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DE3687064T2 - Verfahren zur identifizierung von mit gesteigerter diabetesgefahr assoziierten allelen. - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von mit gesteigerter diabetesgefahr assoziierten allelen.

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DE3687064T2
DE3687064T2 DE86904014T DE3687064T DE3687064T2 DE 3687064 T2 DE3687064 T2 DE 3687064T2 DE 86904014 T DE86904014 T DE 86904014T DE 3687064 T DE3687064 T DE 3687064T DE 3687064 T2 DE3687064 T2 DE 3687064T2
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dqw
hla
antibody
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T Nepom
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Bristol Myers Squibb Co
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Description

    Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Erkrankung, die als insulinabhängiger Diabetes mellitus bekannt ist, und genauer gesagt Verfahren zur Identifizierung von Individuen mit gesteigerten Diabetesrisiko.
    • Hintergrund
  • Diabetes mellitus ist ein komplexes Syndrom (oder Syndrome), das gekennzeichnet ist durch Hyperglykämie, Verdickung der Basalmembran der Kapillargefäße und eine Vielzahl von Spätkomplikationen, einschließlich beschleunigter Ateriosklerose, Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie. (Parker, Clinical Immunology, V.II, 1980). Diabetes kann irgendeines oder alle der obigen Syndrome einschließen und befällt etwa 2% der US-Bevölkerung. Etwa 1 von 4 dieser Fälle ist insulinabhängig, bezeichnet als IDDM, und tritt üblicherweise bei Personen mit einem Alter von unter 30 auf, mit dem schnellen Auftreten von Glucose-Intoleranz.
  • Obgleich es allgemein anerkannt ist, daß erbliche Faktoren in der Ätiologie von Diabetes wichtig sind, sind die betroffenen exakten genetischen Mechanismen nicht verstanden. Die Suche nach einen genetischen Marker für Diabetes-Anfälligkeit für Diabetes waren bis 1973-74 unfruchtbar gewesen, als Forscher zuerst die Aufmerksamkeit auf die Beziehung zwischen Diabetes und dem Histokompatibilitätskomplex im Menschen, genannt HLA, lenkten.
  • Die HLA-Antigene sind durch vier Stellen auf Chromoson Sechs kodiert, bezeichnet als A, B, C und D. Die meisten Assoziationen zwischen HLA und Erkrankungsanfälligkeit haben die D-Region von HLA betroffen. Diese Stelle wurde ursprünglich als nicht-passende genetische Region definiert, an der Stimulation zu einer in einer Richtung ablaufenden gemischten Lymphocyt-Reaktion (MLR) führte. Human-Ia-Antigene Kartieren zu der HLA-D-Region. Diese scheinen durch wenigstens 3 verschiedene Stellen kodiert zu werden, DR, DQ und DP, jede mit ihren verschiedenen Alpha- und Beta-Ketten.
  • Jede HLA-DR-Alloantigenspezifität (DR1-w14) repräsentiert ein serologisch definiertes Reaktionsmuster zwischen gut charakterisierten Antiseren und Molekülen der Klasse II des Haupthistokompatiblitätskomplexes (MHC). Demgemäß entspricht jede Spezifität einem bestimmten, von einem Alloantiserum erkannten Epitop, das auf HLA-D-kodierten Zelloberflächenmolekülen vorhanden ist.
  • Unter den HLA-Spezifitäten ist HLA-DR4 die interessanteste. Es ist festgestellt worden, daß dieses Antigen häufiger in Patienten mit Erwachsenen-Rheumatoidarthritis, insulinabhängigem Diabetes und einigen Formen von Juvenil-Rheumatoidarthritis auftritt als in der allgemeinen Bevölkerung. Die Analyse der Beziehung zwischen HLA-DR-Spezifitäten und einzelnen Klasse-II-Molekülen, exprimiert auf homozygoten Typisierungs-Zellen, hat jedoch gezeigt, daß strukturell verschiedene Moleküle serologisch ununterscheidbar sein können. Die Implikation dieses Befundes ist, daß das, was DR4&spplus;-Zellen gemeinsam haben, das DR4-Epitop ist, getragen von wenigstens einem ihrer D-Region-Genprodukte, das mit dem DR4-Alloantiserum reagiert, um eine positive Typisierungsreaktion zu ergeben. Über dieses kreuzreaktive Epitop hinaus besitzt jedoch jeder Zellcluster eine einzigartige Sammlung von Klasse-II-Antigenen, so daß "DR4" mehrere verschiedene Haplotypen umfaßt. Wenn spezifische Haplotypen für HLA-Assoziationen mit Erkrankung verantwortlich sind, dann ist die serologische HLA-Spezifität allein kein ausreichend spezifischer Marker, um Erkrankungsrisiko optimal vorherzusagen.
