽的核酸序列。
表达盒可以含有本领域技术人员已知的与(一个或多个)目的核酸序列可操作地连接的任何表达控制区。在一些方面，表达控制区是启动子、增强子、操纵基因、阻遏基因、核糖体结合位点、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构、转录终止信号，或其组合。
在一些方面，表达载体用于产生无细菌序列载体。在一些方面，无细菌序列载体是环状共价闭合载体。在一些方面，无细菌序列载体是线性共价闭合载体。
B.载体生产系统
本文提供了载体生产系统，其包含在诱导型启动子的控制下编码重组酶的重组细胞，其中所述重组细胞包含如本文所述的表达载体，其中所述表达载体含有第一重组酶的第一和第二靶序列以及一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列，并且其中所述重组酶靶向所述第一重组酶的第一和第二靶序列或者所述一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列之一。
用于所述载体生产系统的合适宿主细胞包括微生物细胞，例如细菌细胞如大肠杆菌细胞，和酵母细胞如酿酒酵母。还可以使用哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，K1谱系(ATCC CCL 61)或Pro5变体(ATCC CRL 1281))；源自SV40转化的非洲绿猴肾的成纤维细胞样细胞谱系，CV-1谱系(ATCC CCL 70)、COS-1谱系(ATCC CRL 1650)或COS-7谱系(ATCC CRL 1651)；鼠源L细胞；鼠源3T3细胞(ATCC CRL 1658)；鼠源C127细胞；293谱系的人胚胎肾细胞(ATCC CRL 1573)；人癌细胞，包括HeLa谱系的癌细胞(ATCC CCL2)；以及神经母细胞瘤细胞系IMR-32(ATCC CCL 127)、SK-N-MC(ATCC HTB 10)或SK-N-SH(ATCC HTB 11)。
合适的重组酶在如本文所述的重组酶靶序列处催化DNA交换，所述重组酶包括但不限于TelN、Tel、Tel(gp26 K02噬菌体)、Cre、Flp、phiC31、Int和其他lambdoid噬菌体整合酶，例如phi 80、HK022和HP1重组酶。在一些方面，重组酶是TelN、Tel、Cre或Flp。
在一些方面，重组细胞还编码在诱导型启动子控制下的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶靶向表达载体中的核酸内切酶靶序列。
合适的核酸内切酶在该核酸内切酶靶序列处切割多核苷酸。在一些方面，核酸内切酶是归巢核酸内切酶。在一些方面，归巢核酸内切酶是I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I,或I-Vdi141I.。在一些方面，核酸内切酶是I-SceI。在一些方面，核酸内切酶是PI-SceI。在一些方面，重组细胞编码包含核酸内切酶的核酸酶基因组编辑系统。在一些方面，基因组编辑系统是CRISPR-Cas、TALEN、ZFN或大范围核酸酶系统。在一些方面，核酸酶基因组编辑系统是1类或2类CRISPR-Cas系统。在一些方面，核酸酶基因组编辑系统是I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统。在一些方面，CRISPR-Cas系统中的Cas核酸内切酶是Cas9(例如，SpCas9、SaCas9、FnCas9或NmCas9)、Cas9变体(例如，Casβ9,xCas9,SpCas9-NG,SpCas9-NRRH,SpCas9-NRCH,SpCas9-NRTH,SpG,SpRY)、Cas3、Cas12(例如，Cas12a,Cas12b,Cas12c,Cas12d,或Cas12e)、Cas13(例如，Cas13a,Cas13b,Cas13c或Cas13d)或Cas14。
可以使用熟知的技术制备编码重组酶或重组酶和核酸内切酶的重组宿主细胞。例如，在合适的细胞转化条件下，使用合适的载体将编码所选重组酶或核酸内切酶的核酸序列引入细胞中。重组宿主细胞可以通过表达载体转化，或者通过将编码重组酶和/或编码核酸内切酶的核酸序列整合到宿主细胞基因组中来转化。在核酸内切酶与核酸酶基因组编辑系统相关的方面，宿主细胞可被设计为编码核酸酶基因组编辑系统的所有组分，例如，通过用包含所有组分的一种或多种表达载体转化宿主细胞来实现，或通过将所有组分整合到宿主细胞基因组中，或通过组分的转化和整合的组合来实现。在一些方面，宿主细胞编码Cas或Cas样核酸内切酶和gRNA。
重组酶或核酸内切酶(包括核酸酶基因组编辑系统的核酸内切酶)的表达可以在诱导型启动子(即，在特定物理或化学条件或刺激下被激活的启动子)的控制下。在一些方面，诱导型启动子是热调节型、化学调节型、IPTG调节型、葡萄糖调节型、阿拉伯糖诱导型、T7聚合酶调节型、冷激诱导型、pH诱导型或其组合。
本文提供了包含如本文所述的表达载体的重组细胞，所述表达载体含有第一重组酶的第一和第二靶序列以及一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列。在一些方面，所述重组细胞编码所述第一重组酶和/或本文所述的一种或多种重组酶中的一种或多种。在一些方面，所述重组细胞编码本文所述的一种或多种核酸内切酶。在一些方面，所述重组细胞编码本文所述的核酸酶基因组编辑系统。
本文提供了一种产生无细菌序列载体的方法，其包括：在适于表达重组酶的条件下温育本文所述的载体生产系统。在一些方面，该方法进一步包括在适于表达由重组细胞编码的核酸内切酶的条件下孵育该载体生产系统。在一些方面，该方法还包括在适于表达由重组细胞编码的核酸酶基因组编辑系统的条件下孵育该载体生产系统。在一些方面，该方法还包括收获无细菌序列载体。
本文提供了通过本文所述的产生无细菌序列载体的方法产生的无细菌序列载体。
III.无细菌序列载体
本文提供了无细菌序列载体，其包含：(a)包含目的核酸序列的表达盒，和(b)以下的一项或多项：(i)位于表达盒中另一增强子或启动子5'的、包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，(ii)位于表达盒中启动子5'的CMV增强子，(iii)包含内含子的5'UTR，其中该5'UTR整合在表达盒中启动子和目的核酸序列之间，(iv)脊椎动物染色质绝缘子，其整合在表达盒中目的核酸和聚腺苷酸化信号之间，(v)整合在表达盒中目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE，(vi)整合在表达盒中目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR，或(vii)位于表达盒5'的DTS。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒中另一增强子或启动子5’的合成增强子，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒中另一增强子或启动子5'的、包含SEQ ID NO:12的核酸序列的合成增强子。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的多个连续拷贝，例如1、2、3、4、5或更多个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的3个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含SEQ IDNO：46的核酸序列。在一些方面，合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。在一些方面，包含与SEQ ID NO:47至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列的嵌合内含子，整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。在一些方面，包含SEQ ID NO:47的核酸序列的嵌合内含子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，无细菌序列载体包含位于表达盒中启动子5'的CMV增强子。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的核酸序列。在一些方面，CMV增强子整合在包含SEQ ID NO:12的核酸序列的合成增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的多个连续拷贝的3'端，例如，合成增强子的1、2、3、4、5或更多个连续拷贝的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3个连续拷贝的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在SEQ ID NO：46的核酸序列的3'端。在一些方面，CMV启动子整合在CMV增强子的3'端和目的核酸序列的5'。
在一些方面，无细菌序列载体包含与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列，所述核酸序列位于目的核酸序列的5'。在一些方面，无细菌序列载体包含位于目的核酸序列5’的SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:39的核酸序列。在一些方面，与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38或SEQ ID NO:39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％，至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列、或SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、或SEQ ID NO:39的核酸序列，包含表达盒中位于目的核酸序列5’的所有调节元件。
在一些方面，无细菌序列载体包含含有内含子的5’UTR，其中该5’UTR(即，包含内含子的5’UTR)整合在表达盒中启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，与缺乏所述5'UTR的相同无细菌序列载体相比，所述5'UTR可用于改善来自无细菌序列载体的转基因转录物的剪接和翻译。
在一些方面，所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述内含子包含SEQ ID NO：1的核酸序列。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:2至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：2的核酸序列。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：4的核酸序列。
在一些方面，所述5'UTR还包含整合于内含子中的非编码序列。
在一些方面，所述内含子与SEQ ID NO:1至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性，或包含SEQ ID NO:1，并且所述非编码序列整合在所述内含子的两个核苷酸之间，其中所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO：1的位置25至55的任意两个核苷酸。
在一些方面，所述非编码序列是非原核和非病毒的。在一些方面，所述非编码序列是真核序列。在一些方面，所述非编码序列包含内含子、UCOE、S/MAR、SV40增强子序列(例如，一个或一个以上SV40增强子序列，例如两个、三个、四个、五个或更多个SV40增强子序列)、脊椎动物染色质绝缘子(例如，cHS4)、WPRE或其任何组合。
在一些方面，所述非编码序列包含S/MAR。在一些方面，S/MAR是MAR-5，在本文中提供为SEQ ID NO:9。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:3至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：3。
在一些方面，所述5’UTR包含与SEQ ID NO:5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：5。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中鸡β-肌动蛋白启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中CMV启动子和目的核酸序列之间。
在一些方面，所述5'UTR整合在表达盒中启动子和目的核酸序列之间，其中所述启动子整合在CMV增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，CMV增强子整合在包含SEQ ID NO:12的核酸序列的合成增强子的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的多个连续拷贝的3'端，例如，合成增强子的1、2、3、4、5或更多个连续拷贝的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在合成增强子的3个连续拷贝的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列的3'端。在一些方面，CMV增强子整合在SEQ ID NO：46的核酸序列的3'端。
在一些方面，无细菌序列载体包含整合在目的核酸序列的3'端的聚腺苷酸化信号。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、或杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含多个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号、或杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如1、2、3、4或5个拷贝。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，聚腺苷酸化信号包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的核酸序列。在一些方面，聚腺苷酸尾(即，poly(A)尾)位于聚腺苷酸化信号的3'端。在一些方面，poly(A)尾是100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120或更多个残基长度。在一些方面，包含聚腺苷酸化信号和poly(A)尾的该序列与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ IDNO:18至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性。在一些方面，包含聚腺苷酸化信号和poly(A)尾的该序列包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含脊椎动物染色质绝缘子。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子是cHS4。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子整合在表达盒中，位于目的核酸和如本文所述的聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子包含与SEQ ID NO:8至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，脊椎动物染色质绝缘子包含SEQ IDNO：8。
在一些方面，与无所述脊椎动物染色质绝缘子的相同无细菌序列载体相比，所述脊椎动物染色质绝缘子可用于改善无细菌序列载体的建立(即转染效率)。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含WPRE。在一些方面，WPRE整合在表达盒中，位于目的核酸和如本文所述的聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，WPRE整合在表达盒中本文所述的S/MAR的3'端和本文所述的聚腺苷酸化信号的5'端。在一些方面，WPRE整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，WPRE包含与SEQ ID NO:11至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，WPRE包含SEQ ID NO：11。
在一些方面，与缺少WPRE的相同无细菌序列载体相比，WPRE改善自无细菌序列载体的转基因的表达。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含S/MAR。在一些方面，S/MAR整合在表达盒中目的核酸和聚腺苷酸化信号之间。在一些方面，S/MAR整合在表达盒中位于目的核酸序列的3'端和如本文所述的WPRE的5'端。在一些方面，S/MAR整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，S/MAR是MAR-3、MAR-4或MAR-5。在一些方面，S/MAR包含与SEQ ID NO：9至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，S/MAR包含SEQ ID NO:9。
在一些方面，S/MAR是人CSP-B MAR或CSP-C MAR。在一些方面，S/MAR包含与SEQ IDNO：10至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，S/MAR包含SEQ ID NO:10。
在一些方面，与缺乏S/MAR的相同无细菌序列载体相比，S/MAR可用于改善无细菌序列载体的表达水平、稳定性和/或持久性(例如，通过附加体维持和复制，例如载体的扩增和向子代细胞的分配，和/或通过阻止表观遗传沉默)。
在一些方面，包含如上所述的(b)(i)-(b)(v)中的任一项或多项(即，没有DTS)的无细菌序列载体还包含位于表达盒每侧侧翼的增强子序列。在一些方面，所述表达盒每侧侧翼的增强子序列是位于表达盒每侧侧翼的至少两个增强子序列。在一些方面，增强子序列是SV40增强子序列。
在一些方面，无细菌序列载体包含DTS。在一些方面，DTS位于表达盒的5'。在一些方面，DTS是SV40增强子序列。在一些方面，DTS是细胞特异的。在一些方面，DTS是平滑肌细胞、胚胎干细胞、II型肺细胞、内皮细胞或成骨细胞特异的。
在一些方面，本文所述的无细菌序列载体在表达盒中还包含UCOE。在一些方面，UCOE位于表达盒中启动子或任何增强子的5'。在一些方面，UCOE整合在如本文所述的5'UTR的内含子中。
在一些方面，UCOE是A2UCOE。在一些方面，UCOE包含与SEQ ID NO：6至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，UCOE是SEQ ID NO：6。
在一些方面，UCOE是SRF-UCOE。在一些方面，UCOE包含与SEQ ID NO：7至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，UCOE是SEQ ID NO：7。
在一些方面，与缺乏UCOE的相同无细菌序列载体相比，UCOE改善自无细菌序列载体的转基因的表达。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含增强子-1。在一些方面，增强子-1整合在表达盒中位于启动子或任何其他增强子的5'。在一些方面，增强子-1整合在UCOE的3'端和CMV增强子的5'端之间。在一些方面，增强子-1包含与SEQ ID NO：12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，增强子-1是SEQ ID NO：12。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含CMV、EFl、SV40、CAG、Rho、VDM2、HCR或HLP启动子或其变体。在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含CMV启动子变体。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含EFl-α启动子。在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含CMV增强子和EF1-α启动子。
在一些方面，无细菌序列载体在表达盒中包含3'UTR，所述3'UTR包含两个拷贝的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，所述3'UTR整合在目的核酸序列的3'。
在一些方面，3'UTR包含两个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：13至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：13。
在一些方面，3'UTR包含两个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：14至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：14。
在一些方面，3'UTR包含一个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和一个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：15至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：15。
在一些方面，3’UTR还包含poly(A)尾，其包含100至120个腺嘌呤核苷酸，即100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个腺嘌呤核苷酸。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：16至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：16。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：17至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：17。
在一些方面，3'UTR包含与SEQ ID NO：18至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，3'UTR是SEQ ID NO：18。
如本文所述的无细菌序列载体中的目的核酸序列包括本文中在用于产生无细菌序列载体的表达载体时描述的任何核酸序列。
在一些方面，本文所述的无细菌序列载体包含位于目的核酸序列的5’和3’的Cas核酸内切酶靶序列(即，与gRNA靶向序列同源的序列)，其中用于基因编辑的靶位点(例如，染色体中的靶位点)包含相同的Cas核酸内切酶靶序列。
在一些方面，本文所述的无细菌序列载体包含CRISPR-Cas系统。在一些方面，无细菌序列载体包含位于编码Cas核酸内切酶(例如，免疫沉默的Cas9-β2)的序列每一侧侧翼的tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，无细菌序列载体包含如本文所述的5’UTR(例如，5’UTR1)，其在内含子中包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，无细菌序列载体包含如本文所述的嵌合内含子，其包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，本文所述的EF1-α启动子在固有内含子中包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，本文所述的聚腺苷酸化信号或3'UTR包含tRNA-gRNA多顺反子。在一些方面，如本文所述的目的核酸序列和自限性CRISPR-Cas系统位于如本文所述的单个无细菌序列载体上。在后面的方面，包含自限性CRISPR-Cas系统的序列位于包含侧翼为同源臂的目的核酸序列的序列的5'。
本文所述的无细菌序列载体可以包含上述修饰的任意组合。在一些方面，该组合提供协同效应。
在一些方面，无细菌序列载体是环状共价闭合载体。
在一些方面，无细菌序列载体是线性共价闭合载体。
本文提供了包含本文公开的细菌无序列载体的重组细胞。
IV.其他表达载体
上述改进和修饰还可应用于其他表达载体，例如但不限于，用于直接基因表达而非产生无细菌序列载体的表达载体。在一些方面，本文所述的核酸序列作为DNA序列提供，并且表达载体是DNA表达载体。在一些方面，本文所述的核酸序列作为RNA序列提供，并且表达载体是RNA表达载体。RNA序列可以对应于以本文任何SEQ ID NO提供的DNA序列，或者可以对应于与本文任何SEQ ID NO提供的DNA序列互补的DNA序列。
本文提供了包含本文所述核酸序列的任意组合的多核苷酸。
本文提供了包含以下核酸序列的多核苷酸：如本文所述的内含子、含有内含子的5'UTR、和/或3'UTR。
本文提供多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:1、2、3、5、13、14、15、16、17或18中任一项至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述多核苷酸在所述核酸序列的3'端包含100至120个腺嘌呤核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸包含与SEQID NO:13、14或15中的任一个至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列，并且在所述核酸序列的3'端有100至120个腺嘌呤核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、2、3、5、13、14、15、16、17或18中任一项的核酸序列。
本文提供了包含一种或多种本文所述的多核苷酸的表达载体。在一些方面，表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:1、2、3、5、13、14、15、16、17或18中的任一个至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述多核苷酸在所述核酸序列的3'端包含100至120个腺嘌呤核苷酸。在一些方面，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:13、14或15中的任一个至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列，并且在所述核酸序列的3'端有100至120个腺嘌呤核苷酸。在一些方面，表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、2、3、5、13、14、15、16、17或18中任一个的核酸序列。在一些方面，表达载体包含多核苷酸，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:2、3或5中任一个的核酸序列、以及(a)包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17或18中任一个的核酸序列的多核苷酸，或(b)包含SEQ ID NO：13、14或15中任一个的核酸序列以及在该核酸序列3'端的100至120个腺嘌呤核苷酸的多核苷酸。
本文提供表达载体，其包含：含有内含子的5’UTR，其中所述5’UTR整合在表达盒中启动子和目的核酸序列之间；和/或包含两个拷贝的β-珠蛋白聚腺苷酸化信号的3’UTR，所述3’UTR整合在表达盒中目的核酸序列的3'。
在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：2至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：2的核酸序列。
在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：4至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述5'UTR包含SEQ ID NO：4的核酸序列。
在一些方面，所述5'UTR还包含整合于内含子中的非编码序列。
在一些方面，所述内含子与SEQ ID NO:1至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％同一性，或包含SEQ ID NO:1，并且非编码序列整合在所述内含子中的两个核苷酸之间，所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO：1的位置25至55的任意两个核苷酸。
在一些方面，所述非编码序列是非原核和非病毒的。在一些方面，非编码序列是真核序列。在一些方面，非编码序列包含内含子、UCOE、S/MAR、SV40增强子序列(例如，一个或一个以上SV40增强子序列，例如两个、三个、四个、五个或更多个SV40增强子序列)、脊椎动物染色质绝缘子(例如，cHS4)、WPRE或其任何组合。
在一些方面，所述非编码序列是S/MAR。在一些方面，S/MAR是MAR-5，在本文中提供为SEQ ID NO:9。
在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：3至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，5'UTR包含SEQ ID NO：3。
在一些方面，所述5'UTR包含与SEQ ID NO：5至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，5'UTR包含SEQ ID NO：5。
在一些方面，所述3'UTR包含两个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：13至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：13。
在一些方面，所述3'UTR包含两个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：14至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：14。
在一些方面，所述3'UTR包含一个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和一个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号。在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：15至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：15。
在一些方面，所述3’UTR还包含poly(A)尾，其包含100至120个腺嘌呤核苷酸，即100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119或120个腺嘌呤核苷酸。
在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：16至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：16。
在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：17至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：17。
在一些方面，所述3'UTR包含与SEQ ID NO：18至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，所述3'UTR是SEQ ID NO：18。
本文提供了包含合成增强子的表达载体，所述合成增强子包含与SEQ ID NO：12至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，表达载体包含合成增强子，所述合成增强子包含SEQ ID NO：12的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的多个连续拷贝，例如1、2、3、4、5或更多个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含所述核酸序列的3个连续拷贝。在一些方面，合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，合成增强子包含SEQ ID NO：46的核酸序列。
本文提供表达载体，其包含与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38或SEQ ID NO：39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列。在一些方面，表达载体包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQID NO:39的核酸序列。在一些方面，与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38或SEQ ID NO:39至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的核酸序列、或SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核酸序列，包含了表达盒中位于表达载体的目的核酸序列5'的所有调节元件。
V.组合物
本文提供了包含本文所述的表达载体或无细菌序列载体的组合物。
多种方法是本领域已知的并且适于将核酸引入细胞中。实例包括但不限于电穿孔、磷酸钙介导的转移、核转染、声致穿孔(sonoporation)、热休克、磁转染、脂质体介导的转移、显微注射、微弹介导的转移(纳米颗粒)、阳离子聚合物介导的转移(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)或细胞融合。
纳米颗粒运载体例如脂质体、胶束和聚合物纳米颗粒已被研究用于通过各种机制(例如增强渗透性和保留(EPR)效应)来改善治疗剂的生物利用度和药代动力学性质。
其他改进可以通过将靶向配体缀合到纳米颗粒上以实现向靶细胞的选择性递送。例如，受体靶向的纳米颗粒递送已被证明可以改善体外和体内的治疗反应。已研究的靶向配体包括叶酸、转铁蛋白、抗体、肽和适体(aptamer)。此外，可以将多种功能纳入纳米颗粒的设计中，例如，以允许成像和触发细胞内药物释放。
在一些方面，本发明组合物还包含递送剂。在一些方面，递送剂是纳米颗粒。在一些方面，递送剂选自脂质体、非脂质聚合物分子、内体(endosomes)及其任何组合。
在一些方面，递送剂(例如，纳米颗粒)包含靶向配体。
在一些方面，所述组合物还包含生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd ed.(2013)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以包括对个体无毒的那些载体、赋形剂或稳定剂。在一些方面，所述组合物或组合物的一种或多种组分是无菌的。无菌组分可以例如通过过滤(例如，通过无菌过滤膜)或通过辐射(例如，通过γ辐射)来制备。
在一些方面，包含如本文所述的表达载体或无细菌序列载体的组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。
当添加到药物组合物中时，本发明的赋形剂可以被描述为“药学上可接受的”赋形剂，这意味着该赋形剂是这样的化合物、材料、组合物、盐和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触，并且在与合理的效益/风险比相符合的期望接触期中，不引起过度的毒性、刺激、变应反应或其他有问题的并发症。在一些方面，术语“药学上可接受的”是指，对于动物且尤其是人类应用而言，得到联邦或州政府的监管机构批准、或被记载在美国药典或其他普遍认可的国际药典中。可以使用各种赋形剂。在一些方面，赋形剂可以是但不限于，碱性剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、分离剂、包衣剂、外相组分、控释组分、溶剂、表面活性剂、湿润剂、缓冲剂、填充剂、润滑剂或其组合。除了在此讨论的赋形剂之外，赋形剂还可以包括但不限于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nded.(2013)中列出的赋形剂。在本文中，将一种赋形剂纳入特定分类(例如“溶剂”)旨在举例说明而非限制该赋形剂的作用。一种具体的赋形剂可以属于多个类别。
本公开的药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。示例性的施用途径包括肠内、局部、肠胃外、口服、肺部、鼻内、静脉内、表皮、透皮、皮下、肌内或腹膜内施用，或吸入。本文所用的“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射或输注，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外、胸膜内和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些方面，制剂通过非肠胃外途径施用，在一些方面，通过口服施用。其它非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部施用。
在一些方面，药物组合物是冻干的。
VI.治疗用途和方法
本文提供一种在有需要的个体中治疗疾病或疾病的方法，包括向所述个体施用本文描述的表达载体，无细菌序列载体或药物组合物。
所述表达载体、无细菌序列载体或组合物可以通过任何可有效治疗疾病或病症的施用途径施用于个体。
在一些方面，施用是肠内、局部、肠胃外、口服、肺、鼻内、静脉内、表皮、透皮、皮下、肌内、鞘内或腹膜内施用、吸入、或是通过脑室内(ICV)注射、小脑延髓池给药(ICM)或腰椎鞘内穿刺(LIT)的基于脑脊液(CSF)的递送。
在一些方面，施用是通过肠胃外或非肠胃外的施用。
在一些方面，肠胃外施用是通过注射或输注施用。
在一些方面，肠胃外施用是通过静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、眼眶后、脑室内、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸膜内或胸骨内注射或输注，或通过体内电穿孔、核转染、微泡或超声的施用。
在一些方面，非肠胃外施用是口服、局部、表皮、粘膜、鼻内、阴道、直肠或舌下施用。
在一些方面，施用是通过口服、肺部、鼻内、静脉内、表皮、经皮、皮下、肌内或腹膜内施用，或通过吸入施用。
在一些方面，施用是通过口服、鼻或肺的施用。在一些方面，施用是通过鼻施用。
施用可以例如一次、多次和/或在一个或多个长时期内进行。在一些方面，施用是一次、两次(例如，第一次施用，随后在约1、约2、约3、约4或更多周后进行第二次施用)、约每周一次、约每月一次、约每2个月一次、约每3个月一次、约每4个月一次、约每6个月一次、约每年一次或约每十年一次。
本文提供了一种基因编辑的方法，包括将来自如本文所述的表达载体、细菌无序列载体或药物组合物的目的核酸序列插入到基因编辑的靶位点中。
在一些方面，插入是通过非同源末端连接进行的。
在一些方面，插入是通过同源定向修复进行的。在一些方面，目的核酸序列的侧翼具有如本文所述的5'和3'同源臂。
在一些方面，目的核酸序列与用于基因编辑的靶位点同源，并且与靶位点相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失、倒置或重排。
在一些方面，目的核酸序列与基因编辑的靶位点非同源。
在一些方面，目的核酸序列恢复缺失的功能、纠正异常的功能、或提供与基因编辑的靶位点相关的其他功能。
在一些方面，目的核酸序列用于敲除与基因编辑的靶位点相关的基因表达。
在一些方面，基因编辑方法是治疗有需要的个体的疾病或病症的方法。
在一些方面，目的核酸序列用于体内基因编辑。
在一些方面，目的核酸序列用于体外基因编辑。
在一些方面，目的核酸序列用于离体基因编辑(例如，细胞疗法，诸如CAR T细胞疗法)。
在一些方面，所述方法是体外方法。在一些方面，所述体外方法还包括向细胞施用本发明的表达载体、无细菌序列载体或药物组合物(例如，用于体外或离体基因编辑)。在一些方面，所述体外方法还包括向细胞施用用于基因编辑的核酸内切酶、或基因组编辑系统或其组分(例如，用于CRISPR-Cas系统的Cas核酸内切酶和gRNA)。在一些方面，基因组编辑系统是CRISPR-Cas、TALEN、ZFN或大范围核酸酶基因编辑系统。
在一些方面，所述方法是体内方法。在一些方面，所述体内方法还包括向个体施用本发明的表达载体、无细菌序列载体或药物组合物。在一些方面，所述体内方法还包括向个体施用用于基因编辑的核酸内切酶、或基因组编辑系统或其组分(例如，用于CRISPR-Cas系统的Cas核酸内切酶和gRNA)。在一些方面，基因组编辑系统是CRISPR-Cas、TALEN、ZFN或大范围核酸酶基因编辑系统。
用于基因编辑的核酸内切酶或基因组编辑系统或其组分，可以通过本文描述的或本领域已知的用于向细胞或个体施用核酸序列和/或多肽的任何方法来施用，包括通过电穿孔或适用于施用的载体。例如，在包含CRISPR-Cas系统的方面，可以施用编码Cas的RNA和/或gRNA，可以直接施用Cas和/或gRNA，可以施用本文所述的编码Cas和/或gRNA的无细菌序列载体或表达载体，或可以施用本领域已知的编码Cas和/或gRNA的任何其他合适的载体。
在一些方面，目的核酸以本文所述的线性共价闭合无细菌序列载体(即，msDNA)提供。在一些方面，在基因编辑中使用所述线性共价闭合无细菌序列载体，可以避免任何不期望的非同源末端连接，因为无细菌序列载体的末端是闭合的，不与双链断裂发生反应。在一些方面，在基因编辑中使用所述线性共价闭合无细菌序列载体，可以增强同源定向修复。在一些方面，当目的核酸序列由本文所述的线性共价闭合无细菌序列载体提供时，相比当目的核酸序列由环状超螺旋载体提供时，同源定向修复的重组率更高。
提供以下实施例是为了举例说明而非限制。
实施例
实施例1–含有嵌合内含子或5'UTR的表达载体
A.表达载体
将亲本ministring表达载体pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*(MediphageBioceuticals,Inc.,Toronto,CA,U.S.Patent Nos.9,290,778和9,862,954)中的eGFP编码序列，替换为编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和经修饰的萤光素酶报告分子的表达盒，以使其位于亲本载体的两个专门的超级序列(SS*)位点之间，由此制备多基因表达载体，其中所述/>萤光素酶报告分子经修饰而具有用于细胞外表达的分泌序列(NLuc,Promega Corporation)。
亲本载体和多基因载体的表达盒含有CAG启动子，其是包含巨细胞病毒(CMV)增强子、来自鸡β-肌动蛋白的启动子和嵌合内含子的合成启动子。
多基因表达载体的图谱如图1所示(pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*)，其包含位于多基因表达盒侧翼的具有重组酶靶序列(telL,FRT(最小)和loxP)的专门超级序列位点(SS*)，其中所述多基因表达盒包含CAG启动子、编码通过P2A和T2A自切割肽连接的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和分泌型纳米萤光素酶(SecNLuc)的序列(SecNLuc-2A-eGFP)、和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(BGpA)。所述载体的核酸序列以SEQ ID NO：19提供。
通过将相同的eGFP和Nluc序列连同5'UTR克隆到pcDNA3.1载体(Thermo FisherScientific)中，制备了第二多基因表达载体。所述表达载体的图谱如图2所示(载体pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)，所述表达载体包含多基因表达盒，该多基因表达盒含有CMV增强子/启动子、编码通过P2A自切割肽连接的eGFP和SecNLuc的序列(SecNLuc-P2A-eGFP)和牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpA)。所述载体的核酸序列以SEQ ID NO：20提供。
B.转染HEK293细胞
将贴壁的人胚肾293(HEK293)细胞以1x105个细胞/孔接种到24孔板中。
针对(1)pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*,(2)pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA,和(3)pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*，分别使用标准操作程序制备表达载体(1μg)和lipofectamine(3μL)的复合物并进行温育。
使用这三种复合物通过电穿孔分别转染孔中的HEK293细胞，然后孵育48小时。其他孔中的HEK293细胞用3μL不含质粒的lipofectamine处理作为阴性对照。
转染后48小时评估细胞的细胞质GFP表达和萤光素酶表达。
C.细胞质GFP表达
细胞质GFP表达被用作多基因表达载体的转染效率和基因表达水平的量度。通过荧光显微镜评估表达，并且相对于阴性对照(用无质粒的lipofectamine处理的细胞)和阳性对照(pGL2-SS*-CAG-eGFP-BGpA-SS*)(本文也称为亲本质粒CAG-GFP，即PP-CAG-GFP)，对实验表达载体(pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*和pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)的平均GFP表达/强度进行测量。
自动曝光模式下，荧光细胞的活细胞成像表明，实验表达载体产生了GFP，其中具有嵌合内含子的pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*和具有5'UTR的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA具有相似的表达。参见图3和4。基于平均相对荧光强度，与阳性对照相比，实验表达载体的多基因表达不影响GFP表达。同上(Id.)。转染实验表达载体的细胞中的平均荧光强度，比阴性对照细胞至少高3倍。参见图4。
D.萤光素酶表达
使用萤光素酶测定系统(Promega)，根据制造商方案，测量转染细胞和阴性对照细胞的培养基中分泌的萤光素酶的强度，从而评估萤光素酶表达。两种实验表达载体均表达萤光素酶。参见图5。用实验表达载体转染的细胞的培养基中的平均相对萤光素酶强度，比阴性对照细胞的培养基中至少高300倍。同上(Id.)
实施例2—含有WPRE和工程化5'UTR的表达载体
A.表达载体
通过在图1的表达载体中在编码eGFP的序列和BGpA之间克隆土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)来制备多基因表达载体。所得表达载体的图谱如图6所示(pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*)。所述载体的核酸序列提供为SEQ ID NO：21。
制备了另一种多基因表达载体，其含有CMV增强子/启动子和工程化的5'UTR以代替图6中的CAG启动子，其中所述工程化的5'UTR含有内部最小内含子序列(即，5'UTR1，SEQID NO:2)。所得表达载体的图谱如图7所示(pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*)。所述载体的核酸序列提供为SEQ ID NO：22。
制备了另一种多基因表达载体，其含有CMV增强子/启动子和工程化的5'UTR以代替图6中的CAG启动子，其中所述工程化的5'UTR含有其中整合了MAR-5的内含子(即，5'UTR2，SEQ ID NO:5)。所得表达载体的图谱如图8所示(pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*)。所述载体的核酸序列提供为SEQ ID NO：23。
B.萤光素酶表达水平和持久性
消化贴壁的HEK293细胞，分散在电穿孔介质中，并以1x106个细胞/管进行计数。
针对(1)pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(参见实施例1),(2)pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,(3)pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,和(4)pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*，分别使用标准操作程序制备表达载体(1μg)并与细胞一起孵育。
用缺乏哺乳动物表达盒的puc57质粒电穿孔的HEK293细胞作为阴性对照。
电穿孔后，HEK293细胞以3x105个细胞/孔接种并在孔中贴壁。
在电穿孔后第2、6、10、14、17、20、27和34天，针对4种转染之每一个和阴性对照，使用Nano-萤光素酶测定系统(Promega)，根据制造商方案，一式三份测量20μL细胞培养基中分泌的萤光素酶的强度，来评估萤光素酶表达。使用/>酶标仪测量萤光素酶活性，并以相对发光光度计单位(RLU)显示。通过Student T检验进行萤光素酶活性的统计分析。参见图9，其中显示了，相对于阴性对照(Neg.Ctl.(无质粒))，用pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(pGL2-SecNLuc-eGFP),pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(WPRE),pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(5'UTR1+WPRE)或pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(5'UTR2+WPRE)转染的细胞的培养基中的表达水平。*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001和****＝p<0.0001。
在整个实验期间，从转染了四种表达载体中的任一种的细胞中均检测到萤光素酶表达。与pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*相比，pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*和pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*均显示出显著更高的萤光素酶表达，其中pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*显示最高的表达增强。
C.载体扩增至子代细胞和萤光素酶表达
如本实施例B部分所述，HEK293细胞用四种表达载体或puc57质粒(作为阴性对照)转染。细胞每周传代五次。在细胞传代时，对于第1-3代细胞，以原始细胞密度的1/6重新接种细胞；对于第4-5代细胞，以原始细胞密度的1/10重新接种。对于每次细胞传代，如本实施例B部分所述，在细胞重新接种后6-8天测量分泌的萤光素酶表达。参见图10，显示了在每个代次，与阴性对照相比，载体转染的细胞的培养基中的表达水平。统计分析和p值如本实施例B部分所述。
在每个代次，从四种表达载体中的任一种转染的细胞中均检测到萤光素酶表达，表明载体被传递给子代细胞，具有持久的萤光素酶表达。与pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*相比，pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,和pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*在每个代次均显示出显著更高的萤光素酶表达，其中pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*显示最高的表达增强。
在随后的研究中，也观察到msDNA扩增到子代细胞，具有持久的萤光素酶表达。
简言之，使用本文和美国专利号9,290,778和9,862,954中描述的方法，在诱导型大肠杆菌载体生产系统中，从pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*产生了msDNA。使用(1)msDNA(即msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA)(2)亲本质粒(即pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*)以及(3)带有萤光素酶表达盒的常规质粒(即pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA)，分别制备了与lipofectamine的复合物。以总共0.25pmol载体/孔，通过电穿孔，分别用这些载体转染了孔中的HEK293细胞。细胞传代7次，其中每次传代，细胞稀释10倍。分别在第8、15、24、31、38、45和52天测定第1、2、3、4、5、6和7代的相对萤光素酶强度。
如图11所示，pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(即,pDNA(CMV+U1+W))和msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(即,msDNA(CMV+U1+W))在所有代次中都表现出比pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(即，不含超级序列的常规质粒(常规pcDNA))高得多水平的持久转基因表达。与常规质粒的数据集相比，**＝p<0.01,***＝p<0.001和****＝p<0.0001。
D.载体扩增至子代细胞和eGFP表达
根据本实施例C部分，用pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(pGL2-SecNLuc-eGFP)或pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(5'UTR1+WPRE)转染并传代细胞，并分析其eGFP表达。
对于每个代次，在细胞传代后6至8天进行成像。使用CytationTM 5读板仪进行活细胞成像。参见图12A，显示了第1、2、3和5代HEK-293细胞中荧光的代表性显微照片。在每个代次，用任一表达载体转染的细胞中都检测到eGFP表达，表明这些载体均已传递到子代细胞，具有eGFP的持久表达。与pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*相比，pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*在每个代次上都显示出更强的荧光信号，表明转染效率更高。
对于每种表达载体，从一式三份的孔中各获取一张代表性图像，并且使用ImageJ计算机软件通过手动细胞计数，定量了eGFP表达细胞(GFP+)数。使用Student t检验对GFP+细胞进行统计分析。参见图12B，显示了在每代次从一式三份的活细胞荧光图像的视野中观察到的GFP+细胞的线图(一式三份图像的差异不显著(ns)＝p>0.05)。
使用ImageJ软件，手动选择每个GFP+细胞并基于像素强度测量每个细胞的平均荧光强度(MFI)。为了计算每个细胞的最终MFI值，使用以下公式(最终MFI＝细胞MFI-背景MFI)。从每个处理组采集的3张图像之每张中获得至少50个细胞的MFI测量值。然后汇总所有MFI测量值并用于生成点图。使用Student t检验进行统计分析。参见图12C，显示了第5代的MFI点图，其中pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*的n＝257个细胞，pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*的n＝414个细胞，****＝p<0.0001。图12C中的条形图显示了所有测量的GFP+细胞的平均MFI值。经测量，pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*的MFI比pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*高大约3倍。
实施例4—在动物模型中使用msDNA进行非病毒递送
进行研究以评估msDNA向肝脏、视网膜和脑的靶向递送。对于每个靶组织，评估了不同的给药途径(ROA)、剂量、给药方案和递送技术。评估了分泌型萤光素酶表达动力学、细胞质eGFP表达水平和转染效率(TE)。此外，在单次或多次注射后，通过生理学评估、组织形态分析、血浆细胞因子测定和肝毒性分析，评估了对msDNA的耐受性。
在所有递送技术中，通过多次脑室内(ICV)或流体动力学注射(HDI)和静脉内(IV)注射，msDNA在脑和肝组织中显示出强的功效和耐受性质。在单次IV注射后，用msDNA处理的成年小鼠显示出了持续的分泌萤光素酶水平(>108RLU/mg蛋白质)。单次IV注射后，msDNA在肝组织中显示出持久(>100天)表达。还证明了向深部组织区域的显著生物分布，其中80％至97％ TE在脑干、小脑、皮层和丘脑中。使用纳米载体-msDNA复合物进行的三次ICV注射没有显示出任何副作用。
A.肝脏
1.单次高剂量2mg/kg(50μg)流体动力学注射无运载体(carrier-free)裸质粒的萤光素酶表达
C57BL/6J雄性野生型成年8-12周龄小鼠，通过尾静脉流体动力注射(HDI)，接受单次高剂量2mg/kg(50μg)的无运载体pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(无超级序列的阳性对照)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*,pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*。在HDI后第1、3、7、10、15、22、28、42和56天收集处理后小鼠的血浆以检查萤光素酶基因表达。在载体施用后第1天，所有小鼠均表现出高水平的萤光素酶表达(每毫克血浆蛋白108 -109RLU)。在第7天，pCAGLuc和pCAGLuc-WPRE处理的小鼠产生了107 -108RLU/mg血浆蛋白，但pGSNLuc-WPRE处理的小鼠产生了较低的萤光素酶水平(约106RLU/mg蛋白质)。载体给药8周后，所有小鼠均表现出低水平的萤光素酶表达(约105RLU/mg蛋白质)。萤光素酶水平的快速下降可能是由于在质粒处理的小鼠中诱导的体液或细胞介导的免疫反应所致。参见图13-14。
2.单次低剂量0.2mg/kg(5μg)流体动力注射无运载体裸质粒的萤光素酶表达
为了在动物模型中测试非病毒基因递送后质粒DNA的剂量反应，对C57BL/6J雄性野生型成年8-12周龄小鼠，通过尾静脉HDI，施用单次低剂量0.2mg/kg(5μg)无运载体pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(无超级序列的阳性对照，2只小鼠)、pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*(2只小鼠)或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*(2只小鼠)。另外2只小鼠不进行注射并作为阴性对照。HDI后第1、3、7、10、15、22、28、42和56天收集小鼠血浆以检查萤光素酶基因表达。用pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*和pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*处理的小鼠，在载体施用后超过8周，表现出持续高水平的萤光素酶表达(107 -108RLU/mg蛋白质)，且表达量比具有同基因表达盒但无超级序列(SS)的常规对照质粒高100倍以上。参见图15。
通过在HDI载体后24小时腹膜内注射1:5稀释的fluorofurimazine(FFz)，利用IVIS进行体内全身生物发光成像(BLI)。该BLI显示与血浆样本中的萤光素酶水平相关(数据未显示)。
3.单次低剂量0.2mg/kg(5μg)流体动力学注射无运载体裸msDNA的萤光素酶表达
在诱导型大肠杆菌载体生产系统中，使用本文和美国专利号9,290,778和9,862,954中描述的方法，由pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*和pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*产生了msDNA。
通过尾静脉流体动力注射(HDI)，对C57BL/6J雄性野生型成年8-12周龄小鼠施用了单次低剂量0.2mg/kg(5μg)的无运载体pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照，5只小鼠)、msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(5只小鼠)或msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(5只小鼠)。另外2只小鼠不进行注射并作为阴性对照。在HDI后第1、3、7、10、15、22、28、42和56天收集处理后的小鼠的血浆以检查萤光素酶基因表达。
与质粒处理的小鼠类似，msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA处理的小鼠在载体施用后超过8周产生持续高水平的萤光素酶表达(107 -108RLU/mg蛋白质)，而msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA处理的小鼠中的萤光素酶表达在不到一个月的时间内降至低水平(～106RLU/mg蛋白质)。msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA处理的小鼠中萤光素酶表达的快速下降可能是由于肝细胞中CMV启动子的沉默所致。
萤光素酶基因表达通过使用IVIS的全身活体成像来证实。
下面的表1提供了在第1、7和28天来自小鼠个体的数据，包括血浆样品中的萤光素酶表达数据(RLU/mg蛋白质)以及通过BLI检测的数据(光子/秒)。
表1
如图16所示，在HDI后第56天，与亲本质粒pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*相比，用msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA处理的小鼠表现出萤光素酶表达增加10倍。
该数据说明，用msDNA在小鼠中进行非病毒递送是高效的，并且所得基因表达的稳定性超过两个月。
4.单次低剂量0.2mg/kg(5μg)流体动力学注射无运载体裸msDNA的eGFP表达
通过ELISA评估细胞内的细胞质eGFP表达水平。简言之，如第3部分中所述，使用单次低剂量0.2mg/kg(5μg)载体进行HDI后第56天，从小鼠收集肝脏样本，并均质化以提取蛋白质。从肝脏裂解物中测定总蛋白浓度。然后通过ELISA分析GFP蛋白水平。
通过将图17中的数据与萤光素酶的数据进行比较，可以明显看出，细胞质GFP表达水平与来自相同构建体的萤光素酶的分泌水平直接相关。
如图18所示，单次HDI尾静脉注射5μg无运载体msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BgpA，在HDI后最少56天，在肝组织中显示了强且持久的细胞质eGFP表达。
5.低剂量单次静脉注射后肝脏中msDNA的表达及耐受性情况
对C57BL/6J雄性野生型成年8-12周龄小鼠，通过单次静脉内尾静脉注射，施用0.3mg/kg的pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(无超级序列的阳性对照)、msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA,pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*与脂质纳米颗粒运载体的脂质复合物。所述运载体(carrier)也充当阴性运载体对照。
在单次IV注射载体后的第1、3、10、30、58、92、119和174天，如上所述使用IVIS进行体内全身生物发光成像(BLI)。如图19所示，msDNA构建体优于前体和常规质粒，显示出高且持久的萤光素酶分泌。
注射载体后还评估了血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平、肝细胞毒性和细胞因子反应。与含有CMV启动子的构建体相比，含有CAG启动子的前体质粒和msDNA显示出更高的耐受性。然而，与CMV前体亲本和常规质粒相比，含有CMV启动子的msDNA显示出显著较低的细胞因子和肝脏毒性反应。参见下
表2，显示了注射后4小时和14天的细胞因子浓度(pg/mL)和肝功能标志物的酶浓度(U/L)。
B.脑
使用本文和美国专利号9,290,778和9,862,954中描述的方法，在诱导型大肠杆菌载体生产系统中，从pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*和pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*，产生了msDNA。
通过植入的插管，在植入后第0、14和28天，进行3次脑室内(ICV)注射，每次注射1μg DNA，向成年野生型小鼠施用以纳米运载体配制的msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(3只小鼠)或以纳米运载体配制的msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(3只小鼠)。植入后第42天对动物实施安乐死，并从皮层、丘脑、脑干和小脑收集矢状脑切片。
图20显示来自注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的处理组的小鼠#1的皮层、丘脑、脑干和小脑切片。在切片中msDNA的转染效率被确定为在皮层、丘脑、脑干和小脑(浦肯野细胞)中分别为81.9％、73.0％、69.2％和96.0％。转染效率计算为所有DAPI阳性细胞中GFP和DAPI均呈阳性的细胞的百分比。
在注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的处理组的小鼠#1和注射了对照质粒pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA的小鼠的皮层、丘脑和脑干切片中比较GFP表达，显示msDNA与该常统质粒相比，转染效率和由此获得的GFP表达更高(数据未显示)。
来自注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的处理组的小鼠#2的皮层和丘脑的切片显示在图21中，脑干和小脑的切片显示在图22中。神经元用神经元标记物NeuN标记，转染的细胞显示表达GFP。皮层、丘脑、脑干和小脑(浦肯野细胞)中的转染效率分别确定为99.6％、98.8％、98.5％和80.8％。转染效率计算为所有NeuN阳性细胞中GFP和NeuN均呈阳性的细胞的百分比。
来自注射了msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA的处理组的小鼠#1的皮层和丘脑的切片显示在图23中，脑干和小脑的切片显示在图24中。神经元用神经元标记物NeuN标记，转染的细胞显示表达GFP。皮层、丘脑、脑干和小脑(浦肯野细胞)中的转染效率分别确定为91.1％、88.8％、73.7％和92.1％。转染效率计算为所有NeuN阳性细胞中GFP和NeuN均呈阳性的细胞的百分比。
下面的表3总结了上面讨论的注射了msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(“CAG-WPRE”)或msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA(“CMV-WPRE”)的小鼠的转染效率。
表3.
通过植入的插管重复ICV注射导致了良好的整体组织完整性，没有细胞毒性或神经变性的迹象。
数据显示，msDNA是可反复给药的并且在多个脑区域中导致了高转染效率、生物分布和转基因表达，而没有形态学副作用。
实施例5—人细胞中的功效和安全性
pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(阳性对照),msDNA-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA,pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*,msDNA-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA,或pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*分别与脂质纳米颗粒运载体进行脂质复合。
人T细胞(Pan-T(TA+))和肝细胞(Huh7)用0.3μg/mL或1μg/mL剂量的所述脂质复合的载体转染。
与亲本和常规质粒相比，脂质复合的msDNA载体在转染后第3天和第5天在两种细胞类型中均显示出高表达。参见图25-26。
脂质复合的msDNA在离体的人外周血单个核细胞(PBMC)中也具有良好的耐受性。特别是，与常规质粒相比，msDNA在人PBMC中显示出显著较低的细胞因子谱水平(数据未显示)。
实施例6—使用msDNA的同源定向修复
进行研究，与常规质粒DNA相比，评估由msDNA介导的同源定向修复。
使用包含侧翼为5'和3'同源臂的目的基因(GOI)的表达盒，产生常规质粒(质粒DNA HDR-GOI-HDR)。
产生msDNA表达载体，其具有与常规质粒中所用相同的HDR-GOI-HDR序列，并在该序列侧翼具有两个超级序列位点。然后使用本文和美国专利号9,290,778和9,862,954中描述的方法，在诱导型大肠杆菌载体生产系统中产生含有所述HDR-GOI-HDR的msDNA(msDNAHDR-GOI-HDR)。
用等摩尔浓度的质粒DNA HDR-GOI-HDR或msDNA HDR-GOI-HDR与CRISPR基因编辑系统，转染诱导性多能干细胞(iPSC)，以介导GOI的同源定向修复敲入(HDR KI)。
转染后第3、7和15天，相对于转染细胞的总数，通过荧光激活细胞分选(FACS)，计数在其表面上表达GOI的完整健康iPSC的总数，以评估GOI的同源定向修复敲入(HDR KI)效率。如图27B、28B和29A的Q3中所示，常规质粒在转染后3、7和15天的HDR KI效率分别为8.60％、7.76％和8.05％。如图27C、28C和29B的Q3中所示，对于msDNA，在转染后3、7和15天观察到较高的HDR KI效率，分别为15.4％、15.4％和15.7％。
实施例7—含有调节序列修饰的表达载体
A.表达载体
含有两个超级序列位点、CMV增强子/启动子、含有内部最小内含子序列的工程化5'UTR以及编码eGFP和Nluc的多基因表达盒的表达载体(如实施例1和2中所述)，也被设计以包含：含有两个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号和120个腺嘌呤核苷酸的3'UTR(即，2huBGpA-A120，SEQ ID NO：17)，以及以下的一项或多项：(1)位于CMV增强子5'端的合成增强子(即，增强子-1(E1))，SEQ ID NO：12)，(2)位于3'UTR的5'端的WPRE，(3)位于5'超级序列的3'端的SRF-UCOE；和(4)位于eGFP的3'端的人CSP-B MAR(huMAR)。设计的载体的图谱如图30-38所示。图30显示含有所述3'UTR的表达载体(SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:24)的图谱。图31显示包含所述E1和3'UTR的表达载体(SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:25)的图谱。图32显示包含所述E1、WPRE和3'UTR的表达载体(SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:26)的图谱。图33显示包含所述UCOE、E1、WPRE和3'UTR的表达载体(SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:27)的图谱。图34显示包含所述E1、huMAR和3'UTR的表达载体(SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:28)的图谱。图35显示包含所述UCOE、E1、huMAR和3'UTR的表达载体(SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:29)的图谱。图36显示包含所述UCOE、E1、WPRE和3'UTR的表达载体(SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:30)的图谱。图37显示包含所述E1、huMAR、WPRE和3'UTR的表达载体(SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:31)的图谱。图38显示包含所述UCOE、E1、huMAR、WPRE和3'UTR的表达载体(SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,SEQ ID NO:32)的图谱。
B.萤光素酶表达水平
用(1)图2所示常规质粒pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA,(2)SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,(3)SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*,和(4)SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*，通过标准操作程序，分别转染HEK293细胞。
在电穿孔后第2、3、7、10、14、21和28天，如实施例2B中所述，通过测量培养细胞的培养基中分泌的萤光素酶的强度来评估萤光素酶表达。参见图39，显示了在pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA(常规pDNA CMV-U),SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*(A:CMV-U1-3'UTR),SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*(B:E1-CMV-U1-3'UTR),和SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2hBGpA-A120]-SS*(C:E1-CMV-U1-WPRE-3'UTR)转染的细胞的培养基中的表达水平。
如图39所示，与具有相同启动子和多基因表达盒的常规质粒相比，在含有所述3'UTR的msDNA表达载体中萤光素酶表达增加且持久。通过向所述msDNA表达载体中添加E1(Avs B)和WPRE(B vs C)遗传元件，表达进一步增加，并且E1和WPRE遗传元件的相加效应导致了与构建体C相关的最高萤光素酶表达。使用t检验进行统计分析。*＝p<0.05以及**＝p<0.01。
C.载体扩增至子代细胞和萤光素酶表达
HEK293细胞用本实施例B部分中描述的四种表达载体转染。细胞每7天传代一次，共传代五次。在细胞传代时，以原始细胞密度的1/10重新接种细胞。对于每次细胞传代，如实施例2B中所述测量分泌的萤光素酶表达。参见图40，显示了与常规质粒相比，用msDNA表达载体转染的细胞的培养基中的表达水平。统计分析和p值如本实施例B部分所述。
在每个代次，在任何msDNA表达载体转染的细胞中均检测到了萤光素酶表达，说明这些载体被传递至子代细胞并具有持久萤光素酶表达。
如图40所示，，E1和WPRE遗传元件的相加效应导致了在每个代次与构建体C相关的最高萤光素酶表达以及在多次传代后最持久的表达。
实施例8—含有合成启动子序列的表达载体
A.表达载体
产生了五种合成启动子序列：(1)CAG[E1X3+CBA启动子+内含子](SEQ ID NO:35)，含有三个拷贝的合成增强子E1(即，3个拷贝的SEQ ID NO:12)、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子，(2)CAG[E2+CBA启动子+内含子](SEQ ID NO：36)，含有E2(U100)、鸡β-肌动蛋白启动子和嵌合内含子，(3)CAG[E1X3+CBA启动子+UTR1](SEQ ID NO:37)，含有三个拷贝的合成增强子E1、鸡β-肌动蛋白启动子和5'UTR1(即SEQ ID NO:2)，(4)CAG[E2(U100)+CBA启动子+UTR1](SEQ ID NO：38)，含有E2(U100)、鸡β-肌动蛋白启动子和5'UTR1，和(5)CMV增强子-EF1-UTR1(SEQ ID NO:39)，包含CMV增强子、EF1a短启动子和5'UTR1。
如实施例1和2所述，产生含有CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子和编码eGFP和Nluc的多基因表达盒的常规质粒。常规质粒的图谱如图41所示(pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin polyA,SEQ ID NO:34)。
产生了含有两个超级序列位点、CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、嵌合内含子、编码eGFP和Nluc的多基因表达盒、WPRE和3'UTR的msDNA表达载体。载体图谱如图42所示(4-1pGL2-SS*-CAG[CMV增强子+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:40)。
产生了五种msDNA表达载体，其含有两个超级序列位点、编码eGFP和Nluc的多基因表达盒、WPRE和3'UTR以及如上所述的合成启动子(1)-(5)之一，所述载体的图谱分别显示于图43(4-2pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:41)、图44(4-3pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:42)、图45(4-4pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:43)、图46(4-5-pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:44)、和图47(4-6-pGL2-SS*-CMV增强子-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*,SEQ ID NO:45)。
B.萤光素酶表达水平
HEK293细胞以1x105个细胞/孔接种在24孔板中，并分别用lipofectamine和本实施例A部分中描述的载体的复合物以0.25pmol DNA/孔转染。如实施例2B中所述，在转染后第3天和第6天测量分泌的萤光素酶表达。参见图48，显示了与常规质粒相比，用msDNA表达载体转染的细胞的培养基中的表达水平。使用双向Anova分析，相对于常规质粒，进行统计分析。*＝p<0.05，**＝p<0.01，****＝p<0.0001。
与常规质粒相比，所有msDNA表达载体的萤光素酶表达水平都更高。使用包含EF-1启动子元件以及CMV增强子和5'UTR1的4-6-pGL2-SS*-CMV增强子-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA(4-6:CMV-EF1-UTR1-W-3'UTR)，观察到最高表达。
实施例9—SS和表达盒修饰
根据转染效率、目的核酸序列的表达(包括报告基因，例如如实施例1和2中所述的多基因GFP和萤光素酶表达盒)、以及载体在分裂细胞(包括快速和慢速分裂细胞)中的持久性/扩增，评估对本公开的表达载体的超级序列(SS)和表达盒进行修饰的影响。此外，针对在SS位点上的限制性酶活性，评估SS的修饰。
修饰将包括单独的修饰和组合修饰，例如但不限于：整合在载体主链和重组酶切割位点之间位于SS的重组酶非结合区中的核酸内切酶靶序列；整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端(即5'SS的3'端)和启动子的5'之间的CAG启动子；整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端(即5'SS的3'端)和启动子的5'之间的CMV增强子；位于CMV增强子的5'和/或UCOE的3'的增强子-1序列；CMV、EF1、SV40、CAG、Rho、VDM2、HCR或HLP启动子或其变体、CMV启动子变体、EF1-α启动子、合成启动子；整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间包含内含子的5'UTR，其中所述内含子中整合或未整合非编码序列(例如，包含SEQ ID NO:2-5中任一项的核酸序列的5’UTR)；整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子；整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件；整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的支架/基质附着区；位于表达盒中启动子5'的遍在染色质开放元件(例如，在5'SS的3'处并且在表达盒中的其他序列之前)；整合在表达盒中位于目的核酸和3’SS之间的3’UTR，例如直接在终止密码子之后(例如，包含SEQ ID NO:13-16中任一项的核酸序列的3’UTR)；和/或包含100至120个腺嘌呤核苷酸的poly(A)尾(例如，作为3'UTR的3'端)。
序列
SEQ ID NO:1人工内含子
gtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcag
SEQ ID NO:2 5'UTR1
ctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttcca
SEQ ID NO:3 5'UTR1具有MAR-5插入
ctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatagtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttcca
SEQ ID NO:4 5'UTR
attgggatcttcacacagcaggtaaggttgcgggccgggcctgggccgggtccgggccgggccgcactgacccctggtgttgctttttttttttaggccgcaagctgaagcgtgtcc
SEQ ID NO:5 5'UTR2(SEQ ID NO:4的5'UTR，具有MAR-5插入)
attgggatcttcacacagcaggtaaggttgcgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatagccgcactgacccctggtgttgctttttttttttaggccgcaagctgaagcgtgtcc
SEQ ID NO:6A2UCOE元件
gcggccgcacgcgtggccctccgcgcctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcgcgcggggccgccggggggaggggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgcgcgcgcggcggggggaggggccggcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcgccgacgaccgcggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggcggggcgaggacagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgccaaaaccggactccgcccacttcctcgcccgccggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagggggagttgggagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccaggggtcagttccacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttgattcgggtgtttccggaaggggccgagtcaatccgccgagttggggcacggaaaacaaaaagggaaggctactaagatttttctggcgggggttatcattggcgtaactgcagggaccacctcccgggttgagggggctggatctccaggctgcggattaagcccctcccgtcggcgttaatttcaaactgcgcgacgtttctcacctgccttcgccaaggcaggggccgggaccctattccaagaggtagtaactagcaggactctagccttccgcaattcattgagcgcatttacggaagtaacgtcgggtactgtctctggccgcaagggtgggaggagtacgcatttggcgtaaggtggggcgtagagccttcccgccattggcggcggatagggcgtttacgcgacggcctgacgtagcggaagacgccttagtgggggggaaggttctagaaaagcggcggcagcggctctagcggcagtagcagcagcgccgggtcccgtgcggaggtgctcctcgcagagttgtttctccagcagcggcagttctcactacagcgccaggacgagtccggttcgtgttcgtccgcggagatctctctcatctcgctcggctgcgggaaatcgggctgaagcgactgagtccgcgatggaggtaacgggtttgaaatcaatgagttattgaaaagggcatggcgaggccgttggcgcctcagtggaagtcggccagccgcctccgtgggagagaggcaggaaatcggaccaattcagtagcagtggggcttaaggtttatgaacggggtcttgagcggaggcctgagcgtacaaacagcttccccaccctcagcctcccggcgccatttcccttcactgggggtgggggatggggagctttcacatggcggacgctgccccgctggggtgaaagtggggcgcggaggcgggacttcttattccctttctaaagcacgctgcttcgggggccacggcgtctcctcggacggccgggcgcgcc
SEQ ID NO:7SRF-UCOEgcacacgaccacaattccactgaaagcattttaatacggaacttgtcactcccagggagcctccgctcagccggcagttggttcatttcaatccccacgacaacccttcaaagtgcagggcagacagcaggtggctctgcccaggcgcctggatcacagcccggcctgcagccctcacctgggcgcggggagaccctgaggacgctcctccaggcggcgctggccggggcctgcggacacggacgggcgggctgagctccgggacccctccccgcgccccgcaccccgcaccccgcaccccgcaccccgcacccggcgctcacccgtcccagccccgccgcccgcagccccagctgcaacgcagccaccgccgccatcgcacccggccccgcgggcgcttccgggacgcaggaggcatctgcatccggggcgccgctgagtcccgcccagagccccgcccccggctccaggttctgcgagcggcttccgccgggctgctccgcgggcgcgtcggccatgagcgagttgccgggcgacgtgcgggcgtttctgcgggagcacccgagcctgcggctccagacggacgcccgcaaggttcgcagcgcgggaggggaacggagtggcggagaagggcgcagttgggatgaggggctgaggggagggcaggggagaggagagggcaggggagaggggagaggggagagcaggagagaggggaaggcaggggagagggcgcggcgggatcaggggaggagagggaa
SEQ ID NO:8cHS4绝缘子
ggggagctcacggggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgaccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatcccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctgggggatacggggaaaaggggagctcacggggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgaccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatcccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctgggggatacggggaaaa
SEQ ID NO:9MAR-5
tatccatagctgattggtctaaaatgagatacatcaacgctcctccatgttttttgttttctttttaaatgaaaaactttattttttaagaggagtttcaggttcatagcaaaattgagaggaaggtacattcaagctgaggaagttttcctctattcctagtttactgagagattgcatcatgaatgggtgttaaattttgtcaaatgctttttctgtgtctatcaatatgaccatgtgattttcttctttaacctgttgatgggacaaattacgttaattgattttcaaacgttgaaccacccttacatatctggaataaattctacttggttgtggtgtatattttttgatacattcttggattctttttgctaatattttgttgaaaatgtttgtatctttgttcatgagagatattggtctgttgttttcttttcttgtaatgtcattttctagttccggtattaaggtaatgctggcctagttgaatgatttaggaagtattccctctgcttctgtcttctgaaagagattgtagaaagttgatacaatttttttttctttaaatatcttgatag
SEQ ID NO:10人CSP-B MAR(huMAR)
ggatcccattctccttgatgtactaatttttctttaaaagtgataataatagctcccatttagaatttttaaataacacaacaaatgtaaagtaactaatgtgtcctctggatcatggtaagtaatgaataaatttaactccctttaccttctccctttgctattttttccatgctaggatttatacatttttaaaaaactaaatctgctatcaaatgacagctttaaatttactttttaaaatttgttattgtatatatttatggggtataaagtgatgttatgatatatatatacacaatgtacactgattaaatcaagccaattaacattttatcatctcaaatacttaacattttttgtagtgagaacatttgaaatttacttttagcaatttcaaaacatacattattattattaactatagtcaccatgatgtaccatagatctttaaaaacttattcttcctgcctaactgaaactttgtactctttgactaacatcttttcattcccccacttcccagcctctggtaatcaccattacacactctgcttctatgagttcaattgctttagactccacgtaataaatgagatcatgcagcatttggctttctgtgcctggcttatccttgcttagcatggtgtcttacaggttcatccatgttgcaacaaataacagaatctcattctttgttaaggctgaatactattccattgggtatatataccacattttccttatccattaatccactgatggacccttaggttgttgattccatatattggctattgtaaatagtgcagcaatgaacatgagagtgcaactatctcttcaatgtactgatttcgaatccttcggatctatctcagaagtgagattgcaggatcatataattctacttttagtcttttgaggagctccatacagctttccatatggccatactaattacattctcatcaacagtgtacaatggtttccttttctccacatcctcaccaacatttataattttttgtctttttgataatagccatctgacaggtgtaaagtgatagctcattgcagttttaatttgcattttttgatgattagtaatgttgagaattttttcatatatctcttggccagttgcatgtcttctttggaaaaatgtctattcagttcctttgcccattttttaattgggatttttggtttcttgctattgagttgtttgaattc
SEQ ID NO:11WPRE
Tcgacaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg
SEQ ID NO:12增强子-1
gggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcac
SEQ ID NO:13 2个拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(2xlBGpA)
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcac
SEQ ID NO:14 2个拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(2huBGpA)
gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa
SEQ ID NO:15杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(xlhuBGpA)
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaa
SEQ ID NO:16 2xlBGpA-A120
aaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaccagcctcaagaacacccgaatggagtctctaagctacataataccaacttacactttacaaaatgttgtcccccaaaatgtagccattcgtatctgctcctaataaaaagaaagtttcttcacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO:17 2huBGpA-A120
gctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO:18xlhuBGpA-A120
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SEQ ID NO:19pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*
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SEQ ID NO:21 pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*taaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaattggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaacca
SEQ ID NO:22 pGL2-SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
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SEQ ID NO:23 pGL2-SS*-CMV-UTR2-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-BGpA-SS*
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SEQ ID NO:24 SS*-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:25 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:26 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:27 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:28 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-huMAR-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:31 SS*-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:32 SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]-SS*
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SEQ ID NO:33(超级序列,SS*)
taaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacc
SEQ ID NO:34pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin polyA
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagcctgggtcgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagcggccgcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacattggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagta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SEQ ID NO:35CAG[E1X3+CBA启动子+内含子]
gggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacag
SEQ ID NO:36CAG[E2+CBA启动子+内含子]
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SEQ ID NO:37CAG[E1X3+CBA启动子+UTR1]
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SEQ ID NO:38CAG[E2(U100)+CBA启动子+UTR1]
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SEQ ID NO:39CMV增强子-EF1-UTR1
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SEQ ID NO:40 4-1pGL2-SS*-CAG[CMV增强子+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttc
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SEQ ID NO:41 4-2pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggaaaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgt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SEQ ID NO:43 4-4pGL2-SS*-CAG[E1 X3+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*
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SEQ ID NO:44 4-5-pGL2-SS*-CAG[E2(U100)+CBA启动子+UTR1]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*
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taccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgtggaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatggtactgtaactgagctaacataa
SEQ ID NO:45 4-6-pGL2-SS*-CMV增强子-EF1-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3’UTR(108至120polyA)-SS*
cccgggaggtaccgagctcttacgcgtgctagaattaaagtaacccaatcagcacacaattgccattatacgcgcgtataatggactattgtgtgctgataaacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtgactagaagttcctatactttctagagaataggaacttcataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgggttactttaatttggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacctggttgctgactaattgagatgcatgctttgcatacttctgcctgctggggagcctggggactttccacacccctgggtcgacgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagctgccttctccctcctgtgagtttggtaagtcgacgggccgggcctgggccgggtccgggccgggtcgttggatccccactacagcccgatactcaagcttgacgaattcgagtatccaaggtagtggactagtgtgacgctgctgacccctttctttcccttctgcaggttggtgtacagtagcttccaaattgattaattcgagcgaacgcgtcgccaccatgaactccttctccacaagcgccttcggtccagttgccttctccctgggcctgctcctggtgttgcctgctgccttccctgccccagtcttcacactcgaagatttcgttggggactggcgacagacagccggctacaacctggaccaagtccttgaacagggaggtgtgtccagtttgtttcagaatctcggggtgtccgtaactccgatccaaaggattgtcctgagcggtgaaaatgggctgaagatcgacatccatgtcatcatcccgtatgaaggtctgagcggcgaccaaatgggccagatcgaaaaaatttttaaggtggtgtaccctgtggatgatcatcactttaaggtgatcctgcactatggcacactggtaatcgacggggttacgccgaacatgatcgactatttcggacggccgtatgaaggcatcgccgtgttcgacggcaaaaagatcactgtaacagggaccctgtggaacggcaacaaaattatcgacgagcgcctgatcaaccccgacggctccctgctgttccgagtaaccatcaacggagtgaccggctggcggctgtgcgaacgcattctggcggctagcgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctggaagcggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctggacctggatccggaatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcggaaggacatggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaaattaaagtaacccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctagtcacctatttcagcatactacgcgcgtagtatgctgaaataggtttatcagcacacaatagtccattatacgcgcgtataatggcaattgtgtgctgattgggttactttaatttggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgtggaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatggtactgtaactgagctaacataa
SEQ ID NO:46三个拷贝的增强子-1
gggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcacgggactttccggggcggggcacgtggtgcacgggactttccgtgcacgtgcacgggactttccgggactttccgggactttccgtgcaccacgtggggactttccgtgcac
SEQ ID NO:47嵌合内含子
ggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacag
本公开的范围不限于本文描述的具体方面。事实上，除了所描述的那些之外，根据前面的描述和附图，本公开的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
其他方面在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 医学噬菌体生物制药公司 (MEDIPHAGE BIOCEUTICALS, INC.)
<120> 表达载体、无细菌序列载体及其制备和使用方法
<130> 4471.007PC03
<150> US 63/331,638
<151> 2022-04-15
<150> US 63/306,015
<151> 2022-02-02
<150> US 63/211,343
<151> 2021-06-16
<160> 47
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工内含子
<400> 1
gtaagtcgac gggccgggcc tgggccgggt ccgggccggg tcgttggatc cccactacag 60
cccgatactc aagcttgacg aattcgagta tccaaggtag tggactagtg tgacgctgct 120
gacccctttc tttcccttct gcag 144
<210> 2
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR1
<400> 2
ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcgacgggcc gggcctgggc cgggtccggg 60
ccgggtcgtt ggatccccac tacagcccga tactcaagct tgacgaattc gagtatccaa 120
ggtagtggac tagtgtgacg ctgctgaccc ctttctttcc cttctgcagg ttggtgtaca 180
gtagcttcca 190
<210> 3
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR1 具有 MAR-5插入
<400> 3
ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcgacgggcc gggcctgggc cgggtccggg 60
ccgggtatcc atagctgatt ggtctaaaat gagatacatc aacgctcctc catgtttttt 120
gttttctttt taaatgaaaa actttatttt ttaagaggag tttcaggttc atagcaaaat 180
tgagaggaag gtacattcaa gctgaggaag ttttcctcta ttcctagttt actgagagat 240
tgcatcatga atgggtgtta aattttgtca aatgcttttt ctgtgtctat caatatgacc 300
atgtgatttt cttctttaac ctgttgatgg gacaaattac gttaattgat tttcaaacgt 360
tgaaccaccc ttacatatct ggaataaatt ctacttggtt gtggtgtata ttttttgata 420
cattcttgga ttctttttgc taatattttg ttgaaaatgt ttgtatcttt gttcatgaga 480
gatattggtc tgttgttttc ttttcttgta atgtcatttt ctagttccgg tattaaggta 540
atgctggcct agttgaatga tttaggaagt attccctctg cttctgtctt ctgaaagaga 600
ttgtagaaag ttgatacaat ttttttttct ttaaatatct tgatagtcgt tggatcccca 660
ctacagcccg atactcaagc ttgacgaatt cgagtatcca aggtagtgga ctagtgtgac 720
gctgctgacc cctttctttc ccttctgcag gttggtgtac agtagcttcc a 771
<210> 4
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR
<400> 4
attgggatct tcacacagca ggtaaggttg cgggccgggc ctgggccggg tccgggccgg 60
gccgcactga cccctggtgt tgcttttttt ttttaggccg caagctgaag cgtgtcc 117
<210> 5
<211> 698
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR2 (SEQ ID NO:4的5'UTR 具有MAR-5插入)
<400> 5
attgggatct tcacacagca ggtaaggttg cgggccgggc ctgggccggg tccgggccgg 60
gtatccatag ctgattggtc taaaatgaga tacatcaacg ctcctccatg ttttttgttt 120
tctttttaaa tgaaaaactt tattttttaa gaggagtttc aggttcatag caaaattgag 180
aggaaggtac attcaagctg aggaagtttt cctctattcc tagtttactg agagattgca 240
tcatgaatgg gtgttaaatt ttgtcaaatg ctttttctgt gtctatcaat atgaccatgt 300
gattttcttc tttaacctgt tgatgggaca aattacgtta attgattttc aaacgttgaa 360
ccacccttac atatctggaa taaattctac ttggttgtgg tgtatatttt ttgatacatt 420
cttggattct ttttgctaat attttgttga aaatgtttgt atctttgttc atgagagata 480
ttggtctgtt gttttctttt cttgtaatgt cattttctag ttccggtatt aaggtaatgc 540
tggcctagtt gaatgattta ggaagtattc cctctgcttc tgtcttctga aagagattgt 600
agaaagttga tacaattttt ttttctttaa atatcttgat agccgcactg acccctggtg 660
ttgctttttt tttttaggcc gcaagctgaa gcgtgtcc 698
<210> 6
<211> 1579
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> A2UCOE 元件
<400> 6
gcggccgcac gcgtggccct ccgcgcctac agctcaagcc acatccgaag ggggagggag 60
ccgggagctg cgcgcggggc cgccgggggg aggggtggca ccgcccacgc cgggcggcca 120
cgaagggcgg ggcagcgggc gcgcgcgcgg cggggggagg ggccggcgcc gcgcccgctg 180
ggaattgggg ccctaggggg agggcggagg cgccgacgac cgcggcactt accgttcgcg 240
gcgtggcgcc cggtggtccc caaggggagg gaagggggag gcggggcgag gacagtgacc 300
ggagtctcct cagcggtggc ttttctgctt ggcagcctca gcggctggcg ccaaaaccgg 360
actccgccca cttcctcgcc cgccggtgcg agggtgtgga atcctccaga cgctggggga 420
gggggagttg ggagcttaaa aactagtacc cctttgggac cactttcagc agcgaactct 480
cctgtacacc aggggtcagt tccacagacg cgggccaggg gtgggtcatt gcggcgtgaa 540
caataatttg actagaagtt gattcgggtg tttccggaag gggccgagtc aatccgccga 600
gttggggcac ggaaaacaaa aagggaaggc tactaagatt tttctggcgg gggttatcat 660
tggcgtaact gcagggacca cctcccgggt tgagggggct ggatctccag gctgcggatt 720
aagcccctcc cgtcggcgtt aatttcaaac tgcgcgacgt ttctcacctg ccttcgccaa 780
ggcaggggcc gggaccctat tccaagaggt agtaactagc aggactctag ccttccgcaa 840
ttcattgagc gcatttacgg aagtaacgtc gggtactgtc tctggccgca agggtgggag 900
gagtacgcat ttggcgtaag gtggggcgta gagccttccc gccattggcg gcggataggg 960
cgtttacgcg acggcctgac gtagcggaag acgccttagt gggggggaag gttctagaaa 1020
agcggcggca gcggctctag cggcagtagc agcagcgccg ggtcccgtgc ggaggtgctc 1080
ctcgcagagt tgtttctcca gcagcggcag ttctcactac agcgccagga cgagtccggt 1140
tcgtgttcgt ccgcggagat ctctctcatc tcgctcggct gcgggaaatc gggctgaagc 1200
gactgagtcc gcgatggagg taacgggttt gaaatcaatg agttattgaa aagggcatgg 1260
cgaggccgtt ggcgcctcag tggaagtcgg ccagccgcct ccgtgggaga gaggcaggaa 1320
atcggaccaa ttcagtagca gtggggctta aggtttatga acggggtctt gagcggaggc 1380
ctgagcgtac aaacagcttc cccaccctca gcctcccggc gccatttccc ttcactgggg 1440
gtgggggatg gggagctttc acatggcgga cgctgccccg ctggggtgaa agtggggcgc 1500
ggaggcggga cttcttattc cctttctaaa gcacgctgct tcgggggcca cggcgtctcc 1560
tcggacggcc gggcgcgcc 1579
<210> 7
<211> 761
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SRF-UCOE
<400> 7
gcacacgacc acaattccac tgaaagcatt ttaatacgga acttgtcact cccagggagc 60
ctccgctcag ccggcagttg gttcatttca atccccacga caacccttca aagtgcaggg 120
cagacagcag gtggctctgc ccaggcgcct ggatcacagc ccggcctgca gccctcacct 180
gggcgcgggg agaccctgag gacgctcctc caggcggcgc tggccggggc ctgcggacac 240
ggacgggcgg gctgagctcc gggacccctc cccgcgcccc gcaccccgca ccccgcaccc 300
cgcaccccgc acccggcgct cacccgtccc agccccgccg cccgcagccc cagctgcaac 360
gcagccaccg ccgccatcgc acccggcccc gcgggcgctt ccgggacgca ggaggcatct 420
gcatccgggg cgccgctgag tcccgcccag agccccgccc ccggctccag gttctgcgag 480
cggcttccgc cgggctgctc cgcgggcgcg tcggccatga gcgagttgcc gggcgacgtg 540
cgggcgtttc tgcgggagca cccgagcctg cggctccaga cggacgcccg caaggttcgc 600
agcgcgggag gggaacggag tggcggagaa gggcgcagtt gggatgaggg gctgagggga 660
gggcagggga gaggagaggg caggggagag gggagagggg agagcaggag agaggggaag 720
gcaggggaga gggcgcggcg ggatcagggg aggagaggga a 761
<210> 8
<211> 478
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cHS4 绝缘子
<400> 8
ggggagctca cggggacagc ccccccccaa agcccccagg gatgtaatta cgtccctccc 60
ccgctagggg gcagcagcga ccgcccgggg ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat 120
cccgagccgg cagcgtgcgg ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt 180
cctctgaacg cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctgggggata cggggaaaag 240
gggagctcac ggggacagcc cccccccaaa gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc 300
cgctaggggg cagcagcgac cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc 360
ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 420
ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcc tgcagacacc tgggggatac ggggaaaa 478
<210> 9
<211> 581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MAR-5
<400> 9
tatccatagc tgattggtct aaaatgagat acatcaacgc tcctccatgt tttttgtttt 60
ctttttaaat gaaaaacttt attttttaag aggagtttca ggttcatagc aaaattgaga 120
ggaaggtaca ttcaagctga ggaagttttc ctctattcct agtttactga gagattgcat 180
catgaatggg tgttaaattt tgtcaaatgc tttttctgtg tctatcaata tgaccatgtg 240
attttcttct ttaacctgtt gatgggacaa attacgttaa ttgattttca aacgttgaac 300
cacccttaca tatctggaat aaattctact tggttgtggt gtatattttt tgatacattc 360
ttggattctt tttgctaata ttttgttgaa aatgtttgta tctttgttca tgagagatat 420
tggtctgttg ttttcttttc ttgtaatgtc attttctagt tccggtatta aggtaatgct 480
ggcctagttg aatgatttag gaagtattcc ctctgcttct gtcttctgaa agagattgta 540
gaaagttgat acaatttttt tttctttaaa tatcttgata g 581
<210> 10
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CSP-B MAR (huMAR)
<400> 10
ggatcccatt ctccttgatg tactaatttt tctttaaaag tgataataat agctcccatt 60
tagaattttt aaataacaca acaaatgtaa agtaactaat gtgtcctctg gatcatggta 120
agtaatgaat aaatttaact ccctttacct tctccctttg ctattttttc catgctagga 180
tttatacatt tttaaaaaac taaatctgct atcaaatgac agctttaaat ttacttttta 240
aaatttgtta ttgtatatat ttatggggta taaagtgatg ttatgatata tatatacaca 300
atgtacactg attaaatcaa gccaattaac attttatcat ctcaaatact taacattttt 360
tgtagtgaga acatttgaaa tttactttta gcaatttcaa aacatacatt attattatta 420
actatagtca ccatgatgta ccatagatct ttaaaaactt attcttcctg cctaactgaa 480
actttgtact ctttgactaa catcttttca ttcccccact tcccagcctc tggtaatcac 540
cattacacac tctgcttcta tgagttcaat tgctttagac tccacgtaat aaatgagatc 600
atgcagcatt tggctttctg tgcctggctt atccttgctt agcatggtgt cttacaggtt 660
catccatgtt gcaacaaata acagaatctc attctttgtt aaggctgaat actattccat 720
tgggtatata taccacattt tccttatcca ttaatccact gatggaccct taggttgttg 780
attccatata ttggctattg taaatagtgc agcaatgaac atgagagtgc aactatctct 840
tcaatgtact gatttcgaat ccttcggatc tatctcagaa gtgagattgc aggatcatat 900
aattctactt ttagtctttt gaggagctcc atacagcttt ccatatggcc atactaatta 960
cattctcatc aacagtgtac aatggtttcc ttttctccac atcctcacca acatttataa 1020
ttttttgtct ttttgataat agccatctga caggtgtaaa gtgatagctc attgcagttt 1080
taatttgcat tttttgatga ttagtaatgt tgagaatttt ttcatatatc tcttggccag 1140
ttgcatgtct tctttggaaa aatgtctatt cagttccttt gcccattttt taattgggat 1200
ttttggtttc ttgctattga gttgtttgaa ttc 1233
<210> 11
<211> 597
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WPRE
<400> 11
tcgacaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 60
ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 120
cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 180
agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 240
ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 300
tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 360
ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc 420
tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 480
ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 540
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctg 597
<210> 12
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强子-1
<400> 12
gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60
tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca c 111
<210> 13
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 两拷贝的非洲爪蟾β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(2xlBGpA)
<400> 13
aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60
acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120
cttcacaacc agcctcaaga acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta 180
cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga 240
aagtttcttc ac 252
<210> 14
<211> 268
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 两拷贝的人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(2huBGpA)
<400> 14
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180
ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240
taataaaaaa catttatttt cattgcaa 268
<210> 15
<211> 260
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 杂合的非洲爪蟾和人β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(xlhuBGpA)
<400> 15
aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60
acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120
cttcacgctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 180
aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa 240
aacatttatt ttcattgcaa 260
<210> 16
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xlBGpA-A120
<400> 16
aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60
acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120
cttcacaacc agcctcaaga acacccgaat ggagtctcta agctacataa taccaactta 180
cactttacaa aatgttgtcc cccaaaatgt agccattcgt atctgctcct aataaaaaga 240
aagtttcttc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aa 372
<210> 17
<211> 388
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2huBGpA-A120
<400> 17
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gcaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 180
ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 240
taataaaaaa catttatttt cattgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 388
<210> 18
<211> 380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> xlhuBGpA-A120
<400> 18
aaccagcctc aagaacaccc gaatggagtc tctaagctac ataataccaa cttacacttt 60
acaaaatgtt gtcccccaaa atgtagccat tcgtatctgc tcctaataaa aagaaagttt 120
cttcacgctc gctttcttgc tgtccaattt ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 180
aactactaaa ctgggggata ttatgaaggg ccttgagcat ctggattctg cctaataaaa 240
aacatttatt ttcattgcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 380
<210> 19
<211> 7011
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL2-SS*-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-BGpA-SS*
<400> 19
ccgggaggta ccgagctctt acgcgtgcta gaattaaagt aacccaatca gcacacaatt 60
gccattatac gcgcgtataa tggactattg tgtgctgata aacctatttc agcatactac 120
gcgcgtagta tgctgaaata ggtgactaga agttcctata ctttctagag aataggaact 180
tcataacttc gtataatgta tgctatacga agttatgggt tactttaatt tggttgctga 240
ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca 300
cctggttgct gactaattga gatgcatgct ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg 360
ggactttcca cacccctggg tcgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 420
acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 480
ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 540
cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 600
actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 660
aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 720
acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtcgaggt gagccccacg 780
ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt 840
ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc 900
ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag gcggaaaggt gcggcggcag ccaatcagag 960
cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa 1020
gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc 1080
cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg 1140
ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt 1200
tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg 1260
gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc tccgcgctgc 1320
ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg 1380
aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag 1440
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc 1500
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg 1560
gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg 1620
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc 1680
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg 1740
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct 1800
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg 1860
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc 1920
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg 1980
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc 2040
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc 2100
aaagaattga ttaattcgag cgaacgcgtc gccaccatga actccttctc cacaagcgcc 2160
ttcggtccag ttgccttctc cctgggcctg ctcctggtgt tgcctgctgc cttccctgcc 2220
ccagtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 2280
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 2340
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 2400
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 2460
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 2520
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 2580
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 2640
gacgagcgcc tgatcaaccc cgacggctcc ctgctgttcc gagtaaccat caacggagtg 2700
accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcggctagcg ctactaactt cagcctgctg 2760
aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctggaa gcggagaggg cagaggaagt 2820
ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cctggacctg gatccggaat ggtgagcaag 2880
ggcgaggagc tgttcaccgg ggtggtgccc atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac 2940
ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc 3000
ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg cccgtgccct ggcccaccct cgtgaccacc 3060
ctgacctacg gcgtgcagtg cttcagccgc taccccgacc acatgaagca gcacgacttc 3120
ttcaagtccg ccatgcccga aggctacgtc caggagcgca ccatcttctt caaggacgac 3180
ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg acaccctggt gaaccgcatc 3240
gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tggggcacaa gctggagtac 3300
aactacaaca gccacaacgt ctatatcatg gccgacaagc agaagaacgg catcaaggtg 3360
aacttcaaga tccgccacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctcgccga ccactaccag 3420
cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta cctgagcacc 3480
cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc acatggtcct gctggagttc 3540
gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt acaagtaagc ggccgcactc 3600
ctcaggtgca ggctgcctat cagaaggtgg tggctggtgt ggccaatgcc ctggctcaca 3660
aataccactg agatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg 3720
agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt 3780
ttttgtgtct ctcactcgga aggacatggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 3840
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccaa attaaagtaa cccataactt 3900
cgtatagcat acattatacg aagttatgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt 3960
ctagtcacct atttcagcat actacgcgcg tagtatgctg aaataggttt atcagcacac 4020
aatagtccat tatacgcgcg tataatggca attgtgtgct gattgggtta ctttaattgg 4080
tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 4140
tcagcaacca tggatccgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt 4200
ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca 4260
actcgtagga caggtgccgg cagcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4320
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4380
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4440
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 4500
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 4560
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 4620
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4680
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4740
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4800
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4860
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 4920
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4980
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 5040
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 5100
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 5160
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 5220
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 5280
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 5340
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 5400
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 5460
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 5520
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 5580
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 5640
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 5700
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 5760
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5820
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5880
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5940
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 6000
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 6060
gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 6120
atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 6180
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgcgccctgt agcggcgcat 6240
taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 6300
cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 6360
aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 6420
ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 6480
ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 6540
caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 6600
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 6660
taacgcttac aatttgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 6720
tgcgggcctc ttcgctatta cgccagccca agctaccatg ataagtaagt aatattaagg 6780
tacgtggagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat 6840
aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 6900
agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 6960
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatggt actgtaactg agctaacata a 7011
<210> 20
<211> 6991
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcDNA-CMV-5'UTR-SecNLuc-P2A-eGFP-bGHpA
<400> 20
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccctgcct tctccctcct gtgagtttgg 960
taagtcactg actgtctatg cctgggaaag ggtgggcagg agatggggca gtgcaggaaa 1020
agtggcacta tgaaccctgc agccctagga atgcatctag acaattgtac taaccttctt 1080
ctctttcctc tcctgacagg ttggtgtaca gtagcttcca ctcctgccac catgaactcc 1140
ttctccacaa gcgccttcgg tccagttgcc ttctccctgg gcctgctcct ggtgttgcct 1200
gctgccttcc ctgccccagt cttcacactc gaagatttcg ttggggactg gcgacagaca 1260
gccggctaca acctggacca agtccttgaa cagggaggtg tgtccagttt gtttcagaat 1320
ctcggggtgt ccgtaactcc gatccaaagg attgtcctga gcggtgaaaa tgggctgaag 1380
atcgacatcc atgtcatcat cccgtatgaa ggtctgagcg gcgaccaaat gggccagatc 1440
gaaaaaattt ttaaggtggt gtaccctgtg gatgatcatc actttaaggt gatcctgcac 1500
tatggcacac tggtaatcga cggggttacg ccgaacatga tcgactattt cggacggccg 1560
tatgaaggca tcgccgtgtt cgacggcaaa aagatcactg taacagggac cctgtggaac 1620
ggcaacaaaa ttatcgacga gcgcctgatc aaccccgacg gctccctgct gttccgagta 1680
accatcaacg gagtgaccgg ctggcggctg tgcgaacgca ttctggcgga attctgcaga 1740
tatccagcac agtggcggcc gctcgagtct agaggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1800
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgagcaaggg cgaggagctg 1860
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gccgggtcgt tggatcccca ctacagcccg atactcaagc ttgacgaatt cgagtatcca 1200
aggtagtgga ctagtgtgac gctgctgacc cctttctttc ccttctgcag gttggtgtac 1260
agtagcttcc aaattgatta attcgagcga acgcgtcgcc accatgaact ccttctccac 1320
aagcgccttc ggtccagttg ccttctccct gggcctgctc ctggtgttgc ctgctgcctt 1380
ccctgcccca gtcttcacac tcgaagattt cgttggggac tggcgacaga cagccggcta 1440
caacctggac caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt ttgtttcaga atctcggggt 1500
gtccgtaact ccgatccaaa ggattgtcct gagcggtgaa aatgggctga agatcgacat 1560
ccatgtcatc atcccgtatg aaggtctgag cggcgaccaa atgggccaga tcgaaaaaat 1620
ttttaaggtg gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc actatggcac 1680
actggtaatc gacggggtta cgccgaacat gatcgactat ttcggacggc cgtatgaagg 1740
catcgccgtg ttcgacggca aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga acggcaacaa 1800
aattatcgac gagcgcctga tcaaccccga cggctccctg ctgttccgag taaccatcaa 1860
cggagtgacc ggctggcggc tgtgcgaacg cattctggcg gctagcgcta ctaacttcag 1920
cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctggaagcg gagagggcag 1980
aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggacctggat ccggaatggt 2040
gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 2100
cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 2160
gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 2220
gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 2280
cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 2340
ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 2400
ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 2460
ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 2520
caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 2580
ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 2640
gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 2700
ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaaggatc 2760
ccattctcct tgatgtacta atttttcttt aaaagtgata ataatagctc ccatttagaa 2820
tttttaaata acacaacaaa tgtaaagtaa ctaatgtgtc ctctggatca tggtaagtaa 2880
tgaataaatt taactccctt taccttctcc ctttgctatt ttttccatgc taggatttat 2940
acatttttaa aaaactaaat ctgctatcaa atgacagctt taaatttact ttttaaaatt 3000
tgttattgta tatatttatg gggtataaag tgatgttatg atatatatat acacaatgta 3060
cactgattaa atcaagccaa ttaacatttt atcatctcaa atacttaaca ttttttgtag 3120
tgagaacatt tgaaatttac ttttagcaat ttcaaaacat acattattat tattaactat 3180
agtcaccatg atgtaccata gatctttaaa aacttattct tcctgcctaa ctgaaacttt 3240
gtactctttg actaacatct tttcattccc ccacttccca gcctctggta atcaccatta 3300
cacactctgc ttctatgagt tcaattgctt tagactccac gtaataaatg agatcatgca 3360
gcatttggct ttctgtgcct ggcttatcct tgcttagcat ggtgtcttac aggttcatcc 3420
atgttgcaac aaataacaga atctcattct ttgttaaggc tgaatactat tccattgggt 3480
atatatacca cattttcctt atccattaat ccactgatgg acccttaggt tgttgattcc 3540
atatattggc tattgtaaat agtgcagcaa tgaacatgag agtgcaacta tctcttcaat 3600
gtactgattt cgaatccttc ggatctatct cagaagtgag attgcaggat catataattc 3660
tacttttagt cttttgagga gctccataca gctttccata tggccatact aattacattc 3720
tcatcaacag tgtacaatgg tttccttttc tccacatcct caccaacatt tataattttt 3780
tgtctttttg ataatagcca tctgacaggt gtaaagtgat agctcattgc agttttaatt 3840
tgcatttttt gatgattagt aatgttgaga attttttcat atatctcttg gccagttgca 3900
tgtcttcttt ggaaaaatgt ctattcagtt cctttgccca ttttttaatt gggatttttg 3960
gtttcttgct attgagttgt ttgaattcaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 4020
attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 4080
gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc 4140
ctggttgctg tctctttatg aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg 4200
cactgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct 4260
ttccgggact ttcgctttcc ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct 4320
tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg 4380
gaaatcatcg tcctttcctt ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac 4440
gtccttctgc tacgtccctt cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct 4500
gccggctctg cggcctcttc cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct 4560
ttgggccgcc tccccgcgct cgctttcttg ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt 4620
tccctaagtc caactactaa actgggggat attatgaagg gccttgagca tctggattct 4680
gcctaataaa aaacatttat tttcattgca agctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt 4740
aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg aagggccttg 4800
agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgcaaaaaaa aaaaaaaaaa 4860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4920
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcgg aaggacatgg 4980
tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag 5040
tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 5100
catctcaatt agtcagcaac caaattaaag taacccataa cttcgtatag catacattat 5160
acgaagttat gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttctagtca cctatttcag 5220
catactacgc gcgtagtatg ctgaaatagg tttatcagca cacaatagtc cattatacgc 5280
gcgtataatg gcaattgtgt gctgattggg ttactttaat ttggatccgt cgaccgatgc 5340
ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg 5400
ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct 5460
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 5520
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 5580
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ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 5700
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 5760
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 5820
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 5880
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 5940
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 6000
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 6060
aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 6120
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 6180
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 6240
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 6300
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 6360
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 6420
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 6480
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 6540
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 6600
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 6660
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 6720
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 6780
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atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 6900
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 6960
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 7020
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 7080
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 7140
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 7200
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 7260
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 7320
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 7380
gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc 7440
agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc 7500
tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg 7560
ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca 7620
cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc 7680
tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct 7740
tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa 7800
caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttgcca ttcgccattc 7860
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagccc 7920
aagctaccat gataagtaag taatattaag gtacgtggag gttttacttg ctttaaaaaa 7980
cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 8040
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 8100
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatgg 8160
tactgtaact gagctaacat aa 8182
<210> 32
<211> 8943
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SS*-UCOE-E1-CMV-UTR1-SecNLuc-2A-eGFP-MAR-WPRE-3'UTR[2huBGpA-A120]
-SS*
<400> 32
cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agaattaaag taacccaatc agcacacaat 60
tgccattata cgcgcgtata atggactatt gtgtgctgat aaacctattt cagcatacta 120
cgcgcgtagt atgctgaaat aggtgactag aagttcctat actttctaga gaataggaac 180
ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggg ttactttaat ttggttgctg 240
actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac 300
acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg 360
gggactttcc acacccctgg gtcgacgcac acgaccacaa ttccactgaa agcattttaa 420
tacggaactt gtcactccca gggagcctcc gctcagccgg cagttggttc atttcaatcc 480
ccacgacaac ccttcaaagt gcagggcaga cagcaggtgg ctctgcccag gcgcctggat 540
cacagcccgg cctgcagccc tcacctgggc gcggggagac cctgaggacg ctcctccagg 600
cggcgctggc cggggcctgc ggacacggac gggcgggctg agctccggga cccctccccg 660
cgccccgcac cccgcacccc gcaccccgca ccccgcaccc ggcgctcacc cgtcccagcc 720
ccgccgcccg cagccccagc tgcaacgcag ccaccgccgc catcgcaccc ggccccgcgg 780
gcgcttccgg gacgcaggag gcatctgcat ccggggcgcc gctgagtccc gcccagagcc 840
ccgcccccgg ctccaggttc tgcgagcggc ttccgccggg ctgctccgcg ggcgcgtcgg 900
ccatgagcga gttgccgggc gacgtgcggg cgtttctgcg ggagcacccg agcctgcggc 960
tccagacgga cgcccgcaag gttcgcagcg cgggagggga acggagtggc ggagaagggc 1020
gcagttggga tgaggggctg aggggagggc aggggagagg agagggcagg ggagagggga 1080
gaggggagag caggagagag gggaaggcag gggagagggc gcggcgggat caggggagga 1140
gagggaaggg actttccggg gcggggcacg tggtgcacgg gactttccgt gcacgtgcac 1200
gggactttcc gggactttcc gggactttcc gtgcaccacg tggggacttt ccgtgcacga 1260
cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 1320
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 1380
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 1440
ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 1500
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 1560
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 1620
gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 1680
tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 1740
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 1800
ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctctgccttc tccctcctgt 1860
gagtttggta agtcgacggg ccgggcctgg gccgggtccg ggccgggtcg ttggatcccc 1920
actacagccc gatactcaag cttgacgaat tcgagtatcc aaggtagtgg actagtgtga 1980
cgctgctgac ccctttcttt cccttctgca ggttggtgta cagtagcttc caaattgatt 2040
aattcgagcg aacgcgtcgc caccatgaac tccttctcca caagcgcctt cggtccagtt 2100
gccttctccc tgggcctgct cctggtgttg cctgctgcct tccctgcccc agtcttcaca 2160
ctcgaagatt tcgttgggga ctggcgacag acagccggct acaacctgga ccaagtcctt 2220
gaacagggag gtgtgtccag tttgtttcag aatctcgggg tgtccgtaac tccgatccaa 2280
aggattgtcc tgagcggtga aaatgggctg aagatcgaca tccatgtcat catcccgtat 2340
gaaggtctga gcggcgacca aatgggccag atcgaaaaaa tttttaaggt ggtgtaccct 2400
gtggatgatc atcactttaa ggtgatcctg cactatggca cactggtaat cgacggggtt 2460
acgccgaaca tgatcgacta tttcggacgg ccgtatgaag gcatcgccgt gttcgacggc 2520
aaaaagatca ctgtaacagg gaccctgtgg aacggcaaca aaattatcga cgagcgcctg 2580
atcaaccccg acggctccct gctgttccga gtaaccatca acggagtgac cggctggcgg 2640
ctgtgcgaac gcattctggc ggctagcgct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 2700
gacgtggagg agaaccctgg acctggaagc ggagagggca gaggaagtct gctaacatgc 2760
ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctgga tccggaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 2820
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agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 2940
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 3000
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 3060
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atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 3240
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 3300
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 3360
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gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaaggat cccattctcc ttgatgtact 3540
aatttttctt taaaagtgat aataatagct cccatttaga atttttaaat aacacaacaa 3600
atgtaaagta actaatgtgt cctctggatc atggtaagta atgaataaat ttaactccct 3660
ttaccttctc cctttgctat tttttccatg ctaggattta tacattttta aaaaactaaa 3720
tctgctatca aatgacagct ttaaatttac tttttaaaat ttgttattgt atatatttat 3780
ggggtataaa gtgatgttat gatatatata tacacaatgt acactgatta aatcaagcca 3840
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ttttcattcc cccacttccc agcctctggt aatcaccatt acacactctg cttctatgag 4080
ttcaattgct ttagactcca cgtaataaat gagatcatgc agcatttggc tttctgtgcc 4140
tggcttatcc ttgcttagca tggtgtctta caggttcatc catgttgcaa caaataacag 4200
aatctcattc tttgttaagg ctgaatacta ttccattggg tatatatacc acattttcct 4260
tatccattaa tccactgatg gacccttagg ttgttgattc catatattgg ctattgtaaa 4320
tagtgcagca atgaacatga gagtgcaact atctcttcaa tgtactgatt tcgaatcctt 4380
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gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 6960
agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 7020
acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 7080
tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 7140
agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 7200
gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 7260
agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 7320
cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 7380
ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 7440
cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 7500
cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 7560
ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 7620
tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 7680
catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 7740
gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 7800
gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 7860
tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 7920
catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 7980
aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 8040
attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 8100
aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct 8160
gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 8220
ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 8280
gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 8340
ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 8400
gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 8460
tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 8520
tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 8580
ttaacaaaat attaacgctt acaatttgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 8640
aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagcc caagctacca tgataagtaa 8700
gtaatattaa ggtacgtgga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg 8760
aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat 8820
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 8880
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatg gtactgtaac tgagctaaca 8940
taa 8943
<210> 33
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 超级序列, SS*
<400> 33
taaagtaacc caatcagcac acaattgcca ttatacgcgc gtataatgga ctattgtgtg 60
ctgataaacc tatttcagca tactacgcgc gtagtatgct gaaataggtg actagaagtt 120
cctatacttt ctagagaata ggaacttcat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt 180
atgggttact ttaatttggt tgctgactaa ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct 240
gctggggagc ctggggactt tccacacctg gttgctgact aattgagatg catgctttgc 300
atacttctgc ctgctgggga gcctggggac tttccacacc 340
<210> 34
<211> 6326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL2-CAG-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-bGlobin polyA
<400> 34
cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agcctgggtc gacattgatt attgactagt 60
tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt 120
acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg 180
tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg 240
gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt 300
acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg 360
accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg 420
gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca 480
attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg 540
gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggaaaggtgc 600
ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg 660
gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc 720
ccgtgccccg ctccgcgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact 780
cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta 840
atgacggctc gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc 900
tttgtgcggg ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg 960
cgtgcggctc cgcgctgccc ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg 1020
cgctccgcag tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg 1080
gctgcgaggg gaacaaaggc tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg 1140
tgggcgcggc ggtcgggctg taaccccccc ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac 1200
ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc 1260
ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc 1320
tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc ggcgagccgc 1380
agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc 1440
tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cggggcgaag 1500
cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc 1560
cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg ccttcggggg 1620
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 1680
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 1740
ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg aacgcgtcgc caccatgaac 1800
tccttctcca caagcgcctt cggtccagtt gccttctccc tgggcctgct cctggtgttg 1860
cctgctgcct tccctgcccc agtcttcaca ctcgaagatt tcgttgggga ctggcgacag 1920
acagccggct acaacctgga ccaagtcctt gaacagggag gtgtgtccag tttgtttcag 1980
aatctcgggg tgtccgtaac tccgatccaa aggattgtcc tgagcggtga aaatgggctg 2040
aagatcgaca tccatgtcat catcccgtat gaaggtctga gcggcgacca aatgggccag 2100
atcgaaaaaa tttttaaggt ggtgtaccct gtggatgatc atcactttaa ggtgatcctg 2160
cactatggca cactggtaat cgacggggtt acgccgaaca tgatcgacta tttcggacgg 2220
ccgtatgaag gcatcgccgt gttcgacggc aaaaagatca ctgtaacagg gaccctgtgg 2280
aacggcaaca aaattatcga cgagcgcctg atcaaccccg acggctccct gctgttccga 2340
gtaaccatca acggagtgac cggctggcgg ctgtgcgaac gcattctggc ggctagcgct 2400
actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctggaagc 2460
ggagagggca gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggacctgga 2520
tccggaatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 2580
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 2640
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 2700
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 2760
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 2820
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 2880
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 2940
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 3000
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 3060
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 3120
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 3180
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 3240
aagtaagcgg ccgcactcct caggtgcagg ctgcctatca gaaggtggtg gctggtgtgg 3300
ccaatgccct ggctcacaaa taccactgag atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg 3360
acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg 3420
caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag gacattggat ccgtcgaccg 3480
atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 3540
gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 3600
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 3660
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 3720
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 3780
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 3840
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 3900
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 3960
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 4020
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 4080
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 4140
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 4200
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 4260
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 4320
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 4380
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 4440
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 4500
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 4560
tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 4620
cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 4680
gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 4740
cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 4800
ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 4860
aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 4920
atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4980
tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 5040
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 5100
aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 5160
acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 5220
ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 5280
tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 5340
aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 5400
catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 5460
atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 5520
aaaagtgcca cctgacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac 5580
gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc 5640
ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt 5700
agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg 5760
ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac 5820
gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta 5880
ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat 5940
ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt gccattcgcc 6000
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 6060
gcccaagcta ccatgataag taagtaatat taaggtacgt ggaggtttta cttgctttaa 6120
aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta 6180
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 6240
ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 6300
atggtactgt aactgagcta acataa 6326
<210> 35
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAG [E1X3+CBA 启动子+内含子]
<400> 35
gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60
tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca cgggactttc 120
cggggcgggg cacgtggtgc acgggacttt ccgtgcacgt gcacgggact ttccgggact 180
ttccgggact ttccgtgcac cacgtgggga ctttccgtgc acgggacttt ccggggcggg 240
gcacgtggtg cacgggactt tccgtgcacg tgcacgggac tttccgggac tttccgggac 300
tttccgtgca ccacgtgggg actttccgtg cacgtcgagg tgagccccac gttctgcttc 360
actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta 420
ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 480
cgaggggcgg ggcggggcga ggcggaaagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 540
ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 600
gcggcgggcg ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg 660
ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc 720
ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct 780
gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg 840
gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct 900
gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg 960
cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc 1020
ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc 1080
cccctgcacc cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt 1140
acggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg 1200
ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg 1260
agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc 1320
gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc 1380
cgccgcaccc cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg 1440
ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg 1500
ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc 1560
tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc 1620
ctacag 1626
<210> 36
<211> 1559
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAG [E2+CBA 启动子+内含子]
<400> 36
tgggactttc cactagacat gacacagcaa tctgatatgc ttgcgtgaga agaggattca 60
tatcctggga ctttccacag attttaccgg aagttgttag atgcttgcgt gagaagatct 120
aacatgacac agcaatcctt agtgggactt tccaagtatg tggggcgggg agtatacatg 180
acacagcaat tgatcattac cggaagttta taggtgggac tttccagacc tatgcttgcg 240
tgagaagaaa ggtctgggac tttccagtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 300
ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 360
cagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg 420
cggggcgggg cgaggcggaa aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag 480
tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg 540
gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg 600
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 660
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggctcgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 720
agccttaaag ggctccggga gggccctttg tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 780
cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 840
ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 900
gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 960
gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc 1020
acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc 1080
gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg 1140
cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg 1200
gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg 1260
cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca 1320
ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 1380
agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc 1440
cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg 1500
tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacag 1559
<210> 37
<211> 826
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAG [E1X3+CBA 启动子+UTR1]
<400> 37
gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60
tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca cgggactttc 120
cggggcgggg cacgtggtgc acgggacttt ccgtgcacgt gcacgggact ttccgggact 180
ttccgggact ttccgtgcac cacgtgggga ctttccgtgc acgggacttt ccggggcggg 240
gcacgtggtg cacgggactt tccgtgcacg tgcacgggac tttccgggac tttccgggac 300
tttccgtgca ccacgtgggg actttccgtg cacgtcgagg tgagccccac gttctgcttc 360
actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta 420
ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg 480
cgaggggcgg ggcggggcga ggcggaaagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct 540
ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc 600
gcggcgggcg ctgccttctc cctcctgtga gtttggtaag tcgacgggcc gggcctgggc 660
cgggtccggg ccgggtcgtt ggatccccac tacagcccga tactcaagct tgacgaattc 720
gagtatccaa ggtagtggac tagtgtgacg ctgctgaccc ctttctttcc cttctgcagg 780
ttggtgtaca gtagcttcca aattgattaa ttcgagcgaa cgcgtc 826
<210> 38
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CAG [E2 (U100)+CBA 启动子+UTR1]
<400> 38
tgggactttc cactagacat gacacagcaa tctgatatgc ttgcgtgaga agaggattca 60
tatcctggga ctttccacag attttaccgg aagttgttag atgcttgcgt gagaagatct 120
aacatgacac agcaatcctt agtgggactt tccaagtatg tggggcgggg agtatacatg 180
acacagcaat tgatcattac cggaagttta taggtgggac tttccagacc tatgcttgcg 240
tgagaagaaa ggtctgggac tttccagtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 300
ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 360
cagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg 420
cggggcgggg cgaggcggaa aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag 480
tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg 540
gcgctgcctt ctccctcctg tgagtttggt aagtcgacgg gccgggcctg ggccgggtcc 600
gggccgggtc gttggatccc cactacagcc cgatactcaa gcttgacgaa ttcgagtatc 660
caaggtagtg gactagtgtg acgctgctga cccctttctt tcccttctgc aggttggtgt 720
acagtagctt ccaaattgat taattcgagc gaacgcgtc 759
<210> 39
<211> 808
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV 增强子-EF1-UTR1
<400> 39
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg 420
gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag 480
tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc 540
agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac agctgccttc 600
tccctcctgt gagtttggta agtcgacggg ccgggcctgg gccgggtccg ggccgggtcg 660
ttggatcccc actacagccc gatactcaag cttgacgaat tcgagtatcc aaggtagtgg 720
actagtgtga cgctgctgac ccctttcttt cccttctgca ggttggtgta cagtagcttc 780
caaattgatt aattcgagcg aacgcgtc 808
<210> 40
<211> 7772
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 40 4-1 pGL2-SS*-CAG [CMV 增强子+CBA
启动子+内含子]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 to 120 polyA)-SS*
<400> 40
cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agaattaaag taacccaatc agcacacaat 60
tgccattata cgcgcgtata atggactatt gtgtgctgat aaacctattt cagcatacta 120
cgcgcgtagt atgctgaaat aggtgactag aagttcctat actttctaga gaataggaac 180
ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggg ttactttaat ttggttgctg 240
actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac 300
acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg 360
gggactttcc acacccctgg gtcgacgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 420
aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 480
aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 540
tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 600
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 660
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 720
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc 780
cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 840
tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc gcgccaggcg 900
gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggaa aggtgcggcg gcagccaatc 960
agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 1020
aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc 1080
gcgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg 1140
ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggctcgttt 1200
cttttctgtg gctgcgtgaa agccttaaag ggctccggga gggccctttg tgcggggggg 1260
agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg 1320
ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg 1380
cgcgagggga gcgcggccgg gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac 1440
aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcggcggtc 1500
gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1560
tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1620
ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1680
cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1740
atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1800
atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1860
caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1920
tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1980
ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 2040
cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 2100
tggcaaagaa ttgattaatt cgagcgaacg cgtcgccacc atgaactcct tctccacaag 2160
cgccttcggt ccagttgcct tctccctggg cctgctcctg gtgttgcctg ctgccttccc 2220
tgccccagtc ttcacactcg aagatttcgt tggggactgg cgacagacag ccggctacaa 2280
cctggaccaa gtccttgaac agggaggtgt gtccagtttg tttcagaatc tcggggtgtc 2340
cgtaactccg atccaaagga ttgtcctgag cggtgaaaat gggctgaaga tcgacatcca 2400
tgtcatcatc ccgtatgaag gtctgagcgg cgaccaaatg ggccagatcg aaaaaatttt 2460
taaggtggtg taccctgtgg atgatcatca ctttaaggtg atcctgcact atggcacact 2520
ggtaatcgac ggggttacgc cgaacatgat cgactatttc ggacggccgt atgaaggcat 2580
cgccgtgttc gacggcaaaa agatcactgt aacagggacc ctgtggaacg gcaacaaaat 2640
tatcgacgag cgcctgatca accccgacgg ctccctgctg ttccgagtaa ccatcaacgg 2700
agtgaccggc tggcggctgt gcgaacgcat tctggcggct agcgctacta acttcagcct 2760
gctgaagcag gctggagacg tggaggagaa ccctggacct ggaagcggag agggcagagg 2820
aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctgga cctggatccg gaatggtgag 2880
caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt 2940
aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct 3000
gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac 3060
caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga 3120
cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga 3180
cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg 3240
catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga 3300
gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa 3360
ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta 3420
ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag 3480
cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga 3540
gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaaatcaacc 3600
tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 3660
gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 3720
cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 3780
tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 3840
cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 3900
ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 3960
tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 4020
tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 4080
ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 4140
ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cgctcgcttt cttgctgtcc 4200
aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg ggatattatg 4260
aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat tgcaagctcg 4320
ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac 4380
tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc ctaataaaaa acatttattt 4440
tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactcgg 4560
aaggacatgg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 4620
tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 4680
gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caaattaaag taacccataa cttcgtatag 4740
catacattat acgaagttat gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttctagtca 4800
cctatttcag catactacgc gcgtagtatg ctgaaatagg tttatcagca cacaatagtc 4860
cattatacgc gcgtataatg gcaattgtgt gctgattggg ttactttaat ttggatccgt 4920
cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg 4980
actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg 5040
gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 5100
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 5160
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 5220
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 5280
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 5340
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 5400
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 5460
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 5520
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 5580
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 5640
gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 5700
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 5760
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 5820
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 5880
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 5940
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 6000
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 6060
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 6120
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 6180
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 6240
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 6300
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 6360
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 6420
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 6480
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 6540
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 6600
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 6660
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 6720
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 6780
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 6840
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 6900
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 6960
tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 7020
ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 7080
cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 7140
ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 7200
tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 7260
gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 7320
ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 7380
gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttgcca 7440
ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 7500
acgccagccc aagctaccat gataagtaag taatattaag gtacgtggag gttttacttg 7560
ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg 7620
ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 7680
tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 7740
tatcttatgg tactgtaact gagctaacat aa 7772
<210> 41
<211> 7725
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-2 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA
启动子+内含子e]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 to 120
polyA)-SS*
<400> 41
cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agaattaaag taacccaatc agcacacaat 60
tgccattata cgcgcgtata atggactatt gtgtgctgat aaacctattt cagcatacta 120
cgcgcgtagt atgctgaaat aggtgactag aagttcctat actttctaga gaataggaac 180
ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggg ttactttaat ttggttgctg 240
actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac 300
acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg 360
gggactttcc acacccctgg gtcgacggga ctttccgggg cggggcacgt ggtgcacggg 420
actttccgtg cacgtgcacg ggactttccg ggactttccg ggactttccg tgcaccacgt 480
ggggactttc cgtgcacggg actttccggg gcggggcacg tggtgcacgg gactttccgt 540
gcacgtgcac gggactttcc gggactttcc gggactttcc gtgcaccacg tggggacttt 600
ccgtgcacgg gactttccgg ggcggggcac gtggtgcacg ggactttccg tgcacgtgca 660
cgggactttc cgggactttc cgggactttc cgtgcaccac gtggggactt tccgtgcacg 720
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 780
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 840
cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gaaaggtgcg 900
gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 960
cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc 1020
cgtgccccgc tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc 1080
ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa 1140
tgacggctcg tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct 1200
ttgtgcgggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 1260
gtgcggctcc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc 1320
gctccgcagt gtgcgcgagg ggagcgcggc cgggggcggt gccccgcggt gcgggggggg 1380
ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt 1440
gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg 1500
gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg 1560
gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct 1620
cgggggaggg gcgcggcggc ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca 1680
gccattgcct tttatggtaa tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct 1740
gtgcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc 1800
ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc 1860
gtccccttct ccctctccag cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg 1920
gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta 1980
accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc 2040
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ccttctccac aagcgccttc ggtccagttg ccttctccct gggcctgctc ctggtgttgc 2160
ctgctgcctt ccctgcccca gtcttcacac tcgaagattt cgttggggac tggcgacaga 2220
cagccggcta caacctggac caagtccttg aacagggagg tgtgtccagt ttgtttcaga 2280
atctcggggt gtccgtaact ccgatccaaa ggattgtcct gagcggtgaa aatgggctga 2340
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tcgaaaaaat ttttaaggtg gtgtaccctg tggatgatca tcactttaag gtgatcctgc 2460
actatggcac actggtaatc gacggggtta cgccgaacat gatcgactat ttcggacggc 2520
cgtatgaagg catcgccgtg ttcgacggca aaaagatcac tgtaacaggg accctgtgga 2580
acggcaacaa aattatcgac gagcgcctga tcaaccccga cggctccctg ctgttccgag 2640
taaccatcaa cggagtgacc ggctggcggc tgtgcgaacg cattctggcg gctagcgcta 2700
ctaacttcag cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctggaagcg 2760
gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggacctggat 2820
ccggaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 2880
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 2940
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 3000
ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 3060
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 3120
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 3180
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 3240
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 3300
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 3360
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 3420
accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 3480
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 3540
agtaaaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 3600
ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt 3660
cccgtatggc tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg 3720
agttgtggcc cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc 3780
ccactggttg gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc 3840
tccctattgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc 3900
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tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 4020
ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 4080
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcgctcgc 4140
tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc ctaagtccaa ctactaaact 4200
gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc taataaaaaa catttatttt 4260
cattgcaagc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt 4320
ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctaataa 4380
aaaacattta ttttcattgc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
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gaacttctag tcacctattt cagcatacta cgcgcgtagt atgctgaaat aggtttatca 4800
gcacacaata gtccattata cgcgcgtata atggcaattg tgtgctgatt gggttacttt 4860
aatttggatc cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg 4920
ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt 4980
aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5040
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caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5160
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taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 5940
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6000
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<210> 42
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<220>
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启动子+内含子e]-SecNLuc-2A-eGFP-WPRE-3'UTR(108 to 120
polyA)-SS*
<400> 42
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cgcgcgtagt atgctgaaat aggtgactag aagttcctat actttctaga gaataggaac 180
ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatggg ttactttaat ttggttgctg 240
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cacactggta atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga 2460
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 4-4 pGL2-SS*-CAG [E1 X3+CBA
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ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 3120
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 3180
cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 3240
cgctcgcttt cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta 3300
ctaaactggg ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat 3360
ttattttcat tgcaagctcg ctttcttgct gtccaatttc tattaaaggt tcctttgttc 3420
cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc cttgagcatc tggattctgc 3480
ctaataaaaa acatttattt tcattgcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3540
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3600
aaaaaaaaaa aaaaactcgg aaggacatgg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 3660
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 3720
tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caaattaaag 3780
taacccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat gaagttccta ttctctagaa 3840
agtataggaa cttctagtca cctatttcag catactacgc gcgtagtatg ctgaaatagg 3900
tttatcagca cacaatagtc cattatacgc gcgtataatg gcaattgtgt gctgattggg 3960
ttactttaat ttggatccgt cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct 4020
tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc 4080
aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 4140
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 4200
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 4260
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 4320
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 4380
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 4440
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 4500
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 4560
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 4620
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 4680
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 4740
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 4800
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 4860
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 4920
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 4980
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 5040
tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 5100
tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 5160
tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 5220
gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 5280
tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 5340
ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 5400
gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 5460
aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 5520
ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 5580
tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 5640
ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 5700
aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 5760
ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 5820
ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 5880
agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 5940
tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 6000
ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca 6060
ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 6120
gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 6180
caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 6240
cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 6300
tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 6360
acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 6420
gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 6480
ttaacgctta caatttgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 6540
gtgcgggcct cttcgctatt acgccagccc aagctaccat gataagtaag taatattaag 6600
gtacgtggag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac ctccccctga acctgaaaca 6660
taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata 6720
aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg 6780
tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatgg tactgtaact gagctaacat aa 6832
<210> 46
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 三个拷贝的增强子-1
<400> 46
gggactttcc ggggcggggc acgtggtgca cgggactttc cgtgcacgtg cacgggactt 60
tccgggactt tccgggactt tccgtgcacc acgtggggac tttccgtgca cgggactttc 120
cggggcgggg cacgtggtgc acgggacttt ccgtgcacgt gcacgggact ttccgggact 180
ttccgggact ttccgtgcac cacgtgggga ctttccgtgc acgggacttt ccggggcggg 240
gcacgtggtg cacgggactt tccgtgcacg tgcacgggac tttccgggac tttccgggac 300
tttccgtgca ccacgtgggg actttccgtg cac 333
<210> 47
<211> 1016
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合内含子
<400> 47
ggagtcgctg cgttgccttc gccccgtgcc ccgctccgcg ccgcctcgcg ccgcccgccc 60
cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 120
ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 180
cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240
gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 300
cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg 360
cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 420
cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg ctgtaacccc cccctgcacc 480
cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg 540
gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg 600
ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg 660
gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc 720
agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780
cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg 840
gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc 900
ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga 960
ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacag 1016
Claims (135)
1.一种表达载体，其包含：
(a)主链序列；
(b)包含如下组分的序列：
(i)包含目的核酸序列的表达盒，
(ii)位于表达盒5'侧的侧翼的第一重组酶的第一靶序列，
(iii)位于表达盒3'侧的侧翼的第一重组酶的第二靶序列，和
(iv)一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列，其整合在所述第一和所述第二靶序列中位于所述第一重组酶的非结合区中：以及
(c)以下之一或多项：
(i)核酸内切酶靶序列，其整合在所述第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中，其中所述核酸内切酶靶序列位于所述主链序列和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间，
(ii)包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，其整合在表达盒中位于所述第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间，
(iii)整合在表达盒中位于所述第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子的5'端之间的巨细胞病毒(CMV)增强子，
(iv)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间的包含内含子的5'非翻译区(5'UTR)，
(v)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子，
(vi)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)，
(vii)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的支架/基质附着区(S/MAR)，或
(viii)整合在所述第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的DNA核靶向序列(DTS)，其中所述DTS位于所述表达盒与所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。
2.权利要求1的表达载体，其包含整合在所述第一重组酶的第一和/或第二靶序列内并位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的核酸内切酶靶序列，其中所述核酸内切酶靶序列位于所述主链序列和所述第一重组酶和所述一个或多个其他重组酶的切割位点之间。
3.权利要求1或2的表达载体，其包含整合在第一重组酶的第一和第二靶序列内的核酸内切酶靶序列。
4.权利要求1-3任一项的表达载体，其中所述核酸内切酶靶序列用于归巢核酸内切酶。
5.权利要求1-4任一项的表达载体，其中所述核酸内切酶靶序列用于I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I或I-Vdi141I。
6.权利要求1-5任一项的表达载体，其中所述核酸内切酶靶序列用于I-SceI。
7.权利要求1-5任一项的表达载体，其中所述核酸内切酶靶序列用于PI-SceI。
8.权利要求1-3任一项的表达载体，其中所述核酸内切酶靶序列用于Cas核酸内切酶。
9.权利要求8的表达载体，其中所述Cas核酸内切酶是Cas9。
10.权利要求1-9任一项的表达载体，其包含合成增强子，其中所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列，并整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和另一增强子或启动子的5'端之间。
11.权利要求10的表达载体，其中所述合成增强子包含多个连续拷贝的与SEQ ID NO：12至少约90％同一性的核酸序列。
12.权利要求11的表达载体，其中所述合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％同一性的核酸序列。
13.权利要求10-12任一项的表达载体，其中所述合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。
14.权利要求13的表达载体，其包含整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'的嵌合内含子，所述嵌合内含子包含与SEQ ID NO:47至少约90％同一性的核酸序列。
15.权利要求1-14任一项的表达载体，其包含整合在表达盒中位于第一重组酶的第一靶序列的3'端和启动子的5'端之间的CMV增强子。
16.权利要求15的表达载体，其中所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
17.权利要求15或16的表达载体，其中所述CMV启动子整合在CMV增强子的3'端和目的核酸序列的5'。
18.权利要求1-9任一项的表达载体，其包含与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39至少约90％同一性的核酸序列，所述核酸序列整合在第一重组酶的第一靶序列和目的核酸序列之间。
19.权利要求1-9任一项的表达载体，其包含含有内含子的5'UTR，其中所述5'UTR整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间。
20.权利要求19的表达载体，其中所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％同一性的核酸序列。
21.权利要求19或20的表达载体，还包含整合在所述内含子中的非编码序列。
22.权利要求20的表达载体，还包含整合在所述内含子中的两个核苷酸之间的非编码序列，其中所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO:1的位置25至55的任意两个核苷酸。
23.权利要求21或22的表达载体，其中所述非编码序列是S/MAR。
24.权利要求23的表达载体，其中所述S/MAR是MAR-5。
25.权利要求19的表达载体，其中所述5'UTR包含与SEQ ID NO：3至少约90％同一性的核酸序列。
26.权利要求19的表达载体，其中所述5'UTR包含与SEQ ID NO：5至少约90％同一性的核酸序列。
27.权利要求19-26任一项的表达载体，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
28.权利要求19-26任一项的表达载体，其中所述启动子是CMV启动子。
29.权利要求19-28任一项的表达载体，其中所述启动子整合在CMV增强子的3'端。
30.权利要求29的表达载体，其中所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
31.权利要求1-30任一项的表达载体，其中聚腺苷酸化信号整合在目的核酸序列的3'端。
32.权利要求31的表达载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
33.权利要求1-30任一项的表达载体，包含整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子。
34.权利要求33的表达载体，其中所述脊椎动物染色质绝缘子是5'-HS4鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS4)。
35.权利要求1-30或33-34任一项的表达载体，包含整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE。
36.权利要求1-30或33-35任一项的表达载体，包含整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR。
37.权利要求36的表达载体，其中所述S/MAR是MAR-5。
38.权利要求33-37任一项的表达载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
39.权利要求2-38任一项的表达载体，还在第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼包含增强子序列。
40.权利要求39的表达载体，其在第一重组酶的第一和第二靶序列之每一侧的侧翼包含至少两个增强子序列。
41.权利要求39或40的表达载体，其中所述增强子序列是SV40增强子序列。
42.权利要求1-38任一项的表达载体，其包含整合在第一重组酶的第一和/或第二靶序列内、位于所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的非结合区中的DTS，其中所述DTS位于表达盒和所述第一重组酶和所述一种或多种其他重组酶的切割位点之间。
43.权利要求42的表达载体，其中所述DTS是SV40增强子序列。
44.权利要求42的表达载体，其中所述DTS是细胞特异的。
45.权利要求1-44任一项的表达载体，其中所述第一和第二靶序列以及所述一个或多个其他靶序列选自由PY54 pal位点、N15 telRL位点、loxP位点、φK02 telRL位点、FRT位点，phiC31 attP位点和λattP位点组成的组。
46.权利要求45的表达载体，其中所述表达载体包含所有这些靶序列。
47.权利要求45或46的表达载体，其中所述表达载体包含pal位点和整合在pal位点内的telRL、loxP和FRT重组酶靶结合序列。
48.权利要求1-47任一项的表达载体，其中第一重组酶的第一和第二靶序列各自包含SEQ ID NO:33的核酸序列。
49.权利要求1-48任一项的表达载体，其中所述表达载体用于产生无细菌序列载体。
50.权利要求49的表达载体，其中所述无细菌序列载体是环状共价闭合载体。
51.权利要求49的表达载体，其中所述无细菌序列载体是线性共价闭合载体。
52.一种载体生产系统，其包含在诱导型启动子的控制下编码重组酶的重组细胞，其中所述重组细胞包含权利要求1-51任一项的表达载体，并且其中所述重组酶靶向所述表达载体中第一重组酶的第一和第二靶序列或一种或多种其他重组酶的一个或多个其他靶序列之一。
53.权利要求52的载体生产系统，其中所述重组酶是TelN、Tel、Cre或Flp。
54.权利要求52或53的载体生产系统，其中所述重组细胞还编码在诱导型启动子控制下的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶靶向包含该核酸内切酶靶序列的表达载体中的该核酸内切酶靶序列。
55.权利要求54的载体生产系统，其中所述核酸内切酶是归巢核酸内切酶。
56.权利要求55的载体生产系统，其中所述归巢核酸内切酶是I-AniI,I-CeuI,I-ChuI,I-CpaI,I-CpaII,I-CreI,I-DmoI,H-DreI,I-HmuI,I-HmuII,I-LlaI,I-MsoI,PI-PfuI,PI-PkoII,I-PorI,I-PpoI,PI-PspI,I-ScaI,I-SceI,PI-SceI,I-SceII,I-SecIII,I-SceIV,I-SceV,I-SceVI,I-SceVII,I-Ssp6803I,I-TevI,I-TevII,I-TevIII,PI-TliI,PI-TliII,I-Tsp061I或I-Vdi141I。
57.权利要求54-56任一项的载体生产系统，其中所述核酸内切酶是I-SceI。
58.权利要求54-56任一项的载体生产系统，其中所述核酸内切酶是PI-SceI。
59.权利要求54的载体生产系统，其中所述重组细胞编码包含核酸内切酶的核酸酶基因组编辑系统。
60.权利要求59的载体生产系统，其中所述核酸酶基因组编辑系统是包含指导RNA和Cas核酸内切酶的成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)核酸酶系统。
61.权利要求60的载体生产系统，其中所述Cas核酸内切酶是Cas9。
62.权利要求52-61任一项的载体生产系统，其中所述诱导型启动子是热调节型、化学调节型、IPTG调节型、葡萄糖调节型、阿拉伯糖诱导型、T7聚合酶调节型、冷激诱导型、pH诱导型或其组合。
63.一种产生无细菌序列载体的方法，包括在适合表达重组酶的条件下孵育权利要求52-62任一项的载体生产系统。
64.权利要求63的方法，还包括在适合表达核酸内切酶的条件下孵育权利要求38-46任一项的载体生产系统。
65.权利要求63或64的方法，还包括在适合表达核酸酶基因组编辑系统的条件下孵育权利要求59-62任一项的载体生产系统。
66.权利要求63-65任一项的方法，还包括收获无细菌序列载体。
67.通过权利要求63-66任一项的方法产生的无细菌序列载体。
68.一种无细菌序列载体，其包含：
(a)包含目的核酸序列的表达盒，和
(b)以下的一或多项：
(i)位于表达盒中另一增强子或启动子5'的、包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的合成增强子，
(ii)位于表达盒中启动子5'的CMV增强子，
(iii)整合在表达盒中位于启动子和目的核酸序列之间的包含内含子的5’UTR，
(iv)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子，
(v)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE，
(vi)整合在表达盒中位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR，或
(vii)位于表达盒5'的DTS。
69.权利要求68的无细菌序列载体，其包含位于表达盒中另一增强子或启动子5’的合成增强子，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列。
70.权利要求69的无细菌序列载体，其中所述合成增强子包含多个连续拷贝的与SEQID NO:12至少约90％同一性的核酸序列。
71.权利要求70的无细菌序列载体，其中所述合成增强子包含与SEQ ID NO：46至少约90％同一性的核酸序列。
72.权利要求69-71任一项的无细菌序列载体，其中所述合成增强子整合在鸡β-肌动蛋白启动子的5'端。
73.权利要求72的无细菌序列载体，其包含整合在鸡β-肌动蛋白启动子的3'端和目的核酸序列的5'的嵌合内含子，所述嵌合内含子包含与SEQ ID NO:47至少约90％同一性的核酸序列。
74.权利要求68的无细菌序列载体，其包含位于表达盒中启动子5'的CMV增强子。
75.权利要求74的无细菌序列载体，其中所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
76.权利要求74或75的无细菌序列载体，其中所述CMV启动子整合在CMV增强子的3'端和目的核酸序列的5'。
77.权利要求68的无细菌序列载体，其包含位于目的核酸序列5'的、与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO：39至少约90％同一性的核酸序列。
78.权利要求68的无细菌序列载体，其包含整合在表达盒中启动子和目的核酸序列之间含有内含子的5'UTR。
79.权利要求78的无细菌序列载体，其中所述内含子包含与SEQ ID NO：1至少约90％同一性的核酸序列。
80.权利要求78或79的无细菌序列载体，还包含整合在所述内含子中的非编码序列。
81.权利要求79的无细菌序列载体，还包含整合在所述内含子中的两个核苷酸之间的非编码序列，其中所述两个核苷酸对应于SEQ ID NO:1的核苷酸位置25和55的任意两个核苷酸。
82.权利要求80或81的无细菌序列载体，其中所述非编码序列是S/MAR。
83.权利要求82的无细菌序列载体，其中所述S/MAR是MAR-5。
84.权利要求78的无细菌序列载体，其中所述5'UTR包含与SEQ ID NO：3至少约90％同一性的核酸序列。
85.权利要求78的无细菌序列载体，其中所述5'UTR包含与SEQ ID NO：5至少约90％同一性的核酸序列。
86.权利要求78-85任一项的无细菌序列载体，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
87.权利要求78-85任一项的无细菌序列载体，其中所述启动子是CMV启动子。
88.权利要求78-87任一项的无细菌序列载体，其中所述启动子整合在CMV增强子的3'端。
89.权利要求88的无细菌序列载体，其中所述CMV增强子整合在合成增强子的3'端，所述合成增强子包含与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列。
90.权利要求68-89任一项的无细菌序列载体，其中聚腺苷酸化信号整合在目的核酸序列的3'端。
91.权利要求90的无细菌序列载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
92.权利要求68-89任一项的无细菌序列载体，其包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的脊椎动物染色质绝缘子。
93.权利要求92的无细菌序列载体，其中所述脊椎动物染色质绝缘子是cHS4。
94.权利要求68-89或92-93任一项的无细菌序列载体，其包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的WPRE。
95.权利要求68-89或92-94任一项的无细菌序列载体，其包含整合在表达盒中、位于目的核酸和聚腺苷酸化信号之间的S/MAR。
96.权利要求95的无细菌序列载体，其中所述S/MAR是MAR-5。
97.权利要求92-96任一项的无细菌序列载体，其中所述聚腺苷酸化信号包含与SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列。
98.权利要求68-97任一项的无细菌序列载体，还包含位于表达盒之每一侧的侧翼的增强子序列。
99.权利要求98的无细菌序列载体，其在表达盒之每一侧的侧翼包含至少两个增强子序列。
100.权利要求98或99的无细菌序列载体，其中所述增强子序列是SV40增强子序列。
101.权利要求68-97任一项的无细菌序列载体，包含位于表达盒5'的DTS。
102.权利要求101的无细菌序列载体，其中所述DTS是SV40增强子序列。
103.权利要求101的无细菌序列载体，其中所述DTS是细胞特异的。
104.权利要求68-103任一项的无细菌序列载体，其是环状共价闭合载体。
105.权利要求68-103任一项的无细菌序列载体，其是线性共价闭合载体。
106.包含权利要求1-51任一项的表达载体或权利要求67-105任一项的无细菌序列载体的重组细胞。
107.包含权利要求1-51任一项的表达载体或权利要求67-105任一项的无细菌序列载体的组合物。
108.权利要求107的组合物，还包含递送剂。
109.权利要求108的组合物，其中所述递送剂是纳米颗粒。
110.权利要求108或109的组合物，其中所述递送剂包含靶向配体。
111.权利要求107-110任一项的组合物，其是进一步包含药学上可接受载体的药物组合物。
112.一种在有需要的个体中治疗疾病或病症的方法，包括向所述个体施用权利要求1-51任一项的表达载体、权利要求67-105任一项的无细菌序列载体、或权利要求111的药物组合物。
113.包含与SEQ ID NO:1至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
114.包含与SEQ ID NO:2至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
115.包含与SEQ ID NO:3至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
116.包含与SEQ ID NO:5至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
117.包含与SEQ ID NO:12至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
118.包含与SEQ ID NO:46至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
119.包含与SEQ ID NO:13至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
120.包含与SEQ ID NO:14至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
121.包含与SEQ ID NO:15至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
122.权利要求86-88任一项的多核苷酸，还包含位于所述核酸序列3'端的100-120个腺嘌呤核苷酸。
123.包含与SEQ ID NO:16至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
124.包含与SEQ ID NO:17至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
125.包含与SEQ ID NO:18至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
126.包含与SEQ ID NO:35至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
127.包含与SEQ ID NO:36至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
128.包含与SEQ ID NO:37至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
129.包含与SEQ ID NO:38至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
130.包含与SEQ ID NO:39至少约90％同一性的核酸序列的多核苷酸。
131.包含权利要求113-130任一项的多核苷酸的表达载体。
132.包含权利要求114-116任一项的多核苷酸和权利要求119-125任一项的多核苷酸的表达载体。
133.一种基因编辑方法，包括将来自权利要求1-51任一项的表达载体、权利要求67-105任一项的无细菌序列载体、或权利要求107-111任一项的药物组合物的目的核酸序列插入用于基因编辑的靶位点。
134.权利要求133的方法，其中所述基因编辑是通过非同源末端连接进行的。
135.权利要求133的方法，其中所述基因编辑是同源定向修复进行的。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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