NO306996B1 - Isolert bukspyttkjerteloey-celle-(ICA)-antigen for in vitro- bruk - Google Patents
Isolert bukspyttkjerteloey-celle-(ICA)-antigen for in vitro- bruk Download PDFInfo
- Publication number
- NO306996B1 NO306996B1 NO900474A NO900474A NO306996B1 NO 306996 B1 NO306996 B1 NO 306996B1 NO 900474 A NO900474 A NO 900474A NO 900474 A NO900474 A NO 900474A NO 306996 B1 NO306996 B1 NO 306996B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- ica
- protein
- antigen
- cells
- dna
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 29
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 18
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 11
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 abstract description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 30
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl chloride Chemical compound ClS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 OAHKWDDSKCRNFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DSFWJRNXMQDZDN-KQRQZKHZSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-6-[(1s,2r)-2-[(2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-6-[(1s,2r)-2-[(2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-carboxy-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydroxypropyl]oxan-2-yl]oxy-1,3-dihydroxypropyl]-2-carboxy-4-hydroxyoxan-2-yl]oxy-1,3-dihydroxypropyl]-2-[(2s Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@@H]([C@H](O)/C=C/CCCCCCCCCCCCC)NC(C)=O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)C(O)=O)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 DSFWJRNXMQDZDN-KQRQZKHZSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000591210 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 239000012741 Laemmli sample buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000001280 Prediabetic State Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102100034091 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000012880 independent component analysis Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 206010022498 insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 208000021255 pancreatic insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000003820 β-cell dysfunction Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører bukspyttkjerteløy-celleantigener for in vitro bruk som blir bundet med antistoffer i serum fra pasienter med insulinavhengig (type I) diabetes mellitus (IDDM). Oppfinnelsen vedrører spesielt proteiner og peptider som blir bundet til øy-celleantistoffer (ICA) og som blir fremstilt ved rekombinant DNA eller syntetiske fremgangsmåter. Oppfinnelsen vedrører også klonet DNA kodende for slike ICA-proteiner og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige som reagenser for immunoanalyse ved presymptomatisk diagnose av IDDM.
Akkumulerende bevis for cellulære og humorale unormaliteter assosiert med IDDM har ført til hypotesen om at sykdommen er en autoimmun forstyrrelse. Serumantistoffer rettet mot insulinproduserende beta-celler fra bukspyttkjerteløyer, er blitt påvist ved immunofluorescence, [G.F. Bottazzo, A. Florin-Christensen og D. Doniach; Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoimmune Polyendocrine Deficiencies, Lancet ii:1279-1283 (1974) og A.C. MacCuish.J. Jordan, C.J. Campbell, L.J.P. Duncan, og W.J. Irvine: Antibodies to Islet-cell in Insulin-dependent diabetics With Coexistent Autoimmune Disease, Lancet ii:1529-1533 (1974)]. Disse autoanti-stoffene blir observert i 70-80$ av nye diagnostiserte diabetes (NDD), men bare i 0,1-1$ i normale kontrollindivider [C.H. Brogren og A. Lernmark: Islet Cell Antibodies in Diabetes. Clin. Endocrinol. Metab. 11:409-430 (1982)], og G.F. Bottazzo, R. Pujol-Borrell og D. Doniach: Humoral and Cellular Immunity in Diabetes Mellitus. Clin. Immunol. Allergy 1:139-159 (1981)]. ICA'er er blitt akseptert som en forutseende faktor for IDDM. En oversikt om tilstedeværende kunnskap om ICA er tilveiebragt av A. Lernmark, Diabetic Medicine 4:285-292 (1987).
Konvensjonell ICA-analyse består av utsetting av bukspytt-kjerteldeler for serum, farving med et annet antistoff som enten bærer en fluorescerende [G.F.Bottazzo et al., supra] eller enzymmarkør [P.G. Colman, M. Tatkus.m A. Rabizadeh, C. Cahill, og G.S. Eisenbarth: Assay for Islett Cell Antibodies with Rat Pancreas and Peroxidase Protein A. Diabetes Care 11:367-368 (1988)], og observering under et mikroskop. En annen lignende metode omfatter en biotinavidin-sandwich og immunofluorescerende påvisning [T. Kobayashi, T. Sugimoto, T. Itoh, K. Kosaka, T. Tanaka, S. Suwa, K. Sato og K. Tsuju: The Prevalence of Islet Cell Antibodies in Japanese Insulin-dependent qand Non-insulin-dependent Diabetic Patients Studied by Indirect Immunofluorescence and by a New Method. Diabetes 35:335-340 (1986)]. Disse metodene er tidkrevende, arbeidskrevende, vanskelig å reprodusere og har begrenset følsomhet. "Utvikling av en mere hensiktsmessig immunoanalyse for ICA ville muliggjøre omfattende testing for epidemiologi og korrelasjon med IDDM, og bestemmelse av sykdommen med en screeningstest.
