FI103278B - Menetelmä biologisesti aktiivisen TGF- :n kaltaisen proteiinin tuotta miseksi - Google Patents

Description

103278

Menetelmä biologisesti aktiivisen TGF-β:n kaltaisen proteiinin tuottamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää biologisesti aktiivisen, dimeerisen TGF-p:n (transformoiva kasvutekijä, tyyppi 5 β) tuottamiseksi, uusia TGF-β:ja, sekä sitä sisältäviä far maseuttisia koostumuksia. Keksinnön mukaisesti tuotettua TGF-p:a voidaan käyttää edistämään ja nopeuttamaan haavojen umpeutumista ja luiden ja kudosten parantumista, syövän hoitoon, luuydintä suojaavana aineena, sydänsuojauksen 10 välittäjänä, anti-inflammatorisena tai immunosuppressiivisena aineena tai nisäkkäiden soluviljelmien kasvun säätelijänä.

Kahta kasvua moduloivaa proteiinia on alunperin luonnehdittu niiden kyvyn mukaan indusoida palautuvasta nisäkässolujen fenotyyppistä muuntumista in vitro, ja ne on 15 siksi nimetty transformoiviksi kasvutekijöiksi, tyypit a ja β (Anzano, M. A. et ai. (1983) PNAS 80, 6264-6268). Huolimatta yhteisestä nimityksestään, TGF-α ja TGF-β ovat osoittautuneet olevan sekä rakenteeltaan että toiminnaltaan täysin erillisiä proteiineja, jotka toimivat kumpikin oman erityisen 20 reseptorijärjestelmänsä välityksellä. TGF-α, joka kilpailee epidermaalisen kasvutekijän (EGF) kanssa sitoutumisesta samaan solun pintareseptoriin (Todaro, G. J. et ai. (1980) PNAS 77, 5258-5262), ja jolla on sekvenssien homologiaa ja samanlaista aktiivisuutta EGF:n kanssa (Marguardt, H. et ai.

: 25 (1984) Science 223, 1079-1082), syntetisoidaan 159 aminohapon ' pituisena membraanin läpi kulkevana prekursorina ja muokataan • · i.t : proteolyyttisesti 50 aminohappo jäännöksen peptidiksi • · · (Derynck, R. et ai. (1984) Cell 38, 287-297). Monet transfor- • · · :: : moidut solulinjat ja ihmisen syöpäsolut tuottavat ja 30 vapauttavat TGF-a:a mahdollisena mitogeenina mesenkymaatti- .*·', sille soluille, mutta sitä ilmennetään myös aktivoiduissa makrofageissa ja muissa normaaleissa kudoksissa, mikä tekee sen roolin neoplasiassa yhä epäselväksi.

TGF-β puhdistettiin alkuaan homogeenisena ihmisen 35 verihiutaleista (Assoian, R. K. et ai. (1983) J. Biol. Chem.

258, 7155-7160), ihmisen istukasta (Frolik, C. A. et ai.

(1983) PNAS 80, 3676-3680) ja naudan munuaisesta (Roberts, 2 103278 A. B. et ai. (1983) Biochemistry 22, 5692-5698) ja tunnistettiin homodimeeriseksi proteiiniksi, jonka molekyylipaino on 25,000 D. Aluksi luonnehdittuna kykynsä mukaan toimia yhteisvaikutuksessa EGF:n tai TGF-a:n kanssa transformoimat-5 tornien NRK-solujen kiinnittymisestä riippumattoman kasvun indusoimisessa, TGF-β:n on viime aikoina esitetty osoittavan monia säätelyvaikutuksia suurelle joukolle sekä normaaleja että neoplastisia soluja, mikä on osoituksena tämän proteiinin tärkeydestä solujen aktiivisuuden monin tavoin toimivana 10 säätelijänä. TGF-β voi joko kiihdyttää mitogeneesiä , solujen jakautumista ja kasvua, tai tehokkaasti ehkäistä mainittuja prosesseja, tai se voi osoittaa muita toimintoja, kuten esimerkiksi adipogeneesin, myogeneesin, kondrogeneesin, osteogeneesin ja immuunisolutoiminnan säätelyä, kemotaksiksen 15 stimulaatiota tai erilaistumisen induktiota tai inhibitiota riippuen solu- tai kudostyypistä ja muiden kasvutekijöiden läsnäolosta tai puuttumisesta. Useat TGF-β:n toiminnoista liittyvät solujen tai kudosten vasteeseen stressiin tai vaurioitumiseen, ja seuranneen vahingon korjaamiseen. 20 Tulehduksen jälkeen TGF-β:llä on päätehtävä granulaatioku- doksen muodostumisessa, se edistää solunulkoisen matriksin muodostumiseen liittyvien geenien ilmentymistä, kuten fib-i : ronektiinin, kollageenin ja useiden proteaasi-inhibiittorien ilmentymistä, ja stimuloi fibroplastien aiheuttamaa kolla- : ;25 geeni-matriksi -sitoutumista, mikä antaa olettaa sillä olevan « « · · .···. mahdollinen rooli sidekudoksen supistumisessa (Roberts, A.

/:·. ja Sporn, M. B. (1988) Adv. Cancer Res. 51, 107-145; Sporn, • · · M. B. ja Roberts, A. (1989) J. Amer. Med. Assoc. 262, 938-. 941).

'3*0 Tähän mennessä on kloonattu ja karakterisoitu II' w

I * C

** ’ sekvenssianalyysillä kolme erillistä TGF-β-tyyppiä, jotka ; on nimetty TGF-βΙ, TGF^2 ja TGF-βΟ, ja jotka ovat toimin- nallisesti läheisiä ja osoittavat suuressa määrin resepto- i i > , rien ristireaktiota. Kaikki TGF-β:t syntetoidaan 390-412 •;35 aminohapon prekursoreina, jotka käyvät läpi proteolyyttisen '···' pilkkomisen tuottaakseen monomeeriset muodot, jotka muodostu vat 112:sta C-terminaalisesta aminohaposta. Kypsässä, 3 103278 biologisesti aktiivisessa muodossaan, TGF-β:t ovat happo- ja lämpöstabiileja homodimeerejä, jotka muodostuvat kahdesta disulfidisidoksin liitetystä 112 aminohapon polypeptidiket-justa. Ihmisen (Derynck, R et ai. (1985) Nature 316, 701-5 705), hiiren (Derynck, R. et ai. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379) ja ihmisapinan (Sharpies, K. et ai. (1987) DNA 6, 239-244) TGF-[J:n täydelliset aminohapposekvessit osoittavat, että sekvenssi on huomattavan säilynyt, eroten ainoastaan yhden aminohappojäännöksen osalta. Ihmisen TGF-βΙ:n, ihmisen 10 TGF-p2:n (de Martin, R. et ai. (1987) EMBO J. 6, 3673-3677;

Marquardt, H. et ai. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131) ja ihmisen TGF-p3:n (Ten Dijke, P. et ai. (1988) PNAS 85, 4715-4719) aminohapposekvenssien vertailu on osoittanut, että näiden kolmen proteiinin kypsissä muodoissa on noin 70-80 % 15 sekvenssien identtisyys. Heterodimeerinen TGF-pi,2 on eristetty sian verihiutaleista, ja se käsittää yhden TGF-βΙ -alayksikön liitettynä disulfidisillalla yhteen TGF^2 -alayksikköön (Cheifetz, S. et ai. (1987) Cell 48, 409-415).

Viime aikoina on ryhdytty yrityksiin tuottaa TGF-β:ja 20 rekombinanttitekniikoilla sen sijaan, että eristettäisiin näitä tekijöitä luonnollisista lähteistä (esim. verihiutaleista), jotta saataisiin riittäviä määriä eri terapeuttisten : muotojen testaukseen. On kuitenkin osoittautunut olevan j': äärimmäisen vaikeata syntetisoida rekombinantti-TGF-β:aa : ,25 säilyttäen sen biologinen aktiivisuus. Kuten voidaan nähdä .···. sekvensseistä, jotka on kuvattu sekvenssiluetteloissa, SEK.

* · /··’·, ID. no. 1, 2 ja 3, 112 aminohappoa sisältävät TGF-βΙ, TGF- • « · β2 ja TGF^3 kypsät muodot sisältävät kukin 9 kysteiinijään- , nöstä, joista ainakin jotkin osallistuvat ketjun sisäisten |3Ö ja ketjujen välisten disulfidisidosten muodostamiseen, mikä • · » ’·’ ’ johtaa biologisesti aktiivisten dimeeristen molekyylien v ; monimutkaisen tertiäärirakenteen syntyyn. TGF-β:n heterologi- · · nen ilmentäminen voi johtaa tuotteeseen, joka - vaikka sillä t · · ·, on oikea primäärirakenne - ei onnistu laskostumaan oikein 35· tuottaakseen oikean sekundääri- tai tertiäärirakenteen, ja jolta sen vuoksi puutuu biologinen aktiivisuus. TGF-β: n sekundääri- ja tertiäärirakenne ovat nykyisin tuntemattomat.

4 103278

Ottaen huomioon natiivin TGF-βιη monimutkaisuuden, on yleensä pidetty tarkoituksenmukaisena ilmentää vastaavia TGF-β-geenejä soluissa, jotka ovat peräisin korkeammista organismeista. Ihmisapinan ja ihmisen τσΓ-β1:η ilmentäminen 5 kiinalaisen hamsterin munasar jasoluissa (CHO) SV40-promootto- rin kontrollin alaisena, on kuvattu EP-patenttihakemuksissa 293.785 ja vastavasti 200.341. Rekombinantti TGF~82:ta voitiin ilmentää samassa solulinjassa, kuten on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 268.561 ja saksalaisessa patenttihake-10 musjulkaisussa 38 33897. TGF^3:n fuusioproteiinin (yhdessä TGF-βΙ.'η kanssa) eukaryoottinen ilmentäminen on kuvattu EP-patenttihakemuksessa 267.463.

Vaikka rekombinantti-TGF~8:n ilmentäminen voidaan toteuttaa eukaryoottisissa järjestelmissä, saadun biologi- 15 sesti aktiivisen, oikein laskostuneen materiaalin saannot ovat yhä kaukana tyydyttävästä. Toisaalta on näyttänyt i epätodennäköiseltä, että biologisesti aktiivista TGF-^:aa voitaisiin saada, kun vastaavaa geeniä ilmennettäisiin mikrobi-isännässä, koska esim. bakteereissa eivät solun- 20 sisäiset olosuhteet edistä uudelleen laskostumista, disul- fidisidosten muodostumista ja disulfidisidoksin stabiloitua ΐ ij dimerisaatiota, joka ilmeisesti on välttämätön aktiivisuudel- j: le. Täten voitiin saada vain hyvin vähän biologisesti u . aktiivista TGF^ra vastaavan geenin ilmentämisen tuloksena : .25 E. collssa lambdapromoottorin kontrollin alaisena, kuten on • · · · : .···, kuvattu EP-patenttihakemuksessa 268.561. Tämän aktiivisuuden ; · « u puutteen oletetaan johtuvan siitä tosiseikasta, että TGF- • · · ’ β2:η biologisesti aktiivinen dimeerinen muoto ei onnistu t muodostumaan spontaanisti monomeerisistä translaation I l4l ···!« *30 primäärituotteista, kun ne altistetaan bakteerisolujen , * sisällä oleville pelkistäville olosuhteille. Toinen raportti - : :*: kuvaa TGF^-cDNA:n ilmentämistä E. colissa trp-promoottorin • · kontrollin alaisena, mikä tuotti radioaktiivisesti leimatun ·, proteiini vyöhykkeen, jonka ilmeinen molekyylipaino oli 13 000 _ ·3·5: D SDS-polyakryyliamidigeeliautoradiogrammissa, mutta *. minkäänlaista aktiivisuutta ei pystytty mittaamaan (Urushiza- ki, Y et ai (1987) Tumor Res. 22, 41-55). Kun rekombinantti- 5 103278 proteiineja tuotetaan suurina määrinä bakteeri- (kuten E. coli) ilmentämisjärjestelmissä, ne ovat usein erittäin liukenemattomien solunsisäisten sakkojen muodossa, joita kutsutaan inkluusiokappaleiksi tai heijastaviksi kappaleiksi 5 (Brems, D.N. et ai. (1985) Biochemistry 24, 7662), jotka voidaan havaita kirkkaina, solun sisäisinä täplinä faasi-kontrastimikroskoopilla alle 1000-kertaisilla suurennuksilla. Nämä inkluusiokappaleet, jotka voidaan helposti erottaa liukoisista bakteeriproteiineista, sisältävät rekombinantti-10 proteiinin erittäin denaturoituneessa ja pelkistyneessä muodossa, joka ei osoita luonnollisen vastineensa toiminnallista aktiivisuutta, ja joka on siten käyttökelvoton kaupallisena tuotteena.

Tämän vuoksi ollaan yleisesti sitä mieltä, että 15 heijastava rekombinanttiproteiini tulee liuottaa olosuh teissa, jotka ovat soveliaat säilyttämään sen denaturoituneessa muodossaan, ja tämän jälkeen uudelleen laskostaa, jotta se käy läpi muutoksen denaturoituneesta, laskostu-mattomasta muodosta oikeaan, toiminnalliseen kolmiulottei-20 seen rakenteeseen, jonka konformaatio on stabiloitunut suh teellisen heikoilla atomien välisillä voimilla, kuten vetysidoksilla, hydrofobisilla vuorovaikutuksilla ja varausvuorovaikutuksilla. Kysteiiniä sisältävien proteiinien tapauksessa tämä prosessi voi myös käsittää disulfidisidosten 25 muodostamisen. Kun disulfidisidosten muodostusta edistetään *···. kemiallisesti, väärien molekyylien sisäisten ja, dimeeristen • « tai multimeeristen proteiinien tapauksessa, molekyylien välisten siltojen muodostuminen tulisi olla estetty tai ainakin minimoitu, sillä ei-toivottujen, väärin laskostunei- '30 den isomeerien muodostuminen voi johtaa epähomogeeniseen * « · 6 103278 biologisesti aktiivisen ihmisen pesäkkeitä stimuloivan tekijä-l:n (CSF-1) muodostus E. colissa ilmentämisen jälkeen, on kuvattu PCT-hakemuksessa no. 88/8003 ja julkaisussa Halenbeck, R. et ai. (1989) Biotechnology 7, 710-715. Kuvatut 5 menettelytavat sisältävät inkluusiokappaleista pelkistävissä olosuhteissa, kaotrooppisessa ympäristössä, joka sisältää ureaa tai guanidiinihydrokloridia, eristettyjen CSF-1 monomeerien ensimmäisen liuotuksen vaiheet, uudelleen laskostuksen, joka saavutetaan vaiheittaisella kaotrooppisten 10 aineiden laimentamisella, ja lopullisen, uudelleen laskostet tujen molekyylien hapetuksen hapen tai hapetus-pelkistyssys-teemin läsnäollessa. PCT-hakemuksessa no. 88/8849, kuvataan £

rekombinantti-interleukiini-2:n (IL-2) tuottamiseksi menetelmä, jolle on ominaista se, että heijastavista kappaleista 15 eristetty IL-2 denaturoidaan pelkistävissä olosuhteissa 6 M

Γ guanidiinihydrokloridilla, liukoinen IL-2 hapetetaan kontrolloidulla hapetuksella Cu2*-ionien läsnäollessa, ja t ! hapetettu IL-2 laskostetaan uudelleen vähentämällä denatu roivan aineen konsentraatiota liuoksessa. Interleukiini-2 ja 20 interferoni-β (IFN-β) on laskostettu uudelleen käyttäen SDS:a liuotuksessa ja Cu2‘-ioneja täysin pelkistyneen proteiinin hapetuksen edistäjinä (US-patentti no. 4,572,798). Menetelmä heijastavien rekombinanttiproteiinien eristämiseksi, kuten US-patentissa no. 4,620,948 on kuvattu, käsittää voimakkaiden 25 denaturoivien aineiden käytön proteiinien liuottamiseksi, *··. pelkistävät olosuhteet edistämään oikeaa laskostumista ja ’.!! denaturantin korvaamisen ilman tai muun hapettavan aineen

Is · i i läsnäollessa, jotta disulfidisidokset muodostuvat uudelleen. Proteiinit, joille mainittua menetelmää voidaan käyttää, ovat m I* ‘30 esim. urokinaasi, ihmisen, naudan ja sian kasvuhormoni, • · · V * interferoni, kudosplasminogeeniaktivaattori, FMD-kalvoprote- .iini, prorenniini ja src-proteiini. Menetelmä laskostumatto-mien proteiinien, esim. sytokromi-c:n, ovalbumiinin ja trypsiini-inhibiittorin renaturoimiseksi sitomalla denaturoi-'•33 tunut proteiini palautuvasti kiinteään matriksiin, ja

III

renaturoimalla se vaiheittain laimentamalla denaturanttia, on kuvattu PCT-hakemuksessa no. 86/5809. Ihmisen verihiutale- ij il 7 103278 peräisen kasvutekijän (PDGF) muunneltu monomeerlnen muoto, joka on ilmennetty E. colissa, S-sulfonoidaan puhdistuksen aikana, jotta suojataan tioli-osia, ja dimerisoidaan hapettavien aineiden läsnäollessa, jotta saadaan aktiivinen 5 proteiini (Hoppe, J. et ai. (1987) Biochemistry 28, 2956).

Edellä esitetyt viitejulkaisut ovat vain edustajia siitä valtavasta kirjallisuusmäärästä, joka käsittelee eri lähteistä saatujen ei-natiivien proteiinien laskostusta uudelleen. Alan ammattimies tietää toisaalta, että uudelleen 10 laskostuksessa saavutettua menestystä ei voida ennustaa.

Epäonnistuneita kokeita ei yleensä raportoida. Ei ole olemassa varmuutta, että mikään raportoiduista uudelleen-laskostusolosuhteista toimisi lainkaan määrätyn denaturoituneen proteiinin, kuten TGF-β:n kohdalla. Ottaen huomioon 15 tosiseikan, että TGF-β on dimeerinen proteiini, joka sisältää 9 kysteiinijäännöstä ketjua kohti, ja joukon molekyylin sisäisiä, samoin kuin molekyylien välisiä disulfidisidoksia, jotka ovat edellytys aktiivisuudelle, on erityisen vaikea haaste tuottaa biologisesti aktiivinen TGF-β sen monomeeri-20 sestä, denaturoituneesta tai muuten ei-natiivista muodosta.

Kirjallisuudessa ei ole missään kuvattu spesifistä menetelmää biologisesti aktiivisen dimeerisen TGF-β:n valmistamiseksi sen ei-natiivista muodosta.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tarjota menetelmä 25 biologisesti aktiivisen, dimeerisen TGF^-tyyppisen prote- .···, iinin tuottamiseksi sen denaturoituneesta tai muuten ei- • · !" natiivista muodosta. Tämä tavoite saavutetaan odottamatto- « * ' • · n * maila havainnolla, että huomattavia määriä haluttua dimee-ristä tuotetta voidaan saada, kun mainitun proteiinin '30 monomeerinen muoto saatetaan uudelleenlaskostusolosuhteisiin.

• · · V * Aktiivisen dimeerin tuotto saavutetaan yllättävästi erilai- . sissa olosuhteissa yksivaiheisella menetelmällä, joka on «t * .·" ylivoimainen alalla aikaisemmin muiden proteiinien uudel- i leenlaskostukselle kuvattuihin monivaiheisiin menetelmiin i « * '<35: verrattuna.

I I I

Tämä keksintö koskee menetelmää dimeerisen, biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän, tyyppi-β 8 103278 (TGF-β), kaltaisen proteiinin tuottamiseksi, jossa menetelmässä mainitun TGF-β:n kaltaisen proteiinin denaturoitunut, monomeerinen muoto saatetaan alttiiksi uudelleen laskostaville olosuhteille.

