MXPA06006892A - Formulaciones para transfeccion celular de arn de interferencia corta, composiciones relacionadas y metodos de elaboracion y uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que incorporan acido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y ciertos vehiculos de suministro a base de compuestos lipidos conjugados de poliamida, que son particularmente utiles en el suministro de siARN y otros polinucleotidos a las celulas. Tambien, a metodos para elaborar y usar esta composicion.

Description

FORMULACIONES PARA TRANSFECCION CELULAR DE ARN DE INTERFERENCIA CORTA, COMPOSICIONES RELACIONADAS Y MÉTODOS DE ELABORACIÓN Y USO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) con compuestos lípidos conjugados de poliamida, métodos para elaborarlos, así como también métodos para su uso en el suministro de ARNsi a las células. La invención también se refiere a una nueva clase de compuestos lípidos conjugados de poliamida, adecuados para uso en el suministro de polinucleótidos, que incluyen siARN a las células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interferencia de ARN se refiere al fenómeno de la presencia de ARN de doble hebra en una célula que elimina la expresión de un gen que tiene la misma secuencia, mientras deja la expresión de otros genes no relacionados no alterada. Este fenómeno, también conocido como "silenciamiento del gen post-transcripcional" o "silenciamiento de ARN", ha sido notado en plantas por algún tiempo, pero solamente más recientemente ha sido reconocido en animales. Fire et al., Nature, 391, 806 (1998) . El descubrimiento de esta funcionalidad sugiere la posibilidad de herramientas de REF. : 173849 investigación poderosas, para detener la producción de una proteína especifica y terapéuticos específicos del gen que operan por este mecanismo. Detalles del mecanismo de interferencia de ARN (ARNi) , han sido recientemente aclarados. La presencia de dsAR? largos en células, estimula la actividad de una enzima de ribonucleasa II conocida como Dicer. La Dicer está involucrada en el procesamiento del dsA N en piezas cortas de dsARN conocidas como AR?s de interferencia corta (siARN) (Berstein et al., ?ature, 409, 363 (2001)). Los ARN de interferencia corta derivados de la actividad de Dicer, son típicamente de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud. La respuesta de ARNi también caracteriza un complejo de endonucleasa que contiene un siAR?, comúnmente referido como un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) . El complejo de RISC media el desdoblamiento del ARN de hebra única que tiene una secuencia complementaria a la hebra antisentido del duplo de siARN . El desdoblamiento del ARN objetivo toma lugar en la mitad de la región complementaria a la hebra antisentido del duplo de siARN. Elbashir et al., Genes Dev., 15, 188 (2001). Un impedimento potencial para aprovechar el fenómeno de ARNi en células de mamífero es que la presencia de dsARN largos en estas células, también estimula una respuesta de interferona que resulta en un desdoblamiento no específico del ARNm por una ribonucleasa. Sin embargo, se ha mostrado que los AR?s de interferencia corta de 21-meric químicamente sintetizados (siARN) , suprimen efectivamente la expresión del gen en varias líneas de células humanas sin estimular una respuesta de interferona. Eblash'ir et al., ?ature 411, 494 (2001) . En particular, los siARN sintéticos se han encontrado ser más activos cuando contienen 21 oligonucleótidos dobles con dos nucleótidos al 3'-sobresalientes. Elbashir et al., EMBO J. , 20, 6877 (2001). Las características del siARN de alta especificidad, resistencia a ribonucleasas, no inmunogenidad y potencia, sugieren tremendo potencial como agente de transfección celular para aplicaciones terapéuticas y de investigación. Existe una variedad de estrategias para el suministro de composiciones de ácido nucleico a las células. Sin embargo, se han encontrado dificultades técnicas en la transfección del siAR? en las células. Los vectores virales proporcionan suministro relativamente eficiente, pero en algunos casos, presentan problemas de seguridad debido al riesgo de complicaciones inmunológicas o propagación indeseada en el sujeto. Los vectores adenovirales han mostrado ciertas desventajas, en que no se integran en el genoma de la célula y pueden ser transducidos en células en reposo. Sin embargo, todos estos vectores deben ser preparados por técnicas de AD? recombinante que consume tiempo. Los oligonucleótidos pueden también ser suministrados a las células vía agentes de transfección química, los cuales han sido el sujeto de mucho trabajo reciente. Estos agentes incluyen moléculas policatiónicas, tales como polilisina, y lípidos catiónicos. La composición lipososomal Lipofectin® (Felgner et al . , PNAS 84:7413, 1987), que contiene el lípido catiónico DOTMA (cloruro de N- [1- (2 , 3-dioleiloxi) propil] -N,N,N-trimetilamonio) y el fosfolípido neutral DOPE (dioleil fosfatidil etanolamina), es ampliamente usada. Otros métodos, tales como transfección mediada por fosfato de calcio, pueden ser usados para suministrar los oligonucleótidos a las células de conformidad con los procedimientos reportados . Sin embargo, existe una necesidad de agentes de transfección de siARN no tóxicos, efectivos, que son fácilmente usados y aplicables a muchos tipos de células.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Para lograr lo mencionado anteriormente, la presente invención proporciona composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y ciertos vehículos de suministro a base de compuesto lípido conjugado de poliamida, que son particularmente útiles en el suministro de polinucleótidos, que incluyen, siARN a las células. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y compuestos lípidos conjugados de poliamida que tienen la fórmula general : (I) Ra-tNRi-W-CO.alm-Rc en donde n es un número entero seleccionado desde 1 hasta aproximadamente 48 y m es un número entero seleccionado desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48, en donde Ri para cada unidad monomérica, - (NRi-W-CO)-, y Ra son seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, que tiene 1 a 8 átomos de carbono en la estructura de carbono, que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a la porción enlazadora, en donde R-i no es un átomo de hidrógeno por al menos una unidad monomérica, en donde Rc se selecciona de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo hidrazina; un grupo sulfonilo: -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; y un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde, cuando Ri, Ra o Rc es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, dicha estructura base además comprende uno o más átomos de oxígeno y/o nitrógeno, en donde para cada unidad monomérica es seleccionado independientemente de una porción divalente de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituida que tiene de 1 hasta aproximadamente 50 átomos y opcionalmente, uno o más enlaces dobles o triples en un base que contiene carbono y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicha sustitución de W puede ser una porción lípida que está opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde dicha porción lípida es una porción hidrofóbica o anfipática seleccionada del grupo que consiste de: (i) porciones arilo o arilalquilo opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y (ii) porciones alifáticas de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dichas porciones alifáticas opcionalmente tienen uno o más enlaces dobles o triples, y en donde al menos uno de Ra, Rc, para una unidad monomérica única y Rx para una unidad monomérica única comprende una porción lípida. En una modalidad particular, la invención comprende una composición que incluye un siARN en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser útil para suministrar el siARN a una célula, in vi tro o in vivo, para inhibir la expresión de un gen de interés. El vehículo incluye uno o más conjugados lípidos catiónicos peptoides de la fórmula: (VT) L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 e isómeros posicionales en donde L se selecciona a partir de una porción lípida no esteroidea que comprende al menos, una cadena alquenilo o alquilo grasa entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y una porción de esterol; cada grupo R es seleccionado independientemente de alquilo, aminoalquilo y aralquilo, y X se selecciona del grupo que consiste de un enlace directo, un oligopéptido, una cadena alquilo sustancialmente lineal de 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud, y una cadena sustancialmente lineal desde 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud que consiste de enlaces alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo que consiste de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter. Cuando L es una porción lípida no esteroidea (esto es, una porción lípida que no es o no contiene un grupo esterol, tal como un grupo fosfolípido (es decir, R00CCH2CH(C00R) CH2OP(0)20-) , el conjugado lípido catiónico de poliamida es referido en este documento como un "lipitoide" . Cuando L es una porción esterol, (esto es, una porción lípida que es o contiene un grupo esterol, tal como un grupo colesterol) , el conjugado lípido catiónico de poliamida es referido en este documento como un "colesteroide" . El conjugado lípido catiónico peptoide en una composición de la presente invención, puede ser un lipitoide, un colesteroide, o, en una modalidad importante, una combinación de los mismos. En modalidades específicas, R es isopropilo o 4-metoxifenilo. Un colesteroide o lipitoide único puede incluir grupos R diferentes, o pueden ser los mismos dentro de la molécula. Las composiciones de la invención resultan en el suministro eficiente del siARN biológicamente efectivo para células de mamífero efectivas para volver agénico el -ARNm de un gen objetivo. En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en un sujeto, el cual involucra administrar a un sujeto, una composición como se describe anteriormente, en el cual, una hebra del duplo de siARN tiene una secuencia de nucleótido comprendida en un ARNm derivado del gen objetivo. En una modalidad específica, una hebra del duplo de siARN incluye una secuencia representada por la SEC ID ?O: 1, descrita en este documento, y el gen objetivo /ARNm es Aktl . En otro aspecto, la invención proporciona un vehículo de suministro de polinucleótido compuesto de una mezcla de al menos un lipitoide y un colesteroide. Esta combinación de vehículo de suministro de lipitoide/colesteroide, es adecuada para el suministro de una variedad de polinucleótidos tales como AD? plásmido, oligonucleótidos antisentido y siARN, a las células en composiciones que incorporan tales polinucleótidos y el vehículo de suministro lipitoide/colesteroide de combinación. Los métodos para manufacturar compuestos y composiciones descritos en este documento, se proporcionan y contemplan para caer dentro del alcance de la invención, igual que el uso de las composiciones en métodos para manufacturar medicamentos para uso en los métodos de la invención. Estos y otros objetivos y características de la invención llegarán a ser más completamente aparentes cuando se lee la siguiente descripción detallada de la invención, en conjunto con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una selección de conjugados lípidos catiónicos peptoides ("lipitoides" y "colesteroides") , útiles como portadores de siA N en composiciones y métodos de la invención. La Figura 2 es una gráfica que muestra la pérdida de la expresión de Aktl en donde el siARN dirigido contra el Aktl de ARNm, es transfectado en células de cáncer de mama MDA435, usando composiciones de transfección de conformidad con la presente invención. La Figura 3 es una gráfica que muestra la actividad de luciferasa en células tratadas con mezclas de transfección, las cuales fueron preparadas usando siARN contra luciferasa de luciérnaga y varios vehículos de suministro diferentes, de conformidad con la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los materiales y técnicas y aparatos asociados de la presente invención, serán ahora descritos con referencia a varias modalidades . Propiedades y características importantes de las modalidades descritas, están ilustradas en las estructuras en el texto. Mientras la invención será descrita en conjunto con estas modalidades, se debe entender que la invención no está propuesta para ser limitada a estas modalidades. Por el contrario, se pretende cubrir alternativas, modificaciones y equivalentes como pueden estar incluidas dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. En la siguiente descripción, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar un entendimiento completo de la presente invención. La presente invención puede ser practicada sin alguno o todos estos detalles específicos. En otros casos, operaciones de procesos bien conocidos no han sido descritos en detalle para no obscurecer innecesariamente la presente invención.

