NO179106B - Fremgangsmåte for fremstilling av og ekspresjonssystem som koder for og kan uttrykke et rekombinant proteinkompleks med humanfaktor V111:C-aktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant proteinkompleks med human-Fak.tor VI11: C-aktivitet samt ekspresjonssystem som koder for og kan uttrykke et slikt rekombinant proteinkompleks.

Hemofili A er en X-kromosom-tilknyttet arvelig sykdom som rammer 1-2 menn pr. 10.000. Defekten manifesterer seg som en blødningsforstyrrelse på grunn av fraværet av dannelse av levret blod som skriver fra en mangel på Faktor VIII:C. Faktor VIII:C har historisk blitt isolert fra blod i en konsentrert form for terapeutisk behandling av hemofili. Engstelse angående overføring av hepatitt og nå Aids har imidlertid ansporet aktiviteten for tilveiebringelse av alternative tilførsler av Faktor VIII:C. Det er av vesentlig interesse å være i stand til å levere preparater som har Faktor VIII:C-aktivitet uten engstelse med hensyn til overføring av virale sykdommer forbundet med den native Faktor VIII:C.

Faktor VIII:C er et meget stort glykoprotein (nativ Mr 330-360 kiloDalton (kD)), som er tilstede i plasma i ekstremt lave konsentrasjoner. Proteinet er meget mottagelig for spalting av trombin, plasmin, protease C, og andre serin-proteaser. Det blir vanligvis isolert fra plasma eller plasmaprodukter som en serie relaterte polypeptider varierende fra 160-40 kD med dominerende elementer av 92 kD og 80-77 kD. Dette komplekse mønsteret har gjort analysen av strukturen til aktiv Faktor VIII:C meget vanskelig.

Rotblat et al., Biochemistry (1985) 24:4292-4300; Vehar et al., Nature (1984) 312: 337-342; Toole et al., Nature (1984) 312:342-347; og Truett et al., DNA (1985) 4:333-349 beskriver Faktor VIII:C og de relaterte polypeptidene. Orr et al., Molecular Genetics of Clotting Factors, p. 54, s321, rapporterer en "avstands"-funksjon for det sterkt glykosylerte området i Faktor VIII:C. Toole et al., supra, Wood et al., Nature (1984) 312:330-336; og Truett et al., supra, rapporterer sekvensering av Faktor VIII:C, Fulcher et al., Blood

(1983) 61:807-811, rapporterer at toppen for maksimum Faktor VIII:C-aktivitet korrelerer med tilstedeværelsen av 90 kD- og 70 kD-fragmenter. Fulcher et al., J. Clin. Invest. (1985) 76:117-124, foreslår at basert på antistoff-epitop-data med Faktor VIII:C, er både 92 kD- og 80 kD-polypeptidene nødven-dige for Faktor VIII:C-funksjon.

Selv om rekombinant humanfaktor VIII:C av full lengde har blitt fremstilt, er den vanskelig å rense og karakterisere og den er ustabil på grunn av proteolyse. Det praktiske ved å være i stand til på vellykket måte å fremstille og anvende den fulle molekyllengden klinisk er derfor uviss i øye-blikket. Tidligere forsøk på å kombinere 92 kD- og 80 kD-polypeptidene in vitro ga ikke et aktivt preparat. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av et aktivt kompleks av 92 kD- og 80 kD-kjedene.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant proteinkompleks som har humanfaktor VIII:C-aktivitet, men mangler hele eller en del av B-området av humanfaktor VIII:C, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man i trans i en eukaryotisk transformert vertscelle ko-uttrykker: (a) et første gen som koder en signalsekvens og et polypeptid omfattende minst 90 % av aminosyresekvensen av de N-terminale aminosyrene 1-740 i A-området i humanfaktor VIII:C, og eventuelt inkluderer en N-terminaldel i B-området av humanfaktor VIII:C;

og

(b) et annet gen som koder en signalsekvens og et peptid omfattende minst 90 % av aminosyresekvensen til aminosyrene 1649-2332 i C-området av humanfaktor

VIII:C,

hvor ikke mer enn b% av aminosyrene i nevnte aminosyresek-

venser adskiller seg fra de naturlig forekommende aminosyre-sekvensene i faktor VIII:C A- og C-områdene;

og utskiller det rekombinante proteinkomplekset, hvorpå prtoteinkomplekset isoleres.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilveiebragt en ekspresjonssystem som koder for og kan uttrykke et rekombinant proteinkompleks som har human faktor VIII:C-aktivitet, og dette ekspresjonssystemet er kjennetegnet ved at det omfatter to separate ekspresjonsplasmider, hvor det første ekspresjonsplasmidet omfatter et gen som koder for en signalsekvens og et peptid som omfatter minst 90 % av aminosyresekvensen til aminosyrene 1-740 i A-området av humanfaktor VIII:C og eventuelt en N-terminaldel i B-området av humanfaktor VIII:C, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er funksjonelle i en vertscelle, og hvor det andre ekspresjonsplasmidet omfatter et gen som koder for en signalsekvens og et peptid omfattende minst 90 # av aminosyresekvensen til aminosyrene 1649-2332 i C-området av humanfaktor VIII:C og ikke innbefatter B-området, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er funksjonelle i nevnte vertscelle, idet ikke mer enn 5 ^ av aminosyrene i nevnte aminosyresekvenser adskiller seg fra de naturlige forekommende aminosyresekven-sene i faktor VIII:C A-og C-områdene.

Som benyttet heri innbefatter C-området A3 som beskrevet i Wood et al., supra.

Et farmasøytisk preparat kan omfatte det ovenfor beskrevne proteinkomplekset sammen med en fysiologisk akseptabel bærer. Behandling av et individ som trenger Faktor VIII:C-aktivitet omfatter administrasjon til individet av en tilstrekkelig mengde av foreliggende proteinkompleks for å forøke blodlevringsaktiviteten i nevnte individ. Fig. IA illustrerer stedet for de proteolytiske spaltingene som er ansvarlige for utviklingen av 92 kD- og 80 kD-kj edene. Fig. 1B-E viser valgte restriksjonskart for plasmidene pSV7d, PSVF8-92, pSVF8-80 og pSVF8-200, kilden for eller funksjonen til fragmentene og antallet nukleotider som starter fra punktet betegnet 0. De valgte restriksjonssetene er: B, BamHI; Bc, Bell; Bg, Bglll; E, EcoRI; H, Hindlll; Hp, Hpal; K, Kpnl; N, Ndel; Nr, Nrul; P, Pstl;

Pvul, Pvul; PvuII, PvuII; S, Sali; Sc, SacI;

Sm, Smal; St, Stul; X, Xbal. De seter som er omsluttet av parenteser ble benyttet i vektor-konstruksjonen, men ble ikke regenerert.

