JPH07508503A - 自己免疫性糖尿病のための初期抗原（ｅａｒｌｙ ａｎｔｉｇｅｎ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 自己免疫性糖尿病のだめの初期抗原（ｅａｒｌｙ　ａｎｔｉｇｅｎ）本研究は国 立予防衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔ ｈ）からの補助金によりその一部が支持されて（、ｚる。合衆国政府は本研究に ある権利を有する。

技術的分野 本発明はＩ型糖尿病（ｔｙｐｅ　Ｉ　ｄｉａｂｅｔｅｓ）の診断及び治療に有用 な因子に関する。さらに特定すると本発明は疾患の誘導に関連するＴ−細胞増殖 及び賦活を媒介するβ島細胞（β　１ｓｌｅｔｃｅｌｌｓ）におけるマーカーに 関する。

背景の技術 Ｔ型糖尿病は寿命の初期に現れる慢性的自己免疫疾患であることが知られている 。インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれるこの状態は遺伝病であると 考えられるが、非家族性の形態も起こる。■型糖尿病の遺伝的制御（ｇｅｎｅｔ ｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ）の性質は詳細に研究されてきた。主要組織適合性遺伝子 複合体（ＭＭＣ）に付随する遺伝子が疾患の遺伝的伝達に含まれることが明らか であると思われる（Ｗｉｃｋｅｒ、Ｌ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、（１９８７）１６５　：１６３９−１６５４）。いくつかのグループはヒトＨ ＬＡ−ＤＱクラスＩＩＭＨＣコード糖タンパク質のβ−鎖の位置５７におけるア スパラキン酸残基の不在と疾也の発生の間の関連性を示した（Ｐａｒｈｄ、Ｊ、 Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８７）旦又旦：５９９Ａｃａｄ　Ｓｃ ｉ　ＵＳＡ（１９８８）８５：８１１１−８１１５）。

ヒト型のＩ型糖尿病のために最も普遍的に用いられるモデルは非肥満型糖尿病（ ＮＯＤ）マウスモデルである。マウスのＮＯＤ株は最初にＭばれた。このモデル において現れる疾患はヒトにおいて見いだされる疾患と類似している。疾患の症 状が始まるずっと以前に、はとんどがＴ−細胞由来の単核細胞による膵島の進行 性浸潤があり、それがインスリン−生産Ｂ−細胞の破壊を導（。これはＩＤＤＭ の発病の８週間もの長い間、類似のＢＢラットモデル系（下記を参照）でも起こ る。ＮＯＤ疾患は少なくとも３つの遺伝子により制御され、その１つがＭＨＣと 共に分疾但の過程で膵島のインスリン−生産β−細胞が選択的に破壊され、他の 内外圧・島、α−細胞、例えばグルカゴン又はソマトスタチンを生産するものは 影響を受けない。β−細胞の破壊は部分的にＴ−細胞増殖により媒介され、誘導 期においてβ−細胞破壊のエフェクター、例えば細胞障害抗体、ナチュラルキラ ー細胞、マクロファージ及びリンホカインＩｍｍｕｎｏ　ｌ　（１９９０）８　 ：　６１７−６７９）。

かくして一般にＩ型糖尿病の発病は、正常及び自己免疫応答の両方に共通の誘導 期を含み、それは抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するＭＨＣクラスＩＩ付随ペ プチドがＴ−細胞抗原レセプター（Ｔ　ＣＲ）を占めることによるヘルパーＣＤ ４１Ｔ−細胞の初期活性化を含む。この活性化がリンホカインを分泌させ、それ が今度はエフェクターβ−細胞、細胞障害性Ｔ−細胞、ナチュラルキラー細胞、 マクロファージなどを活性化する。実際にネズミモデル系において、抗−ＣＤ４ 抗体（ＧＫｌ、５）を用いて循環系からＣＤ４”７９２３球を除去すると、Ｉ型 糖尿病の発現が阻止されることが示された（Ｓｃｈｉｚｕｒｕ、Ｊ、Ｓ、ｅｔａ ｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）２４０：６５９　６６２）。

■型糖尿病の進行にＴ−細胞が含まれることは、ＮＯＤマウスからの牌臓細胞を 用いて自己免疫性糖尿病を非感受性株に転移できること（Ｗｉｃｋｅｒ、Ｌ、Ｓ 、ｅｔ　ａｌ、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　（１９８６）３５　：　８５５−８６０） 　、及び自己反応性（ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ）７９２３球がＮＯＤマウスに おいて糖尿病を起こせること（Ｒｅｉｃｈ。

Ｅ、−Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　（１９８９）３８：１６４７−１ ６５１）を示すことによっても証明できた。膵島−特異的Ｔ−細胞クローンもＨ ａｓｋｉｎｓ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ　（１９８９）８６：８０００−８００４及びＮａｋａｎｏ、Ｎ、ｅｔ　ａｌ 、、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　（１９９１）１７３　：１０９１−１０９７により製 造された。

ＮＯＤ？ウスモデルを用い、Ｌｅｈｕｅｎ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ＪＩｍｍｕｎｏ 　ｌ　（１９９０）１４４　：　２１４７−２１５１はＮＯＤ株における体液性 異常（ｈｕｍｏｒａｌ　ａｎｏｍａｌｉｅｓ）が糖尿病及び膵島束の発病から分 離されることを示した。それにもかかわらず、ＩＤＤＭ＝感染患者に存在する自 己抗体に結合するタンパク質の同定によりＩ型糖尿病に付随する抗原を同定する 試みがなされてきた。か（してこれらの抗原はすべてエフェクターレベルで存在 し、状態の進行に付随し得るか又は付随し得ない。

Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）λス ４　：１３４８−１３５０は、ＩＤＤＭの発病の前の８週間も長い間、ＢＢクラ ットヒトの場合と類似した１型糖尿病を自然に発現する）において６４’ｋｄの 島細胞タンパク質に対する抗体が存在することを示し、その抗体を膵臓β−細胞 に対する免疫反応の予測に用いることができることを示唆した。続いて予測され る自己抗原がグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）であり、それが抑制性 神経伝達物質であるγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の合成に含まれることがこのグ ループにより特Ｓ）の６５ｋｄの熱ショックタンパク質（ｈ　ｓ　ｐ　６５）と 交差反応性の分子がＮＯＤマウスモデルにおける糖尿病−付随自己抗体と免疫反 応性１５７９により示された。これらの著者は、アシニバント中で投与されたタ ンパク質が免疫原性である傾向があるが溶解性の形態の同タンノくり買が寛容原 性であるという原理を用い、糖尿病を誘導するか、又は糖尿病に対して予防接種 するためにｈｓｐ６５抗原を用いることができると示唆した。実際に免疫原性又 は非免疫原性の形態のｈｓｐ６５を投与するとこの原理と一致する結果が与えら れたと報告された。