  • Restriktionsendonukleaseverdauung genomischer DNA kann verwendet werden, um spezifische Nukleotidsequenzen zu identifizieren, deren Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein als Marker für individuelle Gene oder Gensegmente funktionieren kann. Fragmente, die an eine einzelne Sonde hybridisieren, können manchmal spezifischen Genen zugeschrieben werden. Wenn solch ein Fragment in verschiedenen Individuen variabel exprimiert wird, wird es als "polymorph" bezeichnet und kann potentiell funktionelle Unterschiede betreffen.
  • Forscher haben kürzlich von einer großen Anzahl von Restriktionsendonukleasefragment-Polymorphismen (RFLP) berichtet, die einige Korrelation mit Diabetes zeigen und an die DQβ-Sonden hybridisieren. (Cohen-Haguenauer et al., PNAS 82: 3335-3339, 1985; Owerbach et al., Nature 303: 815-817, 1983). Ein Genompolymorphismus der DQw3-Spezifität ist bestimmt worden, gekennzeichnet durch variable BamHI- und HindIII-Erkennungsstellen (Kim et al., PNAS 85: 8139-8143).
  • Trotz dieser Fortschritte im Verständnis der genetischen Mechanismen, die bei Diabetes-Anfälligkeit betroffen sind, wird die Erkrankung gegenwärtig auf der Grundlage von klinischer Präsentation und Labortests diagnostiziert. Die klinische Präsentation kann in Bereich vom Offensichtlichen bis zum Verwirrenden liegen, in Abhängigkeit von den Symptomen, die zuerst auftreten. Labortests, die auf der Messung von Glucose und Insulin und seinen Vorläufern im Blut von Patienten, vor und nach Herausforderung des Patienten mit Glucose selbst, beruhen, sind diagnostisch. Bisher ist die klinische Fähigkeit, Individuen vor dem Auftreten von Symptomen zu identifizieren, die ein erhöhtes Diabetesrisiko besitzen, in der Technik auffallend nicht-vorhanden gewesen.
  • Die Fähigkeit, Individuen mit erhöhtem Diabetesrisiko zu identifizieren, könnte mehrere wichtige Anwendungen besitzen. Sie könnte in Familien von Individuen mit bekannter Diabetes verwendet werden, um vorherzusagen, welche anderen Familienmitglieder gefährdet sind. Zweitens könnte sie bei Individuen verwendet werden, die diabetische Symptome in Zusammenhang mit anderen komplexeren Erkrankungen zeigen, in einem Versuch zu identifizieren, ob die Individuen "traditionelle" Diabetes haben, die konventionell behandelt werden kann. Sollte schließlich die Identifizierung eines Risikofaktors für IDDM genügend Vorhersagewert besitzen, kann vorhergesagt werden, daß die Kliniker sie in einem Screeningtest verwenden würden, um Individuen mit erhöhtem Risiko für diese Krankheit zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verfügung, die dieses Bedürfnis in der Technik, Individuen mit erhöhtem Diabetesrisiko zu identifizieren, befriedigt und stellt darüber hinaus andere verwandte Vorteile zur Verfügung.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren zu Identifizierung von Individuen mit gesteigertem Diabetesrisiko. Gemäß einen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen in einer Zellkonzentrierung zur Verfügung gestellt, umfassend:
  • Inkubieren eines ersten monoklonalen Antikörpers mit einem Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter erster monoklonarer Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragment, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt, wobei besagte Fragmente mit einer DNA-Sonde nachweisbar sind, die im wesentlichen mit einem Fragment des DQβ&sub2;-Gens des menschlichen Histokompabilitätskomplexes homolog ist,
  • Inkubieren eines zweiten monoklonalen Antikörpers mit einem separaten Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter zweiter monoklonaler Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
  • Nachweisen des Vorhandenseins von Immunkomplexen, die zwischen besagtem ersten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen und besagtem zweiten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen gebildet sind; und
  • Bestimmung aus den Ergebnissen des Nachweisschrittes, ob der mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierte DQw3.2-Haplotyp vorliegt.
  • Die ersten und zweiten monoklonalen Antikörper können markiert sein, wobei geeignete Markierungen Enzyme, Fluorophore, Radioisotope oder Lumineszere einschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist der erste MAb P100.1 und der zweite MAb ist mit A10, wobei positive Reaktivität mit P100.1 und negative Reaktivität A10 das Vorhandensein eines mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten Haplotyps anzeigt.
  • Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen einer Zellkonzentrierung zur Verfügung gestellt, umfassend:
  • Inkubieren eines ersten monoklonalen Antikörpers in einem Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter erster monoklonaler Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BAmHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
  • Inkubieren eines zweiten monoklonalen Antikörpers mit einem separaten Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter zweiter monoklonaler Antikörper mit Zellinien reaktiv, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamhI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) ein 12 kb-Fragment umfaßt
  • Nachweisen des Vorhandenseins von Immunkomplexen, die zwischen besagtem ersten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen und besagtem zweiten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen gebildet sind; und
  • Bestimmung aus den Ergebnissen des Nachweisschrittes, ob der mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierte DQw-3.2-Haplotyp vorhanden ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist der erste MAb P100.1 und der zweite MAb ist GS200.1, wobei positive Reaktivität sowohl mit P100.1 als auch mit GS200.1 das Vorhandensein eines mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten Haplotyps anzeigt.
  • Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein in-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Abhängigkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen in einer Zellkonzentrierung zur Verfügung gestellt, umfassend:
  • Beschichten eines Teils einer Oberfläche einer festen Phase mit einem ersten monoklonaren Antikörper, wobei besagter erste monoklonare Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
  • Beschichten eines separaten Teils besagter Oberfläche einer festen Phase mit einem zweiten monoklonalen Antikörper, wobei besagter zweiter monoklonaler Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
  • Zur-Reaktion-Bringen besagter Zellkonzentrierung mit beiden Teilen besagter Oberfläche, und
  • Nachweisen des Vorhandenseins von Zellen, die an besagte Teile der Oberfläche gebunden sind, und daraus Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit besagter Haplotypen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wie sie in diesem Verfahren verwendet wird, wird die Sonde umfaßt von der Sequenz GGAGCCCACAGTGACCATC.
  • Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beiliegenden Zeichnungen deutlich werden.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Fig. 1 ist ein Schema, das die Genom-Stelle zeigt, von der die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Sonden abgeleitet wurden.
  • Fig. 2 veranschaulicht die Strukturunterschiede zwischen DQw-3.1 und DQw-3.2 bei DQβ&sub2;.
  • Fig. 3 zeigt das Hybridisierungsmuster von Restriktionsfragmenten, die aus der DNA von diabetischen und nicht-diabetischen Individuen erzeugt sind.
    • Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung
  • Innerhalb der vorliegenden Erfindung haben die Anmelder festgestellt, daß es mehrere verschiedene DQ-Allele in DR4&spplus;-Haplotypen gibt und daß spezifische Haplotypen eher als die serologischen Marker Erkrankungsanfälligkeit identifizieren.
  • Eines der DQβ-Gene, bezeichnet als "DQβ&sub1;", ist unter Individuen mit ähnlichen DQ-serologischen Typisierungsspezifitäten relativ nicht-polymorph. Die andere DQ-Stelle, bezeichnet als "DQβ&sub2;", ist polymorph unter Individuen, die bei Verwendung herkömmlicher Typisierungsseren serologisch nicht-unterscheidbar sind. Zwei stabile DQβ&sub2;-Allelvarianten existieren, die Polypeptide kodieren, die DQw3-Spezifitäten tragen. Diese DQβ2-Allelvarianten unterscheiden sich voneinander über einen großen Teil ihrer Genom-DNA, wie durch Restriktionskartierung unter Verwendung einer synthetischen Oligonucleotid-Sonde, die für das β2-Exon spezifisch ist, ermittelt wurde.
  • Analyse von 17 nicht-verwandten HLA-DR4&spplus;-IDDM-Patienten auf Genom-DQβ-Polymorphismen zeigt in 16 ein charakteristisches RFLP-Muster für eine dieser spezifischen DQβ&sub2; Allelvarianten und nicht für die andere. Diese Variante, bezeichnet als "DQw3.2" dient daher als ein spezifischer Genom-Marker für DQβ&sub2;-Gene auf die DR4-serologische Spezifität tragenden Haplotypen, die mit IDDM assoziiert sind. Diese spezifische Variante schließt etwas RFLP ein, wie etwa ein 12,0 Kb BamHI- und ein 1,9 Kb TaqI-DQβ-Fragment, die von anderen Forschern bei Patienten mit Diabetes beobachtet wurden, wie oben angegeben.
  • Durch das Kartieren solcher Nukleotidvariation auf eine spezifische Region eines exprimierten DQβ-Gens haben die Anmelder dieses Genprodukt oder ein nah damit verbundenes Produkt mit Krankheitsanfälligkeit in Verbindung gebracht. Die DQw3.2-Variante identifiziert einen spezifischen allelischen Polymorphismus an einem Genlokus.
  • Die vorliegende Erfindung stellt durch die Entdeckung der DQw3.2-Variante grundlegende Verfahren zur Identifizierung von Individuen mit gesteigertem Diabetesrisiko zur Verfügung. Sie umfassen den serologischen Nachweis des DQw-3.2-Allels.
