NO301768B1

NO301768B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type <beta> (TGF-<beta>)-lignende protein

Info

Publication number: NO301768B1
Application number: NO905264A
Authority: NO
Inventors: Nico Cerletti; Gary Kent Mcmaster; David Cox; Albert Schmitz; Bernd Meyhack
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1989-12-06
Filing date: 1990-12-05
Publication date: 1997-12-08
Also published as: US5922846A; NO905264D0; MX172600B; CA2031430A1; EP0891985A1; PT96068A; US5650494A; AU638075B2; GB8927546D0; CA2031430C; FI103278B1; IL96549A0; IL96549A; IE990992A1; EP0433225A1; ZA909762B; FI905956A0; AU6701890A; PH31649A; KR100203230B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktive, dimere, TGF-6(transformerende vekstfaktor type 6) . TGF-B produsert ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å fremme og aksellerere leging av sår og ben- og vevsreparering, behandling av cancer, som et benmargsbeskyttende middel, formidler av hjertebeskyttelse , antibetennelsesmiddel eller immun-suppresivt middel eller som en vekstregulator i pattedyr-cellekulturer.

To vekstmodulerende proteiner er opprinnelig blittkarakterisert vedderes evne til reversibelt å indusere fenotypisk transformasjon av pattedyrceller in vitro og er dermed blitt betegnet som transformerende vekstfaktorer type a og type6(Anzano, M.A. et al. (1983) PNAS 80, 6264-6268). Til tross for deres felles nomenklatur er TGF-a og TGF-B blitt vist å være både strukturelt og funksjonelt helt distinkte proteiner som hver og en virker gjennom eget unikt reseptorsystem. TGF—a som konkurrerer med epidermal vekstfaktor (EGF) for binding til samme celleoverflatereseptor (Todaro, G.J. et al.

(1980) PNAS 77, 5258-5262) og som deler sekvenshomologier og lignende aktivitet som EGF (Marquardt, H. et al. (1984) Science 223, 1079-1082) blir syntetisert som en transmembran-forløper på 159 aminosyrer og som blir proteolytisk prosessert til et peptid på 50 aminosyreresidier (Derynck, R. et al. (1984 ) Cell 38, 287-297 ). Som et potent mitogen for mesenchymale celler blir TGF-c< produsert og frigjort av mange transformerte cellelinjer og humane cancere, men blir også uttrykt i aktiverte makrofager og i andre normale vev, og som dermed gjør dets rolle i neoplasia uklar.

TGF-B ble opprinnelig renset til homogenisitet fra humane blodplater (Assoian, R.K. et al. (1983) J. Biol. Chem. 258, 7155-7160), human morkake (Frolik, CA. et al. (1983) PNAS 80, 3676-3680 ) og bovin nyre (Roberts, A.B. et al. ( 1983) Biochemistry 22, 5692-5698) og identifisert som et homo-dimerisk protein med en molekylvekt på 25.000 D. Førstkarakterisert veddets evne til å virke synergistisk med EGF eller TGF-a for å indusere forankrings-uavhengig vekst av utransformerte NRK-celler, er TGF-e blitt vist å inneha mange regulerende virkninger på mange forskjellige både normale og neoplastiske celler og dette angir viktigheten av dette proteinet som en multifunksjonel1 regulator av cellulær aktivitet. TGF-e kan enten stimulere mitogenese, celle-proliferasjon og vekst, eller kan effektivt hemme nevnte prosesser, eller kan utvise andre virkninger som f.eks. kontroll av adipogenese, myogenese, chondrogenese, osteo-genese og immuncellefunksjon, kjemotaktisk stimulering eller induksjon eller hemming av differensieringen avhengig av celle eller vevstype, og tilstedeværelse eller fravær av andre vekstfaktorer. Mange av virkningene til TGF-6 er knyttet til responsen av cellene eller vevene overfor stress eller skade, og reparering av resulterende skade. Etter betennelse spiller TGF-B hovedrollen ved dannelse av granuleringsvev, øker ekspresjon av gener knyttet til ekstra-cellulær matrisedannelse så som fibronektin, collagen og flere proteaseinhibitorer og stimulerer collagen-matrise-kontraksjon ved fibroblaster, som foreslår den mulige rollen i bindevevskontraksjon (Roberts, A. og Sporn, M.B. (1988) Adv. Cancer Res. 51, 107-145: Sporn, M.B. og Roberts, A.

(1989) J. Amer. Med. Assoc. 262, 938-941).

Inntil nå er tre bestemte typer TGF-B betegnet TGF-B1, TGF-B2 og TGF-B3 som er funksjonelt nær beslektede og som deler en høy grad av reseptor kryss-reaktivitet blitt klonet ogkarakterisert vedsekvensanalyse. Alle TGF-B er syntetisert som 390 til 412 aminosyreforløpere som gjennomgår proteolytisk spaltning for å danne monomere former, som består av C-terminale 112-aminosyrer. I deres modne, biologisk aktive former er TGF-B syre- og varmestabile disulfid-bundne homodimerer av to polypeptidkjeder på 112 aminosyrer hver. De fullstendige aminosyresekvensene til human (Derynck, R. et al. (1985) Nature 316, 701-705), murin (Derynck, R. et al.

(1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379) og simian TGF-e1

(Sharples, K. et al. (1987) DNA 6, 239-244) viser bemerkel-sesverdig sekvenskonservering som bare er forskjellig i et enkelt aminosyreresidie. Sammenligning av aminosyresekvensen til human TGF-61, human TGF-62 (de Martin, R. et al. (1987) EMBO J. 6, 3673-3677; Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131) og human TGF-63 (Ten Dijke, P. et al.

(1988) PNAS 85, 4715-4719) har demonstrert at de tre proteinene utviser i deres modne former omtrent 70-80% sekvensidentitet. Et heterodimerrsk TGF-61.2 er blitt isolert fra griseblodplater og består av en subenhet TGF-61 disulfid-koblet til en enhet TGF-62 (Cheifetz', S. et al. (1987) Cell 48, 409-415).

Det er i den senere tid blitt gjort forsøk på å fremstille TGF-B ved hjelp av rekombinante teknikker istedenfor isolering av disse faktorene fra naturlige kilder (f.eks. blodplater) for å oppnå tilstrekkelige mengder for testing i forskjellige terapeutiske tilstander. Det er derimot vist å være meget vanskelig å syntetisere rekombinant TGF-B samtidig med at den biologiske aktiviteten blir beholdt. Som det fremkommer fra sekvensene angitt i sekvensoppfør ingen under SEQ ID Nr. 1, 2 og 3 inneholder de 112 aminosyrene som utgjør de modne formene til TGF-el, TGF-62 og TGF-B3 9 cysteinresidier, der minst noen er involvert i intrakjede og interkjede disulfidbindingsdannelse som resulterer i kompleks tertiær struktur til biologisk aktive, dimere molekyler. Heterolog ekspresjon av TGF-B kan føre til et produkt som, til tross for at det har riktig primær struktur, ikke blir foldet riktig for dannelsen av riktig sekundær eller tertiær struktur og som derfor mangler biologisk aktivitet. Inntil nå er de sekundære og tertiære strukturene til TGF-B ukjente.

Dersom kompleksiteten til de native TGF-B molekylene blir tatt med i betraktning har det generelt vært betraktet hensiktsmessig å uttrykke de respektive TGF-B genene i celler avledet fra høyere organismer. Ekspresjon av simian og human TGF-61 i kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler under kontroll av SV40-promoteren er beskrevet i EP-PS 293.785 og 200.341. Rekombinant TGF-62 kan bli uttrykt i samme cellelinje som beskrevet i EP-PS 268.561 og i Tysk Offenlegungsschri ft 38.33897. Eukaryot ekspresjon av et fusjonsprotein av TGF-63 (med TGF-ei) er beskrevet i EP-PS 267.463.

Til tross for at ekspresjon av rekombinante TGF-B kan bli oppnådd i eukaryote systemer er utbyttet av biologisk aktivt, riktig foldet materiale som blir tilveiebragt langt fra tilfredsstillende. Derimot er det usannsynlig at biologisk aktivt TGF-6kan bli tilveiebragt når de respektive genene ble uttrykt i en mikrobiell vert, på grunn av at i f.eks. bakterier er de intracellulære betingelsene ikke tilstrekkelige for refolding, disulfidbindingsdannelse og disulfid-stabilisert dimerisering som er essensielt for aktivitet. Dermed er det bare blitt mulig å oppnå meget lite biologisk aktivt TGF-62 etter ekspresjon av det respektive genet i E. coli under kontroll av lambda-promoteren som beskrevet i EP-PS 268.561. Denne mangelen på aktivitet skyldes det faktum at den biologisk aktive, dimeriske formen av TGF-62 ikke blir dannet spontant fra det monomere primære trans-lasjonsproduktet når utsatt for det reduserende miljøet inne i de bakterielle cellene. En annen publikasjon beskriver ekspresjon av TGF-B cDNA i E. coli under kontroll av trp-promoteren som tilveiebringer et radioaktivt merket protein-bånd med en tilsynelatende molekylvekt på 13.000 D i et autoraciogram i en SDS-polyakrylamidgel, men ingen aktivitet ble målt (Urushizaki, Y. et al. (1987) Tumor Res. 22, 41-55).

Når rekombinante proteiner blir produsert i høye nivåer i bakterielle (så som E. coli) ekspresjonssystemer fremkommer de ofte i form av meget uoppløselige intracellulære presi-pitater betegnet som inklusjonslegemer eller refraktile legemer (Brems, D.N. et al. (1985) Biochemistry 24, 7662) som kan bli gjenkjent som lyse flekker synlige innenfor omfanget av cellene under et fasekontrast-mikroskop ved forstørrelser ned til 1.000 ganger. Disse innleiringslegemene, som lett kan bli separert fra oppløselige bakterielle proteiner, inneholdt det rekombinante proteinet i en for det meste denaturert og redusert form som ikke utviser den funksjonelle aktiviteten til dets naturlige motstykke og som derfor er unyttig som et kommersielt produkt.

Det er derfor generelt enighet om at rekombinant refraktilt protein må bli oppløst under betingelser som er egnede for opprettholdelse av det i dets denaturerte form og deretter må bli refoldet for å gjennomgå overgangen fra denaturert ufoldet form til riktig, funksjonell aktiv tre-dimensjonal struktur, der konformasjonen er stabilisert av relativt svake mellomatomiske krefter så som hydrogenbinding, hydrofobe interaksjoner og ladningsinteraksjoner. Når det gjelder cysteininneholdende proteiner kan denne fremgangsmåten også omfatte dannelse av disulfidbindinger. Når dannelsen av disulfidbindinger blir fremmet kjemisk, bør dannelsen av uriktige intramolekylære og, når det gjelder dimere eller multimere proteiner, intermolekylaere broer bli forhindret eller i det minste minimalisert, på grunn av at dannelsen av uønskede, ikke riktig foldede isomerer kan føre til et ikke-homogent materiale, som dermed kompliserer den videre rensingen av proteinet med ønsket struktur, eller kan danne et protein med redusert aktivitet.

Et antall publikasjoner er fremkommet som angir forsøk på refolding for individuelle proteiner produsert i bakterielle verter, eller som er ellers i en denaturert eller ikke-nativ form. Dannelse av en dimerisk, biologisk aktiv human koloni-stimulerende faktor-1 (CSF-1) etter ekspresjon i E. coli er beskrevet i PCT-søknad nr. 88/8003 og av Halenbeck, R. et al.

(1989) Biotechnology 7, 710-715. De beskrevne prosedyrene omfatter trinnene med første solubilisering av CSF-l-monomerene isolert fra innlæringslegemer under reduserte betingelser i et kaotropisk miljø omfattende urea eller guanidinhydroklorid, refolding som blir oppnådd ved trinnvis fortynning av kaotrofiske midler og til slutt oksidering av refoldede molekyler i nærvær av luft eller et redoks-system. I PCT-søknad nr. 88/8849 er en fremgangsmåte for isolering av rekombinant interleukin-2 (IL-2) beskrevet, kjennetegnet ved at IL-2 isolert fra refraktile legemer er denaturert under reduserende betingelser med 6 M guanidinhydroklorid, opp-løselig IL-2 oksidert av en kontrollert oksidasjon i nærvær avCu<2+->ioner og oksidert IL-2 refoldet ved redusering av konsentrasjonen av denatureringsmiddelet i oppløsningen. Interleukin-2 og interferon-B (IFN-b) er blitt refoldet ved anvendelse av SDS for oppløsning og CU<2+->ioner som oksi-das j onsf remmere av fullstendig reduserte proteiner (US-PS nr. 4.572.798). Fremgangsmåten for isolering av rekombinante refraktile proteiner som beskrevet i US-PS nr. 4.620.948 omfatter sterke denatureringsmidler for å oppløse proteinene, reduserende betingelser for å lette riktig folding og denatureringsmiddelerstatning i nærvær av luft eller andre oksidasjonsmidler for gjendannelse av disulfidbindingene. Proteinene som kan bli anvendt i fremgangsmåten omfatter urokinase, humane-, bovine- og griseveksthormoner, interferon, vevstype-plasminogenaktivator, FMD-kappeprotein, prorennin og src-protein. En fremgangsmåte for renaturering av ufoldede proteiner omfatter cytokrom c, ovalbumin- og trypsininhibitor ved reversibel binding av det denaturerte proteinet til en fast matrise og trinnvis renaturering av denne ved fortynning av denatureringsmiddelet er beskrevet i PCT-søknad nr. 86/5809. En modifisert monomerform av human blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) uttrykt i E. coli blir S—sulfonbehandlet i løpet av rensingen for å beskytte tiol-bestanddelene og blir dimerisert i nærvær av oksidasjonsmidler for å tilveiebringe det aktive proteinet (Hoppe, J. et al. (1989) Biochemistry 28, 2956).