Det ifølge oppfinnelsen fremstilte proteinkompleks omfatter to kjeder, en kjede som har vesentlig den samme aminosyresekvensen som N-terminaldelen (A-området) i Faktor VIII:C og den andre kjeden som har vesentlig den samme aminosyresekvensen som C-terminusen (C-området) i Faktor VIII:C-proteinet. De to kjedene er ca. 92 kD for A-området (unntatt ved forlengelse inn i B-området) og 80 kD for C-området, og betegnes noen ganger henholdsvis som den "tunge" kjeden og den "lette" kjeden. Det tilveiebringes konstruerte nukleinsyreelementer omfattende individuelle ekspresjonsplasmider som har transkripsjonene og translasjone 11 e regulatorområder som er funksjonelle i en pattedyrcelle, som regulerer transkrip-sjonen og translasjonen til de strukturelle genene, hvor hvert strukturelle gen har en sekvens som koder for den ferdige peptidkjeden sammenføyet ved dens N-terminus til en signalsekvens. Ekspresjonsplasmider innføres i en pattedyrvert, hvorved det produseres et proteinkompleks som har Faktor VIII:C-aktivitet. (Med henvisning til sekvensene og områdene i Faktor VIII:C, finnes de sekvenser og områder det vises til på side 333 i Wood et al., som angitt ovenfor.) Det N-terminale polypeptidet vil strekke seg fra aminosyre 10, vanligvis aminosyre 1, til i det minste aminosyre 620, vanligvis i det minste aminosyre 675, mer vanlig aminosyre 740. Polypeptidet vil inneholde minst 85$ av A-området (Wood et al., supra), med vanlig minst 90% og kan eventuelt inneholde en del av N-terminusen i B-området, typisk ikke overskridende ca. aminosyre 1405. Av spesiell interesse er en N-terminalkjede som har hele sekvensen til det trombolytiske spaltningssete ved Ar<g>74Q<->Sery4^.

Den lette kjeden vil ha en aminosyresekvens som er vesentlig den samme som aminosyresekvensen til C-terminusen i et Faktor VIII:C-polypeptid, vanligvis minst 80$, mer vanlig minst 90% av Faktor VIII:C 80 kD-kjeden, spesielt begynnende med aminosyre 1570, vanligvis aminosyre 1600, spesielt aminosyre 1625, mer spesielt aminosyre 1640, fortrinnsvis ved aminosyre 1649, ± 10 aminosyrer, mer spesielt ± 1 aminosyre, og fortsettende til minst aminosyre 2300, vanligvis 2310 ± 10 aminosyrer, fortrinnsvis 2325, ± 5 aminosyrer, mer fore-trukket til den terminale aminosyren (2332). Vanligvis vil den lette kjeden ha minst ca. 85$, mer vanlig minst 95%, av Cl-C2-områdene, helst A3-Cl-C2-områdene.

Vanligvis vil ikke mer enn 10, mer vanlig ikke mer enn 5 %, spesielt ikke mer enn 1 % av aminosyrene i kjedene adskille seg fra aminosyrene som naturlig er tilstede i Faktor VIII:C A- og C-områdene. Spesielt vil ikke mer enn 5%, mer vanlig ikke mer enn 1%, være ikke-konservative substitusjoner. Konservative substitusjoner innbefatter: G,A; V,I,L; D,E; K,R; N,0; F,W,Y, hvor bokstavene mellom de angitte semi-koloner er konservative substitusjoner. (Bokstavene er en-bokstav-kode for aminosyrer.) Når en aminosyre i en gruppe er substituert med en aminosyre i en annen gruppe eller en aminosyre som ikke er angitt ovenfor (C,M,H,P), vil en slik endring anses som ikke-konservativ. DNA-konstruksjonselementer vil bli benyttet for ekspresjon av de angitte polypeptidene. Hver av konstruksjonselementene vil i 5'-3'-transkripsjonsretningen ha en transkripsjonal og translasjonal initieringsregion, en strukturell genkodende region omfattende en sekvens som koder for peptidsignal-sekvensen, inkludert prosesseringssignalet, og en sekvens som koder for de tunge eller lette Faktor VIII:C-kjedene, fulgt av den translasjone I le og transkripsjonel le termineringsregionen.

Initieringsregionen kan omfatte en rekke forskjellige sekvenser som er involvert i initieringen av transkripsjon og translasjon. Disse sekvensene innbefatter forøkningssekven-ser, RNA-polymerase-bindingssete, spaltningssete, ribosomalt bindingssete og translasjonalt initieringssete, og lignende. Den transkripsjonale initieringsregionen kan være den naturlige region eller villtype-regionen som er forbundet med Faktor VIII:C eller kan være alternativ-region for tilveiebringelse av høy transkripsjonal effektivitet. Regionen kan være oppnådd fra viruser som har pattedyrvert-områder eller genene til vertscellen eller gener fra en annen pattedyrvert som er forenelig med vertscellen. Flere forskjellige transkripsjonale initieringsregioner har blitt isolert og demonstrert som operative i pattedyrverter. Disse regionene innbefatter SV-40-tidligpromotor- og senpromotorregionene, adenovirus-hovedsen-promotorregionen, p-aktin-promotorregionen, cytomegalovirus 72 kD-tidligproteinpromotor-regionen, metallotionein-promotoren, og lignende.

Termineringsregionen kan omfatte polyadenyleringssignal-sekvensen, den transkripsjonale termineringssekvensen, og lignende. Termineringsregionen kan være oppnådd fra 3'-regionen i den naturlige eller villtype-regionen i Faktor VIII:C, eller kan være fra det samme strukturelle gen eller et annet strukturelt gen hvorfra 5 *-initieringsregionen var oppnådd. 3'-regionen er ikke så vesentlig for transkripsjons-nivået som initieringsregionen, slik at når den velges er det mer tale om hensiktsmessighet enn om et spesifikt valg.

De strukturelle genene vil bestå av en signalsekvens som koder for den N-terminale aminosyresekvensen og som dirigerer polypeptidet inn i hulrommet i det endoplasmiske retikulum for prosessering og modning. Også innbefattet i signalsekvensen er prosesseringssignalet som gjenkjennes av en endopeptidase, hvor endopeptidasen spalter en peptidbinding, fjerner signalsekvensen for tilveiebringelse av det ferdige polypeptidet. Signalsekvensen kan være den naturlig forekommende signalsekvensen, spesielt for N-terminalpeptidet eller kan være en hvilken som helst signalsekvens som er operativ med peptidene for å sørge for prosesseringen og modningen av polypeptidene.