Introducción La presente invención proporciona composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y vehículos de suministro a base de poliamida lípida conjugada que son particularmente útiles en el suministro de siAR? a las células. En otro aspecto, la invención proporciona un vehículo de suministro de polinucleótido compuesto de una mezcla de al menos un lipitoide y un colesteroide. El vehículo de suministro es adecuado para suministro de una variedad de polinucleótidos, tales como AD? plásmido, oligonucleótidos antisentido y siARN a las células. En un aspecto, la invención proporciona composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y compuestos lípidos conjugados de poliamida que tienen la fórmula general: 0) Ra-[( R?-W-CO)n]m-Rc en donde n es un número entero seleccionado desde 1 hasta aproximadamente 48 y m es un número entero seleccionado desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48, en donde Rx para cada unidad monomérica, - (NRj.-W-CO)-, y Ra se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, que tiene 1 a 8 átomos de carbono en la estructura de carbono, que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a la porción enlazadora, en donde Ri no es un átomo de hidrógeno por al menos una unidad monomérica, en donde Rc se selecciona de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo hidrazina; un grupo sulfonilo: -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; y un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde, cuando Rx, Ra o Rc es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, dicha estructura base además comprende uno o más átomos de oxígeno y/o nitrógeno, en donde W para cada unidad monomérica es seleccionado independientemente de una porción divalente de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituida que tiene de 1 hasta aproximadamente 50 átomos y opcionalmente, uno o más enlaces dobles o triples en una base que contiene carbono y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicha sustitución de W puede ser una porción lípida que está opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde dicha porción lípida es una porción hidrofóbica o anfipática seleccionada del grupo que consiste de: (i) porciones arilo o arilalquilo opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y (ii) porciones alifáticas de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dichas porciones alifáticas opcionalmente tienen uno o más enlaces dobles o triples, y en donde al menos uno de Ra, Rc, W para una unidad monomérica única y Ri para una unidad monomérica única comprende una porción lípida.

En una modalidad particular, la invención comprende una composición que incluye un siARN en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser útil para suministrar el siARN a una célula, in vitro o in vivo, para inhibir la expresión de un gen de interés. El vehículo incluye uno o más conjugados lípidos catiónicos peptoides de la fórmula: . (VT) • L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 e isómeros posicionales en donde L se selecciona a partir de una porción lípida no esteroidea que comprende al menos, una cadena alquenilo o alquilo grasa entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y una porción de esterol; cada grupo R es seleccionado independientemente de alquilo, aminoalquilo y aralquilo, y X se selecciona del grupo que consiste de un enlace directo, un oligopéptido, una cadena alquilo sustancialmente lineal de 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud, y una cadena sustancialmente lineal desde 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud que consiste de enlaces alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo que consiste de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter.

Cuando L es una porción lípida no esteroidea (esto es, una porción lípida que no es o no contiene un grupo esterol, tal como un grupo fosfolípido (es decir, ROOCCH2CH(COOR) CH2OP(0)20-) , el conjugado lípido catiónico de poliamida es referido en este documento como un "lipitoide" . Cuando L es una porción esterol, (esto es, una porción lípida que es o contiene un grupo esterol, tal como un grupo colesterol) , el conjugado lípido catiónico de poliamida es referido en este documento como un "colesteroide" . El conjugado lípido catiónico peptoide en una composición de la presente invención, puede ser un lipitoide, un colesteroide, o, en una modalidad importante, una combinación de los mismos . En modalidades específicas, R es isopropilo o 4-metoxifenilo. Un colesteroide o lipitoide único puede incluir grupos R diferentes, o pueden ser los mismos dentro de la molécula. Las composiciones de la invención resultan en el suministro eficiente del siARN a células de mamífero efectivas para volver agénico el ARNm de un gen objetivo. En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la expresión de un gen objetivo en un sujeto, el cual involucra administrar al sujeto, una composición como se describe anteriormente, en la cual, una hebra del duplo de siARN tiene una secuencia de nucleótido comprendida en un ARNm derivado del gen objetivo. En otra modalidad, se proporciona un método para manufacturar una composición como se describe anteriormente para uso en inhibición de la expresión de un gen objetivo. En una modalidad específica, pueden ser usados completamente, una hebra del duplo de siARN incluye una secuencia representada por la SEC ID NO: 1, descrita en este documento, con dos nucleótidos al 3'-sobresalientes y el gen objetivo/ARNm es Aktl. En otro aspecto, la invención proporciona un vehículo de suministro de polinucleótido compuesto de una mezcla de al menos, un lipitoide y un colesteroide. El vehículo de suministro de lipitoide/colesteroide de combinación es adecuado para suministro de una variedad de polinucleótidos tales como ADN plásmido, oligonucleótidos antisentido y siARN a las células en composiciones que incorporan tales polinucleótidos y el vehículo de suministro lipitoide/colesteroide de combinación. Las composiciones y vehículos de suministro de conformidad con la presente invención, pueden ser usados in vitro, por ejemplo, en conjunto con investigación que incluye, descubrimiento de fármaco, actividades de desarrollo y pruebas, o in vivo para aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, como fármacos de componentes de fármaco para tratar enfermedades) en un mamífero, que incluyen sujetos mamíferos (por ejemplo, humano) . Para tales aplicaciones in vivo, se usa un vehículo farmacéuticamente aceptable de conformidad con la presente invención.

Definiciones A menos que se indique de otro modo, la terminología usada en este documento debe ser dada en su significado normal como se entiende por uno de habilidad en la técnica. Para facilitar el entendimiento de la presente invención, un número de términos definidos son usados en este documento para designar elementos particulares de la presente invención. Cuando se usan, se proponen los siguientes significados : El término "poliamida lípida conjugada", es usado en este documento para referirse a un compuesto que tienen tanto una porción de amida oligomérica como una o más porciones lípidas. El componente de poliamida del compuesto lípido conjugado de poliamida puede, por ejemplo, ser un peptoide, en tal caso, la poliamida lípida conjugada puede ser referida como un "peptoide lípido conjugado", en particular un peptoide catiónico, en tal caso la poliamida lípida conjugada puede ser referida como un "conjugado lípido catiónico peptoide" . Como se usa en este documento, el término "lípido" se refiere a una porción hidrofóbica o antipática. Una porción lípida puede ser conjugada directamente a la porción de amida oligomérica, u opcionalmente, directamente a la porción de amida oligomérica vía una porción enlazadora. El componente lípido de la poliamida lípida conjugada puede ser o contener una porción esterol o no esterol. Como se usa en este documento, el término "lipitoide" se refiere a un peptoide lípido conjugado de la fórmula: (VI) L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 en donde una porción lípida, L, es una porción lípida no esterol. En donde quiera que se use en la especificación y reivindicaciones de este documento, se pretende que esta fórmula cubra los isómeros posicionales o la porción peptoide de la misma, un isómero posicional es cualquier porción que se repite tres veces de la porción peptoide de la fórmula. Como se usa en este documento, el término "colesteroide" se refiere a un peptoide lípido conjugado de la fórmula: L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 en donde la porción lipida, L, es una porción lípida esterol. En donde quiera que se use en la especificación y reivindicaciones de este documento, se pretende que esta fórmula cubra los isómeros posicionales o la porción peptoide de la misma, un isómero posicional es cualquier porción que se repite tres veces de la porción peptoide de la fórmula. Los términos "oligomérico" y "amida oligomérica", son usados intercambiablemente en este documento para referirse a dos o más unidades monoméricas que son enlazadas en conjunto por un enlace amida, es decir, - [- (NR?-W-CO)n]m- .

Como se usa en este documento, el término unidad de "monómero" o "monomérica" , se refiere a la unidad definida por la fórmula - (NRi-W-CO)-.

Los términos "reactivo oligomérico" , "reactivo oligomérico", "reactivo de amida oligomérica" y "reactivo lípido", se refiere en este documento, a especies reactivas a partir de las cuales los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, son sintetizados. Como se usa en este documento, "vehículo de suministro", se refiere a un compuesto lípido conjugado de poliamida como se describe además en este documento, que forma complejos y facilita el suministro de un polinucleótido a través de una membrana celular a un sitio objetivo.

Vehículos de suministro, de conformidad con la presente invención, son "farmacéuticamente aceptables", los cuales, como se usan en este documento, se refieren a la compatibilidad de los vehículos de suministro con materiales biológicos, por ejemplo, para uso en formulaciones farmacéuticas y en otras publicaciones, ya sea in vivo o in vi tro, en donde están en contacto con materiales biológicos, tales como células vivas. Como se usa en este documento, el término "complejo", se refiere a una estructura formada por la interacción entre dos o más compuestos o estructuras. Tal interacción puede ser vía interacción química, tal como, por ejemplo, unión covalente, iónica o secundaria (por ejemplo, enlace de hidrógeno) y similares, o vía interacción física, tal como, por ejemplo, encapsulamiento, atrapamiento, y similares . De conformidad con un aspecto de la invención, los compuestos lípidos conjugados de poliamida, pueden ser formados en complejos a siARN vía unión covalente a través de una secuencia intermediariamente posicionada de aminoácidos que son susceptibles a la degradación por enzimas proteolíticas endógenas. De este modo, por ejemplo, la exposición de los complejos a enzimas degradativas, resulta en desdoblamiento y subsecuente liberación del siARN a partir del complejo. Los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, pueden también ser formados en complejos a siARN vía enlace iónico o secundario, o alternativamente, vía encapsulamiento o atrapamiento. Los términos "polinucleótido" y "ácido polinucleico" , son usados intercambiablemente en este documento para referirse a AD?, ARN y análogos de ácidos nucléicos-péptidos de los mismos, así como también, AD? o AR? que tiene nucleótidos que no contienen fosfato. El siAR? es particularmente usado de conformidad con la presente invención. Otros polinucleótidos empleados en la práctica de algunos aspectos de la presente invención pueden ser de moléculas de hebra única, de doble hebra o quiméricas de hebra única o de doble hebra. Ejemplos específicos incluyen AD? plásmido y oligonucleótidos antisentido. Como se usa en este documento, "sustituido", significa que uno o más hidrógenos pendientes en un grupo funcional orgánico, son reemplazados con un sustituyente, preferiblemente seleccionado de un haluro, un alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, halometilo o haloetilo. Todas las publicaciones mencionadas en este documento están incorporadas por referencia para propósitos de divulgar y describir características de la invención para la cual se citan las publicaciones en conjunto con ésta.

