NO168227B

NO168227B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av et naeringsmiddelfra en naeringsmiddelblanding.

Info

Publication number: NO168227B
Application number: NO854213A
Authority: NO
Inventors: Matti Siren
Original assignee: Perstorp Ab
Priority date: 1984-10-23
Filing date: 1985-10-22
Publication date: 1991-10-21
Also published as: DE3569188D1; ATE37788T1; GB8526080D0; AU582594B2; SE8503165L; SE8504969L; JPS61171789A; GB2167283B; FI854128L; FI854127A0; EP0179441A3; EP0179441A2; SE8504967L; EP0179440A1; IT1190403B; SE8405295L; FR2573080A1; SE8405295D0; JPH0338824B2; SE8503165D0

Description

Oppfinnelsen angår en analogifremgangsmåte til fremstilling av et næringsmiddel fra en naeringsmiddelblanding inneholdende opprinnelig mindre enn 10 mg inositoltrifosfat (IP3) pr. 100 g blanding. Nærmere bestemt blir innholdet av IP3 øket med minst 5 mg pr. 10 0 g blanding, fortrinnsvis til 50-500 mg pr. 100 g blanding.

Der er et økende behov for å motvirke eventuelle uheldige virkninger av vår sivilisasjon, f.eks. miljøfarer forårsaket ved tilførselen av farlige materialer, såsom tungmetaller, og stråling.

Der er også et behov for å motvirke farene forbundet med røking og andre dårlige vaner, ved utvikling av sunn kost og næringsmidler.

Så tidlig som i år 19 00 meldte forskere om oppdagelsen av den organiske fosfatforbindelse fytinsyre, dvs. 1,2,3,4,5,6-heksakis-(dihydrogenfosfat)-myo-inositol (iblant også kalt inositol-heksafosforsyre) i planter. Innholdet av fytinsyre i forskjellige planter varierer betraktelig. Innholdet i korn er vanligvis 0,5-2% med visse unntagelser. Polert ris har et nivå på bare 0,1%, mens vill ris inneholder så meget som 2,2% fytinsyre. Bønner inneholder 0,4-2%, oljeplanter 2-5% og pollen 0,3-2%. Innholdet av fytinsyre i planten varierer under vekstperioden. Innholdet påvirkes også av, blant annet, klimaet.

I litteraturen er nærværet av inositolpentafosfat (IP5) og inositoltetrafosfat (IP4) rapportert i noen få planter. Det er videre kjent at fosfatderivater lavere enn IPg dannes ved spiringen av korn. F.eks. er sluttproduktene ved spiringen inositol og fosfat. Bruken av IP5 er blitt beskrevet i flere vitenskapelige publikasjoner. De fleste forfattere av disse artikler har observert flere negative virkninger på mennesker og dyr ved konsumpsjon av IPg eller stoffer som inneholder IPg. Når hunder fQres med for stor mengde IPg, gir dette opphav f.eks. til rakitt. Hos mennesker har mangel på zink, og som en følge derav langsommere vekst hos barn, blitt observert. Anemi er blitt observert hovedsakelig hos kvinner. På grunn av de ovenfor angitte negative virkninger på mineralbalansen i mennesker og dyr, har forsøk hittil vært gjort for å redusere inntaket av IPg og dets derivater til et minimum.

Kadmium er også funnet å være skadelig for menneskers helse. Skjønt dette metall generelt foreligger i en liten mengde i vårt miljø, er mengden av kadmium som vi utsettes for avhengig av en rekke faktorer. Tilstedeværelsen av kadmium samt dens tilgjengelighet i jorden varierer blant forskjellige områder, med et forholdsvis høyt opptak i planter som vokser i områder med forholdsvis lav pH-verdi. Ved industriell aktivitet, hovedsakelig håndtering av metaller, kan kadmium avgis til luft, jord og vann. Kadmium i jordsmonnet absorberes av planter, og kan således komme inn i næringsinntaket til mennesker og dyr. De viktigste ruter for kadmiumeksponering er via røking, mat og til en viss grad drikkevann.

Kadmium absorberes hovedsakelig i tarmene og gjennom lungene, skjønt bare en liten del av kadmiumet i kosten absorberes. Det midlere kadmiumopptak via kosten er anslått til å være ca. 50 ug pr. dag i de fleste land, men varia-sjonen er stor blant de forskjellige geografiske områder, og blant enkeltpersoner. Data fra røkere viser at så meget som 50% av det inhalerte kadmium kan absorberes. Flere under-søkelser viser dobbelt så høye nivåer av kadmium i blod og organer hos røkere sammenlignet med ikke-røkere. Utskillelsen av kadmium fra det menneskelige legeme er langsom, og en halveringstid på 10-30 år er rapportert. Dette betyr at kadmium akkumuleres i legemet. Mesteparten, 80-90% av det akkumulerte kadmium, er bundet til et protein, metallotionein, hovedsakelig i leveren og nyrene. Dannelsen av metallotionein induseres ved metaller, særlig zink og kadmium. Bindingen av kadmium til metallotionein er meget sterk, og resulterer i en avgifting av kadmium. Det resterende kadmium foreligger i legemet, dvs. det som ikke er bundet til metallotioneiner er fordelt blant de andre organer 1 kroppen med forholdsvis høye nivåer i tarmene, lungene (særlig hos røkere), kretsløpet (hjerte, blodårevegger, milten) og kjertler såsom bukspyttkjertelen og prostata.

Blant de negative virkninger er det kjent at kadmium kan påvirke kroppens elastin/elastase-system. Det er også kjent at kadmium kan påvirke en rekke forskjellige enzymer i kroppen, f.eks. Na<+->, K<+->, (Mg<2+>)-ATP-ase og Ca<2+->, Mg<2+->ATP-ase, som er viktige i ionetransportsystemer. 'Ytterligere eksempler er cytokrom-P450-enzymer som hydrolyserer steroider, fettsyrer, aromatiske forbindelser og giftige forbindelser. Andre viktige enzymer som hindres av kadmium er glutationperoksidase og superoksiddismutase, som beskytter mot tilfeller av peroksidasjon. Zink-avhengige enzymer, såsom leucin-aminopeptidase, hindres også av kadmium.

Resultater fra et stort antall dyreeksperimenter over en rekke år viser negative virkninger selv ved meget lave nivåer av kadmium. Dette betyr at en stor del av befolkningen er påvirket på negativ måte, og dette er fremfor alt tilfelle for røkere. Epidemiologisk forskning viser en sammenheng mellom forekomsten av kreft, høyt blodtrykk og hjerte-karsykdommer (f.eks. arteriosklerose, hjerteinfarkt, plutselig død ved hjertesvikt) og tilstedeværelsen av kadmium i miljøet. Utsettelse for kadmium synes også å være en faktor som øker risikoen for aldersdiabetes.