Ｃａ５ｔａｎｏ、Ｌ、ｅｔ　ａｌは未公開の原稿において、前糖尿病患者からの 抗体を、ラット島λｇｔｌ１発現ライブラリをスクリーニングしてこれらの抗体 と免疫反応性のタンパク質を生産するコロニーを同定するためのプローブとして 用いることを記載した。このコロニーはカルボキンペプチダーゼ−Ｈ（エンケフ ァリン　コンバーターゼ）の１３６アミノ酸フラグメントをコードする挿入片を 含むことが見いだされた。

さらにライブラリのスクリーニングに用いられた血清は、膜形態のカルボキシペ プチダーゼ−Ｈの分子量に相当する５２ｋｄの抗原と反応することが示された。

１型糖尿病に付随する自己抗原と反応する６４ｋｄのＧＡＢＡカルボキンラーゼ 、ｈＳｐ６５抗原、及び５２ｋｄカルボキシペプチダーゼ−Ｈの他に、インスリ ンに対する自己抗体もこの状態に侵された患者に存在することが知られている。

インスリノーマ細胞抗原に特異的なヒトＴ−細胞クローンがＶｏｎＶｌｉｅｔ　 ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９８９）１９　：　２１３− ２１６により製造された。これらのＴ−細胞クローンは、抗原としてラソトイン スリノーマ膜を用い、糖尿病を最近発病した患者の末梢血単核細胞から細胞系を 生成することにより製造された。さらにＩ型糖尿病患者からのＴ−細胞クローン は、５０００−倍に精製され、分子量が３８ｋｄのモノマーを有することが示さ れたインスリン分泌顆粒の内在膜成分に応答することが示された（Ｒｏｅｐ、Ｂ 、　Ｏ，ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９９０）３４旦：６３２−６３４）。

前記の抗原はすべて■型糖尿病のニフエクター期に関連していると思われる。前 記の抗原のいずれもＣＤ４”　Ｔヘルパー細胞誘導期の初期活性化に関連してい ることが示されなかった。これらの抗原はＩＤＤＭの症状の発病後に見いだされ る。

かくしてこれらの広範囲の研究において、疾患の発病後か又はその直前に存在す る因子によって証明される抗原のみが同定された。本発明はこの状態の発現の非 常に初期の段階に対応する抗原を提供する。これらの抗原は診断及び免疫療法の 設計において有用である。

本発明の開示 ここで、■型糖尿病の発病に導く初期Ｔ−細胞誘導期に関連する抗原が同定され た。これらの抗原は疾患の発現の初期診断に有用であり、感受性の患者の免疫療 法に用いることもできる。

１つの特徴において本発明は、哺乳類、特にヒト又はネズミの膵島β−細胞（ｐ ａｎｃｒｅａｔｉｃ　１ｓｌｅｔ　β−ｃｅｌｌ）の細胞質ゾル及び／又は膜に 通常存在する分子量が３０〜６０ｋｄの範囲の抗原、ならびにこの抗原と特異的 に免疫反応性の抗体又はＴ−細胞を目的とする。この活性を有するヒトタンパク 質はＨＥＰＣにより決定される分子量が約３７ｋｄ、４１ｋｄ及び５１ｋｄであ り、ネズミタンパク質のゲル電気泳動により決定される分子量は約３６ｋｄ、４ ２ｋｄ及び５５ｋｄである。他の特徴において本発明は、この抗原に応答する抗 体又はＴ−細胞の存在又は不在に関して患者を評価することによる、■型糖尿病 に対する感受性を診断する方法を目的とする。他の特徴において本発明は、抗原 のペプチドサブユニットを単独で、又は免疫調節剤と組み合わせて用い、本発明 の抗原に対して患者を非感受性とし、抗原に対する免疫応答を阻止することによ り■型糖尿病の発病を予防する方法を目的とする。

図面の簡単な説明 図１は、種々のインスリノーマ抽出物に関するＴ−細胞増殖アッセイの結果を示 す棒グラフである。

図２は、抗原提示細胞の存在及び不在のＴ−細胞増殖に対する効果を示す棒グラ フである。

図３は、インスリノーマ膜タンパク質の、ＮＯＤマウスからのＴ〜細胞の増殖を 賦活する能力に関して検定した、その画分の一次元ゲル電気泳動のニトロセルロ ースプロットを示す。

図４は、不ズミインスリノーマ抽出物について行われ、種々の令のＮ○Ｄマウス から単離したＴ−細胞に関して検定した高性能電気泳動クロマトグラフィー（Ｈ Ｐ　Ｅ　Ｃ）の溶出パターンを示す。

図５は、ＮＯＤマウスＴ−細胞を用いて検定された、ネズミインスリノーマ全細 胞抽出物のＨＰＥＣ溶出パターンを示す。

図６は、ネズミインスリノーマの膜及び細胞質ゾル画分の間の、Ｔ−細胞増殖賦 活活性の分布を示す。

図７は、３０日令のＮＯＤマウスから得たＴ−細胞の増殖を賦活する能力に関し て検定された、ネズミインスリノーマ抽出物の二次元ゲル電気泳動の結果を示す 。

図８は、ＮＯＤ牌臓細胞の応答により検定された、ヒト島の全細胞抽出物のＨＰ ＥＣ溶出パターンを示す。

図９Ａ及び９Ｂは、それぞれＴ−細胞クローンＬＮ−７及びＬＮ＊ＣＭを用いて 分子量分布により分離された抗原−含有抽出物の分析を示す。

図１０Ａ及びＩＯＢは、参照標準マウス及びＴ−細胞クローンＬＮ−７を投与さ れたマウスからの染色膵臓（ｐａｎｃｒｅａｔａ）を示す。

本発明の実施様式 本発明はＩ型糖尿病の誘導期と結合した初期の現象に関連する抗原を提供する。

本発明の抗原はそのままで疾患を発現している患者の初期スクリーニングの機会 を与え、その発現及び／又は永続に干渉して予防する機会を与える。

本発明の抗原は例えばネズミ又はヒトなどの哺乳類の膵島β−細胞又はそれから 誘導された細胞系から得ることができる。関連抗原の種間交差反応性（ｃｒｏｓ ｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が示され、ネズミ及びヒト抗原の 間に有意な相同性があると思われる。かくしてウソ、ブタ、ヒツジ、ネコなどの 他の哺乳類のβ−島に類似の抗原が存在し、単離できると思われる。

抗原は島β−細胞又はその誘導細胞系、あるいは関連神経芽腫細胞又は他の神経 内分泌細胞の膜画分又は細胞質ゾル画分のいずれかから得ることができる。抗原 はＩ型糖尿病に対して非感受性の患者及び感受性の甲者の両方に存在する。従っ て抗原の供給源として用いる細胞は感染した警者から誘導する必要はない。