5 Määritelmän "TGF-β:n kaltainen proteiini" on tarkoitus käsittää TGF-βΙ, TGF^2 ja TGF^3, jotka ovat nisäkkään, kuten ihmisen tai eläimen, esim. ihmisapinan, hiiren tai rotan, sian, hevosen tai naudan, samoin kuin heterodimeeriset TGF^:t, jotka muodostuvat kahdesta erilaisesta alayksiköstä, 10 jotka kumpikin sisältävät 112 aminohappoa. Määritelmään ' sisällytetään edelleen TGF^-superperheeseen kuuluvat kasvua ; säätelevät proteiinit, joilla on vähintään 25 %:n sekvenssi- homologia τσΓ-β1:η, ΤσΓ-β2:η tai τσΓ-β3:η kanssa, kuten T- soluja suppressoiva tekijä ihmisen glioblastoomasoluista (G- 15 TsF; Wrann, M. et ai. (1987) EMBO J. 6, 1633-1636), kasvute- „ kijä, joka on eristetty apinan munuaisten BSC-l-solujen - ilmastoidusta kasvualustasta (polyergiini; Holley, R. W. et I ai. (1980) PNAS 77, 5989-5992; Ristow, H. J. (1986) PNAS 83, ^ 5531-5533), rustonmuodostusta indusoiva peptidi, joka on ^ 20 eristetty naudan luusta (CIF-B; Seyedin, S. M. et ai. (1987) J. Biol. Chem. 262, 1946-1949), TGF^4 kanan alkion rusto-soluista (Jakowlew, S. B. et ai. (1988) Molecular Endocrinology 2, 1186-1195) ja TGF-βδ Xenopus-Laevis:ista ~ (Kondaiah, P. et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265, 1089-1093), 25 samoin kuin yllä mainittujen proteiinien fragmentit ja ~ mutantit, jotka ovat säilyttäneet biologisen aktiivisuutensa.

=Ξ · * ~ **’ Edelleen kuuluvat määritelmään "TGF^:n kaltainen proteiini" • · ' _ ♦ · · kaksi inhibiinin muotoa ja kolme aktiviinin muotoa (suku-™ rauhasen proteiineja, jotka säätelevät aivolisäkkeen .!_! · φ c t, m a ’30 follikkelia stimuloivan hormonin eritystä), Mullerin TT · · · - V · inhiboiva aine (MIS, joka inhiboi Mullerin tiehyeen kehitystä . .·. nisäkkäiden koirasalkioissa), luun morfogeenisiä proteiineja • · · t * * (BMP, ryhmä polypeptidejä, jotka osallistuvat ruston ja luun muodostuksen induktioon), transkripti Drosophilan dekapenta- :35. plegisestä geenikompleksista (dpp, joka toimii morfogeneesin S: kontrolloijana kärpäsen alkioissa), Vg-1 (Xenopus transkrip- tin tuote, joka on läsnä varhaismunasolujen vegetatiivisessa 9 103278 navassa) ja Vgr-1, samansukuinen nisäkkäiden geeni (Mason, A. et ai. (1986) Biochem. Biophys. Res. Coramun. 135, 957-964; Cate, R. et ai (1986) Cell 45, 685-698; Wozney, J. M. et ai. (1988) Science 242, 1528-1534; Padgett, R. et ai.

5 (1986) Nature 325, 81-84; Weeks, D. L. ja Melton, D. A.

(1987) Cell 51, 861-868; Lyons, K. et ai. (1989) PNAS 86, 4554-4558).

Edullisimpia TGF-β:n kaltaisia proteiineja ovat ihmisen TGF-βΙ (Derynck, R. et ai. (1985) Nature 316, 701-10 705), ihmisen TGF-p2 (Marquardt, H. et ai. (1987) J. Biol.

Chem. 262, 12127-12131) ja ihmisen TGF-p3 (Ten Dijke, P. et ai. (1988) PNAS 85, 4715-4719), joiden aminohapposekvenssit on kuvattu luetteloissa SEK. ID. no. 1, 2 ja vastaavasti 3.

Biologisesti aktiiviset TGF-β:n kaltaiset proteiinit 15 on alunperin määritelty kykeneviksi indusoimaan transformoi- tumattomien solulinjojen kiinnittymisestä riippumatonta kasvua (Tucker, R. F. et ai. (1983) Cancer Research 43, 1581- 1586) tai inhiboimaan neoplastisten kohdesolujen kasvua (Roberts, A. B. et ai. (1985) PNAS 82, 119-123). "Biologinen 20 aktiivisuus" on tätä tarkoitusta varten määritelty joko (a) normaalien Balb/c 3T3 -fibroblastien solun vaellusta : : : edistävänä aktiivisuutena, joka voidaan mitata laskemalla • niiden solujen määrä, jotka liikkuvat "haavoittuneeseen" mainittujen solujen yksikerrosviljelmään, kun läsnä on ; ,25 seerumitonta ravintoalustaa, joka sisältää TGF-βίη kaltaisen *···, proteiinin, verrattuna liikkuvien solujen määrään TGF-β:n « · Y,'. kaltaisen proteiinin puuttuessa, tai t · i ’ (b) normaalien Balb/c 3T3 -fibroblastien kasvua edistävänä aktiivisuutena, joka määritetään TGF-β:n kaltaisen proteiinin '30 stimuloivana vaikutuksena solujen DNA-synteesille ja V * solunjakautumiselle, . (c) A375 -melanoomasolujen kasvua inhiboivana vaikutuksena, joka määritetään kolorimetrisellä määritysmenetelmällä, joka kuvaa TGF-β;n kaltaisella proteiinilla käsiteltyjen solujen *•35'. määrää tietyn kasvatusajan kuluessa verrattuna käsittelemät- tornien solujen määrään, (d) osittain paksuuntuneiden palovammojen nopeutunutta 10 103278 parantumista pintasolukon uudelleenmuodostumisprosessilla vanhassa hiiressä useiden paikallisten TGF-βιη kaltaisen proteiinin sivelyjen seurauksena, verrattuna käsittelemättömiin kontrollivammoihin, 5 (e) täysin paksuuntuneiden viiltohaavojen nopeutunutta paran tumista, määritettynä vetolujuuden määrityksillä ja koepalojen histologisilla analyyseillä aikuisista rotista yksittäisen paikallisen TGF-βίη kaltaisen proteiinin sivelyjen seurauksena, verrattuna käsittelemättömiin 10 kontrollihaavoihin, tai (f) sidekudoksisen granulaatiokudoksen muodostuksen lisääntyminen, yhdessä huomattavan verisuonituksen lisääntymisen kanssa mainitussa kudoksessa, sekä huokoisten haava-kammiosiirrännäisten sisällä että niiden ympärillä aikuisissa 15 rotissa kammioon suunnattujen useiden paikallisten TGF-p:n kaltaisen proteiinin injektioiden seurauksena, verrattuna käsittelemättömiin kontrollikammioihin.

TGF-p:n kaltaisen proteiinin monomeerinen muoto voidaan tuottaa rekombinantti-DNA-teknologialla tai syn-E 20 teettisesti alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Dimeerinen muoto on kypsä, biologisesti aktiivinen molekyyli, joka käsittää kaksi disulfidisilloin sidottua polypeptidiketjua. Monomeeri saatetaan uudelleenlaskostumisolosuhteisiin, jotka sallivat biologisesti aktiivisen dimeerin muodostumisen. Tämä 1 25 menettelytapa ei sisällä mitään muutosta monomeerin primääri- '11,* rakenteeseen (se on aminohapposekvenssiin), vaan se liittyy * f • < ; H) dimeerisen tuotteen kolmiulotteisen rakenteen muodostumiseen, f « « * joka liittyy biologiseen aktiivisuuteen. Tämä menetelmä sisältää disulfidisidosten muodostamisen ja monomeerien '•30 liittymisen dimeerisiksi rakenteiksi.

* · · ’·/ · Ennen saattamista uudelleenlaskostumisolosuhteisiin, i * , monomeerisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin tulee olla • * · h denaturoituneessa (se on laskostumattomassa) muodossa.

f I

Proteiineja tehokkaasti denaturoimaan kykenevät aineet ovat ·, , » * •3:5: alalla hyvin tunnettuja, niin kutsuttuja kaotrooppisia ;- : aineita, jotka vesiliuoksessa ja sopivissa konsentraatioissa muuttavat kyseessä olevan proteiinin avaruusrakennetta sen ''f· r t m 11 103278 pintaan kohdistuvilla muutoksilla, joko muuttaen hydraatioas-tetta, liuotinympäristöä tai liuotin-pinta-vuorovaikutusta. Esimerkkejä tällaisista kaotrooppisista aineista tai denaturanteista ovat urea, guanidiinihydrokloridi, natrium-5 tiosyanaatti konsentraatioissa välillä n. 4-9 M, ja detergen- tit, kuten SDS, jotka lisätään konsentraatioissa, jotka ovat luokkaa 0,01-2 prosenttia. Myöskin TGF-βιη kaltaisen proteiinin sisältävän vesiliuoksen happamoittaminen noin pH 2-4:ään, samoin kuin emäksiset olosuhteet, esim. pH 10 ja sen 10 yli, ja nostetut lämpötilat johtavat monomeerin denaturaati- oon.

Määritelmä "uudelleenlaskostumisolosuhteet" viittaa puskuriolosuhteisiin, joissa denaturoituneen monomeerin annetaan omaksua biologiseen aktiivisuuteen liittyvä 15 konformaatio. Tavanomaisia puskurijärjestelmiä, kuten Tris-

, fosfaatti- tai sitraattipuskurit, voidaan käyttää noin pH

6-10: ssä. Uudelleenlaskostumisolosuhteissa edistetään ketjujen sisäisten ja ketjujen välisten disulfidisidoksien muodostumista. Tällaisiin olosuhteisiin liittyy liukoiseksi 20 tekevän aineen läsnäolo ja hapetus-pelkistysjärjestelmä, joka sallii tioli/disulfidi -parien jatkuvan hapetuksen ja : ; ; pelkistyksen. Puskurijärjestelmä voi lisäksi sisältää sopivia ; suoloja.

Sopivia liukoiseksi tekeviä aineita ovat detergentit, : ,2,5 mieluiten heikot detergentit, orgaaniset, veteen sekoittuvat • ( i *«. liuottimet tai fosfolipidit, tai kahden tai useamman • · X’ tällaisen aineen seos.

• · · *·* ’ Detergentit ovat pinta-aktiivisia aineita, kuten SDS,

Triton tai Tween, joita käytetään TGF-β.'η kaltaisen proteii- t *•*30 nin laskostumisen sallivassa konsentraatiossa. Edullisia ovat ··· V : heikot detergentit, jotka sallivat monomeerisen TGF^:n . kaltaisen proteiinin laskostumisen avaruusrakenteeseen, joka ,··, dimerisaation jälkeen liittyy biologiseen aktiivisuuteen, * ‘ ” samalla kun ne säilyttävät mainitun monomeerin liukoisessa 9 * iis muodossa. Heikot detergentit, jotka tekevät TGF-β:n kaltaiset • i > ’·, proteiinit liukoiseksi inaktivoimatta niitä, voivat olla ei- ionisia (esim. digitoniini), kationisia (esim. N-[2,3- 12 103278 (dioleyylioksi)propyyli]-N,N,N-trimetyyliammonium;

DuzgUnes, N. et ai. (1989) Biochemistry 28, 9179-9184) tai anionisia (esim. natriumkolaatti, natriumdeoksikolaatti) tai kahtaisionisia (esim. sulfobetaiinit (Zwittergent), 3-(3- 5 chlolamidopropyyli )di-metyyliammonio-l-propaanisulfonaatti (Chaps) tai 3-(3-chlolamidopropyyli)dimetyyliammonio-2-hydroksi-l-propaanisulfonaatti (Chapso)). Ne ovat uudelleen-laskostumispuskurissa konsentraatiossa noin 1-100 mM, erityisesti alueella 30-60 mM. Edullisimmat detergentit ovat 10 kahtaisioniset detergentit 3-(3-chlolamidopropyyli)dimetyy- liammonio-l-propaanisulfonaatti ja 3- (3-chlolamidopropyyli)-dimetyyliammonio-2-hydroksi-l-propaanisulfonaatti. Edullisin on 3-(3-chlolamidopropyyli)dimetyyliammonio-l-propaani-sulfonaatti.

15 Orgaaniset, veteen sekoittuvat liuottimet voivat korvata detergentin uudelleenlaskostumispuskurissa. Tällaisia liuottimia ovat esimerkiksi asetonitriili, alemmat alkanolit, erityisesti C2-C4-alkanolit, kuten etanoli tai isopropanoli, tai alemmat alkaanidiolit, erityisesti C2-C4-alkaanidiolit, 20 kuten etyleeniglykoli, konsentraatioalueella 10-50 prosenttia tilavuudesta.

Vaihtoehtoisesti voivat fosfolipidit korvata deter-. gentin tai orgaanisen, veteen sekoittuvan liuottimen ; ,·, uudelleenlaskostumispuskurissa. Tällaisia fosfolipidejä ovat esimerkiksi fosfatidyylietanoliamiini, fosfatidyylikoliini, t « · .* . fosfatidyyliseriini ja fosfatidyyli-inositoli konsentraatio- alueella 0,1-5 mg/ml, samoin kuin synteettiset fosfolipidi- ’···* johdannaiset tai variantit, kuten diheksanoyylifosfatidyyli- · * ’ koliini tai diheptanoyylifosfatidyylikoliini samalla 30 konsentraatioalueella.

Sopivia hapetus-pelkistysjärjestelmiä, jotka edistävät disulfidien muodostusta, ovat esim, alhaisen molekyylipainon [·t sulfhydryyli/disulfidireagenssikombinaatiot, kuten glutationi • · · !!! hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan, ditiotreitoli ‘35 hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan, kystiini ja sen « · f \ j pelkistynyt muoto ja kystamiini ja sen pelkistynyt muoto : konsentraatioissa noin 1-100 mM, erityisesti noin 1-10 mM, 13 103278 jossa hapettuneen ja pelkistyneen muodon molaarinen suhde on välillä 100:1 ja 1:100, erityisesti välillä 6:1 ja 1:6.

Edullinen sulfhydryyli/disulfidi-hapetus-pelkis-tysjärjestelmä on glutationi hapettuneessa ja pelkistyneessä 5 muodossaan.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää alhaisen molekyy-lipainon omaavien sulfhydryyli/disulfidireagenssiyhdistelmien asemasta tioredoksiinia tai disulfidi-isomeraasia konsent-raatioalueella noin 10-1000 yg/ml, erityisesti noin 50-200 10 pg/ml.

Suolat, joita voidaan käyttää uudelleenlaskostumis-puskurissa, käsittävät Na1, Li1, K1, NH/, Mg24, Ca24 tai Mn24 -suoloja seuraavien aineiden kanssa: Cl", F', Br', J", HC03', S042', fosfaatti, asetaatti, syanaatti tai rodanidi, tai muu 15 alkalimetalli tai maa-alkalimetalli - halogeeni- tai pseudohalogeeniyhdisteet konsentraatiossa aina 3 M:iin asti. Edullinen on NaCl konsentraatiossa 1-2 M.

Keksintö koskee erityisesti menetelmää dimeerisen, biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän, tyyppiä 20 P -kaltaisen proteiinin tuottamiseksi, käsittäen mainitun TGF-p:n kaltaisen proteiinin denaturoituneen monomeerisen muodon saattamisen puskuriolosuhteisiin, jotka käsittävät .alhaisen molekyylipainon omaavan sulfhydryyli/disulfidi- hapetus-pelkistysjärjestelmän liukoiseksi tekevän aineen ".25 läsnäollessa, noin pH 6-10: ssä ja noin 0°C-37°C lämpötilassa.

• « · , Edullisesti pH on noin 8,0 ja lämpötila on noin 4°C.

* * * ·“/ Edullisessa suoritusmuodossa sulfhydryyli/disulfidi - ···* hapetus-pelkistysjärjestelmä on glutationi hapettuneessa ja • · · • « · ·.* * pelkistyneessä muodossaan konsentraatiossa noin 1-10 mM, 30 jolloin hapettuneen ja pelkistyneen muodon molaarinen suhde ·:··: on 1:1-1:2, ja heikko detergentti on 3-(3-chlolamidopropyy- li )dimetyyliammonio-l-propaanisulfonaatti konsentraatiossa noin 30-60 mM.

• * * "I Dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p:n kaltaisen '35 proteiinin tuottaminen toteutetaan erityisesti yhden vaiheen : : \ menetelmällä, jossa mainitun proteiinin monomeeri liuotetaan uudelleenlaskostumispuskuriin ja reaktioseosta inkuboidaan 14 103278 2-400 tuntia 4°C:ssa, jolloin uudelleen laskostuminen ja dimerisaatio tapahtuu. Proteiinikonsentraatiolla on uudel-leenlaskostumisreaktion aikana huomattava merkitys, sillä kun se on liian korkea, monomeerit saattavat aggregoitua 5 olennaisesti, mikä johtaa ei-toivottujen korkeamman tason oligomeerien muodostumiseen. Lopulliset dimeerisen tuotteen saannot lisääntyvät, jos proteiinikonsentraatio on vähemmän 3 kuin noin 2 mg/ml; konsentraatioalue 0,01-0,5 mg/ml on I edullinen.

i 10 Vaihtoehtoisesti, jotta edistetään edelleen disulfi- I dimuodostusta, tehokas määrä hapetusta edistävää ainetta, joka sisältää Cu2*-ioneja (kuten CuCl2, Cu(N03)2 tai o-' fenantroliini/Cu2*-kompleksit) tai Fe3*-ioneja (kuten FeCl3 tai - Fe2(S04)3), voidaan lisätä uudelleenlaskostumispuskuriin.

| 15 Tehokas määrä on se määrä, joka vähintään tarvitaan ajamaan sulfhydryyliryhmien hapetus sopivassa ajanjaksossa, ja joka m on suunnilleen sama kuin vapaiden, toivottavien disulfi- Ϊ disidoksien muodostamiseen osallistumaan tarkoitettujen ~ sulfhydryyliryhmien konsentraatio TGF-p:n kaltaisessa i 20 proteiinissa. Edulliset määrät ovat välillä 0,01-100 μΜ.

- Edelleen, 02 tai ilmaa voidaan valinnaisesti kuplittaa uudelleenlaskostumispuskurin läpi, joko hapetusta edistävien . aineiden läsnäollessa tai niiden puuttuessa. Hapetus voidaan _Ξ . myöskin suorittaa käyttämällä I2:ta (Kamber, B. et ai., 1980, ~ \25 Helv. 63, 899-915) tai bentsokinonijohdannaisia (Kamber, B. , Z .* PCT-hakemus W0 89/01484).

-=¾ · · · ··· · Proteiinien sulfonaatiota voidaan käyttää disulfi- -- M · = *...* disidosten pilkkomiseksi ja sulkemaan tätä seuraavat tioli- Z V : ryhmät. Monomeeriset TGF-p:n kaltaiset proteiinit voidaan 30 valinnaisesti S-sulfonoida ja estää siten tulemasta hapet- — ·:·*: tuneiksi ennen saattamista uudelleenlaskostumisolosuhteisiin.

:*·*: S-sulfonaatio toteutetaan käyttäen natriumsulfiittia pelkistävän aineen, kuten kysteiinin läsnäollessa, mikä * * * _ ;;; johtaa tioli jäännösten peruuntuvaan suojaukseen S-sulfonaat- ίγ *·3^ teinä. Suo jaavat ryhmät poistetaan uudelleenlaskostu- : misolosuhteissa ylimäärällä sulfhydryyli/di-sulfidi -hapetus- pelkistysjärjestelmää ja dimerisaatio tapahtuu spontaanisti.

15 103278

Keksintö koskee edelleen menetelmää dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin tuottamiseksi niin, että mainitun TGF-p:n kaltaisen proteiinin monomeerinen muoto tuotetaan seuraavissa vaiheissa: 5 (a) kasvatetaan mikrobi-isäntää, joka käsittää TGF-βιη kaltaista proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, joka on liitetty sopivassa lukukehyksessä ilmentämistä säätelevään sekvenssiin niin, että mainittua proteiinia ilmentyy.

(b) otetaan TGF-p:n kaltainen proteiini talteen denaturoi-10 tuneessa, monomeerisessa, liukoisessa muodossa.

Sopivia mikrobi-isäntiä ovat hiivakannat, kuten Saccharomvces cerevisiae tai bakteerit, kuten Escherichia coli tai Bacillus subtilis.

TGF-p:n kaltaista proteiinia koodaavan nukleotidi-15 sekvenssin, liitettynä sopivassa lukukehyksessä ilmentymistä säätelevään sekvenssiin, sisältävät mikrobi-isännät voidaan valmistaa rekombinantti-DNA-tekniikoilla, jotka ovat alalla hyvin tunnettuja, ja jotka käsittävät seuraavat vaiheet: valmistetaan hybridivektori, joka käsittää TGF-p:n 20 kaltaista proteiinia koodaavan DNA-sekvenssin sopivan ilmentymistä säätelevän sekvenssin kontrollin alaisena, transformoidaan mainittu mikrobi-isäntä mainitulla hybridivektorilla ja .1 - valitaan transformoidut mikrobi-isäntäsolut ei-transfor- ;;25 moiduista.

