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CN1927879B - 胸腺五肽活性异构体及其在药物制备中的应用 - Google Patents

胸腺五肽活性异构体及其在药物制备中的应用 Download PDF

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CN1927879B CN2006100172094A CN200610017209A CN1927879B CN 1927879 B CN1927879 B CN 1927879B CN 2006100172094 A CN2006100172094 A CN 2006100172094A CN 200610017209 A CN200610017209 A CN 200610017209A CN 1927879 B CN1927879 B CN 1927879B
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Abstract

本发明的胸腺五肽活性异构体及其在药物制备中的应用属有机化学及化学药品领域。其结构是TP-5中的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr有1个或同时有2个氨基酸用其相对应的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。其制备方法是以常规的Fmoc固相肽合成法合成。药效学实验结果显示，胸腺五肽活性异构体具有显著的免疫增强作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用。体外活性和稳定性测定表明，其活性保持或者高于TP-5的水平，稳定性增强，半衰期提高，因此将大大增强肽类激素的疗效。本发明为胸腺肽活性机理的研究及新药开发提供了理论依据。

Description

胸腺五肽活性异构体及其在药物制备中的应用
技术领域
本发明属有机化学及化学药品领域，特别涉及胸腺五肽的活性异构体及其在制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物中的应用。
背景技术
胸腺是一级淋巴上皮组织，为人体首要的中枢免疫器官，也是T细胞发育的中心器官。它除了提供一个T细胞发育所需要的微循环外，还可以产生多种胸腺肽类激素。胸腺激素能促进T细胞亚群的分化和成熟，进而调节整个免疫系统的功能。哺乳动物成年后随着年龄的增长胸腺逐渐萎缩退化，胸腺激素的分泌量也逐渐降低。大量研究结果表明，老年传染病、肿瘤及自身免疫类疾病与胸腺萎缩、胸腺激素降低有关。当胸腺本身功能不足，或依赖胸腺的免疫系统出现明显的原发性或继发性缺陷、而自身的调节又不足以修复时，给予外源性胸腺激素就可以产生明显的疗效。
现已从胸腺激素中分离、纯化了几种胸腺肽，包括含有49个氨基酸残基的胸腺生成素II、由28个氨基酸残基构成的胸腺素α1和胸腺九肽等。胸腺五肽(TP-5)是胸腺生成素II的残基片段，文献报道它们仍具有胸腺生成素的活性。
胸腺五肽(TP-5)的氨基酸序列为Arg-Lys-Asp-Val-Tyr。结构如下：
其中的Arg表示精氨酸，Lys表示赖氨酸，Asp表示天冬氨酸，Val表示缬氨酸，Tyr表示酪氨酸。
实验室和临床研究结果均证明，在各种紊乱情况下，TP-5可以双向调节免疫系统的功能，它是一个很好的免疫调节剂，且没有任何毒副作用。注射TP-5可以使老年人的胸腺功能缺乏症得以正常化。此外，TP-5可以安全地清除自由基和脂质过氧化物，所以TP-5是一个非常优秀的临床治疗药物。TP-5是一个非常小的分子，分子量仅仅为679，所以它很容易被合成，早在1985年，TP-5在意大利就成为了商品，我国海南中和制药首先制取了该药。
TP-5对用传统方法很难控制的带状疱疹和单纯疱疹也是非常有效的。对其它种类的皮肤病也有同样的作用，如慢性皮肤真菌病、屈侧湿疹、特应性皮炎、变应性湿疹、全身硬皮病、银屑病及其它一些传染病。作为免疫调节剂，TP-5对慢性肝炎也可产生有效的作用，尤其是长期转氨酶水平低下，免疫功能缺陷，及其它治疗方法无效的疾病。它对慢性肝炎的作用，包括症状的消失和肝功能的恢复是非常有效的。TP-5对于治疗肿瘤病人的几种细胞免疫缺陷，尤其作为化疗时的免疫调节剂是令人鼓舞的。临床研究表明，肿瘤患者注射TP-5三十次以后生活质量明显提高，各种免疫指数，如NK细胞活性、白血球总数、淋巴转化率等明显增加，同时，CD4与CD8的比率趋于正常。很多结果表明，通常情况下，TP-5可以有效地增强患者的免疫功能，这对临床上增强患者的免疫功能是非常有意义的。
通过联合使用TP-5与吲哚美辛进行治疗的免疫调节，可以成功地恢复病人的IL-2的合成能力，以及完成手术后T细胞与巨噬细胞的相互作用。这些结果表明，保持术后病人的免疫功能是可能的。在肿瘤手术中，TP-5可以防止老年病人的术后感染及由损伤、烧伤、营养不良及血液中毒等引起的免疫失调。
总之，TP-5在几种免疫及相关疾病的临床研究中表现出双向调节功能。在一定程度上，它可以防止各种免疫缺乏，它是一个非常有效的免疫调节剂。
实验证明，胸腺肽在小肠可部分吸收，并能提高免疫功能。但胸腺五肽在体内易被各种酶类水解，如胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等，因此体内半衰期只有30秒。对于健康个体来讲，肽类激素在体内起到调节作用后迅速被清除是很正常的，但对于患者而言，需要给药治疗时，半衰期短对治疗不利，
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服背景技术TP-5的缺点，增强肽类激素的稳定性，延长它的半衰期以提高疗效。这对肽类激素是一个普遍需要解决的问题，尤其是TP-5，它的半衰期只有30秒，所以改造肽类激素的结构、增加它们在体内的稳定性、提高生物利用度是非常重要的。
本发明解决的技术问题的方案主要是对TP-5的结构进行改造，设计活性肽异构体，在TP-5原有结构的基础上，将其氨基酸序列中部分氨基酸用相应的β-氨基酸、γ-氨基酸代替，所得改造结构后的活性肽在保持原有活性的基础上，提高其稳定性，延长体内半衰期，提高其生物利用度，这对肽类药物的开发将具有重要意义。本发明还通过测定改造结构后的活性肽的活性及体内外稳定性，对它们的药理、药效进行了研究。实验结果表明这些异构体在保持了原有活性的基础上稳定性大大提高。这一发明还为胸腺肽活性机理的研究及新药开发提供了理论依据。
胸腺五肽活性异构体的结构是TP-5中的Arg-Lys-Asp-Val-Tyr有1个或同时有2个氨基酸用其相对应的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