Composiciones En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que incorporan ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) y vehículos de suministro a base de lípidos conjugados de poliamida. Estas composiciones son particularmente útiles en el suministro del siARN a las células. 1. siARN Las composiciones de la presente invención incorporan siARN, los cuales son efectivos para suprimir específicamente la expresión de un gen de interés sin estimular alguna otra actividad perjudicial a la función celular normal, por ejemplo, una repuesta de interferona. Los siARN efectivos son de manera general, pero no necesariamente, químicamente sintetizados. En modalidades específicas, se puede usar completamente el siARN dirigido contra el A Nm de Aktl que tiene la secuencia CAUAGUGAGGUUGCAUCUGGUG (SEC ID NO:l), con dos enlaces de nucleótido 3 ' -sobresaliente y fosfodiéster. En un caso, los dos nucleótidos 3 ' -sobresalientes son nucleótidos TT (ADN). En otro caso, los dos nucleótidos 3 ' -sobresalientes son nucleótidos 2'0-metilo UU (ARN) . Cuando se transfectan en células, como se describe en los Ejemplos 1 y 3 abajo, estos siARN muestran degradación muy efectiva del ARNm Aktl endógeno, resultando en una pérdida de la actividad del gen Aktl correspondiente. Se debe entender que las secuencias de siARN Aktl descritas en este documento, son meramente representativas de cientos de otras secuencias de siARN posibles, que pueden ser combinadas con vehículos de suministro de compuesto lípido conjugado de poliamida, en composiciones de conformidad con la presente invención. Uno de habilidad ordinaria en la técnica, apreciará las descripciones proporcionadas en este documento, de que pueden ser usadas otras secuencias de siA-RN en la misma manera o similar fácilmente valorables, para lograr el mismo efecto para el ARNm y gen correspondiente. 2. Compuestos lípidos conjugados de poliamida La presente invención proporciona composiciones que incorporan vehículos de suministro a base de compuesto lípido conjugado de poliamida. Los conjugados lípidos conjugados de poliamida adecuados para uso en o como estos vehículos de suministro, se describen en las publicaciones de PCT co-propietarias WO 98/06437 y WO 99/08711 (Zuckerman, et al . ) , basados en Documentos Estadounidenses series número 60/023,867, 60/054,743 y 09/132,808; y en la publicación de PCT co-propietaria WO 01/16306 y Serie Estadounidense No. 09/648,254 (Innis, et al . ) , basados en el documento Estadounidense serie número 60/151,246; por este medio incorporados en su totalidad y para todos los propósitos. Estos conjugados de lípido conjugado de poliamida, tienen la fórmula general : (I) Ra-[(NR?-W-CO)„]m-Rc en donde n es un número entero seleccionado desde 1 hasta aproximadamente 48 y m es un número entero seleccionado desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48, en donde Rx para cada unidad monomérica, - (NRi-W-CO)-, y Ra se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, que tiene 1 a 8 átomos de carbono en la estructura de carbono, que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a la porción enlazadora, en donde Ri no es un átomo de hidrógeno por al menos una unidad monomérica, en donde Rc se selecciona de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo hidrazina; un grupo sulfonilo: -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; y un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde, cuando Ri, Ra o Rc es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, dicha estructura base además comprende uno o más átomos de oxígeno y/o nitrógeno, en donde W para cada unidad monomérica es seleccionado independientemente de una porción divalente de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituida que tiene de 1 hasta aproximadamente 50 átomos y opcionalmente, uno o más enlaces dobles o triples en una base que contiene carbono y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicha sustitución de W puede ser una porción lípida que está opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde dicha porción lípida es una porción hidrofóbica o antipática seleccionada del grupo que consiste de: (i) porciones arilo o arilalquilo opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y (ii) porciones alifáticas de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dichas porciones alifáticas opcionalmente tienen uno o más enlaces dobles o triples, y en donde al menos uno de Ra, Rc, W para una unidad monomérica única y Ra para una unidad monomérica única comprende una porción lípida. Las poliamidas lípidas conjugadas de la presente invención, pueden ser polímeros aleatorios en donde cada R y W, aleatoriamente varían de monómero a monómero (es decir, en donde n es 1 y m es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48) . Alternativamente, las poliamidas lípidas conjugadas pueden ser polímeros que tienen m número de n-meros (es decir, en donde n es mayor que 1 y m es un número entero desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48) , que son ya sea de repetición (es decir, cada n-mero es el mismo) o aleatoriamente variable (es decir, la composición monomérica de cada n-mero es aleatoria) . Típicamente, en número entero no es más de aproximadamente 40, más típicamente no más de aproximadamente 20, y aún más típicamente, no más de aproximadamente 6. Preferiblemente, n es aproximadamente 3. El número entero m es típicamente no más de aproximadamente 40, más típicamente, no más de aproximadamente 25. Usualmente, el número entero m no es más de aproximadamente 15, típicamente no más de aproximadamente 12 y aún más típicamente no más de aproximadamente 8. En donde Ri, Ra y Rc son alifáticos, típicamente contienen al menos 2 átomos de carbono en una estructura base y más típicamente, contienen al menos aproximadamente 3 átomos de carbono en una estructura base. Grupos arilo y arilalquilo Ri, Ra y RC/ pueden ser lineales o cíclicos. Arilo y arilalquilo R , Ra y Rc, que tienen menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, también tienen uno o más heteroátomos en la estructura base, tales como, hidrógeno y/o oxígeno. Típicamente, arilo y arilalquilo Rx, Ra y Rc, tienen al menos, aproximadamente 5 átomos de carbono en una estructura base. Ra es típicamente una porción -OH, -H, -SH, -COOH, sulfonilo o lípida, opcionalmente conjugada a una porción enlazadora, Rc es típicamente -OH, -H- , -SH-, -NH2, sulfonilo, hidrazina, o una porción lípida opcionalmente conjugada a una porción enlazadora. Preferiblemente, ya sea Ra o Rc es una porción lípida opcionalmente conjugada a una porción enlazadora. Rx puede ser una cadena lateral que es catiónica, aniónica o neutral a pH fisiológicamente relevante. Típicamente, el pH fisiológico es al menos aproximadamente 5.5 y típicamente, al menos aproximadamente 6.0. Más típicamente, el pH fisiológico es al menos aproximadamente 6.5. Usualmente, el pH fisiológico es menos de aproximadamente 8.5 y típicamente menos de aproximadamente 8.0. Más típicamente, el pH fisiológico es menos de aproximadamente 7.5. Las cadenas laterales catiónicas adecuadas incluyen, por ejemplo, aminoalquilo (por ejemplo, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo, aminopentilo y similares) , así como también derivados de los mismos; (S) -a-metiletilendiamino y derivados del mismo; trimetilaminoetilo y derivados del mismo; guanidinoalquilo (por ejemplo, guanidinoetilo, guanidinopropilo, guanidinobutilo, guanidinopentilo y similares) y derivados de los mismos; aminobencilo y derivados del mismo; piridinio y derivados del mismo; y otras porciones catiónicas similares que son conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Las cadenas laterales neutrales adecuadas incluyen, por ejemplo, (S) o (R) -a-metilbencilo y derivados del mismo; bencilo y derivados del mismo; fenetilo y derivados del mismo; naftilmetilo y derivados del mismo; (S) o (R) -a-metilnaftilo y derivados del mismo; N-propilpirrolidinona y derivados del mismo; ciclohexilmetilo y derivados del mismo; furfurilo y derivados del mismo; 3,4,5-trimetoxibencilo y derivados del mismo; metoxietilo y derivados del mismo; p-metoxifenetilo y derivados del mismo; isoamilo ("IsoA") y derivados del mismo; y otras porciones neutrales similares que son conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Las cadenas laterales aniónicas adecuadas incluyen, por ejemplo, carboximetil, carboxietil y similares y derivados de los mismos; ácido benzoico y derivados del mismo; fosfatos y derivados de los mismos; sulfatos y derivados de los mismos; y otras porciones aniónicas que son conocidas por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Opcionalmente, Rx puede ser una porción encontrada en aminoácidos que se originan naturalmente o que no se originan naturalmente, o Rx puede ser una porción lípida opcionalmente unida a una porción enlazadora. Como se usa en este documento, el término "aminoácido que se origina naturalmente", se refiere a Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, lie, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr) . El término "aminoácido que no se origina naturalmente" , se refiere a aminoácidos típicamente no encontrados en la naturaleza que incluyen, por ejemplo, D-isómeros de aminoácidos que se originan naturalmente . Típicamente, Rx no es hidrógeno por al menos dos unidades monoméricas, más típicamente Rx no es hidrógeno por al menos tres unidades monoméricas si n x m es 3 ó más. Típicamente, menos de aproximadamente 75% de las unidades monoméricas tienen un R que es hidrógeno. Más típicamente, menos de aproximadamente 50% de las unidades monoméricas tienen un Rx que es hidrógeno. Aún más típicamente, menos de aproximadamente 25% de las unidades monoméricas tienen un R que es hidrógeno. Aún más típicamente, Rx no es hidrógeno para cualquiera de las unidades monoméricas . W es típicamente -CH2CH2-, -CH2-C6H4-C (=0) O- (es decir, ácido toluico) , -CH2CH2-0-, -CH2-CH=CH-, o (II) -CR2R3-, en donde R2 y R3 para cada unidad monomérica son seleccionados independientemente a partir de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo: -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalménte sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde, cuando cualquiera de R2, y R3 es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, dicha estructura base además comprende uno o más átomos de oxígeno y/o nitrógeno. Cuando R2 y R3 son alifáticos, típicamente contienen al menos 2 átomos de carbono en una estructura base y más típicamente, contienen al menos aproximadamente 3 átomos de carbono en una estructura base . Grupos arilo y arilalquilo R2 y R3, pueden ser lineales ó cíclicos. Arilo y arilalquilo R2 y R3, que tienen menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, también tienen uno o más heteroátomos en la estructura base, tales como, hidrógeno y/o oxígeno. Típicamente, arilo y arilalquilo R2 y R3, tienen al menos, aproximadamente 5 átomos de carbono en una estructura base. R2 y R3 típicamente son porciones encontradas en aminoácidos que se originan naturalmente y que no se originan naturalmente. Usualmente, al menos uno de R2 y R3 es un átomo de hidrógeno. Más típicamente, R2 y R3 son ambos hidrógeno para todas las unidades monoméricas, de manera tal que el compuesto (I) es un compuesto lípido conjugado de poliglicina N-sustituida. La porción lípida puede ser posicionada a Ra, Rc, Rx para uno o más monómeros, o en una posición sustituida en W para uno o más monómeros. Las porciones lípidas pueden ser unidas directamente en una unidad monomérica, pueden ser unidas directamente a una unidad monomérica vía una porción enlazadora. El término "enlazador" usado en este documento, se refiere a una porción que funciona para acoplar la amida oligomérica y porciones lípidas juntas en una manera tal que la distancia molecular entre las dos porciones es mayor que la que podría ser si las porciones de amidas oligoméricas o lípidas fueran acopladas directamente entre sí. Porciones enlazadoras pueden ser relativamente pequeñas, tendiendo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 átomos en una base, o alternativamente polimérica. Porciones menores enlazadoras son opcionalmente sustituidas y típicamente tienen desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 átomos de carbono en una base (por ejemplo, carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares) . Típicamente, porciones enlazadoras pequeñas tienen menos de aproximadamente 18 átomos en una base, y más típicamente, menos de aproximadamente 15 átomos en una base. Usualmente, porciones enlazadoras pequeñas tienen menos de aproximadamente 10 átomos en una base, y opcionalmente tienen menos de aproximadamente 5 átomos en una base . Porciones enlazadoras pueden ser derivadas de moléculas bifuncionales, tales como, por ejemplo, ácido 6-aminohexanoico, ácido 2- (2- (2 -aminoetoxi) etoxi) etoxi) acético, y similares) , que son capaces de reaccionar con reactivos tanto oligoméricos como lípidos. Porciones enlazadoras también se derivan de grupos tales, como, por ejemplo, grupos acilo y acilo sustituidos, grupos sulfonilo y sulfonilo sustituidos, y otras porciones reactivas similares que son empleadas durante la síntesis química para facilitar la conjugación de la porción lípida a la porción oligomérica.