    • A. Verwendung einer markierten Sonde bei der Analyse des RFLP von DQw3.2
  • Wie oben angegeben, unterscheiden sich die zwei DQβ&sub2;-Allelvarianten voneinander über einen großen Teil ihrer Genom-DNA. Sechs verschiedene Restriktionsendonukleasen, einschließlich Bam HI, Puv II, Hind III, Xba I, Taq I und Sst I, sind alle in der Lage diese Allel-Unterschiede zu erkennen.
  • Nach Reinigung von DNA aus einem interessierenden Individuum kann Verdauung mit einer der oben angegebenen Restriktionsendonukleasen durchgeführt werden. Im Anschluß an die Verdauung werden Proben auf Agarosegelen in Tris-Acetat-EDTA-Puffer einer Elektrophorese unterworfen. Anschließend an die Elektrophorese werden die Gele auf einem Vakuum-Geltrockner getrocknet und die getrockneten Gele in Gegenwart radioaktiv markierter Sonden-DNA in einen Polyethylenbeutel eingebracht. Alternativ könne Southern-Blot-Verfahren verwendet werden, in denen die Gele auf derivatisierte Nitrocellulose- oder Nylon-Membranen übertragen werden. Solche Membranen können dann wahlweise UV-bestrahlt werden und können mit Lösungen, die nicht-radioaktive PNA oder DNA enthalten, vor der Hybridisierung mit markierter Sonden-DNA vorhybridisiert werden. Die Sequenz der verwendeten Oligonukleotidsonden ist in Fig. 1 dargestellt. Wie in Fig. 1 gezeigt, schließen bevorzugte Sequenzen
  • (a) GGAGCCCACAGTGACCATC; und
  • (b) GGACCCCACAGTGACCATCTCCCCATCCAGGACAGAGGCCCTCAAC ein.
  • Die Sonde kann mit einem Radioisotop oder einem Enzym markiert sein. Geeignete Radioisotope schließen ³²P, ³H oder ³&sup5;S ein. Wo die Markierung ein Enzym ist, kann das Enzym direkt an die Sonde oder indirekt über eine Avidin-Biotin-Brücke konjugiert sein (Singer & Ward, PNAS 79: 7331; Pengolizzi et. al., in Advances in Gene Technology: Human Genetic Disorders, Hrg. F.
  • Ahmad). Hybridisierung wird durch Zugabe des (der) geeigneten Substrats (Substrate), Kofaktors (Kofaktoren) und/oder Chromogens (Chromogene) für das Enzym nachgewiesen.
  • Nachdem die Sonden-DNA synthetisiert ist, kann sie mit z. B. P32 markiert werden. In dieser Austauschreaktion wird ein P32 am 5'-Ende des Oligonukleotids bereitgestellt. Das markierte Oligonukleotid wird in geeigneter Weise verdünnt und mit dem getrockneten Gel im Polyethylenbeutel unter Bedingungen, die Hybridisierung begünstigen, inkubiert. Nach ausreichender Zeit wird das getrocknete Gel entfernt, gewaschen und anschließend einem Röntgenfilm ausgesetzt, um durch Audioradiographie das Vorhandensein von Hybridisierungsbanden festzustellen. Die Größe der Hybridisierungsfragmente wird dann relativ zu Molekulargewichtstandards geschätzt.
  • Unter Bezugnahme jetzt auf Fig. 2 kann man sehen, daß das Vorhandensein des DQw3.2-Allels vom Vorhandensein des DQw3.1-Allels durch das Auftreten einer 3,2 Kb-Bande und die Abwesenheit einer 3,4 Kb-Bande unterschieden werden kann, wenn die gereinigte DNA mit Hind 111 verdaut wird.