优选的胸腺五肽活性异构体的结构是TP-5中的赖氨酸(Lys)或/和天冬氨酸(Asp)或/和缬氨酸(Val)有1个或同时有2个氨基酸用其相对应的β-氨基酸或γ-氨基酸代替的氨基酸序列。
所说的天冬氨酸(Asp)可以用β-谷氨酸(β-Glu)或γ-谷氨酸(γ-Glu)代替。
下面列举本发明的部分胸腺五肽的活性异构体，它们的代号和结构为：
LW501：    Arg-Lys-β-Asp-Val-Tyr
Figure S06117209420061020D000031
LW502：    Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
Figure S06117209420061020D000032
LW503：Arg-β-Lys-β-Asp-Val-Tyr
Figure S06117209420061020D000041
LW505  Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
Figure S06117209420061020D000042
本发明的TP-5活性异构体还可以是由β-Arg、γ-Arg，β-Val、γ-Val、β-Tyr代替TP-5氨基酸序列中的Arg、Val、Tyr而得到的各种结构。
本发明的胸腺五肽活性异构体以常规的Fmoc固相肽合成法制备。
原料及试剂：接肽树脂为王树脂(Wang树脂)。氨基酸衍生物分别为Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Asp-otBu、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH或Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
树脂用DMF溶胀30分钟，然后脱保护20分钟，用DMF洗涤，反应器中加入氨基酸衍生物及缩合剂，室温反应3小时，洗涤，再脱保护，加入氨基酸衍生物及缩合剂，重复进行至连接上所有的氨基酸。反应器中再加入切割试剂，室温反应1小时，然后过滤，滤液在乙醚中沉淀，得粗品。
粗产品的纯化：采用高效液相色谱法(HPLC)进行纯化。
洗脱液为三氟乙酸水溶液，乙腈。流速为20ml/min，监测波长为214nm。
本发明对胸腺五肽活性异构体的体外活性和体外稳定性作了测定。
体外活性的测定：
人外周血淋巴细胞和猪胸腺T淋巴细胞的表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，简称为E受体，其使T细胞可与SRBC形成玫瑰花结，这是成熟T细胞的特征之一。细胞经45℃加热1h或用胰酶处理可脱去E受体。胸腺肽可以促进脱E受体的T细胞重新合成E受体，因此可用脱E受体的E花环实验来测定胸腺肽的活性。
胸腺生成素能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原如ConA等激活后产生干扰素(IFN)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-3(IL-3)等多种淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平。淋巴细胞增殖实验是评估受检淋巴细胞功能的常用和主要指标，也是考核药物活性的有效手段。
体外血浆中稳定性的测定：
将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，结果它们比正常结构半衰期均长。
测定结果表明胸腺五肽活性异构体体外免疫活性保持或者高于胸腺五肽(TP-5)的水平。胸腺五肽活性异构体稳定性增强，半衰期大大提高。
本发明对胸腺五肽活性异构体作了一般药理学实验，结果表明对动物神经系统、心血管系统和呼吸系统均无显著影响。
本发明还对胸腺五肽活性异构体作了药效学实验，动物实验结果显示具有显著的免疫增强作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用。说明本发明的胸腺五肽的活性异构体能够在制备免疫调节药物或抗肿瘤药物或抗氧化药物中得到应用。
本发明的胸腺五肽的活性异构体在制备药物中的药物剂型可以是注射液或胶囊或片剂。
附图说明
图1是本发明的LW501的质谱图。
图2是本发明的LW502的质谱图。
具体实施方式
下面的实施例，可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 LW501的固相合成
原料：Frnoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-Asp-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH。偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。加入Fmoc-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
鉴定：用质谱(MS)测定其分子量，为679.77，与LW501相符(见图1)。
实施例2 LW502的固相合成
原料：Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH。偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应：取Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Val-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。加入Fmoc-Glu-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割：上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化：将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
鉴定：用质谱(MS)测定其分子量，为679.77，与LW502相符(见图2)。
实施例3 LW503、LW504、LW505的固相合成
将实施例1中的原料改换用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-Val-OHFmoc-Asp-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用与实施例1相同的方法可以合成出LW503。