Las porciones enlazadoras poliméricas son polímeros sustancialmente lineales (por ejemplo, hidroxi-, carboxi-, fosfo-, amino-, y similares), opcionalmente sustituidas que tienen una base que contiene carbono y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares. Las porciones enlazadoras poliméricas tienen un peso molecular promedio entre aproximadamente 300 daltons y aproximadamente 15,000 daltons, típicamente menos de aproximadamente 10,000 daltons, más típicamente menos de aproximadamente 5,000 daltons y aún más típicamente, menos de aproximadamente 3000 daltons, y opcionalmente menos de aproximadamente 1000 daltons. Las pociones enlazadoras poliméricas adecuadas incluyen, por ejemplo, polietilenglicoles, propilenglicoles, alcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidonas, y similares. Las porciones enlazadoras son porciones hidrofóbicas o porciones antipáticas que son ya sea neutrales (es decir, que no tienen carga o una carga neta de cero) , o cargadas, y ya sea derivadas naturalmente o sintéticamente. Típicamente, la porción lípida en los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, es antipática. Las porciones lípidas adecuadas incluyen: (1) opcionalmente, porciones de arilo o arilalquilo que tienen desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares, en donde la porción arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; (2) opcionalmente, las porciones alifáticas de cadena lineal o ramificada tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 átomos en una estructura base que opcionalmente contienen nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares, y opcionalmente tienen uno o más enlaces dobles o triples. Típicamente, porciones lípidas de arilo y arilalquilo tienen al menos, aproximadamente 16 átomos de carbono y más típicamente tienen al menos aproximadamente 20 átomos de carbono, y aún más típicamente, al menos aproximadamente 30 átomos de carbono. Las porciones lípidas alifáticas empleadas en los compuestos de la presente invención, típicamente tienen al menos aproximadamente 12 átomos de carbono y más típicamente tienen al menos aproximadamente 14 átomos de carbono. Usualmente, las porciones lípidas alifáticas tienen al menos, aproximadamente 18 átomos de carbono, usualmente al menos aproximadamente 24 átomos de carbono, y aún más usualmente al menos aproximadamente 30 átomos de carbono. El número de porciones lípidas en compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, puede variar dependiendo del grado de hidrofobicidad deseado, y también variará con la longitud del oligómero (es decir, n x m) , y el tamaño de la porción lípida. Por ejemplo, cuando la porción lípida tiene aproximadamente 30 átomos de carbono o menos, los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, típicamente tienen conjugado a este, un número de porciones lípidas que es menor que el número computado como 90% del número total de grupos monoméricos (es decir, n x m) (es decir, si n es 3 y m es 3, entonces el número de porciones lípidas conjugadas al compuesto lípido conjugado de poliamida es típicamente menor de aproximadamente 8) . Más típicamente, cuando la porción lípida tiene aproximadamente 30 átomos de carbono o menos, los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, tienen conjugado a este, un número de porciones lípidas que son menos de aproximadamente 80% del número total de grupos monoméricos, más típicamente, menos de aproximadamente 75% del número total de grupos monoméricos, y aún más típicamente, menos de aproximadamente 60% del número total de grupos monoméricos. Cuando la porción lípida tiene más de aproximadamente 30 átomos de carbono, típicamente, los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, tienen conjugado a este un número de porciones lípidas que es menor que el número computado como 50% del número total de grupos monoméricos.

Las porciones lípidas adecuadas incluyen aquellas que tienen uno o más extremos hidrofóbicos que son porciones de cadena recta, alifáticas opcionalmente sustituidas, cada una independientemente que tiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 átomos de carbono en una base, que además, opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre, fósforo y similares. Típicamente, los extremos hidrofóbicos tienen al menos, aproximadamente 10 átomos de carbono en una base y más típicamente tienen al menos, aproximadamente 12 átomos de carbono en una base. Extremos hidrofóbicos empleados en compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, típicamente no tienen más de aproximadamente 26 átomos de carbono en una base, y más típicamente no tienen más de aproximadamente 24 átomos de carbono en una base . Las porciones lípidas naturales empleadas en la práctica de la presente invención, pueden ser derivadas de, por ejemplo, fosfolípidos que incluyen por ejemplo, fosfoglicéridos (que incluyen tanto fosfoglicéridos (tales como, por ejemplo, ácido fosfatídico, fosfatidil etanolamina, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, fosfatidil inositol fosfato, fosfatidil inositol bifosfato, fosfatidil glicerol, difosfatidilglicerol y similares) y éster fosfoglicéridos) ; glicosilglicéridos (tales como, por ejemplo, monogalactosil diacilglicerol, digalactosildiacilglicerol, sulfoquinovosildiacilglicerol , dimanosildiacilglicerol , galactofuranosildiacilglicerol , galactosilglucosildiacilglicerol, galactosilglucosildiacilglicerol, glucosilgalactosilglucosildiacilglicerol y similares) ; esfingolípidos (tales como, por ejemplo, esfingosinas, glicosil ceramidas, gangliósidos y similares) ; como esteróles saturados e insaturados (tales como, por ejemplo, colesterol, ergosterol, estigmasterol, sítosterol y similares); y otros lípidos naturales. Porciones lípidas sintéticas adecuadas pueden ser derivadas de, por ejemplo, dipalmitoil fosfotidiletanolamina (DMPE) (Genzyme Corp., Cambridge), DMRIE-C™ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) , 2-3-dioleiloxi-N- [2 (espermin-carboxamido) etil] -N,N-dimetil-l-propanaminiotrifluoroacetato (DOSPA) (Lipofectamina™, GibcoBRL, Gaithersburg, MD) , 3ß- [N- (N' ,N' -dimetilaminoetil) carbamoil] colesterol, Tfx-50 (Promega Corp., Madison, Wl) , N, NI, N2 ,N3-tetrametil-N,NI,N2 ,N3-tetrapalmitilespermina (TM-TPS) (Cellfectin, GibcoBRL, Gaithersgurg, MD) , dipalmitoil fosfatidiletanolaminoespermina, y similares. Las porciones lípidas adecuadas también incluyen aquellas derivadas de ácidos grasos y alcoholes grasos que tienen desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 24 átomos de carbono en una base. Típicamente, los ácidos grasos y alcoholes grasos tienen al menos, aproximadamente 10 átomos de carbono en una base, y más típicamente, tienen al menos aproximadamente 12 átomos de carbono en una base. Usualmente, los ácidos y alcoholes grasos a partir del cual se derivan las porciones lípidas, tienen menos de aproximadamente 20 átomos de carbono en una base. Típicamente, Ra es una porción lípida o una porción lípida conjugada a una porción enlazadora. Un grupo Ra que contiene una porción lípida particularmente útil, es la porción acilo fosfatidil alquilamino sustituida que tiene la fórmula, (ffl) R4-CO-O-CH2CH(O-CO-R4)-CH2-O-PO3--(CH2)p- H2+-CH2-CO-5 en donde p es un número entero seleccionado de 2 ó 3, y cada R es independientemente seleccionado de una porción de alquilo o alquenilo que tiene entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25 átomos de carbono en una base. De forma típica R tiene hasta aproximadamente 22 átomos de carbono en una base, más típicamente, hasta aproximadamente 20 átomos de carbono, aún más típicamente hasta aproximadamente 18 átomos. De forma típica, R tiene al menos aproximadamente 8 átomos de carbono en una base, más típicamente al menos aproximadamente 10 átomos de carbono, y aún más típicamente al menos aproximadamente 12 átomos de carbono en una base. Porciones R4 ejemplares incluyen dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo y similares. Preferiblemente p es 2. Compuestos de poliamida conjugados con lípido de la presente invención puede ser opcionalmente conjugados adicionalmente o sometidos a complejo con agentes que conceden, por ejemplo, capacidades objetivo, características estructural, actividad biológica o que introduce sitios de degradación y similares. Agentes adecuados incluyen, por ejemplo, mono-, di-, y polisacáridos, polietilenglicoles, aminoácidos, péptidos, polipéptidos, proteínas (que incluyen, por ejemplo, lipoproteínas, glicoproteínas, anticuerpos y similares) , agentes de reticulación, agentes marcadores (tal como, por ejemplo, fluoresceína, biotina, 32P, y similares) , y similares. Aquellos expertos ordinarios en la técnica apreciarán que Ri, R0, Ra, W y la porción lípida particular empleada puede ser fácilmente variada para optimizar las propiedades fisicoquímicas del compuesto lípido conjugado de poliamida para suministrar un tipo particular de polinucleótido. Por ejemplo, porciones de oligomérico de la presente invención adecuadas para uso en el suministro de siARN a células que tienen una carga positiva neta y son capaces de condensar ácidos polinucleótidos de manera que son más compactos en tamaño, facilitando así su suministro a células . Compuestos de fórmula (I) que son adecuados para uso en el suministro de siARN a células, incluyen compuestos lípidos conjugados de poliamida que tienen unidades n-mero repetidas (es decir, en donde n es mayor que 1) . Por ejemplo, cuando n es 3 , el compuesto lípido conjugado de poliamida de fórmula (I) tiene unidades de trímero de repetición, es decir, (IV) Ra- [ (?R?1-W1-CO) - (?R?2-W2-CO) -?R?3-W3~CO) ] m-Rc en donde Ra, Rc, m, cada W y cada Rx se definen como en la fórmula (I) , y isómeros posicionales del mismo. Compuestos que tiene fórmula (IV) que son adecuados para uso en el suministro de siAR? a células que incluyen aquellos en donde Ri1 es una cadena lateral catiónica, R?2 y R?3 ambos son cadenas laterales neutrales, cada W es CH2, Rc es ?H2, y Ra se define por la fórmula (III) . Compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención típicamente forman estructuras ordenadas bi- o tri-dimensionales dependientes de la concentración en solución. Tales estructuras incluyen dos arreglos dimensionales, tales como, por ejemplo, una capa cargada única o una superficie bilateral del lípido, y estructuras tri-dimensionales, tales como, por ejemplo, micelios, vesículas y liposomas. De forma típica, estructuras ordenadas formadas de compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención por ellas mismas, típicamente son suficientemente pequeñas de manera tal que no dispersan la luz. Micelios, vesículas y liposomas preparados de complejos de compuestos lípidos conjugados con polinucleótidos, típicamente tienen tamaños de partícula promedio que son menos de aproximadamente 1 µm, más típicamente menos de 500 nm, y aún más típicamente menos de 200 nm. En modalidades particulares, un vehiculo de suministro a base del compuesto lípido conjugado de poliamida de la presente invención, puede incluir uno o más conjugados lípidos catiónicos peptoides de la fórmula: (VI) L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=O)-N(CH2CH2R)CH2(C=O)33-NH2 e isómeros posicionales en donde L se selecciona de una porción lípida no esteroidea que comprende al menos una cadena alquilo o alquenilo graso entre aproximadamente 8 hasta 24 átomos de carbono en longitud, y una porción de esterol; Cada grupo R es independientemente seleccionado de alquilo, aminoalquilo y aralquilo, y X se selecciona del grupo que consiste de un enlace directo, un oligopéptido, una cadena de alquilo sustancialmente lineal de 2 hasta 30 enlaces en longitud, y una cadena sustancialmente lineal de 2 hasta 30 enlaces en longitud que consiste de enlaces de alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo que consiste de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter. Cuando L es una porción lípida no esterol (que es, una porción lípida que no contiene un grupo esterol, tal como un grupo fosfolípido (es decir, R00CCH2CH (COOR) CH2OP (0) 20-) , el conjugado lípido catiónico de poliamida se refiere en este documento como un "lipitoide" . Cuando L es una porción esterol, (esto es, un una porción lípida que no contiene un grupo esterol, tal como un grupo colesterol) , el conjugado lípido catiónico de poliamida es referido en este documento como un "colesteroide" . El conjugado lípido catiónico de poliamida en una composición de la presente invención puede ser un lipitoide, un colesteroide, o, en una modalidad importante, una combinación de los mismos. En modalidades específicas, R es isopropilo o 4-metoxifenilo. Un lipitoide sencillo o colesteroide puede incluir grupos R diferentes, o puede ser el mismo dentro la molécula. Estos vehículos se pueden preparar por una solución convencional o síntesis de fase sólida, tal como se describe en Zuckermann et al., citado anteriormente, y además detallado abajo. En un procedimiento, los N-términos de un peptoide enlazado a la resina son acilados con un espaciador tal como ácido Fmoc-aminohexanoico o Fmoc- ß-alanina. Después de remover el grupo Fmoc, el grupo amino primario se hizo reaccionar con una porción lípida, tal como cloroformiato de colesterol, para formar un enlace de carbamato, por ejemplo, como se muestra en Colesteroides 1 y 3 de la Fig. 1. El producto es después desdoblado de la resina con ácido trifluoroacético y purificado por CLAR de fase inversa. Una porción lípida derivada del ácido graso, tal como un fisfolípido, se puede usar en lugar de la porción de esteroide, para formar lipitoides como se describe en este documento y también se muestra en la Fig. 1. La porción lípida también es enlazada a la poliamida, por ejemplo, porción peptoide, por otros enlaces, de cualquier longitud efectiva, fácilmente disponibles por el practicante experto. El enlazador es una cadena de hasta aproximadamente 30 enlaces en longitud, y más preferiblemente hasta aproximadamente 15 enlaces en longitud, aunque se puede usar cualquier longitud efectiva. La cadena es típicamente lineal o sustancialmente lineal, aunque cadenas ramificadas (que incluyen oligopéptido) y enlazadores que contienen grupos cíclicos de intervención, también se pueden usar. El enlazador generalmente comprende enlaces (C-C) alquilo y uno o más grupos funcionales tales como enlaces de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido o éter. El enlazador puede comprender grupos funcionales, como en un éster de succinato o poliéter, o puede ser oligopéptido, preferiblemente un 2- a 10-mero, y más preferiblemente un 2-a 5-mero. La porción de esteroide o lípido y segmento del peptoide se puede también unir por un enlace directo . En ciertas modalidades, el enlazador incorpora uno o más enlaces los cuales son susceptibles a desdoblamiento bajo condiciones apropiadas in vivo; por ejemplo, enlaces de éster hidrolizable, carbonato, carbamato o péptido; enlaces de disulfuro, los cuales se desdoblan en compartimentos celulares que tienen un ambiente suficientemente reducido; y enlaces de péptido, desdoblados por peptidasas endógenas. Con respecto a lo último, los enlazadores del polipéptido que tienen diez o menos, o, en modalidades adicionales, cinco o menos péptidos enlazados, están contemplados, aunque pueden también ser usados enlazadores más grandes. Estructuras representativas de esta clase, mostradas en la Fig. 1 se dan las siguientes designaciones: Lipitoide 1, o Ll DMPE (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 2 , o L2 DMPE (NaeNiaNia) 3 Lipitoide 3, o L3 NtdNhd (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 4, o L4 NddNol (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 1, o Cl Col- ß-ala- (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 3, o C3 Col-ß-ala- (NaeNiaNia) 3 en donde "Ntd" es N-tetradecilglicina; "Nhd" es N-hexadecilglicina; "Ndd" es N-dodecilglicina; "Nol" es N- oleilglicina. Los monómeros de peptoide representados en las estructuras anteriores son como sigue: Ma Nae Nmpe N-isoamilglicina N-aminoetilglicina N-4-metoxifenetilglicina En un aspecto, la invención proporciona un vehículo que suministra un agente biológico compuesto de una mezcla de al menos un lipitoide y un colesteroide. El vehículo de suministro es adecuado para suministrar una variedad de polinucleótidos, tales como ADN plásmido, oligonucleótido antisentido y siARN, a células, en donde el vehículo de suministro se combina con el (los) polinucleótido (s) en una composición de conformidad con la presente invención. Composiciones de conformidad con la invención, resulta en suministro eficiente del siARN a células de mamífero agénicas efectivas del ARNm del gen objetivo. Las composiciones y vehículos de suministro de conformidad con la presente invención se pueden usar in vi tro, por ejemplo en conjunto con la búsqueda que incluye descubrimiento del fármaco, desarrollo y actividades de prueba, o in vivo para aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, como fármacos de componentes de fármaco para enfermedades tratadas) en animales, que incluyen sujetos mamíferos (por ejemplo, humano) . Para tales aplicaciones in vivo, se usa un vehículo farmacéuticamente aceptable de conformidad con la presente invención.