En hovedbegrensning i nåværende ICA-tester er den begrens-ende kunnskap og karakterisering av øy-celleantigener involvert. ICA kan ha lavt titer eller affinitet og er bare tilnærmelig med karakteriserte antigener. ICA-antigener som blir påvist ved immunofluorescence-test er av spesiell interesse, og disse antigenene kan omfatte: 1) øy-celleoverflatedeler [N.K. MacLaren, S.W. Hugng, og J. Fogh: Antibody to Cultured Human Insulinoma Cells in Insulin-dependent Diabetes. Lancet 1:997-1000 (1975), og A. Lernmark, Z. R. Freedman, C. Hofmann, A.H. Rubenstein, D.F. Steiner, R.L. Jackson, R.J. Winter og H.S. Traisman: Islet-cell-surface Antibodies in Juvenile Diabetes Mellitus. N. Engl. J. Med. 299:375-380 (1978)], 2) insulin [J.P. Palmer, CM. Asplin, P. Clemons, K. Lyen, 0. Tetpati, P.K. Raghu og T.L. Paquette: Insulin Antibodies in Insulin-dependent Diabetics Before Insulin Treatment. Science 222:1337-1339 (1983), og S. Srikanta, A.T. Ricker, D.K.McCulloch, J.S. Soeldner, G.S. Eisenbarth og J.P.Palmer: Autoimmunity to Insulin, Beta Cell Dysfunction, and Development of Insulin-dependent Diabetes Mellitus. Diabetes 35:139-142 (1986)], 3) et 64.000 dalton (64 kd) øy-protein med ukjent cellulær beliggenhet [S. Baekkeskov, J.H. Nielsen, B. Marner, T. Bilde, J. Ludvigsson, og A. Lernmark: Autoantibodies in Newly Diagnosed Diabetic Children Immunoprecipitate Human Pancreatic Islet Cell Proteins. Nature 298:167-169 (1982)] og 4) cytoplasmiske antigener [G.F. Bottazzo, A. Florin-Christensen, og D. Doniach: Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus With Autoimmune Polyendocrine Deficiencies. Lancet 2:1279-1283 (1974), A.C.MacCuish, J. Jordan, C.J. Campbell, L.J.P. Duncan, og W.J. Irvine: Antibodies to Islet-Cell in Insulin-Dependent Diabetics With Coexistent Autoimmune Disease. Lancet 2:1529-1533 (1974), R. Lendrum, G. Walker, og D.R. Gambli: Islet-Cell Antibodies in Juvenile Diabetes Mellitus of Recent Onset. Lancet 1:880-883 (1975), og W.J. Irvine, C.J. McCallum, R.S. Gray, G.J. G.J. Campbell, L.J.P. Duncan, J.W. Farquhar, H. Vaughan, og P.J. Morris: Pancreatic Islet Cell Antibodies in Diabetes Mellitus Correlated With The Duration and Type of Diabetes, Co-existent Autoimmune Disease, and HLA-type. Diabetes 26:138-147 (1977). 5) glykokonjugat [R.C. Nayak, M.A.K. Omar, A. Rabizadeh, S. Srikanta, og G.S. Eisenbarth, "Cytoplasmic" Islet Cell Antibodies: Evidence That the Target Antigen is a Sialoglyco-conjugate. Diabetes 34:617-619 (1985); P. Vardi, E.E. Dibella, T.J. Pasquarello, og S. Srikanta, Islet Cell Autoantibodies: Pathobiology and Clinical Applications. Diabetes Care 10:645-56 (1987); B.K.Gillard, J.W. Thomas, L.J. Neil og D.M. Marcus, Antibodies Against Ganglioside GT3 in the Sera of Patients with Type I Diabetes Mellitus. Journal of Immunology 142:3826-32 (1989)]. 64 kd-antigenet er blittkarakterisertmed hensyn på størrelse og isoelektrisk punkt ved immunopresipitasjon av radioaktivt merkede øy-proteiner, men det eksisterer ingen
informasjon om sekvensen. To rapporter viser en høy forekomst av antistoff som gjenkjenner dette proteinet i prediabetisk serum, samt nylig diagnostiserte diabetisk sera [S. Baekkeskov, M. Landin, J.K. Kristensen, S. Srikanta, G. Jan Bruining, R. Mandrup-Poulsen, C. de Beufort, J.S. Soeldner, G. Eisenbarth, F. Lindgren, G. Sundquist og A. Lernmark: Antibodies to a 64.000 MW Human Islet Cell Antigen Precede the Clinical Onset of Insulin-dependenst Diabetes. J.Clin. Invest. 79:926-934 (1987), og M. A. Atkinson, N.K. Maclaren, W.J. Riley, D.W. Sharp og L. Holmes: Mr. 64.000 Autoantibodies (64KA) Predict Insulin Dependent Diabetes. American Diabetes Assoc. 48th Annual Meeting (1988) Abstract nr. 391].
Noen andre molekylære arter er blittkarakterisert vedWestern blotting til å være "vanlige antigener" gjenkjent av serum fra diabetikere [D.G. Karounos, V. J. Virta, L.J. Neil, og J.W. Thomas: Analysis of Human and RINm5F Islet Cell Antigens. American Diabetes Assoc. Res. Symp. Woods Hole, MA. October 1987, Abstract nr. 120]. Disse antigenene har molekylvekter på 150 kd, 84 kd, 60 kd, 49 kd og 36 kd.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et isolert bukspyttkjerteløy-celle-(ICA)-antigen for in vitro bruk, kjennetegnet ved at det er relatert til insulin-avhengig diabetes mellitus (IDDM) og omfatter aminosyresekvensen som blir kodet av DNA-innskuddet til rekombinant kloningsvektor ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 eller 40706, eller et fragment av et slikt antigen som har en lengde på minst 3 aminosyrer og som kan binde et øy-celle-autoantistoff.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også ICA-proteiner og peptidfragmenter derav som blir kodet av klonede nukleinsyrer og er nyttige ved diagnostikk av insulinavhengig (Type I) diabetes mellitus (IDDM). Evnen som slike proteiner og peptider har til å bli bundet til det antistoffbindende setet på ICA, vedrører også en anvendelse ved binding eller blokkering av humant immunoglobulin, T-celler eller B-celler involvert i IDDM, inkludert sirkulerende immunoglobulin, T-celler og B-celler.
ICA-proteiner og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse blir tilveiebragt ved slike metoder som fullstendig, eller delvis, ekspresjon, eventuelt med påfølgende fragmentering, av nærværende klonede nukleinsyrer; og peptid eller polypep-tidsyntese basert på aminosyresekvensene bestemt ut fra nærværende klonede cDNA eller fra ICA-antigen-gener i full lengde, som kan bli bestemt eller isolert fra øy-cellenuk-leinsyrebibliotek ved hjelp av tilstedeværende komplementære klonede cDNA-sekvenser. Slike ICA-proteiner og peptider omfatter full-lengde-ICA-proteiner tilstede i, eller på, øy-celler og som blir uttrykt av det humane genet hvis mRNA i det minste delvis er komplementær med hele sekvensen til nærværende klonede cDNA. Også innbefattet i ICA-proteinene og peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, er proteiner uttrykt av rekombinante kloningsvektorer omfattende foreliggende cDNA-innskudd og fragmenter av slike proteiner tilveiebragt ved delvis ekspresjon eller ved påfølgende fragmentering, som med restriksjonsnukleaser. ICA-proteiner og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter også peptider tilveiebragt ved proteinsyntese, som de som er på 3 aminosyrer i lengde eller lenger, som representerer ICA-epitoper eller analoger eller derivater derav.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en DNA-sekvens som er kjennetegnet ved at den koder for et protein eller peptid som nevnt over. Videre tilveiebringer oppfinnelsen en kloningsvektor som er kjennetegnet ved at den inneholder - og kan uttrykke - et innskudd som koder for et protein eller et peptid som tidligere nevnt. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en dyrkbar celle som kjennetegnes ved at den inneholder - og kan uttrykke - en rekombinant kloningsvektor som tidligere nevnt.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antall betydelige fordeler. Molekylær kloning av ICA-antigener muliggjør fremstilling av store og reproduserbare mengder materiale for anvendelse i forskning, diagnostikk og behandling av IDDM, samt muligheten av å studere biologiske mekanismer som er involvert i øy-celledestruksjon og tilsynekomst av ICA. Tilgjengeligheten av store mengder rent antigen muliggjør utvikling av meget følsomme og spesifikke immunoanalyser som kan bli anvendt for å screene den generelle populasjonen for presymptomatisk IDDM eller en predisposisjon til utvikling av
IDDM.
