MXPA04005641A

MXPA04005641A - Metodo de produccion a gran escala de virus de hepatitis a.

Info

Publication number: MXPA04005641A
Application number: MXPA04005641A
Authority: MX
Inventors: Barrett Noel
Original assignee: Baxter Healthcare Sa
Priority date: 2001-12-10
Filing date: 2002-12-10
Publication date: 2005-04-19
Also published as: US6855535B2; CN1617923A; JP4537709B2; AU2002358663B2; WO2003049767A3; CA2469589A1; AU2002358663A1; EP1453957A2; JP2005511078A; WO2003049767A2; US20030108861A1; CN100374552C

Abstract

La presente invencion proporciona metodos de produccion a gran escala de Virus de Hepatitis A (VHA) sobre celulas VERO unidas a un microvehiculo. La invencion tambien proporciona metodos de aislamiento de VHA del sobrenadante de cultivo celular de celulas VERO infectadas de VHA.

Description

i MÉTODO DE PRODUCCIÓN A GRAN ESCALA DE VIRUS DE HEPATITIS A CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos de producción a gran escala de Virus de Hepatitis A (VHA) s'obre células VERO unidas a un microvehículo. La invención también proporciona métodos de aislamiento de VHA del sobrenadante de cultivo celular de células VE RO infectadas de VHA.

ANTECEDE NTES DE LA INVENCIÓN La Hepatitis A continúa produciendo casos esporádicos de j infección, muertes ocasionales y endémicas y es un problema de salud pública alrededor de todo el mundo. La infección se origina por el Virus de Hepatitis A (VHA), un miembro de la familia picornavirus, un grupo pequeño de virus de ARN no desarrollado, La partícula de virus es 27-32 nm en diámetro y se compone de tres polipéptidos divididos de una molécula de precursor de polipéptido único. El virus maduro se compone de polipéptidos VP1 , VP2 y VP3. Las proteínas cápsidas VP1 y VP3 contienen los sitios antigénicos principales y son capaces de inducir anticuerpos neutralizadores (Lemon et a1/. , 1989, ln :Semler et al. , eds. Molecular aspects of picornavirus and detection. Washington, DC: ASM p 1 93-208). El virus de hepatitis A (VHA) es el único virus hepatotrópico el cual puede aislarse del cultivo celular, pero el virus usualmente es difícil ! i I de propagar, con período largo de incubación y sin efecto citopático . Binn et al. (1984, J. Clinical. Microbiol. 20:28{33) probaron varios tipos de I célula de primate para la replicación de VHÁ y condiciones óptimas para el aislamiento y producción de grandes cantidades de virus. La producción libre de suero de VHA se mostró en las células BSC-1 , una estirpe de célula heterodiploide que hasta ahora no se ha utilizado para la preparación de vacunas para utilizarse en humanos. Después de 21 días de cultivo en frascos de rodillos, el antígeno de virus podría encontrarse en el sobrenadante y la fracción celular. ! Las células mantenidas en el medio libre de suero soportaron el crecimiento viral igual que aquel de las células mantenidas en el suero. Una vacuna de VHA candidato se obtuvo de células y del fluido de sobrenadanté de células BSC-1 infectadas mantenidas en el medio libre de sueroi (Binn et al. , 1986. J . Infect. I Diseases 1 53.759-756). Sin embargo, ' Simmonds et al. (1985, Appl. i Enviromental Microbiol. 49:759-755) no encontraron diferencia importante de la producción de VHA a diferente concentración de suero entre 2% y 1 5% en el medio con células AGMK o BSC-1 de células persistentemente infectadas. La producción de virus en las células AGKM primarias fue doble que en las células BSC-1 , pero HVA produjo la célula predominantemente asociada reducida y solamente cierto virus se encontró en el fluido de cultivo. Nasser et al. ( 1 987, Appl. Enviromental Microbiol . 53:2967-2971 ) reportaron que aproximadamente siete veces más de VHA i se produjo en el cultivo de células FRhK-4 en una mitad o menos del tiempo que se requirió para los cultivos BS-C1 , en donde la proporción del VHA asociado por célula contra las células BSC-1 liberadas de VHA se I calculó que fuera 80% a 20% , respectivamente. Flehmig et al. (1987. J. Medical iVirol. 22: 7-1 6) prepararon VHA I del sobrenadante de cultivo celular de fibroblastos embriónicos humanos normales persistentemente infectados crecidos en el medio que contiene suero. Utilizando estos métodos, se produjeron grandes cantidades de sobrenadantes en las fábricas de célula NUNC y el antígeno de VHA aislado del sobrenadante y purificado en múltiples etapas se utilizó para pruebas de vacunación. ' A pesar de que se han reportado que varios tipos de célula de primate soportan la replicación de VHA, tales como la estirpe de célula de riñón de mono rhesus fetal (FRhk-4), las células de riñon de mono verde Africano primarias (AGKM), células de iñón de mono verde Africano continuas (BCS-1 ), estas células generalmente no pueden utilizarse para vacuna humana debido a que se sabe que los ríñones de mono I frecuentemente tienen alto contenido de virus de simio latente. No pueden i utilizarse otras estirpes de célula debido a la naturaleza tumorogénica de estas células. La producción en masa de las estirpes celulares o células de riñón o fibroblasto, epiteliales humanas primarias para propagar el VHA se limita también por el bajo número de paso de estas células en el cultivo. De hecho, las directrices aplicables de la Organización Mundial de la Salud (OMS) indican que solamente se permiten pocas estirpes de célula para la producción de vacuna de virus. Una de las estirpes de célula' que se acepta actualmente y se i valida para la producción de una vacuna aplicable a humanos son las I células VERO. Las células VERO son ' estirpes de células de riñón de i mono continuas que se han autorizado para1 utilizarse en la elaboración de vacunas humanas y se utilizan actualmente para la producción de vacunas de rabias y poliomielitis. También se han hecho intentos para utilizar las células VERO para la producción de VHA, , pero se ha encontrado que la i replicación del VHA sobre las células VER0 se limita debido a que VERO I tiene una restricción de temperatura de crecimiento viral. Además, el virus I nunca se encuentra en los fluidos de 1 sobrenadante de las células infectadas (Locarnini et al. , 1981 , J . Viról. 37 :216-225). US 4,783,407 describe la producción de VHA sobre las células VERO en botellas de rodillos a una temperatura no mayor a 33°C para superar la restricción de temperatura. Se obtuvo el antígeno de VHA por congelación-deshielo de las células cultivadas y liberación del virus producido intracelular. Nunca se ha descrito una vacuna comercial a base de propagación de VHA sobre las células VERO. ¡' i Hasta ahora, se han producido vacunas de VHA inactivadas de formalina para ensayos clínicos (Andre et\ al. , 1990, In. Melnick (ed): Prog. i Med. Virol. Basel, Karger 37: 72-95, Armstrong er al. , 1993, J. Hepatology 18:20-26) y dos se encuentran comercialmente disponibles, las cuales i inducen la protección e inmunidad de larga duración de la infección i primaria. El proceso de elaboración de vacunas de virus completo de VHA inactivado actualmente disponibles utiliza la estirpe de célula de fibroblasto de pulmón embriónico humanó MRC-5 como células huésped en Fábricas de Célula Nunc (NCF), en donde el antígeno de VHA utilizado i para la producción de vacuna se obtiene del lisato de célula del virus intracelularmente producido, debido a qup el antígeno de VHA no se libera i ¡ ¡ eficazmente en el sobrenadante de cultivo y los métodos para concentrar el gran volumen son costosos (Bishop et al 1994. J. Virol. Meth. 47:203-216). Las preparaciones a gran escala de VHA de los lisatos de célula y los sobrenadantes de cultivo celular contienen poblaciones mezcladas de viriones y proviriones (Bishop et al., 1997. Árch. Virol. 142:2147-2160) y la vacuna comercialmente disponible comprende viriones maduros completos y partículas de provirión vacías (Andre 1990 supra, Armstrong 1993 supra).