Forskjellige signalsekvenser har blitt rapportert i littera-turen og innbefatter slike signalsekvenser som vevplasminogenaktivator, tunge og lette immunoglobinkjeder, virale membranglykoproteiner slik som Herpes Simpleks-virus-glyko-proteiner gB og gD, og lignende.

Når det er nødvendig, vil den sekvens som koder det ferdige proteinet og signalsekvensen bli sammenføyet for derved å være i leseramme. Når hensiktsmessige restriksjonsseter er tilgjengelige, kan de kohesive eller butte endene bli sammenføyet på riktig måte. For det meste vil imidlertid adaptorer bli benyttet der deler av den kodenden sekvensen vil bli gjenskapt i den syntetiske adaptoren slik at det avskårede strukturelle gen og/eller den avskårede signalsekvensen vil bli sammenføyet gjennom adaptoren for derved å være i riktig leseramme. Signalsekvensen og det strukturelle gen kan bli delvis restriksjonskartlagt for derved å identi-fisere restriksjonsseter, spesielt unike restriksjonsseter , som kan bli benyttet for å sammenføye de to sekvensene i riktig leseramme ved hjelp av en passende adaptor. Alterna-tivt kan unike restriksjonsseter innføres ved signalsekvens-gjenkjennelsessetet ved hjelp av in vitro-mutagenese.

De translasjonale start- og stoppsignalene vil normalt være en del av det strukturelle gen, og sørge for det passende initieringskodon ved begynnelsen av translasjon og en eller flere stoppkodoner ved avslutningen av translasjon. Disse kodonene vil ofte være tilstede i de benyttede sekvensene, spesielt signalsekvensene som tilveiebringer initierings-kodonet. Stoppkodonene kan tilføyes etter behov som del av termineringsregionen eller kan tilføyes til den kodende region for å sørge for hensiktsmessig 3'-terminus for binding til den transkripsjonale termineringsregionen for tilveiebringelse av en fullstendig termineringsregion.

De forskjellige regionene i ekspresjonsplasmidet (den transkripsjonale og translasjonale initieringsregion-nukleinsyresekvens, den strukturelle gen-nukleinsyresekvens som koder et av polypeptidene og under den transkripsjonale og translasjonale kontroll av initieringsregionen, og en transkripsjonal og translasjonal termineringsregion som kontrollerer prosesseringen av mRNA og den translasjonale terminering), som identifiserer de spesielle nukleotid-sekvensene, kan sammenføyes ved bruk av konvensjonelle metoder. Vanligvis vil de oppnådde sekvenser inneholde, eller være modifisert til å inneholde, restriksjonsseter som deretter kan sammensmeltes der komplementære overheng eller kohesive ender er tilstede. Modifikasjon vil ofte være i ikke-kodende regioner ved innføring av linkere for tilveiebringelse av de ønskede kohesive ender. Endene vil vanligvis være ligerte forut for innføring i vertscellen, skjønt vertscellen kan gis anledning til å sørge for den nødvendige ligering.

Ekspresjonsplasmidene kan sammenføyes med en rekke forskjellige andre sekvenser for spesielle formål. Når amplifikasjon er ønsket, kan ekspresjonsplasmidene sammenføyes i tandem til et gen som forsterkes når det induseres med en passende stimulus. Slike gener som metallotioneingenene, f.eks. human-metallotioneingen, dihydrofolatreduktase, og melkekjertel-tumorvirus LTR hos mus, kan sammenføyes med peptidplasmidene som har sine egne transkripsjonale og translasjonale regulatorsekvenser. Ved benyttelse av tunge metallioner, f.eks. kobber eller kadmium, metotraksat, eller glukokortikoider, kan amplifikasjon av det forsterkende gen og det gen som er av interesse (ekspresjonsplasmidet) oppnås i vertscellen. De strukturelle genene vil ha de passende sekvenser for ekspresjon som beskrevet for ekspresjonsplasmidet .

Ekspresjonsplasmidene kan sammenføyes med en vektor, som vil omfatte et replikasjonssystem som er funksjonelt i vertscellen, hvilken replikasjonssystem kan sørge for stabil episomal opprettholdelse eller integrasjon av ekspresjonsplasmidet i vertgenomet. Vektoren vil også omfatte en markør for seleksjon, for utvelgelse av vertsceller som inneholder DNA-konstruksjonselementet og vektoren fra nevnte vertsceller som mangler DNA-konstruksjonselementet og vektoren.

En rekke forskjellige replikasjonssystemer er tilgjengelige, normalt fra viruser som infiserer pattedyr-vertsceller. Illustrerende replikasjonssystemer innbefatter replikasjons-systemene fra Simian-virus 40, adenovirus, bovin-papilloma-virus, polyomavirus, Epstein-Barr-virus, og lignende.

Markører kan innbefatte resistens overfor et biocid, spesielt et antibiotikum, eller komplementering av auksotrofi for tilveiebringelse av en prototrofisk vert. Spesielle gener av interesse som markører innbefatter kanamycin-resistensgen (NPTII), kloramfenikol-resistensgen (CAT), penicillinase, eller lignende.

Vanligvis vil vektoren være sirkulær og vil ha et eller flere restriksjonsseter som gir anledning for innføring av ekspresjonsplasmidet, trinnvis eller som en ferdig enhet, i vektoren. Ofte vil vektoren også innbefatte et bakterielt replikasjons- og seleksjonssystem som gir anledning for kloning etter hvert av manipulasjonstrinnene. På denne måten kan relativt store omfang av konstruksjonen ved hvert av trinnene fremstilles, isoleres, renses, kontrolleres for å se at den riktige sammenføyning har funnet sted, og deretter anvendes for det neste trinnet.

Forskjellige pattedyr-vertsceller kan benyttes hvori regula-torsekvensene og replikasjonssystemet er funksjonelle. Slike celler omfatter COS-celler, eggstokkceller fra kinesisk hamster (CHO), musenyreceller, hamsternyreceller, HeLa-celler, EepG2-celler og lignende.

Ekspresjonsplasmidene til de ønskede polypeptidene kan sammenføyes i en nukleinsyrekjede eller kan være tilstede i separate nukleinsyremolekyler. Hensiktsmessig kan ekspresjonsplasmidene være deler av forskjellige vektorer eller av den samme vektoren. Dette er hovedsakelig et forhold som gjelder hensiktsmessighet, skjønt i noen situasjoner med spesielle vektorer kan den ene eller den andre konstruksjons-måten være ønskelig.