Figurene 1-5, 14 og 15 er reaktive profiler av ATCC-deponerte ICA-kloner fremstilt i henhold til foreliggende oppfinnelse med diabetisk serum og normalt serum under betingelser beskrevet i eksemplene. Fig. 6 er en kontrollprofil ved anvendelse av kloningsfagen uten rekombinant innskudd. Fig. 7 og 16 oppsummerer serumprofiler av ICA-kloner som viser verdier for reaktivitet tilegnet ved visuell vurdering av profilene i fig. 1-5 og 14-15, respektivt. Fig. 8-13, 17 og 18 er DNA og inskutte proteinsekvenser av bestemte ICA-kloner. Fig. 19 viser resultatene av immunopresipitasjon av en av ICA-klonene med serum fra diabetikere og normalt serum.
Betegnelsen "ICA-antigener" skal heri referere til proteiner og peptider tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse, til tross for at det er å bemerke at i noen tilfeller vil peptidformer ikke være "antigener" i dets fastslåtte betydning, dvs. de vil være hapteniske på grunn av at de krever tilkobling til en konvensjonell makromolekylær bærer for å stimulere produksjonen av antistoffer i et vertsdyr.
"Klonede nukleinsyrer", "klonede ICA-antigensekvenser", "cDNA-innskudd" og lignende betegnelser, referer til innskudd i deponerte rekombinante fag ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 og 40706, og også andre nuklein-syresekvenser av full-lengdegener, eller fragmenter av slike sekvenser, omfattende slike deponerte sekvenser. Det er å bemerke at én eller flere full-lengde-ICA-antigener er kjennetegnet ved homologi med ovennevnte deponerte cDNA-innskudd, det er derimot mulig at to eller flere slike cDNA-innskudd korresponderer med et enkelt ICA-antigen. Innskuddet i ATCC 40703 ser ut til for eksempel å omfatte innskuddene for både ATCC 40550 og ATCC 40554, og disse tre innskuddene kan alle tilsvare forskjellige og/eller overlappende deler av et enkelt ICA-antigen.
Fremstilling av klonede ICA- antigensekvenser
Klonede ICA-antigensekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse, blir generelt tilveiebragt ved uttrykking av humane gener i et egnet rekombinant kloningssystem, f.eks. bakteriofag, og probing av det resulterende genbiblioteket med IDDM-serum for å selektere antigener som blir gjenkjent av ICA-antistoffer. Rekombinante antigener blir deretter screenet med et panel diabetisk serum og normalt serum for å bestemme sykdomsspesi-fisiteten til de identifiserte klonene.
De bestemte deponerte klonene ble spesielt tilveiebragt ved følgende fremgangsmåte (ytterligere detaljer finnes i eksemplene nedenfor). Et humant cDNA-bibliotek ble dannet ved ekstrahering av RNA fra rensede humane øyer. Dette RNA ble separert ved kromatografi for å separere poly-A mRNA fra andre RNA så som ribsomalt RNA og fragmenter av degradert RNA. Separert mRNA ble revers transkribert med et kommersielt tilgjengelig cDNA-kit, ligert til EcoRI DNA-linkere og ligert inn i lambda gt-11 armer for in vitro-pakking. Ligert lambda ble pakket ved anvendelse av et kommersielt kit og deretter påført på et bakterielt teppe i et plateformat. Fagbiblioteket ble screenet med antistoffer fra autoimmune pasienter med type I diabetes. Bakterier infisert med fag, ble spredt på agaroseskåler og rekombinant proteinekspresjon ble indusert kjemisk. Protein ble avsatt på filter som deretter ble probet med serum. Plaque som så ut til å være positive, ble isolert fra agaroseskålene og renset gjennom to isolasjonsrunder. Etter koloningen ble gt-ll-fag infisert inn i en bakteriell vert for ekspresjon i stor skala. Spesifisi-teten til proteinene uttrykt av klonet cDNA ble vurdert ved Western blotting av bakterielle ekstrakter inneholdende det klonede humane proteinet. Preparative polyakrylamidgeler ble kjørt, og elektroblottet på membraner, membranene ble kuttet i strimler, og deretter reagert med en serie normale sera og serum fra diabetikere. Kloner som dannet proteiner som bare reagerte - eller som hovedsakelig reagerte - med serum fra diabetikere, ble valgt.
Rekombinante kloningsvektorer
og subkloning
Som kjent kan cDNA-transkripter ifølge foreliggende oppfinnelse, så som cDNA-bibliotek eller cDNA-innskudd spaltet ut fra en kloningsvektor, bli inkorporert inn i forskjellige rekombinante kloningsvektorer for ampiifikasjon av sekvensen av interesse, og for ekspresjon av ICA-antigener av interesse. En rekombinant kloningsvektor er et biokjemisk molekyl eller struktur, f.eks. DNA, som muliggjør innskudd av polynukleotidsekvenser og replikasjon av innskutte polynukleotidsekvenser når vektoren blir inkorporert inn i en vertscelle. En ekspresjonsvektor omfatter i tillegg evnen til uttrykking av proteinet, kodet av det innskutte polynuk-leotidet. I en ekspresjonsvektor er den innskutte ICA-antigensekvensen operabelt bundet til en egnet kontrollsek-vens som kan tilveiebringe ekspresjon av ICA-antigen i en egnet vert. Den involverte kontrollsekvensen varierer i henhold til verten, og transformasjonsmetoden som blir valgt. Disse forhold er kjent for fagmannen.
Egnede rekombinante kloningsvektorer omfatter plasmider, virus og bakteriofag, og integrerbare fragmenter av DNA (dvs. fragmenter som er integrerbare inn i vertsgenomet ved rekombinasjon). Ekspresjonsvektorer er spesielt foretrukket og kan eksemplifiseres uten begrensning, ved bakteriell pEMBL, pMMB og pUK, gjær pAAH5, pYE4 og pAB112, pattedyr pRSV, vaccinia-avledede vektorer, papillomavledede vektorer, retrovirale vektorer og skyttelvektorer så som pCD8. For en oversikt, se D.M. Glover, DNA Cloning;: A Practical Approach
(1985) IRL Press Ltd. Egnede vertsceller omfatter prokaryo-ter, gjær og høyere eukaryote celler omfattende pattedyr-celler .
Subkloning av cDNA-innskudd kan omfatte utspaltning av innskuddet for ligering inn i en annen kloningsvektor. Innskuddet kan bli spaltet ut ved hjelp av restriksjons-enzymet, korresponderende med linkerne anvendt i det opprinnelige innskuddet eller ved anvendelse av restriksjons-enzymer, valgt fra et restriksjonskart av innskuddet. Utspaltet cDNA kan bli satt inn i en annen egnet vektor for sekvensering, amplifikasjon eller ekspresjon. Dersom terminale restriksjonsseter i den opprinnelige kloningsvektoren er blitt ødelagt, kan andre enzymer anvendes for å gjenvinne innskuddet, og resulterende flankerende regioner fra kloningsvektoren kan på konvensjonell måte bli deletert.