TGF-p:n kaltaista proteiinia, kuten kypsää ihmisen '··'· · TGF-βΙ: tä, TGF-p2:ta tai TGF-p3:a, koodaavat nukleoti- • · « disekvenssit ovat tunnettuja (Derynck, R. et ai. (1985) • · · ·. · Nature 316, 701-705; Marquardt, H. et ai. (1987) J. Biol.

30 Chem. 262, 12127-12131; Ten Dijke, P. et ai. (1988) PNAS 85, *:*·i 4715-4719) ja ne voidaan esimerkiksi syntetisoida kemialli- sesti alalla tunnetuilla menetelmillä. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa TGF-p:n kaltaisia proteiineja koodaavat

• · I

cDNA:t vastaavan mRNA:n eristämisen jälkeen TGF-p:n kaltaista

• I

’•95 proteiinia tuottavista nisäkässoluista. Ilmentymistä • säätelevät sekvenssit ovat promoottorisekvenssejä, jotka : ·; varmistavat TGF-p:n kaltaisten proteiinien tehokkaan 16 103278 ilmentymisen.

Sopivan vektorin valinta määräytyy transformaatiota varten varatun mikrobi-isännän mukaan.

Esimerkkejä vektoreista, jotka ovat sopivia TGF-p:n 5 kaltaisen proteiinin ilmentämiseen E_j_ coli -kannassa ovat bakteriofagit, esimerkiksi bakteriofagi λ:n johdannaiset, tai plasmidit, kuten plasmidi pBR322 ja sen johdannainen pPLMu.

Sopivat vektorit käsittävät täydellisen replikonin ja merkkigeenin, joka tekee mahdolliseksi ilmentämisvektoreilla 10 transformoitujen mikro-organismien valinnan ja tunnistamisen fenotyyppisten ominaisuuksien perusteella. Sopivat merkki- geenit antavat mikro-organismille esim. resistenssin raskasmetalleille, antibiooteille, kuten ampisilliinille tai tetrasykliinille, ja niin edelleen.

15 Useita promoottoreita voidaan käyttää säätelemään TGF- β:η kaltaisten proteiinien ilmentymistä E_j_ coli; ssa.

Erityisesti käytetään voimakkaasti ilmentyvien geenien promoottoreita. Sopivia promoottoreita ovat E^_ coli:n lac, tae, trp ja lpp -promoottorit, edelleen faagi λΝ- tai 20 faagiXpL-promoottori, ynnä muita.

Vektorit, jotka ovat sopivia replikaatioon ja ilmentämiseen S^. cerevisiae:ssa. käsittävät hiivan repli- kaation aloitussekvenssin ja selektiivisen geneettisen : : markkerin hiivalle. Hybridivektorit, jotka käsittävät hiivan ;'#,5 replikaation aloitussekvenssin, esimerkiksi kromosomaalisen • j ;*· autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pidätetään • · · « kromosomien ulkopuolella hiivasolussa transformaation jälkeen • « t t·;·, ja ne replikoi tuvat autonomisesti mitoosin aikana. Myöskin • · · voidaan käyttää hybridivektoreita, jotka sisältävät hiivan 30 2μ plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä. Tällaiset |<t' hybridivektorit integroidaan rekombinaatiolla solussa jo t · · *·* * oleviin 2μ plasmideihin, tai ne replikoituvat autonomisesti.

: Hiivalle sopivia merkkigeenejä ovat erityisesti ne, jotka antavat antibioottiresistenssin isännälle, tai auksotrofisten (Il . 35 hiivamutanttien tapauksessa geenit, jotka täydentävät isännän ’ viat. Vastaavat geenit antavat esimerkiksi resistenssin =1 17 103278 antibiootti sykloheksimidille tai saavat aikaan prototrofian auksotrofiselle hiivamutantille, esimerkiksi URA3. LEU2, HIS3 tai TRPI -geenit.

Promoottorit, jotka ovat sopivia ilmentämiseen 5 hiivassa, ovat esimerkiksi ADHI-. ADHII- tai PH05 -geenin promoottorit, ja myöskin promoottorit, jotka liittyvät glykolyysiin, esimerkiksi PGK- tai GAP-promoottori.

Valinnaisesti voidaan ekspressiovektoriin sisällyttää signaalisekvenssejä, jotka saavat aikaan TGF-p:n kaltaisen 10 proteiinin erittymisen. Sopivia signaalisekvenssejä ovat esim. hiivan hapanfosfataasista (PH05) tai hiivan inver-taasigeenistä johdetut.

Transformoituja mikrobi-isäntiä kasvatetaan nestemäisessä ravintoalustassa, joka sisältää assimiloitavia 15 hiilen-, typen- ja epäorgaanisten suolojen lähteitä, käyttäen alalla tunnettuja menetelmiä.

Useat hiilenlähteet ovat käyttökelpoisia. Esimerkkejä edullisista hiilenlähteistä ovat assimiloitavat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli, fruktoosi tai 20 laktoosi, tai asetaatti, kuten natriumasetaatti, jota voidaan käyttää joko yksin tai sopivissa seoksissa. Sopivia typenläh-teitä ovat esim. aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajotustuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet, edelleen hiivauute, mailasuute, ?5 maissinpehmitysvesi, samoin kuin ammoniumsuolat, kuten . ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan • · · käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Epäorgaaniset • · '··*’ suolat, joita voidaan käyttää, ovat esim. natriumin, kaliumin

I M

V * magnesiumin ja kalsiumin sulfaatteja, klorideja, fosfaatteja 30 ja karbonaatteja. Lisäksi ravintoalusta voi sisältää kasvua *"*: edistäviä aineita. Aineet, jotka edistävät kasvua, ovat esi- merkiksi hivenaineita, kuten rauta, sinkki, mangaani, ynnä muut, tai yksittäisiä aminohappoja.

« * <

Xl Monomeerinen TGF-p:n kaltainen proteiini saadaan

• I

·?·5 mikrobi-isäntäsoluista alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

: : : Nämä menetelmät käsittävät solujen lyysauksen tai mekaanisen hajotuksen, jotta vapautetaan haluttu proteiini, mitä seuraa 18 103278 TGF-βίη kaltaisen proteiinin erottaminen isäntäsolun proteiineista, esim. saostamalla ja/tai kromatografisilla menetelmillä.

Tapauksissa, joissa monomeerista TGF-βίη kaltaista 5 proteiinia tuotetaan mikrobi-isäntäsoluissa liukenemattomina aggregaatteina (inkluusiokappaleet), se täytyy tehdä liukoiseksi, ennen kuin se saatetaan uudelleenlaskostu-misolosuhteisiin. Vastaavasti tämä keksintö koskee edelleen menetelmää, jossa monomeerinen TGF-βίη kaltainen proteiini 10 tuotetaan seuraavilla vaiheilla: (a) eristetään isäntäsoluista veteen liukenematon proteiinifraktio, joka sisältää TGF-βίη kaltaisen proteiinin ja (b) tehdään TGF-βίη kaltainen proteiini liukoiseksi.

Monomeerin liukoiseksi tekeminen ja denaturoiminen 15 saavutetaan ei-liukoisessa muodossa olevan monomeerisen TGF- βίη kaltaisen proteiinin sisältävän raakaproteiinisuspension happamoittamisella noin pH 1-4:ään, edullisesti noin 2,5:een, valinnaisesti pelkistävän aineen, kuten DTT:n läsnäollessa, tai lisäämällä kaotrooppista ainetta, edullisesti guanidiini-20 HCl:a tai kaikkein edullisimmin ureaa, konsentraatiossa noin 4-9 M, emäksisessä pH:ssa tai nostetussa lämpötilassa, kuten edellä on kuvattu. Liukoiseksi tehty monomeeri voidaan . , puhdistaa liukoisuuden aiheuttavista kaotroopeista dialyysil- : lä ja, jos dialyysin aikana muodostuu sakka, lisäsentrifu- i ". 25 goinnilla. Liukoiseksi tehty monomeeri puhdistetaan kromato- grafiällä ja käytetään uudelleenlaskostuksessa, jotta saadaan

* · I

··* · biologisesti aktiivinen, dimeerinen tuote.

• «

Uudelleenlaskostuksen jälkeen biologisesti aktiivinen M· V : dimeeri puhdistetaan epäpuhtauksien poistamiseksi, erityises- _ 30 ti pyrogeenien tai muiden endotoksiinien, joita voi olla F *i **: läsnä tuotteessa sen jälkeen kun rekombinanttiproteiini tuotetaan mikrobi-isännässä. Dimeerin erotus toteutetaan kromatografiällä, kuten koon mukaan lajittelevalla geelikro-;;; matografialla, hydrofobisten vuorovaikutusten kromatografial- ’•;3'5 la tai ioninvaihtokromatografiällä, esim. Mono S pylväässä I : : : ja käänteisfaasi-HPLC:llä.

I : Tämä keksintö koskee edelleen dimeerisiä, biologisesti > 19 103278 aktiivisia TGF-p:n kaltaisia proteiineja, kun ne tuotetaan keksinnön mukaisella menetelmällä. Näitä TGF-βιη kaltaisia proteiineja voidaan käyttää suuressa määrässä terapeuttisia sovellutuksia.

5 Keksintö koskee edelleen monomeeristä, S-sulfonoitua TGF-β.'η kaltaista proteiinia, joka voidaan tuottaa S-sulfonoimalla monomeerinen TGF-^:n kaltainen proteiini. Monomeeriset, S-sulfonoidut TGF-βιη kaltaiset proteiinit ovat uusia yhdisteitä, joita voidaan käyttää biologisesti 10 aktiivisten TGF^:n kaltaisten proteiinien tuottamiseen.

Tämä keksintö koskee edelleen farmaseuttista koostumusta, joka käsittää tehokkaan määrän keksinnön mukaisesti tuotettua dimeeristä, biologisesti aktiivista TGF^:n kaltaista proteiinia, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää 15 suolaa annosyksikkömuodossa.

Tällainen koostumus on infuusioliuosten muodossa tai vastaavasti valmisteina parenteraalista, esimerkiksi intramuskulaarista tai intravenoosista, oraalista, tai erityisesti paikallista antoa varten. Liuokset ovat edul-20 lisesti isotonisia vesiliuoksia tai suspensioita, jotka voidaan valmistaa ennen käyttöä, esimerkiksi lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät aktiivisen aineosan yksin tai . yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.

; ·, Liuokset parenteraalista käyttöä varten ovat yleensä ".'.25 vesiliuoksia. Ne valmistetaan tavanomaisilla menetelmillä ja

III

.* . ne voivat sisältää aktiivisen aineosan lisäksi fysiologisen * · · ··· * suolan, stabiloimisaineen, kuten ihmisen seerumin albumiinin, '···’ aminohappoja, kuten arginiini tai glysiini ja hiilihydraatin, III • · · *.· · kuten glukoosi, mannoosi, dekstraani tai hydroksietyylitärk- 30 kelys. pH voidaan säätää puskurilla, esim. fosfaatilla, sukkinaatilla tai aminohapolla noin 4,5-7: ään. Yleensä lääkepullot täytetään liuoksella ja lyofilisoidaan pitempää varastointia varten.

I I I « I ·

Koostumukset sisältävät tavanomaisia lisäaineita,

• I

•;35 esimerkiksi säilöntäaineita, stabiloimisaineita, kostutus- : : j aineita ja/tai emulgoimisaineita, liuotinaineita, suoloja : osmoottisen paineen säätelemiseksi ja/tai puskureita. Nämä 20 103278 farmaseuttiset koostumukset, jotka voivat, jos on toivottavaa, sisältää muita farmaseuttisesti arvokkaita aineita, tuotetaan tavalla, joka on tunnettu per se. esimerkiksi tavanomaisilla sekoitus-, liuotus-, lyofilisointi- ja/tai 5 sterilointimenetelmillä, ja ne sisältävät noin 1 ng-100 ng/g, erityisesti noin 10 ng-10 pg/g tuotetta, ja lyofilisaattien tapauksessa jopa 100 % aktiivista aineosaa.

TGF-βίη kaltaiset proteiinit ovat kaksinaisia luonteeltaan siinä, että ne toisaalta stimuloivat tiettyjen 10 solutyyppien lisääntymistä, nimittäin fibroblastien, ja toisaalta inhiboivat toisten solutyyppien lisääntymistä, nimittäin kasvainsolujen ja immuunijärjestelmän solujen.

Dimeerisiä, biologisesti aktiivisia TGF-βιη kaltaisia proteiineja, jotka tuotetaan keksinnön mukaisesti, valinnai-15 sesti suolojen muodossa, kuten erityisesti ei-toksisina farmaseuttisina happoadditiosuoloina, valinnaisesti farmaseuttisten formulaatioiden muodossa, käytetään tehokkaina määrinä. Sanamuodolla "tehokas määrä" tarkoitetaan määrää, joka saattaa liikkeelle huomattavan paranemisen, esim. määrä, 20 joka stimuloi toivottujen solujen kasvua ja joka ei ole toksinen normaaleille soluille. Tämä määrä voidaan määrittää esim. kasvatuskokeilla in vitro. TGF-p:n kaltaisten proteii-; nien kaksinaisen luonteen vuoksi "tehokas määrä" on myös ; sellainen, joka huomattavassa määrin inhiboi kasvainsolujen ,'.25 ja immuunisolujen kasvua ja lisääntymistä. Jos suunnitellaan ;\.f ihmis- tai eläinkäyttöä, määrä tulee säätää käsiteltävän • · « erityisen kudoksen mukaan, antotavan mukaan, taudin vakavuu- • v den mukaan, ja hoidettavan potilaan iän ja yleisen kunnon mu- • i r *·* ‘ kaan. Yleensä joko yksittäiset tai päivittäiset annokset 30 aikuisille ihmisille ovat alueella noin 0,01-20 pg sekä *·'*· kasvua stimuloivaa että inhiboivaa vaikutusta varten.

• · · V * Tämän keksinnön mukaisilla farmaseuttisilla koostu- , muksilla on kliinistä käyttöä eläinten, erityisesti ihmisten

I I I

hoidossa, ja haavojen umpeutumistapauksissa erityisesti

• I

'35 vanhojen ihmisten hoidossa.

• * * i i Tämän keksinnön mukaiset koostumukset edistävät ·,/ solujen vaellusta ja lisääntymistä. Koska haavojen umpeu- 21 103278 tuminen käsittää sekä solujen liike- että solujen lisään-tymismallit, nämä tulokset in vitro ovat suoraan merkityksellisiä haavojen umpeutumisprosessille in vivo.

Makuuhaavojen (decubitus ulcers) estäminen tai 5 hoitaminen on edullinen kohde, sillä niitä esiintyy ali tuisesti sairaalapotilailla, erityisesti geriatrisilla ja pyörätuolipotilailla. Vanhoilla ihmisillä haavojen umpeu-tumisprosessi on hitaampi ja tämä potilasryhmä näyttää osoittavan suurempaa taipumusta haavoihin (ei ainoastaan 10 makuuhaavoihin ja diabetekseen liittyviin haavoihin, vaan myös tapaturmiin, palovammoihin ja muihin sen kaltaisiin), jotka joko paranevat hitaasti tai eivät parane lainkaan.

Tämän keksinnön mukaisille koostumuksille esitetään kaksi antotapaa sekä eläinlääketiedettä että erityisesti 15 ihmislääketiedettä varten.

Ensimmäinen ja edullinen antotapa on paikallinen, pintahaavojen paranemisen edistämiseksi, erityisesti vanhemmille ihmisille, joilla haavojen umpeutumisprosessit ovat havaittavasti hitaampia. Ei ole mitään rajoituksia 20 hoidettavan haavan tyypille, ja nämä käsittävät (mutta eivät rajoitu näihin): pintahaavat, jotka käsittävät makuuhaavat, diabetekseen liittyvät haavat, hammas-, suu-, suonikohju- ja hemofiliapintahaavat; palohaavat (erityisesti toisen ja ·.: : kolmannen asteen); leikkaushaavat (mukaanluettuna hammas- ja : : 25 kosmeettisten leikkauksien haavat); tapaturmaisesti saadut • : : haavat (jotka käsittävät viilto- ja pistohaavat, repeämät ja ·*“· muut vammat) ja terapeuttisesti indusoidut haavat (mukaan- • a · luettuna sädehoidon aikana indusoidut haavat). Paikallisesti • · · levitettyinä kokoonpanot voidaan yhdistää muiden aineosien ...30 kanssa, kuten lisäaineiden, kantajien, liukoiseksi tekevien » · ... aineiden ja minkä tahansa muun tunnetun, tai vielä tuntemat- f · · *. toman sekundaarisen kasvutekijän (-tekijöiden) kanssa. Näiden aineosien luonteelle ei ole mitään rajoituksia, paitsi että : : niiden tulee olla farmaseuttisesti ja fysiologisesti . j35 hyväksyttäviä antoa varten, ja ne eivät saa vähentää I · · aktiivisuutta, tai tehdä haitallisesti toksiseksi kokoon- « # *" panojen aktiivisia aineosia. Kun tämän keksinnön mukaisia i 22 103278 kokoonpanoja levitetään pintahaavoille, palohaavoille, ; kirurgisille- tai tapaturmassa saaduille haavoille, kokoon panot ovat edullisesti jauheen, geelin, voiteen, salvan tai huuhteluaineen muodossa, tai niillä voidaan kyllästää 5 transdermaaliset kääreet, laastarit ja siteet, edullisesti nestemäisessä tai puolijuoksevassa muodossa, tai ne voidaan sisällyttää hammastahnaan tai pureskeltavaan kumiin tai hart-f siin.

Toinen antotapa on systeeminen tapa sisäisten haavojen ^ 10 parantamiseksi, jotka joko seuraavat leikkausta, tai sisäelinten kudosvaurioiden parantamiseksi, joille leikkaus on joko mahdoton tai sitä ei vaadita. Tässäkään ei ole , rajoituksia hoidettavan kudoksen tai haavan tyypille, ja ne käsittävät (mutta eivät rajoitu) syvät leikkaushaavat 15 sisäelimiin ja kudoksiin; luun ja ruston (murtuman jälkeen); mahalaukun, pohjukaissuolen ja muut suoliston haavaumat. Annettuna systeemisesti, keksinnön mukaiset koostumukset voidaan formuloida nesteinä, pillereinä, tabletteina, pastilleina suolistoon antoa varten, tai nestemuodossa 20 parenteraalista injektiota varten. Leikkauksen jälkeisten u sisäisten viiltohaavojen hoitamiseksi, ne voivat olla huuhteluaineen muodossa, edullisesti yhdessä fysiologisesti Π ''·' hyväksyttävän suolaliuoksen kanssa. Jälleen, kokoonpanon i "" »i M , , > [J : : : aktiiviset aineosat voidaan yhdistää toisten aineosien

Is *.;25 kanssa, kuten lisäaineiden, kantajien, liukoiseksi tekevien H : aineiden kanssa, ja minkä tahansa tunnetun, tai vielä [J tuntemattoman sekundäärisen kasvutekijän (-tekijöiden) r · · · u: ·*·'; kanssa. Näiden aineosien luonteelle ei ole mitään rajoituk- Ξ ί · siä, paitsi että niiden tulee olla farmaseuttisesti ja ™ fysiologisesti hyväksyttäviä antoa varten ja ne eivät saa tÄ · * · !- ... vähentää aktiivisuutta, tai tehdä haitallisesti toksisiksi i = iti r • · i_ *. näiden kokoonpanojen aktiivisia aineosia.

r ·=: * i~ M,· Haavojen parantamista varten tulee aktiivisen aineosan • · · ir :<it! määrä, joka annetaan, sopeuttaa haavan tyypin, vaikeusasteen : *3,5 ja sijainnin mukaan, ja myöskin hoidettavan potilaan iän ja ; "- · I · . yleisen kunnon mukaan. Yleensä TGF-p:n kaltaisen proteiinin I 1 · ' yksittäisillä tai päivittäisillä annoksilla, jotka ovat noin ΙΪΜ 23 103278 1-20 pg haavan 1 cm2 kohti, on jo huomattavaa parantavaa vaikutusta. Sisäistä käyttöä varten tulee antaa suurempi määrä, riippuen antotavasta, johtuen TGF-p:n kaltaisen proteiinin laimentumisesta ruumiinnesteisiin.