Den måte på hvilken ekspresjonsplasmidene innføres i vertscellen vil være konvensjonell. Hensiktsmessig kan kalsium-fosfat-utfelt DNA eller DNA i nærvær av DEAE-dekstran benyttes for transformasjon. Når virus er involvert, kan transfeksjon eller transduksjon benyttes. Den spesielle måte på hvilken vertscellen transformeres er ikke kritisk i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, avhengig vesentlig av om ekspresjonsplasmidene er sammenføyet til et replikasjonssystem og typen av replikasjonssystemet og tilknyttede gener.

De transformerte cellene kan deretter dyrkes i et passende næringsmedium. Produktet oppnås som et kompleks av de to kjedene slik at mediene eller cellelysatet kan isoleres og det aktive Faktor VIII:C-kompleks ekstraheres og renses. Forskjellige metoder er tilgjengelige for ekstraksjon og rensing, slik som affinitetskromatografi, ioneutvekslings-kromatografi, hydrofob kromatografi, elektroforese, oppløs-ningsmiddel-oppløsningsmiddel-ekstraksjon, selektiv utfelling og lignende. Den spesielle måte på hvilken produktet isoleres er ikke kritisk for oppfinnelsen og vil velges for å minima-lisere denaturering eller inaktivering og maksimere isola-sjonen av et høyrent aktivt produkt.

Det tilveiebringes proteinkomplekser i Coatesten vil ha minst 0,02 U/ml aktivitet, vanligvis minst 0,2, mer vanlig minst 0,5 U/ml aktivitet. Foreliggende produkt kan renses ved affinitetskromatografi ved bruk av antistoffer, spesielle monoklonale antistoffer rettet mot C-terminus-underenheten i Faktor VIII:C-aktiviteten, elektroforese, ekstraksjon, HPLC, osv.

Foreliggende fremgangsmåte gir produksjon av et kompleks av de tunge og lette kjedene som har Faktor VIII:C-aktivitet. Produksjon vises ved hjelp av kondisjonerte media som beskrevet i den eksperimentelle delen, som vil ha minst 50, vanligvis minst 70 mU/ml, mer vanlig minst 200 mU/ml av Faktor VIII:C-aktivitet i Coatest-analysen.

Kompleksene fremstilt ifølge oppfinnelsen som har Faktor VIII:C-aktivitet har en rekke forskjellige anvendelser som immunogener for produksjon av antistoffer, for isolasjon av von Willebrand-faktor ved affinitetskromatografi, i diagnos-tiske analyser for Faktor VIII:C og for behandling av blødere og andre verter som har blodlevringsforstyrrelser. De fremstilte proteinkomplekser kan administreres i en fysiologisk akseptabel bærer slik som vann, saltoppløsning, fosfatbufret saltoppløsning, og citratbufret saltoppløsning, ved konsentrasjoner i området på 10-200 U/ml. Se US patenter 3.631.018;

3.652.530 og 4.069.216 angående metoder for administrasjon og mengder. Andre konvensjonelle additiver kan også innbefattes.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksperimentelt

Eksempel 1

A. Fremstilling av ekspresjonsplasmider

A. 1 pSV7d: En pattedyrcelle- ekspres. ionsvektor Ekspresjonskassettene ble fremstilt ved bruk av pattedyrcelle-ekspresjonsvektoren pSV7d (2423 bp ).

Plasmidet pSV7d (se Truett et al., supra) ble konstruert som følger: 400 bp BamHI/HindIII-fragmentet inneholdende SV40-opprinnelsen for replikasjon og tidligpromotoren ble fjernet fra pSVgtl (Gruss, P. og Khoury, G. , Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1981) 78:133-137) og renset. 240 bp SV40 BclI/BamHI-fragmentet inneholdende Sv40-polyA-addisjonssetet ble fjernet fra pSV2/DHFR (Subramani et al., Molec. and Cell Biol. (1981) 1:854:864) og renset. Fragmentene ble sammensmeltet gjennom følgende linker:

Stoppkodoner

12 3

5'-AGCTAGATCTCCCGGGTCTAGATAAGTAAT-3'

TCTAGAGGGC C CAGATCTATTCATTACTAG

Hindlll Bglll Smal Xbal Bell overheng.

Denne linkeren inneholder fem restriksjonsseter samt stoppkodoner i alle tre leserammer. Det resulterende 670 bp-fragmentet inneholdende SV40-opprinnelsen for replikasjon, SV40-tidligpromotoren, polylinkeren med stoppkodoner og SV40-polyadenyleringssetet, ble klonet inn i BamEI-setet i pML, et pBR322-derivat med ca. 1,5 kb-fjerning (Lusky og Botchan, Cell (1984) 36:391), for oppnåelse av pSV6. EcoRI- og EcoRV-setene i pML-sekvensene i pSV6 ble eliminert ved nedbrytning med EcoRI og EcoRV, behandlet med Bal31-nuklease for fjerning av ca. 200 bp på hver ende, og til slutt religert for oppnåelse av pSV7a. Bal31-reseksjonen eliminerte også et BamHI-restriksjonssete som flankerte SV40-regionen, omtrent 200 bp bort fra EcoRV-setet. For å eliminere det andre BamHI-setet som flankerte SV40-regionen, ble pSV7a nedbrutt med Nrul, som spalter i pML-sekvensen oppstrøms fra replikasjonsopp-rinnelsen. Denne ble resirkularisert ved buttende-ligering for dannelse av pSV7b.

pSV7c og pSV7d representerer suksessive polylinker-erstat-ninger. Først ble pSV7b nedbrutt med Stul og Xbal. Deretter ble følgende linker ligert inn i vektoren for oppnåelse av pSV7c: Bglll EcoRI Smal Kpnl Xbal

5'-AGATCTCGAATTCCCCGGGGGTACCT

TCTAGAGCTTAAGGGGCCCCCATGGAGATC

Deretter ble pSV7c nedbrutt med BaglII og Xbal, og deretter ligert med følgende linker for oppnåelse av pSV7d: BaglII EcoRI Smal Xbal BamHI Sali

5'-GATCTCGAATTCCCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGAC

AGCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGGCACGTGGATC

A.2 PSVF8- 92: Et ekspresionsplasmid for 92 kD- tråden

Med utgangspunkt i BamHI-setet i polylinkeren pSV7d, består pSVF8-92 av et 49 bp syntetisk linker-adaptor-molekyl fra BamHI- til Sacl-kodende nukleotider -30 til +14 i Faktor VIII:C-proteinet (nummerering fra den første A i det translasjonale startsetet; sekvensen er vist under i A.4), et 2267 bp SacI- til Hindlll-fragment fra Faktor VIII:C DNA inneholdt i pSVF8-200 beskrevet nedenfor (opptil nukleotid +2281), og pSV7d fra Hindlll til BamHI.

