NL194828C

NL194828C - Somatostatinepeptiden, alsmede dergelijke somatostatinepeptiden bevattende farmaceutische preparaten.

Info

Publication number: NL194828C
Application number: NL8902981A
Authority: NL
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1988-12-05
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 2003-04-03
Also published as: DE3991505B4; FI102540B1; JPH1095737A; AT403476B; NL194828B; GB2225579B; ATA901789A; FR2639947B1; DK612689D0; NL8902981A; HUT53375A; AU4587189A; CA2004532C; JP2726320B2; WO1990006949A3; FI895809A0; DK612689A; KR900009697A; HU896359D0; GB8927255D0

Description

1 194828

Somatostatinepeptiden, alsmede dergelijke somatosiatinepeptiden bevattende farmaceutische preparaten

De uitvinding heeft betrekking op somatostatinepeptiden met de formule I waarin 5 A een groep met formule RCO- is, waarbij RCO- is a) een L- of D-fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door F, Cl, Br, N02, NH2 OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, b) de rest van een natuurlijk of synthetisch α-aminozuur, dat verschilt van dat gedefinieerd onder a) hiervoor of van een overeenkomstig D-aminozuur, of 10 c) een dipeptiderest waarin de afzonderlijke aminozuurresten al of niet gelijk zijn en zijn gekozen uit die gedefinieerd onder a) en/of b) hiervoor, A' een waterstofatoom weergeeft, Y, en Y2 tezamen een directe binding voorstellen of waarin elk van de substituenten Y, en Y2 een waterstofatoom is, 15 B is -Phe-, waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, N02, NH2, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen (waaronder pentafluoralanine), of B-naftyl-Ala, C is (L)-Trp- of (D)-Trp-, desgewenst ge-a-N-methyleerd en waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, N02, NH2, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, 20 D is Lys of een 4-aminocyclohexylAla of 4-aminocyclohexylGly-rest weergeeft, E is Thr, Ser, Val, Phe, He, of een aminoisoboterzuur- of aminoboterzuurrest voorstelt, G een groep met formule -COOR7, -CH2OR10, /

25 -CON

\

Rl2 of een groep met formule X weergeeft, waarin 30 R7 een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen is, R10 een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerbare ester voorstelt, R„ een waterstofatoom, alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, fenylgroep of C7.10 fenylakylgroep weergeeft, R12 een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een groep met formule -CH(R13)·*, 35 weergeeft, R13 CH2OH, -CH2)2-OH, -(CH2)3-OH, of -CH(CH3)OH, of de substituent, bevestigd aan het a-koolstofatoom van een natuurlijk of synthetisch α-aminozuur (waaronder waterstof) voorstelt en X, een groep met formule -C00R7, -CH2OR10 of -CONR14R15 voorstelt, waarin R7 en R10 de hiervoor gegeven betekenissen hebben, 40 R14 een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstelt en r15 een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, fenylgroep of fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen weergeeft, en

Rn6 een waterstofatoom of een hydroxylgroep voorstelt, onder de voorwaarde dat 45 indien R12 een -CH(R13)-X1 groep voorstelt, R„ een waterstofatoom of een methylgroep is, waarbij de resten B, D en E de L-configuratie bezitten en de resten op de 2- en 7-plaats elk, onafhankelijk van elkaar, de L- of D-configuratie bezitten.

Dergelijke verbindingen en hun bereiding zijn bijvoorbeeld beschreven in de Europese octrooischriften EP-A 1295, 29.579, 215.171,203.031, 214.872, 298.732, 277.419 en ook in EP-A 187.622 als uitgangspro-50 ducten.

EP-A 0.150.844 vermeldt de mogelijkheid van het covalent combineren van chelaatvormende groepen zoals EDTA, DTPA en derivaten ervan aan bijvoorbeeld eiwit, enzym en immunoglobuline. Dergelijke moleculen omvatten een aantal reactieve zijketens, welke gebruikt kunnen worden als aanhechtingsplaatsen voor de chelaatvormende groep, bijvoorbeeld amino-, carboxy- en SH-groepen. Ongelukkigerwijs zijn deze 55 groepen willekeurig over het eiwitmolecuul verdeeld, en de reactie van een dergelijk molecuul met een chelaatvormend middel leidt derhalve onvermijdelijk tot een willekeurig gesubstitueerd eiwit. Er is dus bijvoorbeeld veel onduidelijkheid waar de chelaatgroepen aan worden gehecht en hoeveel chelaatvormende 194828 2 groepen per molecuul worden gebonden. Vanwege deze willekeurige substitutie bezitten gemerkte eiwitten een aantal nadelen zoals het ontbreken van homogeniteit, reproduceerbaarheid, verontreinigingsproblemen en een gebrek aan gevoeligheid ten aanzien van tumoren met een kleine grootte.

US-A 4.678.667 betreft koperchelaatconjugaten welke chemisch gebonden zijn aan een groep van 5 biomoleculen, waartoe antilichamen, antilichaamfragmenten, serumeiwitten en het kleinmoleculige bleomy-cine behoren. Echter bezit de bleomycinestructuur slechts twee "echte” aminozuren en bevat daarnaast veel andere functionele reactieve groepen. Een vermelding of suggestie voor het binden van een chelaat-vormende groep aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van het bleomycine ontbreekt volledig in dit Amerikaanse octrooischrift, hetgeen o.a. gesiaafd wordt met het gestelde in de passage in kolom 6, regels 10 54-58 van dit octrooischrift.

Gevonden werd, dat de bovengenoemde nadelen kunnen worden opgeheven met somatostatinepeptiden, welke aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van het somatostatinepeptide zijn gemodificeerd met een chelaatvormende groep, welke met een radionuclide kan complexeren en nog steeds een bindingsaffiniteit voor somatostatinereceptoren bezit. Dergelijke gemodificeerde somatostatinepeptiden bezitten een hierna 15 nader gedefinieerde en reproduceerbare chemische structuur.

De uitvinding heeft betrekking op somatostatinepeptiden, die ten minste een fysiologisch aanvaardbare hydrofiele chelaatvormende groep voor een detecteerbaar element bevatten, welke chelaatvormende groep direct of indirect door een brugvormende of afstandgevende groep is verbonden aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van het somatostatinepeptide, en de brugvormende of afstandgevende groep verbonden 20 met A, de formule Z-R35-CO-bezit, waarin r35 een alkyleengroep met 1-11 koolstofatomen, een alkenyleengroep met 2-11 koolstofatomen en Z een functionele groep voorstelt, die in staat is covalent met het cheleringsmiddel te reageren of een 25 H2N-CH(R')-CO-groep voorstelt, waarin R' de rest, gehecht in de α-positie aan een natuurlijk of synthetisch oc-aminozuur voorstelt in de vrije vorm of in een farmaceutisch aanvaardbare zoutvorm.

Bij voorkeur heeft de chelaatvormende groep een carboxylgroep en is via een amidebinding aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van het peptide of aan de brugvormende of afstandgevende groep H2N-R35-CO- van dit peptide verbonden.