  • Alternativ kann, wenn die Restriktionsendonuklease BamHI verwendet wird, DQw3.2 von DQw3.1 durch das Auftreten einer 12,0 Kb-Rande und die Abwesenheit von 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Banden unterschieden werden. Vergleichbare Unterschiede können identifiziert werden, wenn die anderen oben beschriebenen Restriktionsendonukleasen verwendet werden, wie folgt
    • B. Serologischer Nachweis des DOw-3.2-Allels
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens der vorliegenden Erfindung könne drei monoklonale Antikörper, bezeichnet als P100.1, A10 und in GS200.1, verwendet werden, um das DQw-3.2-Allel zu identifizieren. Antikörper P100.1 und GS200.1 sind monoklonale Antikörper, die durch Fusion von Mäusemilzzellen, immunisiert mit humanen lympholastenartigen Zellinien, mit dem Myelom NS-1 gezüchtet sind, um Hybridome zu liefern, die monoklalen Antikörper sekretieren. Antikörper P100.1 ist gegen ein Epitop gerichtet, das mit der HLA-DQw3-Spezifität assoziiert ist, während Antikörper GS200.1 ein Epitop nachweist, das mit DQw-3.2 assoziiert ist. Antikörper P100.1 bildet einen Teil der Grundlage für die EP-A-0 204 522 und ist bei der ATCC unter Zugangsnummer HB-8822 hinterlegt worden. Antikörper GS200.1 ist bei der ATCC unter der Zugangsnummer HB-9111 hinterlegt worden. Antikörper A10 ist ein monoklonaler Mäuseantikörper, erhältlich von Dr. Hiroo Maeda, Tokyo, Blood Transfusion Service, Tokyo Japan. Die Verwendung und Charakterisierung dieses Antikörpers beim Screenen von HLA-typisierten Populationen ist beschrieben worden (Bodmer et al., Histocompability Testing 1984, Hrg. Albert, Baur and Mayr (Springer-Verlag, Berlin) S. 217-236; Maeda, H., Tissue Antigens 23: 163-170, 1984)
  • Die oben beschriebenen Antikörper können in Zytotoxizitäts-Tests verwendet werden und auch in Bindungstest, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ELISA, Micro-ELISA, wie identifiziert in EP-A-0 204 522, und Fluoreszenz- und Radioimmun-Tests. In irgendeinen dieser Formate werden Zellen von einem Individuum oder einem Patienten mit den Antikörpern separat vermischt, gefolgt von dem Nachweisverfahren (ob nun Isotop, Fluoreszenz, Chromogen oder Komplement), und dann auf Reaktivität analysiert. Positive Reaktivität mit P100.1 und negative Reaktivität mit A10 liefert die Identifizierung und Diagnose des DQw3.2-Allels. Reaktivität mit P100.1 und A10 liefert die Diagnose des DQw-3.1-Allels. Nicht-Reaktivität mit P100.1 und A10 liefert Ausschluß sowohl von DQw3.1- als auch von 3.2-Allelen.
  • Alternativ können die Antikörper auf separate Teile einer Oberfläche einer festen Phase, wie etwa Kunststoff oder Filterpapier, aufgetragen werden und die Oberfläche der Zellen von einem interessierenden Individuum zur Reaktion gebracht werden. Die Oberfläche wird dann gewaschen, um nicht-gebundene Zellen zu entfernen, und die gebundenen Zellen werden durch Anfärben entweder mit einer Proteinfarbe, wie etwa Coomassie-Blau, oder mit einem zweiten markierten Antikörper sichtbar gemacht.
  • Um die Beispiele, die Folgen, zusammenzufassen, zeigt Beispiel I die Verwendung einer markierten Sonde in der Analyse des RFLP von DQw3.2. Beispiel II zeigt den serologischen Nachweis des DQw3. 2-Allels.
  • Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Voranschaulichung vorgelegt.
    • BEISPIELE BEISPIEL I VERWENDUNG EINER MARKIERTEN SONDE IN DER ANALYSE DES RFLP VON DQW3. 2 Homozygote Zellinien (HCL):
  • EBV-transformierte β-lymphoblastenartige Zellinien wurden aus HLA-D homozygoten Donoren hergestellt, um homozygote Zellinien (HCL) zu liefern, wie im Detail von Nepom et al. (PNAS 80: 6962-6966, 1980) beschrieben. Achtzehn DR4-positive, drei DR5-positive, eine DRw12-positive, zwei DR8-positive, eine DR9-positive und eine DR7-positive HCL wurden verwendet und sind in Tabelle 1 aufgelistet. Jeder dieser HCLs war auch HLA-DQw3-positiv.
    • Verdauung von Genom-DNA:
  • Restriktionsendonuklease-Verdauung zellulärer DNA wurde bei 37ºC mit zwei oder mehr Einheiten Bam HI oder Hind II (Bethesda Research Laboratories) pro ug DNA für 18 Stunden durchgeführt. Die Verdauung wurde mit Minigel-Analyse sowohl des Genom-Verdauungsprodukts als auch der Lambda-DNA, zu der ein aliquoter Teil der Genomverdauungsmischung zugesetzt worden war, auf Vervollständigung überwacht. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Die DNA-Verdauungsprodukte wurden durch Zugabe von 2/3 Volumenteilen 5 M Ammoniumacetat und 2 Volumenteile Ethanol konzentriert. Nach 30minütigem Abkühlen in einem Trockeneis/Methanol-Bad wurde die DNA in einer Mikrofuge für 8 min. pelletiert. Die Pellets wurden in TE (10 mm Tris-HCl, ImM EDTA) resuspendiert.
