NO166943B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av enzymresistente immunomodulerende peptider. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt fremstilling av nye immunomodulerende peptider, mer spesielt slike peptider som har forbedret resistens mot enzymatisk nedbrytning i kroppen.

US patentene 4.190.646 og 4.261.886 beskriver forskjellige pentapeptider med en aktivitet som ligner på den man finner i det langkjedede polypeptid kjent som tymopoietin og beskrevet i US-patentene 4.002.740 og 4.077.949. Den biologiske aktiviteten for enkelte av disse peptider er beskrevet i en artikkel av M. E. Weksler et al., J. Exp. Med. 148:996-1006 (1978). EP patentsøknad, publ. nr. 25.897, og US

patent 4.361.673 beskriver også forskjellige peptider med en aktivitet som tilsvarer den man finner for tymopoietin. Tymopoietin III, også kjent som "splenin" er et tilsvarende peptid som er isolert fra storfemilt. Audhya et al., Bio-chemistry, 20, 6195-6200 (1981). Denne forbindelsen stimulerer induksjon av både T-celler og B-celler.

Selv om de kjente peptider kan brukes p.g.a. sin immunomodulerende aktivitet, så har man funnet at de raskt øde-legges av enzymer både in vitro og in vivo etter tilførsel til dyr eller mennesker. Se f.eks. Int. J. Pept. and Protein Res., 14, 479-484, ibid, 22:187-193 (1983).

Peptider av den type som læres i EP-patentsøknader publ.

nr. 18182 og 37.246, og som sammenlignet med forbindelsene som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse, har nær-liggende struktur, og lignende terapeutisk virkning, blir også hurtig ødelagt av enzymer både in vitro og in vivo,

og er derfor mindre ønskelige for effektiv terapeutisk bruk.

I motsetning til dette er peptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, resistente overfor slik enzymatisk nedbrytning, kfr. delen umiddelbart foran tabell 1 i det nedenstående samt tabellene 1-3 som illustrerer den overlegne stabiliteten som innehas av peptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, og videre vises det til eksempel XXI, induksjonsanalyse. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer peptider og peptid-sammensetninger som er mer resistente enn tidligere kjente peptider overfor enzymatisk nedbrytning i kroppen, og som følgelig har langt høyere terapeutisk verdi.

De nye enzymresistente immunomodulatorpeptidene som fremstilles ifølge oppfinnelsen, har formelen:

eller et farmasøytisk akseptabelt syre- eller baseaddisjonssalt derav, hvor: R er H, NH2, R2-NH2 eller CH^NH hvor R<2> er en laverealkyl-gruppe eventuelt substituert med karboksyl,

W er PRO eller dehydro PRO;

A er laverealkyl;

B individuelt er H dersom A er C^-Cg laverealkyl og er ellers Cj-C^ laverealkyl;

A og B sammen danner -(CB^J^- eller -(CI^Jc;- ;

X er D-ASP, ASP, D-GLU eller GLU;

Y er GLY, VAL, PHE, ILE, LYS, GLN, GLU eller ALA; E er H eller C^- C^ laverealkyl;

R" individuelt er H eller laverealkyl;

forutsatt at V kan være D- eller L-isomer dersom R er forskjellig fra H, og videre forutsatt at ikke mer enn en av V, X og Y er en D-aminosyre.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles peptidene

med formel (I) ovenfor ved at det utføres oppløsnings-peptidsyntese innbefattende trinnvis kobling eller blokk-kobling av aminosyrer eller peptidfragmenter som inneholdes i den ovenfor angitte formel, og nevnte fragment festes ved dannelse av amidbindinger derimellom og, om ønsket, et således oppnådd peptid omdannes til et farmasøytisk akseptabelt syre- eller baseaddisjonssalt derav.

Når R er forskjellig fra H, så kan V opptre i D- eller L-form. Både D- og L-formen av Z inngår også i foreliggende oppfinnelse. Hvis A og B er forskjellig, så kan man ha optiske isomerer for denne verdien av W; og både D- og L-isomeren inngår i foreliggende oppfinnelse, skjønt L-isomeren er foretrukket.

Man har overraskende funnet at peptidene med formel (I) har tymopoietin-lignende eller splenin-lignende aktiviteter, og p.g.a. et nærvær av gruppen W i stilling 2, så er de resistente overfor angrep av både endo- og ekso-peptidaser og trypsin-lignende enzymer i serum.

Foretrukne peptider er de med formel (I), hvor R er acyl-NH, og W er PRO. Mer foretrukne peptider er de méd formel (I) hvor R-V er acyl-ARG, W er PRO, X er ASP eller GLU, Y er GLY eller en L-aminosyre som definert tidligere, Z er TYR eller D-substituert TYR, og R<1> er OH eller NH2. Enda mer fore-

trukne peptider er de med formel (I) hvor R-V er.acetyl-

ARG, W er PRO, X er ASP eller GLU, Y er GLY eller en L-aminosyre som definert tidligere, Z er TYR eller D-substituert TYR, og R i er NH2- Det mest foretrukne peptid er N-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2.

Med begrepet "laverealkyl" forstås forgrenede og rettkjedede mettede hydrokarboner med 1-6 karbonatomer, f.eks. metyl, etyl, propyl, isopropyl, pentyl, heksyl, o.l. Med begrepet "acyl" forstås formyl og laverealkylkarbonylradikaler såsom acetyl, propionyl, succinoyl, o.l.

Representatieve D-substituenter som øker syregraden på fenol-delen av Z-aminosyreresten, er f.eks. 3-klor og 3-nitro.

Fra peptidsyntese er det kjent at andre elektrontiltrekkende grupper, da spesielt i 3-stillingen på fenylringen på Z,

vil øke syregraden på fenolprotonet, noe som også er tilfelle med grupper som stabiliserer de fenoksydioner som oppstår ved doneringen av fenolprotonet.

Blant de syrer som kan brukes for å fremstille salter med foreliggende peptider, kan nevnes uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrobromsyre, perklorsyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, fosforsyre, o.l., foruten organiske syrer såsom maursyre, eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesukker, oksalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilinsyre, kanelsyre, naftalensulfonsyre, sulfanilinsyre, o.l.

Som baser som er i stand til å danne salter med disse peptider er f.eks. uorganiske baser som natriumhydroksyd, ammonium-hydroksyd, kaliumhydroksyd, o.l., og organiske baser såsom mono-, di- og trialkyl- og arylaminer (se f.eks. trietylamin, diisopropylamin, metylamin, dimetylamin, o.l.) og eventuelt substituerte etanolaminer (f.eks. etanolamin, dietanolamin, o.l.

I den foreliggende sammenheng vil aminosyrekomponentene

i peptidene og visse utgangsmaterialer for deres fremstilling, av hensiktsmessighetsgrunner være identifisert ved hjelp av forkortelser. Disse forkortelser er som følger:

Med begrepet "dehydroPRO" forstås 2,3-dehydroPRO, 3,4-dehydroPRO og 4,5-dehydroPRO. 3,4-dehydroPRO er den foretrukne gruppe.

Peptider med formel (I) kan generelt fremstilles ved hjelp av kjent teknikk. Hensiktsmessig kan peptidene fremstilles ved å bruke den såkalte "fastfase"-synteseteknikk som er beskrevet av Merrifield i Journal of the American Chemical Society, 85, 2149-2154 (1963) . Slike fremgangsmåter er også beskrevet i enkelte av de tidligere nevnte patenter. Andre typer teknikk kan f.eks. finnes i M. Bodansky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. utg., 1976. Passende beskyttende grupper som kan brukes i slike synteser og deres forkortelser kan finnes i nevnte referanser, så vel som "Protective Groups in Organic Chemistry", J. F. W. McOmie, redaktør, Plenum Press, New York, 1973. De mest vanlig brukte beskyttende grupper som er brukt i de synteser som er beskrevet heri, er t-butyloksykarbonyl (BOC), benzyl (BZL), t-amyloksykarbonyl (AOC), tosyl (TOS), o-bromfenyl-metoksykarbonyl (BrZ) og 26-diklorbenzyl (BzlC^) •

Peptider med formel (I) hvor X er ASP eller D-ASP, har vist seg å ha biologisk aktivitet som tilsvarer den man finner for tymopoietin, slik dette er beskrevet i de ovennevnte US patenter og artikler, mens de hvor X er GLU eller D-GLU, har en biologisk aktivitet som tilsvarer den man finner for splenin. Forbindelser med formel (I) ble prøvet ved å følge den induksjonsprøvemetode som er angitt av Scheid et al.,

J. Exp. Med. 147: 1727-1743 (1978) og en reseptorprøve-metode som er utformet for å måle forskyvningen av radiomerket tymopoietin fra en reseptorposisjon ved hjelp av prøvepeptidene. Et positivt resultat i induksjonsprøven indikerer at prøvepeptidet har evnen til å etterligne tymopoietinet eller spleninets evne til å indusere en omdannelse av forløpercellene til immunokompetente T-celler eller T-celler og B-celler, respektivt. Et positivt resultat av reseptorprøven indikerer at prøvepeptider har evnen til å binde seg til tymopoietinreseptorposisjonen og således etterligne tymopoietinaktivitet. De fremstilte peptider er positive i induksjonsprøven, mens de hvor C er ASP eller D-ASP er også positive i reseptorprøven.

Peptider med formel (I) hvor Y er ASP eller D-ASP, er karakterisert ved sin evne til å indusere en selektiv differensiering av Thy-1<+> T-celler (men ikke Lyb-2<+> B-celler). Thy-1 er et differensieringsalloantigen som er til stede på T-celler, men ikke på B-celler, mens Lyb-2 er et differensierende alloantigen som er til stede på B-celler, men ikke på T-celler. Undersøkelser av disse peptidene i induksjonsprøven in vivo viser at de har samme induksjonsspesifisitet som tymopoietin. Dette betyr at de induserer differensieringen av Thy-1 -celler eller Thy-1<+ >T-celler, men induserer ikke differensieringen av Lyb-2 celler til Lyb-2<+> B-celler. Peptider med formel (I) hvor X er GLU eller D-GLU er karakterisert ved sin evne til å indusere differensieringen av Thy-1 -celler til Thy-1<+ >T-celler og dessuten Lyd-2 -celler til Lyb-2<+->B-celler.

Som nevnt ovenfor har man funnet at tidligere kjente peptidfragmenter av tymopoietin og splenin og deres analoger er utsatt for en meget rask enzymatisk nedbrytning i dyr eller mennesker som tilføres disse peptider. Man har bestemt at halveringstiden til tymopoietin (tymopoietin-fragment 32-36) i serum er bare ca. 1 minutt. Splenopentin (det tilsvarende fragment for splenin) er også meget utsatt for enzymatisk nedbrytning. De fremstilte peptider har imidlertid en vesentlig øket resistens for enzymatisk nedbrytning, dvs. opptil 1000 ganger bedre enn tymopoietin. Denne vesentlig økede stabilitet for nevnte peptider er fastslått på basis av prøver med.isolerte enzymer av dyre-opprinnelse, f.eks. leucin-aminopeptidase av både cytosol-og mikrosomal-opprinnelse og karboksypeptidase A, B og C),

i forhold til menneskeserum.

Illustrerende stabilitetsdata er angitt i de følgende ta-beller .

<*>1 x 10~^ M peptid og 3 enheter/ml porcin LAP-cytosol i 50 mM Tris pH 8,5-buffer med 5 mM MgCl2 ved 37° ;Fer den foreliggende oppfinnelse var det fullstendig uventet at man kunne fremstille peptider som hadde tilsvarende eller øket tymopoietinlignende eller spleninlignende aktivitet samtidig som man hadde en vesentlig øket resistens overfor enzymatisk nedbrytning. Man har i virkeligheten funnet at mange substitusjoner i 2-stillingen ødelegger eller i vesentlig grad svekker aktiviteten, mens andre substitusjoner i 2-stillingene gjør at man får bibeholdt aktiviteten, men ikke gir noen enzymresistens. Bare de 2-stillingssubstitusjoner som er beskrevet her, gir peptider som samtidig har ekvivalent eller forbedret aktivitet og en i alt vesentlig øket resistens overfor enzymatisk nedbrytning når de f.eks. sammenlignes med tymopoietin. ;P.g.a. disse egenskaper er de fremstilte peptider meget terapeutisk verdifulle ved behandling av mennesker og dyr, ettersom de har evne til å indusere differensieringen av lymfopoietiniske stamceller som oppstår i hemopoietinisk vev til thymus-avledede celler (T-celler) som inngår i kroppens immunreaksjonsapparat. Som et resultat av dette vil de foreliggende peptider ha anvendelse på flere terapeutiske områder. Ettersom forbindelsen har evnen til å utføre enkelte av de angitte funksjoner som man finner i thymus, ;så vil de primært ha anvendelse på forskjellige thymus-funksjoner og immunitetsreaksjoner. Et slikt anvendelses-område er behandlingen av DiGeorge-syndromet, dvs. en tilstand hvor man i alt vesentlig har et fravær av thymus-kjertelen. Injeksjon av et av de fremstilte peptider vil kunne gi en behandling av dette syndrom. P.g.a. at de fremstilte peptider har motstand mot enzymatisk nedbrytning, så ;er de langt mer terapeutisk aktive enn tidligere kjente peptider med tymopoietinlignende aktiviteter. ;Videre vil de fremstilte peptider kunne brukes for å ;hjelpe kroppens samlede immunitetssystem, noe som skjer ved at de øker eller letter den terapeutiske stimuleringen av celle-immuniteten og derfor kan brukes ved behandling av sykdommer som innbefatter kronisk infeksjon, såsom soppinfeksjoner eller mycoplasmainfeksjoner, tuberkulose, spedalskhet, akutte og kroniske virusinfeksjoner o.l. ;De fremstilte forbindelsene kan generelt brukes i ethvert tilfelle hvor celleimmunitetsreaksjonen inngår, og spesielt i de tilfeller hvor det er et underskudd på en immunitet, f.eks. av den type som er nevnt ovenfor i forbindelse med DiGeorge-syndromet. I de tilfeller hvor det således er ;et overskudd av antistoffproduksjon som skyldes ubalanserte T-celler og B-celler, så vil de fremstilte peptider kunne korrigere denne tilstanden ved å stimulere T-celleproduksjonen. De kan således forventes å være av terapeutisk anvendelse både ved visse autoimmunlidelser hvor mange skader de antistoffer som produseres, f.eks. ved systemisk lupuserytematose, reu-matisk artritis eller lignende. ;I sitt bredeste aspekt kan forbindelsene med formel (I) brukes for å regulere immunsystemet hos en pasient som vil være i behov foren slik regulering. Med begrepet "regulering" forstås at forbindelsene med formel (I) kan bringe immunsystemet fra en unormal syk tilstand tilbake til en normal, balansert tilstand. Skjønt denne regulering vil finne sin største anvendelse m.h.t. korreksjon av immunologisk unormale tilstander (f.eks. DiGeorge-syndromet), så kan forbindelsene også brukes for å korrigere tilstander hvor det er for høy immunologisk aktivitet (f .eks. autoimmunologiske lidelser). ;Forbindelsene med formel (I) anvendes for behandling av tilstander som skyldes relative eller absolutte T-celle-underskudd i en pasient (enten dette er mennesker eller dyr) med en slik tilstand og behandling av tilstander som skyldes relative eller absolutte underskudd av thymus i en pasient. Med begrepet "terapeutisk effektiv mengde" forstås en mengde som er effektiv nok til å behandle de tilstander som oppstår p.g.a. T-celle-underskudd eller underskudd på thymus, respektivt. Forbindelsene med formel (I) anvendes også for å indusere lymfopoietiniske stamceller med de samme egenskaper som thymus-avledede lymfocytter hos en pasient. ;For fremstilling av farmasøytiske preparater kan et peptid ;med formel (I) eller et base- eller syreaddisjonssalt av et slikt peptid, blandes som den aktive ingrediens med et farma-søytisk bærestoff eller fortynningsmiddel ved hjelp av vanlig farmasøytisk teknikk. Nevnte fortynningsmiddel kan være i en rekke former avhengig av hvorledes preparatet skal til-føres, f.eks. sublingualt, rektalt, nasalt, oralt eller paren-teralt. Ved fremstillingen av preparater i oral doseringsform kan man bruke mange forskjellige typer kjente farmasøytiske media, f.eks. vann, oljer, alkoholer, smaksstoffer, kon-serveringsmidler, fargestoffer, o.l. i forbindelse med flytende preparater (f.eks. suspensjoner, eliksirer eller opp-løsninger) eller faste fortynningsstoffer slik som stivelser, sukkere, fortynningsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, nedbrytningsmidler, o.l. i forbindelse med faste preparater (f.eks. pulvere, kapsler og tabletter). Man kan også bruke preparater for regulering og frigjøring av de aktive ingredienser. P.g.a. at de så lett kan tilføres, vil ;tabletter og kapsler være den mest fordelaktige orale doseringsformen, og i slike tilfeller vil man selvsagt bruke faste farmasøytiske fortynningsmidler. Hvis dette er ønske-lig, kan tablettene sukkerbelegges eller enterisk belegges på vanlig kjent måte. ;For parenterale produkter vil fortynningsmidlet vanligvis være sterilt vann, skjønt man kan også bruke andre ingredienser for å løseliggjøre de aktive ingredienser eller for konserverende formål. Man kan også fremstille injiserbare suspensjoner, og i slike tilfeller vil man bruke passende flytende fortynningsmidler, suspenderingsmidler, o.l. De fremstilte peptider er generelt aktive når de tilføres i mengder over ca. 10^ug/kg kroppsvekt. For behandling av DiGeorge-syndromet vil peptidene tilføres i mengder på fra 10 til 100^ug/kg kroppsvekt. Vanligvis vil man kunne bruke samme doseringsmengder når man behandler andre lidelser eller sykdommer av den type som er nevnt ovenfor. ;De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen. I alle eksemplene og i det etterfølgende er alle deler pr. vekt hvis intet annet er angitt. ;EKSEMPEL I ;Na- acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin- amid Peptidet ble syntetisert ved den såkalte solid-fase-metoden. Syntesen begynte med 4,16 g p-metylbenzhydrylaminharpiks, substitusjonsnivå 0,39 mmol pr. g, og de følgende aminosyre-derivater ble trinnvis koplet ved hjelp av dicykloheksylkarbodiimid-hydroksybenzotriazol: BOC(BrZ)Tyr, BOC-Val, BOC-(B-Bzl)Asp, BOC-Pro og AOC-(Ng<->tosyl)Arg. Tyrosinet ;ble rekoplet. Amyloksykarbonylgruppen ble fjernet ved hjelp av trifluoreddiksyre, hvoretter harpiksen ble nøytra-lisert med diisopropyletylamin, og aminet ble så acetylert med 15% eddiksyreanhydrid i dimetylformamid. Etter vasking og tørking veiet harpiksen 6,08 g. ;Peptidet ble spaltet fra harpiksen med 60 ml flytende HF inneholdende 6 ml m-kresol ved 0°C i 1 time og 15 minutter. HF ble fjernet under redusert trykk. Residuet ble vasket med etylacetat og eter, hvoretter peptidet ble ekstrahert fra harpiksen med 100 ml 5% eddiksyre. Det lyofiliserte ekstraktet veide 1,042 g. ;475 mg av det urene peptidet ble renset ved kromatografi ;på en 2,6 x 100 cm kolonne av SP-Sephadex eluert med 0,05M ammoniumacetat ved pH 5 med en hastighet på 50 ml pr. time. Fraksjonene 98-122 (10 ml hver) ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga 462 mg produkt med en renhet på mer enn 99%. ;HPLC: rt = 9,1 min. med 12% CH3CN-0,01M NH4OAc ;pH 5 ved 1,5 ml/min. på Whatman Porasil C^g. ;TLC, silikagel 60: ;Rf 0, 2 6 3 : 1 : 1 n-BuOH : HOAc : H2<D ;Rf 0,43 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H20:Pyr ;Rf 0,64 1:1 TFE:NH4OH ;Aminosyreanalyse: ;Asp, 0,99; pro, 1,00; Val, 1,00; Tyr, 0,99; Arg, 1,01; ;70% peptid ;EKSEMPEL II ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Glutamyl- Tyrosin Peptidet ble fremstilt ved solid-fase-metoden idet man startet med BOC-Tyr(OBzlCl2)-harpiksester (2536-138, 0,32 meg/g, 3,2 g). De følgende standardrutiner ble brukt: Fjerning av beskyttelse - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 min., ;så 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min. ;Vasking - 15 ml CH2C12 to ganger i 1 min. hver gang, fulgt av 15 ml iPrOH i 1 min., deretter 15 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver. ;Nøytralisering - 15 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2% min. ;hver gang ;Kopling - 3,0 mmol av den beskyttede aminosyren (0,46 g) ;og HOBT ble oppløst i 2 ml DMF og så fortynnet med 13 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 3 ml CH2C12. Reaksjonstid var 2 timer. ;a y ;Det var nødvendig med en kopling hver gang for BOC -Bzl -Glu, B0C<a->Bzl<B->Asp, BOC-Pro og A0C<a->Tos<g->Arg. Etter endelig fjerning av beskyttelsen, ble harpikspeptidet acetylert i en time ved hjelp av 10% (v/v) Ac20 i 15 ml DMF og 300 mg ;DMAP. ;Harpiksen ble spaltet i HF/anisol (30 ml/6 ml) i en time ;ved 0°C. Den spaltede harpiksresten ble vasket med Et20, filtrert og de faste stoffer ekstrahert med 100 ml 8% HOAc i 30 minutter. Etter filtrering ble filtratet lyofilisert til 1,23 g 3219-69 HF. ;Råpeptidet ble renset på en Sephadex DEAE (2,6 x 90 cm kolonne, 3 L 0,2M, pH 7,8 NH4HC03 fulgt av 2 L 0,33M ;pH 7,8 NH4HC03 som elueringsmiddel, 75 ml/n i gjennom-strømningsmengde, 13 ml fraksjoner, påvirning ved 277 nm). Fraksjonene 214-236 ble slått sammen og lyofilisert, hvorved man fikk 450 mg av den forønskede forbindelse som et fargeløst faststoff, 53% utbytte. ;;EKSEMPEL III ;Na- Succinoyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin ;Peptidet ble fremstilt ved solid-fase-metoden idet man startet med BOC-Tyr (BzlCl2)-harpiksester"(0,32 meg/g, ;3,2 g). Følgende standardrutiner ble brukt: ;Fjerning av beskyttelse - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 min., ;så 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min.; ;Vasking.- 15 ml CH2C12 to ganger i 1 min., fulgt av 15 ml iPrOH i 1 min. og så 15 ml CH2C12 to ganger , 1 min. hver gang; ;Nøytralisering - 15 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2,5 min. ;hver gang; ;Kopling - 3,0 mmol av den beskyttede aminosyren (0,46 g) ;og HOBT ble oppløst i 2 ml DMF og så fortynnet med 13 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 3 ml CH2C12. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen koplet en gang med BOC-Val, to ganger med BOC ct -Bzl <8->Asp, og en gang hver med BOC-Pro, ;AOC -Tos<g>-Arg og p-Anisylsuccinat. ;Harpiksen ble spaltet i HF/anisol (30 ml/7 ml) il time ved 0°C. Harpiksresten ble vasket med Et20 og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert med 1% NH^OH (100 ml) il time, filtrert, hvoretter filtratet ble lyofilisert til 0,88 g 3219-72HF som et fargeløst sprøtt skum. ;Råpeptidet ble renset på en DEAE Sephadex-kolonne (2,6 x ;90 cm, 0,33M NH^HCC^, pH 7,8 som elueringsmiddel, 75 ml/time, 13 ml fraksjoner, påvisning ved 276 nm). Fraksjonene 103-122 ble slått sammen og lyofilisert til 710 mg av den for-ønskede forbindelsen som et fargeløst faststoff, 78% utbytte . Tynnsjiktkromatografi: Silisiumdioksydgel G, 250\ i ;EKSEMPEL IV ;N"- Formyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin Tittelforbindelsen ble fremstilt ved den solid-fase-metoden idet man gikk ut fra BOC-Tyr(BzlCl2)-harpiksester (0,32 meg/ g, 4,7 g). De følgende standardrutiner ble brukt: ;Fjerning av beskyttelse - 25 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 min., ;så 25 ml 50% TFA/CH2C<1>2 i 30 min.; ;Vasking - 25 ml CH2C12 to ganger i 1 min. hver gang, fulgt av 25 ml iPrOH i 1 min. og så 25 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang; ;Nøytralisering - 25 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2,5 min. ;hver gang; ;Kopling - 4,5 mmol av den beskyttede aminosyren (0,69 g) ;og 0,4 6 g HOBT ble oppløst i 3 ml DMF og fortynnet med 25 ml CH2C12, 0,93 g DCC ble oppløst i 5 ml CH2C12 og ;tilsatt blandingen av reaktantene og harpiksen og blandingen ble så omrørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen så koplet en gang med BOC-Val, BOC<a->Bzl<e->Asp, BOC-Pro og AOC<a->Tos<g->Arg. Beskyttelsen på harpiksen ble så fjernet, nøytralisert og formulert med p-nitrofenylformat (RC, 1,0 g), dimetylaminopyridin (0,3 g) i CH2C12 i 16 timer. ;Harpiksen ble vasket, lufttørket og spaltet med HF/anisol (30 ml/5 ml) i 1 time ved 0°C. Harpiksresten ble så vasket med Et-jO og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert med 1% NH4OH (100 ml) og lyofilisert til 1,54 g urent peptid. ;Det urene peptidet ble renset på en DEAE SEphedex-kolonne (2,6 x 85 cm, 0,IM NH^HCO^, pH 7,5 som elueringsmiddel, ;100 ml/time i gjennomstrømningshastighet, 13 ml fraksjoner og påvisning ved 280 nm). Fraksjonene 136-170 ble oppsamlet og lyofilisert, noe som ga 725 mg av den forønskede forbindelsen, 71% utbytte. ;;Tynnsjiktkromatografi Silisiumdioksydgel G, 250|a ;EKSEMPEL V ;N"- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Isoleucyl- Tyrosin, Solvatert Tittelforbindelsen ble fremstilt ved solid-fase-metoden, idet man gikk ut fra BOC-Tyr(BzlCl2)-harpiksester (0,32 meg/g, 2,4 g). De følgende standardrutiner ble brukt: Fjerning av beskyttelse - 20 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 min., og ;så 20 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min.; ;Vasking - 20 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang, fulgt av 20 ml iPrOH i 1 min., og så 20 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang; ;Nøytralisering - 20 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2,5 min. ;hver gang; ;Kopling - 3,0 mmol av den beskyttede aminosyren (0,46 g) og HOBT ble oppløst i 2 ml DMF og så fortynnet med 13 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 3 ml CH2C12, tilsatt blandingen av reaktanter og harpiks og så' omrørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen koplet en gang med BOC-Ile hH^O, BOC<a->Bzl<B->Asp, BOC-Pro og AOC<a->Tos<g->Arg. ;Etter fjerning av beskyttelsen ble harpiksen acylert med Ac20 (1,8 ml) og 0,3 g DMAP i 15 ml DMF i 2 timer. Harpiksen ble så vasket, lufttørket og spaltet i HF/anisol (30 ml/ 4 ml) il time ved 0°C. ;Harpiksresten ble så vasket med Et2<D og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert med 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtrert, hvoretter ekstraktet ble lyofilisert til 2,1 g 3219-87 HF som et fargeløst faststoff. ;Det urene peptidet ble renset på en DEAE Sephadex-kolonne (2,6 x 85 cm, 0,1M NH4HC03, pH 7,5, 80 ml/time, 11 ml fraksjoner, påvisning ved 278 nm). Fraksjonene 135-160 ble slått sammen og lyofilisert to ganger, hvorved man fikk 432 mg av den forønskede forbindelsen som et fargeløst faststoff, 65% utbytte. ;EKSEMPEL VI ;Na- Acetyl- D- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: N- t- butyloksykarbonyl- Prolyl-( B- benzyl) Aspartyl- Valyl-Tyrosin- benzylester ;100 ml metylenklorid og 50 ml av en mettet natriumbikarbonat-oppløsning ble tilsatt 9,40 g (B-Bzl)Asp-Val-Tyr-OBzl-tri-fluoracetat. En mindre mengde dimetylformamid ble tilsatt for å oppløse peptidet. Lagene ble skilt, og det organiske lag ble ekstrahert med mettet natriumbikarbonatoppløsning. Det organiske laget ble tørket over vannfritt natriumsulfat, så redusert i volum til ca. 50 ml ved roterende fordampning. Denne oppløsning ble så tilsatt 2,80 g N-t-butyloksykarbonyl-Prolin. Den ble så avkjølt til 5°C og tilsatt 2,70 g dicykloheksylkarbodiimid i 15 ml metylenklorid. Blandingen ble omrørt ved 5°C i 1 time og så hensatt ved.l5°C i 16 timer. Den ble så redusert til et lite volum ved roterende fordamp- ;ning. 150 ml etylacetat ble tilsatt resten, og blandingen ble så filtrert. Filtratet ble ekstrahert med vann, 10% sitronsyreoppløsning og så mettet natriumbikarbonatoppløs-ning. Etter tørking og fjerning av oppløsningsmidlet fikk man 10,97 g av et glassaktig stoff. Dette produktet ble utkrystallisert fra etylacetat-heksan, noe som ga 8,85 g, smeltepunkt 74-76°C. Omkrystallisering fra etylacetat og petroleter med svak oppvarming ga 7,73 g, smeltepunkt 75-78°C. TLC, silisiumdioksydgel 60: Rf 0,68 med 9:1 CH2C12: MeOH. ;Na- t- butyloksykarbonyl-( Ng- Tosyl)- D- Arginyl- Prolyl-( - benzyl ) Aspartyl- Valyl- Tyrosin- benzylester ;2,31 g BOC-Pro-(B-Bzl)Asp-Val-TyrOBzl ble tilsatt 20 ml 4,0 N HC1 i dioksan. Etter omrøring i 1 time var mesteparten av oppløsningsmidlet fjernet ved roterende fordampning. Resten ble tilsatt eter, noe som ga et fast stoff som ble frafiltrert og vasket med eter. Saltet ble slått sammen med 1,20 g N-t-butyloksykarbonyl-(Ng<->tosyl)-D-Arginin i 20 ml 3:l-blanding av metylenklorid-dimetylformamid. Oppløsningen ble avkjølt til 5°C, hvoretter man tilsatte 0,61 ml diisopropyletylamin, 0,30 g 1-hydroksybenzotriazol og 0,58 g dicykloheksylkarbodiimid. Blandingen ble omrørt ved 5°C i 30 minutter, og så hensatt ved romtemperatur i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble så filtrert, og oppløs-ningsmidlet fjernet ved roterende fordampning. Residuet ble tilsatt etylacetat og vann. Lagene ble skilt, og det organiske laget ekstrahert med 10% sitronsyreoppløsning, mettet natriumbikarbonatoppløsning og så mettet natrium-kloridoppløsning. Fjerning av oppløsningsmidlet ga et glassaktig stoff som ble utkrystallisert fra etylacetat-petroleter. Produktet kom ut av oppløsningen som en gummi, men stivnet til et hvitt pulver ved behandling med petroleter. Produktet veide 1,84 g. ;Na- Acetyl-( Ng- tosyl)- D- Arginyl- Prolyl-( B- benzyl) Aspartyl-Valyl- Tyrosin- benzylestér ;0,87 g av det beskyttede pentapeptidet ble behandlet med ;20 ml 50% trifluoreddiksyre i metylenklorid i 30 minutter. Fjerning av oppløsningsmidlet og tilsetning av eter til resten ga et faststoff. Dette ble oppløst i 10 ml dimetylformamid, så tilsatt 0,15 ml diisopropyletylamin og så ;0,5 ml eddiksyreanhydrid og 0,1 g 4-dimetylaminopyridin, hvoretter blandingen ble omrørt i 45 minutter. Mesteparten av oppløsningsmidlet ble så fordampet. Resten ble tilsatt 0,5N natriumbikarbonatoppløsning, og man fikk en kremaktig suspensjon. Etylacetat ble tilsatt, og det organiske laget ekstrahert med vann, 10% sitronsyreoppløsning og en mettet natriumkloridoppløsning. Fjerning av oppløsningsmidlet ga en gummi på 0,69 g. Man fjernet beskyttende grupper i dette produktet uten ytterligere rensning. ;Na- acetyl- D- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin ;0,69 g av det beskyttede peptidet ble plassert i et reaksjons-kar av teflon. 3 ml M-kresol og 30 ml HF ble tilsatt, og blandingen omrørt ved 0°C i 1 time. Flussyren!ble så fjernet med vakuum. Peptidet ble utfelt med etylacetat og eter og så vasket med dette oppløsningsmidlet. Det ble så oppløst i 3% eddiksyre og lyofilisert. Produktet veide 276 mg. ;Peptidet ble renset ved kromatografi på en kolonne av ;1,6 x 60 cm DEAE-Sephadex, og eluert med 0,10N ammonium-bikarbonatoppløsning, pH 8,0, og man oppsamlet 120 dråpers fraksjoner. Hovedkomponenten ble eluert med en topp som lå omkring fraksjon 82. Den siste delen av toppen inneholdt en urenhet, noe som ble påvist ved tynnsjiktkromatografi. Fraksjonene 77-82 ble slått sammen og lyofilisert. Produktet veide 65 mg. ;HPLC, Whatman C18- Porasil: rt = 8,8 min. med 8% CH3CN- ;0,0IM NH4OAc, pH 5 ved 1,5 ml/min. ;TLC, silisiumdioksydgel GF, 250| a: ;Aminosyreanalyse ;Asp, 1,01; Pro, 0,99; Val, 0,99; Tyr, 1,01; Arg, 1,02; ;100% peptid ;EKSEMPEL VII ;Na- acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Fenylalanyl- Tyrosin ;Peptidet ble syntetisert ved solid-fase-metoden ved hjelp av et Beckman 990B automatisk peptid-synteseapparat. 50% tri-fluoreddikyre-metylenklorid ble brukt for å fjerne beskyttelse, 5% diisopropyletylamin i Cf^C^ for nøytralisering og dicykloheksylkarbodiimid/l-hydroksybenztriazol for kopling. De følgende utgangsf orbindelser ble brukt: 2,00 g BOC- (C^Bzl) - Tyr-harpiksester, 0,32 meg/g, 0,51 BOC-Phe, 2 x 0,62 g BOC-(B-Bzl)Asp, 0,42 g BOC-Pro og 0,85 g AOC-(Ng-tosyl)Arg. Etter inkorporering av Arg ble harpiksens beskyttende grupper fjernet, nøytralisert og omsatt med 5 ml eddiksyreanhydrid i 20 ml dimetylformamid i 20 minutter. Harpiksen ble vasket og tørket, og vekten var 2,73 g. ;Peptidharpiksen ble behandlet med 30 ml HF og 3 ml m-kresol ved 0°C i 50 minutter. Etter fordampning av HF ble produktet vasket med etylacetat og eter. Peptidet ble så ekstrahert med 100 ml 5% eddiksyre. Den filtrerte oppløsning ble lyofilisert, noe som ga 798 mg av et urent produkt. ;389 mg av ovennevnte urene peptid ble renset ved kromatografi på 1,6 x 60 cm kolonne av DEAE-Sephadex eluert med 0,10N NH^HCO^, pH 8,0. Man oppsamlet dråper på 150 dråper. Fraksjonene 75-86 ble slått sammen og lyofilisert. Produktet veide 171 mg. HPLC viste bare spor av urenheter, rt 8,2 min. med 12,5% CH3CN-0,0lM NH4OAc, pH 5 ved 2,0 ml pr. min. på ;Whatman C^g-Porasil-analytisk kolonne. ;TLC, silisiumdioksydgel 60: ;;Aminosyreanalyse: ;Asp, 0,96; Pro, 1,00; Tyr, 1,01; Phe, 1,01; Arg, 1,02; ;100% peptid. ;EKSEMPEL VIII ;Na- acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Glutaminyl- Tyrosin ;Peptidet ble syntetisert ved solid-fase-metoden. Harpiksens beskyttende gruppe ble fjernet med 50% trifluoreddiksyre i metylenklorid, nøytralisert med 5% diisopropyletylamin i metylenklorid og så koplet med dicykloheksylkarbodiimid og 1-hydroksybenzotriazol bortsett fra Gin som ble inkorporert via sin p-nitrofenylester. De følgende utgangsforbindelser ble brukt: 2,00 g N-t-butyloksykarbonyl-(O-diklorbenzyl)-Tyrosin-harpiksester, 0,32 mequiv./g, 0,94 g N-t-butyloksykarbonyl- (B-benzyl)Aspartinsyre, 0,41 g N-t-butyloksykarbonyl-Prolin og 0,85 g Na<->t-butyloksykarbonyl(N<g->tosyl)Arginin. ;Gin og Asp ble koplet omigjen. Etter inkorporering av Arg, ble de beskyttende grupper fjernet, harpiksen ble så nøy-tralisert og omsatt med 5 ml eddiksyreanhydrid og 1,25 ml diisopropyletylamin i 20 ml dimetylformamid i 20 minutter. Etter vasking ble harpiksen vakuumtørket og ga 2,7 5 g produkt . ;Peptidet ble spaltet med 30 HF og 3 ml m-kresol ved 0°C i ;1 time. HF ble fjernet med vakuum, og resten vasket med etylacetat og eter. Peptidet ble ekstrahert med 150 ml 2% eddiksyre. Det filtrerte ekstraktet ble lyofilisert, ;noe som ga 688 mg produkt. ;Peptidet ble renset ved kromatografi på en 2,6 x 90 cm kolonne av DEAE-Sephadex, eluert med 1,2 1 0,10M ammonium-bikarbonat, pH 8,0 og så 0,20M pH 8-buffer. Fraksjonene omkring hovedtoppen (X 278 nm) som var ren ved hjelp av HPLC, ble slått sammen og lyofilisert. Produktet veide 388 mg. ;TLC, silisiumdioksydgel 60: ;;Aminosyreanalyse: ;Asp, 0,99; Glx, 0,99; Pro, 1.03; Tyr, 0,98; Arg, 1,01; ;100% peptid. ;EKSEMPEL IX ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- D- Tyrosin Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: ;Boc- D- Tyr( 2BrZ)- 0- CH2~ harpiks ;Klormetylert polymer<->(0,88 meq/g, 1,13 g, 1 mmol) og vannfritt KF (0,17 g, 3 mmol) ble tilsatt en oppløsning av Boc-D-Tyr(2BrZ) (0,74 g, 1,5 mmol) i 4 ml DMF i en rundkolbe utstyrt med en rører. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 50°C i 24 timer. Harpiksen ble filtrert og vasket med DMF (3 x 25 ml), 50% DMF/I^O (3 x 25 ml), 50% EtOH/H20 (3 x 25 ml) og EtOH (3 x 25 ml). Substitusjonen av Boc-D-Tyr-(2BrZ) på harpiksen var 0,35 mmol pr. gram harpiks basert på en aminosyreanalyse. ;Aoc- Arg( Tos)- Pro- Asp-( OBzl)- Val- D- Tyr( 2BrZ)- O- CH2- harpiks Aoc-Arg(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-0-CH2<r>harpiks ble syntetisert manuelt ved solid-fase-metoden. Aminosyre-derivatene <p>g DCC ble brukt i et overskudd på tre ganger med en ekvivalent HOBt tilsatt for de følgende koplinger: Aoc-Arg(Tos), Boc-Pro, Boc-Asp(OBzl) og Boc-Val. I til-legg til DCC/HOBt-koplingene, måtte man utføre en symme-trisk anhydridkopling for å sikre en fullstendig reaksjon for Boc-Val og Boc-Asp(OBzl). Anhydridene ble fremstilt før kopling ved å tilsette 1,5 ekvivalenter DCC til 3 ekv. av aminosyrederivatet ved 0°C i 1 time. DCC ble frafiltrert før man tilsatte harpiks-peptidet. Man brukte følgende synteseprogram: ;1. 50% TFA/CH2C12 (2 min., 15 min.) ;2. CH2C12 (2x2 min.) ;3. 50% TFA/CH2C12 (25 min.) ;4. CH2C12 (3x2 min.) ;5. isopropanol (2x1 min.) ;6. CH2C12 (4x2 min.) ;7. 7% DIEA/CH2C12 (1x3 min.); 2. behandling (2 min., ;5 min.) ;8. CH2C12 (2x2 min.) ;9. 7% DIEA/CH2C12 (3 min., 4 min.) ;10. CH2C12 (5x2 min.) ;11. Kople neste aminosyre i CH2C12;12. Blande i 5 min. ;13. Tilsett DCC og HOBt i CH2C12/DMF (10:1) ;14. Blande over natten ;15. CH2C12 (6x2 min.) ;16. Ninhydrinprøve (hvis ufullstendig reaksjon, gjenta trinnene 7-16) . ;Aoc-gruppen på Arg ble fjernet med 50% TA/CH2C12 før acetyleringen. ;Ac- Arg( Tos)- Pro- Asp( OBzl)- Val- D- Tyr( 2BrZ)- 0- CH2~ harpiks TFA-Arg-(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-0-CH2"R ;(=1 mmol) ble omrørt i en rundkolbe med eddiksyreanhydrid (1,02 g, 10 mmol) i 2 timer ved romtemperatur i en 1:1-blanding av DMF og pyridin. Den acetylerte peptidharpiksen ble overført til en sintret glasstrakt og vasket med DMF. Produktet ble tørket i vakuum og ga 1,17 g av en uren acetylert peptidharpiks. ;HF- spalting ;1,17 g Ac-Arg(Tos)-Pro-Asp(OBzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-0-CH2-harpiks ble spaltet med 12 ml HF i nærvær av 10% anisol ved 0°C i 1 time. Peptidharpiksen ble overtført til en sintret glasstrakt og vasket skikkelig med eter. Peptidet ble ekstrahert med 10% HOAc/H20 (5 x 10 ml) og så med vann og lyofilisert til 210 mg peptid. ;Rensing av Ac- Arg- Pro- Asp- Val- D- Tyr ;Det urene Ac-Arg-Pro-Asp-Val-D-Tyr ble kromatografert på en Sephadex SPC-25-kolonne (2,5 x 100 cm) ekvilibrert med 0,05M NH40Ac (pH 4,5). Gjennomstrømningshastigheten var 61 ml/time og man oppsamlet fraksjoner på 12 ml/rør. UV-monitoren var satt på x=277 nm. Det forønskede produktet ble eluert mellom rørene 23-28. Fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert til 140 mg peptid (25% peptidutbytte). ;Avsalting av Ac- Arg- Pro- Asp- Val- D- Tyr ;Ettersom gjentatt lyofilisering av det rensede Ac-Arg-Pro-Asp-Val-D-Tyr ikke ga noen økning av peptidinnholdet, brukte man en Sephadex G-10-kolonne (2,5 x 100 cm) for å avsalte peptidet. Kolonnen ble ekvilibrert i vann og så kjørt med en gjennomstrømningshastighet på 30 ml/time. Fraksjoner på 10 ml ble oppsamlet pr. rør, og UV-monitoren var satt på 207 nm for påvisning av produktet. Peptidet ble eluert mellom fraksjonene 21-37. Disse fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga 130 mg av et meget hygroskopisk stoff (33% peptid). ;Tynnsj iktkromatografi: silisiumdioksydgel F60, 200 p ;Rf 0,43 (n-BuOH/HOAc/H20/Pyr - 15:3:12:10) ;Rf 0,60 (n-BuOH/HOAc/H20/EtOAc - 1:1:1:1) ;Aminosyreanalyse: ;Syreanalyse: Asp, 0,99; Pro, 0,98; Val, 1,03; ;Tyr, 0,97; Arg, 1,02. ;Leucin-Amino-Peptidase (LAP)-nedbrytning: Asp, 0,00; ;Pro, 0,00; Val, 0,00; Tyr, 0,00; Arg, 0,00; (0,00 betyr at ingen frigjorte aminosyrer ble påvist). ;EKSEMPEL X ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin Tittelforbindelsen ble fremstilt ved solid-fase-metoden, idet man startet med Boc-Tyr(BzlCl2)-harpiksester (6,50 g, 0,32 mekv/g). De følgende standardrutiner ble brukt: Fjerning av beskyttende gruppe - 40 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 ;min., så 40 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min.; ;Vasking - 40 ml CH2C12 to ganger i 1 min. hver, fulgt av 40 ml iPrOH i 1 min., så 40 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang; ;Nøytralisering - 40 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2,5 min. ;hver gang; ;Kopling - 6,0 mmol av den beskyttede aminosyren (0,92 g) ;og HOBT ble oppløst i 3 ml DMF og så fortynnet med 27 ml CH2C12. 1,24 g DCC ble oppløst i 5 ml CH2C12, tilsatt blandingen av reaktanter og harpiks og så omrørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen koplet en gang med Boc-Val, BOC-Bzl -Asp og BOC-Pro. Halvparten av harpiksen ble lagret, mens resten ble koplet med Aoca-Tosg-Arg. Etter fjerning av beskyttende grupper ble harpikspeptidet acylert en gang med 10% Ac20 i 1:1 DMF:CH2C12 (30 ml) og DMAP (400 mg) i 1 time. Harpiksen ble vasket, lufttørket og spaltet i HF/anisol (30 ml/80 ml) i 1 time ved 0°C. ;Harpiksresteri ble vasket med Et20 og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert med 10% HOAc (100 ml) i 1 time, filtrert, hvoretter ekstraktet ble lyofilisert, noe som ga produktet som et fargeløst faststoff. ;Det urene peptidet ble renset på QAE-Sephadex-kolonne ;(2,6 x 88 cm, 41, 0,05-0,3M NH4HC03-gradient, pH 7,2, ;100 ml/time, 9 ml fraksjoner, påvisning 278 nm). Fraksjonene 120-140 ble slått sammen og lyofilisert. Restpeptidet ble avsaltet på en G-10 Sephadex-kolonne (2,6 x 85 cm, 1% HOAc som elueringsmiddel). Det lyofiliserte acetylpenta-peptidet veiet 830 mg. ;Tynns j iktkromatograf i : 250\ i silisiumdioksydgel G ;EKSEMPEL XI ;Arginyl- D- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin ;Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: N- t- butyloksykarbonyl- D- Prolyl-( B- benzyl) Aspartyl- Valyl-Tyrosin- benzylester ;4,00 g TFA-(B-Bzl)Asp-Val-Tyr-OBzl (inneholdende 15% overskudd av TFA) ble tilsatt 40 ml metylenklorid og 40 ml mettet natriumbikarbonatoppløsning. Blandingen ble omrørt kraftig, hvoretter lagene ble skilt. Det organiske lag ble ekstrahert med bikarbonatoppløsning, og så tørket. Fjerning av oppløsningsmidlet ga et hvitt faststoff. Dette ble oppløst i 45 ml 8:1 CH2Cl2:DMf. Oppløsningen ble så tilsatt 1,08 g N-t-butyloksykarbonyl-D-Prolin (Peninsula) ;og 0,1 g 1-hydroksybenzotriazol. Oppløsningen ble avkjølt på et isbad og man tilsatte 1,03 g dicykloheksylkarbodiimid. Blandingen ble omrørt i et isbad i 90 minutter og så 90 minutter ved romtemperatur. Bunnfallet ble frafiltrert. Filtratet ble ekstrahert med 10% sitronsyreoppløsning, vann og mettet natriumbikarbonatoppløsning. Fjerning av oppløsningsmidlet ga et glassaktig stoff som ble utkrystallisert fra etylacetat og heksan. Produktet veiet 3,33 g, smeltepunkt 82-88°C (dekomponering). ;Tri- benzyloksykarbonyl- Arginyl- D- Prolyl( B- benzyl) Aspartyl-Valyl- Tyrosin- benzylester ;3,31 g av det ovennevnte beskyttede tetrapeptid ble tilsatt 40 ml 50% trifluoreddiksyre i metylenklorid. Etter omrøring i 30 minutter ble oppløsningsmidlet fordampet, og eter tilsatt resten. Det faste produkt ble oppløst i etylacetat ved tilsetning av en mindre mengde metanol. Oppløsningen ble ekstrahert to ganger med en mettet natriumbikarbonat-oppløsning. Det faste produkt etter fjerning av oppløs-ningsmidlet fra det organiske alget, ble oppløst i 10 ml DMF og tilsatt en oppløsning av 2,77 g tribenzyloksykarbonyl-arginin (Bachem) i 5 ml DMF. Oppløsningen ble avkjølt i et isbad, og man tilsatte 0,66 g 1-hydroksybenzotriazol fulgt av 0,89 g dicykloheksylkarbodiimid. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Mesteparten av oppløsningsmidlet ble fjernet med vakuum. Etylacetat ble tilsatt resten og uoppløselige stoffer frafiltrert. Filtratet ble ekstrahert med 10% sitronsyreoppløsning og to ;ganger med en mettet natriumbikarbonatoppløsning. Tørking og fjerning av oppløsningsmidlet ga et tykt oljeaktig produkt. Dette ble kromatografert på silisiumdioksydgel 60 med en gradient fra 3-10% metanol i metylenklorid. Man fikk et fargeløst glassprodukt som veiet 4,14 g. ;Arginyl- D- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin ;1,66 g av det beskyttede pentapeptidet ble hydrogenert med 1 ml maursyre i 20 ml metanol over 0,5 g palladium-svart. Etter 4 timers kraftig omrøring ble katalysatoren frafiltrert, og oppløsningsmidlet fjernet fra filtratet ved roterende fordampning. Resten ble oppløst i 5% vandig eddiksyre og så lyofilisert. Produktet veiet 889 mg. ;Peptidet ble renset ved kromatografi på en 2,6 x 95 cm-kolonne av DEAE-Sephadex. Noe produkt lot seg ikke oppløse i 0,25M NH4HC03, pH 8,0, og dette ble frafiltrert, mens filtratet ble påsatt kolonnen. Den ble så eluert med nevnte buffer ved en hastighet på 100 ml/time, og man oppsamlet 10 ml fraksjoner. Hovedkomponenten ble oppsamlet i fraksjonene 142-156. Det lyofiliserte produktet veiet 6 3 4 mg. ;HPLC: rt - 6,5 min. med 8% CH3CN - 0,01M NH4OAc, pH 5 med ;1,5 ml/min på Wharman C^g - Porasil. ;TLC: silsiumdioksydgel GF, 250 |i ;;Aminosyreanalyse: ;Asp, 0,99; Pro, 0,98; Val, 1,01; Tyr, 1,00; Arg, 1,03; ;94% peptid. ;E KSEMPEL XII ;N - Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin- N- Isobutylamid ;Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: ;A. En omrørt oppløsning av Pro-OCH^-HCl (55,2 g, 33,3 mmol), Aoc<a->Tos<g->Arg (89,6%, 16,4 g, 33,3 mmol og 1-hydroksybenzotriazol (HOBT, 5,10 g, 33,3 mmol) i 15 ml DMF og 50 ml CH2C12 ved 0°C ble tilsatt N-metylmorfolin (NMM, 385 ml, ;1,1 ekv.). Man tilsatte så dråpevis en oppløsning av DCC (6,88 g, 1,0 ekv.) i CH2C12 (10 ml). Etter 5 minutter ble blandingen oppvarmet til romtemperatur og omrørt i 1H time. De faste stoffer ble frafiltrert, mens filtratet ble fordampet og ga en gul olje. Denne ble suspendert i 200 ml EtOAc og igjen filtrert. Oppløsningen ble vasket to ganger med mettet vandig NaHCO^, en gang med vann, en gang med 10% sitronsyre og en gang med mettet natriumkloridoppløs-ning. Det organiske laget ble tørket over natriumsulfat, filtrert og fordampet, noe som ga 17,90 g av et fargeløst skum. Produktet ble renset i tre like porsjoner ved utblås-ningskromatografi (5 x 15 cm kolonne, 5:3 CH2C12:aceton som elueringsmiddel), noe som ga metyl-Ng<->Tosyl-Na<->t-amyloksykarbonyl-arginyl-prolinat (produkt A) som et fargeløst glass, 13,41 g, 73%. ;B. En omrørt oppløsning av produkt A (5,54 g, 10,0 mmol) ;i CH3OH (25 ml) ved 5°C ble tilsatt 20 ml avkjølt vann og 2,00M NaOH (vandig) (5,00 ml, 10,0 mmol). Den fargeløse oppløsning ble holdt på 5-10°C i 18 timer, og så oppvarmet til romtemperatur i løpet av 1 time. Oppløsningen ble så fordampet til ca. 25 ml, pH justert til 9,8, hvoretter opp-løsningen ble ekstrahert en gang med Et20. Den vandige resten ble behandlet med fast sitronsyre til pH 2,8 og så mettet med natriumklorid. Etter ekstraksjon tre ganger med EtOAc, ble de organiske lagene slått sammen, tilbakeyasket en gang med mettet saltoppløsning, tørket over natriumsulfat, filtrert og fordampet, noe som ga Ng<->Tosyl-Na<->t-amyloksy- ;karbonyl-arginyl-prolin (produkt B) som et fargeløst faststoff, 5,30 g , 98%, smeltepunkt 114-115°C. C. En omrørt oppløsning av BOC-Tyr(BrZ) (4,94 g, 10,0 mmol) i 40 ml EtOAc ble tilsatt N-metylmorfolin (NMM, 1,21 ml, 1,1 ekv.). Oppløsningen ble avkjølt til -20°C og man tilsatte dråpevis iBuOCOCl (1,33 ml, 1,02 ekv.). Etter 20 minutter tilsatte man isobutylamin (o,00 ml, 1,1 ekv.). ;Man fikk en tykk, ikke-omrørbar masse etter ca. 10 minutter. Denne massen ble så oppvarmet til romtemperatur, fortynnet med 150 ml EtOAc og vasket en gang med vann, en gang med 10% sitronsyre, en gang med vann, en gang med mettet vandig NaHC03 og en gang med mettet natriumkloridoppløsning. Det organiske laget ble tørket over magnesiumsulfat, filtrert og fordampet, noe som ga N-t-butyloksykarbonyl-0-(2-brom-benzyloksykarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt C) som et fargeløst faststoff, og dette var tilstrekkelig rent for ytterligere bruk. Utbytte 5,10 g, 93%. D. Produkt C (4,19 g, 7,63 mmol) ble tilsatt 50% TFA/CH2C12 (14 ml). Etter omrøring i 40 minutter, ble oppløsningen fordampet til en temperatur på mindre enn 30°C, og deretter evakuert over natten, noe som ga et produkt Dl som en gul olje, 5,65 g. ;En omrørt oppløsning av BOC-Val (1,66 g, 1,00 ekv) i 24 ml EtOAc ved -20°C ble tilsatt NMM (0,92 ml, 1,1 ekv) og så dråpevis iBuOCOCl (1,00 ml, 1,02 ekv). Etter 20 minutter tilsatte man en oppløsning av produkt Dl og NMM (1,97 ml) ;i 5 ml EtOAc, og blandingen ble så oppvarmet til -5°C. Etter 30 minutter fikk man et voluminøst bunnfall. Reaksjonen ble så stoppet med vann og blandingen ekstrahert tre ganger med EtOAc. De organiske ekstrakter ble slått sammen og vasket en gang med mettet vandig NaHCO^, en gang med vann, en gang med 10% sitronsyre og en gang med mettet NaCl-oppløsning. Etter tørking over magnesiumsulfat ble ekstraktet filtrert og fordampet. Det resulterende faste ;produkt ble behandlet med varm Et20, filtrert og tørket, ;noe som ga N-t-butyloksykarbonyl-valyl-O-(2-brombenzyl-oksykarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt D) som et fargeløst faststoff, 4,21 g, 85%, smeltepunkt 175-176°C. ;E. Produkt D (1,95 g, 3,00 mmol) ble tilsatt 4, 5M HC1 i ;5 ml dioksan. Etter 1 time ble oppløsningen fordampet, ;og resten lyofilisert fra dioksan, noe som ga 1,60 g av et flokkulerende faststoff, produkt El. ;En omrørt oppløsning av N°'-BOC-6-Bzl-Asp (0,884 g, 1,0 ekv) ;i 5 ml DMF ved -15°C ble tilsatt 0,33 ml NMM og så 0,36 ml iBuOCOCl. Etter 15 minutter tilsatte man en oppløsning av produkt El og 0,3 ml NMM i 2 ml DMF, og blandingen ble om-rørt og hensatt for oppvarming til romtemperatur. Tripep-tidet ble utfelt med mettet vandig NaHCO^, vasket med vann og filtrert. Omkrystallisering fra EtOAc ga Na<->t-butyloksykarbonyl-B-benzyl-aspartyl-valyl-O-(2-brombenzyloksy-karbonyl)tyrosin-N-isobutylamid (produkt E) som et farge-løst faststoff, 1,90 g, 74%. ;F. Produkt E (1,71 g, 2,00 mmol) ble tilsatt 4,5M HC1 i ;3 ml dioksan. Etter 1 time ble oppløsningen fordampet, og resten ble lyofilisert fra dioksan, noe som ga 1,46 g av et fargeløst faststoff.. Dette ble utrørt i 3 ml DMF og man tilsatte så diisopropyletylamin (DIEA, 0,34 ml), HOBT (0,28 g) og Aoc<a->Tos<g->Arg-Pro (produkt B) (0,98 g). DCC (0,38 g) ble så tilsatt, og blandingen omrørt i 2 timer. Suspensjonen ble filtrert, og filtratet tilsatt halvmettet vandig NaHCO^ (50 ml). Det resulterende produkt ble frafiltrert, oppløst i EtOAc og vasket med H20, 10% sitronsyre og mettet natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble tørket over natriumsulfat, filtrert og fordampet, noe som ga Na<->t-amyloksykarbonyl-Ng<->tosyl-arginyl-prolyl-B-benzyl-aspartyl-valyl-O-(2-brombenzyloksykarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt F) som et blekt gult faststoff, ;1,91 g, 75%. ;G. Produkt F (1,85 g, 1,45 mmol) ble tilsatt 50% TFA/ CH2C12 (4 ml). Etter 30 minutter, ble oppløsningen fordampet i kulden, og så behandlet med Et20, noe som ga 2,35 g av et fast fargeløst produkt. Dette ble tilsatt 0,64 ml NMM, 0,12 g DMAP og 5 ml DMF. 0,5 ml Ac20 ble så tilsatt, og den resulterende gule oppløsningen ble omrørt i 1 time. Reaksjonen ble stoppet med halvmettet NaHCO^-oppløsning. ;Det resulterende blekt brune bunnfallet ble frafiltrert, vasket med 10% salpetersyre, så med vann og så lufttørket, noe som ga Na<->acetyl-Ng<->tosyl-arginyl-prolyl-8-benzyl-aspartyl-valyl-O- (2-br'ombenzyloksykarbonyl) -tyrosin-N-isobutylamid (produkt G) 1,34 g, 77%. ;H. Det beskyttede pentapeptidproduktet G (1,34 g) ble spaltet med HF/anisol (30 ml/6 ml) i 1 time ved 0°C. Resten ble behandlet med Et20 og ekstrahert en gang med 10% HOAc (100 ml) og en gang med 1% NH^OH (100 ml). De vandige ekstrakter ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga gult faststoff, 0,65 g. ;De rene peptider ble renset på SPC25 Sephadex (2,6 x 90 cm kolonne, 0,8M, pH 4,8, elueringsmiddel: Et^NHOAc, 70 ml/time i gjennomstrømningshastighet, 8 ml fraksjoner og påvisning ved 278 nm). Fraksjonene 91-114 ble oppsamlet og lyofilisert, noe som ga tittelforbindelsen som et fargeløst faststoff, 285 mg. ;EKSEMPEL XIII ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Alanyl- Tyrosin Tittelforbindelsen ble fremstilt ved solid-fase-metoden, idet man startet med BOC-Tyr(BzlCl2)harpiksester (0,32 meq/g, 3,2 g). De følgende standardrutiner ble brukt: ;Fjerning av beskyttende gruppe - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i ;1 min, så 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min; Vasking - 15 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang, fulgt av 15 ml IPrOH i 1 min, så 15 ml CH2C12 to ganger 1 min hver gang; ;Nøytralisering - 15 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2h min. hver ;gang; ;Kopling - 3,0 mmol av den beskyttende aminosyren (0,46 g) ;og HOBT ble oppløst i 2 ml DMF og så fortynnet med 13 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 3 ml CH2C12, tilsatt blandingen av reaktanter og harpiksen og så omrørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen så koplet en gang med BOC-Ala, BOC<a->Bzl<6->Asp, BOC-Pro og A0C<a->Tos<g->Arg. Etter fjerning av beskyttende grupper ble harpikspeptidet acylert to ganger med 14% Ac20 i CH2C12 og 60 mg DMAP i 30 minutter. ;Harpiksen ble spaltet med HF/anisol (40 ml/10 ml) il time ved 0°C. Harpiksresten ble så behandlet med Et20 og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert i 100 ml 10% HOAc 1 time, filtrert, hvoretter filtratet ble lyofilisert til ;et råprodukt som veiet 1,08 g. ;Det urene peptidet ble renset på en DEAE Sephadex-kolonne (2,6 x 90 cm, 0, IM NH4HC03, pH 7,8 som elueringsmiddel, ;70 ml/time i gjennomstrømningshastighet, 6,4 ml fraksjoner og påvisning ved 280 nm). Fraksjonene 175-220 ble oppsamlet og lyofilisert, noe som ga 650 mg av tittelforbindelsen, 55%. ;Tynns j iktkromatograf i : silisiumdioksydgel G, 250 p. ;EKSEMPEL XIV ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin- N-Metylamid ;Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: ;A. Boc- Val- Tyr- NHCH3 ;En 500 ml 3-halskolbe ble utstyrt med gasstilførselsrør og en tørris-avkjølt såkalt kaldfingerkjøler med tørkerør. ;Kolben ble tilsatt Boc-Val-Tyr-OBzl (6,95 g, 14,8 mmol) ;og Et20 (250 ml). Ca. 20 g metylamin ble boblet inn i den omrørte suspensjon. Man fikk raskt en fargeløs oppløsning. Etter 1 time ble kolben lukket og lagret ved romtemperatur ;i 101 timer. Det resulterende faste produkt ble frafiltrert, og den overliggende oppløsningen ble fordampet til tørrhet. De samlede faste produkter ble behandlet med varm EtOAc, filtrert og lufttørket, noe som ga Boc-Val-Tyr-NHCH^, (produkt A) 5,03 g, 86%. ;B. Boc-( Bzl6) Asp- Val- Tyr- NHCH3 ;En omrørt oppløsning av 4,5M HCl-dioksan (7 ml) ble tilsatt 2,75 g av produkt A (7,00 mmol). Etter 1 time ble oppløs-ningen fordampet ved redusert trykk. Resten ble oppløst i vann og lyofilisert, noe som ga HC1•Val-Tyr-NHCH^ (produkt Bl) 2,28 g, 99%. ;En omrørt oppløsning av produkt Bl (2,28 g, 6,91 mmol) og Boc-(Bzl )-Asp-succinimidester (2,90 g, 6,90 mmol) i 5 ml DMF ble tilsatt N-metylmorfolin (NMM, 0,85 ml). Den resulterende blekt gule oppløsningen ble omrørt i 24 timer og så tilsatt 5% sitronsyre (150 ml). Det faste produkt ble frafiltrert og vasket med mettet vandig NaHCO^, vann og Et20. Det lysegule faste produktet ble lufttørket og omkrystallisert fra EtOAc/CH^OH, noe som ga produkt B, 3,45 g, 84%. ;C. Boc- Pro-( BzlB) Asp- Val- Tyr- NHCH3 ;En omrørt oppløsning av 4,5M HC1 i dioksan (10 ml) ble tilsatt produkt B (2,80 g, 4,68 mmol). Etter 1 time ble opp-løsningen fordampet ved redusert trykk. Residuet ble opp-løst i vann og lyofilisert, noe som ga HCl-(Bzl )Asp-Val-Tyr-NHCH3, (produkt Cl), 2,3 6 g, 92% ;En omrørt oppløsning av produkt Cl (2,31 g, 4,32 mmol) og Boc-Pro-hydroksysuccinimidester (1,35 g, 4,32 mmol) i 10 ;ml DMF ble tilsatt 0,55 ml NMM. Oppløsningen ble omrørt ;i 22 timer og så tilsatt en mettet vandig NaHCO^-oppløs-ning. Produktet ble frafiltrert, vasket med vann, 10% sitronsyre og vann. Det lyst gule produktet ble lufttørket og omkrystallisert fra EtOAc, noe som ga produkt C i et utbytte på 2,32 g, 77%. ;D. HC1•( NO^) Arg- Pro-( BzlB) Asp- Val- Tyr- NHCH3 ;En omrørt oppløsning av 4,5M HC1 i dioksan (5 ml) ble tilsatt produkt C (2,02 g, 2,90 mmol). Man fikk dannet et bunnfall etter ca. 10 minutter. Etter 1 time ble suspensjonen fordampet ved redusert trykk. Resten ble oppløst i vann og lyofilisert, noe som ga HCl-Pro-(Bzl )Asp-Val-Tyr-NHCH3 (produkt Dl) 1,75 g, 95% som et fargeløst pulver. ;En omrørt oppløsning av produkt Dl (1,73 g, 2,74 mmol), (BOC<a->NOg)Arg (87,9%, 0,99 g, 2,73 mmol), 1-hydroksybenzotriazol (HOBT, 0,42 g) og 0,33>ml NMM i 5 ml DMF ble tilsatt dicykloheksylkarbodiimid (DCC, 0,56 g). Man fikk et bunnfall etter 5 minutter. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen frafiltrert, og filtratet behandlet med mettet vandig NaHC03. Produktet ble oppsamlet, vasket med vann, 10% sitronsyre og så med vann. Det fargeløse produktet ble lufttørket og behandlet i varm EtOAc, noe som ga Boc(N02)-Arg-Pro-(Bzl<B>)-Asp-Val-Tyr-NHCH3 (produkt D2) 2,04 g, 83%. ;En omrørt oppløsning av 4,5M HC1 i 5 ml dioksan ble tilsatt 1,92 g av produkt D2. Etter 1 time ble den pastaaktige reaksjonsblandingen fordampet ved redusert trykk. Resten ble oppløst i vann og lyofilisert, noe som ga 1,64 g av produkt D, 92%. ;E. Aca- Arg- Pro- Asp- Val- Tyr- NHCH3 ;En omrørt oppløsning av produkt D (1,61 g, 1,93 mmol) og 0,33 g N-acetoksy-succinimid i 5 ml DMF ble tilsatt 0,71 ml DIEA. Etter 3 timer ble blandingen fordampet under redusert »trykk. Etter at resten var behandlet med H20 og van-net avhelt, så ble det resulterende faste produkt oppløst i 50% vandig HOAc (100 ml). Etter at oppløsningen var renset med nitrogen, tilsatte man 0,5 g 10% Pd/C, og produktet ble underkastet en hydrogenering i et Parr-apparat (500 ml kar, trykk 3,35 kg/cm<2>). Etter 68 timer ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom et mikroporefil-ter, fordampet ved redusert trykk, oppløst i vann og lyofilisert. Det resulterende urene produktet, produkt El, veiet 1,21 g. ;Det urene acetylerte pentapeptidet ble først renset på en Sephadex SPC-25 (2,6 x 85 cm kolonne, 0,05M NH40Ac, pH 4,5, 100 ml/time i gjennomstrømningshastighet, fraksjoner på ;10 ml). Fraksjonene 38-75 ble slått sammen og lyofilisert og ga 3219-18201, 600 mg. På grunn av lav renhet (92% ved HPLC), ble halvparten av produktet kromatografert omigjen på Sephadex DEAE (2,6 x 81 cm kolonne, 0,03M NH4HC03, pH 8,9, 100 ml/time i gjennomstrømningshastighet, fraksjoner på 10 ml). Fraksjonene 40-50 ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga 375 mg av tittelforbindelsen, 49%. ;Tynnsj iktkromatografi: ;EKSEMPEL XV ;Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Glutamyl- Valyl- Tyrosin- amid Tittelforbindelsen ble fremstilt ved solid-fase-metoden idet man gikk ut fra en p-metylbenshydrylaminharpiks (U.S. Biochemical 31578, 4,0 g, 0,25 mekv/g). De føl-gende standardrutiner ble brukt: ;Fjerning av beskyttende grupper - 30 ml 50% TFA/CH2C12;i 1 min. og så 30 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 min; ;Vasking - 30 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang, fulgt ;av 30 ml iPrOH i 1 min. og så 30 ml CH2C12 to ganger 1 min. hver gang; ;Nøytralisering - 30 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2,5 min. ;hver gang; ;Kopling - 3,0 mmol av den beskyttende aminosyren (0,46 g) ;og HOBT ble oppløst i 3 ml DMF og så fortynnet med 27 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 5 ml CH2C12 og tilsatt blandingen av reaktanter og harpiksen, og det hele ble rørt i 2 timer. ;I rekkefølge ble harpiksen koplet en gang med BOC-Val, BOC-Bzl<Y->Glu, BOC-Pro og AOC<a->Tos<g->Arg. Etter fjerning av beskyttende grupper ble harpikspeptidet acylert en gang med 10% Ac20 i 1:1 DMF:CH2C12 og 60 mg DMAP i 1 time. Harpiksen ble vasket, lufttørket og spaltet i HF/anisol ;(30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C. ;Harpiksresten ble så behandlet i Et20 og så filtrert. ;Det faste produkt ble ekstrahert med 100 ml 0,3% NH^OH i ;1 time, filtrert, hvoretter ekstraktet ble lyofilisert til et urent peptid som et fargeløst faststoff, 378 mg. ;Det urene produktet ble først renset på SPC25 Sephadex ;(2,6 x 83 cm kolonne, 0,03M, pH 4,5, NH^OAc-elueringsmiddel, 75 ml/time, 10 ml fraksjoner, påvisning ved 278 nm). Fraksjonene 140-172 ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga et produkt. ;Ovennevnte produkt ble kromatografert omigjen på en DEAE Sephadex (2,6 x 89 cm kolonne, 0,03M pH 8,9 NH4OAc, 75 ml/time, 10 ml fraksjoner, påvisning ved 278 nm). Fraksjonene 36-46 ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga en tittelforbindelse på 210 mg. Tynnsjiktkromatografi: 250u silisiumdioksydgel G ;EKSEMPEL XVI ;Na- acetyl- D- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosin- amid Tittelpeptidet ble syntetisert ved hjelp av solid-fase-metoden i et Beckman 990B automatisk peptidsynteseapparat. Syntesen startet med 4_,_00 g p-metylbenzhydrylaminharpiks, substitusjonsnivå på 0,25 mmol pr. g. 50% trifluoreddiksyre i metylenklorid ble brukt under fjerning av beskyttende gruppe, 5% diisopropyletylamin i Cf^C^ i nøytralisasjons-trinnet og DCC-HOBt i koplingstrinnet. De følgende amino-syrederivater ble deretter koplet i rekkefølge på harpiksen: BOC-Tyr(BrZ), BOC-Val, BOC-Asp(6-Bzl), BOC-Pro og BOC-D-Arg(Ng-tosyl). • Etter inkorporering av D-Arg ble harpiksens beskyttende grupper fjernet, den ble så nøytra-lisert og omsatt med eddiksyreanhydrid i dimetylformamid med 4-dimetylpyridin som katalysator. Harpiksen ble vasket og tørket i vakuum. Den tørkede harpiksen veiet 5,15 g. Peptidet ble avspaltet fra harpiksen med 50 ml HF inneholdende 5 ml m-kresol ved 0°C i 1 time. Etter vakuum-fjerning av nevnte HF, ble resten vasket med etylacetat og eter. Peptidet ble ekstrahert med 100 ml 5% vandig eddiksyre. Ekstraktet ble så lyofilisert, noe som ga 658 mg urent peptid. ;Ovennevnte peptid ble renset ved kromatografering to ganger på ioneutbytningsharpiks. Den første elueringen var på en 2,6 x 100 cm kolonne av DEAE-Sephadex med 0,05M NH4HC03, pH 8,0. Fraksjonene 57-66 (10 ml hver) ble slått sammen og lyofilisert. Produktet på 572 mg ble påsatt en 2,6 x 90 cm kolonne av SP-Sephadex og eluert med 0,02M NH4OAc, ;pH 4,6. Fraksjonene på 7,5 ml ble slått sammen. Hovedtoppen ble del i tre fraksjoner. Fraksjonene 190-215, 216-240 og 241-285. Det lyofiliserte utbyttet og renheten (HPLC) på disse fraksjonene var følgende: 48 mg (98,8%), 107 mg (98,4%), 232 mg (97,3%). ;TLC, silisiumdioksydgel 60: ;;Aminosyreanalyse: ;Asp, 0,99; Pro, 1,02; Val, 1,03; Tyr, 0,96; Arg, 1,01; ;80,5% peptid ;EKSEMPEL XVII ;N°- Acetyl- Arginyl- 3, 4- dehydro- Prolyl- Aspartyl- Valyl-Tyrosinamid ;Tittelforbindelsen ble fremstilt på følgende måte: ;BOC- 3, 4- dehydro- Prolin ;3,4-dehydro-Pro (200 mg, 1,76 mmol) ble oppløst i dioksan/ H20 (8 ml,2:1). Oppløsningen ble tilsatt 1,8 ml IN NaOH og 436 mg di-t-butyldikarbonat (2 mmol) ved 0°C under om- ;røring. Blandingen ble så omrørt ved romtemperatur over natten. Dioksanet ble fjernet, og den gjenværende vann-fasen ble tilsatt 20 ml etylacetat. Blandingen ble avkjølt på et isbad, surgjort til pH 2,0 med 0,5N saltsyre og så overført til en skilletrakt. Det organiske laget ble ut-skilt, og det vandige laget ekstrahert to ganger med EtOAc (2 x 20 ml). Den samlede organiske fase ble tørket over natriumsulfat og filtrert. Oppløsningsmidlet ble fjernet, og resten ble tørket og brukt uten ytterligere rensing. ;Na- Acetyl- Arginyl- 3, 4- dehydro- Prolyl- Aspartyl- Valyl-Tyrosinamid ;Peptidet ble syntetisert på en (p-metyl)benzhydrylaminharpiks (2 g harpiks, substitusjon av 0,25 mmol av NH2 pr. g harpiks) ved solid-fase-metoden. Inkorporering av BOC-Tyr-(Bzl), BOC-Val, BOC-3,4-dehydro-Pro og Aoc-Arg-(Tos) ble utført via en DCC-kopling. Koplingen ble kon-trollert ved hjelp av den kvalitative ninhydrinprøven. Acetyleringen av arginin ble utført med 50% eddiksyreanhydrid/pyridin (15 ml)og 15 mg DMAP. Peptidylharpiksen ble så vasket med DMF og metylenklorid og så tørket. Den tørkede peptidylharpiksen (2 g) ble spaltet med HF/anisol (20 ml, 9:1) ved 0°C i 1 time. Peptid-harpiksblandingen ble vasket med 3 x 20 ml eter. Etter lyofilisering ble peptidet påsatt en Sephadex SPC-25 kolonne (50 x 0,9 cm) og ekvilibrert med 0,02M NH4OAc, pH 4,6. Gjennomstrøm-ningshastigheten var 80 ml/time og man oppsamlet fraksjoner på 12 ml. Produktet ble eluert mellom rørene 22-39, ;og disse fraksjonene ble slått sammen og lyofilisert. ;Det lyofiliserte materialet ble renset igjen på en Sephadex SPC-25-kolonne (60 x 2,5 cm) som var ekvilibrert med 0,02M NH4OAc, pH 4,5-6,8 under de samme betingelser som beskrevet ovenfor.' Peptidet ble denne gangen eluert mellom rørene 55-75, og disse fraksjonene ble slått sammen lyofilisert, noe som ga 80 mg av tittelproduktet. ;Rf 0,45 (n-BuOH/HOAc/H20/Pyr 15:3:12:10, silisiumdioksydgel F60) Rf 0,27 (n-BuGH/HOAc/H20 3:1:1 , silisiumdioksydgel F60) ;Aminosyreanalyse: ;Asp, 1,04; Val, 1,00; Tyr, 0,85; Arg, 0,96; 3,4-dehydro-Pro, 1,08; peptidinnhold: 72%, hygroskopisk forbindelse 3,4-dehydro-Pro ble eluert meget nær Asp-resten ;i analysen, og hadde en meget lav KF-verdi. ;i ;HPLC: Whatman Partisil - ODS-kolonne ;10% CH3CN/0,02M NH4OAc, pH 4,6 ;Gjennomstrømningshastighet: 2 ml/min ;Peptidet var 99,7% rent og hadde en tilbakeholdelses- ;tid på 14,3 min. ;EKSEMPEL XVIII ;Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosinamid ;) Tittelforbindelsen.ble fremstilt på følgende måte: ;Z- Arg ( Z, Z ) - Pro- Asp ( OBzl) - Val- Tyr- NH-, ;En oppløsning av HCl-Pro-Asp(OBzl)-Val-Tyr-NH2 (0,5 g, ;0,7 mmol) i 15 ml DMF ble under omrøring ved 0°C tilsatt ;i DIEA (0,14 ml, 0,7 mmol) og Z-Arg(Z,Z)-ONp (0,7 g, 1 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur over en weekend. Oppløsningsmidlet ble fjernet i et roterende fordampnings-apparat. Resten ble behandlet med eter og så filtrert. ;Det faste stoff ble omkrystallisert fra CH^OH og CH2Cl2/eter/ ;i petroleter-blanding, noe som ga 0,59 g produkt. R^ 0,78 1 (n-BuOH/HOAc/H*-0 = 3:1:1, silisiumdioksydgel, 200 u) ;

H-NMR (DMSO-dg) indikerte et nærvær av en Z-Arg(Z,Z)-

gruppe.

i Arg- Pro- Asp- Val- Tyr- NH2

Z-Arg(Z,Z)-Pro-Asp(OBzl)-Val-Tyr-NH2 (0,5 g) ble hydroge-

nert med palladium på trekull (0,5 g) og 0,5 g ammonium-

format i 40 ml metanol over natten. Katalysatoren ble

frafiltrert, og filtratet fordampet i et roterende fordamp-ningsapparat. Resten ble oppløst i vann og så lyofilisert. Det urene peptidet ble så plassert på en Sephadex DEAE-kolonne (60 x 2,5 cm) og eluert med 0,01M NH4HC03, pH 7,9. Gjennomstrømningshastigheten var 90 ml/time og man oppsamlet fraksjoner på 10 ml. Peptidet ble eluert mellom rørene 17-29, og disse ble slått sammen og lyofilisert til 290 mg av tittelproduktet.

RfI =0,32 (n-BuOH/HOAc/H20/Pyr = 15:3:12:10, silisiumdioksydgel F60)

RfII = 0,05 (n-BuOH/HOAc/H20 = 3:1:1, silisiumdioksydgel

F60)

Aminosyreanalyse:

Arg, 1,01; Pro, 1,01; Asp, 1,00; Val, 1,01; Tyr, 0,97.

Peptidinnhold: 71%

HPLC: Whatman Partisil - ODS-kolonne

10% CH3CN/0,02M KH2P04 buffer (pH 3,5)

Gjennomstrømningshastighet: 3 ml/min

Peptidet hadde en oppholdstid på 6,3 min. og var 99,5% rent.

EKSEMPEL XIX

Na- Acetyl- Arginyl- Prolyl- Aspartyl- Valyl- Tyrosyl- Glycin- amid Tittelforbindelsen ble fremstilt ved solid-fase-metoden, idet man gikk ut fra p-metylbenzhydrylaminharpiks (U.S. Biochemical 31578, 4,2 g, 0,25 mekv/g). De følgende standardrutiner ble brukt:

Fjerning av beskyttende gruppe - 40 ml 50% TFA/CH2C12 i

1 min, så 50 ml 40% TFA/CH2C12 i 30 min.

Vasking - 40 ml CH2C12 to ganger 1 min hver gang, fulgt av 40 ml iPrOH i 1 min, og så 40 ml CH2C12 to ganger, 1 min hver gang;

Nøytralisering - 40 ml 5% DIEA/CH2C12 to ganger 2h min hver

gang ;

Kopling - 3,0 mmol av den beskyttende aminosyren og 0,46 g HOBT ble oppløst i 2 ml DMF og så fortynnet med 28 ml CH2C12. 0,62 g DCC ble oppløst i 5 ml CH2C12, tilsatt blandingen av reaktanter og harpiks og omrørt i 2 timer.

I rekkefølge ble harpiksen så en gang koplet med BOC-Gly, BOC-Tyr(BrZ), BOC-Val, BOC-Bzi<e->Asp, BOC-Pro og A0C<a->Tos<g->Arg. Etter fjerning av beskyttende grupper ble harpiks-peptidet acylert en gang med 10% Ac20 i 1:1 DMF:CH2C12

(18 ml) og 0,3 g DMAP i 60 minutter. Harpiksen ble vasket, lufttørket og spaltet.i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C.

Harpiksresten ble så behandlet i Et20 og filtrert. De faste stoffer ble ekstrahert med 0,3% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtrert, hvoretter ekstraktet ble lyofilisert og dette ga 720 mg av det urene peptidet som et fargeløst faststoff.

Peptidet ble så renset på en DEAE Sephadex-kolonne (2,6 x 89 cm, 0,03M NH4HCC>3, ubufferet, 75 ml/time, 7 ml fraksjoner, påvisning ved 278 nm). Fraksjonene 42-52 ble slått sammen og lyofilisert, noe som ga 425 mg av tittelforbindelsen . Tynnsj iktkromatografi, 250u silisiumdioksydgel G

EKSEMPEL XX

Ved å følge de fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor og som er anvendt i eksemplene I-XIX fremstilte man følgende forbindelse : N-a-Acetyl-Arginyl-Prolyl-Aspartyl-Valyl-N-a-metyl-Tyrosin, solvatert

Aminosyreanalyse: Arg 1,02, Pro 1,00, Asp 1,00, Val 1,04,

73,5% peptidinnhold

Tynnsjiktkromatografi, silisiumdioksydgel G250F, hard overflate

EKSEMPEL XXI

Induksjonsprøve

Prothymocytter (Thy-1 ) og pro-Lyb-2-celler ble samanriket fra B6-Lyb-2,1 kongenisk musemilt ved en BSA-tetthets-gradientsentrifugering (Pathocyte 5, Miles Laboratories, porsjon 35, 1 ml av 35:29:26:23:18:12%). 26:23 og 23:28 interfaselagene ble slått sammen, og Thy-1<+> og Lyb-2<+->cellene ble fjernet ved en reaksjon med monoklonalt Thy-1,2 og Lyb-2,1-antistoff og festet til plater belagt med affinitetsrenset kanin-antimus F(ab)2. De vaskede ikke-tilfestede cellene ble brukt i begge prøver. Utgangs-populasjonen inneholdt 30-40% prothymocytter og 30-40% pro-Lyb-2-celler (kjent for å representere separate for-løperpopulasjoner). 5 x 10<6->celler/0,5 ml RPMI 1640 ble inkubert i 5 ml plastrør med like volumer av induseririgs-populasjon i en seriefortynning i RPMI 1640 i en fuktig 5% CG^-atmosfære i 3 timer. Cellene ble så bedømt separat for Thy-1 og Lyb-2,1 ekspresjon med monoklonalt antistoff i optimal konsentrasjon ved Protein-A-SRBC-metoden til Scheid og Triglia, Immunogenet., 9, 423-433 (1979) (kontroll uten induseringspopulasjon registrerer <5% induserte celler). De foreliggende peptider stimulerer induksjon av Thy-l<+->celler (T-celler) og er således karakterisert ved

å ha biologisk aktivitet. De foreliggende peptider hvor X er GLU eller D-GLU stimulerer også induksjon av Lyb-2,1<+->celler (B-celler), så vel som T-celler. Som en sammenligning så ga et kontrollpeptid NH2-TYR-ARG-LYS-ASP-VAL-OH ingen stimulering eller ingen induksjon av hverken T-celler eller B-celler.

EKSEMPEL XXII

Reseptorprøve

Materialer - CEM-cellelinjer ble kjøpt fra Amercian Type Culture Collection. 3-nitro-2-pyridinsulfonylklorid og 2-pyridinetiol-l-oksyd ble tilveiebragt fra Dr. Rei Matsueda, Sanyo Laboratories, Tokyo. RPMI-1640, storfeserum fra foster og L-glutamin fikk man fra Gibco, gentamycin fra Schering og lectin-koplede agaroseperler fra Vector Laboratories. Sephadex ble kjøpt fra Pharmacia

Fine Chemicals, kanin-antithymopoietin-antistoff fra Accurate Chemical Scientific Corp., ubiquitin fra Peninsula Laboratory og humant IgG fra Miles Laboratories. Alle andre kjemikalier ble kjøpt fra vanlig kommersielle kjemiske firmaer og var av analysekvalitet.

De følgende forkortelser er brukt: PBS - fosfatbufferet saltoppløsning, TCA - trikloreddiksyre, SDS - natrium-dodecylsulfat, Con A - conkanavilin A, TP - thymopoietin, PEG - polyetylenglykol, BSA - storfeserum-albumin, I.P. - intraperitonealt, PMSF - fenylmetylsulfonylfluorid,

FTA - facteur thymique serique, CRF - cortikotropin-frigjørende faktor, ACTH - adrenocortikotropint hormon, Hepes - N-2-hydroksyetylpiperazin-N-2-etan-sulfonsyre.

