MXPA04000653A - Adhesinas de meningococcus nada, app y orf 40. - Google Patents

Abstract

NadA, App y ORF40 funcionan como adhesinas en N. meningitidis. La adhesion puede ser modulada por objetivar estas tres proteinas. Se describen las variantes alelicas NadA. Se describe una escision autoproteolitica de App, como es la eliminacion de la actividad por mutagenesis. App se procesa y secreta en medio de cultivo cuando se expresa en E coli. Se describen las proteinas de App maduras. Se describen los mutantes bloqueadas. Se describen las vesiculas a partir de huespedes no Neisseriales con expresion de adhesina heterologa.

Description

ADHESINAS ?? ENINGOCOCCUS NADA, APP Y O F 40 Campo de la Invención Esta invención está en el campo de la bioquímica y, en particular, la bioquímica de la bacterias patogénicas en el género Neisseria (por ejemplo N. meningitidis y N. gonorrhoeae) . Antecedentes de la Invención Las solicitudes de Patente Internacional WO 99/24578, W099/36544, WO 99/57280 y WO 00/22430 describen proteínas a partir de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. La secuencia del genoma completa de N. Meningitidis del serogrupo B ha sido publicada (Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815) y ha sido sometida a análisis con el fin de identificar antígenos de vacuna (Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820). Se describen los procedimientos para expresión de las proteínas en la solicitud WO 01/64922. La secuencia del genoma completa del N. meningitidis del serogrupo A es también conocida (Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506). Los datos de secuencia solos, sin embargo, no revelan nada acerca de este patógeno. Los objetos de la presente invención incluyen: (a) proporcionar formas para intervenir en la bioquímica de Neisseria; (b) proporcionar nuevos usos para proteínas de Neisseria conocidas; (c) proporcionar formas alternativas y mejoradas de proteínas de RER153186 Neisseria conocidas, tales como formas inactivas enzimáticamente de proteínas conocidas o productos proteolíticos de proteínas conocidas; y (d) proporcionar materiales útiles para estudiar y modular adhesión Neisserial . DESCRIPCION DE LA INVENCION Nomenclatura usada en la presente Se describe "ORF40" en el ejemplo 1 de la solicitud WO 99/36544. Las secuencias de los serogrupos A y B de N. meningitidis se describen (SEQ ID NO. 1 a 6 en la misma) . Se describen otras formas de la proteína en las solicitudes WO 99/31132 y WO 99/58683, y pueden ser encontradas también en GenBank (véase los números de acceso de gi; 11352902, 7228562, 14578015, 12958107, 7228586, 7228572, 7228594, 7228588, 14578013, 7228568, 7228546, 7228548, 7228592, 14578009, 7228558, 7228600, 7228596, 7228542, 7228574, 7228552, 7228554, 14578023, 14578021, 11354080, 7228584 y 7228590) . Se describe "App" (proteína de adhesión y penetración) como "ORF1" en el ejemplo 77 de la solicitud WO 99/24578. Se describen las secuencias de los serogrupos A y B de N. meningitidis y de N. gonorrhoeae (SEQ ID NO 647 a 654 en la misma) . Se describen otras formas de la proteína en la solicitud WO 99/55873, y puede ser encontrada en GenBank (véase los números de acceso gi : 11280386, 7227246, 11071865, 11071863, 11280387, 7379205) . Se describe "NadA" (Adhesina A Neisserial) a partir del serogrupo B de N. weningitidis como la proteína "961" en la solicitud WO 99/57280 (SEQ ID NO 2943 y 2944) y como "NMB1994" , por Tettelin et al. (véase también GenBank números de acceso 11352904 y 7227256) y en la Figura 9 en la presente . Se expresan estas proteínas preferentemente de otra forma como proteínas de fusión (por ejemplo, sin GST, MBP, is-tag o similar) . Las proteínas preferidas para uso de acuerdo a la invención son aquellas del serogrupo B de N. meningitidis cepa MC58, cepa 2996 o cepa 394/98 (una cepa de Nueva Zelanda) . Se apreciará, sin embargo, que la invención no se limita generalmente por una cepa - pueden ser tomadas referencias a una proteína particular (por ejemplo, "ORF40", "App" etc) para incluir aquella proteína a partir de cualquier cepa. En general, por lo tanto, la referencia a cualquier proteína en particular incluye proteínas las cuales comparten identidad de secuencia con una de las secuencias descritas anteriormente. El grado de "identidad de secuencia" es mayor preferentemente a 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) . Esto incluye mutantes y variantes alélicos . En el contexto de la presente invención, se determina preferentemente identidad de secuencia por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de espacio de afinidad con parámetros penalidad de espacio abierto=12 y penalidad de extensión de espacio=l. Típicamente, 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera para ser una indicación de equivalencia funcional . Las convenciones de nombre usados en las solicitudes WO 99/24578, WO 99/36544 y WO 99/57280 también se usan en la presente (por ejemplo "ORF4", "ORF40", "ORF40-1", etc como se usa en la solicitud WO 99/24578 y WO 99/36544; "m919", "g919", y "a919" etc como se usa en la solicitud WO 99/57280) . App secretada Se ha descubierto que, cuando se expresa en E. coli sin un patrón GST o de fusión his-tag, se exporta App a la membrana externa como un precursor de aproximadamente 160 kDa, donde se procesa y se secreta en el cultivo. La invención por lo tanto proporciona un método para purificar proteína App procesada, el cual comprende las etapas de expresar un gen que codifica la proteína App en una célula huésped no Neisseria; y purificar proteína App procesada a partir del medio de cultivo. La invención también proporciona proteína purificada obtenible por este proceso . La proteína App incluye preferentemente su péptido de señal de 42 residuos del tipo silvestre en la terminación N es decir no se usa el patrón de fusión de la terminal N. Se prefiere también no incluir un patrón de fusión de la terminal C. Para purificar la proteína a partir del medio de cultivo, el cultivo puede ser centrifugado y la proteina puede ser recuperada del sobrenadante. La célula huésped no Neisseria es preferentemente una bacteria y es más preferentemente E. coli . Se conocen en la técnica las técnicas de expresión bacterianas . Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de enlazar ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción corriente abajo (3^) de una secuencia de codificación (por ejemplo gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción la cual se coloca usualmente próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción usualmente incluye un sitio de enlace de ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio llamado un operador, que puede traslapar un sitio de enlace de ARN polimerasa adyacente en la cual inicia la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativa (inducible) , ya que una proteína represora de genes puede enlazar el operador y por lo mismo inhibir la transcripción de un gen específico.

La expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos regulatorios negativos, tal como el operador. Además, puede ser lograda regulación positiva por una secuencia de enlace de proteína activadora de genes, la cual, si está presente es usualmente próxima (5') a la secuencia de enlace de ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP) , la cual ayuda a iniciar la transcripción del operon lac en Escherichia coli [E. coli) ( aibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet . 18:173) . La expresión regulada puede por lo tanto ya sea ser positiva o negativa, por lo mismo ya sea incrementa o reduce la transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de via metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas de metabolización de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) (Chang et al. (1977) Nature 198:1056) y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triftófano (trp) (Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucí. Acids Res. 9:731; Patente de los Estados Unidos 4,738,921; Patente Europea 0036776 y Patente Europea 0121775) . El sistema promotor g-laotamasa (bla) (Weismann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" In Interferon 3 (ed I. Gresser) ) , bacteriófago lambda PL (Shimatake et al . (1981) Nature 292:128) y T5 (Patente de los Estados Unidos 4,689,406) sistemas promotores también proporcionan secuencias promotoras útiles. Además, los promotores sintéticos los cuales no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, pueden ser unidas las secuencias de activación de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago con las secuencias de operon de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético (Patente de los Estados Unidos 4,551,433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp-lac híbrido comprendido de tanto el promotor trp y las secuencias de operon lac que se regulan por el represor lac (Amann et al . (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc . Nati. Acad. Sci . 80:21). Adicionalmente, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se encuentran en forma natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de enlazar ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se encuentra en forma natural de origen no bacteriano puede también ser acoplado con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de expresión de algunos genes en procariotes . El sistema ARN polimerasa T7/promotor de bacteriófago es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol . 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. 82:1074). Además, un promotor híbrido puede también estar comprendido de un promotor bacteriófago y una región operadora de E. coli (Patente Europea 0 267 851) . Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de enlace de ribosoma eficiente es también útil para la expresión de genes extraños en procariotes . En E. coli, el sitio de enlace de ribosoma es llamada la secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos en longitud ubicados 3-11 nucleótidos corriente arriba del codon de inicio (Shine et al. (1975)) Nature 254:34). La secuencia SD es pensada para promover el enlace de AK m al ribosoma por el emparejamiento de bases entre las secuencia SD y AKNr 1SS de E. coli ? 3". (Steitz et al. (1979) "Genetic signáis and nucleotide sequences in messenger RNA" . In Biological Regulation and Development : Gene Expression (ed. R.F. Goldberger) . Para expresar genes eucarióticos y genes procarioticos con sitio de enlace de ribosoma débil (Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli" In Molecular Cloning: A Laboratory Manual) . Una secuencia promotora puede ser enlazada directamente con la molécula de ADN, caso en el cual el primer aminoácido en la terminal N será siempre una metionina, la cual se codifica por el codon de inicio ATG. Si se desea, la metionina en la terminal N puede ser escindida a partir de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno o por ya sea incubación in vivo o in vitro con una metionina N-terminal peptidasa bacteriana (Patente Europea 0129237) . Usualmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por bacterias son regiones regulatorias ubicadas 3^ al codon de terminación de traducción, y de esta forma junto con el promotor flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen a la transcripción de una ARNm el cual puede ser traducido en el polipéptido codificado por la ADN. Las secuencias de terminación de transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de circuito germinal que ayudan a la terminación de transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. colí así como también otros genes biosintéticos . Usualmente, los componentes descritos anteriormente, los cuales comprenden un promotor, secuencia de señal (si se desea), secuencia de codificación de interés, y secuencia de terminación de transcripción, son puestos juntos en construcciones de expresión. Las construcciones de expresión son con frecuencia mantenidas en un replicón, tal como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, de esta forma permitiendo ser mantenido en un huésped procariótico ya sea por expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser ya sea un plásmido de número de copias alto o bajo. Un plásmido de número de copias alto generalmente tendrá un número de copias en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y usual y aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un huésped el cual- contiene un plásmido de número de copias alto contendrá preferentemente por lo menos aproximadamente 10, y más preferentemente por lo menos aproximadamente 20 plásmidos. Ya sea un vector de número de copias alto o bajo puede ser seleccionado, dependiendo del efecto del vector y la proteina extraña en el huésped. Alternativamente, las construcciones de expresión pueden ser integradas en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración usualmente contienen por lo menos una secuencia homologa al cromosoma bacteriano que permite que se integre el vector. Las integraciones parecen resultar de las recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, vectores de integración construidos con ADN a partir de varias cepas Bacillus se integran al cromosoma de Bacillus (Patente Europea 0127328) . Los vectores de integración pueden estar comprendidos también de bacteriófago o secuencias de transposon.