Síntesis de Compuestos lípidos conjugados de poliamida Los compuestos lípidos conjugados de poliamida adecuados para uso en composiciones de la presente invención, se pueden sintetizar por fase sólida y métodos de fase de solución. La presente invención también proporciona un método de compuestos lípidos conjugados de poliamida sintetizados, dicho método comprende : a) poner en contacto (1) un reactivo lípido, con (2) un reactivo oligomérico, en donde dicho reactivo oligomérico tiene la fórmula general : (V) Ta-tíNRi-W-COnlm- o en donde n es un número entero seleccionado de 1 hasta aproximadamente 48, y m es un número entero de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48. en donde cada Ta y Tc es independientemente seleccionado de un grupo terminal y una porción reactiva que es capaz de una reacción adicional con dicho reactivo lípido, en donde Rx para cada unidad monomérica, - (NR-W- CO)-, en dicho reactivo oligomérico se selecciona del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo, -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que contiene opcionalmente nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alifático opcionalmente tiene uno o más dobles o triples enlaces; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más dobles o triples enlaces; y una porción reactiva que es capaz de la reaccionar de forma adicional con dicho reactivo lípido. en donde cuando Rx, Ra o Rc es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, que además comprende uno o más oxígenos y/o átomos de nitrógeno . en donde Rx no es un átomo de hidrógeno para al menos una unidad monomérica, en donde W para cada unidad monomérica se selecciona de una porción divalente de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituida que tiene de 1 hasta aproximadamente 50 átomos en una base que contiene carbono, y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, y opcionalmente uno o más enlaces dobles o triples, en donde dicha sustitución de W puede ser una reacción reactiva que es capaz de reaccionar de forma adicional con dicho reactivo lípido. en donde al menos uno de Ta, Tc, W para una unidad monomérica única, o Ri para una unidad monomérica única, comprende una porción reactiva que es capaz de reaccionar de forma adicional con dicho reactivo lípido; después (b) hacer reaccionar dicho reactivo lípido con dicho reactivo oligomérico para conjugar el reactivo lípido al reactivo oligomérico. El término "reactivo lípido" como se usa en este documento se refiere a especies reactivas que tienen una porción lípida que es capaz de participar en una reacción química, tal como, por ejemplo, desplazamiento nucleofílico, condensación y similares. Los reactivos lípidos que tienen grupos funcionales, tales como, por ejemplo, -NH2, -COOH, -SH, -OH, -S02C1 y -CHO, son particularmente útiles para sintetizar compuestos lípidos conjugados de la presente invención. Los reactivos lípidos para uso en la práctica de la presente invención incluyen reactivos lípidos que tienen cualquiera de las porciones lípidas descritas en este documento, las cuales se hacer reaccionar con, o las cuales se pueden modificar para reaccionar con, reactivos oligoméricos o similares. De forma típica, los reactivos de lípido son aminas primarias, secundarias o terciarias. Reactivos lípidos específicos adecuados para uso en este documento son fosfatidiletanolaminas . Como se usa en este documento, el término "reactivo oligomérico" se refiere a una amida oligomérica que es capaz de participar en una reacción química, tal como, por ejemplo, desplazamiento nucleofílico, condensación y similares. Reactivos de oligómero típicamente son acilados con un grupo saliente que es susceptible a desplazamiento nucleofílico por un nucleófilo, tal momo amina. Reactivos de oligómero adecuados para uso en la práctica de la presente invención incluyen todos los sustituyentes de amida descritos por la fórmula (I) (es decir, - [ (NR?-W-CO)n]m-) en este documento. Como se usa en este documento, el término "porción reactiva" se refiere a una porción que es capaz de participar en una reacción con el reactivo lípido. Las porciones reactivas típicas incluyen, por ejemplo, -NH2, -OH, -H, -SH, -COOH, acilo (por ejemplo, acetilo) , benzoilo, sulfonilo (por ejemplo, dansilo), amida, hidrazina (típicamente un grupo Tc) , y derivados de los mismos (que incluye derivados de alquilo sustituido) y similares. De forma típica, la porción reactiva es una porción acilo sustituida con un grupo saliente que es susceptible para desplazamiento nucleofílico por un nucleófilo, tal como una amina. Grupos terminales ejemplares incluyen porciones que son agentes biológicamente activos, agentes objetivo (por ejemplo, un ligando del receptor celular, anticuerpo, etc.), agentes marcadores, residuos de aminoácido que funcionan, por ejemplo, como un sitio de degradación para enzimas proteolíticas endógenas y similares. Estos grupos terminales típicamente no son reactivos adicionales con el reactivo lípido . El reactivo oligomérico y reactivo lípido pueden opcionalmente enlazarse a algún otro vía una porción enlazadora (la cual opcionalmente se puede derivar de una porción reactiva) . De forma alternativa, la porción enlazadora, la cual se deriva de una molécula que es capaz de reaccionar con reactivos tanto oligomérico como lípido, se puede opcionalmente conjugar a ya sea reactivo lípido u oligómero antes de la reacción entre reactivos lípido y oligómero. Así, el reactivo lípido se puede conjugar al reactivo oligomérico ya sea directamente, o indirectamente vía una porción enlazadora. El término "reaccionar" como se usa en este documento, se refiere a uno o más reacciones químicas que resultan en la formación de un enlace químico entre el reactivo lípido y el reactivo oligomérico, ya sea directamente, o indirectamente vía la porción enlazadora. Reacciones adecuadas incluyen, por ejemplo, condensación (por ejemplo, acilación y similares) y desplazamiento nucleofílico. Reactivo oligomérico que tiene la fórmula general (IV) se puede preparar, por ejemplo, por medio de una serie de reacciones de desplazamiento nucleofílico de conformidad con el método de fase sólida descrito por Zuckermann et al., PCT WO94/06451 (publicada el 31 de Marzo de 1994) , incorporada en este documento por referencia. El método se puede realizar utilizando instrumentación de síntesis de péptido automatizado para permitir síntesis rápida de reactivos oligoméricos de interés. Estos instrumentos están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Applied Biosystems . Específicamente, el monómero agrupado en reactivos oligoméricos se logra por la adición en forma secuencial de unidades "submonoméricas" a la cadena de crecimiento. En un método de agrupación de monómero, cada ciclo de adición de monómero consiste de dos etapas: (1) acilación de un enlace de amina secundaria para el soporte sólido con un agente de acilación que tiene un grupo saliente (es decir, un grupo susceptible a desplazamiento nucleofílico por un nucleófilo, tal como una amina) y un grupo carbonilo (por ejemplo, un grupo carboxilo) (es decir, la "etapa de acilación") seguida por (2) desplazamiento nucleofílico del grupo saliente con una cantidad suficiente de un submonómero que tiene un grupo amino primario, secundario o terciario para introducir una cadena lateral (es decir, la "etapa de desplazamiento nucleofílico") . Agentes de acilación ejemplares incluyen ácido haloacético, ácido halometil benzoico, y similares. La eficiencia del desplazamiento del grupo saliente es modulada por el tipo de agente de acilación empleado. Por ejemplo, cuando un ácido haloacético es empleado, se ha observado que el yodo es más eficiente en el desplazamiento del grupo saliente comparado al cloro. Submonómeros adecuados incluyen alquilaminas, alquenilaminas, aminas aromáticas, alcoxiaminas, semicarbazidas, hidrozidas de acilo y derivados de los mismos, y similares. La síntesis de oligómero usando un procedimiento de submonómero se origina en el carboxi en la dirección amino.