Fullengdegen- kloning
Fragmenter av cDNA-innskuddene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt for å isolere full-lengde-cDNA eller genomiske DNA-kloner fra hensiktsmessige bibliotek ved standard fremgangsmåter. Målbiblioteket blir spredd på skåler, latt vokse, overført til filter og reagert med DNA-prober. Slike DNA-prober blir dannet fra restriksjonsfrag-menter av cDNA-innskuddene ved slike metoder som endemerking, nick-translasjon, tilfeldig primet transkripsjon eller fotokjemisk. 01igonukleotider kan bli syntetisert, merket og anvendt som hybridisasjonsprober. RNA-prober kan også bli dannet fra subklonet cDNA ved transkripsjon fra hensiktsmessige templater.
Rekombinante kloningsvektorer, f.eks. fag eller plasmider, som reagerer med partielle cDNA-kloner, blir rescreenet og deretter kartlagt ved restriksjon. Lovende kloner blir deretter sekvensert for å bekrefte hybridisasjon av opprinnelige prober og for å tilveiebringe utvidet sekvensinformasjon på det større fragmentet. Dersom full-lengdekloner ikke blir tilveiebragt i denne prosedyren, kan hele sekvensen av nukleinsyren kodende for det humane genet bli satt sammen fra overlappende sekvenser av klonede fragmenter.
En alternativ metode for å tilveiebringe lengre fragmenter og eventuelt full-lengdekloner, anvender antistoff tilveiebragt mot ICA-antigener uttrykt av partielle kloner. Etter identifisering av et antigen av interesse, kan det anvendes som et immunogen for å tilveiebringe monoklonale eller polyklonale antistoffer med høyere titer og affinitet. Slike antistoffer vil muliggjøre deteksjon av lengere cDNA-kloner og cDNA-kloner tilstede i mindre mengder i biblioteket.
Antigen og peptidsyntese
ICA-antigener, som definert heri, kan bli fremstilt på forskjellige måter fra klonene og sekvensinformasjonen tilveiebragt i foreliggende oppfinnelse. Man kan uttrykke proteinene fra ICA-antigenkloner tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse, spesielt fra deponerte kloner. Slike uttrykte proteiner eller fragmenter eller spaltnings-produkter derav, kan bli anvendt som antigener for binding til øy-celleantistoffer. Direkte anvendelse av bakterielle ekspresjonsekstrakter kan derimot i noen tilfeller ikke være mulig på grunn av at humant sera normalt reagerer uspesifikt med E.coli-proteiner. I slike tilfeller kan de uttrykte ICA-antigenene bli isolert ved konvensjonelle teknikker, så som elektroforetisk separasjon etterfulgt av immobilisasjon på membraner (Western blotting), eller ved kolonnekromatografi eller affinitetsrensing (f.eks. anti-beta-galaktoseidase-affinitetsharpikskromatografi eller andre konvensjonelle biokjemiske måter, f.eks. salt eller temperaturpresipita-sjon).
Alternativt kan peptidfragmenter bli syntetisert ved velkjente metoder fra aminosyresekvenser avledet fra eksperimentelt bestemte DNA-sekvenser fra ICA-antigenkloner. Overlappende peptider kan bli syntetisert og testet for reaktivitet med ICA-sera. Når reaktive peptider blir funnet, kan mindre peptider bli fremstilt for å kartlegge den minste reagerende enheten, dvs. epitopen.
Fremgangsmåter
En viktig anvendelse av ICA-antigener tilveiebragt i foreliggende oppfinnelse, er diagnostikk og bestemmelse av IDDM. I en slik fremgangsmåte blir en blodprøve, vanligvis en serumprøve, reagert med en valgt eller en serie ICA-antigener og immunoreaktiviteten blir bestemt ved en hvilken som helst konvensjonell teknikk. Det er videre å bemerke at immunoreak-tivitetsprofilen med forskjellige ICA-antigener kan tilveiebringe diagnostisk signifikant informasjon vedrørende sykdommens karakter, f.eks. subtyper, sykdomstilstand, beregning av forløpet til sykdommen, effektiviteten av terapi, f.eks. immunterapi o.l.
En ytterligere anvendelse av foreliggende ICA-antigener in vitro, er ved identifikasjon, merking eller spesifikk destruksjon av autoreaktive B-celler in vitro. Dersom autoantistoffer har en skadelig virkning i IDDM, kan anti-B-celleterapi forsinke eller forhindre forløpet av sykdommen fra prediabetes til klinisk IDDM.
En annen anvendelse av foreliggende ICA-antigener er ved identifikasjon av øy-reaktivitetscellepopulasjoner. ICA-antigener kan virke som stimulerende antigener for T-cellekultur, muliggjøring av betraktelig forbedret T- cellekloning, identifikasjon og vekst. Det er overveiet at ICA T-celledeteksjon kan være signifikant ved diagnostikk av prediabetisk tilstand, og at registrering av nivået av autoreaktive T-celler kan gi en indikasjon på forløpet av sykdommen og anvendelighet ved immunmodulerende terapi. Videre kan dannelsen av ICA T-cellekulturer tilveiebringe en in vitro-modell for konstruering av diabetisk terapi. Det er videre betraktet at T-celleimmunisering kan stoppe eller forsinke autoimmunitet ved dannelse av en humoral respons overfor selvdestruerende elementer.
Evnen som ICA-antigener har til å bli bundet til humant ICA-immunoglobulin og T-celler kan bli anvendt for å blokkere ICA til øy-celler og øy-cellekomponenter in vivo, og antas derfor å tilveiebringe en direkte terapeutisk virkning.
Foreliggende oppfinnelse vil nå bli illustrert ved følgende eksempler.
EKSEMPLER
1. cDNA- bibliotek
Langerhanske øyer ble renset ved dr. Paul Lacy og David Scharp ved Washington Univ., St. Louis, MO, USA, ifølge en publisert prosedyre [C. Ricordi, P.E. Lacy, E.H. Finke, B.J. Olack, og D.W. Scharp: An Automated Method for Isolation of Human Pancreatic Islets. Diabetes 37:413-420 (1988)]. I korthet, ble human bukspyttkjertel dynket med kollagenase og deretter malt. Ficoll gradientsentrifugering ble anvendt for å isolere øyene, som deretter ble dyrket i 1 uke ved romtemperatur. Øyene ble frosset og levert.