30 Opgemerkt wordt dat EP-A-0.247.866 het met een radioactief element merken van eiwitten en polypepti-den beschrijft, met name antilichamen of fragmenten daarvan. De chelaatvormer is rechtstreeks of via een bruggroep gebonden aan een e-aminogroep (dat wil zeggen een zijketenaminogroep) van een antilichaam of antilichaamfragment. Antilichamen en fragmenten daarvan zijn grote moleculen met gewoonlijk een molecuulgewicht van ongeveer 150 kDa. In de meeste gevallen zijn de reactieve e-aminoplaatsen niet-35 geïdentificeerd en het verloop van de reactie van een specifieke e-aminogroep met de chelaatvormer kan niet worden gevolgd, hetgeen leidt tot een niet-homogene verbinding. Bij de onderhavige uitvinding wordt een klein peptidemolecuul (molecuulgewicht ongeveer 1000-1500 dalton) gesubstitueerd met een chelaatvormende groep op een bepaalde enkele aanhechtingsplaats, hetgeen resulteert in een gedefinieerd, reproduceerbaar chelaat.

40 Verder wordt opgemerkt dat in de NL-A 8702345 en oudere NL-A 8902785, die niet is vóórgepubliceerd, peptiden zoals octreotide zijn beschreven die op de Ν-α-plaats kunnen zijn gesubstitueerd met een suikerrest.

De gedeeltelijk niet vóórgepubliceerde, oudere NL-A 8801640 beschrijft somatostatinederivaten waarbij aan het α-Ν-atoom een groep Z-R-CO kan zijn gesubstitueerd, waarbij Z een guamidino- of ureidogroep of 45 bijvoorbeeld een suikerrest kan zijn.

Aanbevolen verbindingen zijn de verbindingen zoals gedefinieerd waarin de rest met formule I de volgende combinatie van groepen heeft: 1.1. Bij de betekenissen a), b) of c) voor RCO-, is de α-aminogroep van de aminozuurresten a) en b) en de eindstandige α-Ν-aminogroep van dipeptideresten c) bij voorkeur ongealkyleerd of mono-C,.·^ gealkyleerd, 50 in het bijzonder met alkyl met 1-8 koolstofatomen gealkyleerd, meer in het bijzonder gemethyleerd. Het verdient het meest aanbeveling dat de eindstandige α-Ν-aminogroep niet-gealkyleerd is.

1.2. Indien RCO betekenis a) heeft, is deze groep bij voorkeur a') een L- of D-fenylalanine- of -tyrosinerest die desgewenst gemono-N-Cn.12 alkyleerd is. Het verdient meer aanbeveling dat a') een L- of D-fenylalaninerest is.

55 1.3. Indien RCO betekenis b) of c) heeft, is de gedefinieerde rest bij voorkeur lipofiel. Aanbevolen resten b) zijn dus b') cx-aminozuurresten met een koolwaterstofzijketen, bijvoorbeeld alkyl met 3, bij voorkeur 4, of meer koolstofatomen, bijvoorbeeld met maximaal 7 koolstofatomen, naftylmethyl of heteroaryl, bijvoorbeeld 3 194828 een 3-(2- of 1-naftyl)-alanine-, pyridyl-methyl- of try plof aan rest, welke resten de L- of D-configuratie bezitten en bij voorkeur zijn de resten c) dipeptideresten waarin de individuele aminozuurresten al of niet gelijk zijn en zijn gekozen uit die gedefinieerd onder a") en b') hiervoor.

Een voorbeeld van een rest c) is bijvoorbeeld de 3-(2-naftyl)-alaninerest.

5 1.4. Het heeft het meest de voorkeur dat RCO betekenis a), in het bijzonder betekenis a'), heeft.

2. B is B', waarin B' is Phe of Tyr.

3. C is C', waarin O' is (D)Trp.

4. D is D', waarin D' is Lys, MeLys of Lys(e-Me), in het bijzonder Lys.

5. E is E', waarin E' is Val of Thr, vooral Thr.

10 6. G is G', waarin G' een groep met formule

Rh /

-CO-N

\ 15 R12 is, in het bijzonder een groep met formule Rn /

-CO-N

20 \ CH(R13)-Xt (in welk geval R,, een waterstofatoom of de methylgroep voorstelt). In het laatste geval heeft -CH(R13)-X1 bij voorkeur de L-configuratie.

6.1. Rt1 is bij voorkeur een waterstofatoom.

25 6.2. Als substituent gehecht aan het a-koolstofatoom van een natuurlijk aminozuur (dat wil zeggen met formule H2N-CH(R13)-COOH), is R13 bij voorkeur -CH2OH, -CH(CH3)-OH, isobutyl of butyl, of R13 stelt een -(CH2)2-OH of -(CH2)3-OH groep voor. Ze is in het bijzonder -CH2OH of -CH(CH3)OH.

6.3. X, is bij voorkeur een groep met formule R-14 30 /

-CO-N

\

Rl5 of -CH2-OR10, in het bijzonder met formule -CH2-OR10 en R10 is bij voorkeur een waterstofatoom of heeft de 35 onder 7 hierna gegeven betekenis. Het verdient het meest aanbeveling dat R10 een waterstofatoom is.

De volgende individuele verbindingen lichten de verbindingen met formule I toe.

I I

H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol eveneens bekend als octreotide 40 I I

(D)Phe-Cys-Thr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 !-!

(D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-TrpNH2 I I

45 (D)Trp-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2 I I

(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-ThrNH2 I I

3-(2-Nafthyl)-(D) Ala-Cys-T yr-(D)T rp-Lys-Val-Cys-ThrNH2 50 I I

3-(2-Nafthyl)-(D)Ala-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-B-Nal-NH2 I I

3-(2-Nafthyl)-(D)Ala-Cys-B-Nal-(D)Trp-Lys-Val-Cys-ThrNH2

I I

55 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH2 B. Analoga met formule II

194828 4

[zie Vale en med., Metabolism, 27, Supp. 1, 139, (1978)] en formule III

, (--1

H-Cys-His-His-Phe-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

(zie EP-A-200, 188) 5 Bijzonder aanbevolen liganden zijn die met formule I l H-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol.

Geschikte chelerende groepen zijn hydrofiele, fysiologisch aanvaardbare chelerende groepen die in staat zijn een complex te vormen met een detecteerbaar element. Onder voorbeelden van chelerende groepen 10 vallen bijvoorbeeld iminodicarbonzuurgroepen, polyaminopolycarbonzuurgroepen, bijvoorbeeld die afgeleid van niet-cyclische liganden, bijvoorbeeld ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), diethyleentriaminepen-taazijnzuur (DTPA), ethyleenglycol-0,0,-bis(2-aminoethyl)-N,N,N,,N'-tetraazijnzuur (EGTA), N,N'-bis(hydroxybenzyl)ethyleendiamine-N,N'-diazijnzuur (HBED) en triethyleentetraminehexaazijnzuur (TTHA), die afgeleid van gesubstitueerd EDTA of -DTPA, bijvoorbeeld p-isothiocyanatobenzyl-EDTA of -DTPA, die 15 afgeleid van macrocyclische liganden, bijvoorbeeld 1,4,7,10-tetra-azacyclododecaan-N,N',N ,N