Der er også foretatt undersøkelser som viser at kadmium kan ha negative virkninger på nyrer, lunger (fibrose, emfysem, kreft), veggene i blodkarene (fettavleiring, arteriosklerose, sammentrekning av veggene i blodkarene, elastisitet, skade på årenes innerhinne), prostacyklin-produksjon, prostata, hjerte (ledningssystemet, sammentrek-ningskraften), placenta, testikler og sentralnervesystemet. Kadmium kan også indusere dannelsen av frie radikaler og derved bevirke lipidperoksidasjon, som kan være viktig i opprinnelsen av andre sykdommer såsom reumatisme. Allergier og bronkitt kan også være forbundet med utsettelse for kadmium. Kjennskapet til den negative virkning av kadmium på mennesker og dyr har øket betraktelig i løpet av de seneste årtier.

En meget intensiv forskningsinnsats har vært gjort i en årrekke for å motvirke de ovenfor nevnte negative virkninger av tungmetaller, såsom kadmium, og de negative virkninger av frie radikaler som dannes på forskjellige måter, f.eks. ved metaller såsom jern, aluminium og kadmium, og ved stråling. Farene forbundet med røking har selvsagt også vært gjenstand for undersøkelse over en lang tid.

Det er mulig å unngå, eller i det minste avhjelpe de ovenfor nevnte negative virkninger som observeres hos dyr og mennesker, ved konsumpsjon av det spesielle inositolfosfat IP3. Oppfinnelsen skaffer en analogifremgangsmåte til fremstilling av et næringsmiddel fra en næringsmiddelblanding og hvor IP3~innholdet i den nevnte blanding økes med minst 5 mg IP3 pr. 100 g blanding. Generelt foretrekkes det å anvende IP3 i saltform. Det kan imidlertid også anvendes i syreform om ønskelig.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse fremstilles ved en analogifremgangsmåte et næringsmiddel med et øket innhold av IP3 fra en næringsmiddelblanding inneholdende opprinnelig mindre enn 10 mg IP3 pr. 100 g blanding. Denne økning av innholdet på minst 5 mg pr. 100 g blanding fortrinnsvis til 50-500 mg pr. 100 g blanding, oppnås ved enzymatisk nedbrytning til IP3 av opprinnelig inneholdt eller senere tilsatt inositolfosfat fra gruppen IP5, IP5 og IP4.

Svært ofte er IP3~innholdet minst 20 mg pr. 100 g blanding. Fortrinnsvis ligger innholdet av IP3 i området 5-500, helst i området 20-500, aller helst 50-500, 100-500 eller 150-500 mg IP3 pr. 100 g næringsmiddelblanding.

Blandingen kan anvendes som et tilsetningsstoff eller som et mellomproduktkonsentrat for å øke IP3~innholdet av andre næringsmiddelprodukter. I slike tilfeller bør innholdet av IP3 i det nevnte mellomliggende konsentrat være minst 20 mg pr. 100 g konsentrat. Vanligvis er imidlertid innholdet av IP3 i konsentratet meget høyere, fortrinnsvis 50 mg - 100 g og helst henholdsvis 75 mg - 80 g, 100 mg - 80 g, 150 mg - 60 g, 200 mg - 60 g, 250 mg - 50 g, eller 300 mg - 50 g pr. 100 g konsentrat. Fortrinnsvis bør innholdet av IP3 i konsentratet være så høyt som mulig.

Det mellomliggende konsentrat kan anvendes i mange forskjellige former, f.eks. som pulver, tabletter, kapsler og granuler. Det er imidlertid også mulig å anvende det i form av en væske, f. eks. en vandig oppløsning.

IP3 velges fortrinnsvis fra gruppen bestående av D-myoinositol-1.2.6-trifosfat, D-myo-inositol-1.2.5-trifosfat, myo-inositol-1.2.3-trifosfat, L-myo-inositol-1.3.4-trifosfat og D-myo-inositol-1.4.5-trifosfat og blandinger derav. Av disse isomerer foretrekkes D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat.

Ofte består 20-100, fortrinnsvis 40-100% av IP3-innholdet regnet på vekt av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat.

I henhold til en egnet fremgangsmåte for fremstilling av IP31 blir et material inneholdende IPg brutt ned enzymatisk med fytaseenzym. IPg kan skaffes enten som et rent materiale eller i form av en IPg-holdig kilde, såsom hvetekli. Fytaseenzym finnes f.eks. i planter, frø og mikroorganismer.

Ved den enzymatiske behandling av IPg finner der sted en hydrolyse som resulterer i en blanding av forskjellige lavere inositolfosfater, dvs. inositolpentafosfat (IP5), inositoltetrafosfat (IP4), inositoltrifosfat (IP3), inositoldifosfat (IP2) > og inositolmonofosfat (IPi).

Som regel blir hydrolysen utført ved en temperatur på 20-70°C og en pH-verdi på 4-8. Hydrolysen blir passende stoppet når frigjøringen av ca. 30-60% av det samlede esterfosfor er oppnådd. På dette trinn er en høy del av den eller de ønskede IP3~isomerer blitt dannet ved hydrolyse av det IPg-holdige materiale.

Blandingen av inositolfosfater som fås kan heretter separeres ved kromatografi for å isolere den IP3~holdige fraksjon. Fortrinnsvis utføres dette i en kolonne. Dersom IP3-fraksjonen inneholder mer enn 1 isomer, kan disse isomerer separeres i et annet etterfølgende kromatografisk separasj onstrinn.

IP3 kan fås som et salt eller som en syre derav. Saltformen foretrekkes, da den er lettere å produsere i ren og konsentrert form enn syren.

Saltformen av IP3-isomeren er lett oppnåelig fra syreformen ved bruk av standard fremgangsmåter. Således kan der fremstilles salter, såsom alkalimetall- og jordalkali-metall-salter, f.eks. litium, natrium, kalium, kalsium eller magnesium. Zinksaltene er imidlertid også meget nyttige, såvel som NH4<+-> og organiske amin-salter. Eksempler på aminer er trietanolamin, dietanolamin, triisopropanolamin, N,N-dimetyl-2-amino-2-metyl-l-propanol, N,N-dimetyletanolamin, tetrabutylamin og cykloheksylamin. Også andre salter kan anvendes. Særlig foretrukne salter er de som er fysiologisk godtagbare.

Fortrinnsvis har fordelingskurven som viser innholdet av de forskjellige inositolfosfater et maksimum og fortrinnsvis det eneste maksimum for IP3 som betyr at innholdet av IP3 er større enn IP2 og/eller IP4. Vanligvis er delen av IP3 minst 10% av den samlede mengde inositolfosfater.

Iblant har blandingen, foruten IP3, et innhold av IP4 og/eller inositoldifosfat (IP2)• I slike tilfeller består fortrinnsvis mer enn 40 vektprosent av den samlede mengde inositolfosfater i blandingen av IP3, mens 30-85 vektprosent av de resterende inositolfosfater består av IP2 pluss IP4. I en slik blanding kan IP3 bestå stort sett av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat. Imidlertid kan også andre IP3~isomerer, særlig de som er nevnt ovenfor, anvendes i et slikt matvareprodukt.

Avhengig av f.eks. formen av blandingen, kan IP3 foreligge i saltform eller i syreform. Syreformen anvendes vanligvis som en væske, fortrinnsvis en vandig oppløsning. I saltform kan IP3 anvendes som et tørt produkt eller alternativt som en væske, fortrinnsvis en vandig oppløsning.

Når IP3 foreligger som et salt, blir saltet generelt valgt fra gruppen angitt ovenfor.

Oppfinnelsen skaffer en fremgangsmåte til fremstilling av en næringsmiddelblanding, hvilket næringsmiddel er stort sett opprinnelig fritt for IP3. Fremgangsmåten omfatter tilsetning av en kilde av IP3 til blandingen i en mengde som er tilstrekkelig til å gi en endelig konsentrasjon på minst 5 mg IP3 pr. 100 g blanding.

Kilden for IP3 kan være IPq, IP5 og/eller IP4 i nærvær av fytase for enzymatisk produksjon av IP3. Alternativt kan den enzymatiske produksjon av IP3 utføres separat og det IP3-holdige produkt som fås, tilsettes næringsmiddelblandingen.

Uttrykket "opprinnelig stort sett fritt for IP3'<1>, skal bety at næringsmiddelblandingen som fremstilles på den vanlige måte ikke inneholder en vesentlig mengde IP3. Således vil innholdet av IP3 være mindre enn 3 mg, normalt mindre enn 2 mg og oftest under 1 mg pr. 100 g av blandingen.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte til fremstilling av en næringsmiddelblanding hvor der i materi-alene som utgjør blandingen etableres et innhold av fytase og av et inositolfosfat valgt fra gruppen bestående av inositoltetrafosfat (IP4), inositolpentafosfat (IP5), og inositolheksafosfat (IPg)/ og hvor på minst ett trinn i produksjons-prosessen tiden og temperaturen av behandlingen samt pH-verdien reguleres for å tillate en inkubasjon på en slik måte at et innhold av inositoltrifosfat (IP3) på minst 20 mg pr. 100 g blanding fås.

På det nevnte inkubasjonstrinn blir minst en porsjon av inositolfosfatet valgt fra IPg, IP5, og IP4 brutt ned enzymatisk til IP3 med fytaseenzym. Delen av det opprinnelige inositolfosfatinnhold som overføres til IP3, kan reguleres innen vide grenser ved variasjon av produksjonsparametrene, såsom inkubasjonstid, temperatur og pH-verdi som nevnt.

Fytaseenzym kan foreligge i planter eller frø, forutsatt at de har et innhold av inositolheksafosfat. På grunn av dette vil det i henhold til oppfinnelsen ikke være nødvendig i alle tilfeller å tilsette enzymet, dersom et plante- eller frøprodukt anvendes som startmateriale. I de tilfeller hvor det nevnte naturprodukt har for lav enzymatisk aktivitet, eller når IPg, IP5 eller IP4 eller en blanding av disse anvendes som startmaterial, kan et fytaseenzym, f.eks. fra kli, tilsettes.

Gjær kan med fordel anvendes som en kilde til fytase. Fortrinnsvis anvendes bakergjær.

Svensk bakergjær fremstilt av Jåstbolaget, Sverige, samt bakergjær fremstilt av Rajamåki, Finland, og Hefefabriken AG, Sveits, er f.eks. blitt brukt i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Når gjær anvendes i henhold til oppfinnelsen, er det meget overraskende brakt på det rene at stort sett bare én isomer fås, nemlig D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat. Selvsagt er bruken av gjær en meget nyttig fremgangsmåte dersom kun den nevnte isomer er ønskelig.

Under inkubasjonen finner der sted en hydrolyse ved en egnet temperatur, vanligvis 20-70°C, helst 30-60°C, og en pH-verdi på 4-8. For å stoppe hydrolysen på det planlagte nivå, kan enzymet ødelegges eller inaktiveres f.eks. ved hurtig oppvarming av det hydrolyserte startmateriale. . Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan modifi-seres på forskjellige måter, f.eks. avhengig av det startmateriale som velges. Startmaterialet kan f.eks.:

1. ha et visst innhold av IPg, IP5 og/eller IP4.

2. ikke ha noe innhold av IPg, IP5 eller IP4.

Ved det første alternativ ovenfor er der forskjellige muligheter for å oppnå en ønsket mengde IP3 i det endelige matvareprodukt. F.eks. kan den ovenfor angitte fremgangsmåte med hydrolysering av inositolfosfåtene til IP3 ved hjelp av fytase anvendes.

Dersom innholdet av IPg, IP5 og/eller IP4 ikke er tilstrekkelig høyt i startmaterialet, kan en tilsetning av dette gjøres. På denne måte kan lP3~innholdet av det endelige produkt økes.

Den ovenfor angitte fremgangsmåte kan anvendes også til produksjonen av et mellomprodukt med et ønsket innhold av IP3, hvilket produkt kan tilsettes til startmaterialet for næringsmiddelblandingen.

Mellomproduktet kan også innføres på et senere trinn i produksjonen av næringsmiddelproduktet.

Fremgangsmåter til fremstilling av IP3 og dets isomerer som sådann er angitt i søkerens ålment tilgjengelige norske patentsøknad nr. 85 42 12, og har tittelen "Inositoltrifosfat^

Ved det andre alternativ ovenfor, hvor startmaterialet ikke har noe innhold av IPg, IP5 eller IP4, kan et slikt inositolfosfat tilsettes sammen med fytase dersom fytase mangler. Deretter kan den ovenfor angitte hydrolysemetode igjen anvendes for å gi det ønskede innhold av IP3 i slutt-produktet .

Alternativt kan mellomproduktet angitt ovenfor settes til startmaterialet eller på et senere trinn i produksjonen av næringsmiddelblandingen.

Ved begge de to ovennevnte fremgangsmåter kan IP3 i konsentrert form tilsettes på et senere eller det endelige trinn i produksjonen av blandingen.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er der skaffet en fremgangsmåte til fremstilling av en næringsmiddelblanding hvor blandingen opprinnelig inneholder mindre enn ca. 10 mg IP3 pr. 100 g blanding, idet innholdet av IP3 økes til minst 20 mg pr. 100 g blanding ved tilsetning av IP3 eller en kilde for dette, eller omsetting av opprinnelig inneholdt inositolfosfat valgt fra gruppen bestående av IP5, IP5 og IP4 ved enzymatisk prosess. I en slik fremgangsmåte til fremstilling av en blanding i henhold til oppfinnelsen, kan blandingen med fordel være et kornprodukt-basert materiale, f.eks. frokost-cerealier, kaker, kjeks og brød. Blandingen kan også velges fra gruppen bestående av søtsaker, sjokolader og tyggegummier. Ofte kan med fordel blandingen også være en grønnsak, frukt, drikk, suppe eller et produkt basert på melk, f.eks. yoghurt.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen, hvor blandingen opprinnelig inneholder mindre enn ca. 20 mg IP3 pr. 100 g blanding, blir innholdet av IP3 øket til minst 50 mg pr. 100 g blanding på samme måte. I nok en utførelsesform av oppfinnelsen, hvor blandingen opprinnelig inneholder mindre enn ca. 50 mg IP3 pr. 10 0 g blanding, blir innholdet av IP3 øket til minst 100 mg pr. 100 g blanding på samme måte.

Innholdet av IP3 i blandingen kan varieres innen vide grenser. Det foretrekkes å ha et innhold av IP3 på 20-500, såsom henholdsvis 50-500, 100-500 eller 150-500 mg IP3 regnet på 100 g blanding. For bakeri-næringsmidler er området fortrinnsvis 20-500, henholdsvis helst 100-500 og aller helst 150-500 eller 200-500 mg IP3 pr. 100 g tørre bakeri-næringsmidler. Det daglige inntak, av IP3 er minst 10 mg, fortrinnsvis minst 50 mg.

Ved produksjonen av en væskeblanding i henhold til oppfinnelsen, kan også innholdet av IP3 varieres i stor utstrekning. Generelt ligger innholdet av IP3 i området 5-500, f.eks. 10-500, 20-500 eller 5-300 mg IP3 pr. 100 g flytende blanding. Den flytende blanding kan f.eks. være en leskedrikk eller suppe.

I henhold til oppfinnelsen kan der skaffes en næringsmiddelblanding hvor konsentrasjonen av IP3 er minst 20 mg pr. 100 g tørr blanding. Økningen av innholdet av IP3 er oppnådd ved tilsetning av fytase og et inositolfosfat valgt fra gruppen bestående av IP4, IP5 og IPg.

Anvendelse av næringsmiddelet fremstilt ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktig i bakeriprodukter. Således er der skaffet en bakeri-næringsmiddelblanding hvor konsentrasjonen av IP3 er minst 20 mg pr. 10 0 g tørr blanding, og graden av hydrolyse av naturlig inneholdt IPg og/eller tilsatt IPg er 20-90%, fortrinnsvis mellom 40 og 70%. Således er forholdet mellom uorganisk fosfor og den samlede mengde fosfor minst 20%, fortrinnsvis minst 40%. Ved en spesiell, bakeri-næringsmiddelblanding er det opprinnelige innhold av IP3 mindre enn 150 mg pr. 100 g blanding, og det opprinnelige innhold av IPg er mindre enn 200 mg pr. 100 g blanding. Innholdet av IP3 i den endelige blanding blir deretter øket ved nedbrytning av IPg.

IP3-isomerene angitt ovenfor har følgende formler:

D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat med formelen:

hvor X er hydrogen, minst ett enverdig, toverdig eller flerverdig kation, eller en blanding derav, n er antallet ioner, og 2 er ladningen på det aktuelle ion;

D-myo-inositol-1.2.5-trifosfat med formelen:

hvor X, n og z har samme betydning som angitt ovenfor; myo-inositol-1.2.3-trifosfat med formelen: hvor X, n og z har samme betydning som ovenfor; L-myo-inositol-1.3.4-trifosfat med formelen: hvor X, n og z har samme betydning som ovenfor; og D-myo-inositol-1.4.5-trifosfat med formelen:

hvor X, n og z har samme betydning som ovenfor.

I hver av de ovenfor angitte formler ligger n i området 6-1 og z i området 1-6. Fortrinnsvis ligger n i området 3-6 og z er 3, 2 eller 1.

Næringsmiddelet fremstilt i henhold til oppfinnelsen har god innvirkning på organismen på mange måter. Det er imidlertid først og fremst beregnet på å hindre eller avhjelpe de forhold som skapes, induseres eller fremmes ved tungmetaller, særlig kadmium, eller sykdommer relatert til slike tungmetaller.

Videre er det en hensikt at det fremstilte næringsmiddel skal ha en god virkning på røkere.

Som eksempler på forhold som den foreliggende blanding er beregnet for å hindre eller avhjelpe, kan nevnes høyt blodtrykk, hjerte-karsykdom, emfysem og øket blodplatesammenhopning. Blandingen har imidlertid en god virkning på mange andre tilstander også.

Oppfinnelsen er forklart ytterligere nedenfor i forbindelse med eksempler på utførelsesformer, hvor eksempel 1 og 2 angår et sammenligningsforsøk hvor en analyse av inositolfosfater i noen i handelen tilgjengelige brødsorter resp. frokostcerealier utføres. Eksempel 3-7 viser en fremgangsmåte til baking av brød i henhold til oppfinnelsen. Eksempel 8 angår fremstillingen av en kake bakt på hvetemel med tilsetningen av et kalsiumsalt av inositolfosfater. Eksempel 9 viser fremstillingen av frokost-cerealier etter tilsetning av et natriumsalt av inositolfosfater. Eksempel 10 viser fremstillingen av et bordsalt ved tilsetningen av natriumsaltet av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat.

Eksempel 11 viser fremstillingen av leskedrikker ved tilsetning av et natriumsalt av inositoltrifosfater. Eksempel 12 angår fremstillingen av honning ved tilsetning av et natriumsalt av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat. Eksempel 13 viser fremstillingen av sjokolade ved tilsetning av et natriumsalt av inositolfosfater. Eksempel 14 viser at i blod fra kaniner kan blodplatesammenhopning bevirket av en injeksjon av kadmium forhindres ved at der gis en diett inneholdende IP3. Eksempel 15 viser virkningen av IP3 på kadmiuminnholdet i forskjellige organer hos mus som hadde mottatt en injeksjon av kadmium. Eksempel 16 viser at IP3 hindrer en økning i blodplatesammenhopning forårsaket av røking. Eksempel 17 og 18 viser at IP3 hindrer eller reduserer dannelsen av frie radikaler. Eksempel 19-24 viser hydrolyse av fytinsyre i forskjellige næringsmiddelkilder. Eksempel 25-31 viser fremstillingen av IP3 og separasjonen av dette til forskjellige isomerer.

Eksempel 1

Analyse av inositolfosfater i noen i handelen tilgjengelige brød.

Tre i handelen tilgjengelige brød, et hvitt brød og to knekkebrød (crisp breads), ble analysert for innholdet av inositolfosfater med HPLC. Knekkebrødene var bakt på helt rugmel resp. helt hvetemel.

En mengde på 20 g av brødene ble malt og ekstrahert med 1% saltsyre i 2 timer ved rysting. Suspensjonen ble sentrifugert, og den ovenpåflytende væske ble samlet opp.

Den ovenpåflytende væske ble analysert med veldefinerte inositolfosfater, og resultatene ble kvantifisert som mg inositolfosfater pr. 100 g (faststoffinnhold).

Resultatene viser at mengden inositoltrifosfater i de i handelen tilgjengelige brød er lav.

Eksempel 2

Analyse av inositolfosfater i frokost-cerealier.

I handelen tilgjengelige Corn Flakes ®, Kellogs, ble analysert for innholdet av inositolfosfater med HPLC. Ekstråksjonsfremgangsmåten og analysen var de samme som beskrevet i eksempel 1. 19 mg IP2 og 2 mg IP3 pr. 100 g fast innhold ble funnet. Ikke noe IP4, IP5 eller IPg kunne påvises. Det IPg som forelå i råmaterialet var nesten fullstendig nedbrutt, og mengden av IP3 var meget lav.

Eksempel 3

Variasjon av gjæringsperioden for knekkebrød bakt på rugmel.

Biologisk syrnet knekkebrød ble bakt på rugmel (1% IPg-innhold). Deigresepten var: 54,6 g mel, 41,8 g vann, 1,3 g salt (NaCl) og 2,4 g av en deig fra en tidligere deigresept.

En surdeig bestående av de ovenfor angitte 2,4 g deig fra en tidligere deigresept og 40% av mengden av melet og 85% av mengden av vannet ble gjæret i et første trinn i 6 timer før blanding med de andre ingredienser (mel, vann og salt). Etter blanding ble deigen gjæret i et andre trinn før forming av brød og baking.. Ovns temperaturen var 250°C. Tre brød med tre forskjellige tider for den andre gjæringsperiode ble produsert. Brødene ble malt opp, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Innholdet av IP3 som funksjon av gjæringstiden ble bestemt som følger:

Resultatet viser at en øket andre gjæringsperiode førte til en reduksjon a-v IP3-innholdet.

Eksempel 4

IP3-innholdet i et brød bakt på hvete- og havremel.

Kjemisk syrnet brød ble bakt på en kombinasjon av hvete- og havremel (0,9% IPg-innhold).

Deigresepten var: 37,7% hvetemel, 17,7% havremel, 39,5% vann, 1,3% salt (50% NaCl og 50% kalsiumacetat). 1% sakkarose og 2,8% bakergjær.

Etter blanding av ingrediensene ble deigen gjæret før brødforming og baking. Gjæringsperioden var 90 minutter, og temperaturen var 37°C. Brødene som ble oppnådd ble malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Innholdet av IP3 ble funnet å være 120 mg pr. 100 g tørt brød.

Eksempel 5

IP3~innholdet i et brød bakt på helt hvetemel.

Et hvitt brød ble bakt på helt hvetemel (0,9% IPg-innhold). Deigresepten var: 55,9% mel, 38,4% vann, 3,5% gjær, 0,6% salt (NaCl) og 1,7% sakkarose.

Etter blanding av ingrediensene ble deigen gjæret før brødet ble formet. Etter en ytterligere gjæringsperiode ble brødet bakt. Den samlede gjæringsperiode var 60 minutter, og baketemperaturen var 17 5°C.

Brødet ble malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Innholdet av IP3 var 70 mg pr. 100 g tørt brød.

Eksempel 6

IP3~innholdet i et brød bakt på rugmel med tilsetning av natriumfytat.

Biologisk syrnet knekkebrød ble bakt på rugmel (1% IPg-innhold) som beskrevet i eksempel 3, men med den forskjell at 0,8 g natriumfytat ble satt til 100 g deig. Gjæringsperioden var 225 minutter.

Brødet ble malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Mengden av IP3 i brødet var 180 mg pr. 100 g tørt brød.

Eksempel 7

IP3~innhold i et brød bakt på rugmel med tilsetning av kalsiummagnesiumfytat.

Biologisk syrnet knekkebrød ble bakt på rugmel (1% IP5-innhold) som beskrevet i eksempel 3, men med den forskjell at 1,5 g kalsiummagnesiumfytat ble satt til 100 g deig. Gjæringsperioden var 225 minutter. Brødet ble malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Mengden av IP3 i brødet var 250 mg pr. 100 g tørt brød.

Eksempel 8

IP3~innhold i en kake bakt på hvetemel med tilsetning av et kalsiumsalt av inositolfosfater.

En kake ble bakt på hvetemel (0,2% IPg-innhold). Deigresepten var 60,1% hvetemel, 3 5,7% vann, 0,6% salt (NaCl) og 3,6% gjær.

Etter blanding av ingrediensene ble deigen gjæret. 0,2 g av et kalsiumsalt av inositolfosfater inneholdende 30 vektprosent IP3 ble satt til i 10 ml vann pr. 100 g deig før kaken ble formet. Etter en ytterligere gjæringsperiode ble kaken bakt i ovnen. Den samlede gjæringstid var 7 5 minutter, og baketemperaturen var 225°C.

Kaken ble malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Mengden av IP3 var 60 mg pr. 100 g tørr kake.

Eksempel 9

IP3~innhold i frokost-cerealier etter tilsetning av et natriumsalt av inositolfosfater.

1000 g i handelen tilgjengelige Corn Flakes ®, Kellogs, ble sprayet med 100 ml varm (80°C) vandig oppløsning inneholdende 50% sakkarose og 10% av et natriumsalt av inositol-fosf ater (inneholdende 30% IP3). Etter tørking ble frokost-cerealiene malt, ekstrahert og analysert som beskrevet i eksempel 1. Innholdet av IP3 var 30 mg pr. 100 g tørt materiale.

Eksempel 10

Bordsalt med tilsetning av natriuminositoltrifosfat.

Natriumsaltet av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat ble blandet med bordsalt på en slik måte at en endelig konsentrasjon på 200 ppm IP3 ble oppnådd.

Eksempel 11

Leskedrikker med tilsetning av et natriumsalt av inositolfosfater.

20 ml av en 15% vandig oppløsning av et natriumsalt av inositolfosfater (inneholdende 40% IP3) ble satt til 5 1 av i handelen tilgjengelig henholdsvis Coca-Cola ®, Seven-Up ® og appelsinjuice. Den endelige konsentrasjon av IP3 i leske-drikkene ble funnet ved HPLC å være 190 mg/l.-

Eksempel 12

Honning med tilsetning av et natriumsalt av inositoltrifosfater. 5 ml av en 20% vandig oppløsning av natriumsalt av D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat ble satt til 50 kg i handelen tilgjengelig honning. Sluttkonsentrasjonen av inositoltrifosfat ble funnet ved HPLC å være 20 mg/kg.

Eksempel 13

Sjokolade med tilsatt IP3.

Til 1500 g smeltet sjokolade ble 6 ml av en 10% vandig oppløsning av et natriumsalt av inositoltrifosfater (inneholdende 30% IP3) tilsatt før senking av temperaturen og dannelse av det endelige sjokoladeprodukt. Innholdet av IP3 i sjokoladen var 110 mg pr. kg sjokolade som bestemt ved HPLC.

Eksempel 14

Kaniner (New Zealand, hvite, hanner) med vekt 2-2,5 kg ble brukt. De ble matet med en diett som var fri for inositolfosfater i 10 dager før eksperimentet. 2 timer før starten av eksperimentet ble 5 0 mg av et natriumsalt av myo-inositol-1.2.6-trifosfat blandet inn i 5 g av dietten for en gruppe på 18 dyr. En annen gruppe med 12 dyr fikk ingen tilsetning av inositoltrifosfat.

Tid: Behandling

0 minutter: Blodprøve 1 (9 ml + 1 ml 3,8% natrium-citrat) ble tatt.