5 Keksinnön mukaisesti tuotettujen TGF-p:n kaltaisten proteiinien muita käyttötapoja ovat luu- ja kudosvaurioiden korjaaminen, syövän hoito nisäkkäissä, toiminta anti-inflammatorisena tai immunosuppressiivisena aineena, kasvun säätelijänä nisäkkäiden soluviljelmissä tai luuydintä 10 suojaavana aineena tai sydänsuojauksen välittäjänä.

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä, ilman että niitä olisi tarkoitettu rajoittaviksi.

Esimerkki 1: TGF-βΙ-, TGF-p2- ja TGF-p3 -cDNA:n 15 kloonaus ja sekvensointi A. Solujen viljely

Ihmisen glioomasoluja CI-215 -linjasta (de Muralt, B. et ai. (1985) Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 21, 207) kasvate-20 taan kudosviljelmäpulloissa (Falcon T75), jotka sisältävät

Culbeccon Modified Eagle Mediumia (DMEM, Gibco) ja 10 % vasikansikiöseerumia.

B. RNA:n uutto : 1x10® solua ihmisen glioomasolulinjasta CI-215 kerätään .25 ja Dounce-homogenisoidaan 30 ml: ssa 5 % sitruunahappoa, jossa ·.· j on 0,2 % (w/v) NP40 detergenttiä, 4eC:ssa. Tumat erotetaan sytoplasmasta sentrifugoimalla 2,500 rpm 10 minuuttia 4°C:ssa • · ·

Sorvali RT 6000-B -pöytäsentrifugissa. Supernatanttia *

sentrifugoidaan 15,000 rpm 30 minuuttia 4°C.ssa Sorvali RC

,..30 5-B -sentrifugissa, joka on varustettu SS-34 -roottorilla.

• ·

Saatu supernatantti poistetaan ja pelletti suspendoidaan * * * uudelleen 30 ml:aan 0,2 M Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 2 % SDS, 25,000 yksikköä/l hepariinia (Sigma), ja uutetaan sitten • <t>* 3 kertaa fenoli/kloroformilla (1:1, v/v), kloroformin : .3.5 sisältäessä 24 osaa kloroformia ja 1 osan isoamyylialkoholia • · f (v/v). Lopulliseen vesifaasiin lisätään 1 tilavuus 3 M natriumasetaattia (pH 5,0) ja 2,5 tilavuutta etanolia.

24 103278

Etanolisakka pestään kahdesti 70 % etanolilla. RNA-pelletti suspendoidaan uudelleen 2 ml:aan 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 1 i mM EDTA, 0,05 % SDS. Polyadenyloitu RNA eristetään oligo-dT -selluloosakromatografiällä, kuten on kuvannut T. Maniatis, 5 Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor

Laboratory, New York (1982).

C. cDNA:n synteesi

Ensimmäinen cDNA-juoste syntetoidaan 10 pg:sta poly

I A*-RNA:ta 100 pl:ssa liuosta, joka sisältää 50 mM TRIS (pH

1 10 8,3), 50 mM KC1, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 30 pg/ml oligo-dT 12- 18, 1 mM kutakin dATP, dCTP, dGTP ja dTTP, 50 yksikköä ; RNaasi-inhibiittoria (Promega) ja 1000 yksikköä Moloney leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Gibco-BRL). _ Reaktioliuosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Reaktioliuos I 15 laimennetaan 400 pl:ksi toisen juosteen puskurilla, joka | sisältää 20 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 100 mM KC1.

Lisätään 12,5 yksikköä RNaasi H: ta (Gibco-BRL) ja reak-1 tioseosta inkuboidaan 10 minuuttia 37 °C:ssa. Reaktioseosta I jäähdytetään jäissä 5 minuuttia ja lisätään 125 yksikköä EL_ = 20 coli:n DNA-polymeraasi I:tä (Promega). Reaktioseosta inkuboidaan sitten vielä 2 tuntia 16°C:ssa. Lisätään 40 μΐ m 0,5 M EDTA:a, mitä seuraa fenoli/kloroformiuutto (1:1, v/v). = '··' Vesifaasiin lisätään 1/10 tilavuutta 3 M natriumasetaattia = (pH6,0)ja4 tilavuutta etanolia, minkä jälkeen reaktioseos- = :.:25 ta saostetaan 30 minuuttia -70°C:ssa.

/ : : : Etanolisakkaa sentrifugoidaan 10 minuuttia 17 000 g:ssä, pelletti pestään kahdesti 70 % etanolilla ja kuiva- — · · · Ξ taan Speed-Vac: ssa. Kaksi juosteinen cDNA liuotetaan ste- rilliin veteen ja ajetaan elektroforeesilla agaroosigeelissä = TRIS-boraattipuskurissa (pH 8,8), jotta saadaan arvioiduksi cDNA:n koko ja määrä.

• · · ^

I f I

*. 5 pg cDNA:ta metyloidaan sitten EcoRI-kohdista, inkuboimalla 1 tunnin ajan 37°C:ssa 100 pl:sa 50 mM TRIS/HC1 (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 80 pM adenosyyli-metioniinia ja 40 : 35 yksikköä EcoRI-metylaasia (New England Biolabs). Reaktioseos- - ta uutetaan fenoli/kloroformilla ja cDNA saostetaan etanolil- r: la ja liuotetaan steriiliin veteen, kuten edellä on kuvattu.

25 103278 5 pg cDNA:ta valmistellaan sitten linkkerin ligaatiota varten inkuboimalla 20 yksikön T4 DNA -polymeraasin kanssa 10 minuuttia 37°C:ssa 200 piissä 33 mM TRIS-asetaattia (pH 7,9), 66 mM kaliumasetaattia, 10 mM magnesiumasetaattia, 0,5 5 mM DTTia ja 0,1 mM kutakin seuraavista: dATP dGTP, dCTP ja dTTP. Reaktio jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja sitten lisätään 20 yksikköä Klenow-polymeraasia (Gibco-BRL) ja inkuboidaan 5 minuuttia huoneenlämmössä ja 5 minuuttia jäissä. Lisätään 10 μΐ 0,5 M EDTAia ja sen jälkeen reak-10 tioseosta uutetaan fenoli/kloroformilla ja cDNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan steriiliin veteen, kuten edellä on kuvattu.

12-meeriset synteettiset 5'-fosforyloidut linkkerit (New England Biolabs No. 1070) ligatoidaan sitten 5 pgiaan 15 cDNAita 100 piissä liuosta, joka sisältää 10 pg linkkeriä 50 mM TRIS/HClissä (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM DTT ja 1 mM ATP, 16°Cissa käyttäen 4000 yksikköä T4 DNA -ligaasia (New England

Biolabs). Ligaasi inaktivoidaan sitten kuumentamalla 70°Cissa

10 minuutin ajan, reaktioseos liuotetaan 500 piiksi 10 mM

20 TRIS/HC1 (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja pilkotaan 1000 yksiköllä EcoRIitä (Boehringer) 6 tunnin ajan 37°Cissa.

Lisätään 50 pl 0,5 M EDTAia ja reaktioseosta kuumennetaan 70°Cissa 10 minuuttia. Kuumennettu reaktioseos lisätään : suoraan Bio-gel A15M -pylvääseen (200-400 mesh, Bio-Rad), :#:2'5 jotta poistetaan monomeeriset linkkerifragmentit. Yli 300 : epin cDNA eluoidaan ekskluusiotilavuudessa.

• · · · D. Kloonaus lambda gtllieen • · 9

Lambda gtllin käsivarret valmistellaan pilkkomalla 100 pg lambda-vektori-DNAita EcoRIillä (New England Biolabs) 30 toimittajan ohjeiden mukaisesti. Pilkottu DNA defosforyloi- » t ... daan käyttämällä 1 yksikkö vasikan suolen alkalista fosfataa- * · · \ siä (Calf Intestine Alkaline Phosphatase, Boehringer ::: Mannheim), kuten on kuvattu. 20-30 ng cDNAita Bio-gel A15M - pylväästä saostetaan etanolissa yhdessä 1 pg:n gtll defosfo-. ’35 ryloitujen käsivarsien kanssa ja suspendoidaan uudelleen 10

pilaan liuosta, joka sisältää 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,8), 10 mM *"’ MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 15 % polyetyleeniglykolia (MW

26 103278 6000) ja 200 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioseosta inkuboidaan 2 tunnin ajan 16 *C:ssa. Reaktioseosta sentrifu-goidaan 10 minuuttia ja pelletti suspendoidaan uudelleen 10 pl:aan steriiliä vettä ja pakataan sitten in vitro 3 tunnin 5 ajan huoneenlämmössä toimittajan ohjeiden mukaisesti (Promega). 0,5 ml SM faagilaimennuspuskuria, joka sisältää 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 100 mM NaCl, 100 mM MgS04 ja 0,01 % gelatiinia, lisätään ja stabiloidaan 25 pl:la kloroformia. Yhteensä 500 000 faagia amplifioidaan 10 YT -maljoilla (15 10 cm halkaisija) käyttämällä 0,7 % agaroosi-YT:tä (Sigma) E.coli Y 1090 -solujen kanssa, kuten on kuvattu (Young, R. ja Davis, R. (1983) PNAS 80, 1194).

E. TGF-pl-, TGF-p2- ja TGF-p3 -insertit sisältävien kloonien seulonta ja valinta 15 Kustakin 10 YT -maljasta tehdään kuusi replikaa nylonfilttereille (Cuno) ja faagit filttereillä denaturoidaan 0,5 M Na0H:lla, 1,5 M NaCl:lla ja neutraloidaan, kuten on kuvattu kirjassa "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" I (T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory, New York,

20 1982). Filtterit laitetaan liuokseen, joka sisältää 0,2 x SSC

ja 0,2 % SDS, 90°C:een 15 minuutiksi ja esihybridisoidaan sitten 4 tunnin ajan 45eC:ssa liuoksessa, joka sisältää 2 x ' SSC: ta, 1 % SDSrää, 0,1 % ficollia, 0,1 % polyvinyylipyrroli- r donia, 0,1 % naudan seerumin albumiinia, 50 mM NaP04 (pH 6,8),

Ϊ f I

v25 50 pg/ml denaturoitua lohen sperman DNA:ta, 0,1 pg/ml oligo i A 12-18:a ja 100 pg/ml poly A+-RNA:ta. Kutakin 6 replikaa hybridisoidaan yli yön 45°C:ssa esihybridisaatiopuskurissa, * * * .‘Γ. johon on lisätty yksi kuudesta 3zP-leimatusta 39 ep:n oligomeeristä (katso jäljempää) konsentraatioon 2 x 105 ...?P cpm/ml.

• · u ... Kuusi oligomeeriä, joita käytetään hybridisaatiossa, • · · syntetisoidaan Applied Biosystem DNA syntetisoijassa, ja ne J#·/ vastaavat nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat TGF-pi:n (katso SEQ.ID. no. 1), TGF-p2:n (katso SEK.ID. no. 2) ja .'35 vastaavasti TGF-p3:n (katso SEK.ID. no. 3) kypsien muotojen s ;= « > 7“ (112 aminohappoa) joko ensimmäisiä aminohappoja (oligomeerit 27 103278 1, 3 ja 5) tai viimeisiä aminohappoja (oligomeerit 2, 4 ja 6).

Kaksi TGF-pi-sekvenssien osoittamiseen käytettävää oligomeeriä ovat: 5 1) 5' GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG 3' 2) 5' TCA GCT GCA CTT GCA GGA GCG CAC GAT CAT GTT GGA CAG 3'

Kaksi TGF-p2-sekvenssien osoittamiseen käytettävää 10 oligomeeriä ovat: 3) 5' GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT 3’ 4) 5' TTA GCT GCA TTT GCA AGA CTT TAC AAT CAT ATT AGA AAG 3' 15

Kaksi TGF^3-sekvenssien osoittamiseen käytettävää oligomeeriä ovat: 5) 5' GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG 3' 20 6) 5' TCA GCT ACA TTT ACA AGA CTT CAC CAC CAT GTT GGA GAG 3' '··. Jokaista oligomeeriä leimataan 40 ng 3' -päästä käyttämällä 32P-cATP:tä ja 20 yksikköä terminaalista transfe-:.:25 raasia (Gibco-BRL) 20 piissä reaktiopuskuria, joka sisältää

U { 100 mM kaliumkakodylaattia (pH 7,2), 1 mM CoCl2:a ja 0,2 mM

:***: DTT:a 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos geelisuodatetaan

• « I

Sephadex G-50 -pylväässä. Eluoituja leimattuja oligomeereja kuumennetaan 95°C:ssa 5 minuuttia ja ne lisätään esihybri- ,..?£> disaatiopuskuriin, kuten edellä on kuvattu.

• · ... Replikat 1-6 hybridisoidaan vastaavasti oligomeerien t * · 1-6 kanssa. Hybridisaation jälkeen filttereitä pestään !,·,'· kahdesti 2 x SSC:llä, 1 x SSC:llä ja 0,1 x SSC:llä huo- : : neenlämmössä 15 minuutin ajan. Positiiviset plakit tunnis- . 3β tetaan autoradiografiällä ja ne seulotaan uudelleen tois- * · » tamalla edellä annettua menettelytapaa, kunnes kaikki plakit maljalla ovat positiivisia. Yksi plakki eluoidaan 1 ml :11a 28 103278 SM-faagilaimennuspuskuria (katso kappale l.D), 100 μΐ lisätään 1 ml:aan E. coli Y 1090 -soluja ja seosta pidetään 20 minuuttia huoneenlämmössä. E.coli Y 1090 solut ja faagit lisätään 100 ml:aan YT-alustaa, joka sisältää 0,2 % maltoosia 5 ja inkuboidaan 37°C:ssa 7 tuntia. Sen jälkeen kun on lisätty 1 ml kloroformia lyysattuihin soluihin, faagi-DNA puhdistetaan menetelmän mukaan, joka on kuvattu kirjassa "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (T. Maniatis, Cold Spring

Harbour Laboratory, New York, 1982). Puhdistettu DNA 10 liuotetaan liuokseen, jossa on 1 ml 10 mM TRIS/HC1 (pH 7,5) ja 1 mM EDTA ja 100 μΐ pilkotaan täydellisesti kokonaismäärässä 1 ml EcoRI:llä toimittajan suosituksia noudattaen (Boehringer). Entsyymireaktioseos uutetaan fenoli/klorofor- - millä ja seostetaan etanolilla. EcoRI cDNA-insertit puhdiste-Ϊ 15 taan geelielektroforeesilla (Ultrapure BRL) käyttämällä NA- 45 DEAE -paperia (Schleicher ja Schuell). DNA eluoidaan

J

1 liuoksella, joka sisältää 50 mM TRIS/HC1 (pH 7,5), 5 mM EDTA

^ ja 1 M NaCl, uutetaan fenoli/kloroformilla ja seostetaan . etanolilla. Saatu pelletti pestään kahdesti 70 % etanolilla

_ 20 ja suspendoidaan uudelleen liuokseen, joka sisältää 10 mM

TRIS/HC1 (pH 7,5) ja 1 mM EDTA.

F. cDNA-inserttien sekvensointi

EcoRI cDNA-insertit alakloonataan Bluescript KS* m m “ vektoriin (Stratagene). cDNA:n identtisyys varmistetaan i :,25 kaksiketjuisella sekvensoinnilla F. Sangerin et ai. (1977) | PNAS 74, 5463 kuvaaman menetelmän mukaan käyttäen edellä ^ :***: kuvattuja oligomeerejä (katso kappale l.E) ja ja Sequenase- · · o - pakkausta (U.S.Biochemicals). Nukleotidisekvenssit, jotka •m 9 * käsittävät kypsän TGF-pi:n TGF-p2:n ja TGF-p3:n 112 aminohap- — ...3P poa, on esitetty SEK.ID. no. l:ssä, 2:ssa ja vastaavasti · · 44· 3 · ssa · — · » · • · \ G. cDNÄ-inserttien araplifikaatio ja alakloonaus plasmidiin pGem-5

• I I

Yllä kuvattuja oligomeerejä (katso kappale l.E) TGF- = ; *3^ pl:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n sekvenssien tunnistamiseen, ^ · · » käytetään amplifikoimaan cDNA-insertit, jotka koodaavat 29 103278 kypsiä 112 aminohapon muotoja (mukaanluettuna lopetuskodo-ni).

Bluescript KS* -plasmidien EcoRI cDNA -insertit (katso kappale l.F) puhdistetaan geelissä, kuten edellä on kuvattu 5 (katso kappale l.E). 50 ng kutakin cDNA-inserttiä amplifikoi- daan 2 x 2 pg vastaavan kahden oligomeerin läsnäollessa polymeraasiketjureaktiolla 100 pl:ssa reaktioseosta, joka sisältää 10 mM TRIS/HC1 (pH 8,35), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,05 % (w/v) NP-40, 0,05 % (w/v) Tween 20 ja 200 μΜ kutakin 10 dATP, dGTP, dCTP ja dTTP käyttäen 5 yksikköä Taq polymeraasia (Perkin-Elmer Cetus). 30 kierrosta amplifikaatiota suoritetaan seuraavissa lämpötiloissa käyttäen Perkin-Elmer Cetus lämmitysyksikköä: 93°C/0,1 minuuttia, 55°C/0,2 minuuttia, 71°C/1,5 minuuttia. Saadut 339 ep:n fragmentit, jotka 15 käsittävät TGF-βΙιη, TGF-p2:n ja vastaavasti TGF-p3:n koodaavat sekvenssit, puhdistetaan geelissä ja alakloonataan plasmidiin PGem-5ZF(+) (Promega), joka on pilkottu Ncolillä, defosforyloitu vasikan suolen alkalisella fosfataasilla (Boehringer) ja täydennetty Klenow-polymeraasilla (Gibco-20 BRL). Saadut rakenteet nimetään pGKM 125 (TGF-βΙ), pGKM 740 (TGF-p2) ja pGKM 126 (TGF-p3) ja käytetään transformoimaan kompetentit E. coli Y 1090 -solut (katso esimerkki 2). Kloonit, jotka sisältävät oikeat TGF-βΙ: tä, TGF-p2: ta ja TGF-! p3:a koodaavat insertit nimetään E. coli Y1090/pGKM 125 :’:25 (TGF-βΙ), E. coli Y1090/pGKM 740 (TGF-p2) ja vastaavasti E_j_ : coli Y1090/pGKM 126 (TGF-p3).

• · · .

• · · • · « « • · · .•Γ. Esimerkki 2: TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n ilmen- täminen E. colissa

...3P

• · ... A. Yleiset menetelmät • · · \ Bakteerikanta (E. coli K 12): LC 137:htpRam, lonR9, lacaB1, malm, trpan, rspL, tsx::Tnl0, supCts (Goff, S. A. et ai. (1984) PNAS 81, 6647-6651).

• * . S5 Plasmidit: 'il.' pPLMu: (Buell, G. et ai. (1985) Nucleic Acids Res. 13, 1923- 1938). Tässä plasmidissa on bakteriofagi XPL-promoottori » 1«278 faagin Mu ner geenin ribosomin sitoutumispaikan kanssa (Van Leerdam, E. et ai. (1982) Virology 123, 19-28). pcl857 : Plasmidi, joka koodaa termolabiilia Xci857-repressoria ja antaa resistenssin kanamysiinille (Remault, E. et ai. 5 (1983) Gene 22, 103-113).

SDS-geelielektroforeesi: SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja proteiinivärjäys tehdään, kuten aikaisemmin on kuvattu (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685) käyttäen Mini-10 protean II kammiota Bioradriita ja 1 mm paksuja 18 % polyak- ! I ryyliamidigeelejä.

Kuumainduktio: | ; 7 ml LB-alustaa (Maniatis et ai. (1982), Molecular Cloning,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 20 ml viljelyputkes-; 15 sa, joka sisältää 40 pg sekä ampisilliiniä että kanamysiiniä (LB/amp/kan) ympätään yhdellä pesäkkeellä ja inkuboidaan ravistelussa yli yön 30°C:ssa. 5 ml tätä yön yli kasvatettua | · viljelmää lisätään 15 ml taan LB/amp/kan -alustaa 100 ml

Erlenmeyerpulloon. Pullo siirretään 42°C ravistelevaan 20 vesihauteeseen. 2 ml näyte otetaan ennen siirtoa (ei- Γ indusoivat olosuhteet) ja 1 ml näytteet 1 tunnin välein ; siirron jälkeen (indusoivat olosuhteet). Solut pelletoidaan ‘ sentrifugoimalla (5 min, 10,000 rpm Eppendorf-sentrifugissa) ja supernatantti poistetaan. Pelletti suspendoidaan uudelleen !- '· 25 100 pl:aan näytepuskuria SDS-PAGEa varten ja kuumennetaan 10 ii : .·.

j : minuuttia 95°C:ssa. 5 μΐ määrät ladataan SDS-PAGEen.