tetraazijnzuur (DOTA) en 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecaan-N,N,,N",N'"-tetraazijnzuur (TETA), die afgeleid van N-gesubstitueerde of C-gesubstitueerde macrocyclische aminen waaronder eveneens cyclamen, bijvoorbeeld zoals beschreven in EP 304.780 A1 en in WO 89/01476-A, groepen met formule IV of V, waarin 20 elk van de substituenten R,, R2 en R3, onafhankelijk van elkaar, een alkylgroep met 1-6 koolstofatomen, arylgroep met 6-8 koolstofatomen of C7.9 arylalkylgroep, elk desgewenst gesubstitueerd door OH, alkoxy met 1-4 koolstofatomen, COOH of S03H, voorstelt, n' = 1 of 2, i = een geheel getal van 2-6 en 25 TT, onafhankelijk van elkaar, a- of β-aminozuren zijn die door amidebindingen met elkaar zijn gebonden, groepen afgeleid van bis-aminothiolderivaten, bijvoorbeeld verbindingen met formule VI, waarin elk van de substituenten R2o, R21 > P22 ©n ^23> onafhankelijk van elkaar, een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstelt, X2 een groep weergeeft die in staat is met de N-aminogroep van een peptide te reageren en 30 m' = 2 of 3, groepen afgeleid van dithiasemicarbazonderivaten, bijvoorbeeld verbindingen met formule VII, waarin X2 een hiervoor gedefinieerde betekenis heeft, groepen afgeleid van propyleenamineoximderivaten, bijvoorbeeld verbindingen met formule VIII, waarin elk van de substituenten R24, R25, R26, R27, R28 en R29· onafhankelijk van elkaar, waterstof of een 35 alkylgroep met 1-4 koolstofatomen voorstellen en X2 en m' de hiervoor gedefinieerde betekenis hebben, groepen afgeleid van diamidedimercaptiden, bijvoorbeeld verbindingen met formule IX, waarin X3 een tweewaardige groep, die desgewenst gesubstitueerd is en een groep bevat die in staat is met de N-aminogroep van het peptide te reageren, bijvoorbeeld alkyleen met 1-4 koolstofatomen of fenyleen met 40 een X2-groep voorstelt en Y5 een waterstofatoom of een CC^R^-groep weergeeft, waarin R30 een alkylgroep met 1-4 koolstofatomen is, of groepen afgeleid van porfyrinen, bijvoorbeeld N-benzyl-5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyfenyl)porfine of TPP met een hiervoor gedefinieerde X2-groep.

45 Aryl is bij voorkeur fenyl en aralkyl bij voorkeur benzyl.

Onder voorbeelden van X2 vallen groepen met formule -(X4)n·, -X5, waarin X4 een alkyleengroep met 1-6 koolstofatomen of een alkyleengroep met 1-6 koolstofatomen desgewenst via een zuurstofatoom of -NH-aan het koolstofatoom gehecht voorstelt, n" is 0 of 1 en Xs een -NCS-groep, een carboxylgroep of een functioneel derivaat daarvan, bijvoorbeeld een zuurhalogenide, anhydride of hydrazide, weergeeft. Het zal 50 duidelijk zijn dat X2 aan een van de koolstofatomen van -[CHa]m.- of =CH-CH= onder vervanging van een waterstofatoom is gehecht.

De chelaatvormende groep welke polyaminopolycarbonzuren omvat is rechtstreeks of indirect met de a-N-aminogroep van het somatostatinepeptide verbonden. Is de groep indirect gebonden, dan is ze zoals hiervoor gemeld via een brugvormende groep of ruimtescheppende groep met formule 55 Z-R35-CO- (a,) gebonden waarin R35 een alkyleengroep met 1-11 koolstofatomen, een alkenyleengroep met 2-11 koolstofatomen of een 5 194828 . H2N-CH(R')-CO-groep voorstelt, waarin R' de rest gehecht in α-positie aan een natuurlijk of synthetisch a-aminozuur, bijvoorbeeld waterstof, alkyl met 1-11 koolstofatomen, benzyl, desgewenst gesubstitueerd benzyl, naftyl-methyl of pyridylmethyl, is en Z een functionele groep weergeeft die in staat is covalent met het cheleringsmiddel te reageren.

5 Z kan bijvoorbeeld een groep zijn die een ether-, ester- ol amidebinding met de chelaatvormende groep kan vormen. Z stelt bij voorkeur amino voor.

De chelaatvormende groepen, bevattende carboxyl, -S03H en/of aminogroepen, kunnen zowel in de vrije vorm als in zoutvorm voorkomen.

Aanbevolen chelaatvormende groepen zijn die afgeleid van polyamino-polycarbonzuurgroepen, 10 bijvoorbeeld die afgeleid van EDTA, DTPA, DOTA, TETA of gesubstitueerd EDTA of DTPA. Chelaatvormende groepen afgeleid van DTPA worden het meest aanbevolen.

In de liganden volgens de uitvinding kan de chelaatvormende groep, indien polyfunctioneel, verbonden zijn met hetzij een enkel somatostatinepeptidemolecuul, hetzij met meer dan een somatostatinepeptidemole-cuul.

15 De liganden volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld in vrije vorm of in zoutvorm voorkomen. Onder zouten vallen zuuradditiezouten met bijvoorbeeld organische zuren, polymere zuren of anorganische zuren, bijvoorbeeld hydrochloriden en acetaten en zoutvormen die verkregen kunnen worden met de carbonzuur of sulfonzuurgroepen die aanwezig zijn in de chelaatvormende groep, bijvoorbeeld alkalimetaalzouten, zoals natrium of kalium, of gesubstitueerde of ongesubstitueerde ammoniumzouten.

20 De liganden volgens de uitvinding kunnen analoog aan bekende methoden worden bereid.

De liganden volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld als volgt worden verkregen: a) verwijdering van ten minste één beschermende groep die in een somatostatinepeptide met een chelaatvormende groep aanwezig is, of b) met elkaar verbinden, via een amidebinding, van twee peptidefragmenten, waarvan elk ten minste één 25 aminozuur of aminoalcohol in een al of niet beschermde vorm bevat en waarvan één de chelaatvormende groep bevat, waarbij de amidebinding zodanig is, dat de gewenste aminozuurvolgorde wordt verkregen en daarna desgewenst stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of c) met elkaar verbinden van een chelaatvormend reagens en het gewenste somatostatinepeptide in een al of niet beschermde vorm, op een dusdanige wijze, dat de chelaatvormende groep wordt bevestigd aan de 30 gewenste N-aminogroep van het peptide en desgewenst daarna stap a) wordt uitgevoerd, of d) verwijdering van een functionele groep van een al of niet beschermd peptide dat een chelaatvormende groep bevat of omzetting ervan in een andere functionele groep, zodat een ander onbeschermd of beschermd peptide met een chelaatvormende groep wordt verkregen en in het laatste geval stap a) van de werkwijze wordt uitgevoerd, of 35 e) oxidatie van een somatostatinepeptide gemodificeerd door een chelaatvormende groep waarin de mercaptogroepen van Cys-groepen in vrije vorm aanwezig zijn, teneinde een analogon te bereiden waarin twee Cys-groepen met elkaar verbonden zijn door een S-S-brug en winning van de aldus verkregen ligand in vrije vorm of in zoutvorm.

De hiervoor beschreven reacties kunnen analoog aan bekende methoden worden uitgevoerd, bijvoor- 40 beeld zoals beschreven in de hiernavolgende voorbeelden, in het bijzonder werkwijzen a) en c). Indien de chelaatvormende groep is bevestigd via een amidebinding, dan kan deze reactie worden uitgevoerd analoog aan de methoden die worden toegepast voor amidevorming. Desgewenst kunnen bij deze reacties beschermende groepen, die geschikt zijn om in peptiden te worden toegepast of voor de gewenste chelaatvormende groepen, worden gebruikt als functionele groepen die niet aan de reactie deelnemen.

45 Onder de aanduiding beschermende groep kan eveneens een polymeerhars met functionele groepen vallen.

Is het wenselijk de chelaatvormende groep te bevestigen aan de eindstandige a-N-aminogroep van een peptide of peptidefragment dat als uitgangsmateriaal wordt toegepast en dat een of een aantal aminogroepen in de zijketen bevat, dan worden deze aminogroepen in de zijketen geschikt beschermd met een beschermende groep, zoals bijvoorbeeld in de peptidechemie gebruikelijk is.