Usualmente, las construcciones de expresión de integración y extracromosomales pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Marcadores seleccionables pueden ser expresados en el huésped bacteriano y pueden incluir genes los cuales llevan a resistencia bacteriana a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol , eritromicina, kanamicina (neomicina) y tetraciclina (Davies et al, (1978) Annu. Rev Microbiol . 32:469). Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como aquellos en las vías biosintéticas de vías biosintéticas de histidina, triftófano, y leucina. Alternativamente, algunos de los componentes descritos anteriormente pueden ser puestos juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente comprendidos de un mercado seleccionable que es ya sea mantenido en un replicón o desarrollado en un vector de integración, como se describe anteriormente. Los vectores de expresión y de transformación, ya sea replicones extracromosomales o vectores de integración, han sido desarrollados para transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, los vectores de expresión han sido desarrollados para, inter alia, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis (Palva et al. (1982) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 79:5582); Patente Europea 0 036 259 y patente Europea 063 953; solicitud WO 84/04541) . Escherichia coli (Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol . 189:113; Patente Europea 0036776; Patente Europea 0' 136829 y Patente Europea 0 136 907), Streptococcus cremoris (Powell et al. (1988) Appl . Environ. Microbiol. 54:655); Streptococcus lividans (Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655), Streptococcus lividans (Patente de los Estados Unidos 4, 745, 056) . Son métodos bien conocidos en la técnica el introducir ADN exógeno en huéspedes bacterianos, y usualmente incluyen ya sea la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN puede ser introducido también en células bacterianas por electroporación . Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies bacterianas a ser transformadas. Véase por ejemplo (Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:5582, Patente Europea 0 0336 259 y Patente Europea 0 063 953; Solicitud WO 84/04541, Bacillus), (Miller et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter) , (Cohén et al. (1973) Proc. Nati. Acad. Sci. 69:2110, Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering : Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H. W.

Boyer and S. Nicosia) , Mandel et al . (1970) J. Mol. Biol . 53:159; Taketo (1988) Biochim Biophys Acta 949:318; Escherichia) , (Chassy et al . (1987) FEMS Microbiol . Lett. 44:173 Lactobacillus) ; (Fiedler et al . (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas) ; (Augustin et al . (1990) FEMS Microbiol.

Lett. 66:203, Stahpylococcus) , (Barany et al . (1980) J.

Bacteriol. 144:698; Harlander (1987). "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al . (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al . (1988) Appl .

Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al . (1987) Proc . 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus). Proteínas de adherencia El Ejemplo 22 de la solicitud de Patente Internacional WO 01/64922 describe que E. coli la cual expresa la proteína NadA puede adherirse a células epiteliales humanas. Este actividad de adherencia ha sido además estudiada y ha sido encontrada para App y ORF40. La invención proporciona métodos para prevenir la unión de células Neisseriales a células epiteliales. Las referencias a "células Neisseriales" en esta sección incluyen cualesquiera especies del género bacteriano Neisseria incluyendo N. gonorrhoeae y N. lactamica .

Preferentemente, sin embargo, la especie es N. meningitidis. La N. meningitidis puede ser de cualquier serogrupo, incluyendo los serogrupos. A, C, W-135 y Y. Más preferentemente, sin embargo, es N. meningitidis del serogrupo B. Las referencias a una "célula epitelial" en esta sección incluyen cualesquiera células encontradas en o derivadas del epitelio de un mamífero. La célula puede ser in vitro (por ejemplo en cultivo celular) o in vivo. Las células epiteliales preferidas son de la nasofaringe . Las células son mas preferentemente células humanas . Bloqueamiento de interacción Neisseria epitelio La invención proporciona un método para prevenir la unión de la célula Neisserial a una célula epitelial, en donde se bloquea la capacidad de una o más App, ORF40 y/o NadA para enlazar a la célula epitelial . La capacidad de enlace puede ser bloqueada en varias formas pero, más convenientemente, se usa un anticuerpo específico para App, ORF40, y/o NadA. La invención también proporciona anticuerpo el cual es específico para App, ORF40, o NadA. Este anticuerpo preferentemente tiene una afinidad para App, ORF40 y/o NadA de por lo menos 10~7 M por ejemplo 10~8 M, 1CT9 M, 1CT10 o más fuerte. Los anticuerpos para uso de acuerdo con la invención pueden ser policlonales , pero son preferentemente monoclonales . Se apreciará que el término "anticuerpo" incluye anticuerpos enteros (por ejemplo IgG, IgA, etc) derivados de anticuerpos enteros los cuales retienen los sitios de enlace antigeno (por eemplo F^ , Fab', F(at>)2 etc.), anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo sFv) , anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados, anticuerpos univalentes, anticuerpos monoclonales humanos (por ejemplo Green (1999) J. Immunol Methods 231:11-23; Kipriyanov & Little (1999) Mol. Biotechnol 12:173-201 etc) y similares. Pueden ser preferibles anticuerpos humanizados para aquellos los cuales son totalmente humanos (por ejemplo Fletcher (2001) Nature Biotechnology 19:395-96). Como una alternativa para usar anticuerpos, pueden ser usados antagonistas de la interacción entre App, ORF40, o NadA y su receptor en la célula epitelial. Como una forma alternativa, puede ser usada una forma soluble del receptor de célula epitelial como un señuelo. Estos pueden ser producidos por remover la transmembrana del receptor y, opcionalmente, regiones citoplásmicas (por ejemplo Patente Europea B2-0139417, Patente Europea A-0609580 etc) . Los anticuerpos, antagonistas y receptores solubles de la invención pueden ser usados como medicamentos para preveir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial .

Inhibición de la expresión del gen de Neisseria La invención proporciona un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, en donde la expresión de proteína a partir de una o más de App, ORF40 y/o NadA se inhibe. La inhibición puede ser en el nivel de transcripción y/o traducción. Una técnica preferida para inhibir la expresión del gen es antisentido (por ejemplo Piddock (1998) Curr Opin. Microbiol 1:502-8; Nielsen (2001) Expert Opin. Investig Drugs 10:331-41; Good & Nielsen (1998) Nature Biotechnol 16:335-358; Rahman et al. (1991) Antisense Res Dev 1:319-327; Methods in Enzymology volúmenes 313 y 314; Manual of Antisense Methodology (eds. Hartmann & Endres) ; Antisense Therapeutics (ed. Agrawal) etc.). Se describen técnicas antisentido antibacterianas en, por ejemplo, solicitudes de patente internacionales WO 99/02673 y WO 99/13893. La invención también proporciona ácido nucleico que comprende un fragmento de x o más nucleótidos de ácido nucleico el cual codifica App, ORF40 o NadA, en donde x es por lo menos 8 (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 ó más) . El ácido nucleico será típicamente una cadena sencilla. El ácido nucleico es preferentemente de la fórmula 5'- (N)a- (X) - (N)b-3', en donde 0 _ a >15, 0 > b 15, N es cualquier nucleótido, y X es un fragmento de un ácido nucleico que codifica App, ORF40, o NadA. X comprende preferentemente por lo menos 8 nucleótidos (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 ó más) . Los valores de a y b pueden ser independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15. Cada nucleótido individual N en las porciones - (N) a- y -(N)b- del ácido nucleico puede ser el mismo o diferente. La longitud del ácido nucleico (es decir a+b+longitud de X) es preferentemente menor a 100 (por ejemplo menor a 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 etc.). Se apreciará que el término "ácido nucleico" incluye ADN, AR , híbridos de ADN/AR , análogos de ADN y ARN tales como aquellos que contienen estructuras principales modificadas (con modificciones en el azúcar y/o fosfatos por ejemplo fosforotioatos , fosforamiditas , etc.), y también ácidos nucleicos de péptido (PNA) y cualquier otro polímero el cual comprende bases de purina y pirimidina u otras bases de nucleótidos natural, química o bioquímicamente modificados, no naturales, o derivados, etc. El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede ser preparado en muchas formas (por ejemplo por síntesis química, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del mismo organismo etc.) y puede tomar varias formas (por ejemplo de cadena sencilla, doble cadena, vectores, sondas, etc.) . Los ácidos nucleicos antisentido de la invención pueden ser usados como medicamentos para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial.

Bloqueo del gen Neisserial La invención proporciona un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, en donde una o más de App, ORF40 y/o NadA se bloquean (knockout) . La invención también proporciona una bacteria de Neisseria en la cual una o más de App, Orf40 y/o NadA se han bloqueado . Las técnicas para producir bacterias bloqueadas son bien conocidas, y se ha reportado una Neisseria bloqueada (por ejemplo Moe et al. (2001) Infect. Immun. 69:3762-3771); Seifert (1997) Gene 188:215-220; Zhu et al. (2000) J. Bacteriol. 182:439-447 etc) . La mutación bloqueada puede estar situada en la región de codificación del gen o puede estar dentro de sus regiones de control de transcripciones (por ejemplo dentro de su promotor) . La mutación bloqueada reducirá el nivel de ARNm que codifica App, ORF40 y/o NadA a <1% de aquel producido por la bacteria del tipo silvestre, preferentemente <0.5%, más preferentemente <0.1%, y más preferentemente a 0%. Pueden ser usadas las mutantes bloqueadas de la invención como composiciones inmunogénicas (por ejemplo como vacunas) para prevenir infección Neisserial. Tal vacuna puede incluir el mutante como una bacteria atenuada viva.