* * *

Kompetenttien solujen valmistus • ·« : Kompetentit E. coli -solut valmistetaan kalsiumklo- ridimenettelytavalla, kuten on kuvattu kirjassa Maniatis et t 3 l ·;30 ai. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 11 New York. Soluja, jotka sisältävät plasmidin pcl857, kasvate taan 30°C:ssa.

;:: .

i B. Ilmentämisvektoreiden pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF- 1-- ·“'· I β2 ja pPLMu.hTGF^3 rakentaminen ja ΤβΡ-βΙιη, TGF^2:n ja i - j:r : 35 ΤϋΓ-β3:n ilmentäminen “ .··. E. coli Y 1090/pGKM 125, E. coli Y 1090/pGKM 740 ja E. coli Y 1090/pGKM 126 (katso esimerkki l.G) -soluja =8= 31 103278

kasvatetaan LB-alustalla ja plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Birnboim, H.C. ja Doly, H (1979) Nucleic Acids Research 7, 1513. 5 pg plasmidi-DNA: ta pilkotaan täydellisesti 50 yl:ssa restriktiopuskuria joko 5 Ncol: llä ja Sali: llä (pGKM 125), Nco.-lla ja EcoRVrllä (pGKM

740) tai ainoastaan Ncol:llä (pGKM 126), seuraten toimittajan suosituksia (Boehringer). DNA saostetaan lisäämällä 5 μΐ 3 M natriumasetaattia, 100 mM MgCl2, 5 mM edta ja 150 μΐ etanolia. Sen jälkeen kun on inkuboitu -70eC:ssa 15 min ajan, 10 DNA pelletoidaan sentrifugoimalla 13 000 g 15 min SS34 roottorissa Sorvali sentrifugissa. Supernatantti poistetaan ja pelletti suspendoidaan uudelleen 80 yl:aan 0,089 M TRIS-boraattia, 0,089 M boorihappoa ja 0,002 M EDTA (TBE-buskuri), joka sisältää 0,25 % bromifenolisinistä ja 0,25 % ksyleeni-15 syanolia. 4 kertaa 20 μΐ näytteet ajetaan elektroforeesilla 1 % agaroosigeelin läpi TBE-puskurissa, joka sisältää 0,5 yg/ml etidiumbromidia, 50 voltilla, kunnes bromi- fenolisinimerkki saavuttaa 10 cm pitkän ja 0,8 cm paksun geelin pohjan. Kypsää TGF-pi:ta, TGF-p2:ta ja vastaavasti 20 TGF-p3:a koodaavat DNA-fragmentit tehdään näkyviksi lyhytaal toisen UV-valon alla, leikataan partakoneenterällä ja elektroeluoidaan geelinkappaleista Schleicher & Schiill ’ Biotrap -laitteessa, asetettu 200 milliampeerille, 1,5 tunnin ajan. Eluoidut DNA-fragmentit saostetaan (katso edellä) ja :25 suspendoidaan uudelleen 20 pl:aan TE:tä.

i j': 5 μΐ plasmidia pPLMu linearisoidaan pilkkomalla joko ·*”· Ncol:llä ja Sali:llä, Ncol:llä ja EcoRV:llä tai ainoastaan • « ·

Ncol: llä, ja puhdistetaan geelissä, kuten edellä on kuvattu fragmentti-DNA:ille. 100 ng linearisoitua ja puhdistettua 4<30 pPLMu-vektori-DNA:ta ja 3 kertaa molaarinen määrä vastaavaa • · ... puhdistettua fragmentti-DNA:ta inkuboidaan 4°C:ssa 15 tuntia f f i

*. 20 pl:ssa ligaatiopuskuria (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5, 10m mM

: : : MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM adenosiini-trifosfaatti), joka : sisältää yhden yksikön DNA-ligaasia (Boehringer).

. '35 10 μΐ ligaatioseosta lisätään 200 yl:aan kylmiä (4eC) • · i M.' kompetentteja E. coli LC 137 -soluja, jotka sisältävät « plasmidin pcl857. 30 minuutin kuluttua solut saatetaan 32 103278 lämpösokkiin inkuboimalla 1,5 min 42 °C vesihauteessa. Lisätään 2 ml LB-alustaa ja viljelmää ravistellaan 60 min 30°C:ssa. 200 μΐ määrät maljataan LB-maljoille, jotka sisältävät ampisilliinia ja kanamysiiniä ja inkuboidaan 22 5 tuntia 30°C:ssa. Kasvatetaan yksittäisiä kolonioita ja analysoidaan plasmidi-DNA. TGF-pi:tä, TGF^2:ta ja TGF~p3:a koodaavien DNA-fragmenttien alakloonauksella pPLMu:ssa saadaan aikaan plasmidit pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu. hTGF^2 ja vastaavasti pPLMu.hTGF-β3. Yllä mainitut konstruktiot 10 sisältäviä klooneja kutsutaan E. coli LC 137/pPLMu.hTGF^l, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF^2 ja vastaavasti E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β3.

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF^l-, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-β2- ja E. coli LCl37/pPLMu.hTGF^3 -soluja - 15 kuumaindusoidaan (katso esimerkki 2.A), ja ilmennetyt proteiinit analysoidaan SDS-PAGE:11a. TGF-βΙ, TGF^2 ja TGF-β3 ovat kaikki havaittavissa kuumaindusoituina proteiineina kaksi tuntia kuumainduktion jälkeen, liikkuen näennäisen noin 12 000 D:n molekyylipainon mukaisesti.

20 C. Transformanttien fermentointi

Yli yön kasvatettavia E. coli LC 137/pPLMu.hTGF^l :n, ; E. coli LC 137/pPLMu.hTGF^2:n ja E. coli LC 137/pPLMu.hTGF- : β3:η viljelmiä 2 1 Erlenmeyer-pulloissa, jotka sisältävät 750 i < < ; ml LB-alustaa 40mg/l, ampisilliinillä ja kanamysiinillä, j .’ .25 kasvatetaan 30°C:ssa. Yli yön kasvatettuja viljelmiä lisätään • :*: 300 ml 750 mlraan LB-alustaa, jossa on yllä mainitut *·>· 9 ·’*’· antibiootit, 2 1 Erlenmeyer-pulloihin, ja kuumennetaan • 9 * .*i'. 42°C:een ravistamalla noin 3,5 minuutin ajan 65°C vesi- • # · hauteessa. Pullot siirretään sitten 42°C ravistelijaan ja 3p inkuboidaan 3 tuntia. Pullot jäähdytetään 12°C:seen jää- * * ... vesihauteessa ja solut kerätään 10 minuutin sentrifugoinnin • · · jälkeen 8,000 rpm:lla GSA-roottorissa (Sorvali).

« • ti _ «tl

Esimerkki 3: TGF-βΙίη, TGF-p2:n ja TGF-β:n ilmentä-. '35 minen Saccharomvces cerevisiaessa

• · I

. : tii l : · i

Kypsän TGF-βΙίη, TGF^2:n ja τσΓ-β3:η koodaavat 33 103278 sekvenssit ilmennetään Saccharomyces cerevisiaessa hiivan hapanfosfataasin (PH05) indusoituvan promoottorin kontrollin alaisena.

Ilmentämisvektorit rakennetaan kahdessa vaiheessa: 5 A. Plasmidin pJDB207/PH05-RIT 12 rakentaminen, B. Plasmidien pJDB207R/PHO5-TGF-pl, pJDB207R/PH05-TGF-p2 ja pjDB207R/PH05-TGF-p3 rakentaminen, jotka A) tarjoavat hiivavektorin ja PH05 -transkription terminaattorin ja B) tarjoavat ilmentämiskasetit, joissa on kypsää TGF-βΙ:tä. TGF-10 p2:ta ja vastaavasti TGF-p3:a koodaavat insertit PH05- promoottorin kontrollin alaisena.

A. plasmidin pJDB207/PH05-RIT 12 rakentaminen Plasmidi p3lRIT 12 (eurooppalainen patenttihakemus EP 277,313) linearisoidaan restriktioendonukleaasilla Sali. 15 Osittainen Hindlll-pilkkominen etidiumbromidin läsnäollessa johtaa 1 ke:n Sall/Hindlll-fragmentin syntyyn, joka käsittää 276 ep:n Sall/BamHI pBR322-sekvenssin, 534 ep:n hiivan hapanfosfataasin PH05 - promoottorin, hiivan invertaasin signaalisekvenssin (koodaa 19 aminohappoa) ja PH05-transkrip-20 tion terminaattorin.

p31RIT 12:n 1 ke:n Sall/Hindlll-fragmentti kloonataan hiiva-E. coli-sukkulavektoriin pjDB207 (Beggs, J. D., Molecular Genetics in Yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Kööpenhamina 1981, s. 383-389), joka on katkaistu Sail: 11a ja Hindlll: 11a.

• I

1,:35 Saatu plasmidi, joka sisältää 1 ke:n insertin, nimetään :T: pJDB207/PH05-RIT 12.

• ;*; B. Plasmidin pJDB207R/PH05-TGF-62 rakentaminen • · · ·

Plasmidi pGKM740 (TGF-P2) (katso esimerkki l.G) pilkotaan NcoI:llä. Tarttuvat päät täytetään reaktiossa 30 Klenow DNA -polymeraasilla. EcoRI-linkkeri (5'-CCGGAATTCCGG;

Biolabs) lisätään ja seos ligatoidaan. Saatu rengasmainen • · ... plasmidi nimetään pGKMA668 (TGF-B2) ja se katkaistaan • » ·

EcoRI:llä ja Sall:llä. 0,4 ke:n EcoRI/Sall -fragmentti ·.;/ eristetään agaroosigeelistä, puhdistetaan ja suspendoidaan : 35 uudelleen steriiliin veteen konsentraatiossa 25 pg/ml.

: ]·, Fragmentti sisältää TGF-β:n kypsän koodaavan sekvenssin, • · » jossa on ATG kehyksessä kodonin GCT kanssa, joka määrittää 34 103278 aminohapon Ala 1 kypsässä TGF-p2:ssa.

PH05-promoottori eristetään plasmidista p31RIT 12 (katso edellä) 534 ep:n BamHI/EcoRI -fragmentissa. Plasmidi pJDB207/PH05-RIT 12 pilkotaan BamHI:llä ja Xholillä. Suuri, 5 6,8 ke:n BamHI/XhoI -fragmentti eristetään. PH05-transkrlp- tion terminaattori jää fragmenttiin. BamHI/EcoRI - PH05-promoottorifragmentti, EcoRI/Sall-fragmentti, joka koodaa TGF-p2:ta ja BamHI/XhoI-vektorifragmentti ligatoidaan. Yksi oikea klooni, jossa on TGF-p2-geeni PH05-promoottorin 10 kontrollin alaisena, kloonattuna vastapäivään orientoituneena pJDB207:ään nimetään pJDB207R/PH05-TGF-p2:ksi.

Analogisella tavalla, kypsä TGF-βΙ ja TGF-p3 ilmennetään S. cerevislaessa. TGF-pi:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvenssit sisältävät plasmidit ovat pGKM125 ja vastaavasti 15 pgkml26 (katso esimerkki l.G). Näiden plasmidien katkaisun

NcoI:llä, EcoRI-linkkereiden lisäämisen ja ligaation jälkeen, saadut rengasmaiset plasmidit katkaistaan EcoRIrllä ja Sall:llä. EcoRI/Sall-fragmentit kloonataan pJDB207: ään, kuten edellä on kuvattu. Saadut plasmidit nimetään pJDB207R/PH05-20 TGF-βΙ ja pJDB207R/PH05-TGF-p3.

C. S. cerevisiae -kannan GRF18 transformaatio S. cerevisiae -kanta GRF18 (MATa, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112. canR, DSM 3665) transformoidaan plasmideilla p JDB207R/PH05-TGF^1 ; :,i25 pJDB207R/PH05-TGF-p2 :V: pJDB207R/PH05-TGF^3 • ;*; käyttäen transformaatiomenetelmää, jonka ovat kuvanneet • · « · ·*" * j Hinnen, A. et ai. (1978) PNAS 75, 1929. Transformoidut i *·»·* : .*:·. hiivasolut selektoidaan hiivan minimaalialustamaljoilla, 30 joista puuttuu leusiini. Yksittäisiä transformoituneita il . hiivapesäkkeitä eristetään ja nimetään

Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-pl • · · \ Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p2

Saccharomvces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p3.

:‘3:5 D. S. cerevisiae -transformanttien fermentaatio ja . solu-uutteiden valmistus i « ·

Hiivatransformantit, kuten edellä on mainittu, 35 103278 sisältävät plasmidit, joissa on PH05-promoottorin kontrolloimat ilmentämiskasetit, ja siksi ne edellyttävät promoottorin derepressoitumisen TGF-βΙ:n, TGF-p2:n tai TGF-p3:n ilmentämiseksi. Transformantit kasvatetaan kukin kahdessa 5 peräkkäisessä esikasvatuksessa (10 ml ja 50 ml) hiivan korkean Pt:n minimaalialustalla, joka on valmistettu Difco Yeast Nitrogen Basen reseptin mukaan ilman aminohappoja, mutta sisältäen 10 g/1 L-asparagiinia (NH4)2S04:n asemesta, 1 g/1 L-histidiiniä ja 20 g/1 glukoosia. Toisen esikasvatuk-10 sen solut pestään 0,9 % NaClissa ja kaikki solut käytetään 100 ml alhaisen Pt:n minimaalialustan ymppäämiseen, joka on valmistettu Difco Yeast Nitrogen Base -alustan reseptin mukaan (ilman aminohappoja), mutta sisältäen 0,03 g/1 KH2P04, 10 g/1 L-asparagiinia, 1 g/1 L-histidiiniä ja 20 g/1 15 glukoosia. Viljelmiä ravistellaan 30°C:ssa 180 rpm.

Solut 10 ml viljelmästä kerätään 5 tunnin, 24 tunnin ja 48 tunnin kuluttua sentrifugoimalla 3000 rpm ja pestään kerran 0,9 % NaClrssa. Solupelletti suspendoidaan uudelleen lyysipuskuriin [66 mM kaliumfosfaatti pH 7,4, 4 mM Zwitter-20 gent (Calbiochem)], lisätään 8 g lasihelmiä (0,5-0,75 mm halkaisijaltaan), ja suspensiota ravistellaan vomakkaasti 4-5 kertaa 2 minuutin ajan kerralla Vortex Mixerissä kylmässä. Solu-uute dekantoidaan, jotta päästään eroon lasihelmistä. Solujäte uutteessa sedimentoidaan sentrifugoimalla 5 min 3000 i.i25 rpm 4°C:ssa. Supernatantti ja pelletit erotetaan ja säilyte- : :: tään -20°C:ssa.

• · • · · I · ♦

··« I

Esimerkki 4: dimeeristen, biologisesti aktiivisten

»M

TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n tuottaminen ‘30 # Jäljessä annettuja menettelytapoja dimeerisen, biolo- ... gisesti aktiivisen TGF-82:n tuottamiseksi, voidaan käyttää • · · vastaavasti dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-pi:n, TGF-p3:n ja vastaavasti muiden "TGF-p:n kaltaisten prote-:'35 iinien" talteenottoon.

. A. Ei-liukoisen, monomeerisen TGF-p2:n saanti Ej.

'.!. ‘ colista 36 103278 E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p2 -soluja fermentoidaan, kuten esimerkissä 2.C on kuvattu. Solujen hajottaminen ja ei-liukoisen TGF-p2:n talteenotto suoritetaan 4°C:ssa. Noin 18 g märkiä soluja suspendoidaan 60 ml:aan 0,1 M TRIS/HC1, 10 5 mM EDTA, 1 mM PMSF (fenyylimetaanisulfonyylifluoridi), pH 8,3 ' (hajotuspuskuri). Solut kuljetetaan kaksi kertaa Frenchpres- sin läpi (SLM Instruments, Inc.) valmistajan ohjeiden mukaisesti, ja tilavuus saatetaan 200 ml:aan hajotuspuskuril-’ la. Suspensiota sentrifugoidaan 20 min 15,000 g. Saatu 10 pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka ^ sisältää 1 M NaCl ja sentrifugoidaan 10 min, kuten edellä.

Pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 % Triton X-100 (Pierce) ja sentrifugoidaan taas -j 10 min, kuten edellä. Pesty pelletti suspendoidaan sitten 50 15 ml:aan 20 mM TRIS/HC1, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 % DTT ja "5 homogenisoidaan Teflon kudosmyllyssä. Saatu suspensio sisältää raa’an, monomeerisen TGF~p2:n ei-liukoisessa muodossa.

B. Monomeerisen TGF-p2:n liukoiseksi tekeminen ja 20 puhdistus

10 ml TGF-p2-suspensiota, joka on saatu esimerkin 4.A

tai 4.C mukaisesti, asidifioidaan 10 % etikkahapolla pH

2,5:een ja sentrifugoidaan Eppendorf-sentrifugissa 10 min H huoneenlämmössä. Supernatantti ajetaan kromatograf iällä li :.:25 Sephacryl S-100 -pylväässä (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) 10 % === · « * etikkahapossa virtausnopeudella 1,4 ml/min. (Vaihtoehtoisesti -f—- · # ii jj j kromatograf ia voidaan tehdä Sephacryl S-100 HR.-llä (Pharma- cia) ja pylväässä voidaan ajaa 1 % etikkahappo tai vastaavas- ;·τ ti 5 mM HC1). Monomeerisen, denaturoidun TGF-p2:n, joka ! ^ · φ, 30 eluoituu 190 ja 220 minuutin välillä, sisältävät fraktiot yhdistetään. Tätä materiaalia käytetään uudelleenlaskostuk- * » ...^ seen, jotta saadaan biologisesti aktiivinen, dimeerinen TGF-

-__ t · I

7Z \ β2 (esimerkit 4.G.J.K.L), tai puhdistukseen edelleen, : käytettäväksi rakenneanalyysissä (esimerkki 4.D).

j rl i i i .1— :_3:5 C. Monomeerisen TGF-p2:n talteenotto Saccharomvces -f— ; cerevisiaesta

Rikottujen solujen pelletti, joka on saatu 500 ml I · l t ττ: , , , 37 103278 fermentaatiosta, toteutettu kuten esimerkissä 3.D on kuvattu, suspendoidaan 20 ml:aan 4 M ureaa, 0,1 M TRIS, 1 % DTT, pH 8,0. Seosta pidetään huoneenlämmössä 30 min ja vorteksoidaan ajoittain joka viides minuutti. Liukenematon materiaali 5 poistetaan sentrifugoimalla 30,000 g 30 minuuttia 4°C:ssa, ja supernatantti säädetään pH 2,5 teen etikkahapolla ja dialysoidaan ekstensiivisesti 5 % etikkahappoa vastaan yli yön 4eC:ssa. Liuos sentrifugoidaan kuten edellä, ja kirkas supernatantti konsentroidaan ultrasuodatuksella YM 10 - 10 membraanilla (Amicon) lopulliseen tilavuuteen 4 ml. Näyte ajetaan kromatografiällä Sephacryl S-100 HRtssä (Pharmacia) 5 % etikkahapossa, kuten esimerkissä 4.B on kuvattu, ja saadaan monomeerinen TGF-p2.

D. Monomeerisen TGF-p2:n puhdistaminen edelleen RP-15 HPLCtllä

Yhdistetyt fraktiot Sephacryl S-100 -pylväästä (esimerkki 4.B) puhdistetaan Vydac 214TP5415 HPLC -kään-teisfaasipylväässä (4,6 x 150 mm. The Separations Group, Hesperia, CA, USA). Pylväs tasapainotetaan seoksella 70 % TFA 20 0,1 % vedessä ja 30 % TFA 0,08 % asetonitriilissä, ja tuote eluoidaan lineaarisella gradientilla 30 minuutin ajan päättyen seokseen 55 % TFA 0,1 % vedessä ja 45 % TFA 0,08 % asetonitriilissä virtausnopeudella 1 ml/min. Eluaatin absorbanssi tutkitaan 216 nmrssa ja yksittäiset piikit ·, 25 kerätään käsin UV-absorbanssin mukaisesti. Denaturoitu, : : : monomeerinen TGF-p2 eluoituu 21,5 minuutissa. Riippuen • erotukseen käytettävästä yksittäisestä käänteisfaasipylvääs- • · ♦ · tä, sama TGF-p2-valmiste eluoituu noin 16 minuutissa ja • · ♦ vastaavasti 18 minuutissa.