将实施例1中的原料改换用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用与实施例1相同的方法可以合成出LW504。
将实施例1中的原料改换用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用与实施例1相同的方法可以合成LW505。
经质谱鉴定其分子量与LW503、LW504、LW505完全相符。
实施例4 TP5活性异构体Arg-Lys-Asp-β-Val-Tyr及Arg-γ-Lys-Asp-β-Val-Tyr的合成
将实施例1中的原料改换用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用与实施例1相同的方法可以合成TP5活性异构体Arg-Lys-Asp-β-Val-Tyr。
将实施例1中的原料改换用Fmoc-Tyr(tBu)-Wang树脂、Fmoc-β-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH，用与实施例1相同的方法可以合成TP5活性异构体Arg-γ-Lys-Asp-β-Val-Tyr。
经质谱鉴定其分子量完全相符。
实施例5玫瑰花结实验
1、T细胞的制备
取新鲜猪胸腺剪碎，100目筛过滤，用D-Hank′液洗涤，滤液中加入淋巴细胞分离液，2000转离心20分钟，吸取T细胞，用D-Hank′液稀释至细胞浓度为2.5×106个/ml。
2、绵羊红细胞的制备
取绵羊血1ml，用D-Hank′液洗涤三次，1500转/分离心3分钟，得到红细胞，再将其稀释至细胞浓度为2.5×107个/ml。
3、玫瑰花结的生成
取T细胞200μl加入样品(50μg/ml)100μl，30℃保温1小时，再加入绵羊红细胞200μl，4℃过夜。
用反应液涂片，显微镜下计数。
Figure S06117209420061020D000081
    样品   TP-5   LW501   LW502   LW503   LW504   LW505
结花增加率(％)   19.73   22.56   18.47   19.36   20.09   19.55
结论：TP-5活性异构体的活性相当于或略高于TP-5。
实施例6  细胞增殖实验
1、细胞悬液的制备
昆明鼠取脾放入D-Hank′液中研磨释放T细胞，再用D-Hank′液洗涤三次，最后用IMEM培养基稀释至细胞浓度为2.5×107个/ml。
2、反应体系
取细胞100μl，样品(50μg/ml)50μl加入96孔板中，二氧化碳培养箱中作用4小时，加入ConA 50μl作用44小时后，体系中加入MTT 20μl作用4小时，2000转/分离心5分钟。加入DMSO振摇20分钟，酶标仪570nm比色，计算刺激率。
Figure S06117209420061020D000091
细胞增殖实验结果：
    样品   TP-5   LW501   LW502   LW503   LW504   LW505
刺激率(％)   60.32   65.73   59.86   61.28   55.36   58.42
结论：TP-5活性异构体的对细胞增殖的影响与TP-5相当。
实施例7  体外血浆中稳定性的测定
为测定各异构体的体外稳定性，我们将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，结果它们比正常结构半衰期均长。
方法：新鲜人血浆37℃水浴活化30分钟，再加入样品，使样品的终浓度为50μg/ml，37℃水浴水解，每间隔1分钟取样品种400μl，加入醋酸400μl终止反应。样品用HPLC检测水解产物的浓度，求算出半衰期。
测定结果：
    样品     TP-5   LW501   LW502   LW503   LW504   LW505
半衰期(分)     1.2     3.5     3.9     2.6     2.8     1.9
结论：TP-5活性异构体的体外稳定性明显好于TP-5。
实施例8 TP-5活性异构体在药物中的应用——免疫增强作用
1、对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响
将60只小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、模型组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组和模型组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。于实验第6天，各组小鼠尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g，于注射后2及20min分别从眼眶静脉丛取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中摇匀，在680nm处测定光密度，计算吞噬指数K和吞噬活性α。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响(x±s)
组别     剂量(μg/kg)   动物数(只) 吞噬指数K 吞噬活性α
    对照     10   0.029±0.016<sup>**</sup>   5.24±1.01<sup>**</sup>
    模型     10   0.016±0.008   3.12±0.45
    TP-5     20     10   0.021±0.004<sup>*</sup>   4.24±1.02<sup>*</sup>
    LW501     20     10   0.036±0.018<sup>***</sup>   5.11±1.02<sup>***</sup>
    LW502     20     10   0.033±0.022<sup>***</sup>   5.67±1.03<sup>***</sup>
    LW503     20     10   0.040±0.020<sup>***</sup>   5.28±1.03<sup>***</sup>
    LW504     20     10   0.038±0.019<sup>***</sup>   5.02±1.01<sup>***</sup>
    LW505     20     10   0.035±0.021<sup>**</sup>   4.85±0.91<sup>**</sup>
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
2、对免疫抑制小鼠血清溶血素抗体生成的影响