Mutagenesis del gen Neisserial La invención proporciona un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, en donde una o más de App, ORF40 y/o NadA tiene una mutación la cual inhibe su actividad. La invención también proporciona una proteína mutante, en donde la proteína mutante comprende la secuencia de aminoácidos de App, ORF40 y/o NadA, o un fragmento de las misma, pero en donde uno o más de los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos es/son mutadas (por ejemplo véase para App) . Los aminoácidos los cuales es/son mutados resultan preferentemente en la reducción o remoción de una actividad de App, ORF40 y/o NadA la cual es responsable directa o indirectamente para adhesión a células epiteliales. Por ejemplo, la mutación puede inhibir una actividad enzimática o puede remover un sitio de enlace en la protelna . La invención también proporciona un ácido nucleico el cual codifica esta proteína mutante . La invención también proporciona un método para producir este ácido nucleico, el cual comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico fuente que codifica App, ORF40 o NadA, y (b) realizar mutagenesis (por ejemplo mutagenesis dirigida a sitio) en el ácido nucleico fuente para proporcionar ácido nucleico que codifica una proteína mutante . La mutación puede implicar deleción, substitución y/o inserción, cualquiera de las cuales puede implicar uno o más aminoácidos. Como una alternativa, la mutación puede implicar truncamiento . La mutagénesis de factores de virulencia es una ciencia bien establecida para muchas bacterias (por ejemplo mutagénesis de toxina descrita en la solicitud WO 93/13202; Rappuoli & Pizza, Capitulo 1 de Sourcebook of Bacterial Protein Toxins (ISBN 0-12-053078-3); Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-41; Alape-Giron et al. (2000) Eur J Biochem 267:5191-5197; Kitten et al. (2000) Infect Immun. 68:4441-4451; Gubba et al. (2000) Infect Immun 68:3716-3719; Boulnois et al. (1991) Mol Microbiol 5:2611-2616 etc.) incluyendo Neisseria (por ejemplo Power et al. (2000) Microbiology 146:967-979; Forest et al. (1999) Mol Microbiol 31:743-752; Cornelissen et al. (1998) Mol. Microbiol 27:611-616; Lee et al. (1995) Infect Immun. 63:2508-2515; Robertson et al. (1993) Mol Microbiol 8:891-901 etc.). La mutagénesis puede ser objetivada específicamente a ácido nucleico que codifica App, ORF40 y/o NadA. Alternativamente, la mutagénesis puede ser global o aleatoria (por ejemplo por radiación, mutagénesis química etc) , la cual será seguida típicamente por tamizar bacterias para aquellas en las cuales se ha introducido una mutación en App, ORF40 y/o NadA. Tal tamizado puede ser por ensayos de hibridización (por ejemplo Southern o Northern blots, etc) , amplificación a base de cebador (por ejemplo PC ) , secuenciación, proteomics, migración de gel SDS-PAGE aberrante, etc. Las proteínas mutantes y ácidos nucleicos de la invención pueden ser usados como composiciones inmunogénicas (por ejemplo como vacunas) para prevenir la infección Neisserial . Métodos de tamizado La invención también proporciona métodos para tamizar compuestos para identificar aquellos (antagonistas) los cuales inhiben el enlace de una célula Neisserial a una célula epitelial . Los antagonistas potenciales para tamizar incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, peptoides, polipéptidos, lípidos, metales, nucleótidos, nucleósidos, poliaminas, anticuerpos, y derivados de los mismos. Las moléculas orgánicas pequeñas tienen un peso molecular entre 50 y aproximadamente 2,500 daltones, y mas preferentemente en el intervalo de 200-800 daltones. Las mezclas complejas de substancias, tales como extractos que contienen productos naturales, bibliotecas de compuestos o los productos de síntesis combinatoriales mezcladas también contienen antagonistas potenciales.