50 Het peptidefragment met de chelaatvormende groep dat bij stap b) wordt toegepast kan worden verkregen door het peptidefragment dat ten minste één aminozuur of aminoalcohol in een al of niet beschermde vorm bevat, te laten reageren met het chelaatvormende middel. De reactie kan analoog aan stap c) worden uitgevoerd.

De chelaatvormende groepen met formule IV of V kunnen worden verbonden met een peptide door een 55 chelaatvormend reagens met formule IV' of V', waarin X een activerende groep voorstelt die in staat is een amidebinding te vormen, te laten reageren met de N-aminogroep van het peptide. De reactie kan worden uitgevoerd op de wijze als beschreven in EP 247.866 A1.

194828 6

Het chelaatvormende reagens dat bij werkwijze stap c) wordt toegepast, kan bekend zijn of analoog aan bekende methoden worden bereid. De gebruikte verbinding is zodanig dat ze de invoering mogelijk maakt van de gewenste chelaatvormende groep aan het somatostatinepeptide, bijvoorbeeld een beschreven polyaminopolycarbonzuur of een zout of anhydride daarvan.

5 Bij de hiervoor beschreven werkwijze, indien in de peptidefragmenten of peptiden die als uitgangsmateriaal worden toegepast, de chelaatvormende groep is bevestigd via een brugvormende of afstand-gevende groep met het peptide, bijvoorbeeld een groep met de hiervoor genoemde formule (a,), kunnen dergelijke peptidefragmenten of peptiden worden bereid door op een gebruikelijke wijze de overeenkomstige aminozuren of peptiden die geen brugvormende of afstandgevende groep bevatten, te laten reageren met 10 een overeenkomstige, brugvormende of afstandscheppende verbinding, bijvoorbeeld een zuur of reactief zuurderivaat dat de brugvormende of afstandgevende groep bevat, bijvoorbeeld een zuur met formule Z-R35-COOH of een reactief zuurderivaat daarvan, zoals een actieve ester. Voorbeelden van actieve estergroepen of carboxylgroep activerende groepen zijn bijvoorbeeld 4-nitrofenyl, pentachloorfenyl, pentafluorfenyl, succinimidyl of 1-hydroxy-benzotriazolyl.

15 Het is ook mogelijk het chelaatvormende reagens eerst te laten reageren met een brugvormende verbinding of verbinding die een afstandgevende groep bevat, teneinde de brugvormende of afstandscheppende groep in te voeren en vervolgens, op een gebruikelijke wijze, te laten reageren met een peptide of peptidefragment.

De liganden volgens de uitvinding kunnen op een gebruikelijke wijze worden gezuiverd, bijvoorbeeld 20 chromatografisch. Bij voorkeur bevatten de liganden volgens de uitvinding minder dan 5 gew.% aan peptiden die geen chelaatvormende groepen bevatten.

De liganden volgens de uitvinding zijn in vrije vorm of in de vorm van farmaceutisch aanvaardbare zouten waardevolle verbindingen. Volgens een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding kan een complex van de liganden volgens de uitvinding met een detecteerbaar element worden gevormd.

25 De onderhavige uitvinding verschaft dus eveneens de liganden volgens de uitvinding, zoals hiervoor gedefinieerd, die zijn gecomplexeerd met een detecteerbaar element (hierna aangeduid met chelaten volgens de uitvinding), in vrije vorm of in de vorm van een zout, hun bereiding en hun toepassing voor in vivo diagnostische en therapeutische behandeling.

Met detecteerbaar element wordt elk element bedoeld, bij voorkeur een metaalion, dat een eigenschap 30 heeft die met therapeutische of in vivo diagnostische methoden kan worden aangetoond, bijvoorbeeld een metaalion dat een detecteerbare straling uitzendt of een metaalion dat in staat is de NMR relaxatie-eigenschappen te beïnvloeden.

Onder geschikte detecteerbare metaalionen vallen bijvoorbeeld zware elementen of de ionen van zeldzame aarden, zoals bijvoorbeeld toegepast bij CAT-scanning (Computer axiale tomografie), para-35 magnetische ionen, bijvoorbeeld Gd3*, Fe3+, Mn2* en Cr2*, fluorescerende metaalionen, bijvoorbeeld Eu3* en radionucliden, bijvoorbeeld γ-emitterende radionucliden, β-emitterende radionuycliden, a-emitterende radionucliden, positron-emitterende radionucliden, bijvoorbeeld 60 Ga.

Onder geschikte ^emitterende radionucliden vallen die welke bruikbaar zijn bij diagnostische methoden. De ^emitterende radionucliden hebben geschikt een halfwaardetijd van 1 uur tot 40 dagen, bij voorkeur van 40 5 uur tot 4 dagen vooral van 12 uur tot 3 dagen. Voorbeelden zijn radionucliden afgeleid van gallium, indium, technetium, ytterbium, rhenium en thallium, bijvoorbeeld 67Ga, 111 In, 99mTc, 169Yb en ^Re. Bij voorkeur wordt het γ-radionuclide gekozen afhankelijk van het metabolisme van de ligand volgens de uitvinding of het gebruikte somatostatinepeptide. Het verdient nog meer aanbeveling dat het ligand volgens de uitvinding wordt gecheleerd met een γ-radionuclide met een langere halfwaardetijd dan de halfwaardetijd 45 van het somatostatinepeptide bij de tumor.

Andere radionucliden die geschikt zijn om bij de beeldvorming te worden toegepast zijn positron emitterende radionucliden, bijvoorbeeld zoals hiervoor vermeld.

Onder geschikte (3-emitterende radionucliden vallen die welke bruikbaar zijn bij therapeutische toepassingen, zoals bijvoorbeeld 9°Y, 67Cu, 188Re, 188Re, 169Er, 121Sn, 127Te, "3Pr, 198Au, 109Pd, 185Dy, aP en 14ZPr. 50 Het B-radionuclide heeft geschikt een halfwaardetijd van 2,3 uur tot 14,3 dagen, bij voorkeur van 2,3 tot 100 uur. Bij voorkeur wordt het β-emitterende radionuclide zodanig gekozen dat dit een langere halfwaardetijd heeft dan de halfwaardetijd van het somatostatinepeptide aan de tumor.

Geschikte α-emitterende radionucliden zijn die welke gebruikt worden bij therapeutische behandelingen, zoals bijvoorbeeld 211 At en 212Bi.

55 De chelaten volgens de uitvinding kunnen worden bereid door reactie van het ligand met een overeenkomstige, detecteerbaar element gevende, verbinding, bijvoorbeeld een metaalzout, bij voorkeur een in water oplosbaar zout. De reactie kan analoog aan bekende methoden worden uitgevoerd, zoals bijvoorbeeld 7 194828 is beschreven in Perrin, Organic Ligand, Chemical Data Series 22. NY Pergamon Press (1982); in Krejcarit en Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com. 77: 581 (1977) en in Wagner en Welch, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979).

Bij voorkeur wordt de complexvorming van de ligand uitgevoerd bij een pH waarbij de ligand volgens de 5 uitvinding fysiologisch stabiel is.