A. 3 PSVF8- 80: Et ekspres. ionsplasmid for 80 kP- tråden

Med utgangspunkt i Sall-setet i polylinkeren pSV7d, består pSVF8-80 av et 201 bp-fragment i en vevplasminogenaktivator-cPNA fra nukleotider -98 til +103 (i forhold til start-kodonet) med avslutning ved Bglll-setet (tPA-sekvenser gitt i Degan, S.J.F. et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:6972-6985), en 29 bp syntetisk Bglll til Bcll-^linker-adaptor som koder nukleotider +5002 til +5031 i Faktor VIII:C ligert til 2464 bp Bcll-fragment i Faktor VIII:C spennende fra et Bcll-sete dannet ved nukleotid 5028 i Faktor VIII:C cPNA gjennom in vi tro mutagenese (Zoller og Smith, Methods in Enzymology

(1983) 100:468), til et Bcll-sete i den 3'-utranslaterte regionen, ved nukleotid 7492, og et 400 bp-fragment i tPA 3'-utranslatert sekvens spennende fra et Bglll-sete til et syntetisk Pstl-sete utviklet fra cPNA-kloningen, fulgt av polylinkeren fra vektoren M13mp9 (Vieira og Messing, Gene

(1982) 19:259) og deretter pSV7d.

A. 4 PSVF8- 200: Et ekspres. i onsplasmid for Faktor VIII:C

cPNA i full lengde

Plasmidet pSVF8-200 (beskrevet i Truett et al.), som inneholder hele Faktor VIII:C cPNA kodende og 3'-utranslaterte sekvensene, idet de 5'-utranslaterte sekvensene er de samme som beskrevet ovenfor for pSVF8-92, ble fremstilt som følger.

Plasmid pSV7d ble nedbrutt med BamHI for å tilveiebringe spalting i polylinker-regionen nedstrøms for SV40-tidligpromotoren. Pen følgende 49 bp BamHI-SacI-linkeradaptoren, som koder for de siste 30 bp i den 5'-utranslaterte regionen og de første 15 bp i den humanfaktor VIII:C-kodende sekvensen, ble syntetisert kjemisk ligert til pSV7d: -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 met gin ile glu

5' GATCC TCTCC AGTTG AACAT TTGTA GCAAT AAGTC ATG CAA ATA GAG CT 3'

3' BamHI G AGAGG TCAAC TTGTA AAGAT CGTTA TTCAG TAC GTT TAT CSacI 5'

Pette ligerte plasmidet ble deretter nedbrutt med SacI for å fjerne overskudd linkere og med Sali for tilveiebringelse av et Sall-overheng.

Fragment 1, 2,9kb Sacl-fragmentet fra pF8-102 inneholdende den 5'-kodende regionen i Faktor VIII:C, og Fragment 2, 6,5kb SacI-SalI-fragmentet fra pF8-6,5 som inneholder den 3'-kodende regionen i faktoren, og pSV7d-modifisert vektor inneholdende 1inkeradaptoren, ble ligert sammen (se truett et al., supra). Denne ligeringsblanding ble deretter benyttet for å transformere E. coli HB101, og kolonier ble utvalgt ifølge resistens overfor ampicillin.

300 transformanter ble analysert ved koloni-filterhybridi-sering ved bruk av BamHI-SacI 5'-adaptoren eller 2,9kb Sacl-fragmentet som prober. De kolonier som er positive med begge prober, ble deretter analysert ved restriksjonskartlegging. Plasmid pSVF8-200, som inneholder hele den kodende regionen for humanfaktor VIII:C-genet og en 5' -utranslatert region på riktig måte innsatt i transkripsjonal orientering i forhold til SV40-tidligpromotoren, ble oppnådd.

B. Transf eks. jon og dyrking av C0S7- celler

Plasmidene som beskrevet ovenfor ble transfisert i C0S7-celler (Guzman, Cell (1981) 23:175) ved bruk av kalsium-fosfat-koutfellingsmetoden (van der Eb og Graham, Meth. Enzymology (1980) 65:826-839) koblet med behandling med klorokvindifosfat (Luthman og Magnusson, Nucl. Acids Res.

(1983) 11:1295-1308) ved bruk av 50 jjm av plasmid DNA pr. 5 x 10^ celler i 14 timer. Celler kan også transfiseres ved DEAE-dekstran-metoden ifølge Sompayrac og Danna P.N.A.S.

(1981) 78:7575-7578.

C0S7-cellene ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium supplert med 10$ kalvefosterserum, 100 U/ml penicillin, 100 pg/ml streptomycin, 292 pg/ml glutamin, og 110 >jg/ml natrium-pyruvat. Prøver ble oppnådd fra en 48 timers oppsamling av serumholdig medium ved 88 timer etter transfeksjon.

C. Analyser

Ved spesifikke intervaller etter transfeksjon ble media fjernet fra cellene og aliquoter ble lagret ved -70°C. Prøver ble testet med henblikk på deres evne til å nedsette den forlengede partielle tromboplastintiden til Faktor VIII:C-manglende plasma i en standard koaguleringsanalyse (Hardisty et al., Thrombosis et Diathesis Haemologica (1962) 72:215). Den mer spesifikke Coatest-analysen (Rosen et al. i Thromb. and Haemostasis (1985) 54:818-823), som måler utviklingen av aktivert Faktor X (Xa) som en lineær funksjon av konsentra-sjonen av eksogent tilført Faktor VIII:C, ble benyttet for å verifisere resultatene fra koaguleringsanalysen. Konsentra-sjonen av immunologisk reaktiv faktor VIII:C-protein i mediet ble bestemt ved anvendelse av en radioimmunoanalyse (RIA) utviklet for å detektere 92 kD-polypeptidet og ved en enzym-bundet immunoabsorberende analyse (ELISA) som er spesifikk for 80 kD-polypeptidet (Nordfang et al., Thromb. and Haemostasis (1985) 53:346).

Som vist i tabell 1 produserte ekspresjon av 92 kD-polypeptidet eller av 80 kD-polypeptidet alene ingen detekterbar aktivitet selv om høye nivåer av hver av de individuelle proteinene var tilstede i de kondisjonerte media. Når celler ble kotransfisert med pSVF8-92- og pSVF8-80-plasmider, inneholdt mediaene ca. 20 mTJ/ml koaguleringsaktivitet. Det samme relative nivået for koaguleringsaktiviteten ble utskilt av celler transfisert med plasmidet pSVF8-200 som koder det fullstendige Faktor VIII:C-protein.

Når kondisjonerte media fra de enkle pSVF8-92- og pSVF8-80-transfektantene ble blandet sammen (ved bruk av flere forskjellige betingelser som angitt i tabell 1) ble det ikke oppnådd noen målbar aktivitet.