Ved ankomst ble øyene tint, slått sammen og vasket. RNA ble ekstrahert ved anvendelse av quanidiniumtiocyanat og sellektivt presipitert med litiumklorid [G. Cathala, J.F. Savouret, B. Mewndez, B.L. West, M. Karin, J.A. Matial og J.D. Baxter: A Method for Isolation of Intact, Transtational-ly Active Ribonucleic Acid. DNA 2:329-335 (1983)]. Omtrent 770 jjg total RNA ble tilveiebragt fra hver ml sentrifugerte øyer. Messenger-RNA ble renset ved anvendelse av Pharmacia 01igo(dT)-cellulose type 7 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, USA), ifølge prosedyren til Maniatis et al., [T. Maniatis, E.F. Fritsel og J. Sambrook: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory s. 197-198]. Omtrent 30 ug RNA ble tilveiebragt etter kromatografi. In vitro translasjon ved anvendelse av et BRL-kit nr. 8110 (Bethesda Research Laboratory, Gaithersburg, MD, USA), og 35s_me-t^on^n ViSte at et stort spekter av molekylvektpro-teiner ble produsert.
Et BRL nr. 8267SA-kit ble anvendt for cDNA-syntese. Ti (10) ug poly-A<+>RNA ble anvendt i reaksjonen. Endende ble behand-let med T4-DNA-polymerase og cDNA ble metylert med EcoRI metylase og S-adenosylmetionin, og ligert til EcoRI-linkere. cDNA ble spaltet med EcoRI og kjørt på en Biogel A15M-kolonne for å separere linkerne og fragmentene.
cDNA ble ligert inn i lambda gt-ll-armer, og pakket med et Stratagene Gigapack Plus-kit (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA, USA). Et bibliotek med omtrent 8,5 x IO<5>kloner inneholdende innskudd, ble tilveiebragt (målt med 5-brom-4-klor-3-indolyl-8-D-galaktopyranosid) og amplifisert på E. coli Y1090.
2. Serum
Serum fra nylig diagnostiserte diabetestilfeller ble tilveiebragt fra dr. William Rily ved University of Florida, Gainsville, FL, USA og dr. Alan Drash ved Children's Hospital of Pittsburgh, PA, USA. Normalt (ikke-diabetisk) serum ble samlet fra individer i laboratoriet. Serum ble fleradsorbert med filter som ble fremstilt, enten ved (a) lysering av lambda-infisert E. coli med kloroform og nedsenking av nitrocellulosefUtrene i dette lysatet, eller (b) preparering av filtrene ved belegging av filtre dynket med isopropyl-P-tio-galaktopyranosid (IPTG) på lambda-infisert E. coli i et plateformat, vesentlig på samme måte som screening av biblioteket. Serum ble fortynnet 1/20-1/200 i blotto-oppløsning (5$ karnasjon ikke-fet tørrmelk, 10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,05$ Tween-20, og 0,05$ natriumazid) etter råseparering som angitt nedenfor.
3. Screening
Screeningsprosedyren er basert på standardprotokoller (T.V. Huynh, R.A. Young og R.W. Davis: Constructing and Screening cDNA Libraries in Fgt 10 and Gft 11 in DNA Cloning. D.M. Glover ed. (1985) IRL Press s. 490-78). Filter ble preparert ved utplating av omtrent 50.000 plaque-dannende enheter (pfu) av biblioteket på hver av ti 150 mm agaroseskåler. Etter vekst ved 42° C i omtrent 3 timer, ble filtere (nitrocellulose) inneholdende IPTG lagt opp på skålene og dyrk-ningen fortsatte ved 37° C i enten 3-4 timer eller overnatt. Filtrene ble blokkert med en blotto-oppløsning og lagret ved 4" C.
Alle antistoffreaksjonene med filtrene ble først utført ved romtemperatur ved 3 timer. I senere eksperimenter ble inkubasjoner av serum utført overnatt ved 4°C i blotto-oppløsning uten Tween-20, mens sekundære antistoffreaksjoner ble utført ved romtemperatur i 1,5 timer. Alle inkubasjonene og vask ble utført på plattformristere med forsiktig rotasjon.
Biblioteket ble flere ganger screenet med humane antistoff-prober. I det første tilfellet ble antistoff renset fra serum fra diabetikere ved HPLC. I det andre og tredje tilfellet ble serum presipitert med 50$ ammoniumsulfat og dialysert. I de første og tredje screeningene ble en blanding av to sera anvendt ved alle rensningsomgangene. I den andre screeningen ble en blanding av 20 sera fra diabetikere anvendt for første rensning. I en ytterligere screening ble 22 sera slått sammen, presipitert med ammoniumsulfat og dialysert, og den endelige arbeidsfortynningen av hvert serum var 1/500 i blotto uten Tween 20.
Etter inkubasjon i sera fra diabetikere, ble filtrene vasket 5-10 minutter hver i Tris-buffret saltvann (TBS), TBS med 0,05$ Tween-20, og deretter i TBS. Humant antistoff bundet til filtrene ble detektert ved reaksjon med kaninantihumant IgG konjugert til alkalisk fosfatase (1/500 i blotto, Dakopatts antibody D-336 - DAKO Corp., Santa Barbara, CA, USA). Filtrene ble vasket i TBS/Tween-20, TBS, og deretter deteksjonsbuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2, anbefalt av BRL for anvendelse i deres DNA-deteksjons-kit, nr. 8239SA). Kromogene substrater (nitroblå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat) ble tilsatt og reaksjonen ble beskyttet for lys. Etter farveutvikling ble filtrene vasket i vann, deretter i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA (TE) og tørket. Best observasjon av plaquene oppnås når filtrene enda er våte.
Positive plaque ble funnet på de opprinnelige skålene ved oppstilling med filtrene. For primære screeninger ble en klump inneholdende en positiv plaque, fjernet ved anvendelse av den butte enden av en steril Pasteur pipette. For påfølgende screeninger hvor individuelle plaque kunne sjeldnes, ble tuppen av pipetten anvendt. Plaque ble eluert inn i plaque-lagringsbuffer (Maniatis et al., ovenfor) og eluert i minst flere timer.
Ovennevnte screeningsmetoder produserte de spesifikke deponerte ICA-klonene beskrevet heri, med unntagelse av ICA-12,3 som ble isolert som følger.