El oligómero es elaborado hasta la longitud deseada, después se termina, por ejemplo, con un grupo bromoacetamida. Una ventaja de usar el agrupamiento de submonómero de fase sólida para construir reactivos oligoméricos de la presente invención, es que se elimina la necesidad de monómeros N-a-protegidos, como solamente se necesitan funcionalidades de cadena lateral reactiva para ser protegidas . De forma típica, el reactivo oligomérico se sintetiza como una serie de unidades di-, tri- o tetra-mero de repetición. Un oligómero catiónico a base de trímero ejemplar tiene la siguiente secuencia de monómero en la dirección amino termina (Ta) al término carboxi (Tc) : (1) monómero positivamente cargado (2) monómero neutral, y (3) monómero neutral. Los términos "monómero neutral" y "monómero positivamente cargado" como se usan en este documento, se refieren a la carga neta de la unidad monomérica. Como se notó anteriormente, en otros ejemplos de conformidad con la presente invención, otras porciones de isómero posicional se pueden usar, por ejemplo neutral-positivo-neutral ; o neutral-neutral-positivo. Se puede originar reacción adicional del reactivo oligomérico con el reactivo lípido, por acilación adicional y/o desplazamiento nucleofílico. Por ejemplo, un reactivo oligomérico que es haloacilado (por ejemplo, en donde Ta es un grupo bromoacetilo) , se puede hacer reaccionar con un reactivo lípido que es una amina primaria, secundaria o terciaria. La conjugación así se origina por desplazamiento nucleofílico del bromuro, para formar un compuesto lípido conjugado de poliamida. Se proporcionan detalles más específicos en el siguiente protocolo de síntesis de submonómero de fase sólida para conjugados lípidos catiónicos peptoide, que incluyen lipitoides y colesteroides, de conformidad con modalidades específicas de la presente invención: Experimental General . Se usaron solventes de grado reactivo sin purificación adicional . Se puede obtener ácido bromoacético de Aldrich (99% de grado) y se puede obtener DIC de Cheminplex International . Todas las reacciones y lavados se realizaron a 35 °C a menos que se indique de otra manera. El lavado de la resina se refiere a la adición de un solvente de lavado (usualmente DMF o DMSO) a la resina, la resina se agitó de manera tal que se obtuvo una resina uniforme (típicamente de aproximadamente 20 segundos) , seguido por el vaciado completo del solvente de la resina. Los solventes son removidos mejor por filtración a vacío a través de la parte inferior de la frita del recipiente de reacción hasta que la resina aparece seca (típicamente aproximadamente 10 segundos) . La suspensión de resina se agitó por medio de argón gaseoso completamente del fondo del recipiente de la frita. Se usan solventes para disolver reactivos que deben ser desgasificados antes del uso por sonicación bajo alojamiento a vacío por 5 minutos. Para solventes lavados, es muy conveniente tener dispensadores que contienen DMF, DMSO y diclorometano disponibles con volúmenes ajustables (1-5 ml) . Sí la síntesis es interrumpida y la resina es almacenada por un periodo de tiempo (durante la noche) , se recomienda que la resina sea bien enjuagada con cloruro de metileno antes del almacenaje. Las resinas que son almacenadas pueden secarse adicionalmente bajo alto vacío. Es deseable no detener una síntesis en la etapa de dímero porque los dímeros pueden ciclizarse después del almacenaje durante un periodo largo de tiempo para formar dicetopiperazinas .

Desprotección de Fmoc y expansión de resina Inicial. Se cargó un recipiente de reacción de la frita con 100 mg de resina de amida Fmoc-Rink (0.50 mmol/g de resina) . A la resina se agregó 2 ml de DMF y esta solución se agitó por 5 minutos para expandir la resina. Se puede usar una barra de vidrio para separar pedazos cortos y gruesos de resina, si es necesario. El DMF es después vaciado. El grupo Fmoc después se remueve agregando 2 ml de piperidina al 2% en DMF a la resina. Esto es agitado por 1 minuto, después se vacía. Se agregan otros 2 ml de piperidina al 20% en DMF a la resina y se agita por 20 minutos, después se vacía. La resina después es lavada con DMF (5 x 2 ml) .

Ciclo de Sintesis de Submonómero. La amina desbloqueda es acilada agregando a la resina 850 µl de 1.2 M de ácido bromoacético en DMF, seguido por 175 µl de N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) pura. Esta solución se agita por 20 minutos a 35°C, después se vacía. La resina después es lavada con DMF (3 x 2 ml) y DMSO (1 x 2 ml) . La etapa de acilación (etapa 1) es después seguida por desplazamiento nucleofílico con una amina primaria (etapa 2). Se agrega a la resina lavada 0.85 ml de una solución 2M de la amina en DMSO. Esta solución se agita por 30 minutos a 35°C y después se vacía. La resina después se lava con DMSO 3 x 2 ml) y DMF (1 x 2 ml) . Esto completa un ciclo de reacción. El ciclo acilación/desplaza iento se repitió hasta que el oligómero deseado es obtenido. El esquema de reacción de la síntesis del submonómero se ilustra abajo: Desdoblamiento (para 50 µmol de resina) . Después de la reacción de síntesis y lavado de resina, la resina se lavó con diclorometano (2 x 2 ml) y se secó in vacuo por dos horas. Se preparó una solución de ácido trifluoroacético (95% acuoso) . La resina seca se colocó en un vial de escintilación de vidrio que contiene una barra de agitación micrón de Teflón, y se agregó aproximadamente 5 ml de TFA acuoso al 95%. Los viales de escintilación se colocaron en una placa de agitación localizada en una campana de aspiración. Una placa de agitación puede acomodar cuatro o cinco viales a un mismo tiempo. Esta solución se agitó por 20 minutos. La mezcla de desdoblamiento se filtró para cada muestra a través de 8 ml de una columna de extracción de fase sólida (SPE) fijada con 20 µm de una frita de polietileno en un tubo de centrifugación cónico de polipropileno de 50 ml . El tiempo de desdoblamiento puede necesitar prolongarse dependiendo de cuales grupos de protección están presentes en una biblioteca particular. La resina es después lavada con 1 ml de TFA al 95% y los filtrados se combinaron. Lo filtrado es después lavado con un volumen igual de agua en el tubo de centrifugador . Esta solución es después congelada y liofilizada a sequedad. Perforando agujeros pequeños en las tapas de los viales, la liofilizacion dirigida de los tubos de polipropileno puede ser conducida. El producto seco es después recuperado en 10 ml de ácido acético glacial y nuevamente liofilizado a sequedad. El producto secado dos veces es después recuperado en 3 ml de acetonitrilo/agua 1:1 y es transferido a un criovial tarado de 5 ml (preferiblemente con un anillo o de silicón) y después se liofiliza a sequedad, generalmente produciendo un polvo suave blanco. La masa recuperada puede después ser calculada y el producto puede permanecer en el criovial para almacenaje en frío. Para propósitos de cálculo de rendimientos, se puede asumir que el producto es la sal de trifluoroacetato . Antes de la última liofilización, se pueden preparar muestras de espectro de masa y CLAR. Si el material va a ser utilizado para probarse en un ensayo biológico, entonces se agrega DMSO para hacer una solución base concentrada. Se prefieren soluciones a una concentración de 100 µM/por compuesto o mayor. Esta solución base lOOx se pude diluir 1:100 en amortiguador, proporcionando una solución de ensayo que contiene DMSO al 1%, y las moléculas de muestra a una concentración de 1 µM por compuesto (una concentración de selección típica) . El DMSO es una buena selección para esto, debido a que los peptoides se disuelven muy bien, y cuando se diluyen son compatibles con más ensayos biológicos (a concentraciones de = 1%) .

Caracterización de Oligómero. Se analizaron oligómeros de peptoide individuales por CLAR de fase inversa en Columnas C-18 (Vydac, 5 µm, 300 A, 4.5 x 250 mm) . Se usó un gradiente lineal de 0-80% de B en 40 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/min (solvente A = TFA al 0.1% en agua, solvente B = TFA al 0.1% en acetonitrilo) . Se colectaron los picos mayores y se proporcionaron para análisis de EM de electro-rocío para determinar los pesos moleculares .

Síntesis de Lipitoide (escala 50 µmol) . Los lipitoides 1 y 2 (Ll y L2) son peptoides estándares en donde el residuo (N-terminal) final es una fofatidiletanolamina, una amina primaria. Ll y L2 usan dimiristilfosfatidiletanolamina (DMPE) como la porción lípida N-terminal. Para instalar este grupo, el N-término es bromoacetilado y lavado usando condiciones estándares de submonómero (anteriores) . La resina después se lava con metanol/clorobenceno al 15% (2 x 2 ml) . Después se prepara una solución 2.0 M de DMPE como sigue. Se disuelve DMPE (Genzima) en metano/clorobenceno al 15% a una concentración de 0.2M. Puesto que este compuesto está en la forma zwiteriónica, el compuesto pude ser neutralizado para obtener la base libre de amina. Esto es completado por la adición de 0.92 equivalente de KOH acuoso al 50% con vórtices rápidos. La adición de base puede conducir a un volumen pequeño de agua además como una fase separada, de manera que la muestra debe ser centrifugada (centrifugador tabletop, rmp max por 1 minuto) y se remueve cualquier fase acuosa. En esta etapa, la pureza de la solución DMPE debe ser verificada por CCD (solvente CCD: 80/20/0.5 CH2C12/CH30H/NH40H, teñido con ninhidrina). El producto debe tener un Rf de ~0.6. La solución de DMPE (2 ml) es entonces agregada a la resina. Debido a la espumosidad de esta solución, la reacción es mezclada muy suavemente (usualmente por soplado intermitente de argón en un sacudidor giratorio) . La reacción es incubada a 35 °C durante la noche. La mezcla de reacción entonces es drenada y lavada con metanol/clorobenceno al 15% (6x 3 mL) , DCE (2 x 3 mL) y DCM (1 x 3 mL) . El desdoblamiento de lleva a cabo bajo condiciones estándares peptoides (véase anteriormente) . Debido a la liofilicidad incrementada de los lipitoides, el análisis por CLAR debe hacerse sobre una columna C4. Los lipitoides 3 y 4 (L3 y L4) , son peptoides estándares en donde los últimos 2 residuos N-terminales son elaborados con aminas hidrofóbicas. Estas aminas son disueltas en metanol/clorobenceno al 15% a una concentración de 1 M. Las reacciones de desplazamiento se realizan con 1 mL de solución a 50 °C por dos horas, seguidas por lavado con metanol/clorobenceno al 15% (3 2 mL) y DMF (3 2 L) .

Síntesis de Colesteroide (escala 50 µmol) . La porción de colesterol es agregada por un procedimiento de dos etapas, en donde un enlazador beta-alanina es primero agregado al N-término del peptoide deseado ( (NaeNmpeNmpe) 3 por Cl y (NaeNiaNia) 3 por C3) , seguido por un acoplamiento con cloroformiato de colesterol. La Fmoc-ß-alanina (NovaBiochem) , es acoplada al N-término por la adición de 2.0 mL de una solución de Fmoc- ß-anilina (0.4 M) y HOBt (0.4 M) en DMF, seguida por la adición de 1.1 equivalentes de DIC puro. La mezcla de reacción se agita por 1 hora, después de lo cual la mezcla de reacción es drenada y la resina es lavada con DMF (2 x 3 L) . El acoplamiento ß-alanina es entonces repetido, después de lo cual la resina es lavada con DMF (3 x 3 mL) y DCE (1 x 3 mL) . Después de la remoción de Fmoc, como se describe anteriormente, la porción de colesterol es entonces agregada añadiendo 2.0 mL de una solución 0.4 M de cloroformiato de colesterol (Aldrich) en DCE, seguida por la adición de 1 equivalente de diisopropiletilamina pura (DIEA) . La mezcla de reacción es mezclada suavemente durante la noche a 35°C. La resina es entonces lavada con DCE (5 x 3 L) y DCM (2 x 3 mL) . Puesto que el carbamato formado es ligeramente lábil ácido, se debe tomar cuidado en el desdoblamiento y manejo del compuesto. El desdoblamiento se realiza por la adición de TFA/DCE 1:1 (5 mL) por 10 minutos. Lo filtrado es colectado y la resina lavada con un adicional de 2 mL de cóctel de desdoblamiento. Los filtrados combinados son entonces secados rápidamente in vacuo, y el aceite resuspendido en acetonitrilo/agua 1:1. Esto es inmediatamente congelado (-80°C) y liofilizado. La muestra debe entonces ser liofilizada una vez más a partir de acetonitrilo/agua (1:1) .