抗原は最初、β−細胞又はその誘導細胞系からの本来の材料の抽出及び分別によ り調製することができるが、コードＤＮＡから組み換え法を用いてもっと簡単に 調製することができる。精製され、単離された形態の本来のタンパク質があると 、これらの抗原をコードするｃＤＮＡの回収に有用なプローブの設計が可能にな る。さらに例えばλｇｔｌｌ甲に得、Ｅ　コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に形質転換さ れた発現ライブラリを、Ｉ型糖尿病に関するネズミモデル、例えばＮＯＤマウス から得たＴ−細胞の増殖に影響する発現産物の能力に関してスクリーニングする ことができる。抗原と免疫反応性の抗体も発現ライブラリのスクリーニングに用 いることができる。

抗原の調製 本発明の抗原は哺乳類患者、特にヒト又はネズミ患者からの膵臓β島細胞、又は それから誘導された細胞系の適した抽出により調製することができる。抗原はＩ 型糖尿病−感受性患者及びＩＤＤＭに感受性でないｗ者の両方のβ−細胞の細胞 質及び／又は膜画分に存在する。さらにβ−細胞から誘導された腫瘍細胞系、例 えばインスリノーマを出発材料として用いることができる。抗原の少なくとも１ つがヒト神経芽腫細胞系及びヒト島に存在することも下文に示された。抽出は一 般に約ｐＨ７〜８の適した膜緩衝液の存在下で細胞をホモジナイズし、遠心によ り細胞材料を除去し、上澄み液を回収し、続いて上澄み液を高速で遠心して膜ヲ ヘレソトとして得、細胞質を上澄み液として得ることにより行う。全細胞抽出物 も用いることができる。膜の調製のための一般的方法はＦａｖａ　ａｎｄ　Ｃｏ ｈｅｎ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８４）２５旦　２６３６−２６４５に記 載されている。

続いて抽出物を、ゲル濾過、アニオン交換クロマトグラフィー、ポリアクリルア ミドケル電気泳動及び池の標準的方法を含む一般的に既知の方法を用いて分離す るのが好ましい。活性画分を回収する。

両分は、ＮＯＤマウスを含む［型糖尿病−感受性患者から得たＴ−細胞、又はそ れから誘導されたＴ−細胞系の増殖に影響するその能力を標準的Ｔ−細胞増殖ア ッセイを用いて評価することにより、活性に関して検定することができる。その ようなアッセイの１つは増殖の尺度として標識チミジン挿入を用い、一般に以下 の通りに行われる；純粋な（未処理の）ＮＯＤマウスから採取した牌臓、リンパ 節又はＰＢＬからの単細胞懸濁液からＴ−細胞試料を得る。死細胞及び赤血球細 胞をＦｉｃｏ１１勾配遠心により、室温の２５００ｒｐｍで２５分間、勾配中で 回転させて除去する。これは濃縮リンパ球集団を与え、抗原提示細胞（ＡＰＣ） を含む。Ｔ−細胞及びＡＰＣを９６−ウェルのＵ−形平板（Ｃｏｓｔａｒ）にお いて０．２５〜０．５ｘ１０６／ウェルで平板培養し、種々の濃度の調べるべき 試料と共に３７℃及び５％ＣＯ２において７２時間インキュベートする。続いて 平板にウェル当たり１μＣ１のトリチウム化チミジンを加え、さらに１６時間イ ンキュベートする。

続いて微量細胞収穫機（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）（Ｓｋａｔ ｒｏｎ）を用いて細胞を収穫し、計数する。標識チミジンの吸収の増加は細胞増 殖の増加を示す。前記の代わりに、別に加えられるＡＰＣと共にクローニングさ れたＴ−細胞系をアッセイで用いることができる。

回収された画分を続いて標準的タンパク質精製法を用い、さらに精製することが できる。実際に純粋なタンパク質を与える特に有用な方法は、二次元ケル電気泳 動である。両分又は抽出物を１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，１５％　グリセ ロール及び６％　アンホリン、ｐＨ３〜１０に調節する。続いてＯ’　Ｆａｒｒ ｅ］］、Ｐ、Ｈ，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈ−４毘（１９７５）λ河川　４００７−４ ０２１の方法に従い、等電点電気泳動を行う。得られた一次元分離につき、続い て１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上への各領域の負荷、及びＬａｅｍｍｌ　ｉ、Ｕ 、に、Ｎａｔｕヱ（１９７０）２λユニ６８０−６８５に従う電気泳動を行う。

同定された画分を続いて精製及び単離形態で回収する。それらは、アミノ酸配列 の決定により、及びβ−島ｍＲＮＡの逆転写によって調製したｃＤＮＡライブラ リから、又は遺伝子ライブラリからのコード遺伝子の回収によりさらに特性化す ることができる。ＤＮＡライブラリは標準的方法を用いて調製することができ、 回収された抗原の全体的又は部分的アミノ酸配列に基づいて設計されたプローブ を用いてスクリーニングすることができる。回収されたＤＮＡは、今度は他の種 において対応する抗原をコードするＤＮＡの回収のためのプローブとして用いる ことができる。

ＤＮＡプローブを用いて抗原をコードする遺伝子を回収する他に、出発ｃＤＮＡ ライブラリを例えばλｇｔｌｌ中の発現ライブラリとして調製することができ、 続いて合成された抗原を検出する方法を用いてライブラリをスクリーニングする ことができる。生産された抗原を検出するためのライブラリのスクリーニングに 関して２つの手段が特に奸才Ｌ７い。

１つの方法では、単離された抗原に対して調製された抗体を、従来の方法におけ るライブラリのスクリーニングに用いることができる。第２の方法ではライブラ リを、そこに含まれる各クローンの、ＮＯＤマウスを含む■型糖尿病感受性患者 から得たＴ−細胞の増殖を賦活する抗原を生産する能力を評価することによりス クリーニングすることができる。

この増殖を賦活することができるタンパク質を生産するコロニーは、賦活抗原を コードする遺伝子を含む。

上記の通りに抗原をコードするＤＮＡを含む１つ又はそれ以上のクローンが同定 されたら、クローンからＤＮＡを単離し、関連挿入片を配列決定及び／又は回収 し、その後の抗原の生産に用いることができる。配列決定されたＤＮＡ及び／又 はその縮重コード形態は、そのような発現系で用いるために部分的に、又は完全 に独立して合成することができる。

抗原の組み換え生産の場合、簡単な宿主に適合性の発現系中にコードＤＮＡを連 結する。多様な宿主系及び該宿主系で作用することができる調節配列を、当該技 術分野において現在用いることができる。適した宿主にはＥ　コリなどの原核細 胞、ならびに真核細胞、例えば酵母、鳥類細胞、昆虫細胞、哺乳頚細胞及び植物 細胞が含まれ、さらに最近、植物全体又は動物全体も用いられてきた。発現系の 構築及び構築された系を用いた適した宿主の形質転換の方法は、現在当該技術に おいて標準的である。