Además, las células MRC-5 crecen lentamente en el cultivo de tejido y requieren suero de cabra fetal. ¦ Los problemas que se originan del uso de suero en el cultivo celular y/o aditivos de proteína derivados de una fuente humana o animal (por ejemplo, la calidad variante y composición de diferentes grupos y el riesgo de contaminación con el micoplasma, virus o agente BSE) se conocen bien. En general, las sustancias derivadas de suero o suero como albúmina, transferina o insulina pueden contener agentes indeseados que pueden contaminar los cultivos y los productos biológicos derivados de los mismos. Además, los aditivos derivados de suero humano tienen que probarse para todos los virus conocidos, como hepatitis o VIH, que pueden transmitirse por suero. El suero de bovino y los productos derivado del mismo, por ejemplo, tripsina, llevan el riesgo de contaminación de BSE.

Además, todo los productos derivados de( suero pueden contaminarse por agentes desconocidos. Por lo tanto, continúan haciéndose intentos de proporcionar sistemas de huésped eficaces y condiciones de cultivo que no requieran suero u otros compuestos derivados de suero. El proceso de producción es tan importante como el medio. El I único proceso que es económicamente viable es un proceso reactivo debido a que puede hacerse adecuado el aumento a escala al tamaño de mercado y la dosis de vacuna necesarias. Para las células adherentes, el proceso de vehículo con un microvehículo clásico es actualmente la mejor elección para la cultivación a gran escala dé las células necesarias para la propagación de virus. Los procesos actuales en base al cultivo de I microvehículo permite la producción de j antígeno viral utilizando los tamaños de termentador de hasta varios miles de filtros. i Widell et al. (1984, J. Virol,. Methods 8:63-71) utilizaron sistemas de cultivo celular de microvehículo de las células FRhk-4 para la I producción a gran escala de VHA y virus intra y extracelular encontrado. i La producción de virus por célula utilizando el sistema de microvehículo fue similar al cultivo convencional crecido en el frasco. Por el otro lado, Junker er al. (1992, Cytotechnol. 9:173-187) mostraron que las células MRC-5 infectadas de VHA unidas a los microvehículos Cytodex convencionales solamente produjeron 3p% de antígeno de VHA en comparación a las células crecidas en frascos debido a la tendencia de células MRC-5 para formar agregados de célula y microvehículo. WO 95/24468 describe las células MRC5 crecidas sobre los microvehículos revestidos de vidrio agregado para la producción de VHA en un sistema de perfusión, en donde el volumen de virus se encontró en las células. En el sistema descrito, las concentraciones mas altas de suero entre 2-10% permitieron mayor producción de VHA que, una baja concentración de nivel de 0,5-2% de suero. Sin embargo, cuando Aunins et al. (1997 ln:Carrondo et al. (eds), Animal Cell Technology, p.175-183) en comparación a I j I I diferentes tecnologías de fabricación tales como Fábricas de Célula Nunc (NCF), microvehículos, reactores mezclados estáticos y Cubos Celulares, encontraron que los microvehículos revestidbs por vidrio según se describe en WO 95/24468 permitieron la formación de agregados estables y la .1 producción de VHA. Sin embargo, las suspensiones de microvehículo monodisperso, no podrían mantenerse para la duración del cultivo, y la productividad del proceso de microvehículo de agregado de vidrio fue aproximadamente la mitad del cultivo estático bajo condiciones similares. i Aunins et al. 1997 (supra) concluyeron que¡ un cultivo de microvehículo de la estirpe de VHA utilizada, no fue viable. ' La demanda de mercado mundial para las vacunas VHA es en I atención a 100 Millones de dosis por año. jLa producción de vacuna eficaz requiere el crecimiento de cantidades a gran escala de virus producido en altas producciones de un sistema huésped.1 Las condiciones de cultivación y proceso bajo las cuales una estirpe de virus crece es de mayor importancia con respecto a lograr una producción alta aceptable de la estirpe. De esta manera, a fin de maximizar la producción del virus deseado, tanto el sistema como las condiciones de cultivación deben i adaptarse específicamente para proporcionar un ambiente que sea ventajoso para la producción del virus deseado. Por lo tanto, existe la necesidad continua de métodos eficaces y seguros para producir virus y antígeno. Además, existe la necesidad de un procedimiento para la propagación viral, empleando materiales que ya se encuentran disponibles y que requieren un número mínimo de manipulaciones consumidoras de tiempo, en donde la selección de una combinación de células huésped, medio de cultivo, condiciones de crecimiento y el sistema de producción esencial para lograr un proceso de producción eficaz.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la producción de antigeno de VHA. 1 i Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la producción de VHA en meclio libre de proteína y suero o I libre de suero. ¡ Otro objeto de la presente invención es proporcionarla para la producción de VHA sin el uso de una protelasa derivada de animal durante el subcultivo y pasando del cultivo celular. Otro objeto de la presente invención es proporcionarla para el i aislamiento de partículas de VHA completo. También otro objeto de la invención es proporcionar un cultivo celular VERO libre de proteína y suero o libre de suero infectado con VHA que continuamente producen antígeno de VHA. I I DESCRIPC IÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De acuerdo con estos y otros objetos, la presente invención proporciona un método para la producción ' continua de virus de Hepatitis A, I comprendiendo las etapas de proporcionar un cultivo celular libre de suero de células VERO unidas a un microveh ículo, infectar dicho cultivo celular i libre de suero de células VERO con VHA, incubar dicho cultivo celular infectado con VHA para propagar dicho VHA, mediante lo cual el VHA se i i libera continuamente en el medio de cultivo celular; y colectar dicho VHA liberado en el medio de cultivo celular. ' I De acuerdo al método de la ¡ invención, las células VERO unidas a un microvehículo crecen bajo condiciones de medio libre de suero a una temperatura de aproximadamente 37°C. Las células crecen de la ampolleta original de células VERO en biomasa a gran escala utilizada en un fermentador para la producción a gran éscala en medio libre de suero.