1 minutt: Intravenøs injeksjon av henholdsvis 4 mikrogram Cd som CdCl2 i 0,5 ml fysiologisk saline eller 0,5 ml fysiologisk saline. 4 minutter: Blodprøve 2 (9 ml + 1 ml 3,8% natrium-citrat) ble tatt.

Behandling av prøvene

De to blodprøver fra hvert dyr ble sentrifugert ved 1200 omdreininger pr. minutt i 10 minutter, og plasmaet med blodplatene ble oppnådd.

Plasmaet med blodplatene fra de to prøver ble analysert med hensyn til reaksjonen på tilsetning av ADP (adenosindi-fosfat) i et aggregometer (Chronopar Corp Mod, 440) i henhold til Born (J. Physiol: 67, 1968). De to prøver ble analysert samtidig ved samme konsentrasjon (1-20 mikromolar) av ADP i de to kanaler på instrumentet.

Prinsippet med denne test er at plasmaet med blodplater er grumset og har lav transmisjon for lys. Etter hvert som ADP tilsettes, aggregerer blodplatene og danner klumper. Dette fører til en økning av transmisjonen som kan måles kvantitativt av instrumentet. Reaksjonen på ADP ble målt i skalaenheter, idet 80 skalaenheter representerer maksimal aggregasjon. For at metoden skal ha maksimal følsomhet med hensyn til å oppdage forandringer i blodplatereaktivitet, bør ADP-dosen bevirke en reaksjon på 5-3 0 skalaenheter. Dette ble normalt oppnådd ved 5 uM ADP, men for noen dyr var en lavere eller høyere dose (1-20 uM) nødvendig.

Resultatene av forsøket er uttrykt som maksimal aggregasjon i prøve 2 (skalaenheter) minus maksimal aggregasjon i prøve 1.

De følgende resultater ble oppnådd:

Ved den dose som ble brukt i dette forsøk, hindret IP3 virkningen av Cd på blodplateaggregasjon.

En økning i blodplateaggregasjon anses som en av de viktigste faktorer som forårsaker hjerte-karsykdommer, f.eks. arteriosklerose, og evnen av IP3 til å hindre aggregasjonen indusert ved kadmium viser at IP3 er meget nyttig for å hindre eller avhjelpe slike sykdommer.

Eksempel 15

Mus som veide 18-20 g ved begynnelsen av forsøket ble brukt. Under forsøket og i minst 7 dager før forsøket ble musene matet med en halvsyntetisk diett fri for inositol-fosf ater. Musene ble deretter delt i to grupper.

De mottok daglig intreperitoneale injeksjoner av henholdsvis fysiologisk saline og inositoltrifosfat (IP3) i 9 dager. Dosen for IP3 var 5,0 mg pr. dag. Det injiserte volum var 0,2 ml.

På dag 2 for eksperimentet, 5-10 minutter etter den andre intraperitoneale injeksjon, fikk alle musene en intravenøs injeksjon på 2,5 mikrocurie på <10>^cd av kadmium-klorid i 50 ul saline. Etter den siste intraperitoneale injeksjon ble musene drept, og flere organer ble dissekert ut og veid.

Radioaktiviteten i de forskjellige organer ble målt ved telling med en gammateller. Radioaktiviteten i organene hos de IP3~behandlede dyr ble sammenlignet med radioaktiviteten for sammenligningsdyr som var blitt behandlet med saline over det samme tidsrom. I resultatene er radioaktiviteten i organene av dyrene behandlet med IP3 uttrykt som prosent av radioaktiviteten funnet i sammenligningsgruppen. Resultatene var som følger: Organnivået hos mus behandlet med kadmium og IP3 som prosent av sammenligningsnivåer (sammenligningsprøver = 100). 15 mus i hver gruppe. Sammenligningsgruppen var blitt behandlet med saline og Cd som angitt.

Resultatene viser at IP3 bevirket en reduksjon i kadmiumnivået i alle organer som ble undersøkt, bortsett fra lever og nyre, idet det antas at kadmiumet sitter forholdsvis trygt på de sistnevnte steder.

Eksempel 16

Virkningen av IP3 på blodplateaggregasjon etter røking hos mennesker ble undersøkt. 4 unge, friske mannlige ikke-røkere mottok ved to anledninger en kapsel inneholdende 50 mg IP3 eller 50 mg av en placebo. Det IP3 som ble anvendt var Ca-saltet av D-myoinositol-1 . 2 . 6-trif osf at . Hverken forsøkspersonen eller forskeren visste hvorvidt forsøkspersonen hadde mottatt IP3 eller placebo.

To timer etter inntak av kapselen ble en blodprøve tatt. Forsøkspersonen røkte deretter to sigaretter i hurtig rekkefølge. En andre blodprøve ble tatt etter røking. Aggregasjonsreaksjonene av blodplatene overfor ADP og kollagen i de to prøver ble bestemt ved bruk av stort sett den samme fremgangsmåte som i eksempel 14. Resultatene er uttrykt som forandring i aggregasjon fra prøven før røking til prøven etter røking. Et positivt tegn angir at aggregasjonen var sterkere etter røking.

I placebo-gruppen bevirket røking en økning i aggregasjonen som var sterkest markert ved lave konsentrasjoner av aggregasjonsmidler. I alle tilfeller ble denne virkning motvirket av IP3. Således hindrer IP3 økning av blodplate-aggregas jon forårsaket ved røking.

Eksempel 17

En reaksjonsblanding bestående av 48 mmol KH2PO4,

2 mmol Na-askorbat, 0,1 mmol H2O2. 0,5 mmol Fe og 1,7 mmol deoksyribose ble inkubert ved 37°C i en time. Lignende reaksjonsblandinger som innbefattet EDTA 1 mmol eller inositoltrifosfat (IP3) 1 mmol ble inkubert på lignende måte. Det IP3 som ble anvendt var D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat.

Etter inkubering ble 1,65 ml tiobarbitursyre i 50 mmol NaOH og 1,65 ml 2,8% trikloreddiksyre satt til 2 ml av reaksjonsblandingen. Blandingen ble varmet opp til 100°C i 20 minutter, og absorbansen ved 5 32 nm ble målt med vann som en blindprøve.

Eksperimentene ble utført med jern i form av Fe<2+>

(Fe(NH4)SC>4) og Fe<3+> (Fe CI3) . Resultatene var som følger:

Produksjon av frie radikaler katalysert ved Fe<2+> og Fe<3+> i nærvær av IP3 eller EDTA, uttrykt som absorbans ved 532 nm.

Disse resultater viser at dannelsen av frie radikaler i reaksjonsblandingen ble redusert med 40% etter tilsetning av IP3. Tilsetningen av EDTA hadde en motsatt virkning. Den øket i høy grad produksjonen av frie radikaler. Således er det vist at IP3 reduserer den jern-avhengige dannelse av frie radikaler.