Het is ook mogelijk het detecteerbare element van de oplossing toe te voegen als een complex met een chelaatvormend tussenproduct, bijvoorbeeld een chelaatvormend middel dat een chelaatcomplex vormt dat het element bij de fysiologische pH van de ligand oplosbaar maakt, doch thermodynamisch minder stabiel is dan het chelaat. Een voorbeeld van een dergelijk chelerend tussenproduct is 4,5-dihydroxy-1,3-benzeen-10 disulfonzuur (Tiron®). Bij een dergelijke werkwijze vervangt het detecteerbare element de ligand.

De chelaten volgens de uitvinding kunnen eveneens worden verkregen door een chelaatvormend middel gecomplexeerd met het detecteerbare element te verbinden met een somatostatinepeptide in een al of niet beschermde vorm en desgewenst ten minste één aanwezige beschermende groep te verwijderen. Dezelfde reactie kan worden uitgevoerd met een chelerend middel waarvan een complex gevormd is met een 15 niet-detecteerbaar metaalion en daarna kan in het verkregen gecomplexeerde peptide het metaalion worden vervangen door het gewenste detecteerbare element.

De chelaten volgens de uitvinding kunnen eveneens worden verkregen door een chelaatvormend middel waarvan een complex is gevormd met het detecteerbare element te verbinden met een somatostatinepepti-defragment dat ten minste één aminozuur in een al of niet beschermde vorm bevat en daarna de pepti* 20 desynthese stap voor stap voort te zetten totdat de uiteindelijke peptidevolgorde wordt verkregen en desgewenst ten minste één aanwezige beschermende groep te verwijderen. In plaats van het detecteerbare element kan een complex van het chelerende middel worden gevormd met een niet-detecteerbaar metaal en dit metaal kan daarna in het verkregen, gecomplexeerde somatostatinepeptide, worden vervangen door het detecteerbare element.

25 Indien de chelaatvormende groep via een brugvormende of afstand scheppende groep is verbonden met het somatostatinepeptide, bijvoorbeeld via een groep met de hiervoor vermelde formule (o^), kan het somatostatinepeptide of peptidefragment of het chelaatvormende middel de genoemde brugvormende of ruimte scheppende groep bevatten.

De hiervoor vermelde reacties kunnen analoog aan bekende methoden, vergelijk bijvoorbeeld EP-A 30 0.150.844 worden uitgevoerd. Afhankelijk van de aanwezige, chelaatvormende groep, kan het rendement van het labelen 100% naderen, zodat zuivering niet nodig is. Radionucliden, zoals bijvoorbeeld technetium-99m kan in geoxideerde vorm worden toegepast, bijvoorbeeld als Tc-99m pertechnetaat dat onder reducerende omstandigheden gecomplexeerd wordt.

De hiervoor vermelde reacties worden geschikt uitgevoerd onder omstandigheden die verontreiniging met 35 sporen metaal vermijden. Bij voorkeur wordt gedestilleerd, gedeioniseerd water, en andere zuivere reagentia, radioactiviteit van chelatiekwaliteit toegepast teneinde de effecten van sporen metalen te verminderen.

De chelaten volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld in vrije of zoutvorm voorkomen. Onder de zouten vallen zuuradditiezouten met bijvoorbeeld organische zuren, polymere zuren of anorganische zuren, 40 bijvoorbeeld hydrochloriden en acetaten en zoutvormen die met de carboxylgroepen die in het molecuul aanwezig zijn, die niet deelnemen aan de chelaatvorming, bijvoorbeeld alkalimetaalzouten, zoals natrium of kalium of gesubstitueerde of ongesubstitueerde ammoniumzouten, kunnen worden verkregen.

De chelaten volgens de uitvinding en hun farmaceutisch aanvaardbare zouten vertonen farmaceutische werking en zijn derhalve bruikbaar als beeldvormend middel, bijvoorbeeld het zichtbaar maken van voor 45 somatostatinereceptoren positieve tumoren en metastasen indien een complex wordt gevormd met een paramagnetisch, een γ-emitterend metaalion of een positron emitterend radionuclide, of als radiofarmaceuti-cum voor de in vivo behandeling van voor somatostatinereceptoren positieve tumoren en metastasen indien een complex is gevormd met een a- of β-radionuclide, volgens standaardproeven.

De chelaten volgens de uitvinding hebben in het bijzonder affiniteit voor somatostatinereceptoren die 50 beïnvloed worden door tumoren en metastasen, zoals blijkt uit standaard in vitro bindingsonderzoekingen.

Een voor somastatinereceptoren positieve tumor afkomstig uit het menselijk maag-darmstelsel werd uit de patiënt verwijderd en onmiddellijk gebracht op ijs en binnen een maximale termijn van 30 minuten bevroren bij -80°C. Voor verdere autoradiografie werd dit bevroren materiaal gesneden met een kryostaat (Leitz 1720) in schijven van 10 pm, bevestigd aan van tevoren gereinigde microscoopplaatjes en ten minste 55 3 dagen bewaard bij -20°C, teneinde het hechtvermogen van het weefsel aan het plaatje te verbeteren. De secties werden 10 minuten bij de omgevingstemperatuur voorgeïncubeerd in Tris-HCI buffer (50 mM, pH 7,4) bevattende CaCI2 (2mM) en KCI (5mM) en werden daarna tweemaal gedurende 2 minuten 194828 8 gewassen in dezelfde buffer, zonder dat extra zouten werden toegevoegd. De secties werden daarna 2 uur bij de omgevingstemperatuur geïncubeerd met een chelaat volgens de uitvinding in Tris-HCI buffer (170 mM, pH 7,4), dat 10 g/liter runderserumalbumine, bacitracine (40 mg/l) en 5 mM magnesiumchloride bevatte, 5 teneinde endogene proteasen te remmen. Niet-specifieke binding werd bepaald door toevoeging van het overeenkomstige, niet-gemerkte, niet-gemodificeerde somatostatinepeptide in een concentratie van 1 pM.

De geïncubeerde gedeelten werden driemaal gedurende 5 minuten gewassen in koude incubatiebuffer die 0. 25.g/l BSA bevatte. Na een kortstondige onderdompeling in gedestilleerd water ter verwijdering van de overmaat zouten werden de secties of delen snel gedroogd en werden hiermee de [3H]-LKB films blootge- 10 steld. Na ongeveer 1 week blootstellen in röntgenstralen cassettes werd waargenomen dat de chelaten volgens de uitvinding, bijvoorbeeld een radionuclide chelaat, zeer goede resultaten bij het labelen van tumorweefsel gaf zonder het omringende gezonde weefsel te labelen, indien werd toegevoegd in een concentratie van ongeveer 10‘1° tot 10'3M.

De affiniteit van de chelaten volgens de uitvinding voor somatostatinereceptoren kan eveneens door in 15 vivo onderzoek worden aangetoond.

Ratten met transplanteerbare exocriene, voor pancreassomatostatinereceptoren positieve tumoren werden behandeld met een intraveneuze injectie van een chelaat volgens de uitvinding. De injectieplaats is de penisader. Onmiddellijk na het toedienen werden de dieren geplaatst bij de collimator van een γ-camera en de verdeling van de radioactiviteit werd op verschillende tijdsperioden gevolgd.

20 De biologische verdeling van de radioactiviteit kan eveneens worden bepaald door in reeksen opofferen van een aantal van dergelijke behandelde ratten en de radioactiviteit van het orgaan te bepalen.

Na toediening van een chelaat volgens de uitvinding, bijvoorbeeld een radionuclidechelaat, bijvoorbeeld een γ-emitterend chelaat, in een dosis van 1—5 pg/kg ligand gelabeld met 0,1—2 mCi radionuclide wordt de tumorplaats aantoonbaar tezamen met de organen waar voornamelijk de excretie uit plaatsvindt.