Típicamente, la proteína App, ORF40 y/o NadA se incuba con una célula epitelial y un compuesto de prueba, y la mezcla es entonces probada para ver si ha sido inhibida la . interacción entre la proteína y la célula epitelial. La inhibición, por supuesto, será determinada con relación a un estándar (por ejemplo la interacción proteína/célula nativa). Preferentemente, el estándar es un valor de control medido en la ausencia del compuesto de prueba. Se apreciará que el estándar puede haber sido determinado antes de realizar el método, o puede ser determinado durante o después de que se ha realizado el método. Puede también ser un estándar absoluto. La proteína, célula y compuesto pueden ser mezclados en cualquier orden. Para métodos de tamizado de alto rendimiento, todas las etapas bioquímicas para este ensayo son realizadas en un solución sencilla en, por ejemplo, un tubo de prueba o placa de microtítulo, y los compuestos de prueba se analizan inicialmente en una concentración sencilla de compuesto . Para los propósitos de tamizado de alto rendimiento, las condiciones experimentales son ajustadas para lograr una proporción de compuestos de prueba identificados como conpuestos "positivos" de entre los compuestos totales tamizados. Otros métodos los cuales pueden ser usados incluyen, por ejemplo, tamizado de dos híbridos inversos (por ejemplo Vidal & Endoh (1999) TIBTECH 17:374-381) en la cual la inhibición de interacción del receptor: Neisseria se reporta como una falla para activar la transcripción. El método puede también implicar simplemente incubar uno o más compuestos de prueba con App, ORF40 y/o NadA y determinar si interactuan. Los compuestos que interactuan con la proteina pueden entonces ser probados para su capacidad de bloquear una interacción entre la proteína y una célula epitelial. La invención también proporciona un compuesto identificado usando estos métodos . Estos pueden ser usados para tratar o prevenir la infección Neisserial. El compuesto tiene preferentemente una afinidad para App, ORF40, y/o NadA de por lo menos 10"7 M por ejemplo 10"8 M, 1CT9 M, 10"10 o más fuerte . La invención también proporciona una composición la cual comprende (a) una bacteria E. coli la cual expresa App y/o ORF40 (y, opcionalmente, NadA) y (b) una célula epitelial (por ejemplo una célula epitelial humana) . Expresión en vesículas de membrana externa (OMV) La Solicitud de Patente Internacional WO 01/52885 describe que la adición de componentes definidos adicionales a vacunas de OMV amplia significativamente su eficacia. La preparación de OMV de NmB es bien conocida en la técnica. Los métodos para obtener preparaciones adecuadas se describen en, por ejemplo: Claassen et al. (Vaccine (1996) 14:1001-1008); Cartwright et al. (Vaccine (1999) 17:2612-2619); Peeters et al. (Vaccine (1996) 14:1009-1015) ; Fu et al. (Biotechnology Y (1995) 12:170-74) ; Davies et al. (J. Immunol .Meth. (1990) 134:215-225); Saunders et al. (Infect. Immun. (1999) 67:113-119); Draabick et al. (Vaccine (2000) 18:160-172); Moreno et al. (Infect. Immun. (1985) 47:527-533); Milagres et al. (Infect. Immun. (1994) 62:4419-4424) ; Naess et al. (Infect. Immun. (1998) 66:959-965) ; Rosenqvist et al. (Dev. Biol . Stand. (1998) 92:323-333); Haneberg et al. (Infect. Immunn. (1998) 66:1334-41); Andersen et al. (Vaccine (1997) 15:1225-34); Bjune et al. (Lanet (1991) 338:1093-96) etc . Se ha descubierto ahora que OMV preparadas de ?. coli la cual expresa un gen de Neisseria heterologo puede dar mejores resultados en pruebas de inmunogenicidad estándar que los antígenos en forma purificada. La invención por lo tanto proporciona un método para preparar una OMV a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizado porque la célula expresa un gen que codifica para la proteína App, ORF40, o NadA. La invención también proporciona (a) OMV obtenible por este proceso, y (b) una vesícula de membrana externa a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizada porque la célula expresa un gen que codifica para proteína App, ORF40 o NadA. La célula huésped no Neisserial es preferentemente una bacteria y es más preferentemente E. coli. Más generalmente, la invención proporciona un método para preparar un OMV a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizado porque la célula expresa un gen que codifica una o más de las siguientes proteínas: (A) Incluso SEQ ID 2-892 de la solicitud WO 99/24578; (B) Incluso SEQ ID 2-90 de la solicitud WO 99/36544; (C) Incluso SEQ ID 2-3020 de la solicitud WO 99/57280; (D) Incluso SEQ ID 3040-3114 de la solicitud WO 99/57280; (E) Incluso SEQ ID 3115-3241 de la solicitud WO 99/57280; (F) Las proteínas 2160 NMB0001 a NMB2160 de Tettelin et al . (supra) . (G) Una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de uno o más de (A) o (F) ; (H) Una proteína que comparte la identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una o más de (A) a (F) ; y (I) Una proteína la cual comprende un fragmento de uno o más de (A) a (F) . Similarmente, la invención también proporciona (a) OMV obtenible por este proceso, y (b) una vesícula de membrana externa a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizada porque la célula expresa un gen que codifica una o más proteínas de (A) a (I) descritas anteriormente . El grado de "identidad de secuencia" referido a (H) es preferentemente mayor a 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) y esto incluye mutantes y variantes alélicas . El "fragmento" referido en (I) debe comprender por lo menos n aminoácidos consecutivos a partir de uno o más de (A) a (F) , y, dependiendo de la secuencia partxcuarl, n es 7 ó más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ó más) . Preferentemente el fragmento comprende un epitopo de uno o más de (A) a (F) . Los fragmentos preferidos son aquellos descritos en la solicitud WO 00/71574 y la solicitud WO 01/04316. Se encuentran las proteínas preferidas para (A) a (F) en N. meningitidis serogrupo B. Mutants de App El aminoácido 267 de SEQ ID 650 de la solicitud WO 99/24578 (SEQ ID 32 en la presente) es una serina. App se cree para ser una serina proteasa y esta serina se cree para ser un residuo catalítico en su sitio activo. Se apreciará que las técnicas de alineación de secuencia estándar revelarán el aminoácido correspondiente para esta Ser-267 para cualquier otra secuencia App (por ejemplo Ser-260 en SEQ ID 652 de la solicitud WO 99/24578, Ser-267 en SEQ ID 654 etc) . La invención proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácido de App, excepto que uno o más de los aminoácidos Ser-267, Asp-158 y His-115 (numerado de acuerdo a SEQ ID 32) es/son mutados . La mutación puede ser una deleción, una inserción, o, preferentemente una substitución. La substitución es preferentemente con uno de los 19 aminoácidos que se encuentran en forma natural diferentes y es más preferentemente con glicina, alanina, tirosina o lisina. Se cree que se escinde App en un sitio entre los aminoácidos 1063 y 1171 (número de acuerdo a SEQ ID 32) . Se apreciará que técnicas de alineación de secuencia estándar revelerán los aminoácidos correspondientes a estos dos residuos para cualquier otra secuencia App . La invención proporciona una proteina la cual comprende la secuencia de aminoácidos de App, excepto que uno o más aminoácidos entre Ser-1064 y Arg-1171 (numerados de acuerdo a SEQ ID 32) se mutan. La mutación puede ser una deleción, inserción, truncamiento, o preferentemente, una substitución. La substitución es preferentemente con uno de los 19 otros aminoácidos que se encuentran en forma natural . El residuo el cual se muta es preferentemente S-1064, D-1065, -1066, L-1067, G-1068, K-1069, A-1070, E-1071, A-1072, K-1073, K-1074, Q-1075, A-1076, E-1077, K-1078, D-1079, N-1080, A-1081, Q-1081, S-1083, L-1084, D-1085, A-1086, L-1087, I-1088, A-1089, A-1090, G-1091, -1092, D-1093, A-1094, V-1095, E-1096, K-1097, T-1098, E-1099, S-1100, V-1101, A-1102, E-1103, P-1104, A-1105, R-1106, Q-1107, A-1108, G-1109, G-1110, E-llll, N-1112, V-1113, G-1114, 1-1115, M-1116 , Q-1117 , A-1118, E-1119, E-1120, E-1121, K-1122, K-1123, R-1124, V-1125, Q-1126, A-1127, D-1128, K-1129, D-1130, T-1131, A-1132, L-1133, A-1134, K-1135, Q-1136, R-1137, E-1138, A-1139, E-1140, T-1141, R-1142, P-1143, A-1144, T-1145, T-1146, A-1147, F-1148, P-1149, R-1150, A-1151, R-1152, R-1153, A-1154, R-1155, R-1156, D-1157, L-1158, P-1159, Q-1160, L-1161, Q-11S2, P-1163, Q-1164, P-1165, Q-1166, P-1167, Q-1168, P-1169, Q-1170 y/o R-1171. Se cree que se escinde alternativamente App en el aminoácido 956 y/o aminoácido 1178 (numerado de acuerdo a la SEQ ID 32) . Se apreciará que técnicas de alineación de secuencia estándar revelarán los aminoácidos que corresponden a estos residuos para cualquier otra secuencia App. La invención proporciona una proteina la cual comprende la secuencia de aminoácidos de App, excepto que se muta uno o más de los aminoácidos Phe-956, Asn-957, Ala-1178, y Asn-1179 (numerada de acuerdo a la SEQ ID 32) . La mutación puede ser una deleción, una inserción, truncamiento o, preferentemente, una substitución. La substitución es preferentemente con uno de los otros 19 aminoácidos que se encuentran en forma natural . La invención también proporciona el ácido nucleico que codifica estas proteínas mutantes . La invención también proporciona un método para producir este ácido nucleico, el cual comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico fuente el cual codifica App, ORF40, o NadA y (b) realizar mutagénesis (por ejemplo mutagénesis dirigida a sitio) en el ácido nucleico fuente para proporcionar ácido nucleico que codifica una proteína mutante. La invención proporciona App madura. La invención también proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la App procesada no comprende el dominio de la terminal C el cual está corriente abajo de un sitio de escisión autoproteolítico en App de longitud total . Por ejemplo, en base a la SEQ ID 32 como App de longitud completa, la invención proporciona SEQ ID 33 a 36. Los dominios de la terminal C los cuales pueden ser removidos durante la autoproteólisis son SEQ ID 38 y 39. La invención también proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la terminal C de la App procesada es Phe- 956 (numerada de acuerdo a SEQ ID 32) . Por ejemplo, la invención proporciona SEQ ID 33 y 35. El aminoácido correspondiente para Phe-956 en otras secuencias App puede ser identificado por técnicas de alineación de secuencia estándar. La invención también proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la terminal C de la App procesada es Ala-1178 (numerada de acuerdo a SEQ ID 32) . Por ejemplo, la invención proporciona SEQ ID 34 y 36. El aminoácido que corresponde a Ala-1178 en las otras secuencias App puede ser identificado por técnicas de alineación de secuencia estándar. La invención también proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la App procesada no comprende SEQ ID 37, 38 ó 39. La invención también proporciona una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. La invención también proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos con por lo menos p% de identidad de secuencia para una o más de SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. Dependiendo de la secuencia particular, el valor de p es preferentemente 50 ó más (por ejemplo 60, 70, 80, 90, 95, 99 ó más) . Estas proteínas incluyen mutantes homólogos, ortólogos, variantes alélicos y funcionales. Típicamente, 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera para ser una indicación de equivalencia funcional . La identidad entre las proteínas es determinada preferentemente por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se implementa en el programa PSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de espacio de afinidad con los parámetros penalidad de espacio abierto=12 y penalidad de extensión de espacio=l. La invención además proporciona proteínas que comprenden un fragmento de una o más de SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. Los fragmentos deben comprender por lo menos q aminoácidos consecutivos a partir de las secuencias y, dependiendo de la secuencia particular, q es 7 ó más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100 ó más) . Preferentemente, los fragmentos comprenden uno o más epítopos de la secuencia. La invención también proporciona un ácido nucleico el cual codifica estas proteínas de la invención. Alelos de NadA La invención proporciona una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una o más de SEQ ID 1 a 14. La invención también proporciona una proteína la cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos x% de identidad de secuencia a una o más de las SEQ ID 1 a 14. El valor de x es por lo menos 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 995, 99.5% ó más). Esto incluye variantes por ejemplo variantes alélicos, mutantes homólogos, ortólogos, paralogos, etc. Un alelo preferido de NadA para uso con la presente invención es la SEQ ID 3 (o SEQ ID 6) . La invención '"' también proporciona una proteína la cual comprende un fragmento de uno o más de las SEQ ID 1 a 14. Estos deben comprender por lo menos n nucleótidos consecutivos de una o más de las SEQ ID 1 a 14, en donde n es 6 ó más (por ejemplo, 7, 8 9, 10, 11, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, ó más) . El fragmento puede comprender una secuencia la cual es común para las SEQ ID 1 a 14, o puede comprender una secuencia la cual no es común a las SEQ ID 1 a 14. Los fragmentos preferidos comprenden uno o más ep topos de las SEQ ID 1 a 14. Otros fragmentos preferidos son (a) los péptidos líder N terminales de las SEQ ID 1 a 14, SEQ ID 1 a 14, pero sin k residuos de aminoácidos N terminales, en donde K es 1 ó más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, etc.) y (c) SEQ ID 1 a 14, pero sin 1 residuos de aminoácidos C terminales, en donde 1 es 1 ó más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 etc) . Fragmento preferidos caen dentro de ambos (b) y (c) es decir truncamiento en tanto las terminales C y N.

Los fragmentos preferidos dentro de la categoría (b) carecen del péptido líder N terminal. Para las SEQ ID 1, 2, 3, 7, 9, 11 y 13 el valor de k es de esta forma 23; para las SEQ ID 4, 5, 6, 8, 10, 12 Y 14 el valor de k es 25. El péptido líder puede ser reemplazado con el péptido líder a partir de otra proteína, por otra proteína (es decir para formar una proteína de fusión) o por una secuencia N terminal alternativa para permitir eficiente expresión. Los fragmentos preferidos dentro de la categoría (c) carecen del anclaje de membrana C terminal. El valor de 1 es de esta forma 54. Variantes menores de esta deleción C terminal pueden ser usadas (por ejemplo donde 1 es 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66) . Las proteínas con la secuencia N terminal M H o MQH son preferidas para aquellos con la secuencia MSM N terminal . La proteína de la invención puede incluir la secuencia eptad (AAi7AA2A¾.3AA4AA5AA6AA7) r en donde: AAX es Leu, lie, Val o Met; cada una de AA2AA3AA47AA5AA6 y AA7 puede ser independientemente cualquier aminoácido; r es un entero de 1 o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 etc) . En donde r es 2 ó más, el significado de ??a AA2 ??3 AA4 AA5 AA6 y 7AA7 puede ser el mismo o diferente en cada una de las repeticiones r heptad. Los heptad pueden formar un dominio de cierre de leucina.