所望の抗原の生産のために、調節配列に作用的に連結された抗原をコードする遺 伝子を含む発現系で形質転換した組み換え宿主細胞を、コードＤ　Ｎ　Ａの発現 を許す条件下で培養し、標準的方法を用いて培養から抗原を回収する。抗原を分 泌させる構築系を用い、続いて抗原を培地から回収することができ、又は抗原を 細胞内で生産することができ、その場合は宿主細胞を溶解することが必要である 。

本発明のβ−島細胞抗原を単離し、特性化するとヘルパーニー細胞上のＴＣＲと の相互作用に関連するペプチドの同定に関する配列情報を与える。これらのペプ チドセグメントは少なくとも約７アミノ酸の連続配列であり、抗原提示細胞の表 面上に存在するＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質と会合し、ＴＣＲと相互作用する 複合体を生ずる。配列決定された抗原のオーバーランプ領域を、上記の通りに行 われるＴ−細胞増殖アッセイにおいて抗原提示細胞の存在下で調べることにより 、関連ペプチドを系統的に同定することができる。そのようなスクリーニングの 方法はＨｉｃｋｌｉｎｇ、Ｊ、に、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎ。

１　（１９９１年提出、印刷中）による報告に含まれている。続いて、ＭＨＣク ラスＩＩ糖タンパク質と複合する能力を保持しているがＴＣＲと反応できない改 変構造を有するペプチドを、このアッセイにおいて既知の賦活物質の存在下でＴ −細胞増殖を阻害するこれらの改変ペプチドの能力を評価することにより設計す ることができる。ペプチド改変には伸長、欠失及び置換、ならびにこれらの組み 合わせが含まれる。増殖を阻害するペプチドが、及第した候補である。

アッセイ アッセイが精製抗原、Ｔ−細胞クローン又は抗原組成物に向けられたものである かどうかに依存していくつかの形態の簡単なアッセイを本明細書に記載する。一 般にすべてのアッセイをミクロタイターウェルで行うことができ、各ウェルは１ ０．０００〜３０．０００のＴ細胞、約１０５〜１０６の組織適合性抗原−提示 細胞、及び抗原（粗抽出物の場合これは約０３〜２０μｇ／ｍｌの量となる）を 含む。しかし比較的精製された抗原の場合、抗原の必要量はもっと少量であり、 Ｔ細胞の供給源として肺臓細胞組成物が用いられた場合、ＡＰＣはすてにもとの 組成物に含まれる。Ｔ細胞、組織適合性ＡＰＣ及び抗原の性質及び量の変更は、 最適化及び実験設計の日常的事柄として理解されるであろう。増殖の尺度として トリチウム吸収が用いられる場合、５％ＦＣ３，ＩＯＵ／ｍｌ　１Ｏ−ｓｔｒｅ ｐ及び２００μＭ　Ｌ−グルタミンを補足したＲＰＭＴ−１６４０などの適した 培地、又は当該技術分野において理解されるＴ−細胞増殖に適した他の培地にお ける７２時間のインキュベーションが簡単な案である。続いて細胞培養物に例え ば１μＣｉ／ウエルのトリチウム化チミジンを加え、６〜１６時間後に細胞を収 穫して計数する。

Ｔ−細胞増殖の測定の他の方法及び前記の案の変更は当該技術分野において既知 である。

Ｔ−細胞クローンの生成 ３０〜４０日令の本来の雌のＮＯＤマウスからの牌臓又はリンパ節細胞を試験管 内で、インスリノーマ（Ｂ２３７２０、下記参照）抗原抽出物又は放射線照射イ ンスリノーマ細胞で賦活した。全細胞抽出物あるいは膜又は細胞質ゾルからの抽 出物を１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で用いた。別の場合、１％　ＮＭＳ、　 Ｐ　ｅ　ｎ−３ｔ　ｒ　ｅ　ｐ、グルタミン及びＩμｇ／ｍｌ　Ｌｅｕｋｏ−Ａ を含むＲＰＭＩ培地中の放射線照射インスリノーマ細胞（５０００細胞／ｍｌ） を用いることができる。

Ｔ−細胞の供給源として用いる牌臓又はリンパ節細胞は、３７°Ｃ及び５％　Ｃ Ｏ２において３〜４日間インキュベートし、続いて洗浄し、１０％　Ｆｅ２　Ｐ ｅｎ−３ｔｒｅｐ、グルタミン及び１５％　ラットＣｏｎ−Ａ上澄み液又は２０ Ｕ／ｍｌ　ｒＭＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を含むＲＰＭＩ培地（完全培地）中 に再墾濁し、５日間インキュベートした。Ｔ＝細胞系の賦活は８〜９日のサイク ルで２〜３回繰り返した（上記の゛完全”培地中の抗原と共に３〜４日、及び抗 原を含まない完全培地＋２０Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２中で５日）。

Ｔ−細胞系の単細胞クローニングは、９６ウエル平板（Ｃｏｓｔａｒ平底１／２ 平底１ト２ ｍ１の放射線照射生存インスリノーマ細胞）及び０．５ｘ１０６の放射線照射牌 臓細胞（ＡＰＣとして）の存在下の完全培地中で行った。７日後にクローンを上 記の抗原＋ＡＰＣで再賦活した。１０〜１４日後、ウェルを正の成長に関して評 価した。成長しているＴ細胞クローンを２４ウエルのＣｏ５ｔａｒ平板に移し、 拡張した。

標識チミジン挿入に基づくアッセイにおいて、０．５ｘｌＯ’の放射線照射牌臓 （２００ＯＲ）抗原−提示細胞と共に２０，０００のＴ細胞を用い、細胞を増殖 に関して調べた。Ｔ−細胞及びＡＰＣ細胞の培養は、抗原抽出物（０　３〜２０ μｇ／ｍＩ）の存在下で３重で開始し、７２時間インキュベートし、その後１μ Ｃｓ／ウエルのトリチウム−標識チミジン（Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ．Ｉ　ｎｃ．） を加え、１６時間後に収穫した。

β−平板シンチレーションカウンターを用いて挿入された放射性を測定し、結果 を挿入されたチミジンの平均ｃｐｍとして表した。標準偏差は１０％以下であっ た。ＬＮ７及びＬＮ＊ＣＭ　Ｔ−細胞クローンを含む多くのＴ−細胞クローンを 得た。

Ｔ−細胞クローンをウェルから採取し、上記の通りに再賦活し、特異性の試験の ために拡張した。

抗体生産 本発明のタンパク質抗原及び関連ペプチドフラグメントを含む抗原を標準的免疫 代案で哺乳類患者に投与し、抗原又はそのペプチドサブユニットと特異的に免疫 反応性の抗体を製造することができる。担体への共役によりペプチドサブユニッ １−に免疫原性を与える方法は、当該技術分野において周知である。タンパク質 又は担体−共役ペプチドを適した働者に、好ましくはアジュバントの存在下で注 射し、血漿又は血清中の抗体力価の検出により免疫化の進行を監視することがで きる。抗原を免疫原として用いた標準的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ又は他のイムノアッセイ を用い、抗体の量を評価することができる。