    • Southern-Blotting:
  • Mit Restriktrionsendonuklease verdaute DNA (12 ug/Spur) wurde auf 0,7% Agarosegele in Tris-Acetat-EDTA-Puffer aufgebracht. Lambda-DNA, verdaut mit Hind III, und X174 DNA, verdaut mit Hyae III (Bethesda Research Laboratories), wurden als Molekulargewichtsmarker einbezogen. Man ließ die Gele bei 1,5 Volt pro Zentimeter für 17 Stunden laufen, dann wurden sie mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Gele wurden 15 min in 0,25 N HCl getränkt, gefolgt von Behandlung mit 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl für eine Stunde, um die DNA zu denaturieren. Die Gene wurden durch einstündiges Tränken in 0,5 M Tris, 3,0 M NaCl, pH 7,0, neutralisiert. Die Gele wurden dann auf einem Vakuum-Geltrockner bei 65ºC getrocknet. Das getrocknete Gel wurde dann in Gegenwart einer radioaktiv markierten DNA-Sonde in einen Polyethylenbeutel eingebracht.
    • Synthese und Markierung einer Oligonukleotidsonde:
  • Eine DNA-Sonde wurde als DQ46 auf einen Applied Biosystems Instrument gemäß den Spezifikationen des Herstellers synthetisiert. DQ46 wurde unter Verwendung des Polynukleotid-Kinase-Markierungsverfahren, beschrieben bei Maniatis et al. (Miniatis, et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Laboratory, 1982), markiert. In dieser Austauschreaktion wurde ein P32 am 5'-Ende des Polynukleotids bereitgestellt.
    • Hybridisierung:
  • 3·10&sup7; bis 5·10&sup7; cpms markiertes Oligonukleotid wurden in 15-20 ml 6X SSC verdünnt und mit dem getrockneten Gel in seinem Polyethylenbeutel für 48 Stunden bei 42ºC inkubiert. Das getrocknete Gel wurde dann entfernt, dreimal bei Raumtemperatur in 2X SSC, 0,1% SDS für 5 Minuten pro Waschung, und zweimal bei 62ºC in 2X SSC, 0,1% SDS für 20 Minuten pro Waschung gewaschen. Das getrocknete Gel wurde dann einem Röntgenfilm ausgesetzt, um durch Autoradiographie das Vorhandensein von Hybridisierungsbanden festzustellen (Fig. 3).
  • Wie in den Fig. 2 und 3 gezeigt, ist bei Verwendung der Restriktionsendonuklease Hind 111 das Vorhandensein einer 3,2 Kb-Bande in Abwesenheit einer 3,4 Kb-Bande ausreichend, um das Vorhandensein von DQw3.2 festzustellen.
    • BEISPIEL II SEROLOGISCHER NACHWEIS DES DQW-3.2-ALLELS
  • Es gibt drei allgemeine Arten von Test, die verwendet werden, um humane Lymphozyten auf HLA-Antigenexpression zu typisieren. Die erste und die gegenwärtig am häufigsten verwendete ist komplementabhängige Lyse. Die zweite sind Tests, die die Bindung von Antikörper an Lymphozyten durch enzymverknüpften Immuntest (ELISA) messen Elemente des ersten Verfahrens sind mit Standardformat-ELISA kombiniert worden, um einen für die HLA-Typisierung geeigneten Mikro-ELISA zu entwickeln. Die dritte verwendet ein fluoreszierende Verbindung, um die Bindung von Antikörper an Lymphozyten zu messen.
  • Die Mikro-ELISA-Methode wird im Detail beschrieben werden und die anderen Methoden in Kürze, als Veranschaulichungen für die Verwendung dieser Methoden.
    • Enzymverknüpfter immunabsorbierender Mikrotest (ELISA) um die Bindung monoklonaler Antikör er an HLA-Antigene nachzuweisen die DQw3.2 bestimmen.
  • Terasaki-Mikroplatten wurden durch Zugabe zu jeder Vertiefung von 5 ul einer 1 ug/ml-Lösung Poly-L-Lysin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. Die Platten wurden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert und mit PBS durch Eintauchen und Dekantieren gewaschen. Humane Leukozyten wurden in jede Vertiefung verteilt, 1 ul einer Suspension von 1 bis 5·10&sup6; Zellen pro ml RPMI-1640-Medium ohne Serum. Die Platten wurden bei 90 xg für 3 Minuten zentrifugiert. Eine Lösung von 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit 0,2% Azid wurde zu den Platten zugegeben, die bei 4ºC für 1 bis 48 Stunden gelagert wurden: Vor Zugabe des Antikörpers wurden die Platten dreimal gewaschen.
  • In dem indirekten Test wurden monoklonale Antikörper und Kontrollverbindungen zu separaten Vertiefungen zugegeben, 1 ul pro Vertiefung. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten fünfmal gewaschen und eine Lösung des F(ab')&sub2;-Fragments von Anti-Immunglobulin, gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), wurde zugegeben, 5 ul pro Vertiefung. Die Platten wurden dann bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten inkubiert. Im direkten Test wurde HRP an den monoklonalen Antikörper gekoppelt; der zweite Schritt ist also nicht notwendig. An HRP gekoppelte Antikörper wurden in einer Lösung von 0,1% BSA in PBS ohne Azid verdünnt.