Antes de la infección con VHA, la temperatura de cultivo celular se reduce a aproximadamente 34°C y además la propagación de virus se realiza a esta temperatura. Las células VERO pueden unirse a un microveh ículo poroso o esférico durante el crecimiento de cultivo celular. El microvehículo puede ser un microvehículo seleccionado del grupo de microvehículos en base a dextrano, colágeno, plástico^ gelatina y celulosa y otros según se describe en Butler (1998. In: Spier & Griffiths, Animal Cell Biotechnology 3:283-303). Para el crecimiento de cultivo celular y durante la infección de virus, puede utilizarse el mismo tipo de microvehículo. Por lo tanto, de acuerdo a una modalidad de la invención, las células VERO libres de suero se cultivan y se infectan en microvehículos¡ esféricos. De acuerdo a otra modalidad de la invención, las células VERO libres de suero se cultivan y i se infectan sobre microvehículos porosos. También es posible que las células crezcan en una biomasa sob;re microvehículos esféricos y subcultivar las células cuando hayan alcanzado la biomasa final del I fermentador y antes de la infección sobre un microvehículo poroso o viceversa . De acuerdo a éste aspecto d la invención , las células VERO ' I ? libres de suero se cultivan sobre un microveh ículo esférico y se infectan con virus cuando las células se unen a imicroveh ículos porosos . Los microvehículos esféricos son aquellos seleccionados del grupo de superficie uniforme tales como Cytodex I®, Cytodex II® y Cytodexl l l® (todos Pharmacia) y microvehículos por!osos tales como Cytopore®, Cytoline® (todos Pharmacia). ' Las células VERO unidas a un' microvehículo se infectan con VHA a una multiplicidad de infección (m.o.í.) entre aproximadamente 0.01 i y aproximadamente 5. 1 í Se ha encontrado que bajo las condiciones anteriormente descritas, el VHA se libera continuamente en el sobrenadante de medio de cultivo celular. Esto fue inesperado debido a la técnica anterior que utiliza células VERO como huésped para VHA( describió que el VHA podía encontrarse solamente intracelularmente y el virus producido tenía que obtenerse de las células (US 4,783,407). ] Los métodos de la presente invención , proporcionan la producción de VHA, en donde el VHA se produce continuamente y se libera en el sobrenadante de cultivo celular. En el método de la invención, el VHA puede producirse por al menos 60 días. La técnica anterior no describe un sistema de cultivo celular que produce continuamente VHA durante tal período largo de tiempo. Al utilizar un sistema de cultivo de microvehículo y la perfusión de cultivo celular, el medio que contiene el virus se remueve continuamente del cultivo celular y el medio de cultivo fresco se agrega y se prefusiona continuamente. Los métodos de la invención proporcionan grandes volúmenes de medio de cultivo comprendiendo VHA que puede colectarse y purificarse del sobrenadante de cultivo celular. ' Los parámetros para las condiciones de cultivo celular óptimas se encuentran un pH entre aproximadamente 6.5 y aproximadamente 8.0, i una concentración de 02 entre aproximadamente 15% y aproximadamente 40%, una velocidad de agitación enjtre aproximadamente 20 y aproximadamente 70 rpm, y una temperatura a 34°C + 0.2°C o 37°C + 0.2°C. Las condiciones de cultivo sé mantienen preferentemente constantes durante el período de tiempo completo de producción de virus. El uso de un aislado de virus que se ha obtenido directamente de un cultivo celular infectado primario para la producción de vacuna de virus lleva el riesgo de contaminación mediante otro virus o un agente desconocido. La contaminación de la cepa de virus y el cultivo celular puede evitarse al utilizar una cepa de virus derivada de una cepa de VHA definida. ' Cualquier estirpe de VHA puede producirse de acuerdo al método de la presente invención. De acuerdo a una modalidad de la invención, las células se infectan con un virus de semilla de VHA que se obtiene al utilizar un cADN de VHA de longitud completa a ARN de VHA transcrito in vitro y las células VERO infectadas. Al utilizar un cADN que se codifica para la VHA para la producción de virus de semilla, se obtiene una cepa de virus homogénea, definida. 