Las proteínas de la invención pueden ser preparadas en muchas formas, por ejemplo por síntesis química (por lo menos en parte) , por digerir polipéptidos más grandes usando proteasas, por traducción a partir de AR , por purificación a partir de cultivo celular (por ejemplo a partir de expresión recombinante) , a partir del mismo organismo (por ejemplo aislamiento a partir de tejido de próstata) , a partir de una fuente de línea celular, etc. Las proteínas de la invención pueden ser preparadas en varias formas, por ejemplo nativas, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lipidadas, no lipidadas etc. La proteína está preferentemente en la forma de un oligómero . Las proteínas de la invención pueden ser unidas o inmovilizadas a un soporte sólido. Las proteínas de la invención pueden comprender una etiqueta detectable por ejemplo una etiqueta radioactiva, una etiqueta fluorescente, o una etiqueta de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo . Las proteínas de la invención están preferentemente en forma aislada o substancialmente aislada. En general , las proteínas de la invención se proporcionan en un ambiente que se encuentra en forma natural por ejemplo se separan de su ambiente en el que se encuentran en forma natural. En ciertas modalidades, la proteína objeto está presente en una composición que se enriquece por la proteína como se compara con el control . Como tal, se proporciona la proteína purificada, donde purificada se entiende que la proteína está presente en una composición que está substancialmente libre de otras proteínas expresadas, donde por substancialmente libre se entiende que menos de 90%, usualmente menos de 60% y más usualmente menos de 50% de la composición se hace de otras proteínas expresadas . El término "proteína" se refiere a polímeros de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede ser interrumpido por no aminoácidos. El término también comprende un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de etiquetado. También incluidos dentro de la definición están, por ejemplo proteínas que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como también otras modificaciones conocidas en la técnica. Las proteínas pueden ocurrir como cadenas sencillas o cadenas asociadas . Los imitantes pueden incluir substituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones . Las substituciones de aminoácidos pueden ser substituciones de aminoácidos conservativas o substituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tales como para alterar un sitio de glicosilación, ' un sitio de fosforilación o un sitio de acetilación, o para minimizar pérdida de duplicado por substitución o deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para función. Las substituciones de aminoácidos conservativos son aquellas que preservan la carga general, hidrofobicidad/hidrofilicidad, y/o volumen estérico del substituyente de aminoácido. Las variantes pueden ser diseñadas como para retener o tener actividad biológica mejorada de una región particular del polipéptido (por ejemplo un dominio funcional y/o, donde el polipéptido es un miembro de una familia de polipéptido, una región asociada con una secuencia de consenso) . Selección de alteraciones de aminoácido para producción de variantes puede ser basada en la accesibilidad (interior contra exterior) del aminoácido, la termoestabilidad del polipéptido variante, puentes disulfuro deseado, sitios de enlace de metal deseados etc. La invención también proporciona ácido nucleico que codifica una proteína de la invención como se define anteriormente. La invención también proporciona ácido nucleico que comprende un fragmento de por lo menos n nucleótidos consecutivos a partir del ácido nucleico, en donde n es 10 ó más (por ejemplo 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, ó más) . Adicionalmente, la invención proporciona ácido nucleico el cual puede ibridizar a ácido nucleico el cual codifica una proteina de la invención, preferentemente bajo condiciones de "alta astringencia" (por ejemplo 65°C en O.lxSSC, 0.5% solución SDS) . Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser usados en reacciones de hibridización (por ejemplo Northern o Southern blots, o en microarreglos de ácido nucleico o "chips de genes") y reacciones de amplificación (por ejemplo PCR, SDA, SSSR, LC , ???, N&SBA., etc) y otras técnicas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser preparados en muchas formas por ejemplo por síntesis química en todo o parte, por digerir polinucleotidos mayores usando nucleasas (por ejemplo enzimas de restricción), a partir de bibliotecas genómicas o ADNc, a partir de la misma bacteria, etc. Los ácidos nucleicos de la invención pueden tomar varias formas, por ejemplo vectores de cadena sencilla, de doble cadena, cebadores, sondas, etiquetados o no etiquetados, etc. Los ácidos nucleicos de la invención están preferentemente en forma aislada o substancialmente aislada. La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a aquellas descritas anteriormente por ejemplo para antisentido, o sonda, o para uso como cebadores.

El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen estructuras principales modificadas, y también ácidos nucleicos de péptido (PNA) etc. El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede ser etiquetado por ejemplo con una etiqueta radioactiva o fluorescente. Esto es particularmente útil donde el ácido nucleico es para ser usado en técnicas de detección de ácido nucleico por ejemplo donde el ácido nucleico es un cebador o como sonda para uso en técnicas tales como PCR, LCR, TMA, NASBA, etc . La invención también proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo vectores de clonación o expresión, tales como aquellos adecuados para inmunización de ácido nucleico) y células huésped transformadas con tales vectores. Inmunización La invención proporciona una composición inmunogénica la cual comprende (a) una proteína NadA Neisserial y/o (b) un ácido nucleico el cual codifica una proteína NadA. La invención también proporciona un método para incrementar una respuesta anticuerpo en un mamífero, el cual comprende administrar una composición inmunogénica de la invención al mamífero. La respuesta anticuerpo es preferentemente una respuesta anticuerpo protectora. El anticuerpo protector bloquea preferentemente la unión de NadA y/o App a células epiteliales . La invención también proporciona un método para proteger un mamífero contra infección Neisserial, el cual comprende administrar al mamífero una composición inmunogénica de la invención. La invención también propociona proteina NadA Neisserial para uso como un medicamento. La invención también proporciona el uso de una proteina NadA en la fabricación de un medicamento para prevenir la infección Neisserial en un mamífero. La invención también proporciona el uso de ácido nucleico que codifica una proteína NadA en la fabricación de un medicamento para prevenir la infección Neisserial en un mamífero . El mamífero es preferentemente un humano. El humano puede ser un adulto o, preferentemente, un niño. La proteína NadA es preferentemente NadA de N. meningitidis. Preferentemente comprende la secuencia de aminoácido de una o más de SEQ ID 1 a 14, o una secuencia de aminoácidos la cual tiene identidad de secuencia a la misma o que comprende un fragmento de la misma (véase anteriormente) . La proteína NadA está preferentemente en la forma de un oligómero (por ejemplo, un dímero, trímero, tetrámero o superior) . Dentro de la SEQ ID 1 a 14, se prefieren las SEQ ID 1 a 12, ya que anticuerpos contra estas proteínas NadA son bactericidas entre los varios alelos ipervirulentos . Donde una respuesta inmune contra una cepa NadA+ no hipervirulentá se desea, sin embargo, se prefieren las SEQ ID 13 y 14. Por supuesto, mezclas NadA son también posibles, particularmente mezclas que contienen más de un alelo NadA. Pueden ser usadas composiciones inmunogénicas de la invención terapéuticamente (es decir para tratar una infección existente) o profilácticamente (es decir para prevenir infección futura) . Los usos y métodos de la invención son particularmente útiles para tratar/proteger contra infecciones de Neisseria. meningitidis, incluyendo serogrupos A, B y C. Son particularmente útiles contra cepas de N. meningitidis a partir de linajes hipervirulentos ET-5, EY-37, y glornérulo A4. Los usos y métodos son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades que incluyen, pero no se limitan a, meningitis (particularmente meningitis bacteriana) y bacteremia . La eficacia del tratamiento terapéutico puede ser probada por monitorear infección Neisserial después de administración de la composición de la invención. La eficacia de tratamiento profiláctico puede ser probada por monitorear respuestas inmunes contra NadA después de la administración de la composición. La composición de la invención puede comprender adicionalmente un antígeno el cual, cuando se administra a un mamífero, produce una respuesta inmune la cual es protectora contra una cepa de N. meningitidis de linaje III: Las composiciones de la invención serán administradas generalmente directamente a un paciente. El suministro directo puede ser realizado por inyección parental (por ejemplo subcutánea, intraperitoneal , intravenosa, intramuscularmente o para el espacio intersticial de un tejido) , o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural o pulmonar. La invención puede ser usada para producir inmunidad sistemática y/o mucosal . El tratamiento de dosis puede ser un programa de una dosis o un programa de dosis múltiple. La composición inmunogénica de la invención incluirá generalmente un portador aceptable farmacéuticamente, el cual puede ser cualquier substancia que no induce por sí misma a la producción de anticuerpos dañinos para el paciente que recibe la composición, y el cual puede ser administrado sin toxicidad excesiva. Portadores adecuados pueden ser macromolécul s metabolizadas lentamente, grandes tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas de virus inactivo. Tales portadores son bien conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Los portadores aceptables farmacéuticamente pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol, y etanol . Substancias auxiliares, tales como agentes de humectado o emulsificado, substancias de amortiguamiento de pH, y similares, pueden estar también presentes en tales vesículas. Los liposomas son portadores adecuados. Una discusión completa de portadores farmacéuticos está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edición, ISBN : 0683306472. Las infecciones Meisseriales afectan varias áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones pueden ser preparadas en varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas . Las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes a la inyección pueden ser preparados también. La composición puede ser preparada por administración tópica por ejemplo como ungüento, crema o polvo. La composición puede ser preparada para administración oral por ejemplo como una tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición puede ser preparada para administración pulmonar por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o una aspersión. La composición puede ser preparada como un supositorio u óvulo. La composición puede ser preparada para administración nasal, aural u ocular por ejemplo como gotas. La composición es preferentemente estéril. Es preferentemente libre de pirógenos. Es preferentemente amortiguada por ejemplo entre el pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. Las composiciones inmunogénicas comprenden una cantidad efectiva inmunológicamente de inmunógeno, así como también otros de los componentes especificados, como se necesite . Por "cantidad efectiva inmunológicamente" , se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis sencilla o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo primate no humano, primate, etc.) la capacidad del sistema inmune del individuo, para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del doctor que trata, y otros factores relevantes. Se expera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas de rutina. El tratamiento de dosis puede ser un programa de una dosis sencilla o un programa de dosis múltiple (por ejemplo incluyendo dosis reforzadoras) . La composición puede ser administrada junto con otros agentes inmunomodulatorios . La composición inmunogénica puede incluir un adyuvante . Adyuvantes preferidos para incrementar la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: (A) compuestos de aluminio (por ejemplo un hidróxido de aluminio tal como oxihidróxido, o un fosfato de aluminio tal como hidroxifosfato u ortofosfato, sulfato de aluminio etc) , o mezclas de diferentes compuestos de aluminio, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por- ejemplo gel, cristalino, amorfo, etc) y con adsorción que es preferida; (B) MF59 (5% de Squaleno, 0.5% de Tween 80 y 0.5% de Span 85, formulados en partículas de submicras usando un micro luidizador) ; (C) liposomas; (D) ISCOM, los cuales pueden carecer de detergente adicional; (E) SAF, que contiene 10% de Squaleno, 0.4% de Tween 80, 5% de polímero de bloque plurónico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicras o llevado a vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor; (F) sistema de adyuvante ibi™ (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% de Squaleno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana a partir del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS) , preferentemente MPL + C S (Detox™) ; (G) adyuvantes de saponina, tales como QuilA o QS21, también conocidos como Stimulon™; (H) chitosan; (I) adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA) ; (J) citosinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferon-?) , factor estimulante de colonias de macrófago, factor de necrosis tumoral, etc ( ) microparticulas (es decir una partícula de ~100 nm a ~150 µp? en diámetro, más preferentemente ~200 nm a ~30 µp? en diámetro, y más preferentemente ~500 a ~10 µm en diámetro) formado a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un ácido poli (oc-hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc) ; (L) lípido A monofosforilo (MPL) ó MPL 3-O-deacilado (3dMPL) (M) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua; (N) oligonucleótidos que comprenden patrones CpG es decir que contienen por lo menos un dinucleótido CG, con 5-metilcitosina opcionalmente que se usa en lugar de citosina; (O) un polioxietileno éter o un éster polioxietileno; (P) un tensioactivo de éster sorbitán de polioxietileno en combinación con un octoxinol o un éter alquilo de polioxietileno o tensioactivo éster en combinación con por lo menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol; (Q) un oligonucleótido inmunoestimulatorio (por ejemplo un oligonucleótido CpG) y una saponina; (R) un inmunoestimulante y una partícula de sal metálica; (S) una saponina y una emulsión aceite en agua; (T) una saponina (por ejemplo QS21) + 3 dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) ; (U) enterotoxina lábil al calor de E. coli ("LT"), o mutantes destoxificadas de los mismos, tales como los mutantes K63 o R72; (V) toxina de cólera ("CT") o mutantes destoxificados de los mismos; (W) micropartxculas (es decir partícula de ~100 nm a ~150 µp? en diámetro, más preferentemente ~200 nm a ~30 µt? en diámetro, y más preferentemente ~500 nm a ~10µt? en diámetro) formado a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (ácido -hidroxi) tal como poli (lácido-co-glicólido) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc) ; y (X) otras substancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para incrementar la eficacia de la composición. Sales de aluminio (fosfatos de aluminio y particularmente hidroxifosfatos, y/o hidróxidos y particularmente oxihidróxido) y MF59 son adyuvantes preferidos para inmunización parental . Mutantes de toxinas son adyuvantes mucosales preferidos. Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil -L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , M-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (??-MDP)·, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2 - (1 -2 '-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) etc. Las composiciones de la invención pueden comprender antigenos (por ejemplo antígenos protectores contra N. meningitidis o contra otros organismos) además de NadA por ejemplo antígenos DTP, antxgeno Hib etc. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser usadas terapéuticamente (es decir para tratar una infección existente) o profilácticamente (es decir para prevenir infección futura) . La inmunización terapéutica es útil particularmente para tratar infección de Candida en sujetos inmunocomprometidos . Como una alternativa para usar antígenos de proteína en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede ser usado el ácido nucleico (preferentemente ADN por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica el antígeno. Renuncias La invención excluye preferentemente: (a) secuencias de aminoácido y ácido nucleico disponibles en bases de datos de secuencias públicas (por ejemplo GenBank o GENESEQ) antes del 26 de Julio de 2002, y, más preferentemente, antes del 27 de Julio de 2001; (b) secuencias de aminoácido y ácido nucleico descritas en las solicitudes de patente que tienen una fecha de presentación, donde sea aplicable, una fecha de prioridad antes del 26 de Julio de 2002 y, más preferentemente, antes del 27 de Julio de 2001. En particular, pueden ser excluidas la entrada de SEQ ID en las siguientes solicitudes de patente: WO 99/24578; WO 99/36544; WO 99/57280; WO 00/22430; WO 00/66741; WO 00/66791; WO 00/71574; WO 00/71725; WO 01/04316; QO 01/31019; WO 01/37863; QO 01/38350; WO 01/52885; WO 01/64920; WO 01/64922. Definiciones El término "que comprende" significa "que incluye" así como también "que consiste" por ejemplo un composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o pude incluir algo además por ejemplo X + Y. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 a 3 muestran datos de expresión para (1) ORF40 (2) App (3) NadA. Las Figuras 4 a 6B muestran análisis FACS de proteínas implicadas en adhesión a células humanas. En las Figuras 4 y 5 (Figura 6) , los datos son para, de izquierda a derecha, ORF40 ( ) , App ( ) , NadA ( ) , y GNA2132 ( ) . Las Figuras 7 y 8 muestran homologías de (7) ORF40 y (8) App. Las Figuras 9A-9C muestran una alineación de alelos NadA, y la Figura 10 muestra la relación de los alelos 1 a 3. La Figura 11 muestra la estructura secundaria predicha de NadA. Las Figuras 12A-12B muestran análisis de secuencias corriente arriba y corriente abajo de NadA. La Figura 13 muestra el análisis PCR de expresión de NadA en diferentes cepas de N. meningitidis. La Figura 14 muestra análisis inmunoblot de expresión NadA en diferentes cepas de N. meningitidis . Las Figuras 15A-15B muestra variación de expresión NadA con tiempo de cultivo. La Figura 16 muestra FACS de NadA de células de N. meningitidis encapsuladas y no encapsuladas isogénicas. Las Figuras 17A-17D muestran resultados de inmunofluorescencia obtenidos usando anti-NadA contra células Chang (17A a 17C) o células HeLa (17D) . Las Figuras 18A-18B muestran resultados de inmunofluorescencia obtenidos usando anti-NadA contra células Chang después de incubación en (A) 37°C, o (B) 4°C. La Figura 19 muestra resultados de inmunofluorescencia para células Chang tratadas con saponina. Las Figuras 20A-20C muestran resultados de inmunnofluorescencia obtenidos usando monocitos . La Figura 21 muestra resultados de inmunofluorescencia obtenidos usando macrófagos . La Figura 22 muestra una secreción IL-oc por monocitos en respuesta al tratamiento con NadA. La Figura 23 muestra el efecto de anti-CD14 en secreción de IL-a por monocitos.