  • Nach Behandlung mit Antikörper wurden die Platten fünfmal gewaschen. Das Vorhandensein von HRP-Antikörper-Komplexen in den Vertiefungen wurde durch die Zugabe einer Lösung von Substrat (Wasserstoffperoxid) und Chromogen (OPD, Organon Diagnostics, West Orange, NJ) oder ABTS (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, NJ) in 0,1 M Natriumcitrat/0,2 M Natriumphosphat sichtbar gemacht. Farbveränderung in den Vertiefungen nach 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur zeigte die Bindung von monoklonalem Antikörper an Leukozyten in diesen Vertiefungen an.
  • Reaktivität mit P100.1 und keine Reaktivität mit A10 wies das DQw3.2-Allel nach und definierte es. Alternativ wies Reaktivität mit P100.1 und Reaktivität mit GS200.1 das DQw3.2.-Allel nach und definierte es.
    • Nachweis der DQw3.2-Spezifität unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, markiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters (FACS)
  • Aus Asziten isolierter monoklonaler Antikörper wurde an FITC gemäß dem Verfahren von Goding (Goding, J. Immunol. Methods 13: 215, 1976) konjugiert. Zu analysierende Zellen wurden mit sättigenden Mengen von FITC-konjugiertem Antikörper vermischt und für 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Behandelte Zellen wurden gewaschen und die Menge an gebundenem Antikörper durch Vergleichen der Fluoreszenzintensität (mittlerer Wert größter statistischer Häufigkeit) von Zellen, die mit Test- und Kontroll-Antikörper inkubiert worden waren, auf einem FACS IV (Becton-Dickinson), ausgestattet mit einem log-Verstärker, bestimmt.
    • Nachweis der DQw3.2-Spezifität unter Verwendung eines komplementvermittelten Microzytotoxizitätstest
  • Im direkten Test wurden humane Leukozyten, 10³-10&sup4;, in jede Vertiefung einer Terasaki-Mikroplatte verteilt, 1 ul monoklonale Antikörper und Kontrollverbindungen wurden zugegeben und für 1 Stunde inkubiert. Heterologes (Kaninchen oder Meerschweinchen) Komplement wurde dann zugegeben. Nach Inkubation für 1 Stunde wurde der Anteil von Zellen, der durch die Kombination von spezifischen Antikörper und komplement abgetötet worden war, durch Eosin-Farbstoffaufnahme bestimmt und visuell durch ein Mikroskop abgelesen. Alternativ kann der Anteil von abgetöteten Zellen radiometrisch oder photometrisch durch Freisetzung von gebundenem Liganden bestimmt werden. Lyse von < 50% Zellen ist Nachweis für positive Reaktivität. Im indirekten Test werden Leukozyten und Antikörper zugegeben, wie oben für den direkten Test beschrieben. Heterologer Antikörper gegen Mäuse-Immunglobulin wird vor Zugabe von Komplement zugegeben. Der Anteil von abgetöteten Zellen wird bestimmt, wie oben für den direkten Test beschrieben. Reaktivität von P100.1, aber nicht von A10 ist Beweis für Vorhandensein von DQw3.2. Alternativ ist Reaktivität von P100.1 und GS200.1 auch Beweis für das Vorhandensein von DQw3.2.