'El VHA utilizado como virus de semilla y la cepa de virus, por ejemplo, puede ser VHA HM175/7. Además del suero u otros aditivos de proteína utilizados para la cultivación celular, la adición de tripsina derivada de una fuente de i animal lleva el riesgo de contaminar el cultivo celular mediante agentes desconocidos. Usualmente, la tripsina de una fuente de animal se utiliza durante el subcuitivo y el paso de cultivos celulares para obtener biomasa celular. Para evitar cualquiera de las contaminaciones derivadas de un agente desconocido o fuente durante el proceso de producción de virus de VHA, en el método de la presente invención, una proteasa originada de i una fuente microbiana se utiliza preferentemente para la producción de biomasa celular de la ampolleta original. De acuerdo a un aspecto de la invención, el cultivo celular utilizado para la producción de VHA en la presente invención se subcultiva de la ampolleta original para el banco dé célula de trabajo y se pasa i mediante el uso de una proteasa microbiana o una actividad similar a la tripsina de una proteasa microbiana. , De acuerdo a una modalidad preferida, se utiliza una enzima como tripsina purificada de una proteasa! microbiana. En particular, la enzima similar a tripsina es tripsina Streptomyces griseus (SGT), una fracción purificada de Pronasa, se utiliza. La SGT purificada se obtiene preferentemente mediante un método de cromatografía de afinidad sobre benzamidina y elución de SGT purificada¡ con un agente de elución que comprende 0.5 a 1.2M dé arginina. Se ha encontrado que la SGT purificada por este método es muy eficaz y puede utilizarse con la carga i ! de proteína reducida al medio debido a su alta actividad específica. La SGT purificada de Pronasa mediante otros métodos conocidos en la materia así también pueden utilizarse en el método de la invención. Tales métodos incluyen aquellos descritos por Yokosawa ef al. (1976. J. i : í í i ¡¡ i ! ¡ Biochem. 79:757-763) u otros métodos cromatográficos. I De acuerdo a otra modalidad ¡preferida de la invención, se utiliza el medio de cultivo libre de proteína y suero para el cultivo celular y crecimiento. Al utilizar solamente las fuentes definidas, tales como el i ¦ ¡ medio mínimo sin adición de suero o proteínas como aditivos de crecimiento para la producción de biomasa ¡celular y propagación de virus, se proporciona un proceso dé producción dé vacuna de virus seguro. De acuerdo a otro aspecto, la invención proporciona un método i' i para aislar las partículas de virus de Hepatitis A completo, comprendiendo i las etapas de proporcionar un cultivo celular libre de suero de células VERO unidas a un microvehículo, infectarl dicho cultivo celular con VHA, incubar el cultivo celular infectado con' VHA para propagar el VHA, ! ' i mediante lo cual el VHA se libera continuamente en el medio de cultivo celular; colectar el VHA producido y liberado en el medio de cultivo celular, y aislar las partículas de VHA completo de dicha colección de VHA del sobrenadante de cultivo celular. El término "partícula de VHA completo" significa las partículas de VHA que contienen ARN de partícula^ de virión de VHA infeccioso, maduro, las cuales comprenden VP1, VP2i y VP3, y proviriones inmaduros que contienen polipéptido de precursor VP1 , VP3 y VPO. ! ' i Las partículas de VHA completo pueden aislarse mediante métodos bien conocidos en la materia, tales como métodos de filtración, centrifugación, sedimentación o cromatográficos. La centrifugación puede realizarse sobre un gradiehte de sucrosa' o gradiente CsCI. Antes de la centrifugación, pueden removerse fragmentos de célula más grandes, por i ejemplo, mediante filtración. ! i ; De acuerdo a otro aspecto, la invención proporciona un cultivo celular VERO libre de suero infectado de VHA unido a un microvehiculo, en donde las células unidas al vehículo continuamente producen y liberan el VHA hacia el medio de cultivó celular. El cultivo celular infectado de VHA de la invención puede liberar VHA continuamente por al menos 60 días. ! i De acuerdo a un aspecto preferido de la invención, se proporciona un cultivo celular libre de prot'eína y suero infectado de VHA del cultivo de células VERO unidas a uh microvehiculo, en donde las I células unidas al vehículo continuamente producen y liberan el antígeno de VHA en el medio de cultivo celular. , Habiéndose ahpra descrito esta invención, la invención se entenderá por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se proporcionan en la presente para propósitos de ilustración solamente y no 1 ¦ i se pretende que sean limitantes al menos que se especifique de otra forma. í EJEMPLO 1 Propagación d^ VHA sobre sistema celular de huésped VERO La estirpe