25 Dientengevolge kan een chelaat volgens de uitvinding, in een reeks specifieke of alternatieve uitvoeringsvormen worden toegepast: 1. Een methode voor de in vivo detectie van voor somatostatinereceptoren positieve tumoren of metastasen bij een patiënt, welke omvat a) het toedienen van een chelaat volgens de uitvinding aan de genoemde patiënt en 30 b) het registreren van de locatie van de receptoren getarget door het genoemde chelaat.

De chelaten volgens de uitvinding die worden toegepast voor de in vivo detectiemethode volgens de uitvinding zijn de chelaten waarvan een complex is gevormd met een γ-emitterend radionuclide, een positron-emitterend radionuclide of een paramagnetisch metaalion, zoals bijvoorbeeld hiervoor is aangegeven.

35 De chelaten volgens de uitvinding die worden toegepast als beeldvormend middel bij methode (1) kunnen parenteraal, bij voorkeur intraveneus, worden toegediend, bijvoorbeeld in de vorm van injecteerbare oplossingen of suspensies, bij voorkeur als enkele injectie. De geschikte dosering zal natuurlijk variëren, afhankelijk van bijvoorbeeld het ligand en het type gebruikt, detecteerbaar element, bijvoorbeeld het radionuclide. Een geschikte, te injecteren, dosis ligt in het traject dat beeldvorming door de fotoscanning-40 methode, bekend uit de stand der techniek, mogelijk maakt. Wordt een radiogelabeld chelaat volgens de uitvinding toegepast, dan kan het geschikt worden toegediend in een dosis met een radioactiviteit van 0,1 tot 50 mCi, bij voorkeur 0,1 tot 30 mCi, vooral 0,1 tot 20 mCi. Een geïndiceerd doseringstraject kan lopen van 1 tot 200 pg ligand, gelabeld met 0,1 tot 50 mCi, bij voorkeur 0,1 tot 30 mCi, bijvoorbeeld 3 tot 15 mCi, γ-emitterend radionuclide, afhankelijk van het gebruikte γ-emitterende radionuclide. Het wordt bijvoorbeeld 45 met In aanbevolen een radioactiviteit in het benedentraject toe te passen, terwijl bij Tc het wordt aanbevolen een radioactiviteit in het bovenste gedeelte van het traject te gebruiken.

De verrijking van de tumorplaatsen met de chelaten kan worden gevolgd met de overeenkomstige beeldvormende methoden, bijvoorbeeld onder toepassing van beeldvormend instrumentarium dat in de nucleaire geneeskunde wordt toegepast, bijvoorbeeld een scanner, γ-camera, roterende γ-camera, elk bij 50 voorkeur met een computer als hulpmiddel, PET-scanner (positron emissie tomografie), MRI uitrusting of CAT-scanning uitrusting.

De chelaten volgens de uitvinding, bijvoorbeeld het grootste gedeelte van de ^emitterende chelaten, worden vrijwel geheel uitgescheiden door de nieren en verzamelen zich niet in sterke mate in de lever.

2. Een methode voor de in vivo behandeling van somatostatinereceptor positieve tumoren en metastasen 55 bij een patiënt die een dergelijke behandeling nodig heeft, welke omvat het toedienen van een therapeutisch doeltreffende hoeveelheid van een chelaat volgens de uitvinding aan een dergelijke patiënt.

De chelaten volgens de uitvinding voor toepassing bij de in vivo behandeling volgens de uitvinding zijn g 194828 de chelaten waarmede een complex met een a- of β-radionuclide, zoals hiervoor is gedefinieerd, is gevormd.

De doseringen die worden toegepast bij het uitvoeren van de therapeutische methode volgens de onderhavige uitvinding zullen natuurlijk afhangen van bijvoorbeeld de speciale, te behandelen aandoening, 5 bijvoorbeeld het volume van de tumor, het betreffende, toegepaste chelaat, bijvoorbeeld de halfwaardetijd van het chelaat in de tumor en de gewenste therapie. In het algemeen wordt de dosis berekend op basis van de radioactiviteitsverdeling voor elk orgaan en de waargenomen doelwitopname. Zo kan bijvoorbeeld het chelaat worden toegediend in een dagelijks doseringstraject met een radioactiviteit van 0,1 tot 3 mCi/kg lichaamsgewicht, bijvoorbeeld 0,1 tot 3 mCi, bijvoorbeeld 1 tot 1,5 mCi/kg lichaamsgewicht. Een geïndi-i0 ceerde dagelijkse dosis ligt tussen 1 en 200 pg ligand gelabeld met 1 tot 3 mCi lichaamsgewicht, bij voorkeur 1-1,5 mCi/kg lichaamsgewicht a- of β-emitterend radionuclide, geschikt in gescheiden doses tot viermaal daags toegediend.

De a- of β-emitterende chelaten volgens de uitvinding kunnen volgens elke gebruikelijke weg worden toegediend, bijvoorbeeld parenteraal, zoals in de vorm van injecteerbare oplossingen of suspensies. Ze 15 kunnen eveneens intraveneus door infuseren worden toegediend, bijvoorbeeld door 30 tot 60 minuten infuseren. Afhankelijk van de plaats van de tumor kunnen ze zo dicht mogelijk bij de tumorplaats worden toegediend, bijvoorbeeld met behulp van een catheter. De gekozen wijze van toedienen kan afhangen van de dissociatiesnelheid van het toegepaste chelaat en de uitscheidingssnelheid.

De chelaten volgens de uitvinding kunnen in vrije vorm of in een farmaceutisch aanvaardbare vorm 20 worden toegediend. Dergelijke zouten kunnen op een gebruikelijke wijze worden bereid en vertonen dezelfde mate van werking als de vrije verbindingen.

De chelaten volgens de uitvinding worden voor toepassing bij de onderhavige uitvinding bij voorkeur een korte tijd voor de toediening aan een patiënt bereid, dat wil zeggen het radioactief merken met het gewenste, detecteerbare, metaalion, bijvoorbeeld het gewenste α-, β- of ^radionuclide, kan kort voor de 25 toediening worden uitgevoerd.

De chelaten volgens de uitvinding kunnen geschikt zijn voor de beeldvorming of ter behandeling van tumoren, zoals van de hypofyse, het maag-darmstelsel, het centrale zenuwstelsel, de borst, prostaat, baarmoeder of van de dikke darm, kleine cellen longcarcinoom, paraganglioma, neuroblastoma, pheochro-mocytoma, medullaire schildkliercarcinomen, myeloma en metastasen daarvan.

30 Volgens een ander aspect van de uitvinding kunnen de ^emitterende chelaten volgens de uitvinding eveneens worden toegepast als beeldvormend middel voor de beoordeling van de nierfunctie.

Men paste groepen van vijf muizen toe. Elke muis werd intraveneus in de staarteder geïnjecteerd met 0. 1 ml bevattende 1 mCi van een chelaat volgens de uitvinding. De muizen werden daarna geplaatst in metabolische kooien teneinde de uitgescheiden urine te verzamelen. Op het tijdstip van 10 of 120 minuten 35 na de injectie werden de urethras afgebonden en de muizen met chloroform geanesthetiseerd. De beeldvorming van het uropoietische systeem werd uitgevoerd onder toepassing van een gebruikelijke beeldvormingsmethode. Bij deze proef verbeteren de γ-emitterende chelaten volgens de uitvinding de beeldvorming van de niersecretie bij toediening in een dosis van 0,1—30 mCi.