Las Figuras 24A-24B muestran resultados de inmunofluorescencia obtenidos usando anti-NadA contra E.coli transformada para expresar NadA. Las Figuras 25A-25C muestran tinción de E. coli transformada usando (A) anti-NadA (B) anti-E.coli o (C) ambas . La Figura 26 es una representación esquemática de características de App. El péptido lider N terminal, el dominio de pasajeros y el dominio ß C terminal se indican. Se muestran las posiciones del sitio activo de serina proteasa, el sitio de enlace ATP/GTP, los dos sitios ricos en Arginina y la región rica en prolina. En Cuadro 1, son mostrados los sitios de escisión. En la Caja 2 se muestra una comparación de sitios proteolíticos conocidos de diferentes autotransportadores y se deriva una firma de consenso. Las flechas indican las escisiones, X=cualguier aminoácido, hyd=residuos hidrofóbicos (a, S) =alanina o serina. La Figura 27 es una representación esquemática de las construcciones usadas para estudiar App. La Figura 28 muestra un western blot de membrana externa y proteínas extracelulares en E. coli. La Figura 29 muestra análisis FACS de membrana externa y proteínas extracelulares en E. coli. La Figura 30 muestra inmunofluorescencia de membrana externa y proteínas extracelulares en E. coli.

La Figura 31 muestra proteínas de E. coli totales analizadas por SDS-PAGE . La Figura 32 muestra un inmunoblot de sobrenadantes de cultivo precipitado sin purificar usando antisuero de ratón contra App-his. La Figura 33 muestra datos de adhesión FACS usando antisuero de conejo contra E. coli. Se muestran porcentajes de células positivas a adhesión cerca de los perfiles de fluorescencia . Las Figuras 34A-34G muestran datos de microscopía de inmunofluorescencia que muestran adherencia y agregación bacteriana . La Figura 35 muestra enlace dependiente a concentración de App-His ( ) , ???a-His ( ) y NMB2132 ( ) expresado como intensidad de fluorescencia promedio neta (MFI) . La Figura 36 muestra el efecto de enlace App-His (100 µg/ml) de preincubación con pronasa (columnas del lado izquierdo) o fosfolipasa A2 (columnas del lado derecho) con concentración incrementada de enzima. Se prueba la pronasa en 0, 250, 500, 1000 µg/ml fosfolipasa A2 se prueba en 0, 50, 200, 800 µg/ml. La Figura 37 es una comparación de especificidad de enlace celular de proteina App-His en 100, 25 ó 6.25 µg ml· contra varias células diferentes.