de VHA HM175/7 (proporcionado típicamente por Robert Purcell, National Institute of Health, Bethesda, MD), la cual se ha aislado inicialmente mediante un espécimen clínico y se ha pasado serialmente en células de mono verde africano primario, que conducen a la atenuación de la estirpe de virus, se prueba para la propagación sobre el cultivo de microvehiculo de célula VERO, i í I i i I Las células VERO (Mono Verde Africano, Cercopthecus aethiops, riñon) se utilizan como estirpe cíe célula en producción. Las células se han obtenido de la Colección de Cultivo Celular Tipo Americano, i ¦ , Rockville, Maryland en un número de paso ,124 bajo la designación ATCC CCL 81. Las células se adajptan para crecer en medio libre de proteína y suero, libre de suero, o que contiene suero según se describe en Kistner er al., (1998 Vaccine 16:960-968) o WO 96/1:5231. Para el crecimiento en medio libre de suero, se utiliza un medi!o F12 de DMEM HAM básico complementado con sales inorgánicas, aminoácidos, bicarbonato de sodio (2g/l) y levadura o extracto de soya (1-10 g/l). El banco de célula de trabajo se prepara sin el uso de cualquier animal derivado de componentes de medio. Una ampolleta de un banco de células de trabajo (WCB) de células VERO cultivadas en medio DMEM mezclado con mezcla de nutriente F12 de Jamón eni una proporción 1:1 se vuelve a suspender en medio que contiene suero y, en medio libre de suero complementado ya sea con extracto de levadura o soya (0.1 a 10%). La subcultivación se realiza al utilizar la tripsina Streptomyces griseus purificada (1 µg/ml) para evitar cualquier agente derivado de una fuente animal que podría comprender cualquier agente de origen' patogénico. Después de la subcultivación en botellas de rodillos y Roux, 6-8 x 107 células/gramo de microvehículo (Cytodex III®, Pharmacia) se inoculan en un fermentador de tanque agitado 12 I. Las células crecen a 37°C por 6-8 días. Las condiciones de cultivo de saturación de oxígeno 20% +/- de 10% y pH 7.1 +/- 0.2 se mantienen constantes y la velocidad de agitación de 30-60 rpm. Al i í I i i segundo día después de la inoculación a una densidad celular de 6x 1 05 a 1 x 1 06 células/ml , una suspénsión de virus de VHA HM1 75/7 con una multiplicidad de infección (m.o. i.) entre Ó.1 y 1 .0 se bombea en el termentador a una temperatura ya sea de 34°C o 37°C. Después de dos horas para permitirse para la absorción de virus, se inicia la perfusión de medio. La mitad del volumen del termentador se intercambia contra el medio fresco cada día . El microvehículo y las células unidas se retienen en el fermentador mediante una criba. Durante el proceso de fermentación , pH 7.1 , 02 (30%), velocidad de agitación 30-60 rpm) y temperatura de 34°C o 37°C, se controlan. La Fig. 1 A muestra el VHA producido sobre células VERO a 34°C en medio libre de suero y el medio que contiene suero (FCS) . La Fig . 1 B muestra el VHA producido sobre células VERO a 37°C en medio libre de suero y el medio que contiene suero (FCS). En los d ías 7, 14, 21 y 28 después de la infección , la cantidad de antígeno producido se determina en el sobrenadante de cultivo celular y en el comprimido celular por medio i de un ensayo ELISA específico de VHA (Médiagnost). La concentración de antígeno por células VERO 1 07 se determina en el sobrenadante de cultivo i celular. Las unidades ELISA (EU) se calculan como el valor recíproco de la dilución de antígeno más; alta que da una reacción positiva en el ensayo ELISA. I La estirpe de VHA HM 1 75/7 sobre las células VERO se replica mejor a temperatura más baja de 34°C qué a 37°C, y mejor en la ausencia que en la presencia de suero (Fig. 1 A y 1 B). A 37°C en el medio que ; i contiene suero, no puede observarse producción de antígeno viral, en ¡. i donde a 37°C en el medio libre de suero (á m.o.i. mayor), se produce el virus. Siguiendo la infección de células VERO libres de suero con VHA m.o.i. se detecta 0.1 o 1 de cantidades aumentadas en el sobrenadante y comprimido celular desde la 3ra semana después de la infección a 34°C (Fig. 1A). En cultivo celular crecido a 34CC; en medio que contiene suero, el antígeno viral se encuentra dominante en el comprimido celular, mientras que sobre las células VERO cultivadas a 34°C en medio libre de suero, el antígeno viral se libera continuamente en el sobrenadante de cultivo celular, en donde a aproximadamente 50% del antígeno viral se i encuentra en el sobrenadante del medio de cultivo.