30 TGF-p2-fraktiot analysoidaan RP-HPLC:llä käyttämällä samaa pylvästä ja liuotinsysteemiä kuin edellä. TGF-p2 • · ... eluoidaan lineaarisella gradientilla yli 42 minuutissa alkaen • · · 100 % TFA:11a 0,1 % vedessä ja päättyen seokseen 30 % TFA : : vedessä ja 70 % TFA 0,08 % asetonitriilissä. TGF-p2 eluoituu :"35 yksittäisenä piikkinä 30,4 minuutin kuluttua. Riippuen . käytetystä yksittäisestä pylväästä, saadaan 29 minuutin ja vastaavasti 29,9 minuutin retentioajat.

38 103278 TGF-p2 analysoidaan sen jälkeen, kun se on sekoitettu kemiallisesti pelkistetyn luonnollisen sian TGF-p2:n kanssa (British Biotechnology Limited, Oxford, UK), jolla on samanlainen primäärinen rakenne kuin ihmisen TGF-p2:lla 5 (Marquardt, H. et ai. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127- 12131). Seos eluoituu yhtenä piikkinä, mikä vahvistaa materiaalin identtisyyden.

E. Monomeerisen TGF-p2:n analyysi SDS-PAGE:lla

Yksittäiset määrät Sephacryl S-100 -pylväästä 10 (esimerkki 4.B) tai käänteisfaasipylväästä (esimerkki 4.D) kuivataan vakuumissa ja analysoidaan SDS-PAGE:lla (Lämmli, t U.K. (1970) Nature 227, 680) 15 % polyakryyliamidi-slab- geeleissä, jotka värjätään Coomassie Blue R-250:llä. Saadaan yksittäinen, molekyylipainoltaan ilmeisesti noin 12 000 D:n 15 vyöhyke, jota ei voida erottaa luonnollisesta sian TGF- 5 p2:sta.

F. Monomeerisen TGF-p2:n N-terminaalisen amonohap-posekvenssin määritys TGF-p2 esimerkistä 4.B haihdutetaan vakuumissa, 20 liuotetaan 25 pl:aan etikkahappoa ja saatetaan aminohap- posekvenssimääritykseen kaasufaasi-proteiinisekvensoijalla,

L

malli 470A (Applied Biosystems).

N-terminaalinen aminohapposekvenssi on: ; 5 10 15 ,25 Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-X-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X- 4 4 4 • · · • · 4 i X-Leu-Arg-Pro • · · * -i.. · · · • · *«( .1: jossa X osoittaa aminohappoa, jota ei ole varmuudella määri- 30 tetty.

Samoin määritetään aminohapposekvenssi TGF-p2:n 4- 4 f vinyylipyridiinijohdannaiselle, joka on valmistettu, kuten • · 4 ovat kuvanneet Marquardt, H. et ai. (1987) J. Biol. Chem.

: 262, 12127-12131.

«i « · 'Γ'7! · · 39 103278 N-terminaalinen amonohapposekvenssi on: 5 10 15

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X- 20 25 5 Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-X-Arg-Asp-Leu- jossa X osoittaa aminohappoa, jota ei ole varmuudella määritetty. Kysteiini määritettiin S-pyridyylietyylikysteiininä.

G. Dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p2:n 10 tuottaminen 3 mg monomeeristä, denaturoitua TGF-p2:ta esimerkistä 4.B liuotetaan 140 ml:aan 50 mM TRIS/HC1 pH 8,0, IM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM pelkistettyä glutationia, 1 mM hapetettua glutationia ja 33 mM Chaps (Calbiochem). 72 tunnin jälkeen 15 4°C:ssa liuoksen pH säädetään 2,5:een HCl:lla ja seos konsentroidaan 10 kertaiseksi ultrasuodatuksella YM 10 membraanilla (Amicon, Danvers, MA, USA) Amicon ravistelukam-miossa. Konsentroitu liuos laimennetaan alkuperäiseen tilavuuteen 10 mM HCl:lla ja konsentroidaan lopulliseen 20 tilavuuteen 10 ml samalla menetelmällä. Saatu sakka poiste taan sentrifugoimalla 5000 g 30 minuuttia. Supernatantti sisältää disulfidisidotun dimeerisen TGF-p2:n, kuten SDS-PAGE:lla määritetään ei-pelkistävissä olosuhteissa. Valmisteen biologinen aktiivisuus määritetään solujen liike- ja : 25 kasvuanalyysillä (esimerkki 5.A) ja solujen kasvun inhibitio- analyysillä (esimerkki 5.B).

| Vaihtoehtoisesti, sen sijaan että käytetään mono- • · · «- meeristä TGF-p2-ta, käytetään S-sulfonoitua TGF-p2-johdan- • · · naista (esimerkki 4. M) dimeerisen, aktiivisen TGF-p2:n « i · *30 tuottamiseen, käyttämällä olennaisesti tässä esimerkissä kuvattua menettelytapaa, sillä erotuksella, että natriumia* kloridikonsentraatio on 2 M. Dimeerisen TGF-p2:n puhdista- • > » *·’ ’ minen ja eristäminen toteutetaan samoilla menetelmillä kuin : dimeeriselle TGF-p2:lle, joka on tuotettu derivatisoimatto- ;’3$ masta monomeerisestä proteiinista (esimerkit 4.H ja 4.1).

·, H. Dimeerisen TGF-p2:n eristäminen kationinvaihto- « · < ' kromatografiällä Mono S -pylväässä • · 40 103278

Konsentroitu liuos esimerkistä 4.G laitetaan 1 ml/min virtausnopeudella Mono S HR 5/5 -pylvääseen (Pharmacia), joka on tasapainotettu seoksella 85 % puskuri A:ta (20 mM

natriumasetaattia, 30 % isopropanoli, pH 4,0) ja 15 % puskuri 5 B:tä (puskuri A, joka sisältää 1 M natriumkloridia)- Pylväs pestään sitten samalla virtausnopeudella, pitäen puskuriseok-sen koostumuksen vakiona, kunnes absorbanssilukema 280 nm:ssa on saavuttanut perustason, mitä seuraa lineaarinen gradientti * 20 minuutin ajan, alkaen injektiosta tasapaino-oloissa ja 10 päättyen seokseen 50 % puskuri A:ta/50 % puskuri B:tä.

Dimeerinen, biologisesti aktiivinen TGF-p2 eluoituu 9 minuutissa gradientin alusta ja se kerätään käsin. Biologisen aktiivisuuden määrityksen perusteella, SDS-PAGE ei-pelkistä-vissä olosuhteissa ja RP-HPLC, yhtään dimeeristä TGF-p2:ta 15 ei löydetty läpivirranneessa fraktiossa. Lisäksi, yhtään monomeeristä TGF-p2:ta ei havaittu DSD-PAGE:lla dimeerisessä TGF-p2-piikissä, joka eluoitui pylväästä suolagradientilla.

I. Dimeerisen TGF-p2:n puhdistaminen edelleen

Dimeerinen TGF-p2 esimerkistä 4.G laimennetaan samalla 20 tilavuudella 0,1 % TFA:ta vedessä ja saatetaan RP-HPLC:hen

Vydac 214TP5415 -pylväässä (4,6 x 150 mm, The Separations 4i Group, USA), joka on tasapainotettu seoksella 80 % TFA:ta 0,1 % vedessä ja 20 % TFA:ta 0,08 % asetonitriilissä. Pylvästä 1 , 1 I' eluoidaan lineaarisella gradientilla 40 minuutin ajan alkaen : 25 injektiolla tasapaino-oloissa ja päättyen seokseen 60 % 4 * .

: TFA:ta 0,1 % vedessä ja 40 % TFA:ta 0,08 % asetonitriilissä * * ·.· [ virtausnopeudella 1 ml/min. Eluaatin absorbanssi 216 nm:ssa i'"'. tutkitaan. TGF-p2 eluoituu retentioajalla 32,7 minuuttia ja ,. se kerätään käsin. SDS-PAGE-analyysi ei-pelkistävissä olosuh- a 30 teissä ilmaisi yhden terävän vyöhykkeen, jonka näennäinen .L molekyylipaino on noin 25 kD. Saatu dimeerinen TGF-p2 on i' ,···. hyvin puhdas.

« « .

J. Vaihtoehtoinen menetelmä I dimeerisen, biologi- Ή sesti aktiivisen TGF-p2:n tuottamiseksi

- · « I

:,,35 Monomeerinen TGF-p2 esimerkistä 4.B liuotetaan : .·. konsentraatioon 0,1 mg/ml 50 mM natriumfosfaattiin, pH 8,0, r~ ,···, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, 2,5 mM kysteiini, 1 mM kystiini ja 50 l-ι t f 41 103278

mM Chaps (Calbiochem). 300 tunnin jälkeen 4°C:ssa pH

säädetään pH 2,5 reen 10 % TFA:lla. Sitten lisätään 30 mg/ml Sepralyte C-l (preparatiivinen taso, 40 pm, Analytichem International, Harbor City, CA, USA), esikäsitelty vuoronpe-5 rään 0,1 % TFA:lla asetonitriilissä ja 0,1 % TFA:lla vedessä, ja seosta sekoitetaan kevyesti 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Geeli suodatetaan lasisintterillä, joka on peitetty uudella etukäteen pestyllä Sepralyte C-l:llä (20 % määrästä, joka on lisätty uudelleenlaskostusliuokseen). Geeli pestään 10 ensin (5 kertaa geelin tilavuus) puskurilla A (0,2 M NaCl/0,1 % TFA/vesi), sitten seoksella 80 % puskuria A ja 20 % puskuria B (0,08 % TFA asetonitriilissä). TGF-p2 eluoidaan seoksella 70 % puskuria A ja 30 % puskuria B. Eluaatti laitetaan suoraan Mono S -pylvääseen HR 5/5 (Pharmacia). TGF-15 β2:n puhdistaminen ja eristäminen tehdään, kuten esimerkeissä 4.H ja vastaavasti 4.1.

Vaihtoehtoisesti asetonitriili puskurissa A ja vastaavasti puskurissa B, jota on käytetty Sepralyte C-l -geelin pesuun ja TGF-p2:n eluutioon, korvataan isopro-20 panolilla. Pesu suoritetaan sitten seoksella 90 % puskuria A ja 10 % puskuria B, ja TGF-p2:n eluutio suoritetaan vaiheittaisella gradientilla (vaiheet 2 % puskuria B) alkaen seoksesta 80 % puskuria A ja 20 % puskuria B ja päättyen seokseen 70 % puskuria A ja 30 % puskuria B. Menettelytapa : 25 edelleen on kuten esimerkeissä 4.H ja vastaavasti 4.1.

:T: K. Vaihtoehtoinen menetelmä II dimeerisen, biologi- • ·'' sesti aktiivisen TGF-p2:n tuottamiseksi .·* . Monomeerinen TGF-p2 esimerkistä 4.B liuotetaan .··. konsentraatioon 0,5 mg/ml 100 mM TRIS/HC1, pH 8,5, IM NaCl, • · t *30 5 mM EDTA, 1 mM pelkistetty glutationi, 1 mM hapetettu glutationi ja 50 mM Chaps (Calbiochem). 450 tunnin jälkeen 4°C:ssa seos säädetään pH 4, Oraan etikkahapolla, laimennetaan W 0 t ' 7 tilavuuden lisäyksellä 20 mM natriumasetaattia, pH 4,0 ja : pumpataan Mono S -pylvääseen HR 5/5 (Pharmacia). Menettelyta- • < < pa edelleen on kuten esimerkeissä 4.H ja vastaavasti 4.1.

* « I

, L. Vaihtoehtoinen menetelmä III dimeerisen, biolo- f « < gisesti aktiivisen TGF-p2:n tuottamiseksi käyttämällä • · 42 103278 tioredoksiinia disulfidien muodostumista edistävänä aineena

Monomeerinen TGF-p2 esimerkistä 4.B liuotetaan konsentraatiossa 0,025 mg/ml 100 mM TRXS/HCl:oon, pH 8,0, 50 mM Chaps, 0,05 mg/ml tioredoksiini. Seosta inkuboidaan 5 4°C:ssa 24 tuntia. Kuten solujen liike- ja kasvuanalyysillä määritetään (esimerkki 5.A), uudelleen laskostuneen, dimeerisen, aktiivisen TGF-p2:n saanto on sama kuin esimerkissä 4.G kuvatulla menetelmällä. Dimeerisen TGF-p2:n puhdistus ja eristäminen tehdään, kuten esimerkeissä 4.H ja 10 vastaavasti 4.1. TGF-p2 eristetään tioredoksiinista Mono S - pylväällä esimerkin 4.H mukaisesti.

M. S-sulfonoidun TGF-p2:n valmistus ja sen käyttö dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p2:n tuottamisessa

Monomeerinen TGF-p2 esimerkistä 4.B liuotetaan huoneen 15 lämpötilassa liuokseen, joka sisältää 6 M ureaa, 100 mM

TRIS/HCl, pH 8,0, 50 mM natriumsulfIittiä ja 0,2 mM kyste-iiniä. S-sulfonoidun TGF-p2:n muodostusta seurataan RP-HPLC:llä käyttäen olosuhteita, jotka on kuvattu esimerkissä 4-D. S-sulfonoidun TGF-p2:n retentioaika on 31,8 minuuttia. 20 Kun reaktio on täydellinen, liuoksen pH säädetään pH 2,0:an 1 N HCl:la. S-sulfonoidusta TGF-p2:sta poistetaan suola FPLC:llä, "Fast desalting column" HR 10/10 (Pharmacia) 10 mM HCl:ssa. S-sulfonoidun TGF-p2:n uudelleenlaskostus, jotta : saadaan dimeerinen, aktiivinen TGF-p2, tehdään oleellisesti * 25 esimerkin 4.G menettelytavan mukaisesti.

N. Väärin laskostuneen TGF-p2:n resyklisaatio : ,·. Kiinteää guanidiinihydrokloridia ja DTT:a lisätään « I ' ”'<t materiaaliin, joka ei ole sitoutunut esimerkin 4.H Mono S - J · · -i IX pylvääseen, jotta saadaan konsentraatio 6 M ja vastaavasti j · · < •30 5 mM, ja pH säädetään ph 8,0:aan kiinteällä Tris:lla. Yhden tunnin kuluttua huoneenlämmössä, seos saatetaan RP-HPLC:aan * ' käyttäen samaa pylvästä ja liuotinsysteemiä kuin esimerkissä * * * : 4.D. Pelkistetty monomeerinen TGF-p2 kerätään, ja asetonit- . riili poistetaan tyhjiössä. Tämä valmiste saatetaan sitten ,-35 esimerkin 4.G mukaiseen uudelleen laskostumismenettelyyn, .1 tr t «11 joko suoraan tai yhdessä juuri eristetyn monomeerisen TGF- ' ' ·' β2:η kanssa esimerkistä 4.B tai 4.C, siten lisäten uudelleen 1. 1 < 1 1 » 43 103278 laskostuneen, aktiivisen, dimeerisen TGF-p2:n kokonaissaantoa.

O. Heterodimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p:n tuottaminen 5 Heterodimeeriset TGF-p:t, jotka muodostuvat kahdesta erilaisesta disulfidisilloin sidotusta 112 aminohapon polypeptidiketjusta, voidaan valmistaa saattamalla ekvimo-laariset määrät kahta vastaavaa monomeeriä uudelleenlas-kostumisolosuhteisiin, kuten esimerkissä 4.G on kuvattu.

10 Dimeerien puhdistus ja eristys suoritetaan esimerkkien 4.H

ja 4.1 mukaisesti antaen heterodimeerisen muodon erota homodimeereistä.

P. Monomeerisen TGF-βΙιη, TGF-p2:n ja vastaavasti TGF-β3:η peptidikartoitus ja sekvenssin määritys 15 TGF-p2: 92 pg (6,7 nmoolia) S-pyridyylietyloitua rekom-binantti-TGF-p2:ta, kuvattu esimerkissä 4. F kuivataan vakuumisentrifugissa ja liuotetaan uudelleen 200 pl:aan 5 mM HCl:a. Lisätään 200 μΐ 0,2 M Tris-asetaattipuskuria, pH 7,8, 20 joka sisältää 10 mM Zwittergent 3-12 -detergenttiä (Calbioc- hem Corporation, La Jolla, Kalifornia), ja sekoitetaan proteiiniliuoksen kanssa. Pilkkominen tehdään 2 pg:lla (liuotettu 50 pl:aan vettä) endoproteinaasi Asp-N:ää (Pseudomonas fragi -mutantista, sequence grade, Boehringer : 23 Mannheim Biochemica, FRG) 37°C:ssa. 13 tunnin kuluttua lisätään 50 μΐ 10 % (v/v) TFA, ja seos erotellaan RP-HPLC:llä • : C4-kapean sisäläpimitan pylväässä (Vydac 214TP52, 2,1x250 mm) M1 c« lineaarisella gradientilla 5-40 % (v/v) asetonitriiliä 0,1 • « % TFA/vedessä 35 minuuttia, virtausnopeudella 0,1 ml/min ja 9 · € ’30 UV-detektoidaan 216 nm:ssa. Kerätyt piikit analysoidaan plasmadesorptiomassa-spektroskopialla, kuten esimerkissä 4.S kuvataan.

f · · V ’ Protonoidussa muodossa (M+H’) olevien peptidien ; määritettyjen molekyylipainojen vertailu laskettujen « 4 · .35 molekyylimassojen kanssa antaa seuraavat tuntomerkit: 4 · t 4 1 44 103278

Fetentioaika M+H+ Laskettu Peptidisekvenssi (min) (D) massa M (D)

16.1 566.1 564.6 DFKR

23.9 1832.3 1831.1 NTINPEASASPCCVSQ

25.9 1292.5 1291.5 DAAYCFRNVQ

29.0 1307.7 1306.6 DNCCLRPLY

31.2 1320.0 1318.5 DTQHSRVLSLY

32.1 1421.1 1419.7 DNCCLRPLYI

10

33.0 3132.3 3131.5 DTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQ

36.9 3425.3 3424.9 DLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYL

WSS

44.5 3739.5 3739.5 DLEPLTTLYYIGKTPKIEQLSNMIVKSC

KCS

15 TGF-βΙ: . 32 pg (2,5 nmoolia) S-pyridyylietyloitua rekom- binantti-TGF-βΙ:tä (valmistettu samalla tavoin kuin S-pyridyylietyloitu Γekombinantti-TGF-β2) pilkotaan 1,5 pg:lla 20 endoproteinaasi Lys-C:tä käyttäen samaa menettelytapaa kuin TGF-^2:n pilkkomiseen, paitsi että inkubaatioaika on 9 tuntia ja että käytetään 12-27 % asetonitriilin lineaarista ~ gradienttia 90 minuuttia C18-pylväässä (Vydac 218TP5205, 2,1 i : x 50 mm).

• 25 ·*·*· Fetentioaika M+H+ Laskettu Peptidisekvenssi Ϊ .·, (min) (D) massa M (D) • · «

!"·! 9.4 810.6 808.9 WIHEPK

— · ·

;·|·. 13.2 619.2 617.7 DLGWK

; ’ 30 20.4 1584.6 1583.7 ALDTNYCFSSTEK

34.9 1613.3 1611.9 VEQLSNMIVRSCK

50.6 1869.8 1868.3 NCCVRQLYEDFRK

P !·: ' 79.8 2875.2 2874.3 GYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSK

j: : f; 87.1 4189.1 4189.0 VLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPL

I: :"‘?5 PIVYYVGRKPK

i: . \ 89.8 3965.0 3963.7 VLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPL

N PIVYYVGRK

l— · · ------ i I · 45 103278 TGF-p3: 20 pg (1,46 nmoolia) S-pyridyylietyloitua rekom-binantti-TGF-p3:a (valmistettu samoin kuin S-pyridyylietoksy-loitu rekombinantti TGF-p2) pilkotaan 0,4 pg:lla endopro-5 teinaasi Asp-N:ää, kuten on kuvattu TGF-p2:lle, paitsi että inkubaatioaika on 22,5 tuntia ja erottelu toteutetaan C18 -pylväässä (Vydac 218TP5205, 2,1 x 50 mm) asetonitriilin lineaarisella gradientilla 16-32 %, 80 minuutissa.