La Figura 38 muestra asociación de bacteria MC58 del tipo silvestre o bloqueo de app de N. meningitídis. La Figura 39 muestra análisis de western blot de lisados totales de MC58 de N. meningitídis cosechada en 0.5 o 0.8 ODS2onm- La-S bandas 1 y 3 muestran MC58 del tipo silvestre y bandas 2 y 4 muestran el bloqueo de App. La Figura 40 muestra un análisis western blot de sobrenadantes en paralelo a la Figura 39. MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Homología NadA NadA muestra homología a (a) YadA de Yersinia enteropatogénica, una adhesina asociada no pilosa implica en virulencia (Cornelis (1998) Microbiol . Mol. Biol . Rev. 62:1315-1352) y (b) UspA2 de Moraxella catarrhalis, una proteína implicada en resistencia a suero y un antígeno protector (Chen et al. (1999) Infect . Immun. 67:1310-1316). La similaridad de secuencia es aglomerada principalmente en la región carboxilo terminal (56-63% de identidad en los últimos 70 aminoácidos) . Fuera de esta región el nivel de identidad cae a 23-25%. YadA y UspA2 han sido identificadas como adhesinas (Hoiczyk et al. (2000) EMBO J 19:5989-5999). Ambas proteínas forman oligómeros de alto peso molecular difíciles de disociarse (150-200 kDa) ancladas a la membrana externa. Nada ha sido encontrada también para formar agregados de alto peso molecular muy estables en la membrana externa de meningococcus . Se analiza la secuencia de aminoácidos de NadA (Nielsen et al. (1997) Protein Engineering 10:1-16; Levin & Garner (1988) Biochim. Biophys . Acta 955:283-295; Berger et al. (1995) PNAS USA 92:8259-8263; Bornberg-Bauer et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26:2740-2746). Se muestra el análisis de estructura secundaria en la Figura 11. Se indican la terminación N globular y terminación C anfipática, ya que son las posiciones del péptido líder (LP) y un anclaje de membrana. La región carboxilo terminal (aa 310-362) tiene una estructura ß anfipática predicha (cadena ß mostrada en negro) y un aminoácido aromático terminal, los cuales son características típicas de dominios de anclaje de membrana externa. La región amino terminal (aa 23-90) no tiene una estructura secundaria definida, pero el resto de la proteína tiene principalmente tendencia a hélice a (84.6%). Dentro de esta región, los residuos 90-146 y 183-228 tienen alta probabilidad de formar bobinas embobinadas. Además, los residuos 122-143 contienen cuatro residuos de leucina en las posiciones "a" de las repeticiones heptad (L-x(6) -L-x (6) -L-x(6)-L) que pueden formar un dominio de cierre de leucina ( Es conocido que ambas bobinas embobinadas y secuencias de cierre de leucina están implicadas en dimerización y pueden mediar oligomerizacion de monomeros vía asociación de dos o más alfa hélices. A pesar de que se aglomera similaridad de estructura primaria entre NadA, YadA y UspA2 en la terminación C, por lo tanto, la similaridad total entre las tres proteínas es conservada en nivel de estructura secundaria. Se presentan los cierres de leucina putativos en tanto NadA y UspA2. NadA, YadA y UspA2 tiene un anclaje de membrana carboxilo terminal hecha por cuatro ß-cadenas antipáticas y una región a-hélice interna con tendencia para formar bobinas embobinadas . En YadA y UspA2 estas a hélices han sido mostradas para formar regiones de bobinas embobinadas, las cuales median la oligomerización de monómeros (Hoiczyk et al. (2000) EMBO J 19:5989-5999; Cope et al. (1999) J. Bacteriol. 181:4026-4034) . La ausencia de residuos de cisteína en las formas maduras de NadA es otra característica compartida con sus homólogos . El ambiente genómico de NadA Se flanquea la región de codificación nadA de 1086 pb en el extremo 3 " por una secuencia terminadora mientras en el extremo 5' (Figura 12A) muestra un sitio de enlace de ribosoma putativo (RBS:5'- AAGG-3') y una región de promotor putativo ubicada 8 y 47 pares de bases, respectivamente, corriente arriba del codón de inicio ATG. 130 pb corriente arriba de la región de codificación están nueve repeticiones del tetranucleótido TAAA (sombreado en negro en la Figura 12A) precedidos por un segundo promotor putativo con -10 y -35 regiones. Debido a la presencia de las repeticiones TAAA, el gen a sido enlistado como uno de aquellos que pueden sufrir variación de fase, a pesar de que las repeticiones no están en la región de codificación (Tettelin et al . ) . El gen homólogo UspA2 tiene una repetición de tetranucleótido (AGAT) ubicado en la misma posición como en nadA, el cual varia en diferentes cepas (Cope et al. (1999) J. Bacteriol . 181:4026-4034) . El contenido G+C del gen nadA y su región corriente arriba es inferior que el promedio (45% contra un promedio del resto del genoma, 51.5%), lo cual sugiere adquisición del gen por transferencia horizontal. El gen nadA y su región corriente arriba no están presentes en la secuencia publicada del genoma del serogrupo A, cepa Z2491 (Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506). En el genoma MenA, una secuencia corta de 16 nucleótidos sin homologías en la base de datos, reemplaza el gen nadA (Figura 12B) , mientras los genes corriente arriba y corriente abajo (nmbl993 y nmbl995) estén bien conservados (91% y 97% de identidad) . El análisis de las secuencias inmediatamente adyacentes a la región nadA y ausentes en la cepa del serogrupo A Z2491 muestra que el segmento está flanqueado por las repeticiones directas TCAGAC. Esto puede indicar un mecanismo de recombinación.

En la cepa A la extensión de 16 nucleótidos tiene un par alterado de repeticiones TCAGAC que la flanquean. Variación en el genotipo NadA Dada la diferencia en la expresión nadA entre serotipos A y B, 175 cepas diferentes de N. meningitidis se eligen para análisis - 150 aislados representativos de los cinco serogrupos asociados a enfermedad (A, B, C, Y y W-135) y 25 cepas aisladas de portadores de salud. El análisis también incluye una cepa cada una de N. gonorrhoeae, N. cinérea y N. lactamica.. Las bacterias se hacen crecer durante la noche en 37°C en una atmósfera humidificada de C02 al 5% en aire en agar de medio de gonococcus (GC) (Difco) complementado con solución complemento de Kellogg (D-glucosa 0.22 M, L-glutamina 0.03 M, nitrato férrico 0.001 M, y cocarboxilasa 0.02 M) (Sigma-Aldrich Chemical Co, St. Louis, Mo . ) como se describe previamente (Knapp et al. (1988) Antimicrob. Agents Chemother. 32:765-767; Roberts et al. (1977) J. Bacteriol . 131:557-563). Se disuelve un conglomerado de bacterias en 500 µ? de PBS y ADN chromosomal se prepara como se describe previamente (Tinsley et al. (1996) PNAS USA 93:11109-11114). Se tamizan las bacterias por PCR y/o hibridización de manchas de gotas (dot blot: técnica de laboratorio para analizar ácidos nucleicos. La muestra a ser analizada es aplicada a un soporte sólido, como una gota, y se reta con una sonda etiquetada para el propósito de identificar secuencias de nucleótido particulares que pueden estar presentes) . Se realiza la amplificación PCR de los genes nadA en 10 ng de ADN cromosomal usando cebadores, mapear 350 nt corriente arriba y corriente abajo a partir de la región de codificación (cebador hacia adelante : SEQ ID 16; cebador inverso; SEQ ID 17), y Platinum Hifi Taq Polimerasa (GIBCO) . Las condiciones PCR son: 30 ciclos de desnaturalización en 95°C por 30 segundos, destemplar en 60°C por 30 segundos, y extensión en 68°C por 1 minuto. Se analizan los productos PCR en un gel de agarosa al 1% y se determinan los tamaños usando un marcador de peso molecular ADN Ladder Plus 1 kb (GIBCO) . Se purifican los fragmentos purificados en una columna Qiaquick (Qiagen) y después se secuencia por ciclos automatizados (Applied Biosystems modelo 377) por caminar el cebador en ambas cadenas del fragmento amplificado. Para dot blotting, la sonda usada es el gen nadA entero, como se amplifica a partir de la cepa 2996 y etiquetada con digoxigenina usando el equipo de Etiquetado y detección de ADN de cebador alta Roche DIG. Se llevan a ebullición alícuotas de 10 µ? de suspensión celular de cada cepa por 10 minutos y se hace una mancha en membrana de nylon (Boehringer) . Las membranas sufren de reticulación de ADN por exposición 2' a luz UV y otros procedimientos estándar para preparación y detección de señal como se reporta por el fabricante.

El gen nadA está ausente en N. gonorrhoeae y en las especies comensales N. lactamica y N. cinérea. En N. meningitidis, sin embargo, 47% de los aislados son positivos para su presencia. PCR genera (Figura 13) un producto de 1800 pb en cepas NadA+ MC58 (banda 1) , 90/18311 (banda 2) y 2996 (banda 3) . Esto da un producto de 400 pb en cepa NadA" Z2491 y NG3/88 (banda 5) . Algunas cepas (por ejemplo 93/4286, C4678, 2022, ISS1113) dan un producto PRCR de 2500 pb (banda 4:L93/4286) . La presencia/ausencia de NadA en N. meningitidis se correlaciona con linaje de cepas. Las cepas aisladas a partir de enfermedad meningococcoal invasiva han sido clasificadas por electroforesis de enzima multilocus (MLEE) en un pequeño número de linajes hipervirulentos : Electroforéticas Tipos ET37, ET5 , glomérulo A4 , linaje III; subgrupos I, III y IV-1 (Achtman (1995) Global epidemiology of meningococcal disease. En Meningococcal disease (Cartwight, ed) John Wiley and Sons, Chichester, England. 159-175; Caugant (1998) APMIS 106:505-25) . Recientemente, una clasificación a base de secuencia, de tipo secuencia multilocus (MLST) , ha sido introducida, la cual clasifica las cepas anteriores en las Secuencias Tipos ST11, T32, ST8, ST41, ST1 , ST5, ST4 , respectivamente (Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145). Las cepas aisladas a partir de portadores saludables cae en muchos tipos diferentes de ET y ST.

El gen nadA está presente en 51 de 53 cepas (96%) de los linajes hipervirulentos ET-5, ET-37 y glomérulo A4, mientras está ausente en todas las cepas de linaje III probadas. Siete de las 25 cepas portadoras son positivas. La mayoría de las cepas del serogrupo C probadas son positivas incluso si no pertenecen a linajes hipervirulentos. Lo mismo es verdadero para las cepas del serogrupo B con el serotipo 2a y 2b. Para el serogrupo A, una cepa que pertenece al subgrupo III es posible mientras las otras dos cepas que pertenecen al subgrupo IV-1 son negativas. El linaje III ha sido únicamente introducido recientemente en Europa y los Estados Unidos y la segregación geográfica en Nueva Zelanda por muchos años puede haber dañado su capacidad de adquirir genes novedosos. Por ejemplo, pueden haber ocurrido mutaciones en las regiones cromosomales rodeantes que previenen el Linaje III de eventos de recombinación adicionales. Otras posibles explicaciones es que las cepas ET-5, ET-37 y Cluster A4 necesitan nadA para legrar fijación de pico mientras que los aislados del linaje III no pueden derivar ningún beneficio significativo a partir de inserción nadA, de esta forma sufriendo una selección negativa. NadA es de esta forma sobre representada en tres linajes de N. meningitidis hipervirulentos. Para ser un gen extraño presente en un subgrupo de cepas hipervirulentas .