Referansene ovenfor er bare representative for en mengde litteratur vedrørende refolding av ikke-native proteiner avledet fra forskjellige kilder. Fagfolk vet at vellykkethet til refoldingseksperimenter . ikke kan forutsies. Ikke vel-lykkede eksperimenter blir vanligvis ikke rapportert. Det er ingen sikkerhet om at noen av de rapporterte refoldings-betingelsene i det hele tatt ville virke med et gitt denaturert protein så som TGF-e. TGF-e er et dimerisk protein inneholdende 9 cysteinresidier pr. kjede og et antall intramolekylære samt intermolekylære di sul fidbindinger som er nødvendige for aktivitet, og det er av denne grunn en spesielt vanskelig utfordring å fremstille biologisk aktiv TGF-e fra dets monomeriske, denaturerte eller ikke-native form. Ingen steder i litteraturen er en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktiv dimerisk TGF-e fra dets ikke-native form beskrevet.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt, dimerisk TGF-e-lignende protein fra dets denaturerte eller ikke-native form. Denne hensikten blir oppnådd ved det uventede funnet som omfatter at betraktelige mengder av ønsket dimerisk produkt kan bli tilveiebragt når den monomere formen av nevnte protein blir utsatt for refoldingsbetingelser. Produksjon av den aktive dimeren blir overraskende oppnådd under forskjellige betingelser i en ett-trinns fremgangsmåte som er overlegen i forhold til flertrinns-fremgangsmåtene beskrevet ifølge teknikkens stand for refolding av andre proteiner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type e (TGF-e)-lignende protein eller et salt derav, kjennetegnet ved å refolde denaturert monomerisk form av nevnte TGF-e-lignende protein i nærvær av et oppløsningsmiddel som muliggjør folding av det monomeriske TGF-e-lignende protein til en romlig konformasjon som etter dimerisering er assosiert med biologisk aktivitet, samtidig som nevnte monomer beholdes i en oppløselig form, valgt fra gruppen bestående av (a) en mild detergent, hvor nevnte milde detergent er tilstede i et konsentrasjonsområde fra 1 til 100 mM, (b) en lavere alkanol, og (c) en lavere alkandiol , hvor nevnte lavere alkanol eller lavere alkandiol er tilstede i et konsentrasjonsområde på 10 til 50 volum-%, hvor pH er mellom6og 10, og hvor utgangskonsentrasjonen av proteinmonomeren er lavere enn 2 mg/ml.

Betegnelsen "TGF-e-lignende protein" skal omfatte TGF-e1, TGF—e2 og TGF-B3 fra pattedyr av human- eller dyreopprin-nelse, f.eks. simian, murin, porcin, equin eller bovin, samt heterodimere TGF-e bestående av- to forskjellige subenheter med 112 aminosyrer hver. Benmorfogeniske proteiner (BMP, en gruppe polypeptider involvert i induksjon av brusk- og bendannelse ) , er også innbefattet.

Foretrukne TGF-e-lignende proteiner er human TGF-ei (Derynck, R. et al. (1985) Nature 316, 701-705), human TGF-62 (Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131) og human TGF-63 (Ten Dijke, P. et al. (1988) PNAS 85, 4715-4719) med aminosyresekvensene angitt i sekvensoppføringen under SEQ ID Nr. 1, 2 og 3.

Biologisk aktive TGF-e-lignende proteiner blir opprinnelig definert ved at de har evne til å indusere forankrings-uavhengig vekst av utransformerte cellelinjer (Tucker, R.F. et al. (1983) Cancer Research 43, 1581-1586) eller inhibere veksten av neoplastiske målceller (Roberts, A.B. et al.

(1985) PNAS 82, 119-123). "Biologisk aktivitet" blir heri definert som enten

a) cellemigreringsfremmende aktivitet på normale Balb/c 3T3-f ibroblaster, som kan bli målt ved telling av antall

celler som migrerer i en "skadet" monolagskultur av nevnte celler, i nærvær av et serumfritt medium inneholdende TGF—6-1ignende protein, sammenlignet med antall celler som migrerer i fravær av TGF-B-1ignende protein, eller

b) den vekstfremmende aktiviteten på normale Balb/c 3T3-fibroblaster bestemt ved den stimulerende virkningen av

TGF-6-1ignende protein på cellulær DNA-syntese og celledeling,

c) veksthemmingen av A375-melanomceller bestemt ved en koiorimetrisk analyse som reflekterer antall celler

behandlet med TGF-6-1ignende protein for en gitt dyrkningsperiode sammenlignet med antallet ikke-behandlede celler,

d) den aksellererte legingen av delvis tykkelsesbrente sår, ved en fremgangsmåte omfattende re-epitelialisering, i

gamle mus etter multiple topiske anvendelser av TGF-e-lignende protein sammenlignet med ubehandlede kontrollsår,

e) den aksellererte legingen av full-tykkelses innsnittssår, bestemt ved trykkfasthetsmålinger og histologiske analyser

av biopsier, i voksne rotter etter enkle topiske applikasjoner av TGF-e-lignende protein sammenlignet med ubehandlede kontrollsår, eller

f) økning i dannelsen av fibrøst granuleringsvev, sammen med en markert økning i vaskularitet i nevnte vev, både i og

rundt porøse sår-rom implantater i voksne rotter etter multiple lokale injeksjoner av TGF-e-lignende protein i rommet sammenlignet med ubehandlede kontrollrom.

Den monomere formen av TGF-e-lignende protein kan bli produsert ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi eller syntetisk ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Den dimere formen er modent, biologisk aktivt molekyl bestående av to disulfid-bundne polypeptidkjeder.

Monomeren blir utsatt for refoldingsbetingelser som muliggjør isolering av biologisk aktiv dimer. Denne fremgangsmåten innbefatter ikke noen forandring i primær struktur (dvs. aminosyresekvens) til monomeren, men vedrører dannelsen av tredimensjonal konformasjon til det dimere produktet som er knyttet til biologisk aktivitet. Denne fremgangsmåten omfatter dannelsen av disulfidbindinger og assosiasjon av monomerer til dimeriske strukturer.

Det monomeriske TGF-e-lignende proteinet må være tilstede i en denaturert (dvs. ufoldet) form far det blir utsatt for refoldingsbetingelser. Såkalte kaotrofiske midler er velkjente for å kunne denaturere proteiner effektivt og som i vandig oppløsning og i egnede konsentrasjoner forandrer den romlige konfigurasjonen til det respektive proteinet gjennom endringer i overflaten derav, enten" ved endring av hydre-ringstilstanden , oppløsningsmiddelmi1jøet eller oppløsnings-middeloverflateinteraksjonen. Eksempeler på slike kaotrofiske midler eller denatureringsmidler omfatter urea, guanidinhydroklorid, natriumtiocyanat i konsentrasjoner i området på omtrent 4 til omtrent 9 M og detergenter så som SDS, som blir tilført i konsentrasjoner i størrelsesorden 0,01 til 2 prosent. Surgjøring av den vandige oppløsningen inneholdende TGF-e-lignende protein til en pH på omtrent 2 til omtrent 4 samt basiske betingelser på f.eks. pH 10 og over og forhøyede temperaturer vil resultere i denaturering av monomeren.

Betegnelsen "refoldingsbetingelser" refererer til bufferbetingelser der den denaturerte monomeren tillates å oppta en konformasjon i samsvar med biologisk aktivitet. Konvensjonelle buffersystemer så som Tris, fosfat- eller citrat-buffer kan bli anvendt ved en pH på omtrent 6 til omtrent 10. Under betingelsene for refolding fremmes intra- og interkjede-disulfidbindingsdannelse. Slike betingelser omfatter tilstedeværelse av et oppløsningsmiddel og et redokssystem som muliggjør kontinuerlig oksidasjon og reduksjon av tiol/- disulfid-parene. Buffersystemet kan i tillegg inneholde egnede salter.

Egnede oppløsningsmidler er detergenter, fortrinnsvis milde detergenter, organiske stoffer, vannblandbare oppløsnings- midler eller fosfolipider eller en blanding av to eller flere slike midler.

Detergenter er overflateaktive forbindelser, så som SDS, Triton eller Tween, anvendt i en konsentrasjon som tillater folding av TGF-6-1ignende protein. Foretrukket er milde detergenter som muliggjør folding av monomerisk TGF-e-lignende protein til den rommelige konformasjonen som etter dimerisering er knyttet til den--biologiske aktiviteten, med beholdelse av nevnte monomer i en oppløselig form. Milde detergenter, som oppløser TGF-e-lignende proteiner uten inaktivering av disse kan være ikke-ioniske (f.eks. digitonin), kationiske (f.eks. N-[2 , 3-(dioleyloksy)-propy1]-N ,N ,N-tr imetylammonium; Diizgunes , N. et al. (1989) Biochemistry 28, 9179-9184) eller anioniske (f.eks. natrium-cholat, natriumdeoksycholat) eller zwitterioniske (f.eks. sulfobetainer (Zwittergent ), 3-(3-chlolamidopropyl)dimety1-ammonio-l-propansulfonat (Chaps), 3-(3-chlolamidopropyl)-dimetylammonio-2-hydroksy-l-propansulfonat (Chapso)). De er tilstede i buffer for refolding i en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM, spesielt i området 30 til 60 mM. Foretrukne detergenter er zwitterioniske detergenter 3-(3-chlolamido-propyl )dimetylammonio-l-propansulfonat og 3-(3-chlolamido-propyl )dimetylammonio-2-hydroksy-l-propansulfonat. Mest foretrukket er 3-(3-chlolamidopropyl)dimetylammonio-l-propan-sul f onat.

Organiske, vannblandbare oppløsningsmidler kan erstatte detergenten i bufferen for refolding. Slike oppløsningsmidler er for eksempel acetonitril, lavere alkanoler, spesielt C2-C4-alkanoler så som etanol eller isopropanol, eller lavere alkandioler, spesielt C2-C4-alkandioler så som etylenglykol, i et konsentrasjonsområde på 10 til 50 prosent pr. volum.

Egnede redokssystemer som fremmer dannelsen av disulfider er f.eks. lavmolekylvekt sulfhydryl/disulfid-reagenskombinasjoner så som glutation i oksidert eller redusert form, ditiotreitol i oksidert og redusert form,8-merkaptoetanol eller e-merkaptometanol i oksidert og redusert form, cystin og den reduserte formen derav og cystamin og dets reduserte form i en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM, spesielt omtrent 1 til 10 mM, der det molare forholdet til den oksiderte og reduserte formen er mellom 100:1 og 1:100, spesielt mellom 6:1 og 1:6.

Foretrukket sulfhydryl/disulfid-redokssystem er glutation i oksidert og redusert form.

Alternativt kan tioredoksin eller disulfidisomerase i et konsentrasjonsområde på omtrent 10 til 1.000 jig/ml , spesielt omtrent 50 til 200 pg/ml bli anvendt istedenfor sulfhydryl/ disulfid-reagenskombinasjoner med lav molekylvekt.

Salter som kan bli anvendt i refoldingsbuffer omfatter salter av Na<+>, Li<+>, K<+>, NH4<+>, Mg<2+>, Ca<2+>eller Mn<2+>med Cl", F", Br", J~, HC03~, fosfat, acetat, cyanat eller rodanid, eller andre alkalimetall- eller alkaliske jordmetall - halogen-eller pseudohalogen-forbindelser i en konsentrasjon på opp til 3 M. Foretrukket er NaCl i en konsentrasjon på 1 til 2 M.

Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type ø-lignende protein, som omfatter at den denaturerte, monomere formen av nevnte TGF-e-lignende protein utsettes for bufferbetingelser omfattende et sulfhydryl/ disulfid-redokssystem med lav molekylvekt i nærvær av et oppløsningsmiddel ved en pH på omtrent 6 til omtrent 10 og en temperatur på omtrent 0°C til omtrent 37°C. pH er fortrinnsvis omtrent 8,0 og temperaturen er omtrent 4<0>C.

I en foretrukket utførelsesform er sulfhydryl/disulfid-redokssystemet glutation i oksidert og redusert form i en konsentrasjon på omtrent 1 til 10 mM, der det molare forholdet til den oksiderte og reduserte formen er 1:1 til 1:2, og den svake detergenten er 3-(3-chlolamidopropy1)dimety1-ammonio-l-propansulfonat i en konsentrasjon på omtrent 30 mM til omtrent 60 mM.

Fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt TGF-e-lignende protein blir utført i en ett-trinns fremgangsmåte, der monomeren til nevnte protein er løst opp i buffer for refolding og reaksjonsblandingen inkubert i 2 til 400 timer ved 4°C idet refolding og dimerisering foregår kontinuerlig. Proteinkonsentrasjonen i løpet av reaksjonen for refolding er av betraktelig viktighet på grunn av at når den er for høy kan monomerene gjennomgå vesentlig aggregasjon som fører til dannelse av uønskede oligomerer med høyere orden. Finale utbytter av dimerisk produkt blir øket dersom proteinkonsentrasjonen er mindre enn omtrent 2 mg/ml og et konsentrasjonsområde på 0,01 til 0,5 mg/ml er foretrukket.

For ytterligere å fremme disulfiddannelse kan en effektiv mengde av et oksidasjonsfremmende middel inneholdende Cup-loner (så som CuCl2, Cu(N03)2eller o-fenantrolin/Cu<2+->komplekser ) eller Fe<3+->ioner (så som FeCl3eller Fe2(S04)3) bli tilsatt, til bufferen for refolding. En effektiv mengde er mengden som ved minimum vil være nødvendig for å utføre oksidasjon av sulfhydrylgruppene innenfor en hensiktsmessig tidsperiode og som er omtrent ekvivalent til konsentrasjonen av frie sulfhydrylgrupper i det TGF-e-lignende proteinet som bestemt vil være involert i dannelsen av ønskede disulfidbindinger. Foretrukne mengder varierer mellom 0,01 til 100 pM'.

02eller luft kan eventuelt bli boblet gjennom bufferen for refolding enten i nærvær eller fravær av oksidasjonsfremmende midler. Oksidasjon kan også bli utført ved anvendelse av I2(Kamber, B. et al., 1980, Heiv. 63, 899-915) eller benzo-chinon-derivater (Kamber, B. PCT-søknad WO 89/01484).

Sulfonering av proteiner kan bli anvendt for å spalte disulfidbindinger og å blokkere resulterende tiolgrupper. Monomere TGF-e-lignende proteiner kan eventuelt bli S-sulfonert og dermed bli forhindret fra å bli oksidert før de blir utsatt for refoldingsbetingelser. S-sul foner ing blir utført ved anvendelse av natriumsulfitt i nærvær av et reduksjonsmiddel så som cystein, resulterende i den rever-sible beskyttelsen av tiolresidier som S-sulfonater. Under refoldingsbetingelser blir beskyttelsesgruppene fjernet ved overskudd av sulfhydryl/disulfid-redokssystemet og dimerisering oppstår spontant.