10

Retentioaika M+H Laskettu Peptidisekvenssi (min) (D) massa M (D)

15 7.0 1308.0 1306.6 ENCCVRPLY

3.8 1381.0 1379.5 DTNYCFRNLE

Π.6 1205.5 1206.3 DTTHSTVLGLY

1252.4 1250.4 DTNYCFRNL

19.4 1421.5 1421.5 DTTHSTVLGLYNT

9 n

1551.2 1551.9 DLEPLTILYYVGR

36.5 3030.4 3029.4 DTTHSTVLGLYNTLNPEASASPC

CVPQ

39.? 2782.6 2781.2 DTNYCFRNLEENCCVRPLYI

45.6 3457.3 3456.0 DLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYL

.'25

·.' RSA

I.:*: 77.9 3726.5 3725.5 DLEPLTTLY Y VGRTPK VEQLS NM V

VKSCKCS

• · ·

:*·*: 82.6 6736.9 6736.9 DTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCC

VPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQL

...¾0 S NM V VKSCKCS

· * · « • · · » · I I I « · « 35 I « « < « « 46 103278 O. Saccharomvces cerevisiaessa ilmennetynmonomeerisen TGF-p2:n rakenteen karakterisointi Näyte materiaalista esimerkistä 4.C puhdistetaan edelleen RP-HPLC:llä, kuten esimerkissä 4.D on kuvattu, ja 5 N.terminaalinen aminohapposekvenssi määritetään, kuten esimerkissä 4.F on kuvattu.

Aminohapposekvenssi on: 5 10 15

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-X-Phe-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-X-10 20 25 X-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-Lys-Arg-Asp-Leu-Gly jossa X kuvaa aminohappoa, jota ei ole varmuudella määritetty.

15 R. Saccharomyces cerevisiaessa ilmennetynmonomeerisen TGF-p2:n uudelleenlaskostus ja dimeerisen TGF-p2:n eristys 1 ja karakterisointi

Saccharomvces cerevisiaessa ilmennetyn monomeerisen TGF-p2:n uudelleenlaskostus ja dimeerisen, biologisesti -r 20 aktiivisen TGF-p2:n eristys tehdään, kuten esimerkeissä 4.G

ja vastaavasti 4.1 on kuvattu.

S. Dimeerisen TGF-p2:n molekyylipaino i : 6 pg:n määrä monomeeristä TGF-p2:ta ja 20 pg dimee- ; I ristä, biologisesti aktiivista TGF-p2:ta, saatu esimerkeissä ,'25 4.D ja vastaavasti 4.1, liuotetaan 25 % etikkahappoon, • .·. adsorboidaan nitroselluloosaan ja analysoidaan BIO I0N 20 • · · ..Li jll.' Plasma Desorption Mass Spectrometrillä (Applied Biosystems, — Uppsala, Ruotsi). Määritetyt molekyylimassat ovat zl~i · · · : ig *·’ M=12'738,0 monomeeriselle TGF-p2:lle (laskettu massa -is 30 M=12'719,7 ) is t * * M=25'422,0 dimeeriselle TGF-p2:lle (laskettu massa · M=25'421,2, olettaen että kaikki kysteiinit ovat disulfideja) - ίϋ . .·. T. Dimeerisen TGF-p3:n molekyylimassa * i t r • · · .··. Dimeerinen, biologisesti aktiivinen TGF-p3 valmis- 'i35 tetaan samoin kuin TGF-p2, kuvattu esimerkeissä 4.A, 4.B, i : 4.G, 4.H ja 4.1. Dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF- β3:η molekyylimassa määritetään, kuten esimerkissä 4.S on 47 103278 kuvattu. Havaittu molekyylimassa on : M=25'434,0 (laskettu massa M=25'427,2, edellyttäen, että kaikki kysteiinit ovat disulfideja) 5 Esimerkki 5: TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n aktii- visuustesti in vitro A. Solujen vaellus- ja kasvumääritys Määritys perustuu TGF-p:n kemotaktiseen aktiivisuu-10 teen fibroblasteille (Postlethwaite, A.E. et ai. (1987) J.

Exp. Med. 165, 251) ja se toteutetaan kuten Burk, R. on kuvannut (1973) PNAS 70, 369.

TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n solujen liikettä edistävä aktiivisuus analysoidaan määrittämällä niiden 15 normaalien Balb/c 3T3 -fibroblastien määrä, jotka kulkevat 22 tunnin kasvatusajan kuluessa mainittujen solujen haavoitettuun yksikerrosviljelmään seerumittomassa alustassa (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco), joka sisältää TGF-pi:tä, TGF-p2:ta tai vastaavasti TGF-p:a, verrattuna niiden 20 fibroblastien määrään, jotka kulkevat haavoitettuun yksiker- rosviljelmään TGF-p:n puuttuessa.

TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-p3:n kasvua edistävä vaikutus määritetään stimuloivana vaikutuksena solujen DNA-:: synteesille ja solunjakautumiselle. Tämä aktiivisuus on ;'£5 ilmeinen mainituissa yksikerrosviljelmissä, joita tarkkail- j laan valomikroskoopissa 44 tunnin kasvatusajan jälkeen, ja f »i « .···, se ilmaistaan määrällisenä joko ,·;·. (a) laskemalla solujen tumien määrä missä tahansa näköken- • · · tässä, mainittujen seerumittomalla alustalla kasvatettujen 3Q solujen viljelmistä, jotka sisältävät TGF-pi:tä, TGF-p2:ta |f>' tai vastaavasti TGF-p3:a, verrattuna solujen tumien määrään, • · · *·* ’ joka on laskettu mistä tahansa näkökentästä viljelmistä, ; jotka ovat kasvaneet TGF-p:n puuttuessa, tai (b) määrittämällä radioaktiivisesta leimatun 3H-tymidiinin , 3,5 oton määrä mainittujen solujen viljelmistä, jotka on « i < ;j kasvatettu seerumittomalla alustalla, joka sisältää TGF-

I

*···’ piitä, TGF-p2:ta tai vastaavasti TGF-p3:a, verrattuna 3H- 48 103278 tymidiinin oton määrään viljelmissä, jotka on kasvatettu TGF-β:η puuttuessa.

Näissä annosvastekokeissa, täysin puhdistettujen TGF-βΐ-, TGF-p2- ja TGF-p3-proteiinien (katso esimerkki 4.K) 5 konsentraatiot alueella 0,1-1000 pg per millilitra viljely- alustaa, ovat riittäviä saamaan esiin 50 % maksimimigraatios-ta ja kasvua edistävästä vasteesta.

B. Solujen kasvun inhibitioanalyysi

Kolorimetrinen analyysi perustuu TGF-βιη inhiboivaan 10 vaikutukseen ihmisen A 375 -melanoomasolujen kasvulle (Brown, T.J. et ai. (1987) J. Immunol. 139, 2977). TGF-βϋ-, TGF-p2-ja TGF-p3-näytteistä tehdään laimennussarja (1:3) tasapohjaisiin 96 kaivon kudosviljelmämaljoihin (Falcon), jotka sisältävät RPMI-1640 -alustaa (Gibco) ja 5 % vasikansikiösee-15 rumia. Kontrollikaivoihin laitetaan pelkkää alustaa. 1,5 x ^ 104 A375-melanomasolua lisätään jokaiseen kaivoon. 72 tunnin inkubaatioajan jälkeen 37°C:ssa 5 % C02:ssa, yhdessä kerroksessa olevat A375-solut pestään kerran, fiksoidaan ja -j värjätään kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Sitoutumaton ] 20 väri pestään pois huolella. Värjätyt solut lyysataan 33 % j etikkahapolla värin vapauttamiseksi (väri on rajottuneena solujen tumiin) ja mitataan OD 590 nm:ssä multiskan-8 Channel j Photometerillä, joka on varustettu Olivetti M 24 PCrllä tes- •t , f : tiyhdisteiden aktiivisuuden laskemiseksi. Koska värjäyksen ; .25 intensiivisyys on jokaisessa kaivossa suoraan verrannollinen i- · tumien määrään (ja siten solujen määrään), tämä tekniikka I · · · · i .*··, tarjoaa kolorimetrisen analyysin TGF-βΙ-, TGF^2- ja TGF^3- • « · .·;* molekyylien antiproliferatiivisten vaikutusten määrittämisek- 1 V! Bi.

3P Käsittely puhdistetulla TGF-βΙ: llä, TGF^2:11a ja TGF- ««««« β3:1ΐ3 konsentraatioalueella 0,001-10 nM inhiboi A375 - • · · *·[ ’ melanoomasolujen kasvua.

Esimerkki 6: In vivo aktiivisuustestit uudelleen . '35 laskostuneille TGF-pi:lle, TGF-p2:lle ja TGF-p3:lle x; ’’ A. Osittain paksuuntuneiden haavojen parantuminen 49 103278 vanhoilla hiirillä

On havaittu, että haavojen paranemisprosessit heikkenevät iän myötä (Grove, G.L. (1982) Arch. Dermatol. Res. 272: 381) ja ne aiheuttavat siksi suuria ongelmia 5 geriatrisen lääketieteen kentälle. Sen tähden tutkitaan uudelleen laskostuneiden, aktiivisten dimeeristen TGF^:jen biologiset vaikutukset in vivo osittain paksuuntuneiden haavojen (toisen asteen palovammojen muodostamia) parantumiseen osittain puutteellisissa tai heikentyneissä haavojen 10 paranemistilanteissa, nimittäin vanhoilla eläimillä, käyttäen seuraavaa menettelytapaa, joka on samanlainen, kuin Schultz, G.S.et ai.(1987) Science 235:350 ovat kuvanneet.

Yksittäisiä keski-ihon lämpövaurioita tehdään selän puoleiseen rintakehään nukutetuille vanhoille C57/BL6-15 hiirille (450 päivän ikäisiä tai vanhempia), joiden selät on aikaisemmin ajeltu, ja joista on poistettu karvat kaupallisella voidemaisella karvanpoistajalla, yhdellä 10 sekunnin käsittelyllä messinkimallineella (lxl cm, 8 g), joka on tasapainotettu 80°C:seen vesihauteessa. Käsittelyä seuraava 20 rakkula poistetaan kirurgisesti ja palovammoja hoidetaan

päivittäin, 5 päivän ajan, paikallisella 25 μΐ sivelyllä steriiliä kantajapuskuriliuosta (joka sisältää 0,8 % w/v : hydroksipropyyliselluloosaa liuoksessa, jossa on 10 mM

histidiiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), ja joka sisältää eri ;25 määriä (500 ng, 100 ng tai 10 ng) uudelleen laskostunutta, : aktiivista dimeeristä TGF-8~muotoa, tai ainoastaan pusku- • · · · .···, riliuosta, tai ei lainkaan käsittelyä. Kaikki paikallisesti annostellut materiaalit ovat steriilejä, endotoksiini- ja • · · pyrogeenivapaita, ja kaikki hiiret ovat suljettuina yksin 30 häkkeihin kokeen aikana. Jokainen koeryhmä käsittää 5 eläintä.

• · · ' Viiden päivän TGF-p-käsittelyn jälkeen hiiret : nukutetaan, rakkulat (jos niitä on) poistetaan kirurgisesti • « · palovammoista ja vammat valokuvataan. Palovammojen alueet, 35 jotka ovat regeneroineet epiteeliä, hahmotellaan vakiopak- ;· suiselle läpinäkyvälle piirtoheitinkalvolle ja jokaisen ’«·* alkuperäisen palovamman parantuneen alueen prosenttiosuus 50 103278 lasketaan planimetrialla. Tuloksia verrataan myös epiteelin regeneraatioprosessiin nuorilla (56-84 päivää vanhoilla) C57/BL6-hiirillä, joilla on samanlaiset keski-ihon palovammat, jotka on jätetty hoitamatta kokeen ajaksi.

5 Esimerkki tällaisesta kokeesta, jossa on käytetty uudelleen laskostunutta, dimeeristä, aktiivista TGF-p2:ta, on esitetty seuraavassa taulukossa, jossa esitetyt arvot edustavat ryhmien arvioiden keskiarvoja ja vaihteluvälejä.

10 • · » · · • · · • · · · • · · * · • · r M» « · · • · 9 4- · »· · · · • * • · « « « • · · « I - ( « I • % ·

• I

“li 51 103278

Ryhmä Eläimet TGF-p2-annos %-osuus alkuperäises- per haava (ng) tä paloalueesta parantunut päivänä 6 5 1 vanhoja 500 59±8 2 vanhoja 100 55±6 3 vanhoja 10 46±7 4 vanhoja vain puskuri 10±9 5 vanhoja ei käsittelyä 16±6 10 6 nuoria ei käsittelyä 66±9

Tulokset edellä olevassa taulukossa esitetyistä pinta- ala-analyyseistä osoittavat, että uudelleen laskostuneen, aktiivisen, dimeerisen TGF-p2:n paikallinen käyttö päivittäin 15 5 päivän ajan sopivassa kantajapuskurissa, stimuloi ja nopeuttaa epiteelin regeneraatiota osittain paksuuntuneissa palovammoissa vanhoilla hiirillä, annoksesta riippuvalla tavalla (ryhmät 4 ja vastaavasti 5). Nuoret hiiret ovat ilmeisesti kyllin kykeneviä kasvattamaan menestyksellä uuden 20 epiteelisolukon haavoihinsa ilman mitään paikallisesti annettavaa TGF-p:a (ryhmä 6). Histologiset analyysit osoittavat lisääntyneen epiteelin muodostusprosessin määrän yhdessä regeneroituneen epidermiksen hyperkeratoosin kanssa 6. päivänä TGF-p.*lla käsitellyissä haavoissa.

25 B. Täysin paksuuntuneiden haavojen parantuminen : .·. aikuisilla rotilla « · * « « · · ,··· Uudelleenlaskostuneiden, aktiivisten, dimeeristen TGF- • · p:jen biologiset vaikutukset tutkitaan myös toisella haavan « · ' ' parntumismallilla in vivo, nimittäin täysin paksuuntuneiden 3Q haavojen (kirurgisella leikkauksella tehdyt) parantumisella aikuisissa rotissa, käyttäen seuraavaa menettelytapaa, joka • · · • · · *.* * on samanlainen, kuin Mustoe, T.A. et ai. (1987) Science ; 237:1333 ovat kuvanneet.

Yksittäiset, täysin syvät 5 cm pitkät lineaariset 35 viillot tehdään kirurginsaksilla 1,5 cm kummallekin puolelle ·· selän puoleista keskilinjaa pentobarbitöni 11a nukutetuille koiraspuolisille Wistar-rotille (300-350 g), joiden selät on 10327« 52 aikaisemmin ajeltu ja joista on poistettu karvat kaupallisella voidemaisella karvanpoistajalla. Koeryhmissä vasemmanpuoleisten viiltojen (katsottuna selkäpuoli ylöspäin) reunat saavat yhden paikallisen käsittelyn (100 μΐ) steriiliä 5 kantajapuskuria (joka sisältää 0,8 % w/v hydroksipropyylisel- luloosaa liuoksessa, jossa on 10 mM histidiiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), joka sisältää eri määriä (2 pg, 1 pg, 0,1 pg tai 0,01 pg) uudelleen laskostunutta, aktiivista dimeeristä TGF-β-muotoa. Ruumiin vastakkaisella puolella olevien oikeanpuo-10 leisten viiltojen reunat saavat vastaavan suuruiset määrät kontrolliplaseboa (naudan seerumin albumiinia) mainitussa kantajapuskurissa, ja kontrollieläinten haavojen reunat saavat ainoastaan kantajapuskuria vasemmanpuoleisiin viiltoihin, eivätkä käsittelyä lainkaan oikeanpuoleisiin 15 viiltoihin, kirurgisten viiltojen jälkeen. Kaikki paikal lisesti annetut materiaalit ovat steriilejä, endotoksiini-ja pyrogeenivapaita. Jokaisen haavan reunat liitetään yhteen viidellä, tasavälisellä, horisontaalisella patja-katko-ompeleella, 5-0 Ethilonia. Kaikki eläimet ovat erillisissä 20 häkeissä ja haavojen annetaan parantua eri ajanjaksot aina 21 päivään saakka käsittelyn jälkeen. Kun rotat on tapettu, koko selän nahka poistetaan jokaiselta eläimeltä, ja kaikki ihonalainen rasva poistetaan huolellisesti jokaisen nahan alapinnalta käyttäen kirurginveistä. Mallinetta, joka koostuu . 25 kahdesta samansuuntaisesta kirurgisesta terästä (8 mm : välimatka terien välillä), käytetään sitten leikkaamaan * · # t··· viiltoja ihosta (ompeleiden välistä jokaisessa viillossa) • « vetolujuusmäärityksiä varten. Jokaisen viillon yhdestä päästä » » » * otetaan näytteet histologista analyysiä varten. Kunkin 30 irrotetun nahkanäytteen kestämä maksimikuormitus määritetään

Universal Tensile Strength Machine -laitteella, malli 144501 • « · V : (Zwick, Ulm, Saksa). Määritykset tehdään 30 mm x 8 mm 9 . suikaleista, jotka kiinnitetään hydraulisten pidinten väliin .··, ja venytetään repeämispisteeseen nopeudella 10 mm per 35 minuutti, maksimikuormitus rekisteröidään graafiselle M ' piirturille. Määritykset tehdään kolmelle näytteelle jokaisesta haavasta ja koeryhmät käsittävät 4 eläintä.

53 103278

Repeämisvoimakkuutta ei mitata haavoista, jotka osoittavat merkkejä infektiosta tai voimakkaasta verenvuodosta (vähemmän kuin 3 % kaikista haavoista).

Esimerkki tällaisesta kokeesta, jossa käytetään 5 uudelleen laskostunutta, dimeeristä aktiivista TGF-p2:ta, on esitetty seuraavassa taulukossa, jossa esitetyt arvot edustavat vetolujuuksien keskimääräisiä suhteita TGF-p2:lla käsitellyissä haavoissa ja plasebolla käsitellyissä haavoissa kolmena samanaikaisena ajankohtana 21 päivän ajanjaksona.

10

Ryhmä TGF-p2-annos per Vetolujuuden suhde viilto (pg) TGF-p2:plasebokäsittely päivä 7 päivä 14 päivä 21 1 2,00 1,9:1 1,7:1 1,4:1 15 2 1,00 1,8:1 1,4:1 1,3:1 3 0,10 1,4:1 1,3:1 1,2:1 4 0,01 1,2:1 1,1:1 1,0:1 5 ei* 1,0:1 1,0:1 1,0:1 (* suhde: vain kantajapuskuri versus ei käsittelyä) 20

Edellä olevassa taulukossa esitetyt tulokset veto-lujuusmääritykeistä osoittavat, että yksi paikallinen käsittely uudelleen laskostuneella, aktiivisella dimeerisellä TGF-β: 11a sopivassa kantajapuskurissa edistää repeämislujuut-; 25 ta kaksinkertaiseksi ja nopeuttaa parantumista täysin syvissä : .·. viiltohaavoissa aikuisilla rotilla annoksesta riippuvalla • · · i .··, tavalla 21 päivän ajanjaksolla (ryhmät 1-4) verrattuna • i

Ij* kontrolliryhmään (ryhmä 5). Histologiset analyysit osoittavat • · huomattavaa mononukleaaristen solujen, fibroblastien ja 30 kollageenin tuotannon lisääntymistä TGF-β:11a käsitellyissä soluissa 21 päivän ajanjaksona verrattuna kontrollihaavoihin.

« · · ' Tilapäinen hyperkeratoosi on myös ilmeinen TGF-β:11a : käsitellyissä haavoissa aina 14 päivään käsittelyn jälkeen.

f i * C. Haavakammiosiirrännäismalli aikuisissa rotissa £55 Uudelleen laskostuneiden, aktiivisten dimeeristen TGF- ··' · p:jen biologisia vaikutuksia tutkitaan myös kolmannella « · haavan parantumisen mallilla in vivo. nimittäin solujen 54 103278 sisäänkasvulla, verisuonten muodostuksella ja sidekudoksisen granulaatiokudoksen muodostuksella huokoisten kammiosiirrän-näisten sisällä ja ympärillä aikuisissa rotissa, perustuen samanlaiseen menettelytapaan, jonka ovat kuvanneet Sporn, 5 M.B. et ai- (1983) Science 219:1329.

