CN102492659A - 一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：细胞的复苏和传代扩增；接种甲肝病毒种子；维持培养感染甲肝病毒的细胞；检测病毒感染复制情况；终止培养，弃维持液，收获培养感染细胞；收集细胞悬液；将细胞悬液提取、纯化。本发明不仅操作简单，生产强度不大；而且实现了基质细胞的高密度大规模培养，提高了甲肝疫苗的产量和质量稳定性，避免了常规生产工艺中由于人工操作带来的污染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种甲肝病毒的生产方法。
背景技术
甲型肝炎简称甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的传染病，本病传播以粪-口途径为主，甲肝病毒随粪便排出体外，可通过日常生活接触、经水、食物等方式经口传播，发达国家主要通过人与人接触传播，经污染水源、食物传播常发生在发展中国家和地区，最突出的例子是上海两次甲型肝炎大爆发，均因食用未经煮熟的毛蚶引起，1983年第一次爆发时有2万人发病，1988年春季，患者近30万，给国家经济和人民健康造成严重损失。
目前国内主要采取的生产方式是采取的转瓶式和细胞工厂等容器静态低密度培养方式培养病毒抗原，再通过纯化等工艺制备甲肝疫苗，该生产工艺存在着生产水平低下，工艺参数不够稳定，同时操作复杂，生产强度大，易发生污染等缺点。同时由于传统生产工艺批量较小，从而导致疫苗产品批间差异大，产品质量稳定性不够好。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供了一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法。
为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用微载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为106个/ml以上时，弃培养液，按照0.001～0.01MOI的比例混合接种甲肝病毒种子；
步骤三：维持培养感染甲肝病毒的细胞：用维持液维持培养感染甲肝病毒的细胞，每天更换维持液，维持培养14～28天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用无菌注射用水或低渗溶液溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从微载体上剥离，筛网分离微载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述步骤一的细胞为人二倍体细胞株，传代细胞系和原代培养细胞中的任一种。
进一步的技术方案是，所述人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种。
进一步的技术方案是，所述传代细胞系为Vero细胞。
进一步的技术方案是，所述步骤一的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体和片状纤维结构载体中的任一种。
进一步的技术方案是，所述步骤二的甲肝疫苗生产用病毒种子为甲型肝炎病毒HM175株。
进一步的技术方案是，所述步骤三维持液为MEM维持液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用微载体生物反应器培养细胞，实现了基质细胞的高密度大规模培养，提高了甲肝疫苗的产量和质量稳定性。
(2)本发明避免了常规生产工艺中由于人工操作带来的污染。
(3)本发明在线检测保证了所收获的病毒培养物的高表达，保证了生产质量。
(4)本发明操作简单，生产强度不大。
具体实施方式
实施例1
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用颗粒状实心微球载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为106个/ml时，弃培养液，按照0.001MOI的比例混合接种甲型肝炎病毒HM175株；
步骤三：维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞：用MEM维持液维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞，每天更换MEM维持液，维持培养14天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃MEM维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用无菌注射用水溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从颗粒状实心微球载体上剥离，筛网分离颗粒状实心微球载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述细胞为人二倍体细胞株WI-38。
实施例2
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用多孔性微球载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为107个/ml时，弃培养液，按照0.01MOI的比例混合接种甲型肝炎病毒HM175株；
步骤三：维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞：用MEM维持液维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞，每天更换MEM维持液，维持培养28天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃MEM维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用无菌注射用水溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从多孔性微球载体上剥离，筛网分离多孔性微球载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述细胞为人二倍体细胞株KMB17。
实施例3
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用颗粒状实心微球载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为106个/ml时，弃培养液，按照0.001MOI的比例混合接种甲型肝炎病毒HM175株；
步骤三：维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞：用MEM维持液维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞，每天更换MEM维持液，维持培养14天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃MEM维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用无菌注射用水溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从颗粒状实心微球载体上剥离，筛网分离颗粒状实心微球载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述细胞为人二倍体细胞株KMB17。
实施例4
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用网状纤维结构载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为106个/ml时，弃培养液，按照0.001MOI的比例混合接种甲型肝炎病毒HM175株；
步骤三：维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞：用MEM维持液维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞，每天更换MEM维持液，维持培养14天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃MEM维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用低渗溶液溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从网状纤维结构载体上剥离，筛网分离网状纤维结构载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述细胞为Vero细胞系。
实施例5
一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用片状纤维结构载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为108个/ml时，弃培养液，按照0.01MOI的比例混合接种甲型肝炎病毒HM175株；
步骤三：维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞：用MEM维持液维持培养感染甲型肝炎病毒HM175株的细胞，每天更换MEM维持液，维持培养28天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃MEM维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用低渗溶液溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从片状纤维结构载体上剥离，筛网分离片状纤维结构载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
进一步的技术方案是，所述细胞为原代培养细胞。
Claims (7)
1.一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：依次包括以下步骤：
步骤一：细胞的复苏和传代扩增：将细胞复苏，并采用微载体生物反应器培养细胞；
步骤二：接种甲肝病毒种子：当细胞浓度为106个/ml以上时，弃培养液，按照0.001～0.01MOI的比例混合接种甲肝病毒种子；
步骤三：维持培养感染甲肝病毒的细胞：用维持液维持培养感染甲肝病毒的细胞，每天更换维持液，维持培养14～28天；
步骤四：检测病毒感染复制情况：从第14天开始，每天抽样，采用免疫荧光法测定细胞中的病毒抗原，检测病毒感染复制情况；
步骤五：终止培养：在病毒感染、复制高峰期终止培养，弃维持液，收获培养的感染细胞；
步骤六：收集细胞悬液：采用无菌注射用水或低渗溶液溶胀破裂细胞，并辅以搅拌，将细胞从微载体上剥离，筛网分离微载体，收集细胞悬液；
步骤七：将细胞悬液提取、纯化。
2.根据权利要求1所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述步骤一的细胞为人二倍体细胞株，传代细胞系和原代培养细胞中的任一种。
3.根据权利要求2所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述人二倍体细胞株为WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一种。
4.根据权利要求2所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述传代细胞系为Vero细胞。
5.根据权利要求1所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述步骤一的微载体为颗粒状实心微球载体、多孔性微球载体、网状纤维结构载体和片状纤维结构载体中的任一种。
6.根据权利要求1所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述步骤二的甲肝疫苗生产用病毒种子为甲型肝炎病毒HM175株。
7.根据权利要求1所述的一种疫苗生产用甲肝病毒的生产方法，其特征在于：所述步骤三维持液为MEM维持液。
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