Et dimerisk, biologisk aktivt TGF-e-lignende protein, der den monomere formen av nevnte TGF-e-lignende protein kan bli fremstilt ved følgende trinn: a) dyrking av en mikrobiell vert omfattende en nukleotidsekvens kodende for TGF-e-lignende protein koblet i riktig leseramme til en ekspresjonskontrol1 sekvens slik at nevnte protein blir uttrykt, b) isolering av TGF-e-lignende protein i en denaturert, momomerisk, oppløselig form.

Egnede mikrobielle verter er gjærstammer som Saccharomyces cerevisiae eller bakterier så som Escherichia coli eller Bacillus subtilis.

Mikrobielle verter omfattende en nukleotidsekvens kodende for TGF-e-lignende protein koblet i riktig leseramme til en ekspresjonskontrol1 sekvens kan bli fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker som er velkjente innenfor fagområdet og som omfatter følgende trinn

preparering av en hybridvektor som omfatter en DNA-sekvens kodende for TGF-e-lignende protein under ekspresjons-kcntroll av en egnet ekspresjonskontrol1 sekvens ,

transformering av nevnte mikrobielle vert med nevnte

hybridvektor og

selektering av transformerte mikrobielle vertsceller fra

utransformerte vertsceller.

Nukleotidsekvensen kodende for TGF-6-1ignende proteiner så som modent humant TGF-61, TGF-62 eller TGF-63 er kjent (Derynck, R. et al. (1985) Nature 316, 701-705; Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131; Ten Dijke, P. et al. (1988) PNAS 85, 4715-4719) og kan f.eks. bli syntetisert kjemisk ved fremgangsmåter som er kjente innenfor fagområdet. Alternativt kan cDNA kodende for TGF-6-1ignende proteiner bli fremstilt etter isolasjon av respektive mRNA fra pattedyrceller som produserer TGF-6-1ignende proteiner. Ekspresjonskontrollsekvenser er promotersekvenser som forsikrer effektiv ekspresjon av TGF-6-1ignende proteiner.

Seleksjon av en egnet vektor blir bestemt av den mikrobielle vertscellen tilveiebragt for transformasjon.

Eksempler på vektorer som er egnede for ekspresjon av TGF-6-lignede protein i en E. coli-stamme er bakteriofager, for eksempel derivater av bakteriofag X, eller plasmider, så som plasmid pBR322 og derivatet derav pPLMu. Egnede vektorer inneholdende et fullstendig replikon og et markørgen, som muliggjør seleksjon og identifikasjon av mikroorganismer transformert med ekspresjonsplasmider ved hjelp av et fenotypetrekk. Egnede markørgener gjør at mikroorganismene for eksempel blir motstandsdyktige overfor tungmetaller, antibiotika så som ampicillin eller tetracyklin, og lignende.

Flere promotere kan bli anvendt for regulering av ekspre-sjonen av TGF-6-1ignende proteiner i E. coli. Promotere av sterkt uttrykte gener blir spesielt anvendt. Egnede promotere er E. coli lac-, tac-, trp- og lpp-promoter, videre fagXX-eller fag XpL-promotor og andre.

Vektorer egnede for replikasjon og ekspresjon i S. cerevisiae inneholder et gjærreplikasjonsorigo og en selektiv genetisk markør for gjær. Hybridvektorer som inneholder et gjærreplikasjonsorigo, for eksempel det kromosomale, autonomt replikerende segmentet (ars), blir beholdt ekstrakromosomal t innenfor gjærcellen etter transformasjon og blir replikert autonomt i løpet av mitose. Hybridvektorer som inneholder sekvenser som er homologe med gjær 2 p plasmid-DNA kan også bli anvendt. Slike hybridvektorer blir integrert ved rekom-binasjon i 2 p plasmider som allerede er tilstede innenfor cellen, eller blir replikert autonomt. Egnede markørgener for gjær er spesielt de som tilveiebringer antibiotika-resistens til verten eller, i tilfellet av auksotrofe gjærmutanter, gener som komplementerer vertslesjoner. Tilsvarende gener tilveiebringer for eksempel resistens overfor antibiotikaets cykloheksimid eller tilveiebringer prototrofi i en auksotrof gjærmutant, for eksempel URA3-, LEU2-, HIS3- eller TRPI-genet.

Promotere egnede for ekspresjon i gjær er for eksempel de fra ADHI-, ADHII- eller PH05-genet, og også promotere involvert i glykolyse, for eksempel PGK- eller GAP-promoteren.

Signalsekvenser som muliggjør sekresjon av TGF-e-1ignende protein kan eventuelt bli innbefattet i ekspresjonsvektoren. Egnede signalsekvenser er f.eks. de avledet fra sur fosfatase (PH05) fra gjær eller gjærinvertasegenet.

Transformerte mikrobielle verter blir dyrket i et flytende medium inneholdende assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og uorganiske salter ved anvendelse av kjente fremgangsmåter.

Forskjellige karbonkilder kan anvendes. Eksempel på foretrukne karbonkilder er assimilerbare karbohydrater, så som glukose, maltose, mannitol, fruktose eller laktose, eller et acetat så som natriumacetat, som enten kan være alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkiIder omfatter for eksempel aminosyrer, så som kasaminosyrer, peptider og proteiner og nedbrytningsprodukter derav, så som trypton, pepton eller kjøttekstrakter, videre gjærekstrakt, malt-ekstrakt, maisuttrekksvæske, samt ammoniumsalter, så som ammoniumklorid, sulfat eller nitrat som kan bli anvendt alene eller i egnede blandinger. Uorganiske salter som kan bli anvendt omfatter for eksempel sulfater, klorider, fosfater og karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium. I tillegg kan næringsmediet også inneholde vekstfremmende forbindelser. Forbindelser som fremmer veksten omfatter for eksempel sporelementer, så som jern, sink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer.

Det monomere TGF-e-1ignende proteinet kan bli isolert fra de mikrobielle vertscellene ved fremgangsmåter som er velkjente. Disse fremgangsmåtene omfatter lysering eller mekanisk ødeleggelse av celler for å frigjøre det ønskede proteinet, etterfulgt av separasjon av TGF-e-lignende protein fra vertscelleproteinene, f.eks. ved presipitasjon og/eller kromatografiske midler.

Det monomere TGF-e-lignende proteinet som blir produsert i de mikrobielle vertscellene som et uoppløselig aggregat (innleiringslegeme) må det bli oppløst før det blir utsatt for refoldingsbetingelser. Det monomere TGF-e-lignende proteinet kan følgelig bli fremstilt ved følgende trinn: a) isolering av den vann-uoppløselige proteinfraksjonen inneholdende TGF-e-lignende protein fra vertscellene og

b) oppløsning av det TGF-e-lignende proteinet.

Oppløsning og denaturering av monomeren blir oppnådd ved

surgjøring av den råe proteinsuspensjonen inneholdende

monomerisk TGF-e-1ignende protein i en ikke-oppløselig form til en pH på omtrent 1 til omtrent 4, fortrinnsvis til omtrent 2,5, eventuelt i nærvær av et reduksjonsmiddel, så som DTT, eller ved tilsetning av kaotrofiske midler, fortrinnsvis guanidin HC1 eller mere foretrukket urea, i en konsentrasjon på omtrent 4 til 9 M, basisk pH eller forhøyede temperaturer som beskrevet ovenfor. Den oppløste monomeren kan bli renset fra oppløsende kaotrofer ved dialyse og, dersom et presipitat oppstår i -løpet av dialyseringen, ved ytterligere sentrifugering. Den oppløste monomeren kan bli renset kromatografisk og anvendt for refolding for å oppnå det biologisk aktive, dimere produktet.

Etter refolding kan den biologisk aktive dimeren bli renset for å fjerne urenheter, spesielt pyrogener eller andre endo-toksiner som kan være tilstede i preparatet etter produksjon av det rekombinante proteinet i mikrobielle vertsceller. Separasjon av dimeren blir utført ved kromatografi så som størrelsesgelkromatografi, hydrofob interaksjonskromatografi eller ionebyttekromatografi , f.eks. på en Mono S-kolonne og revers fase HPLC.

En farmasøytisk sammensetning omfattende en effektiv mengde av et dimerisk, biologisk aktivt TGF-e-lignende protein fremstilt ifølge oppfinnelsen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav i doseringsenhetsform kan bli dannet.

En slik sammensetning er i form av infusjonsoppløsninger eller preparater for parenteral-, for eksempel intramuskulær-eller intravenøs-, oral- eller spesielt for lokal-, dvs. topisk-, administrasjon. Oppløsningene er fortrinnsvis isotone vandige oppløsninger eller suspensjoner som kan bli preparert for bruk, for eksempel fra lyofiliserte preparater som inneholder det aktive ingredienset alene eller sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Oppløsninger for parenteral anvendelse er vanligvis vandige oppløsninger. De blir preparert på vanlig måte og kan i tillegg til det aktive ingredienset inneholde fysiologisk saltvann, et stabili-seringsmiddel , så som humant serumalbumin, aminosyrer, så som arginin eller glysin, og et karbohydrat, så som glukose, mannose, dekstran eller hydroksyetylstivel se. pH kan bli justert med en buffer, f.eks. et fosfat, succinat eller en aminosyre til omtrent 4,5 til 7. Beholderne blir vanligvis fylt med oppløsningen og lyofilisert for lengre langring.

Sammensetningene inneholder konvensjonelle tilsetnings-stoffer, for eksempel konserveringsmidler, stabiliserings-midler, fuktemidler og/eller emulgeringsmidler, oppløsnings-midler, salter for regulering av det osmotiske trykket og/eller buffere.

TGF-e-lignende proteiner har dobbelt karakter på grunn av at de på den ene siden stimulerer proliferasjon av visse celletyper, dvs. fibroblaster, og på den andre siden inhiberer proliferasjonen av andre celletyper, dvs. tumorceller og celler i immunsystemet.

Dimere, biologisk aktive TGF-e-lignende proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen, eventuelt i form av deres salter, så som i spesielt ikke-toksiske farmasøytiske syreaddisjonssalter, eventuelt i form av farmasøytiske formuleringer, kan bli anvendt i en effektiv mengde. Med formen "effektiv mengde" menes en mengde som utviser en signifikant leging, f.eks. en mengde som stimulerer de ønskede cellene til å vokse og som er ikke-toksisk overfor normale celler. Denne mengden kan for eksempel bli bestemt ved in vitro veksteksperimenter. På grunn av den dobbelte karakteren til TGF-e-lignende proteiner er en "effektiv mengde" også en slik mengde som i betraktelig grad inhiberer veksten og proliferasjonen av tumorceller og celler i immunsystemet. Dersom human eller veterinær anvendelse er påtenkt må mengden bli justert til det bestemte vevet som skal bli behandlet, applikasjonsmåten, hvor alvorlig sykdommen er og alderen og generell tilstand til pasienten som skal bli behandlet. Generelt vil den enten enkelte dose eller daglige doser til voksne mennesker være i området på omtrent 0,01 til 20 yg for både vekststimulerende-og inhiberende virkning.

Ovennevnte farmasøytiske sammensetning har en klinisk anvendelse ved behandling av dyr, spesielt pattedyr, mer spesielt mennesker, og når det gjelder leging av sår, spesielt gamle mennesker.

Sammensetningene fremmer cellemigrering og proli ferasjon. På grunn av at leging av sår involverer både cel lemigrer ing og celleprolifereringsmønstre blir disse in vitro-funnene direkte relevante for in vivo- sårlegingsprosessen.

Forhindring eller behandling av sengesår (decubitus ulcers) er en foretrukket anvendelse på grunn av at de ofte fore-kommer hos sykehuspasienter, spesielt geriatriske- og rullestolpasienter. Hos eldre mennesker er prosessen for leging av sår saktere og denne pasientgruppen har oftere sår (ikke bare decubitus og diabetiske sår, men trauma, brannsår og lignende) som enten leges sakte eller ikke i det hele tatt.

To anvendelsestyper for sammensetningene er foreslått for både veterinær- og, spesielt, human medisin.

Den første, og foretrukne, anvendelsen er en topisk anvendelse for fremming av leging av overflatesår, spesielt i eldre mennesker hvor prosessene for leging av sår er merkbart saktere. Det er ingen begrensinger på hvilken sårtype som kan bli behandlet, og disse innbefatter (men er ikke begrenset til): Overflatesår inkludert dekubital- (sengesår), diabetiske-, dentale-, orale-, varikose- og hemofiliske overflatesår; brannsår (spesielt av andre og tredje grad); kirurgiske innsnitt (samt tann- og kosmetisk kirurgi); sår oppstått ved uhell (inkludert innsnitt, penetreringer, vevsskader og andre traumer) og terapeutisk induserte sår

(inkludert de som blir dannet ved radioterapi ) . Når anvendt topisk kan sammensetningene bli kombinert med andre ingredienser, så som hjelpestoffer, bærere, oppløsningsmidler og hvilke som helst andre kjente, eller enda ukjente, sekundære vekstfaktor(er) . Det er ingen begrensninger når det gjelder naturen til disse ingrediensene med unntagelse av at de må være farmasøytisk og fysiologisk akseptable for administrasjon og må ikke redusere aktiviteten, eller gjøres toksisk skadelige, de aktive ingrediensene i sammensetningene. Når sammensetningene ifølge oppfinnelsen blir påført overflatesår, brannsår, kirurgiske- eller uhellssår, er sammensetningene fortrinnsvis i form av et pulver, en gel, en salve eller irrigeringsmiddel, eller de kan bli impregnert i transdermale lapper, plastere og bandasjer, fortrinnsvis i en flytende eller semi-flytende form, eller bli inkorporert i en tannkrem eller en gummi eller harpisk for tygging.

Den andre anvendelsen er systemisk for leging av indre sår enten etter kirurgi eller skade på vev i indre organer hvor kirurgi enten er umulig eller ikke påkrevet. Det er igjen ingen begrensninger på hvilke vevstyper eller sår som kan bli behandlet og disse omfatter (men er ikke begrenset til) dype kirurgiske innsnitt i indre organer og vev; ben og brusk (etter brudd); mage-, tolvfingertarm- og andre tarmsår. Når anvendt systemisk kan sammensetningene ifølge oppfinnelsen bli formulert som væsker, piller, tabletter, stikkpiller for enteral administrasjon, eller i flytende form for parenteral injeksjon. For behandling av indre sår etter kirurgi kan de være i form av et irrigeringsmiddel, fortrinnsvis i kombina-sjon med en fysiologisk akseptabel saltvannsoppløsning. Igjen kan de aktive ingrediensene ifølge sammensetningene bli kombinert med andre ingredienser så som hjelpestoffer, bærere, oppløsningsmidler og andre kjente, eller andog ukjente, sekundære vekstfaktor(er). Det er ingen begrensninger når det gjelder naturen til disse ingrediensene med unntagelse av at de må være farmasøytisk og fysiologisk akseptable for administrasjon og må ikke redusere aktiviteten eller gjøre de aktive ingrediensene ifølge disse sammensetningene skadelig toksisk.