Purificación de Lipitoide y Colesteroide. Los lipitoides y colesteroides son purificados por CLAR de fase inversa antes del uso. Pueden ser usadas columnas C4. En un ejemplo, los compuestos son disueltos en una pequeña cantidad de acetonitrilo/agua al 25% y purificados en una columna C4 de 50 x 20 mm ID DuraGel HS (Peeke Scientific) . Un gradiente lineal de 35-85% B en 40 minutos se usa a una velocidad de flujo de 30 mL/min (solvente A = TFA al 0.1% en agua, solvente V = TFA al 0.1% en acetonitrilo). Las fracciones de producto combinado son combinadas y liofilizadas a un polvo blanco.

Método para Elaborar Composiciones Lípidas Conjugadas de Poliamida Para preparar composiciones de transferencia, una solución acuosa de vehículo de compuesto lípido conjugado de poliamida, tal como un lipitoide o colesterol o mezcla, se formula con el siARN, como se describe en el Ejemplo 1. Los componentes son preferiblemente usados en cantidades relativas, tales como son al menos 1.5 y preferiblemente dos a cuatro, cargas de vehículo positivas para cada carga negativa de siARN . La relación exacta de siARN a vehículo es preferiblemente determinada empíricamente por cada tipo celular, pero está generalmente, en el intervalo de 1.5-2 nmol por vehículo/µg de oligonucleótido sentido. Las células pueden ser transfectadas con composiciones de conformidad con la presente invención, como se describe en el Ejemplol. Detalles adicionales que se refieren al uso de las composiciones de conformidad con la presente invención, se proporcionan abaj o .

Uso de Composiciones Lípidas Conjugadas de Poliamida En otro aspecto, se proporciona un método para inhibir la expresión de una célula objetivo en una célula, el cual involucra administrar a la célula una composición como se describe anteriormente, en la cual una hebra del duplo de siARN, tiene una secuencia de nucleótido comprendida en un ARNm derivado del gen objetivo. La célula puede ser comprendida en un "sujeto" como se define en este documento. Las composiciones de la presente invención que comprenden compuesto (s) lípidos conjugados de poliamida, son capaces de suministrar una cantidad efectiva de un polinucleótido (por ejemplo, siARN) a las células. Como se usa en este documento, el término "cantidad efectiva", se refiere a una cantidad de polinucleótido que es suficiente para inducir detectablemente, o participar en, una respuesta biológica, tal como por ejemplo, transducción de señal, transcripción, traducción, activación de linfocito, que incluye, por ejemplo, producción de anticuerpos y similares. Las cantidades relativas de compuesto lípido conjugado de poliamida al ácido polinucléico (por ejemplo, siARN) , son típicamente seleccionadas de manera tal que la relación de carga +/- del compuesto lípido conjugado de poliamida al polinucleótido en la composición, es al menos aproximadamente 1.5 y menos de aproximadamente 10. Más típicamente, la relación de carga +/- es menos de aproximadamente 8 y aún más típicamente menos de aproximadamente 4. La relación de carga es computada de conformidad con lo siguiente : Relación de carga = (nL x ML)/(3.03 x MSÍAR?) • en donde nL, es el número de moles del compuesto lípido conjugado de poliamida, ML = número puro de cargas/mole de poliamida lípida conjugada, y en donde MSÍARH = microgramos de siAR?. Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma líquida o sólida, y pueden opcionalmente, incluir excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales excipientes pueden ser usados como rellenadores, auxiliares de procesamiento, mejoradores se suministro y modificadores, y similares. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetil celulosa de sodio, dextrosa, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidinona, ceras de baja fusión, resinas de intercambio iónico, y similares, así como también combinaciones de cualquiera de dos o más de los mismos. Una discusión completa de excipientes farmacéuticamente aceptables, está disponible en "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., NJ 1991). Pueden ser incluidos agentes adicionales en las composiciones, tales como, por ejemplo, agentes marcadores, nutrientes y similares. Por ejemplo, cuando el agente biológicamente activo es un polinucleótido, los agentes que promueven la endocitosis de los ácidos nucleicos deseados o ayudan en el enlace de los ácidos nucleicos a la superficie celular, o ambos, pueden ser incorporados en composiciones de la presente invención. Las composiciones líquidas de la presente invención pueden estar en la forma de una solución, suspensión o emulsión con un portador líquido. Los portadores líquidos adecuados incluyen, por ejemplo, agua, salina, solvente (s) orgánico (s) farmacéuticamente aceptable (s) , aceites o grasas farmacéuticamente aceptables, mezclas de los mismos y similares. El portador líquido puede contener otros aditivos adecuados farmacéuticamente aceptables, tales como solubilizadores, emulsificadores, nutrientes, amortiguadores, preservativos, agentes de suspensión, agentes espesantes, reguladores de la viscosidad, estabilizadores y similares. Solventes orgánicos adecuados incluyen, por ejemplo, alcoholes monohídricos, tales como etanol y alcoholes polihídricos tales como glicoles. Los aceites adecuados incluyen por ejemplo, aceite de soya, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón y similares. Para administración parenteral, el portador puede también ser un éster aceitoso, tal como oleato de etilo, miristato de isopropilo y similares. Células adecuadas para uso en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, líneas de células de mamífero disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) , células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , células de riñon embriónico humano, células de riñon de hámster bebé, células sertoli de ratón, células de riñon canino, células de hígado de rata búfalo, células de pulmón humano, células de hígado humano, células de tumor mamario de ratón, otras células de mamífero (que incluyen humano) , por ejemplo, (células troncales, particularmente células hematopoyéticas, linfocitos, macrófagos, células dendríticas, células tumorales y similares), y similares. Tejidos adecuados para uso como muestras en la presente invención incluyen, por ejemplo, tejido derivado de mamíferos, tales como, músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, sangre, médula ósea, timo, corazón, linfo, hueso, cartílago, páncreas, riñon, vesícula biliar, estómago, intestino, testículos, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glande, conectivo y similares. Los modos de administración a una muestra incluyen, por ejemplo, administración ex vivo a muestras derivadas de un sujeto y administraciones in vivo a una muestra. Los métodos para llevar a cabo estos modos de administración son bien conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Por ejemplo, el suministro y reimplantación ex vivo de células transformadas en un sujeto, se puede lograr como se describe en por ejemplo, la Solicitud Internacional No. WO 93/14778 (publicada el 5 de Agosto de 1993) . Como se usa en este documento, el término "sujeto", se refiere a células, líneas de células (que incluyen células de mamífero y líneas celulares) , invertebrados y vertebrados que incluyen aves y mamíferos, tales como, por ejemplo, roedores y humanos. La administración directa a un sujeto, típicamente se realiza por inyección, ya sea subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente o intramuscularmente o suministrada al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también pueden ser administradas en un tumor o lesión. Otros modos de administración incluyen administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas, agujas y disparos de genes o hipo-rocíos. Además del suministro de siARN (u otros polinucleótidos) a las células, los compuestos lípidos conjugados de poliamida de la presente invención, pueden también ser usados en aplicaciones tales como, por ejemplo, selección de compuestos similares al péptido para actividad biológica, incorporación en biosensores, de manera tal que la porción oligomérica tiene la capacidad para enlazarse a un ligando objetivo y similares. Para aplicaciones de selección de fármaco, por ejemplo, las bibliotecas de compuestos lípidos conjugados de poliamida que tienen una variedad de grupos Rx, pueden ser sintetizadas y subsecuentemente seleccionadas para determinar la actividad biológica de conformidad con los métodos para sintetizar y seleccionar bibliotecas peptídicas modificadas descritas en la publicación de PCT WO 91/19735 (publicada el 26 de diciembre de 1991) , incorporada en este documento por referencia.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran pero no están propuestos en ninguna forma, para limitar la invención.

Ejemplo 1. Inhibición de siARN de AR?m objetivo A. Preparación de Mezcla de Transfección Para cada mezcla de transfección (las cuales son ejemplos de composiciones de conformidad con la presente invención) , un vehículo de suministro de combinación lipitoide o de lipitoide/colesteroide, se preparó a una concentración de funcionamiento de 0.5 mM en agua y se mezcló para dar una solución uniforme. El siAR? se preparó a una concentración de funcionamiento de 20 µM en amortiguador suministrado con siAR?. En este ejemplo, los siAR? fueron ARNm de Aktl y que tien n la secuencia CAUAGUGAGGUUGCAUCUGGUG (SEC ID ?0:1), a través de dos enlaces de nucleótido 3'-sobresaliente y fosfodiéster, 2'0-metilo UU (ARN) (disponible de Integrated D?A Technologies) . El siARN fue diluido con OptiMEM™ (Gibco/BRL) , en un tubo micrófugo, a 1 µM, o aproximadamente 15 µl de oligo/ml de OptiMEM™. En un tubo micrófugo separado, se diluyó el vehículo, típicamente en la cantidad de aproximadamente 3.75 nmol de vehículo/100 pmol de siAR?, en la muestra de volumen de OptiMEM™ usado para diluir el siARN . En este ejemplo, las concentraciones de partida del siARN y vehículo usados, resultan en aproximadamente 1.5 µl de vehículo por µl de siARN usado. Se nota que la relación de extracto de siARN a vehículo, debe ser determinada empíricamente por cada tipo de célula, pero generalmente es aproximadamente esta cantidad. El siARN diluido fue inmediatamente agregado al vehículo diluido y mezclado pipeteando ascendentemente y descendentemente. La mezcla fue dejada incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.

B. Transfección Las células fueron colocadas en placas en cajas de cultivo de tejidos un día y adelantadas a transfección en medio de crecimiento con suero, para proporcionar una densidad a transfección de 60-90%. La mezcla de siARN/vehículo, se agregó a las células inmediatamente después del mezclado e incubación, a una concentración final de 50-100 nM de siARN en la mitad del volumen medio de crecimiento normal . Las células fueron incubadas con la mezcla de transfección a 37°C, C02 al 5% por 4-24 horas. Después de la incubación, la mezcla de transfección fue diluida 2 veces con medio de crecimiento normal con suero. La Figura 2 muestra la pérdida de la expresión Aktl cuando el siARN dirigido contra el Aktl de AR?m es transfectado en células de cáncer de mama MDA435 usando composiciones de transfección preparadas como se describe anteriormente. Se compara la efectividad de tres diferentes vehículos de combinación lipitoide (L2 , L3 ) , o lipitoide/colesteroide (LCl/Cl) , con una serie de vehículos de suministro comercialmente disponibles (X = lipof ectamina2000 , disponible de Invitrogen; Y = siPORTamina, disponible de Ambion; y Z=siPORTlípido , disponible de Ambion) , todos en la presencia o ausencia de suero durante la transfección . El control fue siARN eg5 transfectado en las células a una concentración de 100 nM usando los mismos vehículos y condiciones . El siARN eg5 fue de doble hebra, todo el ARN a través de dos enlaces de nucleótidos TT al 3 ' -sobresalientes adicionales y fosfodiéster, y tiene una secuencia que corresponde a la secuencia de ADN AGAAACTAAATTACAACTTGTTA . El ARN total se extraj o usando el Kit Roche High Pure RNA Isolation, de conformidad con los protocolos del fabricante . Los resultados (normalizados : promedio de HPRT y GUSB; niveles de mensaje para Aktl fueron normalizados al promedio de los niveles de los genes monitoreados (HPRT y GUSB) , para compensar pequeñas variaciones en los niveles totales de AR? entre muestras) , muestran que los agentes de transfección y composiciones de la invención, no son sustancialmente afectados por la presencia de ausencia de suero y que fueron muy efectivos en reducir la expresión del gen objet ivo/AR?m.