  • Tabelle 1 und Tabelle 2 veranschaulichen die Ergebnisse von DQw3.2-Bestimmungen in einer Population von homozygoten Typisierungszellen und in einer diabetischen (IDDM) Population. Tabelle 1 Genomische und serologische polymorphe Varianten unter HLS-DOw3-Zellinien, die für HLA-D homozygot sind Monoklonaler Antikörper Reaktivität WALK, obgleich homozygot für HLA-D, ist heterozygot für die DOw-3.1- und DOw-3.2-Allele Tabelle 2 Anstieg von DQw3.2 unter HLA-DR4-Diabetikern, verglichen mit Nicht-Diabetiker DR4-Diabetiker DRB4-Nicht-Diabetiker

Claims (19)

1. In-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen in einer Zellkonzentrierung, umfassend:
Inkubieren eines ersten monoklonalen Antikörpers mit einem Teil besagter- Zellkonzentrierung, wobei besagter erste monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt, wobei besagte Fragmente mit einer DNA-Sonde nachweisbar sind, die im wesentlichen mit einem Fragment des DQ&beta;&sub2;-Gens des menschlichen Histokompabilitätskomplexes homolog ist,
Inkubieren eines zweiten monoklonalen Antikörpers mit einem separaten Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter zweite monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragnentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
Nachweisen des Vorhandenseins von Immunkomplexen, die zwischen besagten ersten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen und besagten zweiten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen gebildet sind; und
Bestimmung aus den Ergebnissen des Nachweisschrittes, ob der mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierte DQw-3.2-Haplotyp vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erste monoklonale Antikörper P100.1 ist, hinterlegt bei der ATCC unter Zugangsnummer HB-8822.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagter zweite monoklonale Antikörper A10 ist, wie in der Beschreibung definiert.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erste und besagter zweite monoklonale Antikörper markiert sind.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung ausgewählt ist aus Enzymen, Fluorophoren, Radioisotopen oder Lumineszeren.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweisschritt durch Enzymreaktion, Fluoreszens- oder Lumineszens-Emission oder Zell-Lyse erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß positive Reaktivität mit besagtem ersten monoklonalen Antikörper und negative Reaktivität mit besagtem zweiten Antikörper das Vorhandensein des DQw-3.2-Allels bedeutet.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß positive Reaktivität mit besagtem ersten monoklonalen Antikörper und positive Reaktivität mit besagtem zweiten Antikörper das Vorhandensein des DQw-3.1-Allels bedeutet.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß negative Reaktivität mit besagtem ersten monoklonalen Antikörper und negative Reaktivität mit besagtem zweiten monoklonalen Antikörper die Abwesenheit sowohl des DQw-3.1- als auch des DQw-3.2-Allels bedeutet.
10. In-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen in einer Zellkonzentrierung, umfassend:
Inkubieren eines ersten monoklonalen Antikörpers mit einem Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter erste monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt, wobei besagte Fragmente mit einer DNA-Sonde nachweisbar sind, die im wesentlichen mit einem Fragment des DQ&beta;&sub2;-Gens des menschlichen Histokompatibilitätskomplexes homolog ist,
Inkubieren eines zweiten monoklonalen Antikörpers mit einem separaten Teil besagter Zellkonzentrierung, wobei besagter zweite monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) ein 12 Kb-Fragment umfaßt,
Nachweisen des Vorhandenseins von Immunkomplexen, die zwischen besagten ersten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen und besagten zweiten monoklonalen Antikörper und besagten Zellen gebildet sind; und
Bestimmung aus den Ergebnissen des Nachweisschrittes, ob der mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierte DQw-3.2-Haplotyp vorhanden ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erste monoklonale Antikörper P100.1 ist, hinterlegt bei ATCC unter Zugangsnummer HB-8822.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß besagter zweite monoklonale Antikörper GS200.1 ist, hinterlegt bei der ATCC unter Zugangsnummer HB-9111.
13. Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß besagter erste und zweite monoklonaler Antikörper markiert sind.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Markierung ausgewählt ist aus Enzymen, Fluorophoren, Radioisotopen oder Lumineszeren.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweisschritt durch Enzymreaktion, Fluoreszens- oder Lumineszens-Emission oder Zell-Lyse erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß positive Reaktivität mit besagten ersten monoklonalen Antikörper und negative Reaktivität mit besagtem zweiten Antikörper das Vorhandensein des DQw-3.1-Allels bedeutet.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß positive Reaktivität mit besagtem ersten monoklonalen Antikörper und positive Reaktivität mit besagtem zweiten Antikörper das Vorhandensein des DQw-3.2-Allels bedeutet.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß negative Reaktivität mit besagtem ersten monoklonalen Antikörper und negative Reaktivität mit besagtem zweiten monoklonalen Antikörper die Abwesenheit sowohl des DQw-3.1- als auch des DQw-3.2-Allels bedeutet.
19. In-vitro-Verfahren zur Identifizierung verschiedener DQ-Allele in mit Anfälligkeit für Diabetes assoziierten DR4&spplus;-Haplotypen in einer Zellkonzentrierung, umfassend:
Beschichten eines Teils einer Oberfläche einer festen Phase mit einem ersten monoklonalen Antikörper, wobei besagter erste monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente, (b) ein 12 Kb-Fragment oder (c) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
Beschichten eines separaten Teils besagter Oberfläche einer festen Phase mit einem zweiten monoklonalen Antikörper, wobei besagter zweite monoklonale Antikörper mit Zellinien reaktiv ist, die homozygot sind für HLA-D, mit einem BamHI-Restriktionsendonukleasefragmentmuster, das (a) 12 Kb-, 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente oder (b) 6,9 Kb- und 3,7 Kb-Fragmente umfaßt,
Zur-Reaktion-Bringen besagter Zellkonzentrierung mit beiden Teilen besagter Oberfläche, und
Nachweisen des Vorhandenseins von Zellen, die an besagte Teile der Oberfläche gebunden sind, und daraus Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit besagter Haplotypen.
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