NO147054B - Fremgangsmaate ved stabilisering av bakteriologiske proever - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for stabilisering av prøver som skal underkastes bakteriologiske laboratorieundersøkelser, spesielt urinprøver, for preservering

av dem under transport.

Anvendelse av borsyre for preservering av bakteriologiske prøver var kjent allerede ved begynnelsen av dette århundre, bl.a. fra veterinærmedisinske arbeider angående en bakteriologisk og produksjonshygienisk test av pasteurisert melk, hvor muligheten av og fordelen ved å anvende 1%-ig borsyreoppløsning som transportmedium til bakteriologiske laboratorier påvises. I forsøkene anvendes B. tuberculosis, og det viste seg at tuberkelbakteriene ikke ble ødelagt i melkeprøver, som ble konservert med 1%-ig borsyre, samtidig som denne konservering gjorde det mulig å trans-portere prøvene i lang tid uten at disse undergikk noen uønskede forandringer som grep forstyrrende inn i undersøkelsen i laboratoriet .

Muligheten for å lette det bakteriologiske laboratoriearbeide ved bakterieanalyser av urinprøver ved hjelp av borsyre-konservering var ennu ikke akseptert ved slutten av 1920-tallet. Viktigheten av umiddelbart å undersøke urinprøver bakteriologisk ved suspekte urinveisinfeksjoner for i størst mulig grad å unngå overvekst av bakteriestammer, har vært understreket overordentlig sterkt til tross for at borsyre kan anvendes preanalytisk uten å forstyrre målinger av andre parametre. Muligheten for å anvende borsyre som 1%-ig transportmedium for å unngå overvekst ved under-søkelser av Brusella abortus er påvist.

Borsyre har vært anvendt ved flere forskjellige undersøk-elser, både humane og dyriske, av bakterievekst og hemning derav i forskjellige medier. Til tross for dette påpekes det i flere videnskapelige arbeider, at bakteriologiske undersøkelser av urin må utføres umiddelbart, hvis ikke oppbevaring under avkjøling (+4°C) er mulig, og da bare i 48 timer. Problemet med overvekst ved langsom transport av urinprøver til bakteriologiske laboratorier gjenstår altså. I et arbeide fra slutten av 1960-tallet påpekes det noe overraskende at undersøkelse av borsyre som kon-serveringsmiddel ved urintransporter ikke er blitt overveiet og enda mindre undersøkt. I dette arbeide anføres at den optimale borsyrekonsentrasjon i en ferdig urintransportprøve skal være 1,8%, og at den preanalytiske tiden ikke bør overstige 4 dager.

Til tross for disse vitenskapelige medisinske arbeider og til tross for at borsyre tidlig var kjent som et funksjonelt kon-serveringsmiddel med hensikt på bakterievekst, har denne metode fått liten utbredelse, det være seg nasjonalt eller internasjonalt ved det bakteriologiske laboratoriearbeide.

Flere grunner kan imidlertid påvises for denne treghet til

å anta en tilsynelatende sikker og relativt sett klart mere økonomisk transportmetode enn kjøletransport„ Metoden innebærer store praktiske vanskeligheter eftersom man må måle opp meget små mengder av et pulver, og eftersom dette skal transporteres i meget små transportrør, samt at borsyren har en relativt lav oppløselig-hetsgrad i urin. Hvis pulveret dessuten oppløses i vann for lettere å kunne måles i eksakte volumer, fåes altfor store volum av borsyreoppløsning og urin, for å bli praktisk anvendbare ved transporter. For på laboratoriet å kunne skille mellom urinprøver med borsyre og urinprøver uten borsyre, kreves et ekstra arbeidsmoment, som er praktisk forstyrrende, idet den sentraliserte laboratorie-diagnostikk krever så få arbeidsmomenter som mulig på grunn av det store antall urinprøver som daglig innkommer (ca. 500 pr. dag ved et større laboratorium).

Borsyrens oppløselighet i vann:

hvilket innebærer at man praktisk ikke kan arbeide med høyere konsentrasjoner enn 3%-ige oppløsninger for å unngå utkryst allisasjon ved temperatursvingninger. Av bl.a. omkostningsgrunner efter-strebes så små transportenheter som mulig, og i alminnelighet anvendes standardiserte transportbeholdere med et volum på 10 ml.