Cyklisk nukleotidprøve - CEM-cellelinjen ble dyrket i forskjellige tidsrom og høstet slik det er beskrevet neden-for. Cellene ble vasket tre ganger i PBS, igjen suspendert i RPMI-1640 i en konsentrasjon på 3,12 x 10<7->celler pr. ml og hensatt for ekvilibrering ved 37°C i 30 minutter før de ble tilsatt 100 ng storfethymopoietin (25 ul,

4,0 ug/ml) til 1 ml av cellene. Inkubering ble fortsatt i 4-5 minutter i et rystende vannbad og så avsluttet ved å tilsette 1 ml iskald 10% TCA med homogenisering og lyd-behandling for å frigjøres cykliske nukleotider. Suspensjonen ble så sentrifugert ved 3000 x g i 20 minutter ved 4°C. Bunnfallet ble oppløst i 0,1N NaOH, og proteininn-holdet bestemt ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskre-

vet av Cadman et al., Anal. Biochem., 96, 21-23. TCA ble fjernet fra den overliggende væske ved ekstraksjon fire ganger med 5 ml vannmettet dietyleter. Etter siste ekstraksjon ble de siste spor av eter fjernet ved oppvarming i 10 minutter i et vannbad på 50°C. Prøven ble så lyofilisert og rekonstituert i 50 mM acetatbuffer, pH 6,2, idet man brukte en radioimmunologisk prøve for påvisning av cykliske nukleotider.

Fremstilling av membran glykoprotein - CEM-human lymfoid-cellelinjen ble dyrket i RPMI-1640 tilsatt 10% varme-inaktivert storfeserum fra foster, 2 mM storfeserum fra foster, 2 mM L-glutamin og 50 ug/ml gentamycin ved 37°C

i en fuktig atmosfære inneholdende 5% CO~, til en slutt-tetthet på 3-4 x 10 6 celler/ml. På o denne konsentrasjonen var cellene i den første stasjonære fase av vekstkurven og mer enn ca. 90% av cellene var levende, noe som ble påvist ved trypan blue-eksklusjonsprøven.

Membranglukoproteinene ble fremstilt ved en modifikasjon av den teknikk som er beskrevet av Hedo et al., Biochem, 20, 3385-3393. Cellene ble vasket en gang med PBS og ble suspendert i 40% sukrose, 50 50 mM Hepes, 1% EDTA, 0,1% 0-fen-antrolin og 1 mM PMSF (i metanol), pH 7,8, og det hele ble homogenisert i et glasshomogeniseringsapparat ved romtemperatur. Den totale suspensjonen ble så underkastet lydned-brytning ved hjelp av en såkalt celle-oppbrytningssonikator utstyrt med en kopptilfestning (modell W-225R) ved 35°C i 10 minutter. Suspensjonen ble sentrifugert ved 600 x g i 10 minutter ved 4°C i en Sorval GLC-3-sentrifuge, og den overliggende væske ble omsentrifugert ved 20.000 x g i en Sorval 5B-sentrifuge ved 4°C i 3 minutter. Den frmstilte urene membranfraksjonen ble suspensjon i 50 mM hepes, 10 mM MgS04 og 1 mM PMSF, pH 7,8, til en sluttproteinkonsentra-sjon på 5 mg/ml. Oppløsning av proteinet ble utstyrt ved å omrøre suspensjonen i 2 timer ved 2 5°C i nærvær av 1% Triton X-100 (sluttkonsentrasjon) og 0,1% brij-96 (poly-oksyetylen 10, oleyleter) (sluttkonsentrasjon). Suspensjonen ble sentrifugert ved 2000 x g i 2 timer ved 4°C,

og den overliggende væske lagret ved -70°C. Oppløselig proteinkonsentrasjon ble målt ved hjelp av den teknikk, som er beskrevet av Cadman et al., idet man brukte BSA

som enstandard, og buffer som en kontroll.

Hvetekim-agglutinin eller ricinus-communis-agglutinin-I ble brukt for rensing av reseptorproteinet. Alle leutin-perlene ble lagret ved 4°C med sine tilsvarende monosakkaridinhibitorer (300 mM).

For hver rensing ble 2 ml lectin-agarose pakket inn i en kolonne med en diameter på 1 cm og vasket ved romtemperatur med 25 ml 0,15M NaCl, 50 mM Hepes, 0,1% Triton X-l og 0,01% SDS, pH 7,8.

Kolonnene ble vasket med 200 ml 0,15M NaCl, 50 mM Hepes

og 0,1% Triton X-100, pH 7,8, fulgt av en sluttvask med nevnte buffer inneholdende 10 mM MgS04. 1 mM PMSF ble tilsatt alle buffersystemene. Oppløseliggjorte membranprote-iner (ca. 10 mg) ble resirkulert fem ganger gjennom individuelle kolonner. Kolonnen ble så vasket med 100 ml 0,15M NaCl, 50 mM Hepes, 10 mM MgS04 og 0,1% Triton X-100, pH 7,8 ved 4°C. Monosakkaridinhibitorer i en konsentrasjon på 400 mM i 3 ml vaskebuffer ble brukt for individuelle kolonneelueringer; N-acetylglukosamin for hvetekim-agglutinin og e-metyl-D-galaktosid for ricinus-communis-agglutinin-I. Monosakkaridene ble påsatt kolonnen som ble stoppet i 30-40 minutter for å få en ekvilibrering og så eluert videre. Proteineluatet ble dialysert mot 500 ml 50 mM Hepes, 10 mM MgS04 og 0,1% Triton X-100, pH 7,8 ved 4°C.

Fremstilling av radiomerket thymopoietin - Thymopoietin ble oppløst i 2,OM natriumkarbonat-bikarbonatbuffer, pH 9,8, for å oppnå frie aminogrupper. Man tilsatte så 3-nitro-2-pyridinsulfonylklorid i dioksan (10:1 mol) og hele oppløsningen ble omrørt i 5 timer ved 20°C. Etter tilsetning av vann ble uoppløselig materiale frasentri-fugert. Det beskyttede peptid ble renset ved å bruke Sephadex G-25-kromatografi fulgt av en nedbrytning med post-prolin-spaltende enzym for å fjerne det NH_-terminale

125

blokkerte prolinet. Metyl-3,5-di( I)jodhydroksybenzimi-dat (4000 Ci/mM) ble oppnådd i en konsentrasjon på 5,5 mCi/ ml i metanol og fordampet til tørrhet. Den jodbehandlede imidoesteren (1,4 nM) ble omsatt med beskyttet thymopoietin (5 ug, 0,9 nM) ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Wood et al., Anal. Biochem., 69, 339-349, med de følgende modifikasjoner. Reaksjonen ble utført i 500 ul av en 0,16M boratbuffer, pH 9,1, i 24 timer ved 4°C. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 500 ul av en 2M sitratfosfatbuffer, pH 5,5, ved 4°C. Prøvene ble kromatografert på en Biogel P-10 kolonne i natriumpyrofosfat,

pH 7,5 (15 dråper/fraksjon), ved 4°C for å utskille det frie jodet.

Det jodbehandlede peptidet ble oppløst i vann og behandlet med 2-pyridinetiol-l-oksyd (10:1 mol) i 5 timer ved romtemperatur for å fjerne de beskyttende grupper. Det merkede peptidet ble renset på en Biogel P-10-kolonne. Man opp-nådde tre radioaktive topper, og de første to var immuno-aktive med kanin anti-thymopoietin-antistoff. Den første toppen ble så påsatt en 1 x 60 kolonne av DEAE-Sephadex A-25 som var ekvilibrert med 50 mM Tris-buffer, pH 7,0. Joderingsblandingen ble eluert med denne bufferen idet man brukte en lineær gradient med økende ionestyrke fra ekvili-breringskonsentrasjonen og opptil 1,0M. Radioaktiviteten for hver fraksjon ble bestemt ved hjelp av et LKB 1280 Ultra gamma-spektrometer.

Fraksjonene med den høyeste radioaktivitet fra hver rensning ble analysert for binding med et overskudd av antithymopoietin-antistoff. Fraksjonene fra topp II (fraksjonene 35-45) på DEAE-Sephadex A-25-kolonnen viste den høyeste spesifikke bindingen og ble følgelig brukt i den etter-følgende radioreseptorprøven.

Jodert thymopoietin beholdt sin biologiske aktivitet slik dette kunne bedømmes ved å undersøke dets effekt i en neuromuskulær prøve (Goldstein, Nature, 247, 11-14 (1974))

og dens effekt på syntesen av vyklisk GMP ved hjlep av CEM-celler.

Bindingsprøve - Bindingsbufferen ble fremstilt ved å tilsette 12 g Piepes, 1,2 g MgS04 og 1,2 g BSA til 1000 ml glass-destillert vann. Man fikk en pH på 7,65 ved hjelp av IN NaOH. Denne lagerstandardoppløsningen ble brukt for å fremstille prøvebuffer og ble brukt i en uke. Prøven ble utført i et glassrør på 12 x 75 mm ved at man tilsatte 100 ul av standardoppløsningen, 25 ul av reseptorproteinet (150-200 ug/ml), 25 ul 125I-TP (80.000 cpm)) og 20 ul 1% Triton X-100, hvoretter volumet ble øket til 200 ul med prøvebuffer. Etter inkubering 18 timer ved 4°C tilsatte man 200 ul humant IgG (1,5 mg/ml) (som bærestoff) og 200 fal 35% PEG-8000 i PBS, pH 7,56, hvoretter det hele ble blan-det og inkubert i 30 minutter på is. Rørene ble så sentrifugert, og resten vasket med 10% PEG i PBS, pH 7,3, og tellet i en LKB-gamma-teller.

Radioaktiviteten i bunnfallet i nærvær av 1 mg/ml ikke-radioaktivt thymopoietin ble tatt som en standard som re-presenterte ikke-spesifikk binding. TCA ble tilsatt den overliggende væske (sluttkonsentrasjon 5%), og utfellbar radioaktivitet ble så målt. Alle prøver viste 95% eller

125 mer, noe som indikerte en minimal frigjøring av fritt I fra sporforbindelsen.

Konkurranseeksperimenter - Ved å bruke den ovennevnte bind-ingsprøve ble 2,3 x 10~<10>M av <125>I-TP inkubert med 4 g bindingsprotein og et prøvepeptid. Inkuberingen ble fortsatt i 12 timer og deretter undersøkte man fritt og bundet 125 I-TP som beskrevet ovenfor. De følgende representa-tive forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen ga en utbytning på minst 50% av den man fikk ved thymopoietinets selv-utbytning ved tilsvarende konsentrasjon: N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLN-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-ALA-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLU-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-ILE-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-LYS-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2;

H2N-ARG-AIB-ASP-VAL-TYR-OH;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NHCH3;

H-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2;

N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH; og N-a-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH.

Som en sammenligning så undersøkte man andre peptider som insulin, glukagon, veksthormon, somatostatin, B-endorfin, FTS, ACTH, CRF og ubiquitin, og ingen av disse ga noen påvisbar utbytning.

Claims (6)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av et enzymresistens immunomodulatorpeptid som har formelen: eller et farmasøytisk akseptabelt syre- eller baseaddisjonssalt derav, hvor: R er H, NH^, R 2 -NH2 eller CH^NH hvor R 2 er en laverealkyl- gruppe eventuelt substituert med karboksyl, W er PRO eller dehydro PRO; A er laverealkyl; B individuelt er H dersom A er C^- C^ laverealkyl og er ellers Cj-C^ laverealkyl; - A og B sammen danner -(CH^)^- eller -(CH^)^- ; X er D-ASP, ASP, D-GLU eller GLU; Y er GLY, VAL, PHE, ILE, LYS, GLN, GLU eller ALA; E er H eller C^- C^ laverealkyl; R" individuelt er H eller laverealkyl; forutsatt at V kan være D- eller L-isomer dersom R er forskjellig fra H, og videre forutsatt at ikke mer enn en av V, X og Y er en D-aminosyre, karakterisert ved at det utføres oppløsningspeptidsyntese innbefattende trinnvis kobling eller blokk-kobling av aminosyrer eller peptidfragmenter som inneholdes i den ovenfor angitte formel og nevnte fragment festes ved dannelse av amidbindinger derimellom og, om ønsket, et således oppnådd peptid omdannes til et farmasøytisk akseptabelt syre- eller baseaddisjonssalt derav.

2. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av peptidet N-a -suksinoyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av peptidet N-a-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av peptidet N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-ILE-TYR-OH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

5. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av peptidet N-oc-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLU-TYR-NH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

6. Analogifremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av peptidet N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLU-TYR-OH, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.