Eksempel 18

Lipidperoksidasjon ble undersøkt i lipid-miceller. Den følgende reaksjonsblanding ble inkubert i 2 timer ved 37°C:

0,4 ml Clark-Lubs buffer pH 5,5

0,2 ml fosfolipidliposomer

0,1 ml IP3 0,5-5 mM eller 0,1 ml H20

0,1 ml Fe<2+> 1 mM eller 0,1 ml H20

0,1 ml Al<3+> 4 mM eller 0,1 ml H20

0,1 ml H20

IP3 var D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat. Etter inkubering ble 0,5 ml tiobarbitursyre + 0,5 ml 25% HC1 tilsatt, og blandingen ble varmet opp ved 100°C i 15 minutter. 1 ml Lubrol PX 1% (Sigma) ble tilsatt, og lipidperoksidasjonen ble målt ved måling av absorbansen ved 523 nm. Resultatene var som følger:

Fe2 + bevirket lipidperoksidasjon (gruppe 1 versus 10). Al<3+> i seg selv bevirket ingen peroksidasjon (2 versus 10), mens kombinasjonen av Fe<2+> og Al3 + bevirket meget sterkere peroksidasjon enn Fe<2+> alene (1 versus 3). Tilsetning av IP3 hindret fullstendig interaksjonen mellom Fe<2+> og Al3 + (3 versus 4). I systemer med bare Fe<2+> bevirket IP3 markert reduksjon i radikaldannelsen (1 versus 5-9).

Eksempel 19

Hydrolyse av fytinsyre i hvete, ekstraksjon og analyse av IP3.

Malte hvetekorn, 100 g inneholdende 1% myo-inositolheksafosfat IP5 ble inkubert i 1000 ml natriumacetat-buffer ved pH 5,2 ved 35°C. Etter en inkubasjonsperiode på 30 minutter ble oppslemmingen frosset til -10°C for å stoppe hydrolysen. 10 g av det frosne materiale ble ekstrahert med 100 ml 0,4 M HC1. Suspensjonen ble ristet i 1 time, og deretter sentrifugert. Den ovenpåflytende væske ble samlet opp og nøytralisert til pH 7 med en vandig oppløsning av NaOH. En prøve av den ovenpåflytende væske ble analysert med HPLC. Analysemetoden ble kalibert med veldefinerte inositolfosfater. IP3~innholdet av ekstraktet var 10 mg inositoltrifosfat.

Eksempel 20

Hydrolyse av fytinsyre i hvite bønner, ekstraksjon og analyse av IP3.

Den samme metode ble anvendt som beskrevet i eksempel 19, men med den unntagelse at 100 g hvite bønner inneholdende 1% myo-inositolheksafosfat ble inkubert ved 55°C i 10 timer. 10 g av det frosne materiale ble ekstrahert med 100 ml 0,4 M HC1. Suspensjonen ble ristet i 1 time, og deretter sentrifugert. Den ovenpåflytende væske ble samlet og nøytralisert til pH 7 med en vandig oppløsning av NaOH. En prøve av den ovenpåflytende væske ble analysert med HPLC. IP3~innholdet av ekstraktet var 5 mg inositoltrifosfat.

Eksempel 21

Hydrolyse av fytinsyre i soyabønner etter tilsetning av en fytasekilde fra mikroorganismer, ekstraksjon og analyse av

300 g soyabønner ble bløtet over natten (1,4% IPg-innhold), skrellet og deretter kokt i 30 minutter. 3 ml vann inneholdende ca. lg Rhizopus oligosporus, NRRL 2710 ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 40°C i 20 timer. 10 g av blandingen ble ekstrahert og analysert ved HPLC som beskrevet i eksempel 19. IP3~innholdet av ekstraktet var 160 mg.

Eksempel 22

Hydrolyse av fytinsyre i hvite bønner med rå hvetefytase, ekstraksjon og analyse av IP3.

Malte bønner, 10 0 g, inneholdende 1% myo-inositolheksa-fosf at, ble suspendert i 1000 ml natriumacetat-buffer ved pH 5,2. 500 mg rå hvetefytase (fra Sigma Chemical Co.) ble tilsatt. Blandingen ble inkubert ved 55°C ved risting. Etter en inkubasjonsperiode på 12 timer ble oppslemmingen frosset til -10°C for å stoppe hydrolysen.

10 g av det frosne materiale ble ekstrahert med 100 ml 0,4 M HC1. Suspensjonen ble ristet i 1 time, og deretter sentrifugert. Den ovenpåflytende væske ble samlet opp og nøytralisert til pH 7 med en vandig oppløsning av NaOH. En prøve av den ovenpåflytende væske ble analysert med HPLC. IP3~innholdet av ekstraktet var 40 mg IP3.

Eksempel 23

Innholdet av IP3 i hvite bønner etter tilsetning av natriumfytat og hydrolyse.

0,3 g natriumfytat ble satt til 100 g malte, hvite bønner (1% IPg). Blandingen ble inkubert i 1000 ml natriumacetat-buffer ved pH 5,2 ved 5 5°C. Etter en inkubasjonsperiode på 4 timer ble oppslemmingen frosset til -10°C for å stoppe hydrolysen. 10 g av det frosne materiale ble ekstrahert og analysert ved HPLC som beskrevet i eksempel 19. IP3-innholdet av ekstraktet var 15 mg IP3.

Eksempel 24

1 kg riskli inneholdende ca. 1% inositolheksafosfat (IPg) ble suspendert i 10 1 natriumacetat-buffer ved pH 5 ved 25°C. Etter 4 timer, når 50% uorganisk fosfor var blitt frigjort, ble oppslemmingen ekstrahert med en tilsetning av 1 1 2 M HC1. Suspensjonen ble ristet i 1 time, og deretter sentrifugert. Den ovenpåflytende væske ble nøytralisert til pH 7 med en vandig oppløsning av Ca(0H)2- En bunnfelling ble oppnådd når 5 1 etanol ble tilsatt. Kalsiumsaltet bestående av en blanding av forskjellige inositolfosfater ble sentrifugert, tørket og rekrystallisert. 20 mg av det rekrystalli-serte kalsiumsalt ble omdannet til syreformen ved tilsetning av fortynnet saltsyre,.og ble analysert ved HPLC. Blandingen besto av 20% inositoltrifosfat. Resten besto av andre inositolfosfater.

Eksempel 25

Hydrolyse av natriumfytat med hvetefytase, og fraksjonering av en blanding av inositolfosfater.

En mengde på 1,6 g natriumfytat (fra mais, Sigma Chemical Co.) ble oppløst i 650 ml natriumacetat-buffer, pH 5,2. 2,7 g hvetefytase (EC 3.1.3.26, 0,015 U/mg, fra Sigma Chemical Co.) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 38°C.

Defosforyleringen ble fulgt ved bestemmelse av det uorganiske fosfor som ble frigjort. Etter 3 timer, når 50% uorganisk fosfor var frigjort, ble hydrolysen stoppet ved tilsetning av 30 ml amoniakk til pH 12. En flytende blanding inneholdende inositolfosfater ble oppnådd.