赤血球から抗血清を分離し、続いてポリクローナル組成物として用いることがで き、あるいは免疫化宿主からの抗体−分泌細胞を標準的方法を用いて不死とし、 抗原又はそのサブユニットに関して免疫特異性のモノクローナル抗体を分泌する 細胞系を得ることができる。抗体自体を他の血漿タンパク質から分離することも できる。ポリクローナル及びモノクローナル組成物の他に、ＦａｂＳＦａｂ’　 などの免疫学的に反応性で特異的なフラグメントもイムノアッセイ法において有 用であり、本発明の抗体に含まれる。これらの抗体又はフラグメントは標準的方 法を用いてＩ？Ｉｕすることができる。

Ｉ型糖尿病の発病に関する予後 本発明の抗体はＩ型糖尿病を現している患者の初期の検出に用いることができる 。抗原自身は正常な及び感受性の患者の両方に存在するが、ＩＤＤＮｉを現して いる轡、者のみが、これらの抗原の存在によって増殖が賦活されるヘルパーニー 細胞を生産する。かくして初期の予後への１つの方法の場合、調べるべき患者か ら得たＴ−細胞を上文で記載した標準的Ｔ−細胞増殖アソセイで用い、本発明の 抗原に対するその応答を調べる。これらのアッセイでそのＴ−細胞が増殖した患 者は、疾患が現れている。

これらの慝者が本発明の初期抗原に対する抗体を生産するか否かは現在知られて いない。これらの抗原を利用できることにより、これらの抗体の存在又は不在を 突き止めることができるであろう。患者が状態の発病の前に抗体を生産すること が示された場合、これらの抗原を用いたこれらの抗体の存在又は不在の検出も、 予後のための手段として用いることができる。これらの抗体の存在又は不在の検 出のための標準的イムノアッセイは周知であり、多様な標識を含む多様な案を用 いることができる。

治療 本発明の抗原を用いることができることは、Ｉ型糖尿病の発現の阻止及び発病の 予防のための新規な治療法の可能性を与える。現在の戦術は非常に侵略的であり 、一般に免疫系抑制剤を用いる。より穏やかな治療が本発明の抗原により与えら れ、それは非免疫原性条件下で投与することができ、その条件は抗原に対する免 疫応答を誘起せずに患者を抗原に対して非応答性とする。許容投薬量の抗原又は その関連ペプチドの投与のための一般的方法は当該技術分野において既知であり 、アジュバントの不在下における導入及び可溶性形態での投与が含まれる。抗原 提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質と複合体を形成し、Ｔ−細胞 を活性化する同定されたペプチドの利用も、非応答性の誘導に用いることができ 、少量のペプチドの投与はこの方法にさらに適している。

皮下、静脈内又は腹膜的注射の既知の経路の他に、本発明の抗原又はペプチドは 経粘膜及び経皮投与影響を含む、ペプチド含有組成物に適した調剤の他の様式を 用いて投与することができ、適した調剤がなされた場合は経口的投薬によっても 投与することができる。注射経路以外によす（ナラびに注射により）そのままの ペプチド又はタンパク質を血流中に導入するための、製薬学的に許容し得る賦形 剤を含む適した調剤は、分をその場で与えるポンプを用いることができる。

本発明の抗原は単独で、あるいは抗−ＣＤ４抗体又は他のＣＤ４阻止剤及び／又 は他の免疫調節物質と併せて投与することができる。耐性を与えるこの方法は米 国特許第４．６８１，７６０号及び第４．　９０４゜４８１号に開示されている 。この方法では抗原及び抗−ＣＤ４抗体又は免疫反応性フラグメントを付随的に 投与する。“付随的”投与は、抗−ＣＤ４成分が抗原に対するヘルパーニー細胞 応答を阻止できる時間枠内を意味する。この意味における“付随的”の性質は上 記で引用した米国特許に記載されており、その記載事項は引用することにより本 明細書の内容となる。

最後に、ＭＨＣクラスＩＩ糖タンパク質と結合することができる拮抗剤として挙 動するが、Ｔヘルパー細胞と相互作用しない複合体を生ずる改変ペプチドを用い た治療法も用いることができる。これらのペプチドの場合の投与様式及び調剤は 上記と同様である。

本発明の抗原は比較的穏やかな様式の干渉を与えてＩＤＤＭの発病を予防するの で、やはり与えられる予後の方法は幼児及び／又は小児に普遍的に適用されるス クリーニング手段として用いることができる。本明細書に記載のアッセイ法は少 量の血液試料しか必要とせず、これが比較的非侵入的なスクリーニングを与える 。本発明の抗原に応答するそのＴ−細胞又は抗体の能力の故に試験に陽性である 患者は、続いて上記のように処置し、疾患の進行を予防することができる。

以下の実施例は例示を目的とし、本発明の制限を目的とするものではない。

実施例１ 単に記載すると、密集細胞層をカルシウム及びマグネシウムイオンの不在下でリ ン酸塩緩衝食塩水を用いて３回洗浄した。最後の洗浄の後に残った液体を吸引し 、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５，１，５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃｌ　２．１ｍＭ　 ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１μｇ／ｍｌのロイペプチンから成る膜緩衝液 を加えた。細胞を緩衝液中にこすり取り、ホモノナイズしくＤｏｕｎｃｅ）、ホ モジネートを５ｏｒｖａｌ　Ｓ３１遠心機の２５００ｒｐｍにおいて、４°Ｃで １０分間遠心した。ペレツトを捨てた。上澄み液を“全細胞抽出物”として用い るか、あるいは４８．０００ｘｇで３０分間遠心して細胞質ゾルから膜を分離し た。膜−含有ペレットを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ中に懸濁し、−７０°Ｃで凍結し た。

細胞質ゾルも試験のために保有した。

−マ細胞系Ｂ２３７２０、グルカゴノーマ膵臓α−細胞系及びヒト神経芽腫細胞 系５Ｙ５Ｙ（Ｇｏｙａ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ　Ｒｅｓ　（ １９９１）１６　：１１３　１１６）に関して行った。