Ved anvendelse av 3%-ig borsyreoppløsning må 13 ml tilsettes til 9 ml urin for at konsentrasjonen skal bli 1,8% borsyre, hvilket er nødvendig for å oppnå konservering. Dette medfører at meget vann tilføres til prøvene og at volumet økes til over det dobbelte.

Det har vist seg at man kan oppnå mere effektiv preservering gjennom tilsetning av bare 0,5 - 0,8% borsyre hvis denne foreligger som et organisk kompleks.

Eftersom konsentrasjonen av borsyre i disse komplekser er

■><>>

høy, blir en ti<*>lsetning på 0,4 - 1,4 ml eller g til 9 ml urin fullt tilstrekkelig. Man øker på denne måte volumet i så begrenset ut-strekning at de standardiserte transportrør kan anvendes. ;Foreliggende fremgangsmåte karakteriseres ved at prøven tilsettes et borsyrekompleks med formelen: ;hvor R kan være ethylenglycol, propandiol-1,2, glycerol, fructose, mannit, sorbit eller andre vannoppløselige dioxy- eller polyoxy-forbindelser, og som er fremstilt ved oppvarmning av borsyren og oxyforbindelsen, idet 1-2 mol av det ved fremstillingen dannede reaksjonsvann fjernes, i en slik mengde at innholdet av borsyre i prøven blir 0,2 - 1,4 vekt%, fortrinnsvis 0,4 - 0,8.vekt%. ;De øvrige kjennetegn ved oppfinnelsen fremgår av under-kravene. ;For at man lettere skal kunne fastslå om preserveringsmidlet ;er tilsatt, kan disse farves med methylenblått eller annet passende farvestoff, som ikke forstyrrer den bakteriologiske under-søkelse»;Eksempel 1 ;100 vektdeler ethylenglycol ;17 vektdeler borsyre BP ;oppvarmes til 98°C, hvorved vann avspaltes, hvorefter temperaturen økes til 112°C i 4 minutter. Derved gikk der av 2 mol vann. Borsyreinnhold = 17,7% ;pH i det konsentrerte reaksjonsprodukt =2,5 ;pH i 10%-ig vannoppløsning =4,4 ;Eksempel 2 ;124 vektdeler glycerol DAB 6 d = 1,23 ;17 vektdeler borsyre BP ;ble oppvarmet til 110°C, hvorved reaksjonen begynte, og 2 mol vann ble avspaltet. Vanninnholdet steg i reaksjonsblandingen fra 11,3% til 22,3%. Temperaturen ble forhøyet i tre minutter til 129°C, hvorefter oppvarmningen ble avbrutt og reaksjonsproduktet fikk avkjøle. ;Vanninnhold =15,5% ;Borsyreinnhold = 12,4% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt = 1,3 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 3,9 ;Methylenblått tilsatt i en konsentrasjon på 5 - 50 ppm. ;Eksempel 3 ;lOO vektdeler d-mannit ;70 vektdeler vann ;32 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 80°C, hvorved reaksjonen begynte. Temperaturen ble forhøyet i 7 minutter til 112°C, hvorved 2 mol vann gikk av. ;Borsyreinnhold = IO,8% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =0,85 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 3»5 ;Produktet fikk størkne og ble presset til tabletter. ;Eksempel 4 ;100 vektdeler fructose ;50 vektdeler vann ;36 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 80°C, hvorefter temperaturen ble forhøyet i ;6 minutter til 109°C, hvorved 2 mol vann gikk av. ;Borsyreinnhold = 12,1% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =1,1 ;pH i 10%-ig vannoppløsning =4,2 ;Reaksjonsproduktet ble presset til tabletter. ;Eksempel 5 ;100 vektdeler propandiol-1,2 ;25 vektdeler borsyre ;ble oppvarmet til 98°C, hvorefter temperaturen ble forhøyet til l6o°C i IO minutter. ;Borsyreinnhold = 20% ;pH i konsentrert reaksjonsprodukt =1,7 ;pH i 10%-ig vannoppløsning = 4,6 ;Innfarvet med methylenblått. ;Borsyre-glycerol-komplekset som ble fremstilt ifølge eksempel 2, ble undersøkt på om individuell følsomhet foreligger mellom forskjellige bakteriearter, ved forskjellige bakterietall og i prøver, som samtidig inneholder flere forskjellige bakteriestammer ved å undersøke prøver dels før og dels efter normalt forekommende transporttype (mindre enn ett døgn), dels i prøve som ble oppbevart i lengre tid før dyrkning. Hensikten var også individuelt å undersøke de forskjellige komponenter som inngitt i produktene med hensyn til antibakteriell virkning samt å forsøke ;å bedømme hvor store avvikelser fra instruksjonene som kan toler-eres med hensyn til tilsatt mengde av det borsyreholdige konser-veringsprodukt, resp. mengden av urin. ;To typer forsøk ble utført: ;1) Prøver ble tatt fra pasienter med bacteriuria. Dels ble prøver tatt av laboratoriets personale, dels ble prøver tatt av avdelingspersonalet og transportert med normale transporter til ;laboratoriet. I de tilfelle hvor prøver og transporter ble utført av laboratoriets personale, har man hatt full kontroll over prøve-tagningsteknikken og transporttiden. Prøver ble tatt efter vasking og tørring som såkalt "mid-stream-prøve" og dyrkning igangsatt ;innen en time. Dyrkningen ble utført på blodagarplater, Drigalski-agar og acidsorbitolagar. Kvantitering ble gjort efter dyrkninger fra seriefortynninger av urinprøve i koksalt. Artsbestemmelse ;ble gjort ved vanlig rutinemetode efter primær inkubering i 18 timer ved 37°C. ;2) Laboratorieforsøk med eksperimentelt fremstilt, bakterie-holdig urin ble utført for å muliggjøre testing av spesielle stammer. Til forsøket ble anvendt åtte bakteriestammer som er van- ;lige ved urinveisinfeksjon, nemlig: ;Escherichia coli ;Klebsiella ;Pseudomonas aeruginosa ;Pseudomonas mirabilis ;Ent erokocker ;Staphyloccus aureus ;Staphylococcus epidermidis ;Staphylococcus saprophyticus ;I forsøk som krever spesielt følsom teststamme, ble gonococcer anvendt. ;Undersøkelsene ble i hovedsak utført som sammenligninger mellom oppbevaring av prøver i kjøleskap, hhv. ved værelsetemperatur med bor-glyceroltilsetning. ;Som referanseverdi ble anvendt det dyrkningsresultat som man fikk ved dyrkning i løpet av en time efter prøvetagningen. ;Til forsøkene