I EJEMPLO 2: Preparación de i cepa de virus de VHA para la producción a gran escala El cADN de longitud completa' del genoma de cepa atenuado HM175/7 clonado en el plásmido bacteriano pHAV/7 (Cohén et al., 1987, J. Virol. 61:3035-3039) se utiliza para preparar el ARN genómico de longitud completa mediante la transcripción in vitro. Las células VERO libres de suero a 34°C se transfectan con ARN de VHA transcrito in vitro para generar las cepas de virus; libres de agentes adventicios. Después de 6 semanas, el antígeno específico de VHA se detecta en el lisato de células infectadas que se utilizan para propagar más el VHA sobre células VERO bajo condiciones libres de suero. La Tabla 1 muestra la concentración de i virus y antígeno producida después de los pasos seriales. Las células infectadas liberaron aproximadamente 50% del antígeno viral en el sobrenadante de célula. Después del 4o paso, la cepa de virus tiene una concentración de 8 x 107 TCID5o/ml.

TABLA 1 : ¡ Concentración de Virus y Antígeno de pasos seriales de estirpe de VHA HM175/7 después de la transfección de células VERO libres de suero La cepa de virus HM175/7 obtenida después de los pasos seriales se utiliza para la producción a gran escala del antígeno de VHA sobre sistema de microvehículo.

EJEMPLO 3: 1 Propagación de, VHA HM175/7 sobre células VERO en medio libre de suero ! VHA H 175/7 según se obtiene de acuerdo al Ejemplo 2 se pasa serialmente en células VERO libres de suero a 34°C. En el día 7, 14, y 21 después de la infección, la concentración de virus y la cantidad de antígeno se determina (Tabla 2). i TABLA 2: Propagación de estirpe de VHA HM175/7 sobre células VERO libres de i í suero a 34°C Las concentraciones de virus de 5 x 108 y 2 x 109 por 5 x 107 células se obtienen en el comprimido celular y el sobrenadante de cultivo I celular, respectivamente. Esto demuestra que el antígeno viral se libera I persistentemente en el sobrenadante de cultivo celular mediante las células VERO libres de suero. Tres semanas de post infección (p.i.), el porcentaje del antígeno viral en el sobrenadante de cultivo celular es aproximadamente 50%, mientras que aproximadamente 75% de la infectividad se ubica ahí (Tabla 2). ' i i EJEMPLO 4: , Producción de l VHA en las células VERO libres de suero propagadas sobre Microvehículo Un fermentador de 6 I que comprende 2 x 1010 de células VERO crecidas en microvehículo (Cytodex III®, Pharmacia) en medio libre de suero se infecta con la estirpe de VHA HM175/7 obtenida de acuerdo al Ejemplo 2 con un m.o.i. de 0.5. Durante un proceso de fermentación a I ¡ largo plazo a 34°C, la cantidad de antígeno en las células y en el ? sobrenadante de cultivo celular se determina repetitivamente. Para I determinar el VHA producido intracelularmente, las células VERO del cultivo celular se colectan y se ajustan a una densidad de célula de 2 x 107 I ! células/ml en PBS y se destruyen por lisis por tres ciclos de ! I congelación/descongelación. Después de la centrifugación a baja velocidad, la concentración infecciosa en los residuos celulares y el sobrenadante de cultivo celular se determina así como también la cantidad de antígeno por ensayo ELISA. Desde el día 1 1 después de la infección, se detecta cantidades crecientes progresivas del antígeno de VHA en el sobrenadante de cultivo celular. El proceso de fermentación sé realiza continuamente y las muestras se toman durante1 un período de 35 días (Tabla 3). En este momento, las células todavía se encuentran viables y producen antígeno de VHA. El sobrenadante del día 23 a 35, se agrupa y la cantidad total de antígeno de VHA producido se calcula que es 2,5 x 106 de unidades ELISA.