Tyhjät kovat polytetrafluorietyleeniputket (sisä- ja ulkoläpimitat 10 ja vastaavasti 12 mm; pituus 32 mm), jokainen rei'itetty noin 250:llä säännöllisesti sijoitetulla rei'ällä (läpimitta 1 mm) ja suljettu kummastakin päästä 10 samaa materiaalia olevalla poistettavalla korkilla, kaasu- steriloidaan ja asetetaan kirurgisesti ihon alle, symmetrisellä tavalla, pienistä viilloista selän puoleisiin kylkiin pentobarbitonilla nukutettuihin aikuisiin Wistar-rottiin (350-400 g). Yksi kaasusteriloitu kudoskammio siirrostetaan 15 jokaiseen kylkeen ja viillot suljetaan yhdellä kirurgisella nipistimellä (Clay-Adams Auto-Clips, 9 mm), jotka poistetaan 5. päivänä leikkauksen jälkeen. Kirurgisen siirrostuksen jälkeen kammiot koteloituvat säikeisellä sidekudoksella, vaikka kammioista itsestään vastaavasti puuttuvat solut. Tämä 20 malli tarjoaa steriilin, määritetyn ja suljetun tilan joka kammion sisällä, jossa haavan parantumisvasteen eri parametrit voidaan määrittää. Eläimet käytetään tutkimukseen 14 päivää kammioiden siirrostuksen jälkeen, kun kirurginen ; viilto on täysin parantunut.

25 Tänä aikana päivittäiset 100 μΐ injektiot steriiliä J .·, kantajapuskuriliuosta (joka koostuu 0,5 % w/v hydroksipro- .·· pyyliselluloosasta liuoksessa, joka sisältää 10 mM histi- • · diiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), jossa on eri määrät (1 pg, 0,1 * * pg tai 0,01 pg) uudelleenlaskostumitta, aktiivista dimeeristä 30 TGF-p-muotoa, annetaan suoraan vasemman puolen kammioihin • · * · · (katsottuna selkäpuoli ylöspäin). Oikean puolen kammiot « « · *.* * saavat vastaavan suuruisen määrän kontrolliplaseboa (naudan * l·. ; seerumin albumiini) mainitussa kantajapuskurissa. Kontrol- 12 Ml , lieläimet saavat ainoastaan kantajapuskuria vasemmanpuolisiin u t 35 kammioihin, kun taas oikeanpuoliset kammiot jäävät käsittele- '* = »il 1Ξ < mättä kokeen ajan. Koeryhmissä on 5 eläintä. Injektiot tehdään kerran päivässä 5 päivän ajan ja kaikki injektoitavat 55 103278 materiaalit ovat steriilejä, endotoksiini- ja pyrogeenivapai-ta. Kaikki eläimet ovat erillisissä häkeissä kokeen ajan ja ne tapetaan 24 tuntia viimeisen injektiosarjän jälkeen. Kammiot poistetaan sitten jokaisesta eläimestä aseptisella 5 menettelyllä ja sidekudos jokaisen kammion sisäpuolella "märkä"-punnitaan. Seerumin proteiinin kokonaismäärä kammion nesteessä arvioidaan käyttämällä Lowryn et ai. (1951) J. Biol. Chem. 193:265 menetelmää. Kunkin kammion sisä- ja ulkopuolelta poistetut sidekudosnäytteet valmistellaan 10 histologista analyysiä varten. Kammion sisällön steriiliys tarkistetaan inkuboimalla kammionestenäytteitä aivo/sydän -infuusiomaljoilla 72 tuntia 37°C:ssa. Määrityksiä ei tehdä kammioista, jotka osoittavat merkkejä infektiosta tai hylkimisestä (vähemmän kuin 3 % kaikista kammioista).

15 Esimerkki tällaisesta kokeesta, jossa käytetään uudelleen laskostunutta, dimeeristä aktiivista TGF-p2:ta, esitetään seuraavassa taulukossa, jossa esitetyt arvot edustavat määritysten keskiarvoja, jotka on saatu proteiinille 5. toisiaan vastaavasta kammioparista (vasen v oikea) 20 jokaisesta eläinryhmästä.

Ryhmä TGF-p2 -annos per proteiinisuhde vastaavissa vasen kammio (pg) kammioissa (vasenroikea) sidekudos seerumin proteiini ,25 1 1,00 3,0:1 1,5:1 2 0,10 2,5:1 1,4:1 • · t .'···' 3 0,01 2,1:1 1,3:1 4 ei* 1,0:1 1,0:1 ' * suhde: ainoastaan kantajapuskuri v ei käsittelyä 30 ' ' Edellä olevassa taulukossa esitetyt tulokset proteiinimää- • 11 V · rityksistä osoittavat, että uudelleen laskostuneen, aktii- f. visen dimeerisen TGF-p2:n paikallinen injektio päivittäin 5 päivän ajan sopivassa kantajapuskurissa edistää jopa 35 kolminkertaisesti sidekudoksen kokonaismäärän kertymistä,

I I I

:·! '· annoksesta riippuvalla tavalla, vasemmanpuoleisissa kammi- i t t oissa verrattuna oikeanpuoleisiin, ruumiin vastakkaisella bo 103278 puolella oleviin kammioihin, jotka olivat saaneet vastaavan suuruiset määrät plaseboproteiinia. Pieni annoksesta riippuva lisäys seerumin proteiinin määrässä vasemmanpuoleisissa kammioissa on myös havaittavissa monien TGF-p2-injektioiden 5 jälkeen (ryhmät 1-3). Eroa ei ole havaittavissa vasemmanpuo leisten ja oikeanpuoleisten kammioiden välillä kontrolliryhmässä (ryhmä 5).

Ryhmiin 1-3 kuuluvien eläinten post-mortem biopsiasta havaitaan johdonmukaisesti, että vasemmanpuoleiset TGF-p:lla 10 käsitellyt kammiot ovat lujemmin kiinnittyneet ruumiin- seinämän ympäröivään sidekudokseen, kuin ruumiin vastakkaisella puolella olevat oikeanpuoleiset kammiot, jotka ovat saaneet plaseboinjektioita. Edelleen, histologiset analyysit osoittavat, että TGF-p:lla käsiteltyjä kammioita ympäröivän 15 sidekudoksen paksuus ja verisuonitus ovat huomattavasti suuremmat kuin plasebolla käsiteltyjä kammioita ympäröivän kudoksen. Liikkuvien fibroblastien ja mononukleaaristen I solujen kerrostumat ovat myös selvät sidekudoksessa TGF-p:lla käsiteltyjen kammioiden sisällä. Kontrolliryhmässä (ryhmä 4) 20 ei ole havaittavissa näkyviä eroja kammioita ympäröivän sidekudoksen paksuudessa tai verisuonituksessa, ei liioin kammioiden kiinnittymisen asteessa ruumiinseinämän sidekudokseen. Nämä tulokset antavat olettaa, että TGF-p:n diffuusio kammioista on vastuussa havaituista eroista. :·;25 Tulehdussolujen steriili suodos, joka koostuu pääasiassa • « 4 makrofaageista, on havaittavissa TGF-p:lla käsiteltyjen • » j : kammioiden seeruminesteessä, kun taas plasebolla käsiteltyjen * * " kammioiden neste osoittaa polymorfonukleaaristen leukosyyt- I ; tien predominanssia. Kaikkien 40 kammion sisällön esimerkissä t 30 esitetyissä ryhmissä 1-4 havaitaan olevan steriili, kammioi- ....| den sisällöstä otettujen näytteiden inkubaation jälkeen T aivo/sydän-infuusiossa 72 tuntia 37°C:ssa.

• · ·

· I

T | | I

"! ·ιι — ( ( * * • · « « · ί · * • « « · · 11·· | « · 57 103278

Esimerkki 7: farmaseuttinen koostumus A. voide ainesosat: % (v/v) 5 sorbitaanimonostearaatti 2,0 polyoksietyleenisorbitaanimonostearaatti 3,0 setyylialkoholi 5,0 kevyt nestemäinen parafiini 8,0 isopropyylimyristaatti 2,0 10 aktiivinen aineosa, TGF-p:n kaltainen proteiini 1,0.10'5 propyleeniglykoli 2,0 glyseroli 2,0 15 deionisoitu vesi 76,0 säilöntäaineet ja muut stabilointiaineet q.s

Kuumennetaan vesifaasi 55-60°C:seen, liuotetaan aktiivinen aineosa siihen, ja dispergoidaan sulanut lipidifaasi siihen 20 voimakkaalla sekoituksella. Jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja homogenisoidaan.

Samalla menettelytavalla voidaan tuottaa voide, joka sisältää 0,01-20 pg/ml.

:,25 Tätä voidetta käytetään haavaan 100 μΐ/cm2.

« · « • · · • · · 5· Sälvd • · · r

Ainesosat: % (v/v) • * · sorbitaanitrioleaatti 5,0 « 30 vaha, mikrokiteinen 3,0 kevyt nestemäinen parafiini 9,0 isopropyylimyristaatti 10,0 t f w \ lanoliinialkoholeja 3,0 * · * « » * :35 aktiivinen ainesosa, ; '·, TGF-p:n kaltainen proteiini 1,0.10-5 '!!/ propyleeniglykoli 2,0 58 103278 glyseroli 2,0 magnesiumsulfaatti, vedellinen 0,7 deionisoitu vesi 65,3 säilöntäaineet q.s.

5

Aktiiviset ainesosat liuotetaan vesifaasiin varovasti lämmittäen, ja dispergoidaan liuos sulaneeseen lipidifaasiin. Jäähdytetään huoneenlämpötilaan ja homogenisoidaan.

10 Samalla tavalla voidaan tuottaa salva, joka sisältää 0,01- 20 pg/cm2. Tätä salvaa käytetään haavaan 100 pl/cm2.

C. Parenteraalinen liuos

Ainesosat: 15 aktiivinen ainesosa, TGF-p:n kaltainen proteiini 0,05 mg/ml ± ihmisen seerumin albumiini 1 mg/ml arginiini tai glysiini 20 mg/ml ± hiilihydraatti 5-20 mg/ml Ί 20 pH 7

Hiilihydraatti on glukoosi, mannoosi, dekstraani, hydrok-sietyylitärkkelys tai näiden seos.

: 25 ph säädetään fosfaatilla, sukkinaatilla, aminohapoilla tai I i : näiden seoksella.

« 1 : Lääkepullot, joissa on 0,05 mg TGF-p:n kaltaista prote- iinia/0,5 ml, valmistetaan ja lyofilisoidaan.

• « · « · r • · w • · · • · · · V • · • · · * 1 1 • · « « » f I · , , a T “ , , 59 103278

Mikro-organismien talletus

Seuraavat mikro-organismit talletettiin talletus-laitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), 5 Mascheroder Weg lb, D-3300, Braunschweig (Saksa):

Mikro-organismi talletuspäivä talletusnumero E. coli LC137/pPLMu.hTGF-βΐ 28.11.1989 DSM 5656 E. coli LC137/pPLMu.hTGF-β2 28.11.1989 DSM 5657 10 E. coli LC137/pPLMu.hTGF-β3 28.11.1989 DSM 5658

Saccharomvces cerevisiae RGF 18 4.3.1986 DSM 3665 • · · »

• · I

• · 1 l«1 • · · I » • · 9 I 1 I • · ·

• I

· « · · • · · »Il 60 103278 SEK.ID. No.1 sekvenssityyppi: nukleotidi ja vastaava polypeptidi sekvenssin pituus: 339 emäsparia juosteisuus: kaksijuosteinen 5 topologia: lineaarinen

lähde: ihmisen cDNA

välitön koelähde: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-pi (DSM 5656) ominaisuudet: 1-336 koodaava alue TGF-pi:lle GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG 39

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys 5 10 AAC TGC TGC GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG 78

Asn Cys Cys Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys 15 20 25 GAC CTC GGC TGG AAG TGG ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC 117 - Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr 30 35 ;3! CAT GCC AAC TTC TGC CTC GGG CCC TGC CCC TAC ATT TGG 15 6

His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp 40 45 50 AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG GTC CTG GCC CTG TAC 195

Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Vai Leu Ala Leu Tyr 55 60 65 j AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG CCG TGC TGC 234 ; Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys i . 70 75 « · · j : GTG CCG CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC TAC 27 3

Vai Pro Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Vai Tyr Tyr \..r 80 85 90 »«· « « · • · · • * GTG GGC CGC AAG CCC AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC AT G 312 . Vai Gly Arg Lys Pro Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met ·:*'* 95 100 • · · • · · • · · t . ATC GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC TGA 339 - 'h' Ile Vai Arg Ser Cys Lys Cys Ser X 105 110 • * ' ~ · · “TT · « · m 61 103278 SEK.ID. No.2 sekvenssityyppi: nukleotidi ja vastaava polypeptidi sekvenssin pituus: 339 emäsparia juosteisuus: kaksijuosteinen 5 topologia: lineaarinen

lähde: ihmisen cDNA

välitön koelähde: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p2 (DSM 5657) ominaisuudet: 1-336 koodaava alue TGF-p2:lle GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT 39

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp 5 10 AAT TGC TGC CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG 78

Asn Cys Cys Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg 15 20 25 GAT CTA GGG TGG AAA TGG ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC 117

Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr 30 35 AAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC CCG TAT TTA TGG 156

Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys Pro Tyr Leu Trp 40 45 50 AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG GTC CTG AGC TTA TAT 195

Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu Tyr . 55 60 65 X _ AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC 234 V * Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys : 70 75 « · · »tt * GTG TCC CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC 273 ··’ Vai Ser Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr V ; 80 85 90 ATT GGC AAA ACA CCC AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG 312 ···, Ile Gly Lys Thr Pro Lys Ile Glu Gin Leu Ser Asn Met V * 95 100 ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC TAA 339

Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser : X 105 110 62 103278 SEK.ID. No.3 sekvenssityyppi: nukleotidi ja vastaava polypeptidi sekvenssin pituus: 339 emäsparia juosteisuus: kaksijuosteinen 5 topologia: lineaarinen

lähde: ihmisen cDNA

välitön koelähde: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p3 (DSM 5658) ominaisuudet: 1-336 koodaava alue TGF-p3:lle GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG 39

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu 5 10 ’ AAC TGC TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG 78

Asn Cys Cys Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin 15 20 25 GAT CTG GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC 117

Asp Leu Gly Trp Lys Trp Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr - 30 35 TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC 156

Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys Pro Tyr Leu Arg 40 45 50 | AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC 195

Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu Tyr 55 60 65 i « ; i AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC 234 T Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys V : 70 75 · » * * * GTG CCC CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT 273 :: :”’ϊ Vai Pro Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr ' ::: so 85 90 • « · • · · Π . GTT GGG AGG ACC CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG 312 •f: Vai Gly Arg Thr Pro Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met 95 100 • · · • · · . GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC TGA 339 ;; Vai Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser : 105 no ! ; II· II· I « I » : * 1 '

"* I I

I I »

Claims (25)

63 103278

1. Menetelmä dimeerisen, biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän, tyyppi β (TGF-β) kaltaisen proteiinin 5 tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainitun TGF-β:n kaltaisen proteiinin denaturoitunut, monomeeri-nen muoto saatetaan uudelleenlaskostumaan liukoiseksi tekevän aineen läsnäollessa, joka aine on heikko detergentti, orgaaninen veteen sekoittuva liuotin tai fosfolipidi, tai 10 kahden tai useamman tällaisen aineen seos.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu lisäksi siitä, että mainitun TGF^:n kaltaisen proteiinin monomeerinen muoto valmistetaan seuraavissa vaiheissa: 15 (a) viljellään mikrobi-isäntää, joka sisältää TGF-β:n kaltaista proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin liitettynä oikeassa lukukehyksessä ilmentymisensäätelysekvenssiin siten, että mainittu proteiini ilmentyy, ja (b) otetaan TGF-β:n kaltainen proteiini talteen denatu-20 roidussa, monomeerisessa, liukoisessa muodossa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monomeerinen TGF^:n kaltainen proteiini on läsnä liukenemattomana aggregaattina mikrobi-isäntäsoluissa, ja ’’ 25 että menetelmässä edelleen ••j · (a) eristetään isäntäsoluista veteen liukenematon proteii- • · *··.’ nifraktio, joka sisältää TGF^:n kaltaisen proteiinin ja • · * ’ (b) tehdään TGF-β:n kaltaisen proteiinin aggregaatti liu koiseksi. :Y: 30

• » - ;*·*; 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ' . tä, että mikrobi-isäntä on hiiva tai bakteeri. • ·

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii-:Y: 35 tä, että liukenematon aggregaatti liuotetaan pH:ssa noin l ·;··· - noin 4, edullisesti pH:ssa noin 2,5. 103278

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukenematon aggregaatti liuotetaan kaotrooppi-sella aineella.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että kaotrooppinen aine on urea tai guanidiini-HCl konsentraatiossa noin 4 - noin 9 M.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu sii-10 tä, että kaotrooppinen aine on detergentti.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TGF-βίη kaltainen proteiini on luun morfogeeni-nen proteiini tai jokin transformoiva kasvutekijä β. 15

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TGF-p:n kaltainen proteiini on BMP-2, ΤσΓ-β2 tai τσΓ-β3.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- j tä, että läsnä on alhaisen molekyylipainon omaava sulfhyd- ryyli/disulfidi-hapetus-pelkistysjärjestelmä.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että läsnä on alhaisen molekyylipainon omaava sulf- i ; ,·, hydryyli/disulfidi-hapetus-pelkistysjärjestelmä, joka on ”1/ glutationi hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan tai ditiotreitoli hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan • · · tai β-merkaptoetanoli hapettuneessa ja pelkistyneessä ; 30 muodossaan tai kystiini ja sen pelkistynyt muoto tai kysta- IM > v* miini ja sen pelkistynyt muoto, ja jossa sulfhydryyli/di- • · · ·/ : sulfidi-hapetus-pelkistysjärjestelmää käytetään konsentraa- ,·, ; tiossa noin 1-100 mM. • « ; · I 4- '*.* 35

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu . I "·" siitä, että alhaisen molekyylipainon omaava sulfhydryy- * * * I li/disulfidi-hapetus-pelkistysjärjestelmä on glutationi 103278 hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan konsentraatiossa noin 1-10 mM, jolloin hapettuneen ja pelkistyneen muodon suhde on välillä 6:1 - 1:6, edullisesti välillä 1:1 - 1:2.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että läsnä on tioredoksiinia tai disulfidi-isomeraasia tai niiden seosta, edullisesti tioredoksiinia, konsentraatiossa noin 10-1000 /xg/ml.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että liukoiseksi tekevä aine on ei-ioninen, ioninen tai kahtaisioninen heikko detergentti.

16. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-15 tä, että detergentti on 3-(3-chlolamidopropyyli)dimetyyli- ammonio-l-propaanisulfonaatti tai 3-(3-chlolamidopropyyli) dimetyyliammonio-2-hydroksi-l-propaanisulfonaatti.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-20 tä, että detergentti on 3-(3-chlolamidopropyyli)dimetyyli- ammonio-l-propaanisulfonaatti tai 3-(3-chlolamidopropyyli) dimetyyliammonio-2-hydroksi-l-propaanisulfonaatti konsentraatiossa noin 30 mM - 60 mM.

18. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii- i . . tä, että pH on noin 6 - noin 10, edullisesti noin 8,0. ··· · * • t» • · • · • · ·

19. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-• · » 9 9 tä, että lämpötila on noin 0 °C - noin 37 °C, edullisesti • · 30 noin 4 °C. • · · « · · • · • · · • · ·

20. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii-tä, että läsnä on Cu2+- tai Fe3+-ioneja sisältäviä hapettu- ’:'': misen edistämisaineita konsentraatiossa noin 0,01 - 100 μΜ. .v. 35 i i i

21. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiosysteemin läpi kuplitetaan lisäksi 02:a. 103278

22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saatu dimeerinen proteiini puhdistetaan kromato-grafialla.

23. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että monomeerinen TGF-β S-sulfonoidaan ennen uudelleen-laskostumista.

24. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siilo tä, että liukoiseksi tekevä aine on 3-(3-chlolamidopropyy- li) dimetyyliammonio-l-propaanisulfonaatti konsentraatiossa noin 30 mM - 60 mM, ja jossa glutationia on läsnä hapettuneessa ja pelkistyneessä muodossaan konsentraatiossa noin 1-10 mM, jolloin hapettuneen ja pelkistyneen muodon molaa-15 rinen suhde on 1:1 - 1:2.

25. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu " siitä, että sulfhydryyli/disulfidi-hapetus-pelkistysjärjes- telmää käytetään siten, että hapettuneen ja pelkistyneen 20 muodon molaarinen suhde on välillä 100:1 - 1:100. • ϊ f # · · ··· · • · · • • · • · · • · t • · · • · 1 · • · · • · L • r " »tr ; # · » ♦ · 1 • · · · · I 1 f ; Τ' I I. I 103278