For leging av sår må mengden av aktiv ingrediens som blir påført justeres etter type, alvorlighet og beliggenhet av såret, og også etter alder og generell tilstand til pasienten som blir behandlet. En enkel eller daglig mengde på fra omtrent 1 pg til 20 jjg TGF-6-lignende protein pr. 1 cm<2>sår har allerede en signifikant legende virkning. For indre anvendelse bør en høyere mengde bli påført avhengig av administråsjonsmåten på grunn av fortynning av det TGF-e-lignende proteinet i kroppsvæskene.

Ytterligere anvendelser av TGF-e-lignende proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen er i ben- og vevsreparasjoner, behandling av cancer i pattedyr, som et anti-betennelsesmiddel eller immunsuppressivt middel , som en vekstregulator i pattedyr-cellekulturer eller som et benmargsbeskyttende middel eller formidler av hjertebeskyttelse.

Eksempler

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1:

Kloning og sekvensering av TGF- Bl. TGF- e2 og TGF- B3 cDNA

A. Dyrking av celler

Humane gliomaceller fra CI-215-linjen (de Muralt, B. et al.

(1985) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 207) blir dyrket i vevskulturflasker (Falcon T75) inneholdende Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (DMEM, Gibco) og 10$ fetalt kalveserum .

B. RNA- ekstraks jon

1 x 10<8>celler fra den CI-215 humane gliomacellei injen blir høstet og Dounce-homogenisert i 30 ml 5$ sitronsyre med 0,2$

(v/v) NP40-detergent ved 4°C. Kjernen blir separert fra cytoplasma ved sentrifuger ing ved 2.500 rpm i 10 minutter ved

4°C i en Sorvall RT 6.000-B bordsentrifuge. Supernatanten blir sentrifugert ved 15.000 rpm i 30 minutter ved 4 C i en Sorvall RC 5-B sentrifuge utstyrt med en SS-34 rotor. Den resulterende supernatanten blir kastet og pelletten resuspendert i 30 ml 0,2 M TRIS/HC1 (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2% SDS, 25.000 enheter/l Heparin (Sigma), og deretter ekstrahert 3 ganger med fenol/kloroform (1:1, v/v), der kloroformen består av 24 deler kloroform og 1 del isoamylalkohol (v/v). Til den endelige vandige fasen blir l volum 3 M natriumacetat (pH 5,0) og 2,5 volumer etanol tilsatt. Etanolpresipitåtet blir vasket to ganger med 70% etanol. RNA-pelletten blir resuspendert i 2 ml 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% SDS. Polyadenylert RNA blir isolert ved oligo-dT-cellulosekromato-grafi som beskrevet av T. Maniatis i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York

(1982)".

C. Syntese av cDNA

Den farste cDNA-tråden blir syntetisert fra 10 pg poly A + -R.\A i 100 pl av en oppløsning inneholdende 50 mM TRIS (pH 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 30 pg/ml oligo-dT 12-18, 1 mM av hver dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 50 enheter RNase inhibitor (Promega) og 1.000 enheter Moloney-leukemi v i rus revers transkriptase (Gibco-BRL). Reaksjonen blir inkubert i 1 time ved 37°C. Reaksjonen blir deretter fortynnet til 400 pl med en annen trådbuf f er ' inneholdende 20 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 100 mM KC1. 12,5 enheter RNase H (Gibco-BRL) blir tilsatt og reaksjonsblandingen inkubert i 10 minutter ved 37°C. Reaksjonsblandingen blir avkjølt på is i 5 minutter og 125 enheter E. coli DNA-polymerase I (Promega) tilsatt. Reaksjonsblandingen blir deretter inkubert i ytterligere 2 timer ved 16°C. 40 pl 0,5 M EDTA blir tilsatt etterfulgt av en fenol/kloroform (1:1, v/v) ekstraksjon. Til den vandige fasen blir 1/10 volum 3 M natriumacetat (pH 6,0) og 4 volumer etanol tilsatt mens reaksjonsblandingen blir presipitert i 30 minutter ved -70°C.

Etanolpresipitasjonen blir sentrifugert i 10 minutter ved 17.000 g, pelletten vasket to ganger med 70% etanol og tørket i en Speed-Vac. Dobbeltrådet cDNA blir løst opp i sterilt vann og elektroforert i en agarosegel i TRIS-boratbuffer (pH 8,8) for å vurdere størrelsen og mengden av cDNA. 5 jjg cDNA blir deretter metylert ved EcoRI-setene ved inkubasjon i 1 time ved 37°C i 100 pl 50 mM TRIS/HC1 (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 80 pM adenosylmetionin og 40 enheter EcoRI-metylase (New England Biolabs). Reaksjonsblandingen blir ekstrahert med fenol/kloroform og cDNA etanolpresipitert og løst opp i sterilt vann som beskrevet ovenfor. 5 pg cDNA blir deretter preparert for 1inker1igering ved inkubering med 20 enheter T4 DNA-polymerase i 10 minutter ved 37°C i 200 pl 33 mM TRIS-acetat (pH 7,9), 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat, 0,5 mM DTT og 0,1 mM av hver av dATP, dGTP, dCTP og dTTP. Reaksjonen blir avkjølt til romtemperatur og deretter blir 20 enheter Klenow-polymerase (Gibco-BRL) tilsatt og inkubert i 5 minutter ved romtemperatur og 5 minutter på is. Etter tilsetning av 10 pl 0,5 M EDTA blir reaksjonsblandingen fenol/kloroform-ekstrahert og cDNA etanolpresipitert og løst opp i sterilt vann som beskrevet ovenfor.

12-mer syntetiske 5'-fosforylerte linkere (New England Biolabs nr. 1.070) blir deretter ligert til 5 pg cDNA i 100 pl av en oppløsning inneholdende 10 pg linker i 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,8), 10 mM MgCl2. 20 mM DTT, 1 mM ATP ved 16°C ved anvendelse av 4.000 enheter T4 DNA-ligase (New England Biolabs). Ligasen blir deretter varmeinaktivert ved 70°C i 10 minutter, reaksjonen fortynnet til 500 pl i 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 6 mM MgCl2. 100 mM NaCl og spaltet med 1.000 enheter EcoRI (Boehringer) i 6 timer ved 37°C. 50 pl 0,5 M EDTA blir tilsatt og reaksjonsblandingen oppvarmet ved 70°C i 10 minutter. Den oppvarmede reaksjonsblandingen blir direkte tilsatt på en Bio-gel A15M-kolonne (200-400 mesh, Bio-Rad) for å fjerne monomerlinkerfragmenter. cDNA på mer enn 300 bp eluerer i eksklusjonsvolumet.

D. Kloning inn i lambda gtll

Lambda gtll-armer blir dannet ved spaltning av 100 pg lambda vektor DNA med EcoRI (New England Biolabs) ifølge forhandleren. Spaltet DNA ble defosforylert ved anvendelse av 1 enhet kalvetarm alkalisk fosfatase fra Boehringer Mannheim som beskrevet. 20-30 ng cDNA fra Bio-gel A15M-kolonnen blir kopresipitert i etanol med 1 pg gtll defosforylerte armer og resuspendert i 10 pl av en oppløsning inneholdende 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,8), 10 mM MgCl2 , 20 mM DTT, 1 mM ATP, 15% polyetylenglykol (MW 6.000) og 200 enheter T4 DNA-ligase. Ligeringsblandingen blir inkubert i 2 timer ved 16°C. Reaksjonsblandingen blir sentrifugert i 10 minutter og pelletten resuspendert i 10 pl sterilt vann og deretter in vitro pakket i 3 timer ved romtemperatur ifølge forhandleren

(Promega). 0,5 ml SM-fag fortynningsbuffer inneholdende 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 100 mM XaCl, 100 mM MgS04og 0,01% gelatin blir tilsatt og stabilisert med 25 pl kloroform. Totalt 500.000 fag blir amplifisert på 10 YT-skåler (15 cm diameter) ved anvendelse av 0.7% agarose-YT (Sigma) med E. coli Y1.090-celler som beskrevet (Young, R. og Davis, R. (1983) PNAS 80, 1194 ).

E. Screening og seleks. jon av . kloner inneholdende TGF- e 1.

TGF— 32 og TGF-& 3 innskudd

Seks replikanylonfiltre (Cuno) blir-dannet fra hver av de 10 YT-skålene og fagene på filtrene denaturert med 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl og nøytralisert som beskrevet i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1982). Filtrene blir plassert i 0,2 x SSC, 0,2% SDS ved 90°C i 15 minutter og deretter prehybridisert i 4 timer ved 45°C i 2 x SSC, 1% SDS, 0,1% ficoll, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 0,1% bovint serumalbumin, 50 mM NaP04(pH 6,8), 50 pg/ml denaturert laksesperm DNA, 0,1 pg/ml oligo A 12-18 og 100 pg/ml poly A<+>RNA. Hver av de 6 replikaene blir hybridisert over natt ved 45"C i prehybridiseringsbufferen der en av seks forskjellige<32p_>merkede 39 bp oligomerer (se nedenfor) er blitt tilsatt til en konsentrasjon på 2 x 10° cpm/ml.

Seks oligomerer anvendt for hybridisasjon blir syntetisert på en Applied Biosystem DNA synthesizer og korresponderer med nukleotidsekvensen som enten koder for de første aminosyrene (oligomerene 1, 3 og 5 ) eller de siste aminosyrene (oligomerene 2, 4 og 6 ) til de modne formene (112 aminosyrer) til TGF-el (se SEQ ID Nr. 1), TGF-32 (se SEO ID Nr. 2) og TGF-63 (se SEQ ID Nr. 3).

De to oligomerene anvendt for deteksjon av TGF-pl-sekvensene er:

1) 5' GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG 3'

2) 5' TCA GCT GCA CTT GCA GGA GCG CAC GAT CAT GTT GGA CAG 3'

De to oligomerene anvendt for deteksjon av TGF-62-sekvensene er : 3) 5' GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT 3' 4) 5' TTA GCT GCA TTT GCA AGA CTT TAC AAT CAT ATT AGA AAG 3'

De to oligomerene anvendt for deteksjon av TGF-63-sekvensene er: 5) 5' GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTG CGC AAC TTG GAG GAG 3' 6) 5' TCA GCT ACA TTT ACA AGA CTT CAC CAC CAT GTT GGA GAG 3' 40 ng av hver oligomer er merket ved 3'-enden ved anvendelse av<32>P-dATP og 20 enheter terminal transferase (Gibco-BRL) i en 20 pl reaksjonsbuffer inneholdende 100 mM kaliumkakodylat (pH 17,2), 2 mM CoCl2og 0,2 mM DTT i 1 time ved 37°C. Reaksjonsblandingen blir gelfiltrert over en Sephadex G-50-kolonne. Eluerte merkede oligomerer blir oppvarmet ved 95°C i 5 minutter og tilsatt til prehybridiseringsbufferen som beskrevet ovenfor.

Replikaene 1 og 6 blir hybridisert med oligomerene 1 til 6. Etter hybridisasjon blir filtrene vasket hver to ganger med 2 x SSC, 1 x SSC og 0,1 x SSC ved romtemperatur i 15 minutter. Positive plakk blir identifisert ved autoradiografi og blir screenet på nytt ved gjentagelse av prosedyren angitt ovenfor helt til alle plakkene på skålen er positive. En enkelt plakk blir eluert i 1 ml SM-fagfortynningsbuffer (se seksjon l.D), 100 ul blir tilsatt til 1 ml E. coli Y 1.090-celler og blandingen holdt i 20 minutter ved romtemperatur. E. coli Y 1.090-celler og fag blir tilsatt til 100 ml YT-medium inneholdende 0, 2% maltose og inkubert ved 37°C i 7 timer. Etter tilsetning av 1 ml kloroform til de lyserte cellene blir fag-DNA renset ifølge fremgangsmåten beskrevet i "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1982). Renset DNA blir løst opp i 1 ml 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA og 100 ul blir fullstendig spaltet i et totalt volum på 1 ml med EcoRI ifølge anbefalingene til forhandleren (Boehringer). Enzym- reaksjonen blir fenol/kloroform-ekstrahert og etanolpresipitert. EcoRI cDNA-innskuddene blir renset ved gelelektroforese (Ultrapure BRL) ved anvendelse av NA-45 DEAE-papir (Schleicher og Schuell). DNA blir eluert i 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 5 mM EDTA, 1 M NaCl, fenol/kloroform-ekstrahert og etanolpresipitert. Den resulterende pelletten blir vasket to ganger med 70% etanol og resuspendert i 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 mM EDTA.

F. Sekvensering av cDNA- innskuddene

EcoRI cDNA-innskuddene blir subklonet inn i Bluescript KS<+>vektor (Stratagene). cDNA-identiteten bekreftet ved dobbelt-trådet sekvensering ifølge fremgangsmåten beskrevet av F. Sanger et al. ( 1977 ) PNAS 74, 5463 ved anvendelse av overnevnte oligomerer (se seksjon l.E) og en Sequenase-kit (U.S. Biochemicals). Nukleotidsekvensen som omfatter 112 aminosyrer til moden TGF-61, TGF-62 og TGF-B3 er angitt under SEQ ID Nr. 1, 2 og 3.

G. Ampiifikasjon av cDNA- innskuddene og subkloning inn i

plasmid pGem- 5

Oligomerene ovenfor (se seksjon l.E) for identifisering av TGF-el, TGF-62 og TGF-63 sekvenser blir anvendt for å amplifisere cDNA-innskuddene kodende for modne 112 aminosyre-former (inkludert stoppkodonet).

