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JPH07165791A - 酵素抵抗性免疫変調ペプチド - Google Patents

酵素抵抗性免疫変調ペプチド

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JPH07165791A
JPH07165791A JP6254375A JP25437594A JPH07165791A JP H07165791 A JPH07165791 A JP H07165791A JP 6254375 A JP6254375 A JP 6254375A JP 25437594 A JP25437594 A JP 25437594A JP H07165791 A JPH07165791 A JP H07165791A
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peptide
amino acid
asp
arg
val
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JP6254375A
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Gideon Goldstein
ギデオン・ゴールドスタイン
George Heavner
ジヨージ・ヒーブナー
Daniel Kroon
ダニエル・クルーン
Tapan Audhya
タパン・オードヤ
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Ortho Pharmaceutical Corp
Original Assignee
Ortho Pharmaceutical Corp
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 体内における酵素分解に対して改良された抵
抗を示す新規な免疫変調ペプチドを提供する。 【構成】 式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１ ［式中、Ｒ−Ｖはアシル−ＡＲＧであり；ＷはＡＩＢで
あり；ＸはＡＳＰ又はＧＬＵであり；ＹはＧＬＹ、ＶＡ
Ｌ、ＬＥＵ、ｎｏｒ ＬＥＵ、ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＬＹ
Ｓ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、又はＡＬＡであり；Ｚは 【化１】 であり；ＤはＨ或いはフェノール性プロトンの活性を増
加させる１又は２個の置換基であり；ＥはＨ或いはＣ1
〜Ｃ３低級アルキルであり；Ｒ１はＯＨ又はＮＨ2、で
ある］のペプチド或いはその製薬学的に許容しうる酸又
は塩基付加塩。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、一般に新規な免疫変調（immuno
modulatory）ペプチド、特に体内における酵素分解に対
して改良された抵抗を示すそのようなペプチドに関す
る。
【０００２】米国特許第４，１９０，６４６号及び第
４，２６１，８８６号は、米国特許第４，００２，７４
０号及び第４，０７７，９４９号に記述されているチモ
ポイエチン（thymopoietin）として公知の長鎖のポリペ
プチドと同様の活性を持つ種々のペンタペプチドを開示
している。上記特許は本明細書に参考文献として引用さ
れる。これらのペプチドのあるものの生物学的活性は
Ｍ．Ｅ．Ｗｅｋｓｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４
８、９９６〜１００６（１９７８）に記述されている。
この文献も本明細書に参考文献として引用される。公開
ヨーロッパ特許願第２５，８９７号及び米国特許第４，
３６１，６７３号も、チモポイエチンに同様の活性を有
するといわれる種々のペプチドを開示している。「スプ
レニン（splenin）」としても公知であるチモポイエチ
ンＩＩＩは牛の脾臓から分離される同様のペプチドであ
る、Ａｕｄｈｙａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２
０、６１９５〜６２００（１９８１）。この物質はＴ細
胞及びＢ細胞の両方の誘導を刺激する。
【０００３】本発明に含まれる他の基本的物質及び生物
学的過程の議論に対しては、上述の特許及び文献が参照
できる。
【０００４】これらの公知のペプチドは、免疫変調活性
に有用であるけれど、動物又は人間の受容体に投与した
後試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）双方において酵素により迅速に分解されること
が発見された。例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．ａｎｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１４、４７９〜４８４（１
９７９）；ｉｂｉｄ，２２、１８７〜１９３（１９８
３）を参照。
【０００５】本発明は、従来法のペプチドよりも体内で
の酵素分解に対して耐性があり、従って治療学的に、よ
り有用な物質であるペプチド及びペプチド組成物を提供
する。
【０００６】本発明は、式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ1 ［式中、Ｒは、Ｈ、ＮＨ2、アシル−ＮＨ、ＣＨ3ＮＨ、
又はピロ−ＧＬＵ−ＮＨであり；Ｖは
【０００７】
【化１２】
【０００８】であり；ＷはＰＲＯ、デヒドロＰＲＯ、又
は
【０００９】
【化１３】
【００１０】であり；Ａはそれぞれ低級アルキルであ
り；ＢはそれぞれＡがＣ4〜Ｃ６低級アルキルの時Ｈで
あり、そしてさもなければＣ1〜Ｃ３低級アルキルであ
り；Ａ及びＢは一緒になって−(ＣＨ2)4−又は−(Ｃ
Ｈ2)5−であり；ＸはＤ−ＡＳＰ、ＡＳＰ、Ｄ−ＧＬ
Ｕ、又はＧＬＵであり；ＹはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＬＥＵ、
ｎｏｒ−ＬＥＵ、ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＬＹＳ、ＧＬＮ、Ｇ
ＬＵ、ＡＬＡ、Ｄ−ＶＡＬ、Ｄ−ＬＥＵ、Ｄ−ｎｏｒ
ＬＥＵ、Ｄ−ＰＨＥ、Ｄ−ＩＬＥ、Ｄ−ＬＹＳ、Ｄ−Ｇ
ＬＮ、Ｄ−ＧＬＵ、又はＤ−ＡＬＡであり；Ｚは
【００１１】
【化１４】
【００１２】であり；ＤはＨ或いはフェノールのプロト
ンの酸性を増加させる或いは実質的に減少させない１又
は２個の置換基であり；ＥはＨ又はＣ1〜Ｃ３低級アル
キルであり；Ｒ１はＯＨ、ＮＨＲ″、
【００１３】
【化１５】
【００１４】であり；そしてＲ″およびＲ″′はそれぞ
れＨ又は低級アルキルであり；但しＶはＲがＨ以外のと
きＤ−又はＬ−異性体であってよく、またＶ、Ｘ、及び
Ｙの高々１つはＤアミノ酸である］の新規なペプチド或
いはその製薬学的に許容しうる酸又は塩基付加塩に関す
る。ＲがＨ以外の時、ＶはＤ又はＬ形で存在しうる。Ｚ
のＤ及びＬ形の双方も本発明に包含される。Ａ及びＢが
異なる場合、光学異性体はこのＷの意味に対して可能で
ある。ここにＬ−異性体は好適であるけれど、Ｄ及びＬ
−異性体の双方が本発明に包含される。
【００１５】更に本発明は、本ペプチドを含有する治療
学的組成物及びこれらのペプチド及び組成物の投与によ
る人間及び動物の処置法を提供する。
【００１６】今回驚くことに、本ペプチドはチモポイエ
チン様又はスプレニン様の活性を有し、またＷ基が２位
に存在するから、エンド及びエクソペプチダーゼ及び血
清中のトリプシン様の酵素による攻撃に耐える。
【００１７】上述のように、本発明はチモポイエチン様
又はスプレニン様の活性を有する新規なペプチド、これ
らのペプチドを含有する治療学的組成物、及びその使用
法に関する。
【００１８】最も広い意味において、本発明は次の式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１ （Ｉ） ［式中、Ｒ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ及びＲ１は上述の通り
である］を有するペプチド或いはその治療学的に許容し
うる酸又は塩基付加塩を提供する。
【００１９】本発明の好適なペプチドは、Ｒがアシル−
ＮＨ及びＷがＰＲＯ又はＡＩＢの式Ｉのものである。更
に好適なペプチドは、Ｒ−Ｖがアシル−ＡＲＧ、ＷがＰ
ＲＯ又はＡＩＢ、ＸがＡＳＰ又はＧＬＵ、ＹがＧＬＹ又
は前述の如きＬアミノ酸、ＺがＴＹＲ又はＤ−置換ＴＹ
Ｒ、そしてＲ１がＯＨ又はＮＨ２である式Ｉのものであ
る、これよりも更に好適なペプチドはＲ−Ｖがアセチル
−ＡＲＧ、ＷがＰＲＯ又はＡＩＢ、ＸがＡＳＰ又はＧＬ
Ｕ、ＹがＧＬＹ又は前述の如きＬアミノ酸、ＺがＴＹＲ
又はＤ−置換ＴＹＲ、及びＲ１がＮＨ２である式Ｉのも
のである。最も好適なペプチドはＮ−アセチル−ＡＲＧ
−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＮＨ２である。
【００２０】本明細書で用いる如き「低級アルキル」と
は、炭素数１〜６の分岐鎖及び直鎖の飽和炭化水素、例
えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ペンチ
ル、ヘキシルなどを含む。「アシル」とはホルミル及び
低級アルキルカルボニル基例えばアセチル、プロピオニ
ル、サクシニルなどを含む。
【００２１】Ｚアミノ酸残基のフェノール性プロトンの
酸性を増加させる代表的なＤ置換基は例えば３−クロル
及び３−ニトロである。ペプチド技術の同業者は、特に
Ｚのフェニル環の３位における他の電子吸引基は、それ
がフェノール性プロトンの供与に由来するフエノキシド
イオンを安定化するので、フェノール性プロトンの酸性
を増加させることを認めるだろう。
【００２２】これらのペプチドと塩を形成しうる酸とし
ては、無機酸例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝
酸、チオシアン酸、硫酸、燐酸など、及び有機酸例えば
ぎ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピル
ビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、
フマル酸、アンスラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホ
ン酸、スルファニル酸などが言及しうる。
【００２３】これらのペプチドと塩を形成しうる塩基と
しては、無機塩基例えば水酸化ナトリウム、水酸化アン
モニウム、水酸化カリウムなど、及び有機塩基例えばモ
ノ、ジ及びトリ−アルキル及びアリールアミン（例えば
トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミ
ン、ジメチルアミンなど）及び随時置換されたエタノー
ルアミン（例えばエタノールアミン、ジエタノールアミ
ンなど）を含む。
【００２４】本明細書を通じて、ペプチド及びその製造
に用いるある種の物質のアミノ酸成分は簡便のために略
号で示される。これらの略号は以下の通りである。
【００２５】アミノ酸 略 号 α−メチルアラニン ＡＩＢ シクロロイシン ＣＬＥ ４−メチルロイシン ４−メチル−ＬＥＵ グリシン ＧＬＹ Ｌ−アラニン ＡＬＡ Ｄ−アラニン Ｄ−ＡＬＡ Ｌ−アルギニン ＡＲＧ Ｄ−アルギニン Ｄ−ＡＲＧ Ｌ−アスパルチン酸 ＡＳＰ Ｄ−アスパルチン酸 Ｄ−ＡＳＰ Ｌ−デヒドロプロリン デヒドロＰＲＯ Ｌ−グルタミン酸 ＧＬＵ Ｄ−グルタミン酸 Ｄ−ＧＬＵ Ｌ−グルタミン ＧＬＮ Ｄ−グルタミン Ｄ−ＧＬＮ Ｌ−イソロイシン ＩＬＥ Ｄ−イソロイシン Ｄ−ＩＬＥ Ｌ−ロイシン ＬＥＵ Ｄ−ロイシン Ｄ−ＬＥＵ Ｌ−リシン ＬＹＳ Ｄ−リシン Ｄ−ＬＹＳ Ｌ−ノルロイシン ｎｏｒ−ＬＥＵ Ｄ−ノルロイシン Ｄ−ｎｏｒ−ＬＥＵ Ｌ−プロリン ＰＲＯ Ｌ−チロシン ＴＹＲ Ｌ−バリン ＶＡＬ Ｄ−バリン Ｄ−ＶＡＬ 「デヒドロＰＲＯ」とは、２，３−デヒドロＰＲＯ、
３，４−デヒドロＰＲＯ、及び４，５−デヒドロＰＲＯ
を含む；３，４−デヒドロＰＲＯは好適である。本発明
のペプチドは一般に次の公知の方法で製造できる。便宜
的には、ペプチドはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５、２１４９〜２１５４（１９
６３）に最初に記述された固相合成法に従って製造でき
る。そのような方法は、前述の過去の特許のあるものに
も開示されている。他の技術は、例えばＭ．Ｂｏｄａｎ
ｓｋｙら、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，第２版、１９７６年
に記述されている。そのような合成に有用である適用な
保護基及びその略号は、この単行本並びにＪ．Ｆ．Ｗ．
ＭｃＯｍｉｅ編、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ
ｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、Ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７３
年に記されている。なおこの両方の文献は本明細書に参
考文献として引用される。本発明で使用される通常の保
護基は、ｔ−ブチロキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジ
ル（ＢＺＬ）、ｔ−アミロキシカルボニル（ＡＯＣ）、
トシル（ＴＯＳ）、ｏ−ブロムフェニルメトキシカルボ
ニル（ＢｒＺ）、及び２，６−ジクロルベンジル（Ｂｚ
ｌＣｌ2）である。
【００２６】ＸがＡＳＰ又はＤ−ＡＳＰの本発明のペプ
チドは上述の米国特許及び単行本に開示されている如き
チモポイエチンに類似の生物学的活性を示し、一方でＸ
がＧＬＵ又はＤ−ＧＬＵのものはスプレニンに類似の生
物学的活性を示すことが発見された。本発明の化合物、
Ｓｃｈｅｉｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７、１７２
７〜１７４３（１９７８）に示される誘導分析法（ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に
従い、また受容体部位からの放射性標識の、試験ペプチ
ドによる置換を測定するように設計された受容体分析法
（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓａｙ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ）に従って試験した。誘導分析における正の結果は、
チモポイエチン又はスプレニンのそれぞれが免疫適応性
のＴ細胞又はＴ細胞及びＢ細胞に対する前駆細胞を誘導
するという能力を模倣する試験ペプチドの能力を示す。
受容体分析に基づく正の値は、チモポイエチンに結合す
る、即ちチモポイエチン活性を模倣する試験ペプチドの
能力を示す。本ペプチドは誘導分析において正であり、
一方ＸがＡＳＰ又はＤ−ＡＳＰのものは受容体分析にお
いても正である。
【００２７】ＸがＡＳＰ又はＤ−ＡＳＰの本発明のペプ
チドは、Ｔｈｙ−１+ Ｔ細胞（Ｌｙｂ−２+ Ｂ細胞でな
い）の選択的分別を誘導する能力が特色である。Ｔｈｙ
−１はＢ細胞でなくてＴ細胞上に存在する分別アロ抗原
（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｌｌｏａｎｔｉ
ｇｅｎ）であり、一方Ｌｙｂ−２はＴ細胞でなくてＢ細
胞上に存在する分別アロ抗原である。これらのペプチド
の、試験管内誘導分析における研究は、それがチモポイ
エチンと同一の誘導特異性を有することを示す。即ちそ
れらはＴｈｙ−１- 細胞のＴｈｙ−１+ Ｔ細胞に対する
分別を誘導するが、Ｌｙｂ−２- 細胞のＬｙｂ−２+ Ｂ
細胞に対する分別を誘導しない。ＸがＧＬＵ又はＤ−Ｇ
ＬＵの本発明のペプチドは、Ｔｈｙ−１- 細胞のＴｈｙ
−１+ Ｔ細胞に対する、またＬｙｂ−２- 細胞のＬｙｂ
−２+ 細胞に対する分別を誘導する能力が特色である。
【００２８】上述の如く、チモポイエチン及びスプレニ
ン及びその同族体の従来法のペプチド・フラグメント
は、それを投与した動物又は人間の内部において非常に
急速な酵素による分解を受けることが発見された。血清
中のチモペンチン（チモポイエチンのフラグメント３２
〜３６）の半減期が凡そ１分間であるということが決定
されている。スプレノペンチン（スプレニンの対応する
フラグメント）も酵素の分解に対して非常に敏感であ
る。しかしながら、本発明のペプチドはチモペンチンよ
りも１０００倍まで酵素分解に対する耐性が実質的に増
大する。本ペプチドのこの実質的に増大した安定性は、
動物起源の分離された酵素（例えばシトゾール（ｃｙｔ
ｏｓｏｌ）及び顆粒の双方の起源のロイシンアミノペプ
チダーゼ及びカルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ及びＣ）に
対して、また人間の血清に対して明らかにされる。次に
表は安定性のデータを例示する。
【００２９】第１表 ロイシン・アミノペプチダーゼに対するペプチドの安定性 ５０％分解＊に必 ペプチド 要な保温時間（分) NH2-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH (チモペンチン) 15 NH2-Arg-Pro-Asp-Val-Try-OH 230 N-アセチル-Arg-Pro-Asp-Val-Try-NH2 ＞1400 NH2-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 1400 NH2-Arg-Cle-Asp-Val-Tyr-OH ＞1400 ＊ ５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５緩衝液中１×１０-3 Ｍペプチド及び３単位／ｍｌ豚のＬＡＰ−シトゾール、
３７℃。
【００３０】第２表 ペプチドのカルボキシペプチダーゼＡに対する安定性 ５０％分解＊に必 ペプチド 要な保温時間（分) NH2-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 18 NH2-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 26 NH2-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-NH2 ＞450 NH2-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 ＞450 N-アセチル-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 ＞1500 ＊ ｐＨ８．５のホウ酸塩緩衝液中１×１０-3 Ｍペプチド及び０．０５単位／ｍｌ牛のカルボキシペプ
チダーゼＡ、３７℃。
【００３１】第３表 ペプチドの人間の血清に対する安定性 ５０％分解＊に必 ペプチド 要な保温時間（分) NH2-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 1.5 NH2-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 32 N-アセチル-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 40 NH2-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-NH2 30分において分解なし N-アセチル-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-OH 38 NH2-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 ＞20 N-アセチル-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 30分において分解なし ＊ 新鮮な人間の血清中１μｇ／ｍｌペプチド、３７