Omtrent 10^ plaque-dannende enheter av fagbiblioteket ble screenet ved DNA-hybridisasjon for tilstedeværelse av sekvenshomologi med ICA-12 cDNA. Fag-plaquene distribuert på over 20 agarskåler, ble replikert på nylonfiltre, og fag-DNA ble denaturert og immobilisert for hybridisasjon ved den konvensjonelle prosedyren til Benton og Davis (1977). Science 196:180., Hybridisasjonsproben var en agarose gel-renset prøve av klonet ICA-12 cDNA, separert fra dets plasmid-vektor ved EcoRI-kutting. cDNA-segmentet ble merket med<32>p vecj tilfeldig primer-merkingsmetoden (Feinberg og Vogelstein
(1984) Anal. Biochem. 137:266). Hybridisering av proben til nylonfUtrene ble utført ifølge Berent et al. (1985) BioTech. 3:208. Fag-plaque identifisert å inneholde DNA som var homolog med ICA-12-proben, ble plukket fra hovedskålene, og f agen ble replikert for en annen runde screening ved hybridisering. Individuelle plaque positive for ICA-12-sekvenser, ble deretterkarakterisertmed hensyn på cDNA-innskudd. Klonen ICA-12,3 ble funnet ved DNA-sekvensanalyse og inneholde hele proteinkodende sekvensen av mRNA delvis representert i ICA-12.
4. Ekspres. i on
Proteiner uttrykt av individuelle kloner, ble analysert ved uttrykking av klonene i E.coli-verter. Innledende ekspresjon med kloner identifisert som ICA-12 og ICA-13 ble utført med lysogener dannet med kloner på standard måte (Huynh, et al.). Påfølgende ekspresjoner ble utført ved infiserende ekspresjon i E. coli CAG-456 [M. Snyder, S. Elledge, D. Sweetser, R.A. Young og R.W. Davis: Fgt-11: Gene isolation with Antibody Probes and Other Applications, Meth. Enzymology 154:107-128 (1987)]. Celler ble høstet og lysert ved resuspensjon i Laemmli prøvebuffer [U.K. Laemmli, Nature 227:680 (1970)]. Bedre elektroforeseresultater ble tilveiebragt når prøvene ble sonikert for å redusere størrelsen av DNA og redusere viskositeten.
Proteingelelektroforese og semitørr elektrooverføring på enten nitrocellulose (Schleicher og Schuell) eller Immobilon (Millipore Company, Bedford, MA, USA) ble utført. Geler ble farvet med Coomassie Blue og filtrene ble påvist ved immunoreaksjon med samme sera anvendt for å screene biblioteket beskrevet ovenfor.
5. Klon- analyse
For å vurdere nyttigheten av individuelle kloner for diagnostikk av IDDM, ble hvert klon testet for reaktivitet med et panel av serum fra diabetikere og normalt serum. Dette ble utført ved å reagere hvert serum med en Western blot-strimmel fra hver klon. Preparativ gelelektroforese ble etterfulgt av semitørr elektrooverføring av proteinene til filtrene. Identiske 3 mm strimler ble kuttet fra filtrene og utsatt for forskjellige sera. Lokalisasjon av antigenbånd ble utført med referanse til analytiske Western blot og strimler reagert med anti-beta-galaktosidaseantistoff (1/2000 mono-klonalt antistoff). Antistoffinkubasjon og deteksjon med sekundært antistoff, er beskrevet ovenfor.
Reaktivitetsprofilene til klonene identifisert som ICA-12, ICA-13, ICA-208, ICA-302, ICA-313, ICA-505 og ICA-525 er vist i fig. 1-5, 14 og 15. Identiske filterstrimler ble kuttet fra preparativ elektro-overføring, og reagert med sera fra diabetikere og normalt sera (for ICA-12, 13, 208, 302 og 3,13, ble strimlene reagert med 20 sera fra diabetikere og 10 normale sera; mens 14 sera fra diabetikere og 6 normale sera ble anvendt for ICA-505 og 525). En kontrollprofil ved anvendelse av vektor (lambda gt-11) uten DNA-innskudd, er vist i fig. 6.
Filterstrimler ble også vurdert ifølge intensitet, 1 = svak reaktivitet, 2, 3 og 4 = veldig sterk reaktivitet. Oppsum-meringer av vurderinger for reaktivitet er angitt i figurene 7 og 16. I fig. 7 er sera 21-30 med forstavelsen "c" normalt kontrollsera, mens sera fra diabetikere er presentert med deres kildeidentifikasjonsnummer. I fig. 16 er sera 15-20 med "MRC" forstavelsen normalt kontrollsera, mens sera fra diabetikere igjen er presentert med kildeidentifikasjonstall. I begge figurer representerer tallene angitt under klonover-skriftene styrken på immunoreaktiviteten bestemt ved visuell tolkning.
Noen kloner identifisert i den første screeningen, ble funnet å ikke reagere i Western blot-formatet. For å teste serum-reaktiviteten til disse klonene, ble lambda gt-11 fag uttrykt i E. coli CAG456 som vist og antigenet ble ekstrahert ved behandling av bakteriene med 4 mg/ml lysozym (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 25 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, 50 mM glukose og 2 mM fenylmetylsulfonylklorid (PMSF) i 5 minutter ved romtemperatur. Celler ble pelletert ved 4°C og resuspendert i iskald buffer (500 mM natriumklorid, 1% NP-40, 50 mM Tris, pH 8, 1 mg/ml aprotinin (Sigma), 2 mM PMSF, 2 ug/ml cymostatin (Sigma), 2 jjg/ml Antipain (Sigma) og 2 ug/ml pepstatin. Ekstraksjon av antigen foregikk i 30 minutter på is, og oppløsningen ble sonikert. Prøver ble spunnet i en Eppendorf mikrofuge i 5 minutter ved 4°C og supernatanter ble anvendt for immunopresipitasjon.
Immunreaksjoner bestod av: 15 ul vaskebuffer (50 mM Tris, 150 mM natriumklorid, 1$ NP-40, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 2,5 ul humant serum og 10 ul ekstrakt. Reaksjonene fikk stå overnatt. Antigen-antistoffkomplekser ble isolert med 20 ul av en 50$ oppslemming av protein-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) i 1 time på is. Harpiksen ble vasket seks ganger med 500 pl vaskebuffer og én gang med vann. Prøvebuffer for PAGE ble tilsatt, og prøvene ble kokt i 5 minutter, sentrifugert i 5 minutter og kjørt på 8$ geler. Immunoblotting ble utført og blottene reagert med anti-beta-galaktosidaseantistoff
(1/1000 fortynning av Sigma nr. G4644 i blotto-oppløsning)
etterfulgt av antimuse-Ig koblet til alkalisk fosfatase (DAK0 nr. D314) og utvikling i farvestoffer. Resultatene er vist i fig. 19 for et ekstrakt av ICA-512. Pilene angir posisjonen til rekombinant antigen.
DNA-innskuddsstørrelsen til de forskjellige klonene ble bestemt ved å dyrke dem enten i et platelysat eller vaes-kelysatformat (Maniatis, et al., ovenfor). Lambda-DNA ble ekstrahert og kuttet med EcoRI, og analysert for størrelse ved agarosegelelektroforese.
Klonene identifisert ovenfor som hovedsakelig reagerte med sera fra diabetikere, er blitt deponert til American Type Culture Collection, Rockwille, MD, USA. Deponeringsmimrene og bestemt innskuddsstørrelse er vist i tabell 1 nedenfor.