Disse resultatene indikerer at et kompleks av amino- og karboksyl-terminalområdene i Faktor VIII:C bibeholder intrinsisk koaguleringsaktivitet og at det indre g-området ikke er vesentlig for aktivitet og heller ikke for sammen-setningen av et aktivt kompleks fra separate tråder.

For å verifisere at den observerte koaguleringsaktiviteten skyldes Faktor VIII:C, ble sensitiviteten for koaguleringen overfor inhibering av et antistoff som er spesifikt for Faktor VIII:C bestemt. Før analyse ble aliquoter av kondisjonerte media preinkubert i 2 timer ved 37°C i nærvær av fortynninger av normalt humanserum eller av serum fra en bløder som hadde utviklet en høy titer av inhiberende antistoffer til Faktor VIII:C. Som vist i tabell 2 ble aktiviteten til det fullstendige molekylet, samt den til 92 kD-80 kD-komplekset, redusert spesifikt av det inhiberende serumet. De samme resultatene ble oppnådd ved bruk av tre forskjellige inhiberende monoklonale antistoffer som binder til 80 kD-elementene.

For mer tydelig å demonstrere eksistensen av et totrådet kompleks, ble de aktive elementene delvis renset fra C0S-cellenemediene ved passasje over en monoklonal antistoff-kolonne rettet mot 80 kD-delen som vist i tabell 3. Omtrent 65$ av den benyttede aktivitet ble bibeholdt av kolonnen og 50% av dette bundede materialet ble eluert i en aktiv form og ved en konsentrasjon som var fem ganger større enn den til de innledende media. Et aktivt kompleks kan således isoleres ved affinitetskromatografi ved bruk av et antistoff som er spesifikt for kun 80 kD-elementene.

vasket med 300 pl buffer A (50 mM imidazol, 0,1 M NaCl, 0,1$ natrluminsulin, 0, 2% NaN3, pH 7,3) og deretter eluert med 300 pl buffer B (2,5 M NaCl, 50$ etylenglykol , 0,5 M imidazol, 0,1 M CaCl2» 0,1$ natr iuminsul in, 0, 2% NaN3, pH 7,3).

Resultater rapportert her demonstrerer at ekspresjon av p-linkerregionen, inneholdende 918 aminosyrer eller ca. 40$ av det totale for det intakte protein, ikke er nødvendig for Faktor "VIII: C-aktivitet. Koekspresjon av individuelle 92 kD-og 80 kD-regioner resulterer i et nivå av Faktor VIII:C-aktivitet som er sammenlignbar med den som oppnås fra ekspresjonen av hele Faktor VIII:C-kodende regionen. Disse proteiner sammensettes in vivo til dannelse av et aktivt kompleks bundet med en kalsiumbro. Det sammensatte elementet krever ikke tilstedeværelse av g-regionen og forekommer effektivt for de to trådene uttrykt i trans.

Det er klart fra de ovenfor angitte resultater at Faktor VIII:C-aktivitet kan oppnås ved direkte fremstilling av et N-terminalfragment og et C-terminalfragment som er uavhengig uttrykt, hvor hvert har sin egen signalsekvens. Faktor VIII:C kan således oppnås mer effektivt fordi den store forløperen ikke behøver å bli klonet og benyttet som den kodende sekvensen for Faktor VIII:C-aktiviteten. Celler kan således benyttes for ekspresjon av Faktor VIII:C som kan mangle evnen for riktig modning eller ferdigstillelse av Faktor VIII:C-proteinet.

Eksempel 2

Ekspresjon av 92 kD-proteinet i COS-celler under anvendelse av pSVF8-92-konstruksjonen var lav sammenlignet med mengden av produsert 80 kD-protein. Konstruksjonen ble følgelig modifisert i et forsøk på å øke nivået av 92 kD-protein. Modifikasjoner av følgende typer ble foretatt: Endringer i den 5'-utranslaterte sekvensen i Faktor VIII:C-genet; innføring av heterologe 5'-utranslaterte og leder-sekvenser; og endringer i de 3'-utranslaterte sekvensene. Disse konstruksjonselementer er oppsummert nedenfor.

A. Ekspresjonsplasmider

A.1 Modifikasjoner i den 5'- utranslaterte region

Plasmid PSVF8- 92B. Dette plasmidet er et derivat av pSVF8-92 hvori de 30 bp i 5'-utranslatert sekvens i pSVF8-92 er erstattet med hele den 5'-utranslaterte regionen i humanfaktor VIII:C cDNA (nukleotider 1-171, se fig. 8 i Truett et al., supra), med en utelatelse av G-C-halene (ved in vitro sete-spesifikk mutagenese), og de tre baseforandringene vist nedenfor ved start-ATG (ved stilling +172, fig. 8, Truett et al., supra) for overensstemmelse med Kozak's foretrukne sekvenser for effektiv mRNA-translasjon i eukaryotiske celler:

Faktor VIII:C: GTATG CAA

Kozak konsensus: ACC ATG G

Denne endring forandrer den andre aminosyren i signalpeptidet til Glu fra Gin.

Plasmid PSVF8- 92E. Dette plasmidet er et derivat av pSVF8-92B hvori polylinkeren avledet fra pSV7d 5' til Faktor VIII:C-sekvensene er fjernet med unntagelse av Sall-setet, og ATG-kodonet i den 5'-utranslaterte regionen (ved 41 ifølge Truett et al., supra) er forandret til ATT, ved in vitro mutagenese.

A.2 Addisjon av heterologe 5'- utranslaterte regioner og

ledersekvenser

Plasmider PSVF8- 92G. H og I. Disse plasmidene er derivater av pSVF8-92B hvori den 5'-utranslaterte regionen samt de naturlige Faktor VIII:C-signalsekvensene er erstattet med den analoge regionen fra human-vevplasminogenaktivator (tPA) cDNA-genet. I pSVF8-92G er de første 35 aminosyrene (signalsekvens) i tPA 5'-regionen sammenføyet med ferdig Faktor VIII:C 92 kD, idet en serin er satt inn istedenfor den første aminosyren (alanin) i 92 kD-proteinet. I pSVF8-92H er de første 32 aminosyrene i tPA 5'-regionen sammenføyet med ferdig Faktor VIII:C 92 kD-protein. I pSVF8-92I er de første 23 aminosyrene i tPA 5'-regionen sammenføyet med ferdig Faktor VIII:C 92 kD protein. tPA-sekvensene er de samme som de som er beskrevet for pSVF8-80.

Plasmid PSVF8- 92J. Dette plasmidet er et derivat av pSVF8-92G hvori tPA 5'-regionen er erstattet med 75 bp i herpes simpleks virus-1 (ESV-1) gD 5'-utranslaterte sekvenser og 75 bp i HSV-1 gD-signalsekvens. pSVF8-92J mangler også Ala -» Ser-substitusjonen (Watson, R.J., et al., Science (1982) 218:381-384).

A. 3 3 ' - utranslatert- regionendringer

Plasmid pSVF8- 92C. Dette plasmidet er en variasjon av pSVF8-92B hvori den 92 kD-kodende regionen er innsatt direkte i det translasjonale stoppkodonet og de naturlige 3'-utranslaterte sekvensene i humanfaktor VIII:C cDNA. Dette plasmidet er et derivat av pSVF8-200.

Plasmid pSVF8- 92L. Dette plasmiet er et derivat av pSVF8-92C hvori den 3'-utranslaterte regionen i pSVF8-92C er erstattet med den 3'-utranslaterte regionen i pSVF8-80.

B. Resultater

Hvert av plasmidene i del A ble transfisert inn i C0S7-celler sammen med pSVF8-80 som beskrevet i eksempel 1 og mediene testet med henblikk på Faktor VIII:C-aktivitet som i eksempel 1.

pSVF8-92B, det første som ble testet, viste aktivitetsnivåer varierende fra 2- til 8-gangers bedring i forhold ti pSVF8-92. Av de gjenværende plasmidene viste pSVF8-92E seg å være best, idet det var 1,65-ganger bedre enn pSVF8-92B. pSVF8-92J og I ga også vesentlig høyere ekspresjonsnivåer enn pSVF8-92,

idet det ga et nivå nær det for pSVF8-92E. Ekspresjonsnivået for pSVF8-92G var omtrent det samme som pSVF8-92, mens det til pSVF8-92H var vesentlig mindre enn det for pSVF8-92. Ekspresjonsnivåene for både pSVF8-92C og pSVF8-92L viser seg å være lik det for pSVF8-92E.

Eksempel 3

Dette eksemplet beskriver fremstillingen av konstruksjonselementer for produksjon av polypeptider som består av 92 kD-tråden og en del av B-området. Disse derivatene ble foretatt i et forsøk på å utvikle en tung tråd som er mer stabil og/eller som på mer effektiv måte sammenføyer seg til et aktivt kompleks med den lette tråden. Derivatene ble valgt for å etterligne molekylære elementer som har blitt observert i plasmaavledede preparater av Faktor VIII:C og i celle-lysater og kondisjonerte media fra celler som uttrykker rekombinant Faktor VIII:C av full lengde. Disse kunne eventuelt oppnås ved trombinspaltninger av Faktor VIII:C av full lengde.

A. Fremstilling av ekspresjonsplasmider

A.l PSVF8- 92S

Dette plasmidet koder en tung 982 aminosyretråd og ble fremstilt fra et cDNA-plasmid pSVF8-302 av full lengde ved delvis spalting ved det første Sacl-setet i den B-område-kodende regionen. En oligonukleotid-adaptor ble benyttet for å installere et translasjonalt stoppkodon og sammenføye den kodende sekvensen med den naturlige humanfaktor VIII:C 3'-utranslaterte sekvensen som begynte ved det første Ball-setet. Dette plasmidet koder de første 978 aminosyrene i nativ humanfaktor VIII:C og fire substituerte aminosyrerester ved karboksy-terminusen.

A.2 PSVF8- 160

Dette plasmidet gir en tung 1323 aminosyretråd og ble fremstilt fra en klon av full lengde (betegnet pSVF8-303) lik pSVF8-200, men med den 5'-utranslaterte regionen til pSVF8-92E. pSVF8-303 ble spaltet med EcoRV og Smal, og de butte endene ble ligert for dannelse av pSVF8-160. Dette plasmidet koder de første 1315 aminosyrene i Faktor VIII:C. Åtte nonsens-aminosyrer ble tilføyet ved karboksyl-terminusen som et resultat av fusjonen av polylinkerene til vektoren pSVF7d.

A.3 PSVF8- 170

Dette plasmidet gir en tung 1416 aminosyretråd og ble også fremstilt fra pSVF8-303. pSVF8-303 ble delvis nedbrutt med Bglll, og det resulterende 6811 bp-fragmentet ble gelisolert og endene ligert sammen til dannelse av pSVF8-170. Dette plasmidet koder de første 1405 aminosyrene i Faktor VIII:C og har en karboksyl-utstrekning på 11 nonsens-aminosyrer på grunn av fusjon av polylinkeren i vektoren pSV7d.

A. 4 PSVF8- 120

Dette plasmidet gir en tung 1107 aminosyretråd og ble fremstilt fra pSVF8-303. Plasmidet pSVF8-303 ble nedbrutt med Apal og de kohesive endene ble ifylt med T4-polymerase. Det resulterende molekylet ble ytterligere nedbrutt med Smal, DNA'en selvligert og propagert i E. coli HB101. Dette plasmidet koder 1102 aminosyrer fra amino-terminusen i Faktor VIII:C pluss ytterligere fem nonsens-aminosyrer ved karboksylterminusen.

B. Resultater

Hvert av plasmidene i del A ble transfisert inn i C0S7-celler sammen med pSVF8-80 som beskrevet i eksempel 1 og mediene testet med henblikk på Faktor VIII:C-aktivitet som i eksempel 1.

Alle disse plasmidene viste vesentlig reduserte ekspresjonsnivåer sammenlignet med det som ble oppnådd for pSVF8-92E. Det er likevel interessant at forholdet for RIA- til Coatest-aktivitet for pSVF8-160 og pSVF8-170 er ca. 1,8, sammenlignet med 7,2 for pSVF8-92E. Dette resultatet tyder på at disse lengre tungkjedede derivatene har en høyere spesifikk aktivitet, dvs. de blir mer effektivt innsatt i aktive underenhetskomplekser enn selve 92 kD-molekylet. Forholdet for koaguleringsaktivitet til Coatest-aktivitet er også lavere for de lengre tunge kjedene ved ~1,7 sammenlignet med 2,3 for 92 kD og 1,35 for det fullstendige molekylet, hvilket antyder at disse lengre polypeptidene danner komplekser som ikke er så aktiverte som tilfellet er for 92 kD + 80 kD-komplekset.

Eksempel 4

Dette eksemplet beskriver fremstillingen av stabile CHO-cellelinjer som produserer Faktor VIII:C 92 kD-80 kD-tråd-komplekset.