350 ml av blandingen ble fort gjennom en ionevekslerkolonne (Dowex 1, kloridform, 25 mm x 250 mm), og eluert med en lineær gradient av saltsyre (0-0,7 N HC1). Porsjoner av eluerte fraksjoner ble fullstendig hydrolysert for å bestemme innholdet av fosfor og inositol. Toppene svarer til forskjellige inositolfosfater, dvs. en topp med forholdet mellom fosfor og inositol lik 3 til 1, består av inositoltrifosfat etc. To fraksjoner med forholdet mellom fosfor og inositol lik 3 til 1 ble oppnådd.

Eksempel 26

Fraksjonering av inositoltrifosfater.

100 ml av den første fraksjon som ble oppnådd i eksempel 25 med et fosfor/inositol-forhold på 3 til 1 ble nøytralisert og utfelt som et bariumsalt etter tilsetning av et overskudd på 10% av 0,1 M bariumacetat-oppløsning. 600 mg av det utfelte salt ble oppløst i 50 ml 0,18 M saltsyre. Oppløsningen ble separert på en ionevekslerkolonne (Dowex 1, kloridform, 25 mm x 2500 mm) med fortynnet saltsyre som elueringsmiddel. Porsjoner av eluerte fraksjoner ble analysert for fosfor. Tre topper bestående av isomerer av inositoltrifosfater kan ses.

Eksempel 27

Strukturell bestemmelse av isomerer av inositoltrifosfater med NMR.

De tre topper som ble oppnådd i eksempel 26 ble analysert ved H-NMR. Dataene viser at toppene består av henholdsvis myo-inositol-1.2.6-trifosfat, myo-inositol-1.2.3-trifosfat og myo-inositol-1.3.4-trifosfat.

Den andre fraksjon som ble oppnådd i eksempel 25 med et fosfor/inositol-forhold på 3 til 1 ble analysert ved H-NMR. Dataene viser at fraksjonen består av myo-inositol-1.2.5-trifosfat.

Eksempel 28

Bestemmelse av optiske isomerer av inositoltrifosfat. 20 mg av forbindelsene som, i henhold til eksempel 27 ved NMR var funnet å være myo-inositol-1.2.6-trifosfat, og myo-inositol-1.3.4-trifosfat ble ytterligere kromatografert på en chiralkolonne basert på acetylert cellulose (20 mm x 300 mm fra Merck) med en blanding av etanol og vann som elueringsmiddel. Fraksjonene ble analysert med et polari-meter. Som det kan ses, består hver forbindelse av en optisk isomer, henholdsvis D-myo-inositol-1.2.6-trifosfat, og L-myoinositol-1.3.4-trifosfat.

Eksempel 29

Hydrolyse av natriumfytat med bakergjær, og fraksjonering av en blanding av inositolfosfater.

En mengde på 0,7 g natriumfytat (fra mais, Sigma Chemical Co.) ble opplost i 600 ml natriumacetat-buffer, pH 4,6. 50 g bakergjær fra Jåstbolaget, Sverige (tørt materiale: 28%, nitrogeninnhold: 2%, fosforinnhold: 0,4%), ble tilsatt med omrøring, og inkubasjonen ble fortsatt ved 45°C. Defosforyleringen ble fulgt ved bestemmelse av det uorganiske fosfor som ble frigjort. Etter 7 timer, når 50% uorganisk fosfor var frigjort, ble hydrolysen stoppet ved tilsetning av 30 ml amoniakk til pH 12. Suspensjonen ble sentrifugert, og den ovenpåflytende væske ble samlet opp.

400 ml av den ovenpåflytende væske ble ført gjennom en ionevekslerkolonne (Dowex 1, kloridform, 25 mm x 250 mm) og eluert med en lineær gradient av saltsyre (0-0,7 N HC1).

Porsjoner av eluerte fraksjoner ble fullstendig hydrolysert for å bestemme innholdet av fosfor og inositol. Toppene svarte til forskjellige inositolfosfater, dvs. en topp med forholdet mellom fosfor og inositol på 3 til 1 består av inositoltrifosfater etc.

Eksempel 3 0

Strukturell bestemmelse av isomerer av inositoltrifosfat.

Fraksjonen oppnådd i eksempel 29 med, et fosfor/inositol-fbrhold på 3 til 1 ble nøytralisert og fordampet før analyse med H-NMR. Dataene viser at toppen består av myoinositol-1 .2.6-trifosfat.

Eksempel 31

Bestemmelse av optiske isomerer av myo-inositoltrifosfat.

Den samme fremgangsmåte ble brukt som beskrevet i eksempel 28, med den forskjell av 10 mg av forbindelsen bestemt med NMR i henhold til eksempel 30, ble analysert. Som det kan ses, består forbindelsen av én optisk isomer, D-myoinositol-1 .2.6-trifosfat.

For å gi en ytterligere forståelse av oppfinnelsen, er der nedenunder angitt formler for noen av IP3~isomerene ifølge oppfinnelsen. Formler er også gitt for IP5, IP5, IP4 og IP2.

De lavere fosfatestere av myoinositol er navngitt avhengig av hvor fosforsyregruppene er plassert på inositol-ringen, med en nummerering som gir så lave posisjonstall som mulig. L og D står for telling, henholdsvis med og mot urviseren, og brukes avhengig av hvilket resultat som gir det laveste posisjonstall. Det karbonatom som har en aksial fosforsyregruppe, har alltid posisjonstallet 2. Struktur-formlene nedenunder er forenklet til syreformen.

Claims

1. Analogifrenigangsmåte til fremstilling av et næringsmiddel fra en næringsmiddelblanding inneholdende opprinnelig mindre enn 10 mg inositoltrifosfat (IP3) pr. 100 g blanding, karakterisert ved at innholdet av IP3 økes med minst 5 mg pr. 100 g blanding, fortrinnsvis til 50-500 mg pr. 100 g blanding, ved enzymatisk nedbrytning til IP3 av opprinnelig inneholdt eller senere tilsatt inositolfosfat fra gruppen IPg, IP5 og IP4.

2. Analogifremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at at der som kilden for IP3 anvendes inositolheksafosfat (IPg), inositolpentafosfat (IP5) og/eller inositoltetrafosfat (IP4) i nærvær av fytase.

3. Analogifremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at fytasen tilsettes i form av gjær.

4. Analogifremgangsmåte som angitt i krav 2 eller 3, karakterisert ved at et innhold av fytase og et inositolfosfat valgt fra gruppen IP4, IP5 og IPg tilveie-bringes i de materialer som utgjør blandingen, og at tiden og temperaturen av nedbrytningen samt pH-verdien reguleres på minst ett trinn av fremstillingsprosessen for å tillate en slik inkubasjon at der fås en hydrolyseringsgrad av IP4, IP5 og/eller IPg på 40-70 % og/eller et innhold av IP3 på minst 20 mg pr. 100 g blanding.

5. Analogifremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved at inkubasjonen utføres separat, og at det IP3~holdige produkt som fås, tilsettes blandingen for oppnåelse av det ønskede IP3~innhold.

6. Analogifremgangsmåte som angitt i krav 4 eller 5, karakterisert ved at temperaturen innstilles i området 20-70°C og pH-verdien i området 4-8 i inkuba-sjonstrinnet.