DNA-innskudd ble overført til en Stratagen Bluescript-vektor. Sekvensering ble utført ved standard teknikker ved anvendelse av T7-sekvenseringskitet sammen med Stratagene Exo III/Mung-bønnenukleasekitet for dannelse av overlappende delesjons-serier av plasmidene.
Tilgjengelig sekvensinformasjon av åtte av ni ovennevnte kloner er angitt i figurene 8-13, 17 og 18. Sekvensen er fullstendig for ICA-12, 302, 313, 208, 505, 12,3, mens bare en del av sekvensen er tilgjengelig for ICA-13 og 525. DNA-sekvensene er eksperimentelt avledet som beskrevet ovenfor. Alle tre mulige leserammer i begge orienteringer ble undersøkt for proteinkodende evne, dvs. lang, åpen leseramme. De mest sannsynlige proteinsekvensene for hver klon er presentert med store bokstaver under DNA-sekvensen (med unntagelse for ICA-505 hvor den tilgjengelige informasjonen ikke muliggjør tilveiebringing av leserammen kodende for proteinantigenet).
Claims (9)
1.
Isolert bukspyttkjertel øy-celle-(ICA)-antlgen for in vitro bruk,karakterisert vedat det er relatert til insulin-avhengig diabetes mellitus (IDDM) og omfatter aminosyresekvensen som blir kodet av DNA-innskuddet til rekombinant kloningsvektor ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 eller 40706, eller et fragment av et slikt antigen som har en lengde på minst 3 aminosyrer og som kan binde et øy-celle-autoantistoff.
2.
Isolert protein ifølge krav 1,karakterisertved at det er et full-lengdeprotein uttrykt av det humane genet hvor mRNA er komplementær med den fullstendige sekvensen til DNA-innskuddet til den rekombinante kloningsvektoren ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 eller 40706, eller et fragment av et slikt antigen som har en lengde på minst 3 aminosyrer og som kan binde et øy-celle-autoantistoff.
3.
Isolert protein eller peptid ifølge krav 1,karakterisert vedat aminosyresekvensen blir kodet av DNA-innskuddet til rekombinant kloningsvektor ATCC 40550, 40551, 40552, 40553, 40554, 40703, 40704, 40705 eller 40706, eller et fragment av et slikt antigen som har en lengde på minst 3 aminosyrer og som kan binde et øy-celle-autoantistoff.
4.
Isolert protein eller peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3,karakterisert vedat det blir oppnådd ved ekspresjon av en rekombinant DNA-vektor som inneholder et innskudd kodende for et slikt protein eller peptid, eller ved peptidsyntese.
5 .
Anvendelse av ICA-antigenet Ifølge kravene 1-4 for in vitro diagnostisering av insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) i en pasient, ved at en blodprøve oppnådd fra en slik pasient kontaktes med et antigenreagens som omfatter et protein eller peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, og bindingen av antistoffet fra pasientens blodprøve til antigenereagenset blir bestemt.
6.
Isolert DNA-sekvens,karakterisert vedat den koder for et protein eller peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.
7.
Rekombinant kloningsvektor,karakterisertved at den inneholder og kan uttrykke et innskudd som koder for et protein eller et peptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3.
8.
Dyrkbar celle,karakterisert vedat den inneholder og kan uttrykke en rekombinant kloningsvektor ifølge krav 7.
9.
Anvendelse av proteinet ifølge kravene 1-4 for detektering av tilstedeværelse av T-celler eller B-celler som er involvert i insulinavhengig diabetes mellitus i en human blodprøve, ved at blodprøven kontaktes med proteinet eller peptidet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, og bindingen mellom et slikt protein eller peptid og T-celler eller B-celler fra blodprøven, bestemmes.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31254389A | 1989-02-17 | 1989-02-17 | |
| US44170389A | 1989-12-04 | 1989-12-04 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO900474D0 NO900474D0 (no) | 1990-02-01 |
| NO900474L NO900474L (no) | 1990-08-20 |
| NO306996B1 true NO306996B1 (no) | 2000-01-24 |
Family
ID=26978437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO900474A NO306996B1 (no) | 1989-02-17 | 1990-02-01 | Isolert bukspyttkjerteloey-celle-(ICA)-antigen for in vitro- bruk |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0383129B1 (no) |
| JP (1) | JP2858467B2 (no) |
| AT (1) | ATE122394T1 (no) |
| AU (1) | AU626636B2 (no) |
| CA (1) | CA2010275C (no) |
| DE (1) | DE69019190T2 (no) |
| DK (1) | DK0383129T3 (no) |
| ES (1) | ES2072928T3 (no) |
| FI (1) | FI103730B1 (no) |
| GR (1) | GR3017019T3 (no) |
| IE (1) | IE66997B1 (no) |
| IL (1) | IL93397A (no) |
| NO (1) | NO306996B1 (no) |
| PT (1) | PT93166B (no) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001360A (en) * | 1988-12-13 | 1999-12-14 | University Of Florida | Method and compositions for early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
| US5645998A (en) | 1988-12-13 | 1997-07-08 | University Of Florida Research Foundation | Methods and compositions for the early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
| JPH02200700A (ja) * | 1989-01-30 | 1990-08-08 | Shionogi & Co Ltd | 新規ｒｅｇ蛋白質 |
| US5175085A (en) * | 1990-02-20 | 1992-12-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for diagnosing autoimmune insulin dependent diabetes mellitus |
| US5744327A (en) * | 1990-02-20 | 1998-04-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing insulin in response to non-glucose secretagogues |
| US5427940A (en) * | 1991-06-03 | 1995-06-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Engineered cells producing insulin in response to glucose |
| JP2727377B2 (ja) | 1990-09-07 | 1998-03-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 糖尿病自己抗体の検出方法 |
| US5998366A (en) * | 1990-09-21 | 1999-12-07 | The Regents Of The University Of California | Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders |
| US5674978A (en) * | 1990-09-21 | 1997-10-07 | The Regents Of The University Of California | Peptides derived from glutamic acid decarboxylase |
| US6682906B1 (en) | 1990-09-21 | 2004-01-27 | The Regents Of The University Of California | Cloned glutamic acid decarboxylase |
| WO1992006105A1 (en) * | 1990-10-02 | 1992-04-16 | Trigen Incorporated | Antibodies and methods for diagnosis and treatment of diabetes |