EcoRI cDNA-innskuddene til Bluescript KS<+->plasmidene (se seksjon l.F) blir gelrenset som beskrevet ovenfor (se seksjon l.E). 50 ng av hvert cDNA-innskudd blir amplifisert i nærvær av 2 x 2 pg av respektive to oligomerer ved en polymerase-kjedereaksjon i en 100 pl reaksjonsblanding inneholdende 10 mM TRIS/HC1 (pH 8,35 ), 50 mM KC1 , 1,5 mM MgCl2, 0,05%

(v/v) NP-40, 0,05% (v/v) Tween 20 og 200 pm av hver av dATP, dGTP, dCTP og dTTP ved anvendelse av 5 enheter Taq-polymerase (Perkin-Elmer Cetus ). 30 runder av amplifikasjon blir utført under følgende temperaturer ved anvendelse av en Perkin-Elmer Cetus-oppvarmingsblokk: 93°C/0,1 minutter, 55°C/0,2 minutter,

71°C/1,5 minutter. Resulterende 339 bp fragmenter som dekker kodende sekvenser til TGF-e1 , TGF-62 og TGF-63 blir renset på gel og subklonet inn i plasmid PGem-5ZF(+) (Promega) spaltet med Ncol, defosforylert med kalvetarm alkalisk fosfatase (Boehringer) og ifylt med Klenow-polymerase (Gibco-BRL). Resulterende konstruksjoner blir betegnet pGKM 125 (TGF-ei). pGKM 740 (TGF-62) og pGKM 126 (TGF-63) og anvendt for å transformere kompetente E. coli Y 1.090-celler (se Eksempel 2). Kloner inneholdende riktige"innskudd kodende for TGF-61, TGF-62 og TGF-63 blir betegnet E. coli Y 1.090/pGKM 125 (TGF-e 1 ) , E. coli Y 1.090/pGKM 74 o" (TGF-62 ) og E. coli Y 1.090/pGKM 126 (TGF-63).

Eksempel 2:

Ekspresjon av TGF- 61. TGF- 62 og TGF- 63 i E■ coli

A. Generelle fremgangsmåter

Bakteriell stamme ( E. coli K12)

LC 137: htpRam, lonR9, lac^, mal^, trp^, pho^, rspL, tsx::TnlO, supCu(Goff, S.A. et al. (1984) PNAS 81, 6647-6651).

Plasmider

pPLMu: (Buell, G. et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 1923-1938). Dette plasmidet inneholder bakteriofag X P^-promoter med fag Mu ner gen robosom-bindingssete (Van Leerdam, E. et al. (1982) Virology 123, 19-28).

pcl857: Plasmid kodende for en termolabil XCI857-repressor og med resistens overfor kanamycin (Remault, E. et al.

(1983) Gene 22, 103-113).

SDS gelelektroforese

SDS polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og protein-farging blir utført som tidligere beskrevet (Laemmli, U.K.

(1970) Nature 227, 680-685) ved anvendelse av Miniprotean II-cellen fra BIORAD og 1 mm tykke 18% polyakrylamidgeler.

Varmeinduks. i on

7 ml LB-medium (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) i et 20 ml dyrk-ningsrør inneholdende 40 ug av både ampicillin og kanamycin (LB/amp/kan) blir inokulert med en enkelt koloni og inkubert med rysting over natt ved 30°C. 5 ml av denne over natt-kulturen blir tilsatt til 15 ml LB/amp/kan i en 100 ml Erlenmeyer-flaske. Denne flasken blir overført til en 423C vannbadryster. En 2 ml prøve blir tatt før overføring (ikke-induserende betingelser) og 1 ml prøver i intervaller på1time etter overføringen (induserende betingelser). Celler blir pellettert ved sentr i fuger ing (5 min., 10.000 rpm i en Eppendorf-sentrifuge) og supernatantene fjernet. Pelletten blir resuspendert i 100 ul prøvebuffer for SDS-PAGE og varmet i 10 min. ved 95°C. 5 ul aliquoter blir applisert for SDS-PAGE.

Preparering av kompetente celler

Kompetente E. coli-celler blir preparert ved kalsiumklorid-prosedyren som beskrevet i Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York. Celler inneholdende plasmid pcl857blir dyrket ved 30°C.

B. Konstruksjon av ekspresjonsvektorene pPLMu. hTGF- Sl.

pPLMu. hTGF- 62 og pPLMu. hTGF- 63 og ekspresjon av TGF- 61.

TGF- 62 og TGF- 63

E. coli Y 1.090/pGKM 125, E. coli Y 1.090/pGKM 740 og E. coli Y 1.090/pGKM 126 (se Eksempel l.G) celler blir dyrket i LB-medium og plasmid-DNA preparert ved metoden til Birnboim, H.C. og Doly, H. (1979) Nucleic Acids Research 7, 1513. 5 ug plasmid-DNA blir fullstendig spaltet i 50 ul restriksjons-buffer med enten Ncol og Sali (pGKM125), Ncol og EcoRV (pGKM740) eller Ncol alene (pGKM126) ifølge forhandlerens anbefalinger (Boehringer). DNA blir presipitert ved tilsetning av 5 ul 3 M natriumacetat , 100 mM MgCl2. 5 mM EDTA og 150 ul etanol. Etter inkubasjon ved -70°C i 15 min. blir DNA pellettert ved sentrifuger ing ved 13.000 g i 15 min. i SS34- rotor i en Sorval1-sentr i fuge. Supernatanten blir fjernet og pelletten resuspendert i 80 pl 0,089 M TRIS-borat, 0,089 M borsyre og 0,002 M EDTA (TBE-buffer) inneholdende 0,25% bromfenol-blå og 0,25% xylencyanol. 4 ganger 20 pl prøver blir elektroforert gjennom en1% agarosegel i TBE-buffer inneholdende 0,5 pg/ml etidiumbromid ved 50 volt helt til bromf enol-blå markøren når bunnen av den 10 cm lange og 0,8 cm tykke gelen. DNA-fragmentene kodende for moden TGF-e1, TGF-B2 og TGF-63 blir visualisert under kortbølge UV-lys, kuttet ut med et barberblad og elektroeluert fra gelstykket i et Schleicher & Schtill Biotrap-apparatur med påføring av 200 mamp i 1,5 timer. Eluerte DNA-fragmenter blir presipitert (se ovenfor) og resuspendert i 20 pl TE. 5 pl plasmid pPLMu blir linearisert ved spaltning med enten Ncol og Sali, Ncol og EcoRV eller Ncol alene og gelrenset som beskrevet ovenfor for fragment-DNA. 100 ng linearisert og renset pPLMu-vektor-DNA og 3 ganger molar ekvivalent av respektivt renset fragment-DNA blir inkubert ved 4°C i 15 timer i 20 pl 1igeringsbuffer (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM adenosintr i fosfat) inneholdende 1 enhet DNA-ligase (Boehringer). 10 pl av 1 igeringsblandingen blir tilsatt til 200 pl kalde (4°C) kompetente E. coli LC 137-celler inneholdende plasmid pclg57. Etter 30 min. blir cellene varmesjokkbehandlet ved inkubasjon i 1,5 min. i et 42°C vannbad. 2 ml LB-medium blir tilsatt og kulturen rystet i 60 min. ved 30°C. 200 pl aliquoter blir sådd ut på LB-skåler inneholdende ampicillin og kanamycin og inkubert i 22 timer ved 30°C. Enkeltkolonier blir dyrket og plasmid-DNA analysert. Subkloning av DNA-fragmentene kodende for TGF-61, TGF-62 og TGF-63 i pPLMu resulterer i plasmidene pPLMu.hTGF-ei, pPLMu.hTGF-62 og pPLMu.hTGF-63. Kloner inneholdende overnevnte konstruksjoner blir betegnet E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-ei, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-6 2 og E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-63.

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-61 , E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-6 2 og E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-63 celler blir varme indusert (se Eksempel 2.A) og uttrykte proteiner analysert ved SDS-PAGE. TGF-61, TGF-62 og TGF-63 fremkommer alle som varmeinduserte proteiner 2 timer etter varmeinduksjon migrerende med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 12.000 D.

C. Fermentering av transformantene

Over natt-kulturene til E. coLi LC 137/pPLMu.h.TGF-61, E. coli LC 137/pPLMu.h.TGF-62 og E. coli LC 137/pPLMu.h.TGF-63 i 2 1 Erlenmeyer-flasker inneholdende 750 ml LB-medium med 40 mg/l ampicillin og kanamycin blir dyrket ved 30°C. 300 ml av over natt-kulturene blir tilsatt til 750 ml LB-medium inneholdende antibiotika som nevnt ovenfor i 2 1 Erlenmeyer-f lasker og oppvarmet til 42° C med rysting i omtrent 3,5 minutter i et 65" C vannbad. Flaskene blir deretter overført til en 42°C ryster og inkubert i 3 timer. Flaskene blir kjølt ned til 12° C i et isvannbad og cellene samlet etter sentrifugering i 10 minutter ved 8.000 rpm i en GSA-rotor (Sorvall).

Eksempel 3

Ekspresjon av TGF- 61. TGF- 62 og TGF- 63 i Saccharomvces cerevisiae

Kodende sekvenser til moden TGF-61, TGF-62 og TGF-63 blir uttrykt i Saccharomyces cerevisiae under kontroll av den induserbare promoteren til sur fosfatase fra gjær (PH05).

Ekspresjonsvektorene blir konstruert i to trinn:

A. konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05-RIT 12,

B. konstruksjon av plasmidene pJDB207R/PH05-TGF-6l, pJDB207R/ PH05-TGF-62 og pJDB207R/PH05-TGF-63, hvor A) tilveiebringer gjærvektor og PH05-transkripsjonell terminator og B) tilveiebringer ekspresjonskassetter med et innskudd kodende for moden TGF-61, TGF-62 og TGF-63, under kontroll av PH05-promoteren.

A. Konstruksjon av plasmid pJDB2Q7/ PH05- RIT 12

Plasmid p31RIT 12 (EP-PS 277.313) blir linearisert med restriksjonsendonuklease Sali. Delvis Hindi 11-spaltning i nærvær av etidiumbromid resulterer i et 1 kb Sal I/Hindi 11-fragment omfattende 276 bp Sall/BamHI pBR322-sekvensen, 534 bp promoter og sur fosfatase fra gjær PH05, gjær-invertase-signalsekvensen (kodende for 19 aminosyrer) og PH05-transkripsjonel1 terminator. 1 kb SalI/Hindi 11-fragmentet til p31RIT 12 blir klonet- inn i gjær-E. coli-skytte 1-vektor pJDB207 (Beggs, J.D. i: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, København, 1981, sidene 383-389), som var blitt kuttet med Sali og Hindlll. Det resulterende plasmidet inneholdende 1 kb innskuddet blir betegnet pJDB207/PH05-RIT 12.

B. Konstruksjon av plasmid pJDB207R/ PH05- TGF- 62

Plasmid pGKM740 (TGF-62) (se Eksempel l.G) blir spaltet med Ncol. De klebrige endene blir fylt i en reaksjon med Klenow DNA-polymerase. EcoRI-linker (5'-CCGGAATTCCGG; Biolabs) blir tilsatt og blandingen ligert. Det resulterende sirkulære plasmidet blir betegnet pGKMA668 (TGF-62) og spaltet med EcoRI og Sali. Et 0,4 kb EcoRI/SalI-fragment blir isolert fra en agarosegel, renset og resuspendert i sterilt vann i en konsentrasjon på 25 pg/ml. Fragmentet inneholder den modne kodende sekvensen til TGF-62 med en ATG i ramme til kodon GCT som definerer aminosyre Ala 1 til moden TGF-62.

PH05-promoteren blir isolert fra plasmid p3lRIT 12 (se ovenfor) på et 534 bp BamHI/EcoRI-fragment. Plasmid pJDB207/ PH05-RIT 12 blir spaltet med BamHI og Xhol. Det store 6,8 kb BamHI/XhoI-fragmentet blir isolert. PH05-transkripsjonelle terminator forblir på fragmentet. BamHI/EcoRI PH05-promoter-fragmentet, EcoRI/Sal I-fragmentet kodende for TGF-62 og BamHI/XhoI-vektorfragmentet blir ligert. En riktig klon med TGF-62-genet under kontroll av PH05-promoteren klonet i en ikke riktig klokke-orientering inn i pJDB207 blir betegnetPJDB207R/PH05-TGF-62.

På en analog måte blir moden TGF-61 og TGF-63 uttrykt i S. cerevisiae. Plasmidene inneholdende kodende sekvenser til TGF-61 og TGF-63 er pGKM125 og pGKM26 , respektivt (se Eksempel l.G). Etter spaltning av disse plasmidene med Ncol, addisjon av EcoRI-1inkere og ligering, blir resulterende sirkulære plasmider spaltet med EcoRI og Sali. EcoRI/Sall-fragmentene blir klonet inn i pJDB207 som beskrevet ovenfor. Resulterende plasmider blir betegnet pJDB207R/PHO5-TGF-ei og pJDB207R/PH05-TGF-63.

C. Transformasjon av S. cerevisiae- stamme GRF18

Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (MATa, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can<R>, DSM 3665) blir transformert med plasmidene

pJDB2 07R/PH05-TGF-61

pJDB207R/PH05-TGF-62

pJDB207R/PH05-TGF-63

ved anvendelse av transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen, A. et al. (1978) PNAS 75, 1929. Transformerte gjærceller blir valgt på gjærminimalmediumskåler som mangler leucin. Enkle transformerte gjærkolonier blir isolert og betegnet

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-6l Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-e2 og Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-e3.

D. Fermentering av S. cerevisiae- transformanter og preparering av celle- ekstrakter

Gjærtrar.sf ormanter, som nevnt ovenfor, inneholder plasmider med PH05-promoterkontrollerte ekspresjonskassetter og krever derfor cerepresjon av promoteren for ekspresjon av TGF-61, TGF-62 eller TGF-63. Transformantene blir hver dyrket i to suksessive prekulturer (10 ml og 50 ml) i gjær høyt P-^ minimalmedium fremstilt ifølge oppskriften til Difco-gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, men som inneholder 10 g/l L-asparagin istedenfor (NH4)2S04, 1 g/l L-histidin og 20 g/1 glukose. Cellene i den andre prekulturen blir vasket i 0,9% NaCl og alle cellene anvendt for å inokulere 100 ml lav Pjminimalmedium fremstilt ifølge oppskriften til Difco-gjær-nitrogenbasemedium (uten aminosyrer), men som inneholder 0,03 g/l KH2P04, 10 g/l L-asparagin, 1 g/l L-histidin og 20 g/l glukose. Kulturene blir agitert ved 30°C ved 180 rpm.