インスリノーマ細胞の細胞質ゾル画分につきさらに、Ａｐｐ　ｌ　ｉ　ｅｄＢｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、ＨＰＥＣ２３ＯＡ系を用いて高性能電気泳動クロマ トグラフィー（ＨＰ　Ｅ　Ｃ）を行った。（抽出物は細胞質と共に膜から誘導さ れたタンパク質を含むと思われ、４００μｇの全タンパク質につきＨＰＥＣを行 う。） ＨＰ　Ｅ　Ｃの場合、抽出物を７．５ｍＭ　ｔｒｉｓ−リン酸塩ｐＨ７，５，０ ，２５％　ＳＤＳ、１５％　グリセロールの最終１度に調節し、続いて１０％　 ５ＤＳ−ｔｒｉｓリン酸塩チューブ・ゲル（ｔｕｂｅｇｅ　Ｉ）（３，５ｘｌＯ ｃｍ）上に負荷し、ｔｒｉｓ−リン酸塩緩衝系において電気泳動を行った。タン パク質はケルの底から７．５ｍＭ　ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５中に溶出させ 、タンパク質濃度に関して検定し、１２．５％　ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 上で分析した。これらの両分においてタンパク質の８０％が回収された。

下記に記載するアッセイにおいて増殖応答を誘導する画分を集めた。

これらの画分は３０〜６０ｋｄの分子量範囲に相当し、図１においてＣ−プール 　Ｉと標識しである。Ｃ−プール　Ｉならびにα−細胞及びヒト神経芽腫細胞の “細胞質ゾル”抽出物（いくらかの膜部分も含む）から得た対応するプール（図 １においてそれぞれα−プール及びＮＢ−プールと標識しである）をＴ−細胞増 殖アッセイを用いて比較し、この場合Ｔ−細胞は３〜３０日令の賦活されていな い（ｕｎｐｒ　ｊｍｅｄ）雌のＮＯＤマウスの稗臓から調製した。単細胞Ｖ濁液 を調製した上文に記載の要領で、この場合稗臓及びリンパ節からＴ−細胞組成物 を得、Ｆ１ｃｏｌｌ勾配遠心を用いて死細胞及び赤血球を除去して透明化した。

得られた組成物はＴ−細胞型の全範囲及び抗原提示細胞を含む。

上記に記載の通り、６令におけるリンパ球組成物を９６ウエルＵ−形二板甲てウ ェル当たり０２５〜０．５ｘ１０６細胞において平板培養した。リンパ球は未分 別（未処理〕肺臓から得、Ｂ−細胞及びＡＰＣの供給源とし、てマクロファージ を含んだ。６令のグループに関し、牌臓細抱は３〜８マウスのプールを与えた。

ウェルをタンパク質画分（１０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベ・−トシた。反応 混合物を５％ＣＯ２における３７℃で７２時間インキュベートし、続いて平板に ウェル当たり１μＣｉのトリチウム化チミジンを与え、さらに１６時間インキュ ベートした。細胞を収穫し、計数した。

結果を図１に示す。図に示されている通り、ＲＰＭＩ培地のみはいずれの条件下 においてもこのアッセイでチミジン吸収を賦活せず、いずれの抽出物プールもＢ ＡＬＢ／ｃ又はＣ５７Ｂ１マウスから上記の方法で誘導されたＴ−細胞の増殖を 賦活しなかった。これは、応答がＮＯＤマウスからのＴ−細胞に特異的であるこ とを示す。さらにアルファ細胞からのプールは賦活を示さない。これらのマウス は■型糖尿病一様症状を現さない。ＮＯＤマウスからのＴ−細胞の賦活に対する 感受性を８〜２８日令の種々の令で調べた。

図１に示す通り、Ｂ２３７２０ネズミインスリノーマ（β島）から誘導されたＣ −プール　Ｉは非常に若いマウス、ならびに比較的高含のマウスからのＴ−細胞 に対して賦活性であった。ヒト神経芽腫一対応プールはすべての令において増殖 を賦活した。しかしα−プールはＮＯＤ丁−細胞増殖を賦活することができず、 β−細胞特異的抗原であることを示した。誘導剤としてＰＨＡを用いた参照標準 はＮＯＤ、ＢＡＬＢ／Ｃ及びＣ５７Ｂ１／６株すべてからのＴ−細胞の予想され た程度の賦活を示した。

上記のＴ−細胞アッセイを、試験ＮＯＤ　丁−細胞組成物から抗原提示細胞を除 去し、ＡＰＣの存在下及び不在下、ならびに固定ＡＰＣの存在下における種々の 抽出物の効果を評価することにより修正した。

このＴ−細胞組成物の場合、ＮＯＤマウスからの稗臓細胞の単細胞懸濁液をナイ ロンウール（Ｒｏｂｉｎ　Ｌａｂ）カラム上に通過させ（Ｊｕｌ　ｉｕｓ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９７３）３：６４５）、Ｔ−細胞 を濃縮してＢ−細胞、プラズマ細胞及び抗原提示細胞を枯渇させた。細胞をカラ ムにおいて、完全培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣ３）中の３７°Ｃで４５分間イン キュベートし、続いて大量の培地でゆっくり洗浄した。平均１５〜２５％の収率 が得られ、得られた細胞は有効ＡＰＣを含まなかった。ＡＰＣの存在下で実験し た試料の場合、放射線照射（４０００Ｒ）ＮＯＤ牌臓稗臓からＡＰＣを調製し、 固定ＡＰＣはＡＰＣを０．１％グルタルアルデヒドで６０秒間処理することによ り調製した。

図２に示す通り、β島細胞質ゾル抽出物又はヒト神経芽腫細胞細胞質ゾルの存在 下で応答を誘起するために、抗原提示細胞の存在が必要である。α−細胞からの 抽出物はＡＰＣの存在下及び不在下の両方で有意な応答を誘起しなかった。抗原 供給源として全細胞抽出物を用いる場合、ＡＰＣ又は、抗原とインキュベートし たわずか４時間後に固定したＡＰＣがインスリノーマ抽出物又はヒト神経芽腫５ Ｙ５Ｙ抽出物によるＴ−細胞増殖の賦活に必要であった。

前記の結果から示される通り、ヒト抗原（神経芽腫細胞系から誘導）はＮＯＤ　 Ｔ−細胞組成物と種間交差反応性であり、β島及びヒト細胞系の両方から誘導さ れた抗原はチミジン吸収の賦活に有効であるために抗原提示細胞の存在を必要と する。

Ｂ２３７２０インスリノーマから抽出した膜タンパク質につき、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅを用い、ゲル当たり２ｍｇの合計負荷を用いてサイズ分離を行った。溶出パタ ーンを図３においてニトロセルロースプロットとして示す。図３に示されている 通り、分子量３７．８．４１．９及び５５において別々のピークが観察され、１ ０８．７における小ピークは５５ｋｄビークの２倍であると思われる。図３に示 す溶出パターンは、３０〜４０日令のＮＯＤマウスからの稗臓−誘導Ｔ−細胞に よるチミジン吸収につき観察された分当たりのカウントとして示されている。

実施例１に記載の通りに調製されたマウスインスリノーマＢ２３７２０からの細 胞質画分につき、実施例１に記載の通りに行われる高性能電気泳動クロマトグラ フィー（ＨＰＥＣ）を行った。結果を図４に示す。