TABLA 3: Producción de Antígeno de cultivo celular de microvehículo VERO infectado i ¡ i I EJEMPLO 5: | ! Establecimiento del proceso de producción de VHA a gran escala I Para establecer el proceso de fermentación a gran escala, se investigan diferentes estrategias para la propagación de VHA. Las células VERO subconfluentes, propagadas bajo las condiciones libres de suero, se cultivan en diferentes tipos de microvehículos de microvehículo poroso o esférico, tal como Cytodex III®, Cytoline® o Cytopore®, todos los tipos siendo adecuados para el proceso de cultivación a largo plazo: ! Dos días después de que las células se han cultivado sobre los diferentes tipos de microvehículos, las células VERO se infectan con VHA m.o.i. de 1.0. La propagación celular se realiza en un fermentador de 10 I a 34°C con perfusión continua de medio de crecimiento libre de suero o libre de suero y proteína. Durante la fase de cultivación, el sobrenadante de cultivo celular se prueba para el antígeno de VHA. Los datos se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4: Producción de Antígeno de VHA (en EU/ml) después de la propagación de células VERO! sobre diferentes microvehículos infección. El antígeno de virus obtenido se calculó por una producción promedio de dosis de vacurla de un fermentador de 100 I por I de medio por 60 días y se resume en la Tabla 5.

TABLA 5: Producción de VHA sobré células VERO y cálculo de productividad para la Escala 100 I : Purificación de antígeno de VHA del sobrenadante de cultivo celular El sobrenadante de cultivo celular colectado del medio de cultivo de perfusión según se describe en el Ejemplo 6 que comprende antígeno de VHA, se separa de los residuos celulares a baja velocidad de centrifugación o filtro profundo, y se concentra por ultrafiltracion utilizando una membrana de 50 K Ómega (cierre de 50 000 Da, Fíltron). El concentrado se purifica además por centrifugación sobre un 20%-60% de gradiente de sucrosa y se fracciona. Cada fracción se prueba para el antígeno de VHA mediante un ensayo ELISA cualitativo (Mediagnost). El antígeno de VHA se instalo en dos fracciones de valor máximo. Las fracciones de valor máximo se agrupan por separado y se concentran por centrifugación a alta velocidad. Durante el proceso anteriormente descrito, la cantidad de antígeno y el contenido de proteína se determina. Las dos fracciones agrupadas de valor máximo se analizan por análisis de mancha Western con anticuerpos específicos para los polipéptidos de VHA VPO, VP1 y VP3 así como también una mezcla de los mismos. Las fracciones agrupadas de valor máximo 12-19 consisten de viriones maduros (debido a la presencia de la proteína cápsida VP2 y la ausencia de VPO). Las fracciones I agrupadas de valor máximo 22-25 contienen proviriones y/o preproviriones. I Esto muestra que mediante el proceso descrito, el VHA se libera continuamente en el medio de cultivo celular mediante las células VERO persistentemente infectadas en medio libre de proteína y suero o libre de suero durante el proceso de elaboración a gran escala. Las fracciones respectivas 12-19 y 22-25 se colectan, la preparación de virus se somete al método de inactivación de virus y la preparación inactivada se formula en una composición de vacuna.