动物分组给药同实验1，在给药第1天，每只小鼠用5％鸡红细胞0.2ml腹腔注射进行免疫，于实验第6天，各组小鼠眼眶静脉丛取血20μl，加入1ml生理盐水中摇匀，再加入5％鸡红细胞0.5ml，在冰浴中加入0.5ml补体(1∶10新鲜豚鼠血清)，在37℃恒温水浴中温育30min，在冰浴中终止反应3min，2000rpm离心10min，取上清1ml，加入3ml都氏液，室温静置10min后，在540nm处测光密度值。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增加环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠血清溶血素抗体的生成，作用明显强于对照TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对免疫抑制小鼠血清溶血素抗体生成的影响(x±s)
    组别 剂量(μ g/kg) 动物数(只)
    对照     10   0.032±0.011<sup>**</sup>
    模型     10   0.018±0.010
    组别 剂量(μ g/kg) 动物数(只)
    TP-5     20     10   0.027±0.009<sup>*</sup>
    LW501     20     10   0.040±0.020<sup>***</sup>
    LW502     20     10   0.039±0.019<sup>***</sup>
    LW503     20     10   0.042±0.023<sup>***</sup>
    LW504     20     10   0.040±0.011<sup>**</sup>
    LW505     20     10   0.036±0.012<sup>**</sup>
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3、体内对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
将50只小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组按10 ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。于实验第6天，末次给药1h后，所有小鼠脱颈椎处死。取脾按上述方法制备脾细胞，同上法培养后测定。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对小鼠脾淋巴细胞增殖具有显著促进作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
体内胸腺免疫活性肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(x±s)
  药物浓度(μg/kg)   cpm/1×10<sup>6</sup>细胞
    对照     0     4338±894
    TP-5     20     5125±1548<sup>**</sup>
    LW501     20     8341±1038<sup>***</sup>
    LW502     20     7563±1055<sup>***</sup>
    LW503     20     8652±1067<sup>***</sup>
    LW504     20     7132±1056<sup>***</sup>
    LW505     20     6676±1021<sup>***</sup>
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例9 TP-5活性异构体在药物中的应用——抗肿瘤作用
1、对荷S180肿瘤小鼠的影响
将50只小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、阳性药组、给药组。各组小鼠在无菌条件下，将S180瘤株(培养7日，1∶4稀释)接种在小鼠右侧腋下0.2ml/只。给药组按20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组腹腔注射20mg/kg环磷酰胺，每日一次，连续6日，末次给药1h后，称各组小鼠体重，脱颈处死小鼠。取瘤称重。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对S180移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为33～48％。
胸腺活性肽对荷S180肿瘤小鼠的影响(x±s)
  药物(μg/kg)     肿瘤重量(g)   抑制率(％)
  对照     0     2.41±0.31
  环磷酰胺     20000     0.74±0.29<sup>***</sup>     69.29
  TP-5     20     1.26±0.31<sup>***</sup>     46.11
  LW501     20     1.38±0.28<sup>***</sup>     47.72
  LW502     20     1.35±0.28<sup>***</sup>     44.35
  LW503     20     1.56±0.31<sup>***</sup>     46.76
  LW504     20     1.43±0.32<sup>***</sup>     40.66
  LW505     20     1.61±0.30<sup>***</sup>     33.20
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
2、对荷H22肿瘤小鼠的影响
实验过程同上，接种瘤株为H22瘤株。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对H22移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为34～49％。
胸腺活性肽对荷H22肿瘤小鼠的影响(x±s)
  药物(μg/kg)   肿瘤重量(g)   抑制率(％)
    对照     0   2.19±0.45
    环磷酰胺     20000   0.78±0.22<sup>***</sup>     64.38
    TP-5     20   1.11±0.35<sup>***</sup>     49.31
  药物(μg/kg)   肿瘤重量(g)   抑制率(％)
    LW501     20   1.36±0.34<sup>***</sup>     45.65
    LW502     20   1.35±0.38<sup>***</sup>     48.29
    LW503     20   1.28±0.37<sup>***</sup>     47.51
    LW504     20   1.24±0.32<sup>***</sup>     43.38
    LW505     20   1.43±0.51<sup>***</sup>     34.70
 与模型组比较  *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3、对荷瘤小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)的影响
动物分组给药同1，按文献方法[2]测定血清IL-2含量。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增加荷S180肿瘤小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)水平，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。表明胸腺活性肽具有提高荷瘤小鼠T细胞生长因子作用。
胸腺活性肽对荷S180肿瘤小鼠血清IL-2的影响(x±s)
  药物(μg/kg)     IL-2  (μg/L)
  对照     1.74±0.65
  TP-5     20     2.04±0.56
  LW501     20     3.24±0.56<sup>***</sup>
  LW502     20     3.65±0.59<sup>***</sup>
  LW503     20     3.41±0.60<sup>***</sup>
  LW504     20     3.02±0.64<sup>***</sup>
  LW505     20     2.91±0.81<sup>**</sup>
与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01，***P＜0.001
实施例10 TP-5活性异构体在药物中的应用——胸腺活性肽抗氧化作用
1、对小鼠脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的影响
将60只小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、模型组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组和模型组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。末次给药1h后，模型组和给药组按10ml/kg腹腔注射0.1％CCl4豆油溶液，正常组腹腔注射同体积豆油，禁食16h后，取脑、肝和胸腺组织，按Lowry法[3]测定蛋白质含量，按TBA法[4]测定脂质过氧化产物-丙二醛含量。胸腺免疫活性肽20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脑、肝和胸腺脂质过氧化产物-丙二醛升高均有明显的降低作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对小鼠脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的影响(x±s)
    药物(μ g/kg)     MDA(nmol/mg)
    脑   肝   胸腺
  对照     0     1.12±0.43<sup>*</sup>   0.14±0.09<sup>***</sup>   0.10±0.04<sup>***</sup>
  模型     0     1.51±0.22   0.34±0.09   0.31±0.07
  TP-5     20     1.03±0.30<sup>*</sup>   0.28±0.08<sup>*</sup>   0.25±0.08<sup>*</sup>
  LW501     20     0.60±0.23<sup>***</sup>   0.16±0.05<sup>***</sup>   0.19±0.08<sup>***</sup>
  LW502     20     0.56±0.22<sup>***</sup>   0.18±0.06<sup>***</sup>   0.18±0.06<sup>***</sup>
  LW503     20     0.58±0.25<sup>***</sup>   0.19±0.04<sup>***</sup>   0.20±0.08<sup>***</sup>
  LW504     20     0.64±0.26<sup>***</sup>   0.20±0.05<sup>***</sup>   0.21±0.06<sup>***</sup>
  LW505     20     0.76±0.21<sup>***</sup>   0.21±0.03<sup>***</sup>   0.21±0.09<sup>***</sup>
与模型组比较  *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
2、胸腺活性肽对小鼠超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
取实验10.1小鼠肝组织和血清，按试剂盒方法测定SOD活性。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脂质过氧化肝组织和血清SOD活性的降低均具有明显的增强作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对小鼠SOD活性的影响(x±s)
药物(μg/kg)   肝SOD(U/g)      血清SOD(nU/ml)
  对照     0   29.26±6.87<sup>***</sup>     162.24±9.40<sup>***</sup>
  模型     0   18.26±3.58     101.02±10.12
  TP-5     20   22.13±4.01<sup>*</sup>     121.26±10.24<sup>*</sup>
  LW501     20   28.61±4.98<sup>***</sup>     150.98±11.34<sup>***</sup>