CHO-DUKX-Bl-celler (Urlaub og Chasin, P.N.A.S. (1980) 77:4216-4220) ble kotransfisert med pSVF8-92C og pSVF8-92E, pSVF8-80 og pAd-DHFR under anvendelse av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden ifølge Graham og Van der Eb (op. sit.) og modifikasjoner beskrevet av Wigler et al., Cell (1978) 14:725:731 og Lewis et al., Somatic Cell Genetics (1980) 6:333-347. Plasmiet pAd-DHFR, som bærer det dhfr-genet, ble konstruert ved sammensmelting av hoved-senpromotoren fra adenovirus-1 (Ad-MLP, kartenheter 16-17,3) med dhfr cDNA fra mus ved 5'-enden. DNA'et som koder for intronet for SV40 t-antigen og SV40-tidligregion-polyadenyleringssetet ble oppnådd fra pSV2-neo (Southern og Berg, J. Mol. Appl. Genet.

(1982) 1:327-341) og sammensmeltet med 3'-enden i dhfr cDNA'en. Disse tre segmentene ble subklonet inn i pBR322 for oppnåelse av plasmid pAd-DHFR. Vektforholdet for plasmidene var henholdsvis 10:1:5 i pSVF8-92C-ko-transfeksjonen og 1:1:1 eller 10:10:1 i pSVF8-92E-kotransfeksjonene. I en av pSVF8-92C-transfeksjonene ble plasmidene nedbrutt med Pvul, som spalter utelukkende i p<->laktamase-genet til pBR322. I dette tilfellet ble lineære DNA-molekyler introdusert istedenfor superviklede molekyler. Media fra de resulterende DHFR-positive kloner ble analysert ved hjelp av ELISA og Coatest, som beskrevet ovenfor. Stabiliteten til positive kloner ble bedømt ved gjentatt passasje i T-75-kolber og analyse av mediene. Tabell 4 nedenfor angir ekspresjonsnivåene for de positive, stabile klonene fra den lineære DNA.

Primære kloner fra pSVF8-92C-gruppen ble oppbevart i T-75-kolber. Klon 11-D5 viste seg å være den høyest uttrykkende klon, idet den produserte > 90 mU/ml Coatest-aktivitet i T-75-kolbekulturer. Etter seks ukers passasje ble denne klon bragt under seleksjon i 0,025 pM, 0,05 pM, 0,1 jjM og 0,2 pM metotreksat. Kloner viste seg på 0,025 jjM platene, hvilket indikerer at DHFR-genene har forøket seg ved et lavt meto-treksatnivå.

Linjer 8-C1 og 10-C2 i pSVF8-92E-gruppen ble selektert i metotreksat (0,025 pM til 0,2 >jMa9 og resistente kloner ble analysert med henblikk på Faktor VIII:C-aktivet ved Coatest, RIA og ELISA. 22 metotreksat-resistente 8-Cl-kloner ble undersøkt, idet dataene for 10 av disse er angitt i tabell 5. Mengden av Faktor VIII:C-forøkelse varierer blant kloner hvilket antyder at enten en av underenhetsgenene kan ha blitt forøket med DEFR-kassetten, eller begge, eller ingen av dem. Merk kloner 8C1-A2, 8C1-A2, 8C1-C2 og 8C1-C5 som eksempler på disse fire mulighetene. Likeledes ble 30 metrotreksat-selekterte derivater av 10-C2 bedømt, og data for 20 av disse er også representert i tabell 5. Disse inneholder også et aktivitetsspektrum. Merk kloner 10C2-A2, 10C2-D2, 10C2-B5 og 10C2-C6 som eksempler på de fire forskjellige koforøkelses-mulighetene•

Plasmider pSVF8-92 og pSVF8-80 ble deponert ved the American Type Culture Collection (ATCC) den 24. januar 1986 og gitt ATCC aksesjonsnummeret 40222 og 40223, respektivt. Plasmid pSVF8-200 ble deponert ved ATCC den 17. juli 1985 og gitt ATCC aksesjonsnummer 40190.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et rekombinant proteinkompleks som har humanfaktor VIII:C-aktivitet, men mangler hele eller en del av B-området av humanfaktor VIII:C, karakterisert ved at man i trans i en eukaryotisk transformert vertscelle ko-uttrykker: (a) et første gen som koder en signalsekvens og et polypeptid omfattende minst 90 % av aminosyresekvensen av de N-terminale aminosyrene 1-740 i A-området i humanfaktor VIII:C, og eventuelt inkluderer en N-terminaldel i B-området av humanfaktor VIII:C; og (b) et annet gen som koder en signalsekvens og et peptid omfattende minst 90 % av aminosyresekvensen til aminosyrene 1649-2332 i C-området av humanfaktor VIII:C, hvor ikke mer enn 5$ av aminosyrene i nevnte aminosyresekvenser adskiller seg fra de naturlig forekommende aminosyre-sekvensene i faktor VIII:C A- og C-områdene; og utskiller det rekombinante proteinkomplekset, hvorpå prtoteinkomplekset isoleres.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen til polypeptidet kodet av det første genet er den samme som aminosyresekvensen til aminosyrene 1-1102 i humanfaktor VIII:C.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen til polypeptidet kodet av det første genet er den samme som aminosyresekvensen til aminosyrene 1-1315 i humanfaktor VIII:C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyresekvensen til polypeptidet kodet av det første genet er den samme som aminosyresekvensen til aminosyrene 1-1405 i humanfaktor VlllrC.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det første genet innbefatter et humanfaktor VIII:C 5'-initieringsområde som forøker ekspresjonen av polypeptidet kodet av det første genet.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at det første genet innbefatter et humanfaktor VIII:C 3'-termineringsområde som forøker ekspresjonen av polypeptidet kodet av det første genet.

7 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6, karakterisert ved at det første genet og det andre genet befinner seg i separate ekspresjonsplasmider.

8. Ekspresjonssystem som koder for og kan uttrykke et rekombinant proteinkompleks som har human faktor VIII:C-aktivitet, karakterisert ved at det omfatter to separate ekspresjonsplasmider, hvor det første ekspresjonsplasmidet omfatter et gen som koder for en signalsekvens og et peptid som omfatter minst 90 # av aminosyresekvensen til aminosyrene 1-740 i A-området av humanfaktor VIII:C og eventuelt en N-terminaldel i B-området av humanfaktor VIII:C, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er funksjonelle i en vertscelle, og hvor det andre ekspresjonsplasmidet omfatter et gen som koder for en signalsekvens og et peptid omfattende minst 90 % av aminosyresekvensen til aminosyrene 1649-2332 i C-området av humanfaktor VIII:C og ikke innbefatter B-området, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som er funksjonelle i nevnte vertscelle, idet ikke mer enn 5 ^ av aminosyrene i nevnte aminosyresekvenser adskiller seg fra de naturlige forekommende aminosyresekven-sene i faktor VIII:C A-og C-områdene.