EJEMPLO 8 Purificación de tripsina Streptomyces griseus de Pronasa: A. Cromatografía de Intercambio de lón 30 g de Pronasa (Boehringer Ingelheim) se disolvió en el Regulador A (0.02 piridina, pH 5.0) en una concentración final de 40 mg/ml I de Pronasa. 25 mi de la solución se sometió a la cromatografía de intercambio de catión sobre CM Sefarosa Cl 6B (Pharmacia) equilibrada j con regulador A). La elución se realizó a temperatura ambiente utilizando un gradiente lineal con el regulador A (0.02 de piridina) y regulador B (0.75 M de piridina pH 5.0) con 5 veces el volumen de columna. Las fracciones colectadas se probaron para las propiedades de inhibición al mezclar las muestras de las fracciones con inhibidor de soya j en una proporción 1 : 1 0 (por ¡ejemplo, 1 mg de inhibidor de soya/100 µg de proteína) seguido por un ensayo de sustrato cromatográfico utilizando S2222. Los resultados se expresaron como unidades de absorción ? por minuto (? A/min). La fracción que tiene la actividad inhibidora más alta para el inhibidor de soya se analizó más por SDS-PAGE y se coloreó con Comasí. La actividad de tripsina se midió por ensayo cromogénico utilizando éster de etilo N-bénzoil-L-arginina (BAEE, en regulador Tris pH 8.0, 20 mM de CaCI2, 25°C) a medida que se determina el sustrato y unidades de absorción ? por minuto. Como una referencia de control, se utilizó una solución de tripsina de porcino (1 mg/ml) con una actividad específica de 1 3 x 1 03 U/mg. La actividad específica se definió como las unidades de actividad de enzima de tripsina por mg de proteína . Los resultados se resumen en la Tabla 7. La actividad de quimotripsina se midió por ensayo cromogénico utilizando hidrocloruro de carboximetoxipropionil-L-arginil-L-propil-L- B. Cromatografía de afinidad sobre benzamidina inmovilizada Una columna de rápido flujo d|e Sefarosa 6B de Benzamidina (Pharmacia) equilibrada con el regulador A (50 mM de Tris, 0.5 M de NaCI pH 7.0) se cargó con 40 mi de una solución de Pronasa (75 mg/ml, regulador A). La elución se realizó con e ÍlI U Reeggiulador B (50 mM de Tris, 0.5 M de NaCI pH 7.0, 10 inM de hidrocloruro de benzamidina pH 7.0), regulador C (0.5 M de NaCI, 0.6M de argiriina , pH 5.5) o regulador D (0.5 M de NaCI, 1M de arginina, pH 5.5) Las fracciones colectadas se probaron para las propiedades inhibidoras utilizando el inhibidor de soya así como también la actividad de quimotripsina y tripsina según se describe en el Ejemplo 8A. La actividad específica se determinó como unidades de actividad de enzima por mg de proteína. TABLA 7 Purificación de Pronasa por cromatografííaa de afinidad sobre benzamidina inmovilizada y elución con benzamidina Cromatografía de afinidad y elución cor i benzamidina (Regulador B) Pronasa Strepromyces Pronasa no p urificada Fracción Purificada griseus Proteína (g) 3 0.13 Actividad Específica U/mg 1.6 x 1 O3 19 x 103 Recuperación U en % 100 60 Estabilidad por SDS-PAGE estab e estable Inhibición por inhibidor de n.d. 99.98 + 0.1% soya (% de inhibición) Actividad de quimotripsina n.d. 0.1 (? A/min) Los resultados resumidos en la Tabla 7 muestran que por elución competitiva con benzamidina, 60 í.> de la actividad similar a la tripsina purificada de Pronasa se recuperó |con una actividad específica de aproximadamente 140 U^g j de proteína, Sin embargo, la fracción que contiene proteasa similar a la tripsina (purificada se purifica además preferentemente y la benzamidina se remueve antes de utilizarse en procesos que incluyen el crecimiento de cultivo celular o la producción de biológicos para la aplicación en humanos TABLA 8 Purificación de Pronasa por c romatpgrafía de afinidad sobre ? benzamidina inmovilizada y elución con 0.6M de arginina y 1M de arginina Cromatografía de afinidad y elución con 0 .6M de arginina (Regulador C) Pronasa Strepromyces Pronasa no p Lirificada Fracción Purificada griseus Proteína (g) 3 0.13 Actividad Específica U/mg 1.6 x 1 O3 26 x 103 Recuperación U en % n.d. 63 Estabilidad por SDS-PAGE i establ e estable Inhibición por inhibidor de n.d. 99.89 + 0.1% soya (% de inhibición) Actividad de quimotripsina n.d. <0.1 (? A/min) Cromatografía de afinidad y elución con 1M de arginina (Regulador D) Pronasa Strepromyces Pronasa no p urificada Fracción Purificada griseus Proteína (g) 3 0.13 Actividad Específica U/mg 1 .6 x 1 )3 46.5 x 1 03 Recuperación U en % n .d . 71 % Estabilidad por SDS-PAGE establ estable Inhibición por inhibidor de n .d . 99.99 + 0.1 % soya (% de inhibición) Actividad de quimotripsina n .d . <0. 1 (? A/min) LAL (EU/1 000 U) 88 <4 Según puede observarse de os resultados en la Tabla 8, aproximadamente 63% de la actividad sinhilar a la tripsina inicial de la Pronasa se recuperó cuando se utiliza un ifegulador que comprende 0.6 M de arginina, mientras que aproximadame|nte 71 % se recupera con un regulador que comprende 1 M de arginina. La SGT purificada eluida con arginina de un vehículo dé afinidad de benzamidina también tuvo una actividad específica más alta en comparación a la SGT obtenida por cromatografía de intercambio de ión o e ución con benzamidina de un vehículo de benzamidina. Además, un producto de la actividad específica y pureza más alta se obtuvo cuando se utilizó un regulador que comprende aumentar la molaridad de arginina. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero no limitan su alcance, Otras variantes de la invención serán fácilmente aparentes por un experto en la materia y se comprenden por las reivindicaciones anexas. Todas lab publicaciones, las patentes, y las solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan en la presente para referencia en todos los propósitos

Claims

REIVINDICACIO NES método para la prod ucción continua de virus de Hepatitis A, comprendiendo lias etapas de proporcionar un cultivo celular libre de suero de células VERO unidas a un microvehículo, infectar dicho cultivo celular libre de suero de células V RO unidas a un microvehículo con VHA, incubar dicho cultivo celular libre de suero de las células VERO unidas a un microvehículo e infectadas con VHA para propagar dicho VHA, mediante lo cual el VHA se¡ libera continuamente en el medio de cultivo celular; y colectar dicho VHA liberado en el medio de cultivo celular, en donde el microvehículo se selecciona del grupo que consiste de microvehículos porosos y esféricos. 2. El método según la ijeivindicación 1 , caracterizado porque dichas células crecen a una temperatura de aproximadamente 37°C. 3. El método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha temperatura sé reduce a apr|oximadamente 34°C antes de la i i infección . 4. El método según cualqul piera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los microvehículos comprenden dextrano, gelatina, colágeno, plástico o celulosa. 5. El método según cualquliera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las células se infectan con un virus de semilla de estirpe de VHA H 1 75/7. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las células se infe ctan con VHA a una multiplicidad 14. Un cultivo celular libre do proteína y suero infectado de VHA de células VERO unidas a un microvehículo, en donde dichas células unidas a dicho vehículo liberan continuamente el antígeno de VHA en el medio de cultivo celular, en donde el mi crovehículo se selecciona del ' i grupo que consiste de microvehículos porosos y esféricos.