De onderhavige uitvinding verschaft dus eveneens een methode voor de in vivo beoordeling van de 40 nierfunctie bij een patiënt, welke omvat het toedienen van een doeltreffende hoeveelheid van een γ-emitterend chelaat aan deze patiënt en registratie van de nierfunctie.

Voigens een verder aspect van de uitvinding wordt verschaft: 1. Een farmaceutisch preparaat dat een ligand volgens de uitvinding in vrije vorm en/of in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout, desgewenst met één of een aantal farmaceutisch aanvaardbare dragers 45 of verdunningsmiddelen daarvoor, bevat, ii. een farmaceutisch preparaat dat een chelaat volgens de uitvinding in vrije en/of farmaceutisch aanvaardbare zoutvorm, desgewenst met één of een aantal farmaceutisch aanvaardbare dragers en/of verdunningsmiddelen daarvoor bevat.

Dergelijke preparaten kunnen op een gebruikelijke wijze worden bereid of vervaardigd.

50 Een preparaat volgens de uitvinding kan eveneens worden aangeboden in een gescheiden verpakking met instructies voor het mengen van de ligand met het metaalion en voor toediening van het verkregen chelaat. Het kan eveneens worden aangeboden in een dubbelpakvorm, dat wil zeggen als een enkelvoudige verpakking die gescheiden eenheidsdoseringen van het ligand en het detecteerbare metaalion bevat met instructies voor het mengen ervan en voor het toedienen van het chelaat. Een verdunningsmiddel of drager 55 kan in de eenheidsdoseringsvormen aanwezig zijn.

In de volgende voorbeelden zijn alle temperaturen in °C en de [a]20^ waarden ongecorrigeerd. De volgende afkortingen zijn toegepast: 194828 10

Boe tert.-butoxycarbonyl ' TFA trifluorazijnzuur DTPA diethyleentriamine-pentaazijnzuur.

5 Γ I

Voorbeeld 1: DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol

| I

Men loste 1,12 g Dphe-Cys-Phe-DTrp-Lys(e-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol in vrije basevorm (1 mM) op in 5 ml van een mengsel van gelijke volumedelen dioxan en water en liet deze verbinding reageren met 5 g NaHC03.

10 Onder roeren voegde men langzaam 520 mg DTPA dianhydride toe. Daarna roerde men het reactiemengsel nog 30 minuten en vroor het droog. Het residu werd opgelost in 250 ml water en de pH werd met geconcentreerd zoutzuur ingesteld op 2,5. Het neergeslagen product werd afgefiltreerd, gewassen en gedroogd boven fosforpentoxide. Na chromatograferen over een kolom silicagel werden de volgende producten

I I

15 geïsoleerd: 230 mg DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(e-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol en 500 mg van het over-

| I

komstiae dimeer DTPA-(DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(e-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol)2.

r_-1

Men mengde 3 ml TFA met 200 mg DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(€-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol. Nadat men 20 het mengsel 5 minuten op kamertemperatuur had gehouden sloeg men het mengsel met diisopropylether neer, filtreerde en droogde het. Het residu werd ontzout over Duolite en gelyofiliseerd, waardoor 150 mg van de in de titel genoemde verbinding werd verkregen: [a]20D = -26,6° (c = 1 95% AcOH).

Het uitgangsmateriaal kan als volgt worden verkregen:

25 I I

a) H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(Boc)-Thr-Cys-Thr-ol

Men druppelde 2,25 g di-tert.butyl-pyrocarbonaat, opgelost in 30 ml DMF, langzaam bij kamer temperatuur

I I

30 toe aan een oplossing van 10 g H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol-acetaat in 100 ml DMF. Nadat men het mengsel 2 uur op kamertemperatuur had gehouden verwijderde men het oplosmiddel onder verminderde druk en voegde aan het residu 200 ml diisopropylether toe. Het neerslag dat zich vormde werd afgefiltreerd, uitgewassen met diisopropylether en gedroogd. Het ruwe product werd chromatografisch gezuiverd over silicagel (elutiemiddel: CH2CI2-MeOH = 9:1) en werd daarna geïsoleerd als een wit, amorf 35 poeder.

I I

Voorbeeld 1A: DTPA-(DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol)2

I I

De fractie die het tussenproduct DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(e-Boc)-Thr-Cys-Thr-ol)2, zoals verkregen 40 bij voorbeeld 1, bevatte werd behandeld op de wijze als beschreven hiervoor voor de overeenkomstige monomere vorm en de Boe beschermende groepen werden verwijderd, waardoor de in de titel genoemde verbinding werd verkregen: ΓαΓη = -24,5° (c = 0,55 85% AcOH).

i-1 45 Voorbeeld 2: H2N-(CH2)5-CO-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (zie de oudere, niet-voorgepubliceerde NL-A 8801640) r i a. Men loste 0,56 g H-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys(BOC)-Thr-Cys-Thr-ol, 0,5 mmol Fmoc-e-aminocapronzuur en 115 mg hydroxybenzotriazool op in 10 ml DMF en koelde deze oplossing af tot -30°C. Daarna voegde 50 men aan deze oplossing een oplossing van 115 mg dicyclohexylcarbodiimide in 5 ml DMF (afgekoeld tot -10°C) toe.

Na een reactietijd van 24 uur, gedurende welke tijd het mengsel opwarmde tot kamertemperatuur, werd het verkregen dicyclohexylureum afgefiltreerd en het filtraat werd verdund met water tot 10 maal het volume ervan. Het neergeslagen reactieproduct werd afgefiltreerd, gewassen en gedroogd boven fosforpentoxide.

55 Het ruwe product werd zonder verdere zuivering gebruikt voor de volgende stap.

b. Fmoc-splitsing.

Men behandelde 0,5 g van het ruwe product van de koppelingsreactie (a) 10 minuten bij kamertempera-

Claims

11 194828 tuur met 5 ml van een mengsel van dimethylformamide en piperidine (4:1, vol./vol.) (heldere oplossing) en mengde daarna met 100 ml diisopropylether. Het aldus neergeslagen reactieproduct werd afgefiltreerd, gewassen en gedroogd. Dit ruwe product werd zonder verdere zuivering bij de volgende stap toegepast, c. BOC-splitsing.

1. Somatostatinepeptide, met de formule I, waarin A een groep met formule RCO- is, waarbij RCO- is a) een L- of D-fenylalaninerest waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door F, Cl, Br, NOz, NH2, OH, alkyl met 1-3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, b) de rest van een natuurlijk of synthetisch α-aminozuur, dat verschilt van dat gedefinieerd onder a) 55 hiervoor of van een overeenkomstig D-aminozuur, of c) een dipeptiderest waarin de afzonderlijke aminozuurresten al of niet gelijk zijn en zijn gekozen uit die gedefinieerd onder a) en/of b) hiervoor, 194828 12 A' een waterstofatoom weergeeft, Y, en Y2 tezamen een directe binding voorstellen of waarin elk van de substituenten Yn en Y2 een waterstofatoom is, B is -Phe-, waarvan de ring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, N02, NH2, OH, alkyl met 5 1-3 koolstof atomen en/of alkoxy met 1-3 koolstof atomen (waaronder pentafluoralanine), of β-naftyl-Ala, C is (L)-Trp- of (D)-Trp-, desgewenst ge-a-N-methyleerd en waarvan de benzeenring desgewenst gesubstitueerd is door halogeen, N02, NH2, OH, alkyl met 1—3 koolstofatomen en/of alkoxy met 1-3 koolstofatomen, D is Lys of een 4-aminocyclohexylAla of 4-aminocyclohexylGly-rest weergeeft, 10. is Thr, Ser, Val, Phe, lie, of een aminoisoboterzuur- of aminoboterzuurrest voorstelt, G een groep met formule -COOR7, -CH2OR10, Rn / -CON 15 \ R« of een groep met formule X weergeeft, waarin R7 een waterstofatoom of een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen is, R10 een waterstofatoom of de rest van een fysiologisch aanvaardbare, fysiologisch hydrolyseerbare ester 20 voorstelt, Rn een waterstofatoom, alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, fenylgroep of C7.10 fenylakylgroep weergeeft, R12 een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen of een groep met formule -CH(R13)-X1 weergeeft,