種々の令のＮＯＤマウスから誘導されたＴ−細胞に関して検定した溶出パターン を示す。図４においてわかる通り、種々の画分に関する増殖応答は、１７〜５４ 日間をかけて安定して増加する。

ラットインスリノーマの全細胞抽出物も上記の条件下でＨＰＥＣを行った。図５ は、上文に記載の方法を用いて４０日令の雌のＮＯＤマウスの膵臓から調製した インスリノーマー特異的Ｔ−細胞系Ｎ０Ｄ−Ｆ２Ｏの増殖応答により決定した溶 離パターンを示す。活性の３つのピークが示されている。

前記の結果から明らかな通り、抗原は不ズミインスリノーマの細胞質ゾル抽出物 、全細胞抽出物及び膜抽出物とされているものに存在すると思われる。図６はＮ ０Ｄ−Ｆ２ＯＴ−細胞系増殖を用いて評価した各抽出物中の抗原の相対的活性の 比較を示す。図６に示されている通り、抗原の大多数は膜に存在すると思われる 。

実施例１に記載の通りに調製されたインスリノーマの膜画分につき、二次元電気 泳動を行った。試料を１％　Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎＸ−１００，１５％グリセロール 及び６％　アンホリン、ｐＨ３〜１０に調節した。−久方法の後にゲルをそのガ ラス管から取り出して１０％　ＳＤＳファージ実施例１に記載の方法を用い、ヒ ト島の全細胞抽出物を得た。上記の方法を用いてこれらの抽出物につき行ったＨ ＰＥＣは、図８に示す溶出プロファイルを与え、対応するヒト抗原の分子量が３ ０〜６０ｋｄの範囲であることを確証した。図８の溶出プロファイルは４０日令 の雌のＮＯＤマウスからの新しい膵臓細胞を用いて決定した。

図８に示されている通り、ヒト島抽出物は約３７ｋｄにおける１つ、約４１ｋｄ における１つ及び約５１ｋｄにおける１つの３つの別々のピークを含む。

上文に記載した通りに調製したＴ−細胞クローンのパネルを用い、３つのタンパ ク質の異なる性質を研究した。第１に、インスリノーマの全細胞抽出物上で選択 された３０日令の雌のＮＯＤマウスのリンパ節細胞から確立されたＴ−細胞系は 、賦活していないＮＯＤリンパ球の活性と類似のＴ−細胞活性を示し、すなわち ３０〜６０ｋｄの領域に３つの抗原ピークに相当する応答の３つのピークがある 。しかし２サイクルの抗原再賦活の後、限界希釈によりクローニングされたＴ− 細胞系はそれが応答する抗原において差を示した。Ｔ−細胞クローンＬＮ＊ＣＭ は約５１ｋｃｌの抗原に応答しく図９Ａ）、クローンＬＮ７は約３７ｋｄの抗原 に応答した（図９Ｂ）。かくしてＴ−細胞活性の各ピークは多量体又は分解産物 に対抗するおそら（別々のタンパク質に対応する。

実施例３ 本発明の抗原を、島から得られる他のタンパク質と区別するために、１０μｇ７ ｍｌの試験抗原及び、ＲＰＭＩ−ベース培地中で調製した雌のネズミＮＯＤ稗臓 細胞の単細胞懸濁液のウェル当たり１〜３ｘｌＯ’細胞の培養物を用い、上記の 標準的チミジン挿入アッセイを用いた。結果を表１に示す。

表１ 全細胞抽出物 ベータ　インスリノーマ　３１５５３±１８６２アルフア　グルカゴノーマ　１ ０１２±３８島（ＮＯＤマウス）　１３４１６±２１７８島代１−）　２９０３ ２±２０９０ 膵臓ホルモン ラット　インスリン　８９９±１０５ ウノ　インスリン　９５８±８７ Ｃ−１ペプチド（マウス）　８５４±１１９Ｃ−１ペプチド（ラット）　９９７ ±６８グルカコン　１００２±９５ ソマトスタチン　７６５±７４ 組み換えタンパク質 ｈｓｐ６５　１０７８：！：３２９ ｈｓｐ７０　９３２±１１９ カルボキシペプチダーゼ−Ｈ５５９±１２１ＰＭ−１６６９±９８ ＣＡＤ−６５９９±２５ 表１のデータは、β−インスリーマ、ＮＯＤマウスからの島及びヒトからの島が 肺臓細胞中へのチミジン挿入の賦活に成功することを示している。α−グルヵゴ ノーマの抽出物は成功しない。インスリン、Ｃ−ペプチド、グルカゴン及びソマ トスフチンを含む他の膵臓ホルモンも活性でない。熱シヨツクタンパク質（ｈｓ ｐ）６５、ｈｓｐ７０．カルボキノダーセーＨ，ＰＭ−１、ＣＡＤ−６５、ＣＡ Ｄ−６７及びベリフェリンも不活性である。これらのタンパク質のいずれも高抽 出物の賦活効果を示すことができない。

組み換えタンパク質として表１に挙げたタンパク質は、以下の通りに調製した。

ヒトｈｓｐ６５をコードするｃＤＮＡを、４２°Ｃで２時間インキュベートした 後にヒトＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系から単離されたポリＡ“ＲＮＡを用いたＰＣ Ｈによりクローニングした。逆転写に続いてｈｓｐ５５−コードフラグメントを プライマー５°　−ＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＡＡＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴ Ｃ；ＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＣ及び５°−ＧＴｃｃＴｃＧＡＧＴＴＡＧＡＡｃＡＴ ＧｃｃＡｃｃＴｃｃｃＡＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣを用いたＰＣＲにより増幅した（ ９４℃で３０秒、５５°Ｃで３０秒、及び７２℃で１分を３０サイクル）。ヒト 　カルボキシヘブチダーゼ−Ｈ，ＰＭ−１（Ｇ、Ｅｉｓｉｎｂａｒｔｈから寄贈 ）及びヒトｈｓｐ７０　（ＡＴＣＣ／クローン　ｐＨ２，３）をコードするｃＤ ＮＡは、Ｎ−末端において６つのヒスチジン残基で標識したタンパク質をコード するように、６つのヒスチジン残基をコードする合成りＮＡフラグメントをｐＴ ｒｃ９９Ａ発現ベクターのポリリンカー中に挿入することにより構築した発現ベ クターｐＴｒｃ９９Ａ　（Ａｍａｎ。

Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　（１９８８）６旦：３０１−３１５）（Ｈ１５ ６）中にクローニングした。プラスミド構築物をＥ、コリーＴｇｌ（ｓｕｐＥ　 ｈｓｄ△５ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ’　［ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃＩｇ ｌａｃＺΔ　Ｍ１５コ中に形質転換し、培地にＩＰＴＧを加えることによりタン パク質発現を誘導した。バクテリアを１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０，６Ｍ 　ＧｕＨＣ１中で溶解し、４０ｋｇで３０分間遠心することにより不溶性物質を 除去した。６ＭＧｕＨＣ１の存在下でＮ１−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ 、Ｃｈａｔｓｗｏ　ｒ　ｔ　ｈ、ＣＡ）を用いて組み換えタンパク質を精製し、 ＰＢＳに対して透析した。ＢＣＡアッセイ（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ｃ　ｅ）を用いて タンパク質濃度を決定した。バクロウィルス系で発現したマウスＣＡＤ−６５、 ＣＡＤ−６７及びベリフェリンはＤｒ、Ｒｏｌａｎｄ　Ｔｉ５ｃｈ　（Ｈ，Ｍｃ Ｄｅｖｉｔｔ　Ｉａｂ、５ｔａｎｆｏｒｄ）から寄贈された。

Ｔ−細胞系ＬＮ−７をインスリノーマ抗原で賦活し、３日後に２〜５ｘ１０６の 賦活細胞を３週令の雌のＮＯＤマウスに腹膜的注射した。４週間後、膵臓を取り 出し、ホルマリン緩衝液中に固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

令の符合する雌のＮＯＤマウスからの膵臓を参照標準として用いた。

この実験の結果を図１０Ａ及びＩＯＢに示す。図１０Ａは参照標準を′示し、図 １０ＢはＬＮ−７Ｔ細胞を注射されたマウスを示す。注射されたマウスは参照標 準と比較して破壊的膵島炎の促進を示した。ＬＮ＊ＣＭＴ細胞クローンを用いて 同様の結果が得られた。

箋′−３つｊ　Ｙ′（−モヒ４〆　ミ→；ｔ　Ｂ　（コ＝〕）　ン１１丁考％／ 丁／　ミ、！与ヒ６９と シＮｄ０ Ｂ　２３７２０インスリノ一マ分別細胞７１抽出物抗原に対するＮＯＤ肝臓細胞 の増殖応答 Ｂ　２３７２０細胞質のＩ−（Ｐ　Ｅ　Ｃ画分ｔニア５Ｃｏ■ ＦＩＧ、　５ （ユ別　冷凋４〆ミ子 （ｔｎｃｂ）　ｙ　＜÷０６４・ Ｆｉｇ、　ＩＯＡ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　８ ８２８−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１００　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　７０５５ −２Ｊ／／（Ａ６１Ｋ　３９１００ ３９：３９５） （７２）発明者　パポースキイ、リサ アメリカ合衆国カリフォルニア州９４１１４サンフランシスコ・ジャーシイスト リート１６５エイ Ｉ （７２）発明者　ゲルバー、コハバ アメリカ合衆国カリフォルニア州９４０４０マウンテンビュウ・ディアーウツド コート

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．膵島β−細胞から単離することができ、約３０〜６０ｋｄの範囲のモノマー 分子量を有し、抗原提示細胞の存在下でＮＯＤネズミＴ−細胞の増殖を賦活する ことができる、精製され且つ単離された形態の抗原。
2. ２．ヒト膵島β−細胞膜から単離することができ、ＨＰＥＣにより決定される分 子量が約３７ｋｄ、４１ｋｄ又は５１ｋｄであるか、あるいは ネズミ膵島β−細胞膜から単離することができ、ゲル電気泳動により決定される 分子量が約３６ｋｄ、４２ｋｄ又は５５ｋｄである、請求の範囲１に記載の抗原 。
3. ３．抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ−コード糖タンパク質に結合 して複合体を形成し、該複合体がＮＯＤネズミＴ−細胞により認識されることを 特徴とする請求の範囲１に記載のタンパク質抗原のペプチドフラグメント、ある いは ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩ−コード糖タンパク質に結合して複合体を形成し、 該複合体がＮＯＤネズミＴ−細胞により認識されることを特徴とするその改変形 態。
4. ４．請求の範囲１に記載のタンパク質抗原をコードする、精製され、単離された 形態の組み換えＤＮＡ、あるいは宿主に適合性の調節配列に作用的に結合したコ ードＤＮＡを含み、宿主細胞に含まれた時にコードＤＮＡを発現することができ る発現系に含まれた、請求の範囲１に記載のタンパク質抗原をコードする組み換 えＤＮＡ。
5. ５．請求の範囲４に記載の発現系を含む組み換え宿主細胞。
6. ６．請求の範囲５に記載の細胞を該コードＤＮＡの発現を許す条件下で培養し、 細胞培養物からタンパク質を回収することを含む、膵島β−細胞から単離するこ とかでき、３０〜６０ｋｄの範囲のモノマー分子量を有し、抗原提示細胞の存在 下でＮＯＤネズミＴ−細胞の増殖を賦活することができる、Ｉ型糖尿病の治療及 び診断で有用なタンパク質の製造法。
7. ７．精製され、単離された形態であるか、あるいは実質的に赤血球を含まない組 成物中に含まれるか、あるいは実質的に血漿タンパク質を含まないか、あるいは モノクローナル抗体である、請求の範囲１に記載の抗原と特異的に免疫反応性の 抗体又はその免疫学的反応性フラグメント。
8. ８．患者から得たＴ−細胞を、Ｔ−細胞増殖アッセイの条件下で請求の範囲１に 記載の抗原と接触させ、該抗原の存在下で該Ｔ−細胞が増殖する能力を決定し、 このような条件下でそのＴ−細胞が増殖する患者をＩ型糖尿病を現していると同 定することを含む、Ｉ型糖尿病を現している患者の同定法。
9. ９．患者から得た血清又は血漿を、請求の範囲１に記載の抗原と免疫反応性の抗 体が複合体を形成する条件下で請求の範囲１に記載の抗原と接触させ、該複合体 の存在又は不在を検出し、該複合体を形成することができる血清又は血漿を与え る患者をＩ型糖尿病を現していると同定することを含む、Ｉ型糖尿病を現してい る患者の同定法。
10. １０．Ｉ型糖尿病の発現又は進行の予防において用いるための、非免疫原性形態 の請求の範囲１に記載の抗原、又は請求の範囲３に記載のペプチド。
11. １１．Ｉ型糖尿病の発現又は進行の予防において用いるための、免疫調節剤と組 み合わされた、非免疫原性形態の請求の範囲１に記載の抗原、又は請求の範囲３ に記載のペプチド。
12. １２．活性成分としての非免疫原性形態の請求の範囲１に記載の抗原、又は請求 の範囲３に記載のペプチドを、製薬学的に許容し得る賦形剤と混合して含み、場 合により免疫調節剤をさらに含む、Ｉ型糖尿病の発現又は進行の予防において有 用な製薬学的組成物。
13. １３．該免疫調節剤が抗−ＣＤ４抗体又はその免疫反応性フラグメントを含むこ とを特徴とする請求の範囲１２に記載の組成物。
14. １４．請求の範囲１に記載の抗原に応答性のＴ−細胞が濃縮された、赤血球を含 まない組成物。