ble anvendt dels ren borsyre i pulverform, dels forskjellige konsentrasjoner av borsyrekomplekser ifølge eksempel 2. ;Eksperimentel bacteriuria-urin: ;Fra bakteriekolonier på agarplater ble gjort oppslemninger ;i fysiologisk koksaltoppløsning. Kvantitering ble gjort med mål-setningen å få en bakteriemengde mellom ca. 100.000 og 10 milli-oner pr. ml urin efter tilsetning av oppslemningen til uinfisert urin. ;Result at ;Forsøk ble utført med borsyre i pulverform. Til 9 ml urin ble tilsatt 0,1 g borsyre. Anvendte teststammer fremgår av tabell 1. ;Den ifølge metodebeskrivelsen fremstilte, bakterieholdige urin ble kvantitert og delt i to porsjoner. Den ene ble anbrakt ved +4°C, til den annen ble tilsatt borsyre, og den ble oppbevart i værelsetemperatur. Kvant itering ble utført efter 24 timer og efter 48 timer. Av tabellen fremgår det at ingen anmerkningsverdige avvikelser skjer enten urinen oppbevares koldt eller ved værelsetemperatur med borsyretilsetning. ;Pasientprøver: Prøver ble tatt av seks geriatriske pasienter i pleieavdelinger. Dyrkningen av prøvene ble satt i gang i løpet av 1 time, hvorefter prøvene ble behandlet analogt med ovenstående. Av tabell 2 fremgår det at avvikelsene for såvel avkjølte som i borsyre oppbevarte prøver er mindre enn en 10-potens. ;For å finne ut om glycerol i seg selv skulle ha hemmende virkning på bakterier, ble følgende forsøk utført: 15 friske bakterieisolater fra pasienter med bacteriuria ble tilsatt urin som ble kvantitert og oppdelt i tre porsjoner for oppbevaring ved +4°C, for oppbevaring ved værelsetemperatur med tilsetning av borsyre og for oppbevaring ved +22°C med tilsetning av glycerol. Av tabell 3 fremgår undersøkte bakteriestammer og målte forandringer i 10-log. I ingen av tilfellene har man fått hemning ved tilsetning av glycerol. Forandringer i kjøleoppbevart, hhv. ved væreIsetemperatur oppbevart prøve med borsyretilsetning var i alle tilfelle mindre enn en 10-potens. ;For å bestemme om negativ virkning kunne oppnåes ved kombinasjonen av borsyrekompleks ifølge eksempel 2 og kjøleoppbevaring, ble følgende forsøk utført: Til urin ble tilsatt fem forskjellige bakteriearter. Prøven ble kvantitert og oppdelt. Ubehandlet urin ble oppbevart ved -20°C. En annen porsjon av prøven ble tilsatt borsyrekompleks ifølge eksempel 2 og oppbevart dels ved +4°C og dels ved værelsetemperatur. ;Av tabellene fremgår det at kombinasjonen av kjøleoppbevar-ing og borsyre-glycerol-kompleks ifølge eksempel 2 ikke gir av-vikende resultater efter oppbevaring i 18 timer. Frysning av urin medfører helt upålitelige kvantitative resultater. Avvikelsene er større for gramnegative staver enn for grampositive coccer. ;For å undersøke glycerolens effekt på bakterier, ble der utført forsøk med en spesielt følsom stamme: ;Urin med og uten glyceroltilsetning ble sammenlignet. Til ;9 ml urin ble tilsatt 0,65 ml glycerol. Gonococcer ble tilsatt såvel til denne urin som urin uten glyceroltilsetning. Kvantitering ble gjort efter 1, 2, 4 og 6 timer. Av tabell 5 fremgår den prosentuelle andel av opprinnelig tilførte gonococcer, som kan ;igjenisoleres efter angitt tid. Av tabellen fremgår dét at gonococcer hurtig avlives i urin og ikke kan gjenfinnes 4 timer efter tilsetningen, mens tilsetning av glycerol gjør at gonococcer for-satt isoleres efter 6 timer. ;;Forsøket ble utført med tilsetning av forskjellige farve-stoffer. Lofflers methylenblått (0,5 g/1.000 ml) ble utspedt og tilsatt til urin. Farven i en konsentrasjon på 0,01 ml/9 ml urin var tydelig iakttagbar for det blotte øye. For å bestemme methylenblåtts virkning på bakterier, ble der utført forsøk med en 10 ganger sterkere oppløsning. Borsyre-glycerol-kompleks med og uten methylenblått ble satt til prøver. Av tabell 6 fremgår det at tilsetningen av methylenblått ikke forstyrrer kvantiter-ingen av de undersøkte bakteriestammer. ;Feilmarginaler: ;For å bestemme i hvor høy grad man kan gjøre avvikelser fra metodebeskrivelsen med hensyn til mengden av urin, hhv. mengden av borsyrekomplekstilsetning, ble der gjort forsøk med forskjellige konsentrasjoner. ;For forsøket ble anvendt urin med tilsetning av E. coli. ;Med utgangspunkt fra tidligere rapporter om passende konsentrasjon av borsyre og efter justeringer bygget på erfaringer, ble det fremstilt et borsyre-glycerolkompleks med 12,4% borsyre. Til vanlig urinprøvemengde, 9 ml, ble tilsatt ni forskjellige mengder fra 0,4 til 0,8 ml (0,65 ml tilsvarer 0,82% borsyre). Prøvene ble oppbevart ved +22°C i 24 timer. Kvantitering ble gjort dels fra drøyt 5 måneder gammel oppløsning, dels fra nytilberedt oppløsning. Forandringene innen fortynningsområdet var mindre enn en 10-potens. Borsyrekomplekset ble pakket i en porsjonspose. Ved valg av ;0,65 ml pr. porsjonspose ble resultatet sannsynligvis ikke påvirket, hvis man ved slurv unnlater å tømme en tredjedel av innholdet i ;urinprøven og derved får en lavere konsentrasjon av borsyre enn det som er tilsiktet. Metoden synes dessuten å tåle en viss kon-sentrasjonsøkning ved at for lite urin fåes i røret. Ifølge beregningen tillater metoden at man unnlater å tilsette 3 - 4 ml av de anbefalte 9 ml. ;Sluttforsøk ;Sluttforsøk ble utført på prøvene tatt fra pasienter med bacteriuria. All prøvetagning ble gjort med tilsetning fra porsjonspose, og transport av prøven ble utført med ordinære rutiner.<* >En del av prøven ble forsynt med bor-glycerol-kompleks og oppbevart ved værelsetemperatur, og den annen del ble avkjølt og kjøle-transportert. Begge prøvetyper ble oppbevart i 24 timer, hvorefter kvantitering ble utført. Resultatene fremgår av tabell 7.

Store problemer foreligger ved transport av prøver før bakteriologisk dyrkning» Uønskede forandringer inntreffer, hvis ikke dyrkningen skjer i løpet av meget kort tid efter prøvetag-ningen. Forandringene kan forhindres ved kjøletransport. Kjøl-ing av prøven kan iblant medføre frysing av prøven, hvilket er skadelig for mange bakteriearter. Kjølemetoden er klosset og uøkonomisk. Anvendelsen av borsyre som preserverende tilsetning til urinprøver har tidligere vært påvist og verifisert ved nye forsøk. Ulempene med borsyre i pulverform har bevirket forsøk med å få borsyre i oppløsning. Borsyre-glycerol-komplekser er blitt fremstilt ifølge eksempel 2, og methylenblått er tilsatt for å gjøre tilsetningen til prøven synlig. Såvel laboratoriemessig som kliniske prøveundersøkelser har vist at sammensetningen ifølge oppfinnelsen har den tilsiktede virkning. Forandringer er ikke oppstått i prøvene i løpet av to døgn. Et stort antall forskjellige bakteriearter, aktuelle som ethiologi til urinveisinfeksjon, er blitt prøvet. Ingen antibakteriell virkning er påvist for noen av de inngående bestanddeler ved den anvendte konsentrasjon. Ut-titrering av sikkerhetsmarginalene for feilanvendelse av produktene har vist at man sannsynligvis kan tolerere en 30%-ig feildosering, såvel oppad som nedad, fra den anbefalte konsentrasjon.

Ved produktenes konsentrasjon er man ikke låst til noen spesiell rørtype, men kan fleksibelt tilpasse seg til de prøve-volumer og rørtyper som anvendes ved forskjellige laboratorier.

Det er åpenbart at dette system er betydelig smidigere enn kjøletransport og at det eliminerer risikoen for fryseskader på prøven. Fra transportsynspunkt byr metoden på større smidighet og betydelig lavere omkostninger. Riktig gjennomført kjøletransport har i praksis vist seg å være meget vanskelig å utføre.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte ved stabilisering av prøver som skal underkastes bakteriologiske laboratorieundersøkelser, spesielt urin-prøver, for å preservere dem under transport, karakterisert ved at der til prøven tilsettes et borsyrekompleks med formelen: hvor R betegner ethylenglycol, propandiol-1,2, glycerol, fructose, mannit, sorbit eller andre vannoppløselige dioxy- eller poly-oxyforbindelser, som er fremstilt ved oppvarmning av borsyre og oxyforbindelse idet 1-2 mol av det ved fremstillingen dannede reaksjonsvann fjernes, i en slik mengde at innholdet av borsyre i prøven blir 0,2 - 1,4 vekt%, fortrinnsvis 0,4 - 0,8 vekt%.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at der tilsettes en blanding av borsyrekomplekser,

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at der anvendes et borsyrekompleks som er tilsatt et farvestoff.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at der som farvestoff anvendes methylenblått i en mengde på 5 - 50 ppm.