| AU671589B2 (en) * | 1991-05-15 | 1996-09-05 | Board Of Regents Of The University Of Washington, The | Cloning and expression of human islet glutamic acid decarboxylase autoantigen |
| US5792656A (en) * | 1991-06-03 | 1998-08-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods of preparing genetically engineered cells that produce insulin in response to glucose |
| JPH07508503A (ja) * | 1992-02-27 | 1995-09-21 | ザ・ボード・オブ・トラステイーズ・オブ・ザ・リランド・スタンフオード・ジユニア・ユニバーシテイ | 自己免疫性糖尿病のための初期抗原（ｅａｒｌｙ ａｎｔｉｇｅｎ） |
| US5200318A (en) * | 1992-05-13 | 1993-04-06 | Miles Inc. | Diagnosis of IDDM with a panel of immunoreagents |
| WO1996038479A1 (fr) * | 1995-05-30 | 1996-12-05 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede de diagnostic du diabete sucre insulino-dependant et kit de diagnostic |
| EP0929683A1 (en) | 1996-03-06 | 1999-07-21 | ZymoGenetics, Inc. | DIABETES MELLITUS 37 kD AUTOANTIGEN PROTEIN-TYROSINE PHOSPHATASE |
| AU7159898A (en) * | 1997-04-25 | 1998-11-24 | Genetics Institute Inc. | Secreted proteins and polynucleotides encoding them |
| CN110244051A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-17 | 许昌学院 | 一种用于糖尿病的多组分标记免疫检测系统 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE53862T1 (de) * | 1982-01-22 | 1990-06-15 | Cetus Corp | Verfahren zur charakterisierung von hla und die darin benutzten cdns-testmittel. |
| IL69686A (en) * | 1983-09-11 | 1988-03-31 | Yeda Res & Dev | Compositions containing cell membrane proteins and process for their preparation |
| DE3687064T2 (de) * | 1985-06-14 | 1993-11-11 | Bristol Myers Squibb Co | Verfahren zur identifizierung von mit gesteigerter diabetesgefahr assoziierten allelen. |
| CA1327162C (en) * | 1987-04-09 | 1994-02-22 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University (The) | Method for prophylactically treating an individual for an autoimmune disease |
| ATE130762T1 (de) * | 1987-06-24 | 1995-12-15 | Autoimmune Inc | Behandlung von autoimmun-erkrankungen durch orale verabreichung von autoantigenen. |
-
1990
- 1990-02-01 NO NO900474A patent/NO306996B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-02-03 DK DK90102179.0T patent/DK0383129T3/da active
- 1990-02-03 DE DE69019190T patent/DE69019190T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-03 AT AT90102179T patent/ATE122394T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-03 EP EP90102179A patent/EP0383129B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-03 ES ES90102179T patent/ES2072928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-14 IL IL93397A patent/IL93397A/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-02-15 PT PT93166A patent/PT93166B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-02-15 FI FI900759A patent/FI103730B1/fi active IP Right Grant
- 1990-02-16 CA CA002010275A patent/CA2010275C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-16 AU AU49883/90A patent/AU626636B2/en not_active Expired
- 1990-02-16 IE IE58990A patent/IE66997B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-02-16 JP JP2034016A patent/JP2858467B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-02 GR GR950402141T patent/GR3017019T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO900474D0 (no) | 1990-02-01 |
| IL93397A0 (en) | 1990-11-29 |
| DE69019190D1 (de) | 1995-06-14 |
| FI103730B (fi) | 1999-08-31 |
| EP0383129B1 (en) | 1995-05-10 |
| DK0383129T3 (da) | 1995-10-09 |
| JP2858467B2 (ja) | 1999-02-17 |
| JPH0347133A (ja) | 1991-02-28 |
| IE900589L (en) | 1990-08-17 |
| IE66997B1 (en) | 1996-02-21 |
| FI103730B1 (fi) | 1999-08-31 |
| NO900474L (no) | 1990-08-20 |
| ES2072928T3 (es) | 1995-08-01 |
| AU626636B2 (en) | 1992-08-06 |
| PT93166B (pt) | 1997-11-28 |
| EP0383129A3 (en) | 1991-07-31 |
| PT93166A (pt) | 1990-08-31 |
| CA2010275A1 (en) | 1990-08-17 |
| IL93397A (en) | 1997-06-10 |
| ATE122394T1 (de) | 1995-05-15 |
| FI900759A0 (fi) | 1990-02-15 |
| GR3017019T3 (en) | 1995-11-30 |
| DE69019190T2 (de) | 1995-09-14 |
| EP0383129A2 (en) | 1990-08-22 |
| CA2010275C (en) | 2000-08-29 |
| AU4988390A (en) | 1990-08-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO306996B1 (no) | Isolert bukspyttkjerteloey-celle-(ICA)-antigen for in vitro- bruk | |
| US5541291A (en) | Methods and compositions useful in the diagnosis and treatment of autoimmune diseases | |
| JPH10327880A (ja) | ヒト・ナトリウム依存性リン酸輸送体（ｉｐｔ−１） | |
| JP2001527524A (ja) | ヒト乳房腫瘍特異性タンパク質 | |
| EP0448635A1 (en) | METHOD AND COMPOSITIONS FOR EARLY DETECTING TREATMENT OF INSULIN-DEPENDENT DIABETES MELLITUS (IDDM). | |
| US5840836A (en) | Pancreatic islet cell antigens obtained by molecular cloning | |
| AU661828B2 (en) | Methods and compositions for early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus | |
| US5762937A (en) | Methods and compositions for the early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus | |
| US5645998A (en) | Methods and compositions for the early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus | |
| CA2049921C (en) | Allergenic proteins from ragweed and uses therefor | |
| US6001360A (en) | Method and compositions for early detection and treatment of insulin dependent diabetes mellitus | |
| JPH05501952A (ja) | Ｔｓｈ受容体 | |
| US5208144A (en) | Method for detection of human dna containing the gene encoding low density lipoprotein receptor | |
| Bergman et al. | Biochemical characterization of a beta cell membrane fraction antigenic for autoreactive T cell clones | |
| US6627735B2 (en) | Islet cell antigen 1851 | |
| US5591831A (en) | Solubilization and purification of the active gastrin releasing peptide receptor | |
| US6811989B1 (en) | Pancreatic islet cell antigens obtained by molecular cloning | |
| Fan et al. | Purification and characterization of a recombinant human thyroid peroxidase expressed in insect cells | |
| Suk et al. | Identification of a novel human member of the DEAD box protein family | |
| CN100374864C (zh) | 使用βig-h3蛋白质的诊断试剂盒 | |
| JP2928176B2 (ja) | インシュリン依存性真性糖尿病処置組成物 | |
| Demotz et al. | Studies on the Nature of Physiologically Processed Antigen | |
| JPH1132783A (ja) | Ｈｆｉｚｇ５３ポリヌクレオチドおよびポリペプチド | |
| ROONEY | MOLECULAR STUDIES OF HUMAN SCHWANGERSCHAFTSPROTEIN 1 (SP (1))(PREGNANCY PROTEIN, PLACENTAL GLYCOPROTEIN) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |