NO312009B1 - Anvendelse av et konjugat av en målsökende gruppe og 213BBi radioisotop for fremstilling av et medikament - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av et konjugat av en målsøkende gruppe og <213>Bi radioisotop for fremstilling av et medikament for behandling av cancer i mikrometastaser som har en diameter på lmm eller mindre. For tiden er det flere metoder for seterettet terapi som er antydet for å eliminere uønskede celler eller smittsomme organismer fra kroppen til et pattedyrindivid.

Det er mange terapiområder hvor nevnte metoder kan anvendes.

De mest viktige synes å være immunsykdommer (enten autoimmune sykdommer eller ervervede immunsykdommer), kreft og virus- eller mikrobe-infeksjoner.

Seterettet terapi er en fremgangsmåte hvorved en cytotoksisk forbindelse blir avgitt i den umiddelbære nærhet av målecellen eller den smittsomme organisme. Dette gjøres vanligvis ved kobling av en målsøkende gruppe til den cytotoksiske forbindelse.

Denne målsøkende gruppe gjenkjenner en struktur i, på eller nær målet. Kjente målsøkende grupper omfatter, men er ikke be.grenset til, antistoffer, nærmere bestemt monoklonale antistoffer og særlig humane monoklonale antistoffer, nukleinsyrer, reseptorrettede ligander o.L.

Cytotoksiske forbindelser kan f.eks. være medikamenter, såsom adriamycin, toksiner såsom ricin A og radioisotoper.

Radioisotoper kan anvendes ikke bare for terapi, men de kan også anvendes for å identifisere setet eller setene for målet (bildedannelse). Terapi med mål-søkende grupper er bredt kjent. Målsøkingen kan gjennomføres ved innsikting av den målsøkende gruppe direkte til det ønskede setet, men den kan også rettes mot en annen målsøkende gruppe som blir rettet mot det ønskede setet (såkalt forhånds-målsøking). Forhåndsmålsøking gir en fordel sammenlignet med direkte målsøking når spesifisiteten til de målsøkende grupper ikke er tilstrekkelig. Ved å anvende en første lokaliserende gruppe etterfulgt av en andre gruppe koblet til en cytotoksisk forbindelse, kan den mengde cytotoksisk forbindelse som avgis til ikke-målseter, nedsettes signifikant.

Kjente målsøkende grupper, såsom antistoffer, kan ofte ikke tilveiebringes med en stor mengde cytotoksiske forbindelser uten å hemme deres målsøkende spesifisitet. Det har derfor ofte vært antydet å anvende et bærermolekyl, såsom HSA eller en nukleinsyre, eller en polymer, som kan fylles med et stort antall cytotoksiske forbindelser og kobles til en målsøkende gruppe.

Alle de ovenfor nevnte variasjoner av temaet seterettet terapi og/eller bildedannelse kan anvendes mer fordelaktig med den foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse av et konjugat av en målsøkende gruppe og <2>13Bi radioisotop for fremstilling av et medikament for behandling av cancer i mikrometastaser som har en diameter på 1 mm eller mindre.

Et vel anerkjent problem på området bildedannelse og seterettet radioterapi er å finne en egnet radioisotop. Bortsett fra den energimengde som frigjøres ved deres spalting, og som skulle være tilstrekkelig til å være målbar utenfor individet i tilfelle bildedannelse og tilstrekkelig dødelig for målet i tilfelle terapi, er det også et

problem å finne en isotop med en passende halveringstid.

En isotop med en lang halveringstid kan ikke velges p.g.a. den biologiske halveringstid for den målsøkende gruppe, hvilket betyr at de fleste av isotopene vil spaltes etter disintegrering av konjugatet. Denne spalting etter disintegreringen av konjugatet vil føre til cytotoksisitet for andre celler eller vev enn målet.

Dessuten vil alle konjugater som ikke lokaliseres bli utskilt fra kroppen og forårsake et radioaktivt avfallsproblem.

Det er heller ikke praktisk å velge en radioisotop med altfor kort halverings-tid, p.g.a. pakkings- og transportforsinkelser, og fordi institusjonen som utfører terapien må være utstyrt til å lage konjugatet, transportere det til pasienten og administrere det i løpet av et svært kort tidsintervall, ellers vil det meste av radioisotopen være spaltet før den kommer inn i kroppen, for ikke å snakke om lokaliseringen på målsetet.

De isotoper som anvendes for bildedannelse er vanligvis gammaemitterende isotoper, for terapi kan anvendes augerelektronemitterende, a,/5-emitterende, eller a-emitterende isotoper.

Mest foretrukket for den foreliggende oppfinnelse er a-emitterende isotoper.

Celledrepevirkningen på kort hold av a-partikler er enorm: en 1 mm diameter tumor, omfattende kanskje 600.000 cancer-celler behøver bare 6 a-partikler av 6 MeV pr. celle for å avgi en dose på 600 rad, hvilket forårsaker et 99,9% celledrepe-forhold, og det spesifikt p.g.a. den stokastiske karakter av treffe- og drepe-mekanismen.

P.g.a. den samme stokastiske karakter vil imidertid en 10 ganger lavere a-strålingsdose øke celleoverlevingsforholdet med en faktor 500: mer enn 50% av cellene (eller ikke-tumorceller av lignende morfologi for den saks skyld) ville over-leve en 60 rad a-strålingsdose, tilsvarende 0,6 a-partikler pr. celle.

Denne egenskap ville gjøre en effektiv a-radioimmunoterapi innenfor rekkevidde, forutsatt at det kan oppnås en "kvalitetsfaktor" for isotop-antistoff-konjugatet på 10 eller bedre. Det er formålet med den foreliggende oppfinnelse å bidra til dette mål på den mest essensielle måte.

Kvalitetsfaktoren er et forhold mellom lokalisert antistoff på målsetet, dividert med det antistoff "som kleber" til annet vev.

Forestillingen om å anvende a-partikler som sender ut radioisotoper som midler for avliving av tumorceller ble allerede nevnt i litteraturen under midten av 50-årene. Siden da ble og er andre potensielle kandidatisotoper blitt foreslått, hvorav et godt sammendrag er gitt av Fisher (1) og av Wilbur (2) som bringer listen til (med deres halveringstid i parentes): <223>Ra (11,4 d), <225>Ac (10 d), <224>Ra (3,6 d), <225>Fm (20 h), 211 At (7,2 h), <212>Bi (60 m) og <213>Bi (47 <m>).

Selv om viktige publikasjoner fremkommer regulært i litteraturen angående mikrodosimetri, antistoffisotopkoblingsteknikker, prekliniske in vitro- og in vivo-eksperimenter, utføres det inntil videre ingen klart definerte kliniske eksperimenter i stor skala, av flere forskjellige grunner: a. ingen humane monoklonale antistoffer med bevist tilstrekkelig kvalitet er

ennå tilgjengelig,

b. ingen biologiske sikkerhetsdata er tilgjengelige for antistoffkoblingsmiddel-kombinasjoner (sistnevnte for binding av radioisotopen), c. noen isotoper kan kanskje ikke bli tilgjengelige for storskalaanvendelse ved akseptable kostpriser ( 225Fm), d. det kan være for vanskelig og derfor for dyrt å fremstille isotoper p.g.a. den nødvendige fremstillingsprosess ( 211 At fira <20>9Bi ved en ( a, 2n) reaksjon i en

cyklotron og påfølgende isolering pluss rensing),

e. andre isotoper har en Rn-isotop som første datter i deres nedbrytningssekvens, hvilket tillater omfordeling av datterkjerner før spaltingen (<2>24Ra,

<223>Ra), og også nødvendiggjør gasstette reaksjonsbetingelser,

f. noen isotoper kan ha en relativt langlivet datterisotop et sted i deres spalte-sekvens (<224>Ra, <223>Ra, <225A>c), også med muligheten for at døtrene derav kan

omfordeles før spalting,

g. den radioaktive halveringstid for noen isotoper er så lang at mesteparten av aktiviteten forlater pasienten uspaltet, hvilket fører til et avfallsproblem ,223-n 224„ 225 A \ nl

( Ra, Ra, Ac) eller

h. halveringstiden for isotopen er så kort at mesteparten av isotopen spaltes før

den når frem til sitt endelige mål (<212>Bi, <213>Bi),

i. tilstrekkelig forløpermateriale kan ikke være tilgjengelig for på en gang å ekstrahere den nødvendige mengde isotop for en enkelt pasientbehandling

( Bi, Bi) og

j. isotoper som gir harde gammastråler ved sin isotopspalting behøver skjerming for å forhindre strålingsfare for teknikere og sykepleiere.

Ett eller flere av argumentene oppført ovenfor vil gjøre det svært vanskelig, om ikke umulig, noensinne å anvende noen av isotopene i stor skala for a-radioimmunoterapi, og særlig dersom én eller flere av de andre kan anvendes på akseptable tekniske, logistiske og finansielle betingelser.

Den nærmeste tidligere teknologi til den foreliggende oppfinnelse (den franske patentsøknad FR-A-2 527 928) beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av konjugater av et antistoff og <212>Bi. Disse konju<g>ater lider imidlertid fremdeles av de ulemper som er nevnt ovenfor under e, h, i og j.

Konjugatet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse er av en mål søkende gruppe og kan fremstilles sammen med radioisotopen på eller nær pasientens sykeseng. Den relativt langlivete radioisotop hvorav døtrene i nedbrytningssekvensen overveiende emitterer a- og/- eller p-stråler, blir fylt i et egnet medium og ut av hvilket medium en relativt kortlivet isotop blir eluert og blir koblete til den målsøkende gruppe.

Relativt langlivet i denne sammenheng betyr at radioisotopene har en nedbrytningstid av størrelsesorden flere dager, hvilket muliggjør tilstrekkelig tid for emballering og transport. Relativt kortlivet i denne sammenheng betyr at radioisotopene har en nedbrytningstid av størrelsesorden minutter eller timer.

Med en nedbrytningssekvens hvori overveiende a- og/eller /3-stråler blir emittert, menes en nedbrytningssekvens som ikke forårsaker strålingsfare forårsaket av gamma-stråler for folk som arbeider med forbindelsene uten ulempen ved å anvende beskyttelsesskjerming.

Radiokonjugatet kan lages eller kvasi lages på terapistedet. P.g.a. spaltings-sekvensen som resulterer hovedsakelig i a- og/eller /3-stråling er det blitt mulig at det ikke er nødvendig med noen strålingsbeskyttelse. Dette er ekstremt nyttig, fordi det er blitt mulig, p.g.a. fraværet av gamma-stråling, at konjugeringen kan utføres ved eller nær sykesengen uten at det er nødvendig å anvende strålingsbeskyttelse eller isolering av pasienten. Dette er å foretrekke ikke bare fra synspunktet strålingsfare, men det gir også fordeler for tilgjengeligheten av den kortlivede isotop. Denne isotop kan fremstilles i pasientens nærhet og tillate hurtig administrasjon og forhindring av tap av terapeutisk virkning forårsaket av den hurtige nedbrytning av isotopen. På denne måte er det blitt mulig å anvende kortlivede radioisotoper for terapi.

En ionebytterkolonne for et annet hensiktsmessig substrat fylt med den lang-livede isotop kan plasseres ved eller nær sykesengen, f.eks. hvor den kort-livede isotop kan elueres ved vasking av substratet med en egnet løsning. Etter eluering blir den kortlivede isotop koblet til den målsøkende gruppe og (eventuelt sammen med en infusjonsløsning) kan konjugatet administreres. Dette kan alt gjøres på kontinuerlig måte med et apparat ifølge denne oppfinnelse som vist i fig. 1 eller fig. 3, eller på intermittent måte ved anvendelse av vanlige laboratorieglassvarer.

Det kan naturligvis også gjøres mulig å tilsette den målsøkende gruppe til elueringsløsningen slik at koblingen finner sted i kolonnen.

Denne oppfinnelse angår anvendelsen av den kort-livede isotop fra listen nevnt ovenfor, <213>Bi. Oppfinnelsen gjør det mulig for en fagperson på dette området å melke denne isotop ved en kontinuerlig eller intermittent ekstraksjonsmetode fra én av dens forløpere, <225>Ac, ved pasientens sykeseng, eller i det nærmeste sykehus-laboratoriet, å binde 213Bi - på kontinuerlig eller intermittent måte til den målsøkende gruppe, å enten blande eller ikke blande konjugatløsningen med en infusjonsvæske og å administrere denne blanding intravenøst til pasienten - f.eks. som skjematisk vist i figur 1.

Det første inntrykk av denne fremgangsmåten kan synes ekstremt uøkonomisk, fordi <225> Ac, som selv er en a-emitterende isotop, frembringer tre potensielt terapeutisk anvendbare a-partikler før den avgir <2>13Bi-isotopen, som vist i figur 2. Kildematerialet for <2>25 Ac, 229 Th og derved også <2>25 Ac selv, kan imidlertid gjøres tilgjengelig ved tilstrekkelig lav kostnad til å tillate at den kan anvendes på den foreslåtte måte på økonomisk forsvarlig vis.

Anvendelsen av <213>Bi er ikke bare å foretrekke ut i fra synspunktet strålingsfare. Den er også å foretrekke p.g.a. at ingen gassformige isotoper forekommer i nedbrytningssekvensen for dens forløpere. Dette er fordelaktig sammenlignet med anvendelsen av andre isotoper som kan nedbrytes med en gassformig isotop som gjør det nødvendig at håndteringen og reaksjonsmiljøet er lufttett. Melking, konjugering og administrering av <213>Bi blir ikke hemmet av nødvendigheten for å ha lufttette betingelser, og reaksjonene kan utføres under vanlige betingelser.

Den målsøkende gruppe kan fortrinnsvis være et monoklonalt antistoff, eller et fragment eller et derivat derav. Fortrinnsvis vil et slikt antistoff være et humant eller et humanisert antistoff for å forhindre immunologiske reaksjoner mot antistoffet. Ikke-humane antistoffer er mest av murin opprinnelse. Disse, som alle andre fremmede proteiner, er svært immunogene hos mennesker. Fenomenet HAMA, humane antimusantistoffer, er vel kjent på dette området og begrenser alvorlig anvendelsen av musavledede antistoffer i diagnostiske og særlig i terapeutiske anvendelser i menneskeindivider. En enkelt anvendelse av et murint antistoff er vanligvis tilstrekkelig til å mobilisere en immun respons som vil forhindre at påfølgende anvendelser kan være effektive.

Naturligvis kan det anvendes fragmenter og/eller derivater av de målsøkende grupper, så lenge som de beholder en vesentlig mengde av målspesifisitet. For denne oppfinnelse skal det således forstås at hvor en målsøkende gruppe er nevnt, skal man også betrakte et fragment eller et derivat derav som del av denne oppfinnelse.

Fortrinnsvis er antistoffer rettet mot tumorassosierte antigener, såsom CEA (Carcino-embryonisk antigen), AFP (alfa-foetorotein), FHAP (fast homoarginine-sensitve alkaline phosphatase), p97 (melanom-spesifikt) og EL-1 (forlengelses-faktor 1).

En annen foretrukket målsøkende gruppe blir dannet av en ligand for en celleoverflatereseptor eller et fragment eller derivat av en slik ligand. Eksempler på slike ligander er agonister og/eller antagonister av farmakologisk aktive reseptorer, men også T-celle-epitoper som kan binde seg til T-celle-reseptoren blir foretrukket.

Det er mulig å behandle flere pasienter med én ionebytterkolonne fylt med isotop. Mengden av ifylt isotop avhenger av antallet pasienter som skal behandles. Den ønskede isotop kan elueres fra kolonnen intermittent, med egnede intervaller avhengig av halveringstidene i nedbrytningskjeden.

Med beslektede tumorer eller smittsomme organismer kan den samme mål-søkende gruppe (eller blanding av målsøkende grupper) anvendes for forskjellige pasienter. For ikke-relaterte sykdommer må det være en måte til å forandre frem-stillingen av den målsøkende gruppe.

Koblingen av isotopen til den målsøkende gruppe kan gjøres på hvilken som helst egnet måte, så lenge som den målsøkende spesifisitet av den målsøkende gruppe ikke hemmes i vesentlig utstrekning.

Fortrinnsvis vil koblingen bli utført gjennom ett av de nå mange kjente chelateringsmidler. Som allerede beskrevet kan det være fordelaktig å koble isotopene til en bærer, såsom HSA, hvilket naturligvis også kan utføres gjennom chelateringsmidler. Fordelen med en bærer er at et stort antall radioisotoper kan bringes frem til målcellen. Siden det antas at flere a-partikler er nødvendig for ødeleggelse av én målcelle, vil en økning i antallet isotoper i det nærmeste naboskap av målcellen være å foretrekke.

Den enkleste måte til å beskrive fremgangsmåten som kan anvendes og apparatet med referanse til figur 1, er som følger: En kapillarkolonne inneholder som eksempel to ganger den mengde forløper-<225> Ac som er nødvendig for en enkel pasientdose av <2>13Bi. Eksempel: i et tilfelle tilsvarer pasientdosen 30 mCi (tilsvarer 2-10" 9 g) av <2>13Bi i løpet av en 10 dagers periode, kapillarkolonnen (3) vil inneholde 200 ptCi av <2>25 Ac (tilsvarer 4-10" 9 g).

<225> Ac er tilstede i en 3 -form på et egnet ionebyttersubstrat. Etter dens

(kontinuerlig forekommende) nedbrytning, blir den strippet av fra kolonnen med en viss overdose av elueringsmidlet i flasken (1) inneholdende den egnede målsøkende gruppe som er i stand til å binde isotopen. Bindingsdelen av den målsøkende gruppe og andre kjemiske likevektsbetingelser for elueringsmiddel-ionebyttersystemet blir valgt slik at <2>13Bi, for alle praktiske formål, binder seg kvantitativt til den mål-søkende gruppe. Den umiddelbare datter av <2>25 Ac, <221>Fr har en radioaktiv nedbrytningshalveringstid på 4,8 min.. Det er denne isotop som virker via den svært kortlivede 217 At som den direkte forløper for 113 Bi. I tilfelle <2>21Fr ikke blir holdt tilbake av seg selv eller i ionebyttersubstratet, vil den forsinkende virkning av <221>Fr-halveringstiden forårsake behovet for et visst tidsrom mellom nedbrytningen av 225 Ac og dens stripping fra kapi• llarsøylen og bindingen av <2>13Bi til de mål-søkende grupper. Den optimale verdi for en slik forsinkelse er et sted mellom halveringstiden for 221 Fr og halveringstiden for <213>Bi-isotopene.

Denne forsinkelse kan utvirkes ved lengden av røret mellom kapillarkolonnen (3) og pasienten (4), om nødvendig øket med en ekstra lengde av mellomliggende slange, som angitt i figur 1 som (5). Infusjonsvæsken fra flasken (2) kommer inn i pasienten, den er blandet med det isotop-holdige eluat fra kolonne (3), som angitt som koblingen (6) i figur 1.

For å oppnå optimale stripping- og konjugeringsbetingelser i kapillarkolonnen (3), kan det være at blandingen av elueringsmidlet i flasken (1) ikke er optimal (f.eks. dens pH-verdi) for administrering til pasienten. Antas det at volum hastigheten av infusjonsvæske er en størrelsesorden høyere enn for eluatvæsken, kan dette lett motvirkes ved en kompenserende (bufret) pH-verdi ute av balanse for infusjonsvæsken.

Det er også mulig at bindingen av den målsøkende gruppen blir hemmet av elueringsmidiets fysikalsk-kjemiske egenskaper. En annen utførelse av denne oppfinnelse er følgelig representert i fig. 3 hvor et elueringsmiddel blir ledet fra beholderen (7) gjennom en ionebytterkolonne (3) slik at en radioisotop blir strippet fra denne kolonne. Elueringsmidlet som inneholder isotopen blir blandet med en væske fra beholderen (1) inneholdende en målsøkende gruppe, slik at isotopen blir bundet til den målsøkende gruppe. Det resulterende fluid blir blandet med infusjonsvæske fra beholderen (2) ved sammenkoblingen (6) og administrert til pasienten (4). Eventuelt kan elueringsmidlet inneholdende isotopen ledes gjennom en ytterligere slangelengde (5) for å korrigere for halveringstiden for intermediære datterisotoper.

Utvikling og den kliniske anvendelse av a-radioimmuno-terapi, i dette tilfellet ved anvendelse av <2>13Bi som det aktive celledrepende middel muliggjør: "enkeltpasientkits" i form av forløper med en halverings-tid som er logistisk styrbar angående: minimalisering av tap av aktivt materiale ved radioaktiv nedbrytning under

operasjoner som emballering, transport osv.,

transportsikkerhet over lange avstander og ved håndtering i hospitaler, anvendbarhet i praksis i stor skala i mange hospitaler uten behov for spesielle

forholdsregler angående:

håndteringen av materialet og anvendelsesrfemgangsmåter vedrørende

behandlng av pasienter, alle uten komplisert overvåkingsutstyr, oppsamlings- og håndteringsutstyr for (urinholdig) avfall,

maksimal (og i tilfelle kontinuerlig ekstraksjon, nesten fullstendig)

anvendelse av <213>Bi etter at den er dannet fra forløpeirsotopen,

maksimal fleksibilitet i doseadministrasjon ved muligheten for å forandre behandlingstid, ved å tillate et minimumsområde for enkeltpasientkit-forløper-konsentrasjonsstandarder.

Alle disse aspekter vedrører således nøyaktige områder hvor a-partikler med kort rekkevidde er best egnet for sine potensielle terapeutiske anvendelser som: mikrometastaser (på mindre enn 1 mm diameter) av forskjellige cancere, cellulære cancere som leukemi og

også visse typer av svært lokaliserte autoimmune sykdommer, hvorav alle i alt vesentlig kan behandles direkte enten av blodsirkulasjonssystemet eller lokalt uten behovet for langsomme diffusjonsprosesser av antistoff-ligand-isotop-kompleksene gjennom det intercellulære rom for å finne sin endelige bestemmelse.

En spesiell fordel ved intermittent administrasjon av de terapeutiske radio-konjugater er den fordel som forekommer ved dosefraksjonering. Statistisk er det mulig å beregne den dose som er nødvendig for å drepe 99,9% av tumorcellene med en dose av radiokonjugat: antas det at det finnes en leukemisk tumormengde (monocellulær, blod og margben) på 1 kg, som er omtrent lik 10 12 celler, og at 10 a-partikler er nødvendig for å drepe en celle (6 MeV), ville det trenges IO<13 >a-partikler, hvilket tilsvarer 50 mCi • <2>13Bi. For en enkelt dose som ville drepe 99,9% av tumorcellene ville det således behøves 50 mCi <2>13Bi.

"Dose versus overleving"-forholdet for denne cellemorfologi med 6 MeV a-partikler kan avledes fra formelen D/Do= -ln S, hvori S = overlevingsandel, D = administrert dose og Do = referansedose for 37% overleving. Ut i fra denne formel kan det beregnes følgende tabell av verdier:

Tabell 1. Dose versus drepeforhold for tumorceller. Tallene er det antall a-partikler som er nødvendig for å drepe den gitte % tumorceller. I tilfelle A er det nødvendig med 600 rad for å oppnå et drepeforhold på 99%. I tilfelle B antas det at 2000 rad er nødvendig for den samme virkning.

Ut i fra denne tabell kan avleses virkningene av en intermittent, dose-fraksjonert administrasjon: Virkningen av celleoverleving på påfølgende doser av 5 mCi <2>13Bi i tilfelle A

er som følger:

den første dose av 5 mCi tilsvarer 1 a-partikkel pr. celle, hvilket gir 50%

overleving, som betyr at 0,5-10 12 celler er tilbake.

den andre dose på 5 mei tilsvarer 2 a-partikler pr. celle, hvilket gir 20%

overleving, som betyr at 0,1 • 10 12celler er tilbake;

den tredje dose på 5 mCi tilsvarer 10 a-partikler pr. celle, hvilket gir 0,1%

overleving som betyr at 0,1 • 109 celler er tilbake;

den fjerde dose på 5 mCi tilsvarer 10.000 a-partikler pr. celle, hvilket betyr fullstendig dreping.

Det kan således vises at ved intermittent dosering er en total dose på 4 ganger 5 = 20 mCi <213>Bi tilstrekkelig til å gi fullstendig dreping av tumorcellene. For større klarhet er virkningene av mellomliggende tumorvekst og maksimering av antallet målsøkende grupper på tumorcellene blitt utelatt. Allikevel er det klart at ved intermittent adminsitrasjon kan den samlede mengde av radioaktivt materiale holdes mindre.

Selv i tilfelle B, som har en mer ufordelaktig dose versus overlevingsrate, oppnås en fordelaktig virkning:

1. dose 1 o/celle -> 75% overleving 0,75-10 12 celler

2. dose 1,3 a/celle-» 70% overleving 0,50-IO<12> celler

3. dose 2 a/celle -» 60% overleving 0,30-IO<12> celler

4. dose 3 a/celle -> 50% overleving 0,15-IO<12> celler

5. dose 6 a/celle —> 25% overleving 0,04-IO<12> celler

6. dose 25 a/celle -> 0,3% overleving -> 0,1-IO<9> celler

7. dose 10.000 a/celle -> total dreping etter 35 mCi.

Det er to måter som for tiden er kjent for å oppnå <229>Th som forløper for <225>Ac-kilde-isotopen: fra lagret 233 U, ved naturlig a-nedbryting. Satser av <233>U ble laget i formeringskjernereaktorer for ca. 30 år siden, men ble aldri anvendt som kjernebrensel.

Noe av dette 233 U ble skilt fra den <233>Th-mengde som det var laget ut i fra,

slik at det nå tilgjengelige <2>29Th kan oppnås i svært ren form.

ved bestråling med høy neutronflux fra naturlig 226 Ra, med <227> Ac som mellomprodukt. Videre bestråling av dette <227> Ac gir om lag like store mengder av 229 Th og 228Th, sistnevnte med mye kortere halveringstid (2 år) enn 229 Th. På den ene side kompliserer dette ekstraksjonen av <225>Ac betyde-lig, men i korrekt utstyrte installasjoner kan det på den annen side gi <224>Ra, en «-emitter med en halveringstid på 3,7 dager. Når Ra isoleres tilfredsstillende, kan det anvendes som en kilde for ""Pb.

Halveringstiden på 10,5 timer for <212>Pb vil forårsake betydelige komplika-sjoner under håndtering. Når disse blir tatt hånd om tilfredsstillende, kan man imidlertid regne med å anvende <2>12Pb-isotopen på samme måte som <225> Ac i denne oppfinnelse som en kilde for <212>Bi ved sykesengen, som for alle praktiske formål virker som en a-emitter med en halveringstid på 1,0 time.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Separasjonskjemien for de forskjellige radioaktive elementer nevnt i teksten foran, er blitt klarlagt for flere tiår siden og er vel-dokumentert i den offisielle litteratur. Eksempler er referansene (3) og (4). 99 S Ac kan adskilles fra <990>Th på en Dowex 50 ionebytter ved eluering med 4N HNO3. Etter fordampning av syren kan <225> Ac løses igjen i 0,5N HNO3 i en bestemt konsentrasjon og absorberes i en passende mengde av Dowex 50, som deretter blir materialet i mini-kolonnen (3) i figur 3.

Eksempel 2

0,68±0,07 mCi av <225>Ac ble levert fra the European Joint Research Centre. Dette ble lastet inn på en MP-50 kationbytterharpiks (Bio-Rad). Det dannede <213>Bi ble eluert med en blanding av 50:50 10% NH4Ac:MeOH med en pH på 6,75. En autobyrette ble anvendt til å gi 35 /xl elueringsmiddel pr. min.; alternativt ble det utført manuell eluering med 50 /il mengder elueringsmiddel pr. min..

I et par eksperimenter var det nødvendig å rense <2>13Bi. Dette ble gjennomført ved oppvarming av elueringsmidlet til tørrhet i et 10 ml beger inneholdende 0,5 ml kons. HNO3. Etter inndamping under en IR-lampe, ble vismutaktiviteten overført til en kolonne med MP-50 harpiks (2x30 cm, pre-ekvilibrert med 0,1M HNO3). Harpiksen ble vasket med 0,2 ml H2O. Deretter ble <2>13Bi eluert med 0,5 ml HC1 og HI. Forskjellige konsentrasjoner av HC1 og HI er forsøkt. Figur 4 viser eluerings-mønstrene for <213>Bi. I alle tilfeller er elueringen hurtig og kvantitativ. Alt av isotopen kan oppnås i løpet av 5 til 10 min. etter at elueringen er startet.

Eksempel 3

Radiomerking ble utført ved å tilsette tilstrekkelig 3M NHUAc til <2>13Bi stock-løsningen til å oppnå pH 4,0-5,0. Deretter ble 53 pil eller 106 /il av en 4,7 mg/ml løsning av monoklonalt antistoff B3 koblet med chelatoren CHX-DTPA (cyklo-heksyldietylentriaminpentaeddiksyre) ifølge fremgangsmåten beskrevet i (5) forsiktig blandet inn i løsningen. Etter en reaksjonstid på 15 min. ble tilsatt 1,5 /il av 0,1 M EDTA. Løsningen ble overført til en 1 ml sprøyte med 0,2 ml vasking. Løsningen ble deretter injisert i HPLC (høytrykks-væskekromatografi) med en TSK 3000 kolonne. Bufferen var 0,02M MES/C1" (MES = morfolinoetansulfonsyre), 0,15M NaCl, pH 6,5. Eluering av B3-antistoffet foregikk ved 7,5 min.. Mengden av <213>Bi inkorporert i antistoffet ble overvåket med en in-line radiokjemisk detektor (Beckman). Alle aktivitetsmålinger av <213>Bi ble korrigert for nedbrytning (t-/2 = 45,6 min.). Resultatene er gjengitt i tabell 2. Aktivitetene av 225 Ac, 221 Fr eller <217>At var ikke påvisbare i noen av <213>Bi-elu<e>ringsproduktene.

Eksempel 4

På samme måte som beskrevet i eksempel 2 og 3 ble 213 Bi eluert fra <2>25Ac og koblet til en målsøkende gruppe. For dette eksperiment ble anvendt et konjugat av monoklonalt antistoff Ml95 og chelatoren CHX-DTPA. Tabell 3 sammenfatter resultatene.

Tegnforklaring til figurene.

Figur 1 viser et apparat ifølge denne oppfinnelse.

Et elueringsmiddel inneholdende en målsøkende gruppe ledes fra en beholder (1) gjennom en ionebytterkolonne (3) hvori radioisotopen binder seg til den målsøkende gruppe. RC blandes med infusjonsvæske fra beholderen (2) i sammenkoblingen (6) og administreres til pasienten (4). Eventuelt er det en ytterligere slangelengde mellom kolonnen (3) og sammenkoblingen (6) for å korrigere for halveringstidene for de mellomliggende datterisotoper.

Figur 2 viser nedbrytningskjeden for <2>25Ac.

Figur 3 viser et annet apparat ifølge denne oppfinnelse.

Et elueringsmiddel ledes fra en beholder (7) gjennom en ionebytterkolonne (3) slik at en radioisotop elueres fra denne kolonnen.

Elueringsmidlet inneholdende isotopen blir blandet med en væske fra en beholder (1) inneholdende en målsøkende gruppe, slik at isotopen blir bundet til den målsøkende gruppe. Det resulterende fluid blandes med infusjosnvæske fra beholderen (2) i sammenkoblngen (6) og administreres til pasienten (4). Eventuelt kan elueringsmidlet inneholdende isotopen ledes gjennom en ytterligere slangelengde (5) for å korrigere for halveringstiden for mellomliggende datterisotoper.

Figur 4 viser elueringsoppførselen for <2>13Bi ved flere HC1- og HI-konsentrasjoner.

Referanser:

(1) D.R. Fisher: "a-particle emmitters in medicine", foredrag ved et symposium holdt ved Loews LEnfant Plaze Hotel, Wahsington, DC, 21. og 22. september 1989, sidene 194-214, publisert av the American College of nuclear physicians. (2) D.S. Wilbur: "Potential use of a-emitting radionuclides in the treatment of cancer", Antibody, Immunoconjugates, og Radiopharmaceuticals, volum 4, nr. 1, 1991, sidene 85-97, publisert av Mary Ann Liebert, Inc. (3) T. Mitsugashira: "Preparation of traces for actinium, thorium, protactinium and uranium", SPEY, Min. Educ. Sei. & Cult., Tokyo, 9, 1984, sidene 111-116. (4) S. Suzuki: "Solution chemistry of light actinide elements", Japan-US seminar on Thorium fuel reactors - proceedings, Nara, Japan, 18. til 22. oktober 1982 (Tokyo, 1985) sidene 137-143. (5) Mirzadeh, S., Brechbiel, M.W., Atcher, R.W., Gansow, O.A., Bioconjugate Chem., volum 1, 1990, 59-65.

Claims (3)

1. Anvendelse av et konj* ugat av en målsøkende gruppe og <2>13Bi radioisotop for fremstilling av et medikament for behandling av cancer i mikrometastaser som har en diameter på 1 mm eller mindre.

2. Anvendelse ifølge krav 1, idet den målsøkende gruppen er et monoklonalt antistoff eller et fragment eller et derivat derav.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori det monoklonale antistoff er et humant eller humanisert antistoff.