Celler fra 10 ml kultur ble samlet etter 5 timer, 24 timer og

48 timer ved sentrifugering ved 3.000 rpm og vasket en gang i 0,9% NaCl. Cellepelletten blir resuspendert i lyseringsbuffer [66 mM kaliumfosfat pH 7,4, 4 mM Zwlttergent (Calbiochem)] . 8 g glasskuler (0,5-0,75 mm diameter) blir tilsatt og suspensjonen omfattende rystet 4-5 ganger i 2 min. hver på en Vortex-mikser i kulde. Celleekstraktet blir dekantert for å fjerne glasskulene. Celledebriset i ekstraktet blir sedi-mentert ved sentrifugering i 5 min. ved 3.000 rpm ved 4°C. Supernatanten og pellettene blir separert og lagret ved -20°C.

Eksempel 4

Fremstilling av dimerisk.biologisk aktiv TGF- Bl. TGF- 62 og TGF- B3

Prosedyrene angitt nedenfor for fremstilling av dimerisk, biologisk aktiv TGF-B2 kan bli anvendt analogt for isolering av dimerisk, biologisk aktiv TGF-Bl, TGF-B3 og andre "TGF-e-lignende proteiner".

A. Isolering av ikke- oppløselig. monomerisk TGF- B2 fra E.

coli

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-e2-celler blir fermentert som beskrevet i Eksempel 2.C. Celleødeleggelse og isolering av ikke-oppløselig TGF-B2 blir utført ved 4°C. Omtrent 18 g våtceller blir suspendert i 60 ml 0,1 M TRIS/HC1, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (fenylmetansulfonylfluorid), pH 8,3 (ødeleggelses-buffer). Cellene blir sendt to ganger gjennom en Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) ifølge fremstillerens instruksjoner og volumet blir bragt til 200 ml med ødeleggelsesbufferen. Suspensjonen blir sentrifugert i 20 min. ved 15.000 g. Den oppnådde pelletten blir suspendert i 100 ml ødeleggelses-buffer inneholdende 1 M NaCl og sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Pelletten blir suspendert i 100 ml ødeleggelses-buffer inneholdende 1% Triton X-100 (Pierce) og sentrifugert på nytt i 10 min. som ovenfor. Den vaskede pelletten blir deretter suspendert i 50 ml 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% DTT og homogenisert i en Tef lon-vevsmaler. Den resulterende suspensjonen inneholder, rå monomerisk TGF-62 i en ikke-oppløselig form.

B. Oppløsning og rensing av monomerisk TGF- 62

10 ml TGF-62-suspensjon tilveiebragt ifølge Eksempel 4.A eller 4.C blir surgjort med 10% eddiksyre til pH 2,5 og sentrifugert i en Eppendorf-sentr ifuge i 10 min. ved romtemperatur. Supernatanten blir kromatografert på en Sephacryl S-100-kolonne (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) i 10% eddiksyre ved en strømningshastighet på 1,4 ml/min. (Alternativt kan kromato-graferingen bli utført på Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) og kolonnen kan bli kjørt i 1% eddiksyre eller 5 mM HC1). Fraksjoner inneholdende monomerisk, denaturert TGF-62 eluerende mellom 190 min. og 220 min. blir slått sammen. Dette materialet blir anvendt for refolding for å tilveiebringe biologisk aktiv, dimerisk TGF-62 (Eksmplene 4.G.J.K.L) eller for ytterligere rensing for strukturanalyse (Eksempel 4.D. ).

C. Isolering av monomerisk TGF- 62 fra Saccharomyces cerevisiae

Pellett med brukne celler tilveiebragt fra en 500 ml fermen-tasjon utført som beskrevet i Eksempel 3.D blir suspendert i 20 ml 4M urea, 0,1 M TRIS, 1% DTT, pH 8,0. Blandingen blir holdt ved romtemperatur i 30 minutter med vorteksing hvert 5. minutt. Uoppløselig materiale blir fjernet ved sentrifugering ved 30.000 g i 30 minutter ved 4"C og supernatanten justert til pH 2,5 med eddiksyre og omfattende dialysert mot 5% eddiksyre over natt ved 4°C. Oppløsningen blir sentrifugert som ovenfor og den klare supernatanten konsentrert ved ultrafiltrering på en YM 10-membran (Amicon) til et slutt-volum på 4 ral. Prøven blir deretter kromatografert på Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) i 5% eddiksyre som beskrevet i Eksempel 4.B. med tilveiebringing av monomerisk TGF-62.

D. Ytterligere rensing av monomerisk TGF- 62 ved RP- HPLC

Aliquoter av sammenslåtte fraksjoner fra Sephacryl S-100-kolonnen (Eksempel 4.B.) blir renset på en Vydac 214TP5415 HPLC revers fasekolonne (4,6 x 150 mm, The Separations Group, Hesperia, CA, USA). Kolonnen blir ekvilibrert i en blanding av 70% TFA 0,1% i vann og 30% TFA 0,08% i acetonitril, og produktet eluert i en lineær gradient over 30 min., som slutter med en blanding av 55% TFA 0,1% i vann og 45% TFA 0,08% i acetonitril i en strømningshastighet på 1 ml/min. Eluatet blir registrert for absorbans ved 216 nm og individuelle topper blir samlet manuelt ifølge UV-absorbansen. Denaturert, monomerisk TGF-62 blir eluert ved 21,5 min. Avhengig av den individuelle revers-fasekolonnen som blir anvendt som separasjon av det samme preparatet av TGF-62 blir eluert rundt 16 min. og 18 min.

TGF-62-fraksjonene blir analysert ved RP-HPLC ved anvendelse av samme kolonne og oppløsningsmiddelsystem som ovenfor. TGF-62 blir eluert ved en lineær gradient over 42 min. begynnende fra 100% TFA 0,1% i vann og som slutter med en blanding på 30% TFA i vann og 70% TFA 0,08% i acetonitril. TGF-62 blir eluert som en enkelt topp etter 30,4 min. Avhengig av den individuelle kolonnen anvendt blir reten-sjonstider på 29 min. og 29,9 min., respektivt, tilveiebragt.

TGF-62 blir analysert etter samblanding av kjemisk redusert naturlig porcin TGF-62 (British Biotechnology Limited, Oxford, UK) som har en identisk primærstruktur som human TGF-62 (Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131). Blandingen eluerer som en enkelt topp og bekrefter identiteten til materialet.

E. Analyse av monomerisk TGF- B2 ved SDS- PAGE

Individuelle aliquoter fra Sephacryl S-100 kolonnen (Eksempel 4.B) eller revers-fasekolonnen (Eksempel 4.D) blir tørket i vakuum og analysert med SDS-PAGE (Låmmli, U.K. (1970) Nature 227, 680) på 15% polyakrylamid slaggeler farget med Coomassie-blå R-250. Et enkelt bånd med tilsynelatende molekylvekt på omtrent 12.000 D blir tilveiebragt og kan ikke skjelnes fra redusert naturlig porcin TGF-B2.

F. N. terminal aminosyresekvens- bestemmelse av monomerisk

TGF- B2

TGF-B2 fra Eksempel 4.B blir avdampet i vakuum, løst opp i 25 ul eddiksyre og utsatt for aminosyresekvens-bestemmelse på en gassfase proteinsekvensatormodell 470A (Applied Biosystems ).

Den N-terminale aminosyresekvensen er:

5 10 15 Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-X-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X-X-Leu-Arg-Pro

der X betegner en aminosyre som ikke er blitt positivt bestemt.

Den N-terminale aminosyresekvensen blir bestemt for 4-vinylpyridin-derivatet til TGF-B2 fremstilt som beskrevet av Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131.

Den N-terminale aminosyresekvensen er:

5 10 15 Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X-20 25

Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-X-Arg-Asp-Leu-

der X betegner en aminosyre som ikke er positivt identifisert. Cystein ble bestemt som S-pyridyletylcystein.

G. Dannelse av dimerisk, biologisk aktiv TGF- 32

3 mg monomerisk denaturert TGF-32 fra Eksempel 4.B blir løst opp i 140 ml 50 mM Tris/HCl pH 8,0, IM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation, 1 mM oksidert glutation og 33 mM Chaps (Calbiochem). Etter 72 timer ved 4°C blir pH til oppløsningen justert til pH 2,5 med HC1 og blandingen konsentrert 10 ganger ved ultrafiltrering på en YM 10-membran (Amicon, Danvers, MA, USA) i en Amicon-rørt celle. Den konsentrerte oppløsningen blir fortynnet til det opprinnelige volumet med 10 mM HC1 og konsentrert til et finalt volum på 10 ml ved samme metode. Det dannede presipitatet blir fjernet ved sentrifuger ing ved 5.000 g i 30 minutter. Supernatanten inneholder disulfid-bundet dimerisk TGF-32 vurdert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Den biologiske aktiviteten til preparatet blir målt ved cellemigrering og vekstanalyse (Eksempel 5.A) og cellevekstinhibisjonsanalyse (Eksempel 5.B).

Alternativt, istedenfor anvendelse av monomerisk TGF-32, blir S-sulfonert TGF-32-derivåtet (Eksempel 4.M) anvendt for dannelsen av dimerisk aktiv TGF-32 ved anvendelse av hovedsakelig prosedyren beskrevet i dette eksemplet med unntagelse av natriumklorid-konsentrering som er 2M. Rensing og isolering av dimerisk TGF-32 blir utført ved samme fremgangsmåte som dimerisk TGF-32 dannet fra ikke-derivatisert monomerisk protein (Eksempel 4.H og 4.1).

H. Isolering av dimerisk TGF- 32 ved kationbvttekromatografi

på en Mono S- kolonne

Den konsentrerte oppløsningen fra Eksempel 4.G blir anvendt ved en strømningshastighet på 1 ml/min. på en Mono S HR 5/5 kolonne (Pharmacia) ekvilibrert i en blanding av 85% buffer A (20 mM natriumacetat, 30% isopropanol, pH 4,0) og 15% buffer B (buffer A inneholdende 1 M natriumklorid). Kolonnen blir deretter vasket ved samme strømningshastighet ved å holde bufferblandingssammensetningen konstant helt til absorbans-avlesningen ved 280 nm har nådd baselinjenivået, etterfulgt

/

av en lineær gradient over 20 minutter begynnende ved injeksjon ved 1ikevektsbetingelsene og slutter med en blanding av 50% buffer A/50% buffer B. Dimerisk biologisk aktiv TGF-32 blir eluert 9 minutter etter begynnelsen av gradienten og samlet manuelt. Vurdert ved biologisk akti-vitetsbestemmelse, SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og RP-HPLC ble det ikke funnet dimerisk TGF-62 i gjennomstrømningsfraksjonen. I tillegg ble det ikke påvist monomerisk TGF-62 ved SDS-PAGE i dimerisk TGF-62-toppen eluert fra kolonnen av saltgradienten.

I. Ytterligere rensing av dimerisk TGF- 62

Dimerisk TGF-62 fra Eksempel 4.G blir fortynnet med det samme volumet 0,1% TFA i vann og utsatt for RP-HPLC på en Vydac 214TP5415-kolonne (4,6 x 150 mm, The Separations Group, USA) ekvilibrert i en blanding av 80% TFA 0,1% i vann og 20% TFA 0,08% i acetonitril. Kolonnen blir eluert med en lineær gradient over 40 min. begynnende ved injeksjon ved likevekts-betingelser og som avsluttes med en blanding av 60% TFA 0,1% i vann og 40% TFA 0,08% i acetonitril ved en strømnings-hastighet på 1 ml/min. Eluatet blir registrert for absorbans ved 216 nm. TGF-62 blir eluert med en retens j onstid på 32,7 min. og samlet manuelt. SDS-PAGE-analyse under ikke-reduserende betingelser viste et enkelt skarpt bånd med tilsynelatende molekylvekt på omtrent 25 kD. Tilveiebragt dimerisk TGF-62 har høy renhet.

J. Alternativ fremgangsmåte I for fremstilling av dimerisk.

biologisk aktiv TGF- 62

Monomerisk TGF-62 fra Eksempel 4.B blir løst opp i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml i 50 mM natriumfosfat, pH 8,0, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, 2,5 mM cystein, 1 mM cystin og 50 mM Chaps (Calbiochem). Etter 300 timer ved 4°C blir pH justert til pH 2,5 med 10% TFA. Deretter blir 30 mg/ml Sepralyte C-l (preparativ kvalitet, 40 pm, Analytichem International, Harbor City, CA, USA), forbehandlet sekvensielt med 0,1% TFA i acetonitril og 0,1% TFA i vann, tilsatt og blandingen blir forsiktig rørt i 30 min. ved romtemperatur. Gelen blir filtrert over en glassfritte dekket med frisk forvasket Sepralyte C-l (20% av mengden tilsatt til refoldingsoppløs-ningen). Gelen blir vasket først med (5 ganger gelvolumet) buffer A (0,2 M NaCl/0,1% TFA/vann), deretter med en blanding av 80% buffer A og 20% buffer B (0,08% TFA i acetonitril). TGF-32 blir eluert med en blanding av 70% buffer A og 30% buffer B. Eluatet blir applisert direkte på en Mono S-kolonne ER 5/5 (Pharmacia). Rensing og isolering av TGF-32 blir utført som i eksemplene 4.H og 4.1.

Alternativt blir acetonitril i buffer A og buffer B anvendt for vasking av Sepralyte C-l gelen og eluering av TGF-32 erstattet med isopropanol. Vasking blir deretter utført med en blanding av 90% buffer A og 10% buffer B og eluering av TGF-32 blir oppnådd med en trinnvis gradient (trinnvis 2% buffer B) begynnende med en blanding av 80% buffer A og 20% buffer B og avslutter med en blanding av 70% buffer A og 30% buffer B. Ytterligere prosedyre er som Eksemplene 4.H og 4.1.

K. Alternativ fremgangsmåte II for fremstilling av dimerisk,

biologisk aktiv TGF- 32

Monomerisk TGF-32 fra Eksempel 4.B blir løst opp i en konsentrasjon av 0,5 mg/ml i 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, IM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM redusert glutation, 1 mM oksidert glutation og 50 mM Chaps (Calbiochem). Etter 450 timer ved 4°C blir blandingen justert til pH 4,0 med eddiksyre, fortynnet ved tilsetning av 7 volumer 20 mM natriumacetat, pH 4,0 og pumpet på en Mono S-kolonne HR 5/5 (Pharmacia). Ytterligere prosedyre som i Eksempel 4.H og 4.1.