℃。
【００３２】本発明に先立っては、同等の又は増大した
チモポイエチン様又はスプレニン様活性を有し且つ一方
で実質的に増大した酵素分解に対する耐性をもつことの
できるペプチドが製造できることは全く予期されなかっ
た。事実本申請者は、２位における多くの置換基が活性
を破壊し又はかなり減少させ、また一方２位における多
くの他の置換基が活性を保持させるが酵素に対する耐性
を付与できないということを発見している。本明細書に
記述する２位の置換基だけは、（例えば）チモポイエチ
ンと比較した場合に同等の又は増大した生物学的活性及
び実質的に増大した酵素分解に対する耐性を同時に有す
るペプチドを提供することができる。
【００３３】本発明のペプチドは、これらの特徴が故
に、人間及び動物の処置に治療上有用である。即ちそれ
らは血液形成（ｈａｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ）組織に起源
するリンパ細胞形成（ｌｙｍｐｈｏｉｅｔｉｃ）幹細胞
の分別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を、身体の
免疫応答に包含されうる胸腺に由来する細胞（Ｔ細胞）
中へ誘導するための能力をもっている。結果として、本
ペプチドは多方面の治療用途があると考えられる。主
に、本化合物は、胸腺の示される機能のあるものを遂行
しうるから、種々の胸腺の機能及び免疫の領域に用途を
有する。１つのそのような適用例は、ジジョージ症候群
（ＤｉＧｅｏｒｇｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、即ち胸腺の
先天的な欠乏状態の処置である。本ペプチドの１つの注
射はこの欠陥を克服しよう。本ペプチドは、酵素分解に
対する耐性があるから、チモポイエチン様活性を有する
従来法のペプチドよりも治療学的に有効である。
【００３４】更に本ペプチドは、細胞免疫の治療学的刺
激を増大させ又はそれを補助し、これによって慢性感染
例えば菌又はマイコプラズマの感染、肺結核、ハンセン
病、急性及び慢性及びウイルス性感染などを含む病気の
処置に有用であるという点において、身体の総免疫を補
助するのに有用であると考えられる。
【００３５】本化合物は、一般に細胞免疫が組織であ
る、特に上述のジジョージ症候群における如く免疫に欠
陥がある、いずれかの分野において有用であると考えら
れる。即ちＴ細胞をＢ細胞の均衡がとれないために抗体
の生産が過剰である場合、本ペプチドはＴ細胞の生産を
刺激してこの状態を正すことができる。即ちそれらは、
損傷抗体が生産されるある種の自己免疫病、例えば全身
的狼瘡紅斑病（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙ
ｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、リュウマチ性関節炎などにお
ける治療に使用できることが予期される。
【００３６】最も広い用途では、本化合物は調整の必要
な対象、即ち人間又は動物の免疫系を調整するのに有用
である。本明細書に用いる如き「調整」とは、本化合物
が免疫系を異常な病気の状態から正常な平衡のとれた状
態へ戻させるということを意味する。この調整は免疫学
的欠乏症（例えばジジョージ症候群）の補正に大きな用
途のあることが見出されているけれど、過剰な免疫学活
性（例えば自己免疫病）の状態を正すのにも使用でき
る。それ故に本発明は、本化合物の１つの免疫調整有効
量を対象に投与することを含んでなる、そのような調整
の必要な対象の免疫系を調整する方法並びにこれらの方
法を実施するための製薬学的組成物を包含する。
【００３７】本発明は、相対的又は絶対的Ｔ細胞欠乏症
に由来する状態をもつ対象に、式（Ｉ）のペプチドの治
療学的有効量を投与することを含んでなる、該対象（人
間又は動物）のそのような状態を処置する方法を提供す
る。また本発明は、式（Ｉ）のペプチドの治療学的有効
量を投与することを含んでなる、対象の胸腺の相対的又
は絶対的欠乏症に由来する状態の処置を提供する。本明
細書に用いる如き「治療学的有効量」は、それぞれＴ細
胞の欠乏、即ち胸腺の欠乏に由来する状態を処置するの
に有効な量を意味する。更に本発明は、式（Ｉ）のペプ
チドの有効誘導量を投与することを含んでなる、胸腺に
由来するリンパ細胞の特性を発現すべく対象のリンパ形
成幹細胞を誘導する方法も提供する。また本発明はこれ
らの方法を実施するための製薬学的組成物を提供する。
【００３８】本発明の製薬学的組成物を製造するために
は、通常の製薬学的混合法に従い、式１のペプチド或い
はその塩基又は酸付加塩を活性成分として、製薬学的担
体と良く混合する。この担体は投与に期待する調製物の
形態、例えば舌下、直腸、鼻腔、経口、又は非経口投与
に依存して多種の形をとることができる。経口投与形の
組成物を調製するには、有用な製薬学的媒体のいずれ
か、例えば経口液体調製物（例えば懸濁液剤、エリキサ
ー剤及び溶液剤）の場合には水、油、アルコール、風味
剤、保存剤、着色剤など、或いは経口固体調製物（例え
ば粉末剤、カプセル剤、及び錠剤）の場合には担体例え
ば殿粉、砂糖、希釈剤、顆粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊
剤などが使用しうる。放出の制御された形態も使用でき
る。錠剤及びカプセル剤は、その投与が容易であるから
最も有利な経口投与単位形である。この場合には固体の
製薬学的担体が明らかに使用される。所望により、錠剤
は標準的な技術によって糖衣であっても腸溶性であって
もよい。
【００３９】非経口調製物の場合、担体は普通無菌水を
含んでなるが、（例えば）溶解度を高めるため或いは保
存のために他の成分を含んでいてもよい。注射用懸濁液
も調製しうる。この場合には適当な液体担体、懸濁剤な
どが使用できる。本ペプチドは約１０μｇ／体重ｋｇ以
上の量で投与した時に一般に活性である。ジジョージ症
候群の処置のためには、ペプチドを約１０〜約１００μ
ｇ／体重ｋｇの割合で投与してよい。一般に同一の投薬
量の範囲は言及した他の病気又は状態の処置にも使用し
うる。
【００４０】次の実施例は、本発明を例示するが、これ
を特に制限することを意図しない。実施例中及び本明細
書を通して部は断らない限り重量によるものとする。
【００４１】
【実施例】実施例Ｉ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシンアミ ド ペプチドは固相法で合成した。合成を、置換度０．３９
ミリモル／ｇのｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
４．１６ｇで始め、次のアミノ酸誘導体をジシクロヘキ
シルカルボジイミド−ヒドロキシベンゾトリアゾールで
段階的に結合させた：ＢＯＣ（ＢｒＺ）Ｔｙｒ．ＢＯＣ
−Ｖａｌ，ＢＯＣ−（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ，ＢＯＣ−Ｐ
ｒｏ，及びＡＯＣ−（Ｎg−トシル）Ａｒｇ。次いでチ
ロシンを再び結合させた。アミロキシカルボニル基をト
リフルオル酢酸で除去し、樹脂をジイソプロピルエチル
アミンで中和し、アミンをジメチルホルムアミド中１５
％無水酢酸でアセチル化した。洗浄及び乾燥後、樹脂は
６．０８ｇであった。
【００４２】樹脂から、ｍ−クレゾール６ｍｌを含有す
る液体ＨＦ６０ｍｌを０℃で７５分間作用させることに
より、ペプチドを開裂させた。残渣を酢酸エチル及びエ
ーテルで洗浄し、次いでペプチドを５％酢酸１００ｍｌ
で樹脂から抽出した。凍結乾燥した抽出物は１．０４２
ｇであった。
【００４３】粗ペプチド４７５ｍｇ部分を、ＳＰ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ２．６×１００ｃｍのクロマトグラフィー
により、ｐＨ５の０．０５Ｍ酢酸アンモニウム５０ｍｌ
／時で流出精製した。画分９８〜１２２（それぞれ１０
ｍｌ）を一緒にし、凍結乾燥して、純度９９％以上の生
成物４６２ｍｇを得た。
【００４４】ＨＰＬＣ：ｒｔ＝Ｗｈａｔｍａｎ Ｐｏｒ
ａｓｉｌ Ｃ18において、１２％ＣＨ3ＣＮ−０．０１
Ｍ ＮＨ4 ＯＡｃ（ｐＨ５）１．５ｍｌ／分で９．１分
間。
【００４５】ＴＬＣ、シリカゲル６０： Ｒf０．２６ ３：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：
Ｈ2Ｏ Ｒf０．４３ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ：ｐｙｒ Ｒf０．６４ １：１ ＴＦＥ：ＮＨ4ＯＨ アミノ酸分析： Ａｓｐ， ０．９９；Ｐｒｏ， １．００；Ｖａｌ，
１．００；Ｔｙｒ，０．９９；Ａｒｇ， １．０１；ペ
プチド含量７０％。
【００４６】実施例ＩＩ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−グルタミル−チロシン： ペプチドを、ＢＯＣ−Ｔｙｒ
（ＯＢｚＣｌ2）樹脂エステル（２５３６−１３８、
０．３２ｍｅｑ／ｇ、３．２ｇ）を出発物質として固相
法で製造した。次の標準的な手順を用いた。
【００４７】脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １
５ｍｌで１分間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １
５ｍｌで３０分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ１分間を２回、
続いてｉＰｒＯＨ １５ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 １５ｍｌでそれぞれ１分間を２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ
２．５分間を２回； 結合−保護されたアミノ酸３．０ミルモル（０．４６
ｇ）及びＨＯＢＴをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、次いでＣＨ
2Ｃｌ2 １３ｍｌで希釈。ＤＣＣ（０．６２ｇ）をＣＨ
2Ｃｌ2 ３ｍｌに溶解。反応時間２時間。
【００４８】ＢＯＣα−Ｂｚｌγ−Ｇｌｕ、ＢＯＣα−
Ｂｚｌβ−Ａｓｐ、ＢＯＣ−Ｐｒｏ、及びＡＯＣα−Ｔ
ｏｓg−Ａｒｇに対してそれぞれ１回の結合が必要であ
った。最後の脱保護基の後、ＤＭＦ １５ｍｌ及びＤＭ
ＡＰ（３００ｍｇ）中Ａｃ2Ｏ １０％（ｖ／ｖ）を用
いて６０分間樹脂ペプチドをアセチル化した。
【００４９】樹脂ＨＦ／アニソール（３０ｍｌ／６ｍ
ｌ）中において０℃下に６０分間開裂させた。この開裂
した樹脂残渣をＥｔ2Ｏでクエンチング（ｑｕｅｎｃｈ
ｉｎｇ）し、固体を８％ＨＯＡｃ １００ｍｌで３０分
間抽出した。濾過後、濾液を凍結乾燥して３２１９−６
９ＨＦ１．２３ｇを得た。
【００５０】粗ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ
で精製した。（カラム２．６×９０ｃｍ、０．２Ｍのｐ
Ｈ７．８ ＮＨ4ＨＣＯ3 ３ ｌで、続いて０．３３Ｍ
のｐＨ７．８ ＮＨ4ＨＣＯ3 ２ ｌを流出剤として使
用、流速７５ｍｌ／時、１３ｍｌ／画分、検出２７７ｎ
ｍ）。画分２１４〜２３６を集め、凍結乾燥し、所望の
化合物を無色の固体として得た。４５０ｍｇ、５３％。
【００５１】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.00 Pro 1.04 Asp 0.99 Glu 1.00 Tyr 0.98 ペプチド含量85.1％ 実施例ＩＩＩ Ｎα−サクシノイル−アルギニル−プロリル−アスパル
チル−バリル−チロシン： ペプチドを、ＢＯＣ−Ｔｙｒ
（ＢｚｌＣｌ2）樹脂エステル（０．３２ｍｅｑ／ｇ、
３．２ｇ）を出発物質として固相法で製造した。次の標
準的な手順を用いた。
【００５２】脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １
５ｍｌで１分間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １
５ｍｌで３０分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ１分間を２回、
続いてｉＰｒＯＨ １５ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 １５ｍｌでそれぞれ１分間を２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ
２．５分間を２回； 結合−保護されたアミノ酸３．０ミルモル（０．４６
ｇ）及びＨＯＢＴをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、次いでＣＨ
2Ｃｌ2 １３ｍｌで希釈。ＤＣＣ（０．６２ｇ）をＣＨ
2Ｃｌ2 ３ｍｌに溶解。反応時間２時間。
【００５３】順次樹脂に、ＢＯＣ−Ｖａｌを１回、ＢＯ
Ｃα−Ｂｚｌβ−Ａｓｐを２回、そしてＢＯＣ−Ｐｒ
ｏ、ＡＯＣα−Ｔｏｓg−Ａｒｇ及びｐ−アニシルサク
シネートをそれぞれ１回結合させた。
【００５４】樹脂をＨＦ／アニソール（３０ｍｌ／７ｍ
ｌ）中において０℃下に６０分間開裂させた。この開裂
した樹脂残渣をＥｔ2Ｏでクエンチング（ｑｕｅｎｃｈ
ｉｎｇ）し且つ濾過した。固体を１％ＮＨ4ＯＨ（１０
０ｍｌ）１時間抽出し、濾過し、濾液を凍結乾燥して３
２１９−６９ＨＦ０．８８ｇを無色の脆い泡状物として
得た。
【００５５】粗ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ
で精製した。（カラム２．６×９０ｃｍ、０．３３Ｍの
ｐＨ７．８ ＮＨ4ＨＣＯ3 を流出剤として使用、流速
７５ｍｌ／時、１３ｍｌ／画分、検出２７６ｎｍ）。画
分１０３〜１２２を集め、凍結乾燥し、所望の化合物を
無色の固体として得た。７１０ｍｇ、７８％。
【００５６】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.01 Pro 1.02 Asp 0.99 Val 1.00 Tyr 0.97 ペプチド含量82.7％ 実施例ＩＶ Ｎα−ホルミル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシン： ペプチドを、ＢＯＣ−Ｔｙｒ（Ｂ
ｚｌＣｌ2）樹脂エステル（０．３２ｍｅｑ／ｇ、４．
７ｇ）を出発物質として固相法で製造した。次の標準的
な手順を用いた。
【００５７】脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２
５ｍｌで１分間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２
５ｍｌで３０分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ２５ｍｌでそれぞれ１分間を２回、
続いてｉＰｒＯＨ ２５ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 ２５ｍｌでそれぞれ１分間を２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２５ｍｌでそれぞれ
２．５分間を２回； 結合−保護されたアミノ酸４．５ミルモル（０．６９
ｇ）及びＨＯＢＴ（０．４６ｇ）をＤＭＦ ３ｍｌに溶
解し、次いでＣＨ2Ｃｌ2 ２５ｍｌで希釈。ＤＣＣ
（０．９３ｇ）をＣＨ2Ｃｌ2 ５ｍｌに溶解、これを反
応物と樹脂の混合物に添加、２時間撹拌。
【００５８】順次樹脂に、ＢＯＣ−Ｖａｌ、ＢＯＣα−
Ｂｚｌβ−Ａｓｐ、ＢＯＣ−Ｐｒｏ、及びＡＯＣα−Ｔ
ｏｓg−Ａｒｇ−を一度結合させた。次いでこの樹脂を
脱保護基し、中和し、そしてＣＨ2Ｃｌ2 中ｐ−ニトロ
フェニルホーメート（ＲＣ、１．０ｇ）、ジメチルアミ
ノピリジン（０．３ｇ）で１６時間ホルミル化した。
【００５９】樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ／アニソ
ール（３０ｍｌ／５ｍｌ）中において０℃で１時間開裂
させた。この開裂した樹脂残渣をＥｔ2Ｏでクエンチン
グ（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）し、濾過した。固体を１％Ｎ
Ｈ4ＯＨ（１００ｍｌ）抽出し、凍結乾燥し、粗ペプチ
ド１．５４ｇを得た。
【００６０】粗ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ
で精製した。（カラム２．６×８５ｃｍ、０．１Ｍのｐ
Ｈ７．５ ＮＨ4ＨＣＯ3 を流出剤として使用、流速１
００ｍｌ／時、１３ｍｌ／画分、検出２８０ｎｍ）。画
分１３６〜１７０を集め、凍結乾燥し、所望の化合物を
無色の固体として得た。７２５ｍｇ、７１％。
【００６１】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.04 Pro 0.95 Asp 1.01 Val 1.02 Tyr 0.98 ペプチド含量100％ 実施例Ｖ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−イソロイシル−チロシン、溶媒和 表題の化合物を、ＢＯＣ−Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ2）樹脂
エステル（０．３２ｍｅｑ／ｇ、２．４ｇ）を出発物質
として固相法で製造した。次の標準的な手順を用いた。
【００６２】脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２
０ｍｌで１分間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２
０ｍｌで３０分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ２０ｍｌでそれぞれ１分間を２回、
続いてｉＰｒＯＨ ２０ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 ２０ｍｌでそれぞれ１分間を２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ２０ｍｌでそれぞれ
２．５分間を２回； 結合−保護されたアミノ酸３．０ミルモル（０．４６
ｇ）及びＨＯＢＴをＤＭＦ２ｍｌに溶解し、次いでＣＨ
2Ｃｌ2 １３ｍｌで希釈。ＤＣＣ（０．６２ｇ）をＣＨ
2Ｃｌ2 ３ｍｌに溶解、これを反応物及び樹脂の混合物
に添加し、２時間撹拌。
【００６３】この樹脂に、ＢＯＣ−Ｉｌｅ １／２ Ｈ
2Ｏ、ＢＯＣα−Ｂｚｌβ−Ａｓｐ、ＢＯＣ−Ｐｒｏ、
及びＡＯＣα−Ｔｏｓg−Ａｒｇを連続的に１回結合さ
せた。
【００６４】脱保護基、樹脂をＤＭＦ（１５ｍｌ）中Ａ
ｃ2Ｏ（１．８ｍｌ）及びＤＭＡＰ（０．３ｇ）で２時
間アシル化した。樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ／ア
ニソール（３０ｍｌ／４ｍｌ）中において０℃で１時間
開裂させた。
【００６５】樹脂残渣をＥｔ2Ｏでクエンチングし、濾
過した。この固体を１％ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）で１
時間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して３２１９−
８７ＨＦ２．１ｇを無色の固体として得た。
【００６６】粗ペプチドをＳｅｐｈａｄｅｘ ＤＥＡＥ
で精製した。（カラム２．６×８５ｃｍ、０．１Ｍのｐ