Ej emplo 2 . Pérdida de Actividad de Luciferasa Después de la Transfección de siARN Las mezclas de transfección fueron preparadas usando siARN contra luciferasa de luciérnaga (CGUACGCGGAAUACUUCGA (SEC ID NO: 2); de Elbashir et al., Nature, 411, 494 (2001) y varios vehículos de suministro diferentes, de conformidad con la presente invención como se describe en este documento (Ll, L2 , Ll/Cl, L4, 1L1/3C1) , sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. La actividad de luciferasa se cuantificó con el Sistema de Ensayo Reportero de Luciferasa Dual de Promega, de conformidad con las direcciones de envasado. Como se muestra en la Figura 3, la actividad de luciferasa en MDA231 que expresa establemente luciferasa, fue sustancialmente reducida después de la transfección de un siARN contra luciferasa. El control fue una línea celular no transfectada. Este resultado proporciona indicación adicional de la capacidad de las composiciones de conformidad con la presente invención, para el suministro efectivo de siARN a las células.

Ejemplo 3. Formación Agénica del Mensaje de Aktl en Células Transfectadas con siARN La Tabla 1 muestra datos para experimentos emprendidos para comparar la efectividad de la formación agénica del mensaje Aktl en células transfectadas con siARN por una composición que incorpora un vehículo de suministro de combinación lipitoide/colesteroide, de conformidad con la presente invención y usando un agente de transfección comercialmente disponible (Fugened, disponible de Roche. Las células HT1080 fueron transfectadas con 100 nM de dos diferentes siARN (siARN dirigido contra ARN mensajero de Aktl que tiene la secuencia CAUAGUGAGGUUGCAUCUGGUG (SEC ID NO: 1), a través de dos enlaces de nucleótidos TT 3' -sobresalientes y fosfodiéster o a través de dos enlaces de nucleótido 3'-sobresaliente y fosfodiéster 2'-0-?r?etü UU (ARN), usando una composición que incorpora un vehículo de suministro de combinación lipitoide/colesteroide (1L1/3C3) , sustancialmente de conformidad con los procedimientos de preparación y transfección descritos en el Ejemplo 1. La reducción en los niveles de ARNm de aproximadamente 69-83%, fue observada para composiciones de conformidad con la presente invención. Los resultados indican que las composiciones de conformidad con la presente invención, son casi más efectivos en la formación agénica de ARNm de Aktl que el agente comercial Fugened.

Tabla 1 Aunque la invención anterior ha sido descrita con algún detalle para propósitos de claridad de entendimiento, será aparente que ciertos cambios y modificaciones pueden ser practicados dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Se debe notar que existen muchas formas alternativas para implementar tanto los procesos como composiciones de la presente invención. Por consiguiente, las presentes modalidades están para ser consideradas como ilustrativas y no restrictivas, y la invención no está limitada a los detalles dados en este documento, pero puede ser modificada dentro del alcance y equivalentes de las reivindicaciones adjuntas. Los contenidos de cada una de las patentes, solicitudes de patentes y artículos de diarios citados anteriormente, están por este medio, incorporados por referencia en su totalidad y para todos los propósitos como se expone completamente en su totalidad. Se hace constar que con relación esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (33)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Compuesto, que comprende: ácido ribonucleico de interferencia corta (siARN) en un vehículo de suministro farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque el vehículo comprende al menos un compuesto de la fórmula:

(I) Ra-[NR?-W-CO) m-Rc en donde n es un número entero seleccionado desde 1 hasta aproximadamente 48 y m es un número entero seleccionado desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 48, en donde Rx para cada unidad monomérica, - (NR?-W-CO) - , y Ra son seleccionados independientemente a partir del grupo que consiste de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo carboxilo; un grupo sulfonilo; -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, que tiene 1 a 8 átomos de carbono en la estructura de carbono, que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático úpcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a la porción enlazadora, en donde Rx no es un átomo de hidrógeno por al menos una unidad monomérica, en donde Rc se selecciona de un átomo de hidrógeno; un grupo hidroxi; un grupo amino; un grupo hidrazina; un grupo sulfonilo: -SH; un grupo alifático de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido que tiene 1 a 8 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicho grupo alifático opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; un grupo arilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo; y un grupo arilalquilo opcionalmente sustituido que tiene 3 a 12 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y una porción lípida que es opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde, cuando Rlf Ra o Rc es un grupo arilo o arilalquilo que tiene menos de 5 átomos de carbono en una estructura base, dicha estructura base además comprende uno o más átomos de oxígeno y/o nitrógeno, en donde W para cada unidad monomérica es seleccionado independientemente de una porción divalente de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituida que tiene de 1 hasta aproximadamente 50 átomos y opcionalmente, uno o más enlaces dobles o triples en una base que contiene carbono y opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dicha sustitución de W puede ser una porción lípida que está opcionalmente unida a una porción enlazadora, en donde dicha porción lípida es una porción hidrofóbica o anfipática seleccionada del grupo que consiste de: (i) porciones arilo o arilalquilo opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde el grupo alquilo de dicho arilalquilo opcionalmente tiene uno o más enlaces dobles o triples; y (ii) porciones alifáticas de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidas que tienen desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 átomos de carbono en una estructura base que opcionalmente contiene nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo, en donde dichas porciones alifáticas opcionalmente tienen uno o más enlaces dobles o triples, y en donde al menos uno de Ra, Rc, W para una unidad monomérica única y R para una unidad monomérica única comprende una porción lípida. 2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el vehículo de suministro comprende un conjugado lípido catiónico peptoide de la fórmula

L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=O)-N(CH2GH2R)GH2(C=O)]3-NH2 e isómeros posicionales en donde L se selecciona a partir de una porción lípida no esterol que comprende al menos, una cadena alquenilo o alquilo grasa entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y una porción de esterol; cada grupo R es seleccionado independientemente de alquilo, aminoalquilo y aralquilo, y X se selecciona del grupo que consiste de un enlace directo, un oligopéptido, una cadena alquilo sustancialmente lineal de 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud, y una cadena sustancialmente lineal desde 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud que consiste de enlaces alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo que consiste de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter. 3. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha cadena grasa de alquilo o alquenilo es de entre aproximadamente 14 y 24 átomos de carbono de longitud.

4. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque L es un grupo fosfolípido, que tiene dos cadenas grasas de alquilo o alquenilo de entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud.

5. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque L es un grupo colesterilo.

6. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque R es isopropilo o 4-metoxifenilo.

7. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el vehículo de suministro comprende un conjugado lípido catiónico peptoide de la fórmula: L-(CH2)n-(C=0)-tN(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 en donde L se selecciona de (i) un grupo fosfatidiletanolamino, que tiene cadenas grasas alquilo o alquenilo de entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y (ii) un grupo colesterilo ligado al segmento adyacente -(CH2)n- por un éster, amida o enlace carbamato; n es 1-5; y R se selecciona de isopropilo y 4-metoxifenilo.

8. Composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el conjugado lípido catiónico peptoide se selecciona del grupo que consiste de compuestos representados en este documento como: Lipitoide 1, o Ll DMPE (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 2 , o L2 DMPE (NaeNiaNia) 3 Lipitoide 3, o L3 NtdNhd (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 4, o L4 NddNol (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 1, o Cl Chol-ß-ala- (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 3, o C3 Chol-ß-ala- (NaeNiaNia) 3 y combinaciones de los mismos.

9. Composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el conjugado lípido catiónico peptoide es una combinación de un lipitoide y un colesteroide .

10. Composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la relación de lipitoide: colesteroide es aproximadamente 5:1 hasta 1:5.

11. Composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la relación lipitoide : colesteroide es aproximadamente 1:1 hasta 1:3.

12. Composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el lipitoide es Ll y el colesteroide es Cl .

13. Composición de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la relación de lipitoide : colesteroide es aproximadamente 1:3.

14. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la relación molar de vehículo : siARN es aproximadamente 3.75nmol : 10Opmol .

15. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el siARN comprende un ARN de 21-23 meros dobles, a través de dos enlaces de nucleótido 3 ' -sobresaliente y fosfodiéster.

16. Composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el siARN comprende la secuencia representada por la SEC ID NO:l, a través de dos enlaces de nucleótido 3 ' -sobresaliente y fosfodiéster.

17. Método para inhibir la expresión de un gen objetivo en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar al sujeto, una composición como se menciona de conformidad con la reivindicación 1, en donde una hebra del siARN doble tiene una secuencia de nucleótido comprendida en un ARNm derivado del gen objetivo.

18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el vehículo de suministro comprende un conjugado lípido catiónico peptoide como se menciona de conformidad con la reivindicación 2.

19. Método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el vehículo de suministro es una combinación de un lipitoide y un colesteroide.

20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la relación de lipitoide : colesteroide es aproximadamente 5 : 1 hasta 1:5.

21. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la relación de lipitoide : colesteroide es aproximadamente 1 : 1 hasta 1:3.

22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el lipitoide es Ll y el colesteroide es Cl.

23. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el siARN comprende la secuencia representada por la SEC ID NO: 1, a través de dos enlaces de nucleótido 3 ' -sobresaliente y fosfodiéster.

24. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sujeto es una célula de mamífero o una línea celular.

25. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.

26. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sujeto es un humano.

27. Composición, caracterizada porque comprende: una mezcla de al menos dos conjugados lípidos catiónicos peptoides, cada uno de la fórmula: L-X-[N(CH2CH2NH2)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)-N(CH2CH2R)CH2(C=0)]3-NH2 e isómeros posiciones, en donde, en un primer compuesto, L es una porción lípida no esterol que comprende al menos una cadena grasa alquilo o alquenilo de entre aproximadamente 8 y 24 átomos de carbono de longitud, y, en un segundo compuesto, L es una porción esterol; cada grupo R es seleccionado independientemente de alquilo, aminoalquilo y aralquilo, y X se selecciona del grupo que consiste de un enlace directo, un oligopéptido, una cadena alquilo sustancialmente lineal desde 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud, y una cadena sustancialmente lineal desde 2 hasta aproximadamente 30 enlaces de longitud que consiste de enlaces alquilo y uno o más enlaces seleccionados del grupo que consiste de éster, amida, carbonato, carbamato, disulfuro, péptido y éter.

28. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la relación del primero al segundo compuesto es desde aproximadamente 5:1 hasta 1:5.

29. Composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la relación del primero al segundo compuesto en la composición es desde aproximadamente 1 : 1 hasta 1:3.

30. Composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la relación del primero al segundo compuesto en la composición es aproximadamente 1:1.

31. Composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la relación del primero al segundo compuesto es desde aproximadamente 1:3.

32. Composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque los conjugados lípidos catiónicos peptoides son seleccionados independientemente del grupo que consiste de compuestos representados en este documento como : Lipitoide 1, o Ll DMPE (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 2 , o L2 DMPE (NaeNiaNia) 3 Lipitoide 3, o L3 NtdNhd (NaeNmpeNmpe) 3 Lipitoide 4, o L4 NddNol (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 1, o Cl Chol-ß-ala- (NaeNmpeNmpe) 3 Colesteroide 3, o C3 Chol-ß-ala- (NaeNiaNia) 3 y combinaciones de los mismos .

33. Composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la composición consiste de Ll y Cl .