L. Alternativ fremgangsmåte III for fremstilling av dimerisk, biologisk aktiv TGF- 32 ved anvendelse av tioredoksin som

et disulfid- fremmende middel

Monomerisk TGF-32 fra Eksempel 4.B blir løst opp ved en konsentrasjon av 0,025 mg/ml i 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 50 mM Chaps, 0,05 mg/ml tioredoksin. Blandingen blir inkubert ved 4°C i 24 timer. Bestemt ved cellemigrering og vekstanalyse (Eksempel 5.A) er utbyttet av refoldet dimerisk aktiv TGF-32 lik det ifølge fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 4.G. Rensing og isolering av dimerisk TGF-32 er som i Eksemplene 4.H og 4.1. TGF-32 blir separert fra tioredoksin i Mono S-kolonne ifølge Eksempel 4.H. M. Fremstilling av S- sulfonert TGF- 32 og anvendelse derav for

dannelse av dimerisk, biologisk aktiv TGF- 32

Monomerisk TGF-32 fra Eksempel 4.B blir løst opp ved romtemperatur i 6M urea, 100 mM Tris/HCl", pH 8,0, 50 mM natriumsulfitt og 0,2 mM cystein. Dannelse av S-sulfonert TGF-32 blir registrert ved RP-HPLC ved anvendelse av betingelsene ifølge Eksempel 4.D. Retensjonstiden til S-sulfonert TGF-32 er 31,8 min. Etter endt reaksjon blir pH til oppløsningen justert til pH 2,0 med 1 N HC1. S-sulfonert TGF-32 blir avsaltet på en FPLC "Fast Desalting Column" HR 10/10 (Pharmacia) i 10 mM HC1. Refolding av S-sulfonert TGF-32 for tilveiebringing av dimerisk aktiv TGF-32 blir utført hovedsakelig ifølge fremgangsmåten i Eksempel 4.G.

N. Recvklisering av uriktig foldet TGF- 32

Fast guanidiniumhydroklorid og DTT blir tilsatt til materialet som ikke er bundet til Mono S-kolonnen ifølge Eksempel 4.H for å tilveiebringe en konsentrasjon på henholdsvis 6 M og 5 mM, og pH blir justert til pH 8,5 med fast Tris. Etter 1 time ved romtemperatur blir blandingen utsatt for RP-HPLC ved anvendelse av samme kolonne og oppløsnings-middelsystem som i Eksempel 4.D. Redusert monomerisk TGF-32 blir samlet, og acetonitril fjernet i vakuum. Dette preparatet blir deretter utsatt for refoldingsprosedyren ifølge Eksempel 4.G enten direkte eller sammen med nylig isolert monomerisk TGF-32 fra Eksempel 4.B eller 4.C, for derved å forbedre det totale utbyttet av refoldet aktivt dimerisk TGF-32.

43

0. Dannelse av heterodimerisk, biologisk aktiv TGF- e Heterodimeriske TGF-e består av to forskjellige disulfid-bundede polypeptidkjeder med hver 112 aminosyrer og kan bli fremstilt ved å utsette ekvimolare mengder av de to respektive monomerene for refoldingsbetingelser som beskrevet i Eksempel 4.G. Rensing og isolasjon av dimerene blir utført ifølge Eksemplene 4.Hog 4.1 som muliggjør separasjon av den heterodimeriske formen fra homodimerene.

P. Peptid- kartlegging og sekvensbe& temmelse av monomerisk

TGF— ei. TGF- 62 og TGF- e3.

TGF-62:

92 ug (6,7 nmol) S-pyridyletylert rekombinant TGF-62 beskrevet i Eksempel 4.F blir tørket i en vakuumsentrifuge og løst opp i 200 ul 5 mM HC1 . 200 ul 0,2 M Tri s-acetatbuf f er, pH 7,8, inneholdende 10 mM Zwittergent 3-12 detergent (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA) blir tilsatt og blandet med proteinoppløsningen. Spaltningen blir utført med 2 ug (løst opp i 50 ul vann) endoproteinase Asp-N (fra Pseudomonas fragi mutant, Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG) ved 37°C. Etter 13 timer blir 50 ul 10%

(v/v) TFA tilsatt og blandingen separert ved RP-HPLC på en C4 snever-borekolonne (Vydac 214TP52, 2,1 x 250 mm) med en lineær gradient på 5 til 40% (v/v) acetonitril i 0,1% TFA/vann i 35 min. ved en strømningshastighet på 0,1 ml/min. og UV deteksjon ved 216 nm. Samlede topper blir analysert ved plasma desorpsjonsmasse-spektroskopi som beskrevet i Eksempel 4.S.

Sammenligningen av målt molekylmasse (i Dalton, D) av peptidene i deres protonerte form (M+H<+>) med beregnet molekylmasse muliggjør følgende identifikasjon:

TGF-el:

32 ug (2,5 hmol) S-pyridyletylert rekombinant TGF-el (fremstilt som S-pyridyletylert rekombinant TGF-e2) blir spaltet med 1,5 ug endoproteinase Lys-C ved anvendelse av samme fremgangsmåte som for spaltning av TGF-e2 med unntagelse av at inkubasjonstiden er 9 timer og en lineær gradient på 12 til 27% acetonitril i 90 min. blir anvendt på en C18-kolonne (Vydac 218TP5205, 2,1 x 50 mm).

TGF-63:

20 ug (1,46 nmol ) S-pyridyletylert rekombinant TGF-63 (fremstilt som S-pyridyletoksylert rekombinant TGF-62) blir spaltet med 0,4 pg endoproteinase Asp-N som beskrevet for TGF-62 med unntagelse av at inkubasjonstiden er 22,5 timer og separasjonen blir utført på en C18-kolonne (Vydac 218TP5205, 2,1 x 50 mm) med en lineær gradient på 16 til 32% acetonitril i 80 min.

Q. Strukturell karakterisering av monomerisk TGF- 62 uttrykt i

Saccharomyces cerevisiae

En aliquot av materialet fra Eksempel 4.C blir ytterligere renset ved RP-HPLC som beskrevet i Eksempel 4.D og den N-terminale aminosyresekvensen blir bestemt som beskrevet i Eksempel 4.F.

Aminosyresekvensen er:

der X betegner en aminosyre som ikke er positivt identifisert .

R. Refolding av monomerisk TGF- 32 uttrykt i Saccharomyces cerevisiae og isolering og karakterisering av dimerisk

TGF- 62

Refolding av monomerisk TGF-32 uttrykt i Saccharomyces cerevisiae og isolering av dimerisk biologisk aktiv TGF-62 blir utført som beskrevet i Eksemplene 4.G, 4.H og 4.1.

S. Molek<y>lmasse til dimerisk TGF- 62

En aliquot på 6 ug monomerisk TGF-62 og 20 pg dimerisk biologisk aktiv TGF-62 tilveiebragt i Eksemplene 4.D og 4.1 blir løst opp i 25% eddiksyre, adsorbert på nitrocellulose og analysert på et BIO ION 20 Plasma-desorpsjonsmassespektro-meter (Applied Biosystems, Uppsala, Sverige). Bestemte molekylmasser er

M = 12.738,0 for monomerisk TGF-62 (beregnet masse

M = 12.719,7)

M = 25.422,0 for monomerisk TGF-62 (beregnet masse M = 25.421,2 idet alle cysteiner beregnes som disulfider)

T. Molek<y>lmasse til dimerisk TGF- 63

Dimerisk biologisk aktiv TGF-63 blir fremstilt som TGF-62 beskrevet i Eksemplene 4.A, 4.B, 4.G, 4.H og 4.1. Molekyl-massen til dimerisk biologisk aktiv TGF-63 blir bestemt som beskrevet i Eksempel 4.S. Funnet molekylmasse er: M = 25.434,0 (beregnet masse M = 25.427,2 med antagelsen

at alle cysteiner er disulfider)

Eksempel 5

In vitro- aktivitetstest for TGF- 61. TGF- e2 og TGF- 63

A. Cellemigrering og vekstanalvse

Analysen er basert på den kjemotaktiske aktiviteten til TGF-6 på fibroblaster (Postlethwai te, A.E. et al. (1987 ) J. Exp. Med. 165.251) og blir utført som beskrevet av Burk, R. (1973) PNAS 70.369.

Den cellemigrerende fremmende aktiviteten til TGF-el, TGF-62 og TGF-63 blir analysert ved måling av antallet normale Balb/c 3T3-fibroblaster som migrerer over en dyrkningsperiode på 22 timer inn i en såret monolagskultur av nevnte celler i serumfritt medium (Dulbecco's modifiserte Eagle-medium, Gibco) inneholdende TGF-el, TGF-62 eller TGF-63, sammenlignet med antallet fibroblaster som migrerer inn i en såret monolagskultur i fravær av TGF-e.

Den vekstfremmende aktiviteten til TGF-el, TGF-62 og TGF-63 blir bestemt ved den stimulerende effekten på cellulær DNA-syntese og celledeling. Denne aktiviteten fremkommer i nevnte monolagskulturer observert under lysmikroskop etter en dyrkningsperiode på 44 timer og blir kvantifisert ved enten

a) telling av antallet cellekjerner, i et hvilket som helst gitt betraktningsområde, i kulturer av nevnte celler

dyrket i serumfritt medium inneholdende henholdsvis TGF-el, TGF-62 eller TGF-63, sammenlignet med antall

cellekjerner som blir talt, i et hvilket som helst gitt betraktningsområde, i kulturer dyrket i fravær av TGF-e eller

b) måling av mengden radiomerket<3>H-tymidinopptak i kulturer av nevnte celler dyrket i serumfritt medium inneholdende

henholdsvis TGF-el, TGF-e2 eller TGF-e3, sammenlignet med mengden av<3>H-tymidinopptak i kulturer dyrket i fravær av TGF-e.

I disse doserespons-eksperimentene er konsentrasjoner av fullstendig rensede TGF-el, TGF-B2 og TGF-e3 proteiner (se Eksempel 4.K) i området 0,1 til 1.000 pg pr. milliliter kulturmedium tilstrekkelig for å oppnå 50% av maksimal migrering og vekstfremmende respons.

B. Cellevekst inhibisjonsanalvse

Kolorimetrisk analyse er basert på den inhibitoriske virkningen av TGF-e på veksten av humane A 375-melanomceller (Brown, T.J. et al. (1987) J. Immunol. 139, 2977). TGF-el, TGF-32 og TGF-e3 prøver blir fortynnet i serie (1:3) i flatbunnede 96-brønns vevskulturplater (Falcon) inneholdende RPMI-1.640 medium (Gibco) og 5% fetalt kalveserum. Kontroll-brønnene mottok bare medium. 1,5 x IO<4>A375-melanomceller blir tilsatt til hver brønn. Etter en inkubasjonsperiode på 72 timer ved 37° C i 5% C02blir A375-cellemonolagene vasket en gang, fiksert og farget med krystallfiolett i 15 minutter. Ubundet farge blir grundig vasket ut. Fargede celler blir lysert med 33% eddiksyre for å frigjøre fargen (som er i cellekjernen) og OD ble målt ved 590 nm med et multiskan-8 Channel fotometer utstyrt med en Olivetti M 24 PC for å beregne aktiviteten til testforbindelsene. På grunn av at intensiteten på fargingen i hver brønn er direkte knyttet til antall kjerner (og derfor til antall celler), tilveiebringer denne teknikken en koiorimetrisk analyse for måling av anti-proliferative virkninger til TGF-el-, TGF-e2- og TGF-e3-molekylene.

Behandling med renset TGF-el, TGF-e2 og TGF-e3 over et konsentrasjonsområde på 0,001 til 10 nM hemmer veksten av A375-melanomcellene.

Eksempel 6

In vivo- aktivitetstester for refoldet TGF- el. TGF- 62 og TGF- 63

A. Leging av delvis- tykkelsessår 1 gamle mus

Det er kjent at prosessene ved leging av sår blir forringet med øket alder (Grove, G.L. (1982) Arch. Dermatol. Res. 272:381) og utgjør derfor store problemer innenfor feltet geriatrisk medisin. In vivo biologiske virkninger av refoldet aktiv dimerisk TGF-e på leging av delvis-tykkelsessår (dannet ved annengradsforbrenning) blir undersøkt i en delvis manglende eller forringet reparering av sår-situasjonen, i gamle dyr, ved anvendelse av følgende protokoll som er lik den beskrevet av Schulz, G.S. et al. (1987) Science 235:350.

Enkelte midtdermale termiske sår blir utført på dorsal thorax til bedøvede gamle C57/BL6-mus (alder 450 dager eller mer), hvor ryggene på forhånd er blitt barberte og behandlet med en kommersiell kremtype hårfjerner ved en enkelt 10 sekunders anvendelse av en messingtemplat (lxl cm, 8 g) som er blitt ekvilibrert ved 80° C i et vannbad. Den resulterende blemmen blir fjernet kirurgisk og brannsårene behandlet daglig, i 5 dager, med en topisk applikasjon av 25 ul steril baererbuffer-oppløsning (bestående av 0,8% v/v hydroksypropylcellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (500 ng, 100 ng eller 10 ng) av refoldet aktiv dimerisk TGF-6-form, eller med bufferoppløsning alene, eller blir ubehandlede. Alle topisk påførte materialer er sterile, endotoksin-frie og pyrogenfrie, og alle mus blir individuelt buret inn i løpet av eksperimentets varighet. Hver eksperimentelle gruppe består av 5 dyr.

Etter 5 dagers behandling med TGF-e blir musene bedøvet, blemmene (dersom tilstede) blir kirurgisk fjernet fra brannsårene, og brannsårene fotografert. Brannområder som har regenerert epitelium blir fremhevet på "overhead projector film" som er gjennomsiktig med jevn størrelse og prosent-andelen av hvert opprinnelige brannsårområde som er leget blir beregnet ved planimetri. Resultatene blir også sammenlignet med epitelisk regenereringsprosess i unge (56-84 dager gamle) C57/BL6-mus med identiske midtdermale brannsår som blir ubehandlede i løpet av eksperimentet.

Et eksempel på et slikt eksperiment ved anvendelse av refoldet dimerisk aktiv TGF-e2 er vist i følgende tabell hvor viste verdier representerer gjennomsnittet og område for gruppevurderingene.