  LW502     20   27.45±5.11<sup>***</sup>     154.87±11.25<sup>***</sup>
  LW503     20   28.33±5.02<sup>***</sup>     153.32±11.21<sup>***</sup>
药物(μg/kg)   肝SOD(U/g)      血清SOD(nU/ml)
  LW504     20   26.84±5.01<sup>***</sup>     142.65±10.54<sup>***</sup>
  LW505     20   24.98±4.86<sup>**</sup>     134.58±7.97<sup>**</sup>
与模型组比较  *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
3、对超氧阴离子自由基(O2 -)产生的抑制作用
反应体系含pH7.7缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，0.2mmol/L XAN，0.1mmol/LEDTA)0.97ml，细胞色素C(20mg/ml)0.01ml，不同浓度的药物0.01ml，XOD(0.9U/ml)0.01ml。按细胞色素C还原法测定还原型细胞色素C生成量[5]，以此间接计算超氧阴离子自由基(O2 -)的产生量。胸腺活性肽1μg/ml可明显抑制还原型细胞色素C生成量，表明胸腺活性肽对超氧阴离子自由基(O2 -)产生具有明显的抑制作用。
胸腺活性肽对超氧阴离子自由基(O2 -)产生的的影响(x±s)
药物(μg/ml)     Reduced Cytochrome C(nmol·mg<sup>-1</sup> protein·min<sup>-1</sup>)
  对照     0     19.2±1.9
  TP-5     1     15.4±1.8<sup>*</sup>
  LW501     1     14.38±2.0<sup>*</sup>
  LW502     1     16.3±1.9<sup>*</sup>
  LW503     1     15.8±1.7<sup>*</sup>
  LW504     1     16.1±1.8<sup>*</sup>
  LW505     1     14.6±1.4<sup>**</sup>
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例11 TP-5活性异构体在药物中的应用——注射液(氯化钠溶液)
分别称取实施例1、2的方法得到胸腺活性异构体LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100mg，溶于1000ml 0.9％氯化钠溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌制成产品。
实施例12 TP-5活性异构体在药物中的应用——注射液(水溶液)
分别称取实施例1、2的方法得到胸腺活性异构体LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100mg，溶于1000ml水中制成水溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌，制成成品。
实施例13 TP-5活性异构体在药物中的应用——胶囊    
分别称取实施例1、2的方法得到胸腺活性异构体LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100g，药用淀粉0.5kg，按公知的胶囊制备技术和装备制成胶囊，每粒10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下要求。
实施例14 TP-5活性异构体在药物中的应用——片剂
分别称取实施例1、2的方法得到胸腺活性异构体LW501、LW502、LW503、LW504、LW505各100g，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，氧化硅30g，按公知的制片技术和装备制成片剂，每片10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下要求。
附：
胸腺五肽活性异构体氨基酸序列表
胸腺五肽活性异构体     氨基酸序列
 LW501  Arg-Lys-β-Asp-Val-Tyr
 LW502  Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
 LW503  Arg-β-Lys-β-Asp-Val-Tyr
 LW504  Arg-β-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
 LW505  Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
 其它结构举例如下*：  Arg-Lys-β-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-β-Lys-Asp-Val-Tyr
 Arg-Lys-β-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-Lys-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr
 Arg-β-Lys-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-γ-Lys-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-γ-Lys-β-Asp-Val-Tyr
胸腺五肽活性异构体     氨基酸序列
 Arg-γ-Lys-β-Asp-β-Val-Tyr
 Arg-Lys-β-Glu-Val-Tyr
*该表仅列出了胸腺五肽活性异构体的部分结构式

Claims (1)

1.一种胸腺五肽活性异构体，其特征是，其氨基酸序列是Arg-Lys-β-Asp-Val-Tyr或Arg-Lys-γ-Glu-Val-Tyr  或Arg-β-Lys-β-Asp-Val-Tyr或Arg-β-Lys-γ-Glu-Val-Tyr或Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val-Tyr。
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