25 R13 CH2OH, -CH2)2-OH, -(CH2)3-OH, of -CH(CH3)OH, of de substituent, bevestigd aan het a-koolstofatoom van een natuurlijk of synthetisch α-aminozuur (waaronder waterstof) voorstelt en Xn een groep met formule -COOR7, -CH2OR10 of -CONR14R15 voorstelt, waarin R7 en R10 de hiervoor gegeven betekenissen hebben, R14 een waterstofatoom of een alkylgroep met 1—3 koolstofatomen voorstelt en 30 R1S een waterstofatoom, een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen, fenylgroep of fenylalkylgroep met 7-10 koolstofatomen weergeeft, en R16 een waterstofatoom of een hydroxylgroep voorstelt, onder de voorwaarde dat indien R12 een -CH(R13)-X, groep voorstelt, R„ een waterstofatoom of een methylgroep is, waarbij de resten B, D en E de L-configuratie bezitten en de resten op de 2- en 7-plaats elk, onafhankelijk van 35 elkaar, de L- of D-configuratie bezitten, met het kenmerk, dat het somatostatinepeptide ten minste een fysiologisch aanvaardbare hydrofiele chelaatvormende groep voor een detecteerbaar element bevat, welke chelaatvormende groep direct of indirect door een brugvormende of afstandgevende groep is verbonden aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van het somatostatinepeptide, en de brugvormende of afstandgevende groep verbonden met A, de formule Z-Rgg-CO- bezit waarin 40 R35 een alkyleengroep met 1-11 koolstofatomen, een alkenyleengroep met 2-11 koolstofatomen en Z een functionele groep voorstelt, die in staat is covalent met het cheleringsmiddel te reageren of een HnN-CH(R')-CO-groep voorstelt, waarin R' de rest, gehecht in de α-positie aan een natuurlijk of synthetisch α-aminozuur voorstelt in de vrije vorm of in een farmaceutisch aanvaardbare zoutvorm.

2. Somatostatinepeptide volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de chelaatvormende groep een 45 carboxylgroep heeft en via een amidebinding is bevestigd aan de eindstandige α-Ν-aminogroep van dit peptide of van de brugvormende of afstandgevende groep H2N-R3S-C0- van dit peptide.

3. Somatostatinepeptide volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het somatostatinepeptide octreotide is.

4. Somatostatinepeptide volgens een of meer conclusies 1—3, met het kenmerk, dat het somatostatinepep

50. I tide DTPA-(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol in vrije vorm of in zoutvorm is.

5. Somatostatinepeptide volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat het peptide via een chelaatvormende groep is gecomplexeerd met een detecteerbaar element, in vrije vorm of in de vorm van een zout.

5 Men behandelde 300 mg van het ruwe product verkregen bij (1 .b) 5 minuten bij kamertemperatuur met 5 ml 100%-ige TFA (volledig opgelost) en mengde daarna met 50 ml diisopropylether. Na toevoeging van 2 ml van een mengsel van waterstofchloride en diethylether werd het verkregen neerslag afgefiltreerd, gewassen en gedroogd onder hoog vacuüm. Het eindproduct werd chromatografisch gezuiverd over siiicagel (CHCI3:methanol:water:azijnzuur = 10 7:3:0,5:0,5) en daarna ontzout over Duolite (gradiënt:water:azijnzuur = 95:5)—water:dioxan:azijnzuur = 45:50:5). De in de titel genoemde verbinding werd verkregen als acetaat (wit lyofilisaat). [a]20D = -32° (c = 0,5 95% AcOH). Het verkregen product wordt toegepast voor de reactie met DTPA volgens de werkwijze van de 15 voorbeelden 1 en 1A. Voorbeeld: 2A Door toepassing van de werkwijze beschreven in voorbeeld 2 werd de volgende ligand bereid: I I

20 DTPA-BAIa-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol. [al20,, = -14,8° (c = 0,5 95% AcOH). I I Voorbeeld 3:11 Ίη gelabelde DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol |-1

25 Men loste DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (voorbeeld 1A) op in 5 ml 0,01 M azijnzuur. Daarna leidde men de verkregen oplossing door een 0,22 μ Millex-GV filter en verdeelde haar in porties van 0,1 ml en sloeg ze op bij -20°C. 111lnCI3 (Amersham, 1 mCi/100 μΙ) werd van tevoren verdund in een gelijk volume 0,5 M natriumacetaat en het labelen geschiedde door de ligand te mengen met de lnCI3 oplossing en zachtjes homogeniseren bij kamertemperatuur.

30 HEPES buffer (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethaansulfonzuur, natrium- en kaliumchloride, natrium waterstoffosfaat en dextrose) met pH = 7,4, werd toegevoegd teneinde de oplossing 10 M te maken. Γ~ I Voorbeeld 4: “Y gelabeld DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol 90Y werd verkregen uit een ^Sr-^Y radionuclide generator. De constructie van de generator, de elutie 35 ervan en de omzetting van het [^JEDTA in het acetaatcomplex werd uitgevoerd volgens de methode beschreven door M. Chinol en D.J. Hnatowich in J. Nucl. Med. 28, 1465—1470 (1987). Men liet 1 mg r-1 DTPA-DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol opgelost in 5 ml 0,01 M azijnzuur opwarmen tot kamertemperatuur en voegde 1,0 mCi 90Y in 50 μΙ steriel 0,5M acetaat toe. Daarna liet men het mengsel ongestoord 30 40 minuten tot 1 uur staan, teneinde de chelaatvorming tot een maximum op te voeren. Een groep liganden volgens de uitvinding zijn somatostatinepeptiden, bijvoorbeeld somatostatineanaloga, die ten minste aan één van de aminozuureenheden een cheiaatvormende groep gehecht aan de genoemde aminogroep via een amidebinding, in vrije vorm of in zoutvorm, bevatten. Een groep chelaten volgens de uitvinding zijn de hiervoor genoemde liganden waarvan een complex met 45 een detecteerbaar element, bijvoorbeeld een metaalion, in vrije vorm of in zoutvorm, is gevormd.

6. Somatostatinepeptide volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het somatostatinepeptide DTPA-i 1 (D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol gelabeld met 111ln of Ö0Y, in vrije vorm of in een farmaceutisch 13 194828 , aanvaardbare zoutvorm is.

7. Farmaceutisch preparaat dat een somatostatinepeptide volgens een der conclusies 1-5 en/of een complex daarvan met een detecteerbaar element zoals gedefinieerd in conclusie 6 of 7, in vrije vorm en/of in de vorm van een farmaceutisch aanvaardbaar zout, tezamen met een farmaceutische drager of 5 verdunningsmiddel, bevat. Hierbij 2 bladen tekening