Resultatene av planimetriske analyser vist i tabellen ovenfor demonstrerer at topisk applikasjon av refoldet aktiv dimerisk TGF-62 daglig i 5 dager i en egnet bærerbuffer stimulerer og aksellererer regenerering av epitel i delvis-tykkelsessår i eldre mus på en doseavhengig måte (gruppene 1-3) sammenlignet med bare bærerbuffer eller ubehandlede sår (gruppene 4 & 5). Unge mus er nok kompetente til å regenerere epitel i sårene i fravær av topisk påført TGF-e (gruppe 6). Histologiske analyser viser omfanget av den forsterkede nyepiteldannelses-prosessen sammen med en hyperkeratose av regenerert epidermis på dag 6 i TGF-e-behandlede sår.

B. Leging av ful 1- tykkelsessår i voksne rotter

De biologiske virkningene til refoldet aktive dimeriske TGF-e blir også undersøkt i en annen in vivo-modell for reparering av sår, dvs. ved leging av ful 1-tykkel sessår (dannet ved kirurgisk innsnitt) i voksne rotter, ved anvendelse av følgende protokoll som er lik den som er beskrevet av Mustoe, T.A. et al. (1987) Science 237:1333.

Enkelte, ful1-tykkelse 5 cm lange. 1ineære innsnitt blir laget med kirurgiske sakser 1,5 cm på begge sider av den dorsale midtlinjen til pentobarbiton-bedøvede hann-Wistar-rotter (300-350 g) der ryggene på forhånd er blitt barberte og behandlet med en kommersiell kremtype hårfjerner. I eksperi-mentgruppene får kantene til venstreside-innsnitt (sett med dorsalsiden øverst) enkelte topiske applikasjoner (100 ul) av en steril bærerbuffer (bestående av 0,8% v/v hydroksypropylcellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (2 ug, 1 ug, 0,1 ug eller 0,01 ug) av en refoldet aktiv dimerisk TGF-6-form. Kantene til kontralaterale høyresidige innsnitt mottar tilsvarende like mengder av en placebo-kontrol1 (bovint serumalbumin) i nevnte bærerbuffer og innsnittskantene i kontrolldyrene mottar bare bærerbuffer i venstresidige innsnitt og ingen behandling i høyresidige innsnitt etter kirurgisk innsnitt. Alle topisk påførte materialer er sterile, endotoksinfrie og pyrogenfrie. Kantene til hvert sår blir deretter belagt med 5 jevnt plasserte, avbrutte hori-sontale madrass-sting av 5-0 Ethilon. Alle dyrene blir huset separat og sårene blir leget i forskjellige perioder opp til og inkludert 21 dager etter behandling. Etter ofring blir hele dorsalhuden fjernet fra hvert dyr og subkutant fett forsiktig dissektert fra undersiden av huden ved anvendelse av en kirurgisk skalpell. Et templat bestående av to parallelle kirurgiske blad (8 mm avstand mellom bladene) blir deretter anvendt for å skjære ut hudstrimler (mellom stingene på hvert innsnitt) for strekkfasthetsmålinger. Prøver blir tatt fra en ende av hvert innsnitt for histologisk analyse. Maksimal belastning tolerert av hver utskårede hudprøve blir målt med en universal strekkfasthets-maskinmodel1 144501 (Zwick, Ulm, FRG ) . Målinger blir utført på 30 mm x S mm strimler som er festet mellom hydrauliske klyper og deretter strukket til bristepunktet i en grad av 10 mm pr. minutt, med maksimal belastning registrert på en kartmåler. Målinger blir utført på triplikate prøver fra hvert sår og eksperimentell-gruppene bestod av 4 dyr. Bruddstyrke blir ikke målt på sår som viser tegn på infeksjon eller- omfattende blødning (mindre enn 3% av alle sårene).

Et eksempel på et slikt eksperiment ved anvendelse av refoldet dimerisk aktiv TGF-62 er vist i følgende tabell hvor verdiene som er vist representerer gjennomsnittsforholdene til strekkfasthet mellom TGF-e2-behandlede sår og placebo-behandlede sår ved 3 tidspunkter med lik avstand over en periode på en 21 dagers dagtid.

Resultatene til strekkfasthetsmålingene vist i tabellen ovenfor demonstrerer at enkel topisk applikasjon av refoldet aktiv dimerisk TGF-62 i en egnet bærerbuffer forsterker bruddstyrken opp til 2 ganger, og aksellererer legingen av full-tykkelses innsnittssår i voksne rotter på en doseavhengig måte over en 21 dagtidsperiode (gruppene 1-4) sammenlignet med kontrollgruppen (gruppe 5). Histologiske analyser viser den markert økte influks av mononukleære celler, fibroblaster og collagenproduksjon i TGF-6-behandlede sår over 21 dagers perioden sammenlignet med kontrol1 sårene. En forbigående hyperkeratose er også synlig i TGF-e-behandlede sår opp til 14 dager etter behandling.

C. Sår-" chamber"- implanteringsmodelI i voksne rotter

De biologiske virkningene av refoldet aktiv dimerisk TGF-e blir også undersøkt i en tredje in vivo-modell for reparering av sår, dvs. på cellulær innvekst, vaskularisering og dannelse av fibrøst granuleringsvev i og rundt porøse "chamber"-implantater i voksne rotter, basert på en protokoll som er lik den som er beskrevet av Sp<*>brn, M.B. et al., ( 1983) Science 219:1329. ;Tomme stive polytetrafluoretylen-rør (indre og ytre dia-metere, 10 og 12 mm; lengde 32 mm), hver perforert med omtrent 250 hull med lik avstand (diameter 1 mm) og forseilet i hver ende med en fjernbar topp av identisk materiale, blir gass-sterilisert og kirurgisk innført subkutant, på symmetrisk måte, gjennom små innsnitt inn i dorsale flanker av pentobarbiton-bedøvede voksne Wistar-rotter (350-400 g). Et gass-sterilisert vevsbur blir implantert inn i hver flanke og innsnittene blir lukket med enkelte kirurgiske klyper (Clay-Adams Auto-Clips, 9 mm) som blir fjernet 5 dager etter kirurgi. Etter kirurgisk innsnitt blir "chambers" innkapslet med fibrøst bindevev til tross for at det er et relativt fravær av celler innenfor selve "chambers". Denne modellen tilveiebringer et sterilt, definert og innkapslet område innenfor hvert "chamber" der forskjellige parametre til en sårlegingsrespons kan bli kvantifisert. Dyrene- blir anvendt for eksperimentering 14 dager etter implantasjon av "chambers", etter fullstendig leging av kirurgiske innsnitt. ;På dette tidspunkt ble daglige injeksjoner av 100 yl steril bærerbufferoppløsning (bestående av 0,5% v/v hydroksypropylcellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (1 yg, 0,1 yg eller 0,01 yg) av en refoldet, aktiv dimerisk TGF-e-form gitt direkte inn i vensteside-rom ("chambers") (sett med dorsalsiden øverst). Høyreside-rom får tilsvarende like mengder av-en placebo-kontrol1 (bovint serumalbumin) i nevnte bærerbuffer. Kontrolldyrene mottar bærerbuffer alene i venstreside-rom mens høyreside-rom forblir ubehandlet i løpet av eksperimentet. Eksperimentelle grupper består av 5 dyr. Injeksjonene blir utført en gang daglig i 5 dager og alt injisert materiale er sterilt, endotoksin-fritt og pyrogen-fritt. Alle dyr blir huset individuelt i løpet av eksperimentet og blir ofret 24 timer etter siste injeksjonsserie. Rommene blir deretter fjernet fra hvert dyr ved aseptisk teknikk, og det fibrøse vevet fra innsiden av hvert rom blir "våt"-veiet. Det totale serøse proteinet i romvæsken blir beregnet ved anvendelse av metoden til Lowry et al., (1951) J. Biol. Chem. 193:265. Prøver av fibrøst vev fjernet fra innsiden og utsiden av hvert rom blir preparert for histologiske analyser. Steriliteten til rominnholdet blir under-søkt ved inkubasjon av romvæskeprøvene på hjerne/hjerte-infusjonsskåler i 72 timer ved 37°C. Målinger blir ikke utført på rom som viser tegn på infeksjon eller frastøting (mindre enn 3% av alle rommene). ;Et eksempel på et slikt eksperiment som anvender refoldet dimerisk aktiv TGF-B2 er vist i følgende tabell hvor viste verdier representerer gjennomsnittsforholdene til målinger oppnådd for protein i 5 tilpassede par av rom (venstre v høyre) fra hver gruppe av dyr. ; Resultatene til proteinmålingene vist i tabellen ovenfor demonstrerer at lokal injeksjon av refoldet aktiv dimerisk TGF-62 daglig i 5 dager i en egnet bærerbuffer forsterker, opp til 3 ganger, akkumuleringen av totalt fibrøst vev, på en doseavhengig måte, i venstre-sidede rom sammenlignet med høyre-sidede kontralaterale rom som har mottatt tilsvarende like mengder av et placeboprotein. En liten doseavhengig økning i mengden av serøst protein i venstre-sidede rom blir også observert etter multippel injeksjon med TGF-62 (gruppene 1-3). Ingen forskjeller er synlige mellom venstre-sidede- og høyre-sidede rom i kontrollgruppen (gruppe 5). ;Ved post-mortem biopsi av dyrene i gruppene 1-3 blir det observert at venstre-sidede TGF-6-behandlede rom blir mer fast knyttet til omgivende bindevev i kroppsveggen enn kontralaterale høyre-sidede rom som har mottatt placebo-injeksjoner. Histologiske analyser viser videre at tykkelsen og vaskulariteten til det fibrøse vevet som omgir TGF-6-behandlede rom er markert større enn det til vevet som omgir placebo-behandlede rom. Lag av migrerende fibroblaster og mononukleære celler er også tydelig innenfor det fibrøse vevet på innsiden av TGF-6-behandlede rom. Ingen synlige forskjeller blir observert i enten tykkelse eller vaskularitet til det fibrøse vevet som omgir rommene, og heller ikke i grad av kobling av rommene til bindevevet i kroppsveggen i kontrollgruppen (gruppe 4). Disse resultatene foreslår av diffusjon av TGF-6fra rommet er ansvarlig for de observerte forskjellene i virkning. Et sterilt infiltrat av betennelsesceller, bestående hovedsakelig av makrofager, blir funnet i serøsvæsken i TGF-6-behandlede rom, mens kontralaterale placebo-behandlede romvæsker viser en overvekt av polymorfonukleære leukocytter. Innholdene i alle 40 rom i gruppene 1-4 vist i eksempelet blir funnet å være sterile etter inkubering av prøver av rominnhold i hjerne/hjerte-infusjon i 72 timer ved 37°C. ;Eksempel 7 ;Farmasøytisk sammensetning ;A. Krem ; ; Varm den vandige fasen til 55-60°C, oppløs aktiv forbindelse i denne og disperger smeltet lipidfase i denne ved grundig røring. Avkjøl til romtemperatur og homogeniser. ;På lignende måte kan en krem omfattende henholdsvis 0,01 til 20 ug/ml bli fremstilt. ;100 ul/cm^ krem blir applisert på såret. ;B. Salve ; ; Aktiv forbindelse, TGF-e-lignende protein 1,0*10<5>Propylenglykol 2,0

Oppløs den aktive forbindelsen i den vandige fasen med forsiktig oppvarming og disperger oppløsningen i den smeltede lipidfasen. Avkjøl til romtemperatur og homogeniser.

På lignende måte kan en salve omfattende henholdsvis 0,01 til 20<p>g/ml bli fremstilt. Av denne salven blir 100 pl/cm<2>sår påført.

C. Parenteral oppløsning

Ingredienser:

Karbohydratet er glukose, mannose, dekstran, hydroksyetyl-stivelse eller en blanding derav.

pH blir justert med fosfat, succinat, aminosyrer eller en blanding derav.

Beholdere med 0,05 mg TGF-B-1ignende protein/0,5 ml blir dannet og lyofilisert.

Deponering av mikroorganismer

Følgende mikroorganismer ble deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (FRG):

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type e (TGF-B)-1ignende protein eller et salt derav,karakterisert vedå refolde denaturert monomerisk form av nevnte TGF-B-1ignende protein i nærvær av et oppløsningsmiddel som muliggjør folding av det monomeriske TGF.-B-l ignende protein til en romlig konformasjon som etter dimerisering er assosiert med biologisk aktivitet, samtidig som nevnte monomer beholdes i en oppløselig form, valgt fra gruppen bestående av (a) en mild detergent, hvor nevnte milde detergent er tilstede i et konsentrasjonsområde fra 1 til 100 mM, (b) en lavere alkanol, og (c) en lavere alkandiol, hvor nevnte lavere alkanol eller lavere alkandiol er tilstede i et konsentrasjonsområde på 10 til 50 volum-%, hvor pH er mellom 6 og 10, og hvor utgangskonsentrasjonen av proteinmonomeren er lavere enn 2 mg/ml.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det TGF-B-1ignende proteinet velges fra gruppen bestående av benmorfogeniske proteiner, TGF-B2 og TGF-B3.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det TGF-B-lignende proteinet velges fra gruppen bestående av TGF-B2 og TGF-B3.

4. Fremgangsmåte ifølge krav l,karakterisertved at detergenten velges fra gruppen bestående av sulfobetainer, 3-(3-klolamidopropyl )dimetylammonio-1-propansulfonat, 3-(3-klolamidopropyl )dimetylammonio-2-hydroksy-l-propansulfonat, digitonin, cholat og deoksycholat.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav l,karakterisertved at detergenten velges fra gruppen bestående av sulfobetainer, 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-1-propansulfonat, 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-2-hydroksy-l-propansulfonat, digitonin, cholat og deoksycholat.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,'.karakterisertved at den detergenten velges fra gruppen bestående av 3-(3-klolamidopropyl )dimetylammonio-r-propansulfonat, 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-2-hydroksy-l-propan-sulf onat.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at detergenten velges fra gruppen bestående av 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-l-propansulfonat og 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-2-hydroksy-1-propansulfonat i en konsentrasjon på omtrent 30 mM til 60 mM.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at et redokssystem er tilstede.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at temperaturen er mellom omtrent 0*C og omtrent 37°C.

10 . Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisertved at redokssystemet er glutation i oksidert og redusert form som blir anvendt i en konsentrasjon på omtrent 1 til 10 mm, og hvori det molare forholdet til oksidert og redusert form er 1:1 til 1:2.