Ｈ７．５ ＮＨ4ＨＣＯ3 流速８０ｍｌ／時、１１ｍｌ
／画分、検出２７８ｎｍ）。画分１３５〜１６０を集
め、２回凍結乾燥し、所望の化合物を無色の固体として
得た。４３２ｍｇ、６５％。
【００６７】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.01 Pro 1.02 Asp 1.00 Ile 0.94 Tyr 0.99 ペプチド含量70.5％ 実施例ＶＩ Ｎα−アセチル−Ｄ−アルギニル−プロリル−アスパル
チル−バリル−チロシン： 表題の化合物を次のように製
造した：Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−プロリル−（β−ベン
ジル）アスパルチル−バリル−チロシンベンジルエステ
ル 塩化メチレン１００ｍｌ及び飽和炭酸水素ナトリウム５
０ｍｌに（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＯＢ
ｚｌトリフルオルアセテート９．４０ｇを添加した。少
量のジメチルホルムアミドを添加してペプチドを溶解し
た。この層を分離し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム
溶液で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、次いで回転蒸発機により容量を約５０ｍｌまで減じ
た。この溶液を、Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−プロ
リン２．８０ｇに添加した。次いでこの溶液を５°まで
冷やし、塩化メチレン１５ｍｌ中ジシクロヘキシルカル
ボジイミド２．７０ｇを添加した。この混合物を５℃で
１時間撹拌し、１５℃で１６時間放置した。次いで反応
混合物を回転蒸発により少容量まで減少させた。酢酸エ
チル１５０ｍｌを残渣に添加し、混合物を濾過した。濾
液を水、１０％クエン酸溶液及び飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液で抽出した。乾燥後溶媒を除去し、ガラス状物１
０．９７ｇを得た。この生成物を酢酸エチル−ヘキサン
から結晶化して８．８５ｇを得た。融点７４〜７６℃。
続いて酢酸エチル−石油エーテルから僅かにだけ暖めな
がら再結晶して７．７３ｇ得た。融点７５〜７８℃。Ｔ
ＬＣ、シリカゲル６０：Ｒf＝０．６８（ＣＨ2Ｃｌ2：
ＭｅＯＨ ９：１）。
【００６８】Ｎα−ｔ−ブチロキシカルボニル−（Ｎg
−トシル）−Ｄ−アルギニル−プロリル−（β−ベンジ
ル）アスパルチル−バリル−チロシンベンジルエステル ＢＯＣ−Ｐｒｏ−（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒＯＢｚｌ ２．３１ｇに、ジオキサン中４．０ ＮＨ
Ｃｌ ２０ｍｌを添加した。１時間撹拌した後、溶媒の
殆んどを回転蒸発機によって除去した。この残渣にエー
テルを添加して固体を得、これを濾過し、エーテルで洗
浄した。この塩を塩化メチレン−ジメチルホルムアミド
３：１の２０ｍｌ中Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−
（Ｎg−トシル）−Ｄ−アルギニン１．２０ｇと一緒に
した。溶液を５℃でまで冷やし、ジイソプロピルエチル
アミン０．６ｍｌ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
０．３０ｇ、及びジシクロヘキシルカルボジイミド０．
５８ｇを添加した。この混合物を５℃で３０分間撹拌
し、室温下に１６時間放置した。反応混合物を濾過し、
溶媒を回転蒸発機により除去した。この残渣に酢酸エチ
ルと水を添加した。層を分離させ、有機層を１０％クエ
ン酸溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液及び飽和塩化ナ
トリウム溶液で抽出した。溶媒を除去した後ガラス状物
を得、これを酢酸エチル−石油エーテルから結晶化させ
た。生成物は溶液からゴム状物として分離されたが、こ
れを石油エーテルでそしゃくした時白色の粉末に固化し
た。生成物は１．８４ｇであった。
【００６９】Ｎα−アセチル−（Ｎg−トシル）−Ｄ−
アルギニル−プロリル−（β−ベンジル）アスパルチル
−バリル−チロシンベンジルエステル 保護されたペンタペプチド０．８７ｇ部分を塩化メチレ
ン中５０％トリフルオル酢酸２０ｍｌで３０分間処置し
た。溶媒を除去し、エーテルを残渣に添加して固体を得
た。生成物をジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、
ジイソプロピルエチルアミン０．１５ｍｌ、続いて無水
酢酸０．５ｍｌ及び４−ジメチルアミノピリジン０．１
ｇを添加し、混合物を４５分間撹拌した。次いで溶媒の
殆んどを蒸発させた。この残渣に０．５Ｎ炭酸水素ナト
リウム溶液を添加し、クリーム状の懸濁液を得た。酢酸
エチルを添加し、有機層を水、１０％クエン酸溶液及び
飽和塩化ナトリウム溶液で抽出した。溶媒を除去し、ゴ
ム状物０．６９ｇを得た。これを精製しないで脱保護基
した。
【００７０】溶媒を回転蒸発機によって除去した。この
残渣にエーテルを添加して固体を得、これを濾過し、水
洗した。この塩を３：１塩化メチレン−ジメチルホルム
アミド２０ｍｌ中Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−（Ｎ
g−トシル）−Ｄ−アルギニン１．２０ｇと一緒にし
た。この溶液を５℃でまで冷却し、ジイソプロピルエチ
ルアミン０．６１ｍｌ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール０．３０ｇ、及びジシクロヘキシルカルボジイミド
０．５８ｇを添加した。混合物を５℃で３０分間撹拌
し、次いで室温で１６時間放置した。反応混合物を濾過
し、溶媒を回転蒸発機で除去した。残渣を酢酸エチルと
水を添加した。層を分離し、有機層を１０％クエン酸溶
液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、及び飽和塩化ナトリ
ウム溶液で抽出した。溶媒を除去した後ガラス状物を
得、これを酢酸エチル−石油エーテルから結晶化させ
た。生成物は溶液からゴム状物として分離されたが、石
油エーテルでそしゃくした時白色の粉末に固化した。生
成物は１．８４ｇであった。
【００７１】Ｎα−アセチル−（Ｎg−トシル）−Ｄ−
アルギニル−プロリル−（β−ベンジル）アスパルチル
−バリル−チロシンベンジルエステル 保護されたペンタペプチド０．８７ｇ部分を塩化メチレ
ン中５０％トリフルオル酢酸２０ｍｌで３０分間処理し
た。溶媒を除去し、残渣にエーテルを添加して固体を得
た。生成物をジメチルホルムアミド１０ｍｌに溶解し、
ジイソプロピルエチルアミン０．１５ｍｌ、続いて無水
酢酸０．５ｍｌ及び４−ジメチルアミノピリジン０．１
ｇを添加し、混合物を４５分間撹拌した。溶媒の殆んど
を蒸発させた。この残渣に０．５Ｎ炭酸水素ナトリウム
溶液を添加し、クリーム状懸濁液を得た。酢酸エチルを
添加し、有機層を水、１０％クエン酸溶液、及び飽和塩
化ナトリウム溶液で抽出した。溶媒を除去して重さ０．
６９ｇのゴム状物を得た。この物質を精製しないで脱保
護基した。
【００７２】Ｎα−アセチル−Ｄ−アルギニル−プロピ
ル−アスパルチル−バリル−チロシン 保護されたペプチド０．６９ｇをテフロン製の反応容器
に入れたｍ−クレゾール３ｍｌ及びＨＦ ３０ｍｌを添
加し、混合物を０℃で１時間撹拌した。ＨＦを真空下に
除去した。ペプチドを酢酸エチル−エーテルで沈殿さ
せ、この溶媒で洗浄した。ペプチド３％酢酸に溶解し、
凍結乾燥した。生成物は２７６ｍｇであった。
【００７３】このペプチドを、０．１０Ｎ炭酸水素アン
モニウムｐＨ８．０で流出させるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘの１．６×６０ｃｍカラムのカラムクロマトグラ
フィーに供し、１２０滴の画分を集めることによって精
製した。主成分は画分８２を中心ピークにして流出し
た。ピークの後半はＨＰＬＣで示されるように不純物を
含有した。画分７７〜８２を一緒にし、凍結乾燥した。
生成物は６５ｍｇであった。
【００７４】ＨＰＬＣ、Ｗｈａｔｍａｍ Ｃ18−Ｐｏｒ
ａｓｉｌ： ｒｔ＝８分、８％ＣＨ3ＣＮ−０．０１Ｍ ＮＨ4ＯＡ
ｃ、ｐＨ５及び１．５ｍｌ／分。
【００７５】ＴＬＣ、シリカゲルＧＦ、２５０μ ：Ｒf 溶媒系 0.36 3:1:1 nBuOH:HOAc:H2O 0.67 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H2O:EtOAc 0.55 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H2O:Pyr アミノ酸分析: Ａｓｐ、１．０１；Ｐｒｏ、０．９９；Ｖａｌ、０．９
９；Ｔｙｒ、１．０１；Ａｒｇ、１．０２；ペプチド１
００％。
【００７６】実施例ＶＩＩ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−フェニルアラニル−チロシン： ペプチドを、Ｂｅｃｋ
ｍａｍ ９９０Ｂ自動ペプチド合成機を用いて固相法で
合成した。５０％トリフルオル酢酸−塩化メチレンを脱
保護基のために、そしてＣＨ2Ｃｌ2 中５％ジイソプロ
ピルエチルアミンを中和のために、またジシクロヘキシ
ルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
を結合のために使用した。次の出発物質を用いた：ＢＯ
Ｃ−（Ｃｌ2Ｂｚｌ）Ｔｒｙ−樹脂エステル２．００ｇ
（０．３２ｍｅｑ／ｇ）、ＢＯＣ−Ｐｈｅ ０．５１
ｇ、ＢＯＣ−（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ ２×０．６２ｇ、
ＢＯＣ−Ｐｒｏ ０．４２ｇ、及びＡＯＣ−（Ｎｇ−ト
シル）Ａｒｇ ０．８５ｇ。Ａｒｇの導入後、樹脂を脱
保護基し、中和し、ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中無
水酢酸５ｍｌと２０分間反応させた。この樹脂を洗浄
し、乾燥した。重さは２．７３ｇであった。
【００７７】このペプチド樹脂を０℃下に５０分間ＨＦ
３０ｍｌ及びｍ−クレゾール３ｍｌで処理した。ＨＦの
蒸発後、生成物を酢酸エチル及びエーテルで洗浄した。
ペプチドを５％酢酸１００ｍｌで抽出した。次いで濾過
した溶液を凍結乾燥して粗生成物７９８ｍｇを得た。
【００７８】粗ペプチド３８９ｍｇを、０．１０ＮのＮ
Ｈ4ＨＣＯ3、ｐＨ８．０で流出させるＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘの１．６×６０ｃｍのカラムを用いるクロマ
トグラフィーで精製した。１５０滴の画分をそれぞれ集
めた。画分７５〜８６を併せ、凍結乾燥した。生成物は
１７１ｍｇであった。ＨＰＬＣは痕跡量にすぎない不純
物しか有さず且つＷｈａｔｍａｎ Ｃ18−Ｐｏｒａｓｉ
ｌ分析カラム、１２．５％ＣＨ3ＣＮ−０．０１Ｍ Ｎ
Ｈ4ＯＡｃ、ｐＨ５、２．０ｍｌ／分において、ｒｔが
８．２であった。
【００７９】ＴＬＣ、シリカゲル６０：Ｒf 溶媒系 0.21 3:1:1 n-BuOH:HOAc:H2O 0.48 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H2O:Pyr 0.59 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H2O:EtOAc アミノ酸分析: Ａｓｐ、０．９６；Ｐｒｏ、１．００；Ｔｙｒ、１．０
１；Ｐｈｅ、１．０１；Ａｒｇ、１．０２；ペプチド１
００％。
【００８０】実施例ＶＩＩＩ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−グルタミニル−チロシン ：ペプチドを固相法で合成し
た。樹脂を塩化メチレン中５０％トリフルオロ酢酸で脱
保護基し、塩化メチレン中５％ジイソプロピルエチルア
ミンで中和し、そしてｐ−ニトロフェニルエステルとし
て導入するＧｌｎを除いてジシクロヘキシルカルボジイ
ミド及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて結
合させた。次の出発物質を用いた：Ｎ−ｔ−ブチロキシ
カルボニル−（Ｏ−ジクロルベンジル）チロシン樹脂エ
ステル２．００ｇ、０．３２ミリ当量／ｇ、Ｎ−ｔ−ブ
チロキシカルボニルグルタミンｐ−ニトロフェニルエス
テル０．９４ｇ、Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−（β
−ベンジル）アスパルチン酸０．６２ｇ、Ｎ−ｔ−ブチ
ロキシカルボニルプロリン０．４１ｇ、及びＮα−ｔ−
ブチロキシカルボニル−（Ｎg−トシル）−アルギニン
０．８５ｇ。Ｇｌｎ及びＡｓｐを再結合させた。Ａｒｇ
の導入後、樹脂を脱保護基し、中和し、ジメチルホルム
アミド２０ｍｌ中無水酢酸５ｍｌ及びジイソプロピルエ
チルアミン１．２５ｍｌと２０分間反応させた。洗浄後
樹脂を真空乾燥して２．７５ｇを得た。
【００８１】ペプチドを、ＨＦ３０ｍｌ及びｍ−クレゾ
ール３ｍｌを用い、０℃で１時間開裂させた。ＨＦを真
空下に除去し、残渣を酢酸エチル及びエーテルで洗浄し
た。次いでペプチドを２％酢酸１５０ｍｇで抽出した。
濾過した抽出物を凍結乾燥し、生成物６８８ｍｇを得
た。
【００８２】このペプチドを、０．１０Ｍ炭酸水素アン
モニウム、ｐＨ８．０の１．２ ｌ、次いで０．２０
Ｍ、ｐＨ８の緩衝液を用いて流出させるＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘの２．６×９０ｃｍのカラムによるクロマ
トグラフィーで精製した。ＨＰＬＣで精製された主要ピ
ーク（λ２７８ｎｍ）の画分を一緒にし、凍結乾燥し
た。生成物は３８８ｍｇであった。
【００８３】ＴＬＣ、シリカゲル６０：Ｒf 溶媒系 0.17 3:1:1 n-BuOH:HOAc:H2O 0.31 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H2O:Pyr 0.36 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H2O:EtOAc アミノ酸分析: Ａｓｐ、０．９９；Ｇｌｘ、０．９９；Ｐｒｏ、１．０
３；Ｔｙｒ、０．９８；Ａｒｇ、１．０１；ペプチド１
００％。
【００８４】実施例ＩＸ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−Ｄ−チロシン： 表題の化合物を次の如く製造
した：ＢＯＣ−Ｄ−Ｔｒｙ（２ＢｒＺ）−Ｏ−ＣＨ2−樹脂 上部からの撹拌機を備えた丸底フラスコ中において、Ｄ
ＭＦ ４ｍｌ中ＢＯＣ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）（０．
７４ｇ；１．５ミリモル）の溶液に、クロルメチル化重
合体（０．８８ミリ当量／ｇ；１．１３ｇ；１ミリモ
ル）及び無水ＫＦ（０．１７ｇ；３ミリモル）を添加し
た。反応混合物を５０℃で２４時間撹拌した。樹脂を濾
過し、ＤＭＦ（３×２５ｍｌ）、５０％ＤＭＦ／Ｈ2Ｏ
（３×２５ｍｌ）、５０％ＥｔＯＨ／Ｈ2Ｏ（３×２５
ｍｌ）及びＥｔＯＨ（３×２５ｍｌ）で洗浄した。ＢＯ
Ｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）の樹脂上の置換度は、アミ
ノ酸分析に基づいて０．３５モル／樹脂ｇであった。
【００８５】Ａｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓ
ｐ（ＯＢｚｌ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｏ
−ＣＨ2−樹脂 Ａｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｏ−ＣＨ2−
樹脂を、固相法に従い手動で合成した。次の結合に対し
て１当量のＨＯＢｔを添加しつつ、アミノ酸誘導体及び
ＤＣＣを３倍過剰量で使用した：Ａｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏ
ｓ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、
及びＢｏｃ−Ｖａｌ。ＤＣＣ／ＨＯＢｔの結合物に加
え、Ｂｏｃ−Ｖａｌ及びＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）に
対する完全な反応を保証するために、対称無水物結合物
を予じめ作らねばならなかった。即ち結合に先立って、
ＤＣＣ１．５当量をアミノ酸誘導体３当量に０℃で１時
間添加することによって対称無水物を生成せしめた。次
いでＤＣＣを濾別して、樹脂−ペプに添加した。なお次
の合成プログラムを用いた。
【００８６】 １．５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 （２分間、１５分間） ２．ＣＨ2Ｃｌ2 （２×２分間） ３．５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 （２５分間） ４．ＣＨ2Ｃｌ2 （３×２分間） ５．イソプロパノール（２×１分間） ６．ＣＨ2Ｃｌ2 （４×２分間） ７．７％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 （１×３分間）；第２
回目の処理（２分間、５分間） ８．ＣＨ2Ｃｌ2 （２×２分間） ９．７％ＤＩＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 （３分間、４分間） １０．ＣＨ2Ｃｌ2 （５×２分間） １１．次のアミノ酸をＣＨ2Ｃｌ2 中で結合 １２．５分間混合 １３．ＣＨ2Ｃｌ2／ＤＭＦ（１０：１）中ＤＣＣ及びＨ
ＯＢｔを添加 １４．夜通し混合 １５．ＣＨ2Ｃｌ2 （６×２分間） １６．ニンヒドリン試験（反応が不完全ならば工程７〜
１６を繰返した） ＡｒｇのＡｏｃ基を５０％ＴＡ／ＣＨ2Ｃｌ2で除去し、
次いでアセチル化した。
【００８７】Ａｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ
（ＯＢｚｌ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｏ−
ＣＨ2−樹脂 ＴＥＡ Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｏ−ＣＨ2−
Ｒ（〜１ミリモル）を、丸底フラスコ中室温で２時間、
１：１ＤＭＦ／ピリジン溶液中無水酢酸（１．０２ｇ、
１０ミリモル）と共に撹拌した。アセチル化したペプチ
ド−樹脂を、ガラスフイルター付き濾斗に移し、ＤＭＦ
で洗浄した。生成物を真空下に乾燥して、粗アセチル化
ペプチド−樹脂１．１７ｇを得た。
【００８８】ＨＦ開裂 Ａｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）
−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−Ｏ−ＣＨ2−樹脂
（１．１７ｇ）を、１０％アニソールの存在下に０℃で
１時間ＨＦ １２ｍｌにより開裂させた。ペプチド樹脂
をガラスフイルター付き濾斗に移し、エーテルで完全に
洗浄した。次いでペプチドを１０％ＨＯＡｃ／Ｈ2Ｏ
（５×１０ｍｌ）及び続いてＨ2Ｏで抽出し、凍結乾燥
してペプチド２１０ｍｇを得た。
【００８９】Ａｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−
Ｄ−Ｔｙｒの精製 粗Ａｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｙｒ
を、０．０５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ（ｐＨ４．５）で平衡化
したＳｅｐｈａｄｅｘ ＳＰＣ−２５のカラム（２５×
１００ｃｍ）でクロマトグラフィー処理した。流速は６
１ｍｌ／時であり、１２ｍｌ／試験管の画分を集めた。
ＵＶモニターをλ＝２７７ｎｍに設定した。所望の生成
物は試験管２３〜２８間で流出した。これらの画分を集
め、凍結乾燥してペプチド（ペプチド２５％）１４０ｍ
ｌを得た。
【００９０】Ａｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−
Ｄ−Ｔｙｒの脱塩 精製したＡｃ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｄ−
Ｔｙｒを繰返し凍結乾燥してもペプチド含量を増大させ
得ないから、ペプチドを脱塩するためにＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−１０のカラム（２５×１００ｃｍ）を用いた。
カラムを水中で平衡化させ、３０ｍｌ／時の流速で操作
した。１０ｍｌ／試験管の画分を集め、生成物の検知の
ためにＵＶモニターを２０７ｎｍに設定した。ペプチド
は画分２１〜３７間で流出した。これらの画分を集め、
凍結乾燥して、非常に吸湿性の物質（ペプチド３３％）
１３０ｍｇを得た。
【００９１】薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＦ６
０；２００μ）： Ｒf 0.43（n-BuOH/HOAc/H2O/Pyr−15:3:12:10） Ｒf 0.60（n-BuOH/HOAc/H2O/EtOAc−1:1:1:1） アミノ酸分析： 酸加水分解、Ａｓｐ、０．９９；Ｐｒｏ、０．９８；Ｖ
ａｌ、１．０３；Ｔｙｒ、０．９７；Ａｒｇ、１．０
２。
【００９２】ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）分
解、Ａｓｐ、０．００；Ｐｒｏ、０．００；Ｖａｌ、
０．００；Ｔｙｒ、０．００；Ａｒｇ、０．００（０．
００は遊離したアミノ酸が検知できなかったことを意味
する）。 実施例Ｘ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシン 表題の化合物を、Ｂｏｃ−Ｔｒｙ（Ｂｚｌｃｌ2）樹脂
エステル（６．５０ｇ、０．３２ミリ当量／ｇ）から始
めて、固相法で製造した。次の標準的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０ｍｌで１分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０ｍｌで３０
分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ４０ｍｌでそれぞれ１分間２回、続
いてｉＰｒＯＨ ４０ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2
４０ｍｌでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０ｍｌでそれぞれ
２．５分間で２回； 結合−保護されたアミノ酸６．０ミリモル及びＨＯＢＴ
（０．９２ｇ）をＤＭＦ ３ｍｌに溶解し、次いでＣＨ
2Ｃｌ2 ２７ｍｌで希釈した。ＤＣＣ（１．２４ｇ）を
ＣＨ2Ｃｌ2 ５ｍｌに溶解し、反応物及び樹脂の混合物
に添加し、２時間撹拌した。
【００９３】順次樹脂をそれぞれＢｏｃ−Ｖａｌ、Ｂｏ
ｃ−Ｂｚｌβ−Ａｓｐ及びＢｏｃ−Ｐｒｏと１回結合さ
せた。樹脂の半分を貯蔵し、残りをＡｏｃα−Ｔｏｓg
−Ａｒｇと結合させた。脱保護基後樹脂ペプチドを、
１：１ ＤＭＦ：ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）中１０％Ａｃ
2Ｏ及びＤＭＡＰ（４００ｍｇ）で１回、６０分間に亘
りアシル化した。この樹脂を洗浄し、空気乾燥し、そし
てＨＦ／アニソール（３０ｍｌ／８ｍｌ）中０℃で１時
間開裂させた。
【００９４】樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチングし、
濾過した。固体を１０％ＨＯＡｃ（１００ｍｌ）で１時
間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して生成物を無色
の固体として得た。
【００９５】粗ペプチドをＯＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘで
精製した（カラム２．６×８８ｃｍ、４ ｌ、０．０５
〜０．３Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3 グラジエント、ｐＨ７．
２；１００ｍｌ／時、９ｍｌ／画分、検知器２７８ｎ
ｍ）。画分１２０〜１４０を集め、凍結乾燥した。この
残渣のペプチドをＧ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘで脱塩し
た（カラム２．６×８５ｃｍ、流出剤１％ＨＯＡｃ）。
凍結乾燥したアセチルペンタペプチドは８３０ｍｇであ
った。
【００９６】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.03 Pro 0.99 Asp 1.00 Val 1.00 Tyr 0.97 ペプチド含量 75.1％ 実施例ＸＩ アルギニル−Ｄ−プロリル−アスパルチル−バリル−チ
ロシン： 表題の化合物を次のように製造した：Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−Ｄ−プロリル−（β−
ベンジル）−アスパルチル−バリル−チロシンベンジル
エステル ＴＦＡ（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＯＢｚ
ｌ（ＴＦＡを１５％過剰量で含有）４．００ｇに、塩化
メチレン４０ｍｌ及び飽和炭酸水素ナトリウム溶液４０
ｍｌを添加した。混合物を激しく撹拌し、次いで層を分
離した。有機層を炭酸水素塩溶液で抽出し、乾燥した。
溶媒を除去することにより白色の固体を得た。この物質
を８：１ ＣＨ2Ｃｌ2：ＤＭＦ ４５ｍｌに溶解した。
この溶液にＮ−ｔ−ブチロキシカルボニル−Ｄ−プロリ
ン（ペニシシュラ）１．０８ｇ及び１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール０．１ｇを添加した。この溶液を氷浴中
で冷やし、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．０３ｇ
を添加した。この混合物を氷浴中で９０分間、次いで室
温で９０分間撹拌した。そして沈殿を濾過した。濾液を
１０％クエン酸溶液、水及び飽和炭酸水素ナトリウム溶
液で抽出した。溶媒を除去することによってガラス状物
を得、これを酢酸エチル−ヘキサンから結晶化した。生
成物は３．３３ｇであった。融点８２〜８８℃（分
解）。
【００９７】トリ−ベンジロキシカルボニル−アルギニ
ル−Ｄ−プロリル（β−ベンジル）アスパルチル−バリ
ル−チロシンベンジルエステル 上述の保護されたテトラペプチド３．３１ｇに、塩化メ
チレン中５０％トリフルオル酢酸４０ｍｌを添加した。
３０分間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、残渣にエーテル
を添加した。固体生成物を、少量のメタノールの添加に
より酢酸エチルに溶解した。この溶液を飽和炭酸水素ナ
トリウム溶液で２回抽出した。有機層から溶媒を除去し
て得られる固体をＤＭＦ １０ｍｌに溶解し、ＤＭＦ
５ｍｌ中トリベンジロキシカルボニル−アルギニン（Ｂ
ａｃｈｅｍ）２．７７ｇの溶液に添加した。この溶液を
氷浴中で冷やし、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
０．６６ｇ、次いでジシクロヘキシルカルボジイミド
０．８９ｇを添加した。反応混合物を室温で１６時間撹
拌した。溶媒のほとんどを真空下に除去した。この残渣
に酢酸エチルを添加し、不溶物を濾過した。濾液を１０
％クエン酸溶液で、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液
で２回抽出した。乾燥し、溶媒を除去することによって
粘稠な油生成物を得た。この物質を、塩化メチレン中３
〜１０％メタノールのグラジエントを用いるシリカゲル
６０でのクロマトグラフィーに供した。重さ４．１４ｇ
の無色のガラス状の生成物を得た。
【００９８】アルギニン−Ｄ−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシン 保護されたペンタペプチド１．６６ｇ部分を、パラジウ
ム黒０．５ｇ上においてメタノール２０ｍｌ中ぎ酸１ｍ
ｌで水素化した。４時間激しく撹拌した後、触媒を濾過
し、溶媒を回転蒸発機により濾液から除去した。残渣を
５％水性酢酸に溶解し、凍結乾燥した。生成物は８８９
ｍｇであった。
【００９９】ペプチドをＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘの
２．６×９５繊維のカラムのクロマトグラフィーに供し
た。０．２５Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3 ｐＨ８．０に溶解しな
い物質を濾過し、濾液をカラムにかけた。カラムを、こ
の緩衝液を用いて１００ｍｌ／時で流出させ、画分を１
０ｍｌずつ集めた。主な成分は画分１４２〜１４６で流
出した。この凍結乾燥した生成物は６３４ｍｇであっ
た。
【０１００】ＨＰＬＣ：ｒｔ−Ｗｈａｔｍａｎ Ｃ18−
Ｐｏｒａｓｉｌにおいて１．５ｍｌ／分で６．５分、８
％ＣＨ3ＣＮ−０．０１Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ ｐＨ５。
【０１０１】ＴＬＣ、シリカゲルＧＦ、２５０μＲf 溶媒系 0.42 1:1:1:1 nBuOH:HOAc:H2O:EtOAc 0.34 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H2O:Pyr 0.53 1:1 TFE:NH4OH アミノ酸分析: Ａｓｐ、０．９９；Ｐｒｏ、０．９８；Ｖａｌ、１．０
１：Ｔｙｒ、１．０１；Ａｒｇ、１．０３；ペプチド９
４％。
【０１０２】実施例ＸＩＩ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシン−Ｎ−イソブチルアミド 表題の化合物を次のように製造した： Ａ．０℃のＤＭＦ（１５ｍｌ）及びＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍ
ｌ）中のＰｒｏ−ＯＣＨ3・ＨＣｌ（５５．２ｇ、３
３．３ミリモル）、Ａｏｃα−Ｔｏｓg−Ａｒｇ（８
９．６％、１６．４ｇ、３３．３ミリモル）及び１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、５．１０ｇ、
３３．３ミリモル）の撹拌溶液に、Ｎ−メチルモルフォ
リン（ＮＭＭ、３８５ｍｌ、１．１当量）を添加した。
次いでＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中ＤＣＣ（６．８８ｇ、
１．０当量）の溶液を滴々に添加した。５分後反応物を
室温まで暖め、９０分間撹拌した。得られた固体を濾別
し、濾液を蒸発させ、黄色の油を得た。これをＥｔＯＡ
ｃ（２００ｍｌ）中に懸濁させ、再び濾過した。この溶
液を飽和水性ＮａＨＣＯ3で２回、Ｈ2Ｏで１回、１０％
のクエン酸で１回、そして飽和食塩水で１回洗浄した。
有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、無色
の泡状物１７．９０ｇを得た。この反応混合物を、３つ
の等しいバッチに分け、フラッシュ・クロマトグラフィ
ー（カラム５×１５ｃｍ、流出剤として５：３ ＣＨ2
Ｃｌ2：アセトン）により精製し、メチルＮg−トシル−
Ｎα−ｔ−アミロキシカルボニル−アルギニル−プロリ
ネート（生成物Ａ）の無色のガラス状物として得た。１
３．４１ｇ、７３％。
【０１０３】Ｂ．５℃のＣＨ3ＯＨ（２５ｍｌ）中生成
物Ａ（５．５４ｇ、１０．０ミリモル）の撹拌溶液に、
冷却したＨ2Ｏ（２０ｍｌ）及び２．００Ｍ ＮａＯＨ
（水性）（５．００ｍｌ、１０．０ミリモル）を添加し
た。得られた無色の溶液を５〜１０℃に１８時間保持
し、次いで室温に１時間暖めた。溶液を約２５ｍｌまで
蒸発させ、ｐＨを９．８に調節し、Ｅｔ2Ｏで１回抽出
した。この水性残渣を固体のクエン酸でｐＨ２．８に処
理し、次いでＮａＣｌで飽和させた。ＥｔＯＡｃで３回
抽出後、有機層を一緒にし、飽和食塩水で１回逆洗浄
し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、Ｎg−ト
シル−Ｎα−アミロキシカルボニル−アルギニル−プロ
リン（生成物Ｂ）を無色の固体として得た。５．３０
ｇ、９８％、融点１１４〜１１５℃。
【０１０４】Ｃ．ＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）中ＢＯＣ−Ｔ
ｙｒ（ＢｒＺ）（４．９４ｇ、１０．０ミリモル）の撹
拌溶液に、Ｎ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ、１．２１
ｍｌ、１．１当量）を添加した。この溶液を−２０℃ま
で冷却し、ｉＢｕＯＣＯＣｌ（１．３３ｍｌ、１．１当
量）を滴々に添加した。２０分後、イソブチルアミン
（１．００ｍｌ、１．１当量）を添加した。１０分後に
濃密な撹拌できない物質が生成した。この反応混合物を
室温まで暖め、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、Ｈ
2Ｏで１回、１０％クエン酸で１回、Ｈ2Ｏで１回、飽和
水性ＮａＨＣＯ3で１回及び飽和食塩水で１回洗浄し
た。有機層をＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、蒸発させ、
Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−Ｏ−（２−ブロムベン
ジロキシカルボニル）−チロシン−Ｎ−イソブチルアミ
ド（生成物Ｃ）を、更なる用途に対して十分純粋な無色
の固体として得た。５．１０ｇ、９３％。
【０１０５】Ｄ．生成物Ｃ（４．１９ｇ、７．６３ミリ
モル）に、５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（１４ｍｌ）を添
加した。４０分間撹拌した後、溶液を３０℃以下で蒸発
させ、夜通し脱気して生成物Ｄ１を黄色の油として得
た。５．６５ｇ。
【０１０６】−２０℃のＥｔＯＡｃ（２４ｍｌ）中ＢＯ
Ｃ−Ｖａｌ（１．６６ｇ、１．００当量）の撹拌溶液
に、ＮＭＭ（０．９２ｍｌ、１．１当量）、次いでｉＢ
ｕＯＣＯＣｌ（１．００ｍｌ、１．０２当量）を滴々に
添加した。２０分後に、ＥｔＯＡｃ（５ｍｌ）中生成物
Ｄ１及びＮＭＭ（１．９７ｍｌ）の溶液を添加し、反応
物を−５℃に暖めた。３０分後に、かなりの沈殿が生成
した。反応をＨ2Ｏで停止させ、ＥｔＯＡｃで３回抽出
した。有機抽出物を一緒にし、飽和水性ＮａＨＣＯ3で
１回、Ｈ2Ｏで１回、１０％クエン酸で１回、そして飽
和食塩水で１回洗浄した。ＭｇＳＯ4で乾燥した後、抽
出物を濾過し、蒸発させた。得られた固体を熱Ｅｔ2Ｏ
でそしゃくし、濾過し、乾燥し、Ｎ−ｔ−ブチロキシカ
ルボニル−バリル−Ｏ−（２−ブロムベンジロキシカル
ボニル）−チロシン−Ｎ−イソブチルアミド（生成物
Ｄ）を無色の固体として得た。４．２１ｇ、８５％、融
点１７５〜１７６℃。
【０１０７】Ｅ．生成物Ｄ（１．９５ｇ、３．００ミリ
モル）に、ジオキサン（５ｍｌ）中４．５Ｍ ＨＣｌを
添加した。１時間後に溶液を蒸発させ、残渣をジオキサ
ンから凍結乾燥して、ふわふわした固体、生成物Ｅ１を
１．６０ｇ得た。
【０１０８】−１５℃のＤＭＦ（５ｍｌ）中Ｎα−ＢＯ
Ｃ−β−Ｂｚｌ−Ａｓｐ（０．８８４ｇ、１．０当量）
の撹拌溶液にＮＭＭ（０．３３モル）を添加し、次いで
ｉＢｕＯＣＯＣｌ（０．３６ｍｌ）を添加した。１５分
後、ＤＭＦ（２ｍｌ）中生成物Ｅ１及びＮＭＭ（０．３
ｍｌ）の溶液を添加し、反応混合物を撹拌し、室温まで
暖めた。トリペプチドを飽和水性ＮａＨＣＯ3で沈殿さ
せ、Ｈ2Ｏで洗浄し、濾過した。ＥｔＯＡｃから再結晶
することにより、Ｎα−ブチロキシカルボニル−β−ベ
ンジル−アスパルチル−バリル−Ｏ−（２−ブロムベン
ジロキシカルボニル）−チロシン−Ｎ−イソブチルアミ
ド（生成物Ｅ）を無色の固体として得た。１．９０ｇ、
７４％。
【０１０９】Ｆ．生成物Ｅ（１．７１ｇ、２．００ミリ
モル）にジオキサン（３ｍｌ）中４．５Ｍ ＨＣｌを添
加した。１時間後、溶液を蒸発させ、残渣をジオキサン
から凍結乾燥して無色の固体１．４６ｇを得た。これを
ＤＭＦ（３ｍｌ）中にスラリーとし、ジイソプロピルエ
チルアミン（ＤＩＥＡ、０．３４ｍｌ）、ＨＯＢＴ
（０．２８ｇ）及びＡｏｃα−Ｔｏｓg−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ（生成物Ｂ）（０．９８ｇ）を添加した。次いでＤＣ
Ｃ（０．３８ｇ）を添加し、反応物を２時間撹拌した。
スラリーを濾過し、濾液を準飽和水性ＮａＨＣＯ3（５
０ｍｌ）でクエンチングした。得られた固体を濾過し、
ＥｔＯＡｃ中に入れ、Ｈ2Ｏ、１０％クエン酸及び飽和
食塩水で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過
し、蒸発させ、Ｎα−ｔ−アミロキシカルボニル−Ｎg
−トシル−アルギニル−プロリル−β−ベンジル−アス
パルチル−バリル−Ｏ−（２−ブロムベンジロキシカル
ボニル）−チロシン−Ｎ−イソブチルアミド（生成物
Ｆ）を淡黄色の固体として得た。１．９１ｇ、７５％。
【０１１０】Ｇ．生成物Ｆ（１．８５ｇ、１．４５ミリ
モル）に５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍｌ）を添加し
た。３０分後に溶液を冷却しつつ蒸発させ、Ｅｔ2Ｏで
そしゃくし、無色の固体２．３５ｇを得た。この固体に
ＮＭＭ（０．６４ｍｌ）、ＤＭＡＰ（０．１２ｇ）及び
ＤＭＦ（５ｍｌ）を添加した。次いでＡｃ2Ｏ（０．５
ｍｌ）を添加し、得られた淡黄色の溶液を１時間撹拌し
た。この反応を準飽和ＮａＨＣＯ3溶液でクエンチング
した。得られた褐色の沈殿を集め、１０％クエン酸、Ｈ
2Ｏで洗浄し、空気乾燥して、Ｎα−アセチル−Ｎg−ト
シル−アルギニル−プロリル−β−ベンジル−アスパル
チル−バリル−Ｏ−（２−ブロムベンジロキシカルボニ
ル）−チロシン−Ｎ−イソブチルアミド（生成物Ｇ）を
得た。１．３４ｇ、７７％。
【０１１１】Ｈ．保護されたペンタペプチド生成物Ｇ
（１．３４ｇ）を、ＨＦ／アニソール（３０ｍｌ／６ｍ
ｌ）を用い、０℃で１時間開裂させた。この残渣をＥｔ
2Ｏでクエンチングさせ、１０％ＨＯＡｃ（１００ｍ
ｌ）で１回及び１％ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）で１回抽
出した。水性抽出物を一緒にし、凍結乾燥して黄色の固
体０．６５ｇを得た。
【０１１２】粗ペプチドをＳＰＣ ２５ Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘで精製した（カラム２．６×９０ｃｍ、０．８Ｍの
ｐＨ４．８ Ｅｔ3ＮＨＯＡｃ流出剤、流速７０ｍｌ／
時、８ｍｌ／画分、検知器２７８ｎｍ）。画分９１〜１
１４を集め、凍結乾燥し、標題の化合物２８５ｍｇを無
色の固体として得た。
【０１１３】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.01 Pro 1.02 Asp 1.01 Val 1.00 Tyr 0.95 ペプチド含量 57.4％薄層クロマトグラフィー シリカゲルＧ、２５０μ 展開剤 Ｒf 15:3:12:10 nBuOH:HOAc:H2O:ピリジン 0.67 1:1 トリフルオルエタノール:NH4OH 0.90 1:1:1:1 nBuOH:HOAc:H2O:EtOAc 0.67実施例ＸＩＩＩ Ｎα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−アラニル−チロシン 表題の化合物を、Ｂｏｃ−Ｔｒｙ（ＢｚｌＣｌ2）樹脂
エステル（３．２ｇ、０．３２ミリ当量／ｇ）から始め
て、固相法で製造した。次の標準的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌで１分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌで３０
分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ１分間２回、続
いてｉＰｒＯＨ １５ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2
１５ｍｌでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 １５ｍｌでそれぞれ
２．５分間で２回； 結合−保護されたアミノ酸３．０ミリモル及びＨＯＢＴ
（０．４６ｇ）をＤＭＦ２ｍｌに溶解し、次いでＣＨ2
Ｃｌ2 １３ｍｌで希釈した。ＤＣＣ（０．６２ｇ）を
ＣＨ2Ｃｌ2 ３ｍｌに溶解し、反応物及び樹脂の混合物
に添加し、２時間撹拌した。
【０１１４】順次樹脂をＢＯＣ−Ａｌａ、ＢＯＣα−Ｂ
ｚｌβ−Ａｓｐ、ＢＯＣ−Ｐｒｏ及びＡＯＣα−Ｔｏｓ
g−Ａｒｇと１回結合させた。脱保護基後、樹脂ペプチ
ドをＣＨ2Ｃｌ2中１４％Ａｃ2Ｏ及びＤＭＡＰ（６０ｍ
ｇ）で２回、３０分間に亘りアシル化した。
【０１１５】この樹脂をＨＦ／アニソール（４０ｍｌ／
１０ｍｌ）で０℃下に１時間開裂させた。樹脂残渣をＥ
ｔ2Ｏでクエンチングし、濾過した。固体を１０％ＨＯ
Ａｃ１００ｍｌ中で１時間抽出し、濾過し、濾液を凍結
乾燥して粗生成物１．Ｏ８ｇを得た。
【０１１６】粗ペプチドをＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
で精製した（カラム２．６×９０ｃｍ、流出剤０．１Ｍ
ＮＨ4ＨＣＯ3 ｐＨ７．８、流速７０ｍｌ／時、６．
５ｍｌ／画分、検知２８０ｎｍ）。画分１７５〜２２０
を集め、凍結乾燥し、表題の化合物を得た。６５０ｍ
ｇ、５５％。
【０１１７】アミノ酸分析：アミノ酸 比 Arg 1.01 Pro 1.02 Asp 1.00 Ala 0.98 Tyr 0.98 ペプチド含量 55.9％ 実施例ＸＩＶ アルギニル−α−アミノイソブチリル−アスパルチル−
バリル−チロシン 表題の生成物を次のように製造した：Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−α−アミノイソブチリ
ル−（β−ベンジル）− アスパルチル−バリル−チロシ
ンベンジルエステル 水性塩基で中和し、酢酸エチル中へ抽出することによ
り、（β−Ｂｚｌ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＴｙｒＯＢｚｌト
リフルオロアセテートから遊離のアミンを得た。溶媒を
除去して固体１．９０ｇを得、これをＤＭＦ ５ｍｌ中
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．４９ｇを添加し
た塩化メチレン２５ｍｌに溶解した。次いで溶液を５℃
に冷却し、Ｎ−ｔ−ブチロキシカルボニル−α−アミノ
イソ酪酸０．６５ｇ、次いでジシクロヘキシルカルボジ
イミド０．６６ｇを添加した。混合物を５℃で３０分間
撹拌し、室温下に１６時間放置した。反応混合物を濾過
し、濾液を水で抽出し、次いで塩化メチレンで希釈し、
飽和炭酸水素ナトリウム溶液で２回抽出した。無水硫酸
マグネシウムで乾燥した後、溶媒を除去して油を得、こ
れをシリカゲル６０でのフラッシュ・クロマトグラフィ
ーによって精製した。この場合流出剤としては、最初に
塩化メチレン中１％メタノール、次いで５％ＭｅＯＨ−
ＣＨ2Ｃｌ2を用いた。無色ガラス状の主生成物を１．７
５ｇ得た。
【０１１８】Ｎα，δ，ω−トリベンジロキシカルボニ
ル−アルギニル−α−アミノイソブチリル−（β−ベン
ジル）−アスパルチル−バリル−チロシンベンジルエス
テル Ｂｏｃ−Ａｉｂ−（β−Ｂｚｌ）−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒＯＢｚｌ １．７５ｇにジオキサン中４．５Ｎ Ｈ
Ｃｌ ２５ｍｌを添加し、溶液を５０分間撹拌した。回
転蒸発機によって容量を減じ、残渣エーテルを添加し
た。沈殿を濾過し、エーテルで洗浄した。次いで塩か
ら、水性塩基での中和及び塩化メチレン中への抽出によ
って遊離のアミンを得た。溶媒を除去し、無色のガラス
状物１．３６ｇを得た。
【０１１９】このテトラペプチドを塩化メチレン１０ｍ
ｌに溶解し、ＤＭＦ ５ｍｌ中Ｎα，δ，ω−トリベン
ジロキシカルボニル−アルギニン１．２７ｇ及び１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール０．３４ｇの溶液に添加し
た。この溶液を氷浴中で冷却し、ＣＨ2Ｃｌ2 ５ｍｌ中
ジシクロヘキシルカルボジイミド０．４５ｇの溶液を添
加した。この混合物を氷浴中で３０分間、次いで室温で
３−１／２時間撹拌した。反応混合物を塩化メチレンで
希釈し、濾過した。濾液を水、飽和炭酸水素ナトリウム
溶液２回、１０％クエン酸溶液、及び飽和塩化ナトリウ
ム溶液で抽出した。乾燥後に溶媒を蒸発させて油を得
た。生成物を、９８：２ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ流出液を
用いるシリカゲル６０でのフラッシュ・クロマトグラフ
ィーにより精製した。主生成物は重さ２.０６ｇのゴム
状物であった。このＮＭＲスペクトルはＺ3−Ａｒｇ−
Ａｉｂ−（β−Ｂｚｌ）−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＴｙｒＯＢ
ｚｌに妥当であり、生成物はペプチド１モル当り３モル
のＤＭＦが溶媒和していることを示した。
【０１２０】アルギニル−α−アミノイソブチリル−ア
スパルチル−バリル−チロシン 保護されたペンタペプチド１.７５ｇを、９：１メタノ
ール−１Ｎ水性酢酸を溶媒として用いることにより、１
０％パラジウム担持活性炭の存在下４０ｐｓｉの水素圧
で水素化した。Ｐａｒｒ装置で１８時間振とうした後、
混合物を濾過し、触媒を水洗した。メタノールを減圧下
に濾液から除去した。残渣を５％酢酸で希釈し、凍結乾
燥した。生成物は６８７ｍｇであった。
【０１２１】ペプチドを、０.１０Ｎ酢酸アンモニウム
ｐＨ５で流出させるＳＰ−Sephadexのカラム２.６×９
０ｃｍでのクロマトグラフイーにより精製した。溶液を
カラムに供する前に、上記緩衝液に不溶な物質を濾過し
た。主成分は画分７０〜９２で流出した（画分それぞれ
１０ｍｌ）。ＨＰＬＣで純粋な画分７８〜９２を集め、
凍結乾燥して表題の化合物７２５ｍｇを得た。
【０１２２】 ＴＬＣ、シリカゲル６０：Ｒｆ 溶 媒 系 ０.３２ １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ０.３３ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡＣ： Ｈ2Ｏ：ｐｙｒ ０.１３ ３：１：１ Ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： Ｈ2Ｏ アミノ酸分析：Ａｓｐ、０.９９；Ｖａｌ、１.０１；Ｔ
ｙｒ、１.００；Ａｒｇ、１.０２；Ａｉｂ、１.０１；
ペプチド５７.７％。
【０１２３】実施例ＸＶＮα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシン−Ｎ−メチルアミド 表題の化合物を次のように製造した： Ａ．Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3 ５００ｍｌの３ツ口フラスコに、ガス導入管及びドライ
アイスで冷却できる乾燥管のついた冷フインガー凝縮器
（Cold finger condenser)を取りつけた。このフラスコ
にＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＯＢｚｌ（６.９５ｇ、１
４.８ミリモル）及びＥｔ2Ｏ（２５０ｍｌ）を仕込ん
だ。メチルアミン（約２０ｇ）を攪拌スラリー中にバブ
リングした。この結果無色の溶液が直ぐに生成した。１
時間後にフラスコの栓をし、室温で１０１時間貯蔵し
た。得られた固体を濾過し、上澄溶液を乾固するまで蒸
発させた。併せた固体を熱ＥｔＯＡｃ中でそしゃくし、
濾過し、空気乾燥し、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣ
Ｆ3（生成物Ａ）を得た。５.０３ｇ、８６％。
【０１２４】Ｂ．Ｂｏｃ−（Ｂｚｌβ）Ａｓｐ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3 ４.５Ｍ ＨＣｌ−ジオキサン（７ｍｌ）の攪拌溶液
に、生成物Ａ（２.７５ｇ、７.００ミリモル）の添加し
た。１時間後、溶液を減圧下に蒸発させた。残渣をＨ2
Ｏ中に溶解し、凍結乾燥して、ＨＣｌ・Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＮＨＣＨ3（生成物Ｂ１）を得た。２.２８ｇ、９９
％。
【０１２５】ＤＭＦ（５ｍｌ）中生成物Ｂ１（２.２８
ｇ、６.９１ミリモル）及びＢｏｃ−（Ｂｚｌβ）−Ａ
ｓｐサクシニミドエステル（２.９０ｇ、６.９０ミリモ
ル）の攪拌溶液に、Ｎ−メチルモルフオリン（ＮＭＭ、
０.８５ｍｌ）を添加した。得られたかすかに黄色の溶
液を２４時間攪拌し、次いで５％クエン酸（１５０ｍ
ｌ）でクエンチングした。固体を集め、飽和水性ＮａＨ
ＣＯ3、Ｈ2Ｏ及びＥｔ2Ｏで洗浄した。明黄色の固体を
空気乾燥し、ＥｔＯＡｃ／ＣＨ3ＯＨから再結晶して生
成物Ｂを得た。３.４５ｇ、８４％。
【０１２６】Ｃ．Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−（Ｂｚｌβ）Ａｓｐ
−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3 生成物Ｂ（２.８０ｇ、４.６８ミリモル）を、ジオキサ
ン（１０ｍｌ）中４.５Ｍ ＨＣｌの攪拌溶液に添加し
た。１時間後に溶液を減圧下に蒸発させた。残渣をＨ2
Ｏに溶解し、凍結乾燥して、ＨＣｌ・（Ｂｚｌβ）Ａｓ
ｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3（生成物Ｃ１）を得
た。２.３６ｇ、９２％。
【０１２７】ＤＭＦ（１０ｍｌ）中生成物Ｃ１（２.３
１ｇ、４.３２ミリモル）及びＢｏｃ−Ｐｒｏ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステル（１.３５ｇ、４.３２ミリ
モル）の攪拌溶液にＮＭＭ（０.５５ｍｌ）を添加し
た。この溶液を２２時間攪拌し、次いで飽和水性ＮａＨ
ＣＯ3でクエンチングした。固体を集め、Ｈ2Ｏ、１０％
クエン酸及びＨ2Ｏで洗浄した。明黄色の固体を空気乾
燥し、ＥｔＯＡｃから再結晶して生成物Ｃを得た。２.
３２ｇ、７７％。
【０１２８】Ｄ．ＨＣｌ・（ＮＯ2 g）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−
（Ｂｚｌβ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3 ４.５Ｍ ＨＣｌの攪拌溶液に、生成物Ｃ（２.０２ｇ、
２.９０ミリモル）を添加した。約１０分後に沈殿が生
成した。１時間後にスラリーを減圧下に蒸発させた。残
渣をＨ2Ｏに溶解し、凍結乾燥し、ＨＣｌ・Ｐｒｏ−
（Ｂｚｌβ）Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3（生
成物Ｄ１）を無色の粉末として得た。１.７５ｇ、９５
％。
【０１２９】ＤＭＦ（５ｍｌ）中生成物Ｄ１（１.７３
ｇ、２.７４ミリモル）、（Ｂｏｃα−ＮＯ2 g）Ａｒｇ
（８７.９％、０.９９ｇ、２.７３ミリモル）、１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、０.４２ｇ）
及びＮＭＭ（０.３３ｍｌ）の攪拌溶液に、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０.５６ｇ）を添加し
た。５分後に沈殿が生成した。３時間後に反応混合物を
濾過し、濾液を飽和水性ＮａＨＣＯ3で処理した。得ら
れた固体を集め、Ｈ2Ｏ、１０％クエン酸、及びＨ2Ｏで
洗浄した。無色の固体を空気乾燥し、熱ＥｔＯＡｃ中で
そしゃくし、ＢＯＣ（ＮＯ2 g）Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｂｚ
ｌβ）−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3（生成物
Ｄ２）を得た。２.０４ｇ、８３％。
【０１３０】ジオキサン（５ｍｌ）中４.５Ｍ ＨＣｌ
の攪拌溶液に生成物Ｄ２（１.９２ｇ）を添加した。１
時間後にペースト状の反応混合物を減圧下に蒸発させ
た。残渣をＨ2Ｏに溶解し、凍結乾燥して生成物Ｄを得
た。１.６４ｇ、９２％。
【０１３１】Ｅ．Ａｃα−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨＣＨ3 ＤＭＦ（５ｍｌ）中生成物Ｄ（１.６１ｇ、１.９３ミリ
モル）及びＮ−アセトキシ−サクシンイミド（０.３３
ｇ）の攪拌溶液ＤＩＥＡ（０.７１ｍｌ）を添加した。
３時間後に混合物を減圧下に蒸発させた。残渣をＨ2Ｏ
で処理し、傾斜した後、得られた固体を５０％水性ＨＯ
Ａｃ（１００ｍｌ）に溶解した。この溶液をＮ2でパー
ジした後、１０％ Ｐｄ／Ｃ ０.５ｇを添加し、混合
物をＰａｒｒの装置（容器５００ｍｌ、Ｐｏ＝４７.０p
sig）での水素化に供した。６８時間後反応混合物を微
孔性フイルターを通して濾過し、減圧下に蒸発させ、Ｈ
2Ｏに溶解し、凍結乾燥した。得られた粗残渣（生成物
Ｅ１）は１.２１ｇであった。
【０１３２】この粗アセチル化ペンタペプチドを、最初
にSephadex ＳＰＣ−２５で精製した（カラム２.６×８
５ｃｍ、０.０５Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ ｐＨ４.５、流速１
００ｍｌ／時、１０ｍｌ／画分）。画分３８〜７５を集
め、凍結乾燥して３２１９−１８２０１を６００ｍｇ得
た。低純度（ＨＰＬＣで９２％）のために、この半分を
Sephadex ＤＥＡＥのクロマトグラフイーに再び供した
（カラム２.６×８１ｃｍ、０.０３Ｍ ＮＨ4ＨＣＯ3、
Ｐｈ８.９、流速１００ｍｌ／時、１０ｍｌ／画分）。
画分４０〜５０を集め、凍結乾燥し、表題の化合物を得
た。３７５ｍｇ、４９％。
【０１３３】アミノ酸分析： アミノ酸 比 Ａｒｇ ０.９９ Ｐｒｏ １.０１ Ａｓｐ １.０３ Ｖａｌ １.０１ Ｔｙｒ ０.９７ ペプチト８２.９％薄層クロマトグラフイー： 展開剤 Ｒｆ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５３ Ｈ2Ｏ：ピリジン １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.１９ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ３：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.１７ Ｈ2Ｏ 実施例ＸＶＩＮα−アセチル−アルギニル−プロリル−グルタミル−
バリル−チロシンアミド 表題の化合物を、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
（Ｕ.Ｓ.Ｂiochemical３１５７８、４.０ｇ、０.２５ミ
リ当量／ｇ）から始めて、固相法で製造した。次の標準
的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ３０ｍｌで１分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ３０ｍｌで３０
分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ３０ｍｌでそれぞれ１分間２回、続
いてｉＰｒＯＨ ３０ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2
３０ｍｌでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ３０ｍｌでそれぞれ
２.５分間で２回； 結合−保護されたアミノ酸３.０ミリモル及びＨＯＢＴ
（０.４６ｇ）をＤＭＦ３ｍｌに溶解し、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 ２７ｍｌで希釈した。ＤＣＣ（０.６２ｇ）をＣＨ
2Ｃｌ2 ５ｍｌに溶解し、反応物及び樹脂の混合物に添
加し、２時間攪拌した。
【０１３４】順次樹脂をＢＯＣ−Ｖａｌ、ＢＯＣ−Ｂｚ
ｌγ−Ｇｌｕ、ＢＯＣ−Ｐｒｏ及びＡＯＣα−Ｔｏｓg
−Ａｒｇと１回結合させた。脱保護基後樹脂ペプチド
を、１：１ＤＭＦ；ＣＨ2Ｃｌ2中１０％Ａｃ2Ｏ及びＤ
ＭＡＰ（６０ｍｇ）で１回、６０分間に亘りアシル化し
た。樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ／アニソール（３
０ｍｌ／８ｍｌ）中において０℃で１時間開裂させた。
【０１３５】この樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチング
し、濾過した。固体を０.３％ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）
で１時間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して粗ペプ
チドを無色の固体として得た。３７８ｍｇ。
【０１３６】粗ペプチドを最初にＳＰＣ２５Sephadexで
精製した（カラム２.６×８３ｃｍ、０.０３Ｍ、ｐＨ
４.５のＮＨ4ＯＡｃ、７５ｍｌ／時、１０ｍｌ／画分、
検知器２７８ｎｍ）。画分１４０〜１７２を集め、凍結
乾燥して、凍結乾燥物を得た。
【０１３７】この凍結乾燥物をＤＥＡＥ Sephadexのク
ロマトグラフイーに再び供した(カラム２.６×８９ｃ
ｍ、０.０３Ｍ、ｐＨ８.９のＮＨ4ＯＡｃ、７５ｍｌ／
時、１０ｍｌ／画分、検知器２７８ｎｍ）。画分３６〜
４６を集め、凍結乾燥して表題の化合物を得た。２１０
ｍｇ。
【０１３８】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ １.００ Ｐｒｏ １.０２ Ｇｌｕ １.０２ Ｖａｌ ０.９９ Ｔｙｒ ０.９８ ペプチド含量９２.２％薄層クロマトグラフイー 、シリカゲルＧ、２５０μ 展開剤 Ｒｆ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５３ Ｈ2Ｏ：ピリジン １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.３３ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ５：５：３：１ ＥｔＯＡｃ：Ｈ2Ｏ：Ｐｙｒ： ０.７２ ＨＯＡｃ 実施例ＸＶＩＩＮα−アセチル−Ｄ−アルギニル−プロリル−アスパル
チル−バリル−チロシンアミド 表題のペプチドを、Beckman９９０Ｂ型自動ペプチド合
成機を用い、固相法で合成した。合成を、置換度０.２
５ミリモル／ｇのｐ−メチルベンズヒドリルアミン４.
００ｇで開始した。脱保護基工程には塩化メチレン中５
０％トリフルオル酢酸を、中和工程にはＣＨ2Ｃｌ2中５
％ジイソプロピルエチルアミンを、また結合工程にはＤ
ＣＣ−ＨＯＢｔを用いた。続いて次のアミノ酸誘導体を
樹脂に結合させた；ＢＯＣ−Ｔｙｒ（ＢｒＺ）、ＢＯＣ
−Ｖａｌ、ＢＯＣ−Ａｓｐ（β−Ｂｚｌ）、ＢＯＣ−Ｐ
ｒｏ、及びＢＯＣ−Ｄ＝Ａｒｇ（Ｎg−トシル）。Ｄ−
Ａｒｇの導入後、樹脂を脱保護基し、中和し、触媒とし
ての４−ジメチルピリジンの存在下にジメチルホルムア
ミド中無水酢酸と反応させた。樹脂を洗浄し、真空下に
乾燥した。乾燥した樹脂は５.１５ｇであった。
【０１３９】ペプチドを、ｍ−クレゾール５ｍｌを含有
するＨＦ５０ｍｌにより、０℃で１時間に亘り樹脂から
開裂させた。真空下にＨＦを除去した後、残渣を酢酸エ
チル及びエーテルで洗浄した。ペプチドを５％水性酢酸
１００ｍｌで抽出した。抽出物を凍結乾燥して、粗ペプ
チド６５８ｍｇを得た。
【０１４０】ペプチドをイオン交換樹脂でのクロマトグ
ラフイーにより２回精製した。最初の流出は、ＤＥＡＥ
−Sephadexの２.６×１００ｃｍのカラムを用い、０.０
５ＭＮＨ4ＨＣＯ3、ｐＨ８.０で行なった。画分５７〜
６６（それぞれ１０ｍｌ）を集め、凍結乾燥した。この
生成物５７２ｍｇをＳＰ−Sephadexの２.６×９０ｃｍ
カラムに供し、０.０２Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ４.６で
流出させた。画分７.５ｍｌずつを集めた。主ピークを
３つに分けた：画分１９０〜２１５、２１６〜２４０及
び２４１〜２８５。これらの区分の凍結乾燥したものの
収率及び純度（ＨＰＬＣ）は４８ｍｇ（９８.８％）、
１０７ｍｇ（９８.４％）、２３２ｍｇ（９７.３％）で
あった。
【０１４１】 ＴＬＣ、シリカゲル６０： Ｒｆ０.１９ ３：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ Ｒｆ０.４４ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： Ｐｙｒ Ｒｆ０.８１ ３：２：１ Ｐｙｒ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏアミノ酸分析 ： Ａｓｐ、０.９９；Ｐｒｏ、１.０２；Ｖａｌ、１.０
３；Ｔｙｒ、０.９６；Ａｒｇ、１.０１；ペプチド８
０.５％。
【０１４２】実施例XVIIIＮα−アセチル−アルギニル−α−アミノイソブチリル
−アスパルチル−バリル−チロシンアミド 表題の化合物を、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
（Ｕ.Ｓ.Ｂiochemical３１５７８、６.８３ｇ、０.３ミ
リ当量／ｇ）から始めて、固相法で製造した。次の標準
的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０ｍｌで１分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０ｍｌで３０
分間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ５０ｍｌでそれぞれ１分間２回、続
いてｉＰｒＯＨ５０ｍｌで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2
５０ｍｌでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０ｍｌでそれぞれ
２.５分間で２回； 結合−保護されたアミノ酸５.０ミリモル及びＨＯＢＴ
（０.７７ｇ）をＤＭＦ４ｍｌに溶解し、次いでＣＨ2Ｃ
ｌ2 ４１ｍｌで希釈した。ＤＣＣ（１.０３ｇ）をＣＨ
2Ｃｌ2 ５ｍｌに溶解し、反応物及び樹脂の混合物に添
加し、２時間攪拌した。
【０１４３】順次樹脂をＢＯＣ−Ｖａｌ、ＢＯＣ−Ｂｚ
ｌβ−Ａｓｐ、ＢＯＣ−Ａｉｂと１回及びＡＯＣα−Ｔ
ｏｓg−Ａｒｇと２回結合させた。脱保護基後樹脂ペプ
チドの半分を、１：１ＤＭＦ：ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）
中１０％Ａｃ2Ｏ及びＤＭＡＰ（４００ｍｇ）で１回、
６０分間に亘りアシル化した。樹脂を洗浄し、空気乾燥
し、ＨＦ／アニソール（３０ｍｌ、８ｍｌ）中において
０℃で１時間開裂させた。
【０１４４】この樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチング
し、濾過した。固体を１％ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）で
１時間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して粗ペプチ
ドを無色の固体として得た。４２５ｍｇ。
【０１４５】粗ペプチドを最初にＤＥＡＥ Sehadexで
精製した（カラム２.６×８５ｃｍ、０.０３Ｍ、緩衝さ
れてないＮＨ4ＯＡｃ、７５ｍｌ／時、７ｍｌ／画分、
検知器２７８ｎｍ）。画分７９〜９５を集め、凍結乾燥
して、表題の化合物を得た。２６０ｍｇ。
【０１４６】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ １.０２ Ａｉｂ ０.８９ Ａｓｐ １.００ Ｖａｌ １.０２ Ｔｙｒ １.００ ペプチド含量８４.８％薄層クロマトグラフイー ，シリカゲルＧ２５０μ 展 開 剤 Ｒｆ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.６１ Ｈ2Ｏ：ピリジン １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５７ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ４：２：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.７１ Ｈ2Ｏ：ピリジン 実施例ＸＩＸアルギニル−α−アミノイソブチリル−アスパルチル−
バリル−チロシンアミド 表題の化合物を実施例ＸＶＩＩＩに記述したように固相
法で合成した。残りの樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ
／アニソール（３０ml／８ml）中において０℃下に１時
間開裂させた。
【０１４７】樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチングし、
濾過した。固体を１０％ＨＯＡｃ（１００ml）で抽出
し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して、粗ペプチドを無色
の固体として得た。３８５mg。
【０１４８】粗ペプチドをＣＭ Sephadexで精製した
（カラム２.６×８０cm、２ｌ、０.１０Ｍの緩衝されて
いないＮＨ4ＯＡｃ、次いで０.２Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、７
５ｍ／時、１２ml／画分、検知器２７８ｎｍ）。
【０１４９】画分６２〜９９を集め、凍結乾燥し、表題
の化合物を得た。４３５mg、収率５０％。
【０１５０】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ １.０２ Ａｉｂ ０.９５ Ａｓｐ ０.９７ Ｖａｌ １.０１ Ｔｙｒ １.００ ペプチド含量５８.３％。
【０１５１】薄層クロマトグラフイ シリカゲルＧ，２５０μ 展 開 剤 Ｒf １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５５ Ｈ2Ｏ：ピリジン １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５６ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ４：２：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.７２ Ｈ2Ｏ：ピリジン 実施例ＸＸＮα−アセチル−アルギニル−３，４−デヒドロ−プロ
リル−アスパルチル−バリル−チロシンアミド 表題の化合物を次の如く製造した：ＢＯＣ−３，４−デヒドロ−プロリン ３，４−デヒドロ−Ｐｒｏ（２００mg，１.７６ミリモ
ル）をジオキサン／Ｈ2Ｏ（８ml，２：１）に溶解し
た。この溶液に１Ｎ ＮａＯＨ（１.８ml）及びジ−ｔ
−ブチルジカーボネート（４３６mg，２ミリモル）を撹
拌しながら０℃で添加した。次いで混合物を室温で夜通
し撹拌した。ジオキサンを除去し、残りの水性相に酢酸
エチル（２０ml）を添加した。この混合物を氷浴中で冷
却し、０.５Ｎ ＨＣｌでｐＨ２.０に酸性にし、分液濾
斗に移した。有機層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃ（２
×２０ml）で２回抽出した。一緒にした有機相をＮａ2
ＳＯ4で乾燥し、濾過した。溶媒を除去し、残りの残渣
を乾燥し、更に精製しないで用いた。
【０１５２】Ｎα−アセチル−アルギニル−３，４−デ
ヒドロ−プロリル−アスパルチル−バリル−チロシンア
ミド ペプチドを固相法に従い、（ｐ−メチル）ベンズヒドリ
ルアミン−樹脂（樹脂２ｇ；置換、ＮＨ2 ０.２５ミリ
モル／樹脂ｇ）上で合成した。ＢＯＣ−Ｔｙｒ−（Ｂｚ
ｌ），ＢＯＣ−Ｖａｌ，ＢＯＣ−３，４−デヒドロ−Ｐ
ｒｏ及びＡｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）の導入はＤＣＣ結合
法によって行なった。結合を定量的ニンヒドリン試験で
監視した。アルギニンのアセチル化を５０％無水酢酸／
ピリジン（１５ml）及びＤＭＡＰ（１５mg）で行なっ
た。次いでこのペプチジル樹脂をＤＭＦ及びＣＨ2Ｃｌ2
で完全に洗浄し、乾燥した。乾燥したペプチジル樹脂
（２ｇ）を、ＨＦ／アニソール（２０ml；９：１）を用
い、０℃で１時間開裂させた。このペプチド−樹脂混合
物をエーテル（３×２０ml）で洗浄した。凍結乾燥後、
ペプチドをSephadex ＳＰＣ−２５カラム（５０cm×
０.９cm）に適用し、０.０２Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ４.
６で平衡化させた。流速は８０ml／時であり、１２mlず
つ画分を集めた。生成物は試験管２２〜３９間で流出し
た。これを集め、凍結乾燥した。
【０１５３】この凍結乾燥した物質を、上述と同一の条
件下に、０.０２Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ、ｐＨ４.５〜６.８平
衡化させたSephadex ＳＰＣ−２５のカラム（６０cm×
２５cm）で再び精製した。ペプチドは試験管５５〜７５
間で流出した。これを集め、凍結乾燥し、表題の生成物
８０mgを得た。
【０１５４】Ｒｆ０.４５（ｎ−ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ／
Ｈ2Ｏ／Ｐｙｒ １５：３：１２：１０；シリカゲルＦ
６０） Ｒｆ０.２７（ｎ−ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ ３：１：１；
シリカゲルＦ６０） アミノ酸分析：Ａｓｐ，１.０４；Ｖａｌ，１.００；Ｔ
ｙｒ，０.８５；Ａｒｇ，０.９６；３，４−デヒドロ−
Ｐｒｏ，１.０８；ペプチド含量：７２％；分析におい
て、吸湿性の物質、３，４−デヒドロ−ＰｒｏはＡｓｐ
−残渣の次に流出し、非常に低いＲｆ値を有した。
【０１５５】ＨＰＬＣ：Whatman Partisil−ＯＤＳカ
ラム １０％ＣＨ3ＣＮ／０.０２Ｍ ＮＨ4ＯＡｃ；ｐＨ４.６ 流速；２ml／分 ペプチドは純度９９.７％であり、１４.３分の保持時間
を有した。
【０１５６】実施例ＸＸＩアルギニル−プロリル−アスパルチル−バリル−チロシ
ンアミド 表題の化合物を次のように製造した：Ｚ−Ａｒｇ（Ｚ，Ｚ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ2 ＤＭＦ（１５ml）中ＨＣｌ・Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ）−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ2（０.５ｇ；０.７ミリモ
ル）の溶液に、ＤＩＥＡ（０.１４ml；０.７ミリモル）
及びＺ−Ａｒｇ（Ｚ，Ｚ）−ＯＮｐ（０.７ｇ，１ミリ
モル）を撹拌しながら０℃で添加した。この混合物を室
温で１週間に亘って撹拌した。溶媒を回転蒸発機で除去
した。残渣をエーテルでそしゃくし、濾過した。固体を
ＣＨ3ＯＨ及びＣＨ2Ｃｌ2／エーテル／石油エーテル混
合物から再結晶して、生成物０.５９ｇを得た；Ｒｆ０.
７８（ｎ−ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ／Ｈ2Ｏ＝３：１：１、
シリカゲル、２００μ）1Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）
はＺ−Ａｒｇ（Ｚ，Ｚ）−残渣の存在を示す。
【０１５７】Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−ＮＨ2 Ｚ−Ａｒｇ（Ｚ，Ｚ）−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ2（０.５ｇ）を、ＣＨ3ＯＨ（４
０ml）中Ｐｄ黒（０.５ｇ）及びぎ酸アンモニウム（０.
５ｇ）で夜通し水素化した。触媒を濾過し、濾液を回転
蒸発機で除去した。この残渣をＨ2Ｏに溶解し、凍結乾
燥した。次いで粗ペプチドをSephadexＤＥＡＥカラム
（６０cm×２.５cm）に供し、０.０１Ｍ ＮＨ4ＨＣ
Ｏ3、ｐＨ７.９で流出させた。流速は９０ml／時であ
り、１０mlずつ画分を集めた。ペプチドは試験管１７〜
２９で流出した。これを集め、凍結乾燥して表題の生成
物２９０mgを得た。
【０１５８】ＲｆI＝０.３２（ｎ−ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ
／Ｈ2Ｏ／Ｐｙｒ＝１５：３：１２：１０；シリカゲル
Ｆ６０） ＲｆII＝０.０５（ｎ−ＢｕＯＨ／ＨＯＡｃ／Ｈ2Ｏ＝
３：１：１；シリカゲルＦ６０） アミノ酸分析： Ａｒｇ，１.０１；Ｐｒｏ，１.０１；Ａｓｐ，１.０
０；Ｖａｌ，１.０１；Ｔｙｒ，０.９７； ペプチド含量：７１％ ＨＰＬＣ：Whatman Partisil−ＯＤＳカラム １０％
ＣＨ3ＣＮ／０.０２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4 緩衝液（ｐＨ３.５） 流速；３ml／分 ペプチドは６.３分の保持時間を有し、純度が９９.５％
であった。
【０１５９】実施例ＸＸＩＩＮα−アセチル−アルギニル−２−アミノイソブチリル
−アスパルチル−バリル−チロシン 表題の化合物をＢｏｃ（ＢｒＺ）Ｔｙｒベンジエステル
樹脂（４.５６ｇ，０.４４ミリモル当量／ｇ）から始め
て、固相法で製造した。次の標準的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０mlで５分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０mlで２０分
間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ５０mlでそれぞれ１分間２回、続い
てｉＰｒＯＨ ５０mlで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2 ５
０mlでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０mlでそれぞれ
２.５分間で２回； 通常の結合−保護されたアミノ酸６.０ミリモル及びＨ
ＯＢＴ（０.９２ｇ）をＤＭＦ ４mlに溶解し、次いで
ＣＨ2Ｃｌ2 ４１mlで希釈した。ＤＣＣ（１.２４ｇ）
をＣＨ2Ｃｌ2 ５mlに溶解し、反応物及び樹脂の混合物
に添加し、２時間撹拌した。
【０１６０】対照無水物の結合−保護されたアミノ酸６
ミリモルを、２０：１ ＣＨ2Ｃｌ2：ＤＭＦ（２１ml）
に溶解し、０℃に冷却した。次いでＤＣＣ（０.８３
ｇ）を添加し、反応混合物を３０分間撹拌した。濾過
後、濾液を樹脂に添加し、２０時間撹拌した。
【０１６１】順次樹脂をそれぞれＢｏｃ−Ｖａｌ，Ｂｏ
ｃ（Ｂｚｌβ）−Ａｓｐ，Ｂｏｃ−Ａｉｂ，及びＡｏｃ
α−Ｔｏｓg−Ａｒｇと１回結合させた。次いで樹脂を
Ａｏｃα−Ｔｏｓg−Ａｒｇ対照無水物と１回再結晶さ
せた。
【０１６２】脱保護基後樹脂ペプチドを、１：１ＤＭ
Ｆ：ＣＨ2Ｃｌ2（２０ml）中１０％Ａｃ2Ｏ及びＤＭＡ
Ｐ（３００mg）で１回、６０分間に亘りアシル化した。
樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ／アニソール（３０ml
／８ml）中において０℃で１時間開裂させた。
【０１６３】この樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチング
し、濾過した。固体を１％ＮＨ4ＯＨ（１００ml）で１
時間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して粗ペプチド
を無色の固体として得た。６００mg。
【０１６４】粗ペプチドを最初にＤＥＡＥ Sephadexで
精製した（カラム２.６×８６cm、０.１５Ｍ，緩衝され
ていないＮＨ4ＯＡｃ、１００ml／時、１２.５ml／画
分、検知器２７７ｎｍ）。画分１０９〜１１９を集め、
凍結乾燥して、表題の化合物を得た。２３０mg。
【０１６５】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ ０.９８ Ａｉｂ １.０２ Ａｓｐ １.００ Ｖａｌ １.０３ Ｔｙｒ ０.９７ ペプチド含量６４.４％。
【０１６６】薄層クロマトグラフイー シリカゲルＧ，２５０μ 展 開 剤 Ｒｆ ４：１ トリフルオルエタノール： ０.３５ ＮＨ4ＯＨ １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.６２ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５２ Ｈ2Ｏ：ピリジン 実施例ＸＸＩＩＩアルギニル−シクロロイシル−アスパルチル−バリル−
チロシン 表題の化合物をＢＯＣ（Ｂｚｌ）βＡｓｐ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ（ＢｒＺ）ベンジルエステル樹脂（２.６５ｇ，約
１.０ミリモル当量）から始めて固相法で製造した。次
の標準的な手順を用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlで５分
間、次いで５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlで２０分
間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlでそれぞれ１分間２回、続い
てｉＰｒＯＨ ４０mlで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2 ４
０mlでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlでそれぞれ
２.５分間で２回； 結合方法１−保護されたアミノ酸５.０ミリモル及びＨ
ＯＢＴ（０.７７ｇ）をＤＭＦ ４mlに溶解し、次いで
ＣＨ2Ｃｌ2 ３６mlで希釈した。ＤＣＣ（１.０３ｇ）
をＣＨ2Ｃｌ2 ５mlに溶解し、反応物及び樹脂の混合物
に添加し、１６時間撹拌した。
【０１６７】結合方法２−保護されたアミノ酸８.０ミ
リモルをＣＨ2Ｃｌ2 ４０ml及びＤＭＦ １mlに溶解
し、０℃に冷却した。次いでＤＣＣ（０.８３ｇ）を添
加し、反応混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過し、
濾液を樹脂に添加し、３時間撹拌した。
【０１６８】結合方法３−保護されたアミノ酸活性エス
テル５.０ミリモル及びＨＯＢＴ（０.７７ｇ）をＤＭＦ
２０ml及びＣＨ2Ｃｌ2 ２０mlに溶解した。この溶液を
樹脂に添加し、２４時間撹拌した。
【０１６９】結合方法４−保護されたアミノ酸活性エス
テル５.０ミリモル及びＤＭＡＰ（０.５ｇ）をＤＭＦ２
０ml及びＣＨ2Ｃｌ2 ２０mlに溶解した。この溶液を樹
脂に添加し、６８時間撹拌した。
【０１７０】順次樹脂を、方法１によりＢＯＣ−Ｃｌｅ
と、方法３によりＺ3−Ａｒｇ−ＯＮｐと１回結合さ
せ、方法２によりＡｏｃα−Ｔｏｓg−Ａｒｇと１回再
結合させ、最後に方法４によりＺ3Ａｒｇ−ＯＮｐと結
合させた。脱保護基後、樹脂を洗浄し、空気乾燥し、Ｈ
Ｆ／アニソール（３０ml，８ml）中において０℃で１時
間開裂させた。
【０１７１】この樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチング
し、濾過した。固体を１％ＮＨ4ＯＨ（１００ml）で１
時間抽出し、濾過し、ＨＯＡｃでｐＨ６に調節し、そし
て抽出物を凍結乾燥して粗ペプチドを無色の固体として
得た。７２０mg。
【０１７２】粗ペプチドを最初にＤＥＡＥ Sephadexで
精製した（カラム２.６×８５cm、０.１２Ｍ、緩衝され
ていないＮＨ4ＨＣＯ3、１００ml／時、１２.５ml／画
分、検知器２０６ｎｍ）。画分３１７〜３７０を集め、
凍結乾燥して、所望の物質を得た。このペプチドをＧ−
１０ Sephadex のクロマトグラフイーで脱塩した（カ
ラム２.６×８３cm、流出剤１％ＨＯＡｃ、３ml／時、
４ml／画分、検知器２７７ｎｍ）。画分７８〜１０５を
集め、凍結乾燥して表題の化合物を得た。３９５mg。
【０１７３】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ １.００ Ｃｌｅ １.０５ Ａｓｐ ０.９８ Ｖａｌ １.００ Ｔｙｒ ０.９８ ペプチド含量７５.８％。
【０１７４】薄層クロマトグラフイー シリカゲルＧ，２５０μ 展 開 剤 Ｒｆ １５：３：１２：１０ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.５５ Ｈ2Ｏ：ピリジン １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ： ０.６０ Ｈ2Ｏ：ＥｔＯＡｃ ４：１ トリフルオルエタノール： ０.２１ ＮＨ4ＯＨ 実施例ＸＸＩＶＮα−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパルチル
−バリル−チロシル−グリシンアミド 表題の化合物を、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂
（Ｕ．Ｓ． Biochemical ３１５７８，４.２ｇ，０.２
５ミリ当量／ｇ）から始めて固相法で製造した。次の標
準的な手順で用いた： 脱保護基−５０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlで１分
間、次いで４０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ５０mlで３０分
間； 洗浄−ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlでそれぞれ１分間２回、続い
てｉＰｒＯＨ ４０mlで１分間、次いでＣＨ2Ｃｌ2 ４
０mlでそれぞれ１分間２回； 中和−５％ＤＩＥＡ／ＣＨ2Ｃｌ2 ４０mlでそれぞれ
２.５分間で２回； 結合−保護されたアミノ酸３.０ミリモル及びＨＯＢＴ
（０.４６ｇ）をＤＭＦ２mlに溶解し、次いでＣＨ2Ｃｌ
2 ２８mlで希釈した。ＤＣＣ（０.６２ｇ）をＣＨ2Ｃ
ｌ2 ５mlに溶解し、反応物及び樹脂の混合物に添加
し、２時間撹拌した。
【０１７５】順次樹脂をＢＯＣ−Ｇｌｙ，ＢＯＣ−Ｔｙ
ｒ（ＢｒＺ），ＢＯＣ−Ｖａｌ，ＢＯＣ−Ｂｚｌβ−Ａ
ｓｐ，ＢＯＣ−Ｐｒｏ及びＡＯＣα−Ｔｏｓg−Ａｒｇ
と１回結合させた。脱保護基後樹脂ペプチドを、１：１
ＤＭＦ：ＣＨ2Ｃｌ2中（１８ml）１０％Ａｃ2Ｏ及びＤ
ＭＡＰ（０.３ｇ）で１回、６０分間に亘りアシル化し
た。樹脂を洗浄し、空気乾燥し、ＨＦ／アニソール（３
０ｍｌ、８ｍｌ）中において０℃で１時間開裂させた。
【０１７６】この樹脂残渣をＥｔ2Ｏ中でクエンチング
し、濾過した。固体を０.３％ＮＨ4ＯＨ（１００ｍｌ）
で１時間抽出し、濾過し、抽出物を凍結乾燥して粗ペプ
チドを無色の固体として得た。７２０ｍｇ。
【０１７７】粗ペプチドをＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
で精製した（カラム２.６×８９ｃｍ、０.０３Ｍ、緩衝
されてないＮＨ4ＨＣＯ3、７５ｍｌ／時、７ｍｌ／画
分、検知器２７８ｎｍ）。画分４２〜５２を集め、凍結
乾燥して、表題の化合物を得た。４２５ｍｇ。
【０１７８】アミノ酸分析 アミノ酸 比 Ａｒｇ １.０３ Ｐｒｏ １.０１ Ａｓｐ ０.９９ Ｖａｌ ０.９９ Ｔｙｒ １.０１ Ｇｌｙ ０.９７ ペプチド含量 ７９.５％薄層クロマトグラフィー シリカゲルＧ，２５０ 展 開 剤 Ｒｆ ３：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ ０.２３ １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： ０.５９ ＥｔＯＡｃ ４：２：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： ０.７１ ピリジン 実施例ＸＸＶ 実施例Ｉ〜ＸＸＩＶに用いたものと同様のペプチド製造
法に従い、次のものを製造した： Ａ．Ｎ−α−アセチル−アルギニル−プロリル−アスパ
ルチル−バリル−Ｎ−α−チロシン、溶媒和。
【０１７９】アミノ酸分析：Ａｒｇ−１.０２；Ｐｒｏ
−１.００；Ａｓｐ−１.００；Ｖａｌ−１.０４；ペプ
チド含量 ７３.５％薄層クロマトグラフィー シリカゲルＧ２５０ Ｆ．硬い表面 展 開 剤 Ｒｆ ３：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ ０.５０ ４：２：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： ０.７４ ピリジン ２：２：１ ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：濃ＮＨ4ＯＨ ０.７６ Ｂ．アルギニル−４−メチル−ロイシル−アスパルチル
−バリル−チロシン、溶媒和。
【０１８０】アミノ酸分析：Ａｓｐ−１.００；Ｖａｌ
−１.００；Ｔｙｒ−０.９６；Ａｒｇ−１.００；４−
Ｍｅ−Ｌｅｕ−０.９６；ペプチド含量９３.０％薄層クロマトグラフィー シリカゲル６０ 展 開 剤 Ｒｆ １：１：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ ０.６０ ＥｔＯＡｃ 15：３：12：10 ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： ０.４８ ピリジン ４：２：３：１ ｎ−ＢｕＯＨ：ＨＯＡｃ：Ｈ2Ｏ： ０.６１ ピリジン 実施例ＸＸＶＩ誘導分析 密度勾配遠心分離によってプロチモサイト（ｐｒｏｔｈ
ｙｍｏｃｙｔｅ）（Ｔｈｙ−１-）及びＰｒｏ−Ｌｙｄ
−２細胞を、Ｂｄ−ｌｙｂ−２.１のコンゲニック（ｃ
ｏｎｇｅｎｉｃ）マウスの脾臓から、一緒に高濃度化し
た（Ｐａｔｈｏｃｙｔｅ ５，Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、ロット番号３５、３５：２９：２６：
２３：１８：１２％の１ｍｌ）。その２６：２３及び２
３：２８の界面層を一緒にし、そしてＴｈｙ−１+及び
Ｌｙｂ−２+細胞を、モノクローナルＴｈｙ−１.２及び
Ｌｙｂ−２.１抗体との反応及び親和性精製したウサギ
の抗マウスＦ（ａｂ）2で被覆したプレートへの付着に
よって除去した。洗浄した非付着性の細胞を両分析に対
して使用した。この出発の集団は３０〜４０％のプロチ
モサイト及び３０〜４０％のＰｒｏ−Ｌｙｂ−２細胞
（別に委託された前駆集団を表わすことが公知）を含有
した。同容量の誘導体（ｉｎｄｕｃｅｒ）を一連の希釈
でＲＰＭＩ１６４０中に有する５ｍｌのプラスチック製
試験管において、５×１０6細胞／ＲＰＭＩ１６４０の
０.５ｍｌを、有湿の５％ＣＯ2、雰囲気中で３時間培養
した。次いで細胞を、Ｓｃｈｅｉｄ及びＴｒｉｇｌｉ
ａ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，９，４２３〜４３３
（１９７９）のＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−ＳＲＢＣ法によ
り、Ｔｈｙ−１及びＬｙｂ−２.１表現に対して別々に
最適濃度のモノクローナル抗体で分析した（誘導体レジ
スター（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）を含まない対照＜５％誘導
細胞）。本発明のペプチドはＴｈｙ−１+細胞（Ｔ細
胞）の誘導を刺激し、従って生物学的活性を有すること
がわかった。またＸがＧＬＵ又はＤ−ＧＬＵである本ペ
プチドは、Ｌｙｂ−２.１+細胞（Ｂ細胞）、並びにＴ細
胞の誘導を刺激した。比較のために、対照のペプチドＮ
Ｈ2−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−ＯＨ
はＴ細胞又はＢ細胞のいずれかの誘導を刺激しなかっ
た。
【０１８１】実施例ＸＸＶＩＩ受体分析 材料 −ＣＥＭ細胞系統をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｕｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
３−ニトロ−２−ピリジンスルホニルクロライド及び２
−ピリジンチオール−１−オキシドは、サンヨー研究所
（東京）のマツダ・レイ博士から提供された。ＲＰＭＩ
−１６４０、胎牛の血清及びＬ−グルタミンはＧｉｂｃ
ｏから、ゲンタマイシンはＳｃｈｅｒｉｎｇから、そし
てレクチンを結合させたアガロース・ビーズはＶｅｃｔ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓから、ウサギの抗チモポイエチン抗体はＡｃ
ｃｕｒｔａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ｃｏｒｐ．から、ユビキチンはＰｅｎｉｎｓｕｌ
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから、そして人間のＩｇＧは
Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
すべての他の化学品は、普通の商業的供給源から購入
し、試薬級のものであった。用いる略号は次の通りであ
る：ＰＢＳ，燐酸塩緩衝の食塩水；ＴＡＣ，トリクロル
酢酸；ＳＤＳ，ドデシル硫酸ナトリウム；Ｃｏｎ Ａ，
コンカナビリンＡ；ＴＰ，チモポイエチン；ＰＥＧ，ポ
リエチレングリコール；ＢＳＡ，牛の血清アルブミン；
Ｉ．Ｐ．，腹腔内；ＰＭＳＦ，フエニルメチルスルホニ
ルフルオリド；ＰＴＳ，フアクツール・チミク・セリク
（ｆａｃｔｅｕｒ ｔｈｙｎｉｑｕｅ ｓｅｒｉｑｕ
ｅ）；ＣＲＦ，コルチコトロピン（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒ
ｏｐｉｎ）遊離因子：ＡＣＴＨ，向副腎皮質性（ａｄｅ
ｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ）ホルモン；Ｈｅ
ｐｅｓ，Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジンＮ−２−
エタン−スルホン酸。
【０１８２】環状（ｃｙｃｌｉｃ）ヌクレオチド分析−
ＣＥＭ細胞系統を異なる期間生長させ、下記の如く採取
した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４
０中に３.１２×１０7細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ、３
７℃で３０分間平衡化させ、次いで牛のチモポイエチン
１００ｎｇ（２５μｌ；４.０μｇ／ｍｌ）を細胞１ｍ
ｌに添加した。培養を振とう水浴中で４〜５分間継続
し、次いで氷冷した１０％ＴＣＡ１ｍｌを添加して終了
させ、均一化と超音波によって環状ヌクレオチドを遊離
させた。この懸濁液を４℃下に２０分間、３０００×ｇ
で遠心分離した。沈殿を０.１Ｎ ＮａＯＨに溶解し、
蛋白質含量を、Ｃａｄｍａｎら、Ａｎｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，９６，２１〜２３の方法で決定した。ＴＣＡを、水
を飽和したジエチルエーテル５ｍｌで４回抽出すること
によって上澄液から除去した。最後の抽出後、残存する
痕跡量のエーテルを、５０℃の水浴中で１０分間加熱す
ることによって除去した。この試料を凍結乾燥し、サイ
クリック・ヌクレオチドの放射性免疫分析のために５０
ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ６.２に再溶液化した。
【０１８３】膜糖蛋白の調整−ＣＥＭの人間リンパ細胞
系統を、５０％ＣＯ2を含む有湿雰囲気下に、１０％の
熱で不活性化した胎牛の血清、２ｍＭの胎牛の血清、２
ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイ
シンを補充したＲＰＭＩ−１６４０中において、３〜４
×１０6細胞／ｍｌの最終密度まで培養した。この濃度
において、細胞は生長曲線の初期静止相にあり、６０％
以上がトリパン青の排除によって生きていることがわか
った。
【０１８４】膜糖蛋白は、Ｈｅｄｏら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２０，３３８５〜３３９３の技術の改変によって
製造した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４０％スクロー
ス、５０％のｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ＥＤＴＡ、０.１
％のＯ−フエナンスロリン、及び１ｍＭ ＰＭＳＦ（メ
タノール中）、ｐＨ７.８、中に懸濁させ、ガラス製ホ
モゲナイザーで室温下に均一にした。次いで全懸濁液
を、カップ・ホーン（ｃｕｐ ｈｏｒｎ）付属部付きの
細胞破壊超音波器（Ｗ−２２５Ｒ型）を用い、３５℃で
１０分間超音波処理に供した。この懸濁液をＳｏｒｖａ
ｌ ＧＬＣ−３型遠心分離機において４℃下に１０分間
６００×ｇで遠心分離し、上澄液をＳｏｒｖａｌ ５Ｂ
型遠心分離機において４℃下に３分間２０,０００×ｇ
で再び遠心分離した。このペレットから得られた粗膜画
分を、５ｍｇ／ｍｌの最終蛋白濃度で、５０ｍＭ Ｈｅ
ｐｅｓ，１０ｍＭ ＭｇＳＯ4及び１ｍＭ ＰＭＳＦ、
ｐＨ７.８、に懸濁させた。この懸濁液を１％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００（最終濃度）及び０.１％ｂｒｉｇ−
９６（ポリオキシエチレン１０、オレイルエーテル）
（最終濃度）の存在下に２５℃で２時間撹拌することに
よった蛋白の可溶化を行なった。懸濁液を４℃下に２時
間２０００×ｇで遠心分離し、上澄液を−７０℃で貯蔵
した。可溶性蛋白の濃度を、Ｃａｄｍａｎらの教示に従
い、ＢＳＡを基準とし且つ緩衝液を対照物として用いる
ことにより測定した。
【０１８５】受体蛋白の精製のために、胚芽の凝集素又
はレシヌス・コミユニス（ｒｅｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕ
ｎｉｓ）の凝集素Ｉを用いた。すべてのレクチンのビー
ズを、その対応する単糖類禁止剤（３００ｍＭ）と一緒
に４℃で貯蔵した。それぞれの精製に対して、レクチン
−アガロース２ｍｌを直径１ｃｍのカラムに充填し、室
温下に０.１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、
０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１及び０.０１％ＳＤＳ、ｐＨ
７.８、の２５ｍｌで洗浄した。
【０１８６】次いでカラムを、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、
５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、ｐＨ７.８、の２００ｍｌで洗浄し、最後に１
０ｍＭＭｇＳＯ4を含有するこの緩衝液で洗浄した。す
べての緩衝液系にＰＭＳＦ（１ｍＭ）を添加した。可溶
化した膜蛋白（〜１０ｍｇ）を５回、個々のカラム中を
循環させた。次いでこのカラムを４℃以下に、０.１５
Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ Ｍｇ
ＳＯ4及び０.１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７.
８、の１００ｍｌで洗浄した。個々のカラムの流出に対
しては、洗浄緩衝液３ｍｌ中４００ｍＭの濃度の単糖類
禁止剤を用いた；コムギの胚芽凝集素に対してＮ−アセ
チルグルコサミン及びリシヌス・コミユニスの凝集素−
Ｉに対してβ−メチルＤ−ガラクトシド。この単糖類を
カラムに適用し、これを３０〜４０分間停止して平衡化
させ、次いで更に流出させた。蛋白流出物を、５０ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、及び０.１％Ｔｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ７.８、の５００ｍｌに対し
て４℃で透析した。
【０１８７】放射性標識のチモポイエチンの準備−チモ
ポイエチンを２.０Ｍ炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ
９.８、に溶解して、遊離のアミノ基を得た。ジオキサ
ン中３−ニトロ−２−ピリジンスルホニルクロライド
（１０：１モル）をチモポイエチン溶液に添加し、２０
℃で５時間撹拌した。水の添加後、不溶性物質を遠心分
離した。保護されたペプチドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−２５のクロマトグラフィーを用いて精製し、続いてポ
スト−プロリン（ｐｏｓｔ−ｐｒｏｌｉｎｅ）開裂酵素
とそしゃくしてＮＨ2−末端と結合したプロリンを除去
した。メチル３，５ジ［125Ｉ］ヨードヒドロキシベン
ズイミデート（４０００Ｃｉ／ｍＭ）をメタノール中
５.５ｍＣｉ／ｍｌの濃度で得、乾固するまで蒸発させ
た。このヨード化したイミドエステル（１.４ｎＭ）
を、Ｗｏｏｄら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９，
３３９〜３４９の方法を次のように改変した方法に従
い、保護されたチモポイエチン（５μｇ；０.９ｍＭ）
と反応させた。反応を、０.１６Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐ
Ｈ９.１、中において４℃で２４時間行なった。次いで
２Ｍクエン酸塩燐酸緩衝液、ｐＨ５.５、の５００μｌ
を４℃で添加して反応を停止させた。この試料を、４℃
下にピロリン酸ナトリウム、ｐＨ７.５、中Ｂｉｏｇｅ
ｌＰ−１０のカラムでのクロマトグラフィーに供し（１
５滴／画分）、遊離のヨウ素を分離した。
【０１８８】ヨード化したペプチドを水に溶解し、室温
下に５時間２−ピリジンチオール１−オキシド（１０：
１モル）で処理して、保護基を除去した。標識したペプ
チドをＢｉｏｇｅｌ Ｐ−１０のカラムで精製した。３
つの放射性ピークが得られた。そのうち最初の２つはウ
サギの抗チモポイエチン抗体に免疫活性であった。次い
で第１のピークを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ
７.０、で平衡化されたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ−２５の１×６０ｃｍカラムに適用した。ヨード化混
合物を、イオン強度を平衡濃度から１.０Ｍまで直線的
グラジエントで増加させつつ、上記緩衝液で流出させ
た。各画分の放射性を、ＬＫＢ１２８０型超ガンマ分光
計を用いて決定した。
【０１８９】各精製経路からのピーク放射性を有する画
分を、過剰の抗チモポイエチン抗体との結合に対して分
析した。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５カラム
のピークＩＩ（画分３５〜４５）の画分は最高の特異的
結合を示し、結果として放射性受体分析において使用で
きた。
【０１９０】ヨード化チモポイエチンは、神経筋肉分析
（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，１１〜
１４（１９７４））におけるその効果及びＣＥＭ細胞に
よる環状ＧＭＰの合成に及ぼすその効果を評価すること
によって決定される如く生物学的活性を保持する。
【０１９１】結合分析−Ｈｅｐｅｓ １２ｇ、ＭｇＳＯ
4 １.２ｇ及びＢＳＡ １.２ｇを蒸留水１０００ｍｌに
添加することによって分析緩衝液を製造した。１Ｎ Ｎ
ａＯＨを用いてｐＨ７.６５にした。原料標準溶液を、
分析緩衝液を用いて作り、１週間に亘って使用した。分
析を、１２×７５ｍｍのガラス製試験管中において、標
準溶液１００μｌ、受体蛋白（１５０〜２００μｇ／ｍ
ｌ）２５μｌ、125Ｉ−ＴＰ（８０,０００ｃｐｍ）２５
μｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の２０μｌを添加
し、容量を分析緩衝液で２００μｌにすることによって
行なった。４℃で１８時間培養した後、人間のＩｇＧ
（１.５ｍｇ／ｍｌ）（担体として）およびＰＢＳ中３
５％ＰＥＧ−８０００、ｐＨ７.５６、の２００μｌを
添加し、混合し、そして氷上で３０分間培養した。試験
管を遠心分離にかけ、残渣をＰＢＳ中１０％ＰＥＧ、ｐ
Ｈ７.３、で洗浄し、ＬＫＢ−ガンマ計数管でカウント
した。
【０１９２】非放射性チモポイエチン１ｍｇ／ｍｌの存
在下における沈殿中の放射性活性を、非特異的結合を表
わすものとした。ＴＣＡを上澄液（最終濃度５％）に添
加し、沈殿しうる放射性活性を測定した。すべての時間
において、これは９５％を越え、遊離125Ｉのトレーサ
ーからの最小の遊離を示した。
【０１９３】競争実験−上記の結合分析法に従い、125
Ｉ−ＴＰ ２.３×１０-10Ｍを結合蛋白及び試験ペプチ
ド４ｇと共に培養した。培養を１２時間継続し、遊離の
及び結合した125Ｉ−ＴＰを上述のように決定した。本
発明の次の代表的な化合物は、同等濃度においてチモポ
イエチンの自己変位（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によ
って引き起こされるものの少なくとも５０％の変位を引
き起こした。
【０１９４】Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳ
Ｐ−ＧＬＮ−ＴＹＲ−ＯＨ；Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ
−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＡＬＮ−ＴＹＲ−ＯＨ；Ｎ−α−ア
セチル−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＧＬＵ−ＴＹＲ−Ｏ
Ｈ；Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＩＬ
Ｅ−ＴＹＲ−ＯＨ；Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＰＲＯ
−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＴＹＲ−ＯＨ；Ｎ−α−アセチル−
ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＮＨ2；Ｈ2
Ｎ−ＡＲＧ−ＡＩＢ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＯＨ；
Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−
ＴＹＲ−ＮＨＣＨ3；Ｈ−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−Ｖ
ＡＬ−ＴＹＲ−ＮＨ2；Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−Ｐ
ＲＯ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＯＨ；及びＮ−α−ホ
ルミル−ＡＲＧ−ＰＲＯ−ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−Ｏ
Ｈ。
【０１９５】比較のための他のペプチド、例えばインシ
ュリン、グルカゴン、生長ホルモン、ソマトスタチン、
β−エンドルフイン、ＦＴＳ、ＡＣＴＨ、ＣＲＦ、及び
ユビキチンは検知しうる代替性を誘発しなかった。
【０１９６】上記実施例は本発明を冷時するために示し
たものであって、その範囲を限定するものではない。そ
の範囲は特許請求の範囲にだけ示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/66 8318−4Ｈ (72)発明者 ジヨージ・ヒーブナー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州フレミ ントン・サマーロード・ボツクス73ビー (72)発明者 ダニエル・クルーン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08807 ブリツジウオーター・ホークロード470 (72)発明者 タパン・オードヤ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08807 ブリツジウオーター・フツトヒルロード 473

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ1 ［式中、Ｒは、Ｈ、ＮＨ2、アシル−ＮＨ、ＣＨ3ＮＨ、
    又はピロ−ＧＬＵ−ＮＨであり；Ｖは 【化１】 であり；Ｗは 【化２】 であり；Ａはそれぞれ低級アルキルであり；Ｂはそれぞ
    れＡがＣ4〜Ｃ６低級アルキルの時Ｈであり、そしてさ
    もなければＣ1〜Ｃ３低級アルキルであり；Ａ及びＢは
    一緒になって−(ＣＨ2)4−又は−(ＣＨ2)5−であり；Ｘ
    はＤ−ＡＳＰ、ＡＳＰ、Ｄ−ＧＬＵ、又はＧＬＵであ
    り；ＹはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＬＥＵ、ｎｏｒ−ＬＥＵ、Ｐ
    ＨＥ、ＩＬＥ、ＬＹＳ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、ＡＬＡ、Ｄ−
    ＶＡＬ、Ｄ−ＬＥＵ、Ｄ−ｎｏｒ ＬＥＵ、Ｄ−ＰＨ
    Ｅ、Ｄ−ＩＬＥ、Ｄ−ＬＹＳ、Ｄ−ＧＬＮ、Ｄ−ＧＬ
    Ｕ、又はＤ−ＡＬＡであり；Ｚは 【化３】 であり；ＤはＨ或いはフェノールのプロトンの酸性を増
    加させる或いは実質的に減少させない１又は２個の置換
    基であり；ＥはＨ又はＣ1〜Ｃ３低級アルキルであり；
    Ｒ１はＯＨ、ＮＨＲ″、 【化４】 であり；そしてＲ″およびＲ″′はそれぞれＨ又は低級
    アルキルであり；但しＶはＲがＨ以外の時Ｄ−又はＬ−
    異性体であってよく、またＶ、Ｘ、及びＹの高々１つは
    Ｄアミノ酸である］のペプチド或いはその製薬学的に許
    容しうる酸又は塩基付加塩。
  2. 【請求項２】 式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１ ［式中、Ｒ−Ｖはアシル−ＡＲＧ又はアシル−Ｄ−ＡＲ
    Ｇであり；ＷはＡＩＢであり；ＸはＤ−ＡＳＰ、ＡＳ
    Ｐ、Ｄ−ＧＬＵ、又はＧＬＵであり；ＹはＧＬＹ、ＶＡ
    Ｌ、ＬＥＵ、ｎｏｒ ＬＥＵ、ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＬＹ
    Ｓ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、ＡＬＡ、Ｄ−ＶＡＬ、Ｄ−ＬＥ
    Ｕ、Ｄ−ｎｏｒ ＬＥＵ、Ｄ−ＰＨＥ、Ｄ−ＩＬＥ、Ｄ
    −ＬＹＳ、Ｄ−ＧＬＮ、Ｄ−ＧＬＵ、又はＤ−ＡＬＡで
    あり；Ｚは 【化５】 であり；ＤはＨ或いはフェノール性プロトンの活性を増
    加させる又は実質的に減少させない１又は２個の置換基
    であり；ＥはＨ又はＣ1〜Ｃ３低級アルキルであり；Ｒ
    １はＯＨ、ＮＨＲ″、 【化６】 であり；そしてＲ″及びＲ″′はそれぞれＨ又は低級ア
    ルキルであり；但しＶ、Ｘ、及びＹの 高々一つはＤ
    アミノ酸である］のペプチド又はその製薬学的に許容し
    うる酸又は塩基付加塩。
  3. 【請求項３】 式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１ ［式中、Ｒ−Ｖはアシル−ＡＲＧであり；ＷはＰＲＯ又
    はＡＩＢであり；ＸはＡＳＰ又はＧＬＵであり；ＹはＧ
    ＬＹ、ＶＡＬ、ＬＥＵ、ｎｏｒ ＬＥＵ、ＰＨＥ、ＩＬ
    Ｅ、ＬＹＳ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、又はＡＬＡであり；Ｚは 【化７】 であり；ＤはＨ或いはフェノール性プロトンの活性を増
    加させる１又は２個の置換基であり；ＥはＨ或いはＣ1
    〜Ｃ３低級アルキルであり；Ｒ１はＯＨ又はＮＨ２であ
    る］のペプチド或いはその製薬学的に許容しうる酸又は
    塩基付加塩。
  4. 【請求項４】 Ｒ−Ｖがアセチル−ＡＲＧ及びＲ1がＮ
    Ｈ2である請求項３項記載のベプチド。
  5. 【請求項５】 ＮＨ2−ＡＲＧ−ＡＩＢ−ＡＳＰ−ＶＡ
    Ｌ−ＴＹＲ−ＯＨである第１項記載のペプチド。
  6. 【請求項６】 Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＡＩＢ−Ａ
    ＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＮＨ２である第２項記載のペプ
    チド。
  7. 【請求項７】 ＮＨ2−ＡＲＧ−ＡＩＢ−ＡＳＰ−ＶＡ
    Ｌ−ＴＹＲ−ＮＨ２である第３項記載のペプチド。
  8. 【請求項８】 Ｎ−α−アセチル−ＡＲＧ−ＡＩＢ−Ａ
    ＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＯＨである第３項記載のペプチ
    ド。
  9. 【請求項９】 ＮＨ2−ＡＲＧ−ＣＬＥ−ＡＳＰ−ＶＡ
    Ｌ−ＴＹＲ−ＯＨである第１項記載のペプチド。
  10. 【請求項１０】 ＮＨ2−ＡＲＧ−４−メチル−ＬＥＵ
    −ＡＳＰ−ＶＡＬ−ＴＹＲ−ＯＨである第１項記載のペ
    プチド。
  11. 【請求項１１】 相対的又は絶対的Ｔ細胞欠乏症に由来
    する状態をもつ対象に、第１項記載のペプチドの治療学
    的に有効な量を投与することを含んでなる該状態の処置
    法。
  12. 【請求項１２】 胸腺に由来するリンパ球の特性を発現
    させるべく、第１項記載のペプチドの有効誘導量を対象
    に投与することを含んでなる該対象のリンパ造成幹細胞
    を誘導する方法。
  13. 【請求項１３】 第１項記載のペプチドの治療学的に有
    効な量を、対象に投与することを含んでなる、該対象の
    胸腺の相対的又は絶対的欠乏症に由来する状態の処置
    法。
  14. 【請求項１４】 第１項記載のペプチドの免疫調整有効
    量を、対象に投与することを含んでなる、該対象の免疫
    系を調整の必要に応じて調整する方法。
  15. 【請求項１５】 式 Ｒ−Ｖ−Ｗ−Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１ ［式中、ＲはＨ、ＮＨ2、アシル−ＮＨ、ＣＨ3ＮＨ、又
    はピロ−ＧＬＵ−ＮＨであり；Ｖは 【化８】 であり；Ｗは 【化９】 であり；Ａはそれぞれ低級アルキルであり；Ｂはそれぞ
    れＡがＣ4〜Ｃ６低級アルキルの時Ｈであり、そしてさ
    もなければＣ1〜Ｃ３低級アルキルであり；Ａ及びＢは
    一緒になって−(ＣＨ2)4−又は−(ＣＨ2)5−であり；Ｘ
    はＤ−ＡＳＰ、ＡＳＰ、Ｄ−ＧＬＵ、又はＧＬＵであ
    り；ＹはＧＬＹ、ＶＡＬ、ＬＥＵ、ｎｏｒ−ＬＥＵ、Ｐ
    ＨＥ、ＩＬＥ、ＬＹＳ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、ＡＬＡ、Ｄ−
    ＶＡＬ、Ｄ−ＬＥＵ、Ｄ−ｎｏｒ ＬＥＵ、Ｄ−ＰＨ
    Ｅ、Ｄ−ＩＬＥ、Ｄ−ＬＹＳ、Ｄ−ＧＬＮ、Ｄ−ＧＬ
    Ｕ、又はＤ−ＡＬＡであり；Ｚは 【化１０】 であり；ＤはＨ或いはフェノールのプロトンの酸性を増
    加させる或いは実質的に減少させない１又は２個の置換
    基であり；ＥはＨ又はＣ1〜Ｃ３低級アルキルであり；
    Ｒ１はＯＨ、ＮＨＲ″、 【化１１】 であり；そしてＲ″およびＲ″′はそれぞれＨ又は低級
    アルキルであり；但しＶはＲがＨ以外のときＤ−又はＬ
    −異性体であってよく、またＶ、Ｘ、及びＹの高々１つ
    はＤアミノ酸である］のペプチド或いはその製薬学的に
    許容しうる酸又は塩基付加塩を製造する際に、アミノ基
    の保護されたＺアミノ酸を共有結合によって不溶性の樹
    脂重合体にエステル化し、アミノ保護基をＺアミノ酸残
    基から除去し、アミノ基の保護されたＹアミノ酸との反
    応でＹアミノ酸をＺ樹脂に結合させ、α−アミノ保護基
    をＹアミノ酸残基から除去し、アミノ基の保護されたＸ
    アミノ酸との反応でＸアミノ酸をＹ−Ｚ−樹脂へ結合さ
    せ、アミノ保護基をＸアミノ酸残基から除去し、アミノ
    基の保護されたＷアミノ酸との反応でＷアミノ酸をＸ−
    Ｙ−Ｚ−樹脂に結合させ、アミノ保護基をＷアミノ酸残
    基から除去し、アミノ基の保護されたＨ−Ｒ置換のＶア
    ミノ酸との反応でＮ−Ｒ置換のＶアミノ酸をＷ−Ｘ−Ｙ
    −Ｚ−樹脂に結合させ、酸（Ｒ′＝ＯＨ）、アンモニア
    （Ｒ１＝ＮＨ２）、又は適当なアミンを用いて樹脂をペ
    プチドから開裂し、そしてすべての保護基を除去する、
    上式のペプチド或いはその製薬学的に許容しうる酸又は
    塩基付加塩を製造する方法。
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