Alelos de NadA Como productos de PCR tienen tamaños diferentes (Figura 13) y la mayoría de las cepas NadA+ pueden ser agrupadas en tres tamaños diferentes, se secuencian los genes para 36 cepas representativas de cada tamaño: 26 cepas positivas, 4 cepas con un producto de PCR grande, y 6 cepas de NadA". En las cepas negativas, se descubre una secuencia de 16 pb la cual es idéntica a la secuencia presente en la secuencia de genoraa del serogrupo A publicado. El análisis de la secuencia de las cuatro cepas del producto de PCR grande revela una interrupción por una copia sencilla de IS1301, interrumpiendo la proteína después de 162 aminoácidos con un codón de detención. El sitio de inserción es idéntico en las cuatro cepas, pero la orientación de IS1301 difiere, lo cual indica eventos independientes. El consenso objetivo para IS1301, 5^-AYTAG-3^ se encuentra dentro del gen NadA en el nucleótido 472, generado por una mutación A->G, y se acompaña por una duplicación TA. En cepas nadA+, el tamaño del gen está en el intervalo de 1086 a 1215 pb, con variación consecuente de las secuencias de aminoácido de las proteínas codificadas de 362 a 405 aminoácidos. Es posible aglomerar 22 de los 26 genes de NadA en tres alelos bien definidos (Figuras 9 y 10; Tabla I) . La secuencia del gen dentro de cada alelo es idéntica y la identidad total entre los alelos está en el intervalo de 96% a 99%. Este nivel de conservación es sorprendente y sugiere presión selectiva débil y/o una adquisición muy reciente del gen de nadA. La última posibilidad es consistente con el contenido bajo de G+C del genoma en esta región (véase anteriormente) .

Las secuencias mostradas en la Figura 9A asume que el aminoácido N terminal es la primera Met en la estructura de lectura abierta (SEQ ID 4 a 6) , pero la segunda Met (residuo 3 en la SEQ ID 4 a 6) tiene un patrón Shine-Dalgarno mejor posicionado (Figura 9B) . Las secuencias que inician a partir del segundo codón Met son de esta forma preferidas (SEQ ID 1 a 3) . El alelo 1 codifica para una proteína de 362 aminoácidos (SEQ ID 1) e incluye la cepa MC58 y todas las cepas ET-5 positivas secuenciadas . Las otras cinco cepas que pertenecen al alelo 1 son aisladas muy recientes y no han sido aún clasificados como ET, aunque la clasificación de serotipo y serosubtipo (B:15:P1.7 y B:4:P1.15) de estas cepas sugiere afiliación de estas cepas al complejo ET-5. El alelo 2 codifica para una proteina de 398 aminoácidos (SEQ ID 2} la cual resulta de la adición de 2 aa después de un residuo 268 (numerado de acuerdo a la SEQ ID 1) , además de 41 aa después del residuo 271, y delecion de 7 aa después del residuo 122 , lo cual resulta en la delecion de la primera repetición heptad del dominio de cierre de leucina. Los residuos de leucina en un espaciamiento fijo de siete residuos identifica comúnmente cierres de leucina. Una leucina en las repeticiones ha sido reerrplazada frecuentemente en su mayoría por Met, Val o lie. En este caso el alelo 2 puede usar la lie corriente arriba o corriente abajo para formar el patrón de cierre de leucina. El alelo 3 codifica para una proteína de 405 aminoácidos (SEQ ID 3) y, como alelo 2, contiene 43 aminoácidos extra en los residuos 268 y 271 pero difiere del alelo 2 por no tener la delecion 7aa después del residuo 122. El alelo 3 se encuentra en las cepas del serogrupo 7A, B y C. Las cepas 4/26 positivas restantes (ISS1024, ISS759, 973-1720, 95330; marcados con * en la Tabla 1) contienen menores variantes de alelos 1 a 3 ; La cepa del serogrupo C ISS1024 tiene una variante del alelo 2 con una simple delecion de repetición heptad en los residuos 229-235 (SEQ ID 7/8) . Esta secuencia es clasificada originalmente como un cuarto alelo pero ha sido reclasificada como una variante del alelo 2. El alelo 2 es encontrado de esta forma en todas las cepas ET-37, un cepa del cluster A4 y tres cepas del serogrupo C del tipo no ET adicionales . Las cepas del serogrupo C ISS759 y 973 -1720 ambas contienen una variante del alelo 3 con una mutación de aminoácidos sencilla en el péptido líder (SEQ ID 9/10 ) que resulta de una mutación de nucleótido sencilla . Entre las 3 cepas de alelo, solamente 973-1720 pertenece a una cepa ipervirulenta (cluster A4) . La cepa 95330 del serogrupo B contiene un recombinante (quimera) de alelos 1 y 2 (SEQ ID 11/12 ) , con nadA que es una fusión entre la porción N terminal del alelo 2 y el segmento C terminal del alelo 1. El sitio putativo de recombinación es ubicado aproximadamente entre los residuos 141 y 265 de la proteína. Todas las inserciones y deleciones suceden en la región de bobina embobinada e implican 7 ó 41 aminoácidos los cuales , representan 2 ó 6 cambios de la hélice o , permite las variaciones en longitud de la región de bobina embobinada sin alterar la estructura total . Adicionalmente , la deleción en ISS1024 resulta en la pérdida de la primera repetición heptad del dominio de cierre de leucina pero no destruye el dominio porque los residuos de leucina en un espaciamiento fijo de siete residuos pueden ser reemplazados en su mayoría por Met, Val o lie . En este caso el alelo 2 puede usar la lie corriente arriba o corriente abajo para formar el patrón de cierre de leucina (Figura 11) . Cualquiera de estas varias secuencias de NadA y alelos pueden ser usados de acuerdo con la invención. Cuando se extiende el análisis de secuencia al promotor putativo y regiones terminadoras (50 pb corriente arriba, 350 pb corriente abajo) , las variaciones son encontradas solamente en la región 5'. Tres cepas italianas (ISS1071, ISS832 y ISS1104) difieren por una sola mutación de base mientras en la cepa 961-5945 hay 7 bases de diferencia (iindicado con * en la Figura 10) . Se encuentran también variaciones en las regiones 5^ donde se repite el tetranucleótido TAAA de 4 a 12 veces en cepas diferentes (Tabla 1) . El número de repeticiones es variable también dentro de cada alelo (Tabla 1) . Se realiza trabajo adicional en cepas portadoras aisladas a partir de individuos saludables por exudado orofaringeo . Algunas cepas, incluso si se describen como portadores, pertenecen a glomrulos hipervirulentos, y NadA es encontrada en todas las cepas portadoras como se describe anteriormente (es decir alelo 1 en las cepas ET-5 y alelo-2 en las cepas ET-37) . Se encuentra también nadA en cinco cepas portadoras (NGE28, 65/96, 149/96, 16269, 16282)las cuales no pertenecen a un glomérulo hipervirulento . Estas cinco cepas comparten una secuencia (SEQ ID 13 y 14) la cual no se encuentra en cepas aisladas a partir de pacientes. Este alelo es referido como "alelo C" (portador) . Una alineación del alelo C con alelos 1 a 3 se muestra en la Figura 9C. La alteración en los segmentos de bobina embobinada de la proteína es evidente. A diferencia de los alelos 1 a 3 , la proteína del alelo C no forma fácilmente un agregado de alto peso molecular cuando se expresa en E. coli . Como los alelos 1 a 3, sin embargo, el alelo C se expone en la superficie de N. meningitidis, porque es un objetivo para anticuerpo bactericida originado contra si mismo. Sin embargo, estos anticuerpos no son bactericidas contra cepas que portan alelos 1 a 3, similarmente, anticuerpos que se originan contra los alelos 1 a 3 no son bactericidas contra las cepas del alelo C. Oligómeros NadA en la superficie celular La solicitud WO 01/64922 reporta que NadA forma estructuras oligoméricas . Para estudiar oligómeros de NadA en más detalle, se sondean lisados celulares enteros de N. meningitidis por Western blot . Se hacen crecer colonias bacterianas (cepas MC58 (alelo 1), 90/18311 (alelo 2), 2996 (alelo 3), L93/4286 (inserción IS1301) y NG3/88 (nadA~) ) a una fase estacionaria en caldo GC complementado con glucosa al 0.3%. Se toman las muestras en diferentes tiempos, granuladas por centrifugación en 3000 x g por 10 minutos, y se vuelve a suspender en PBS y se descongela/congela hasta lisis bacteriana. Cantidades iguales de proteínas son sometidas a SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 12.5% y se electrotransfiere en membranas de nitrocelulosa. Para preparar suero policlonal anti-NadA, se expresa NadA recorabinante y se purifica. Secuencias que codifican los tres alelos nadA (alelo 1: aa 24-362; alelo 2 ; aa 24-343; alelo 3: aa 24-350), se amplifican por PCR en ADN cromosomal y se clonan en pET21b+ vector (Novagen) . Los plásmidos se transforman en BL21 de E. coli (DE3) para expresar las proteínas como las fusiones de histidina de la terminal C. Se induce la expresión de la proteina en 30°C por agregar IPTG 1 M en OD60onm 0.3 y hacer crecer las bacterias por unas 3 horas adicionales; se evalúa la expresión por SDS-PAGE. Las proteínas de fusión reco binantes se purifican por cromatografía de afinidad en resina de Sepharose 4B de flujo rápido guelada conjugada a Ni2+. Se usan 20 de la proteína purificada para inmunizar ratones hembra CDl de seis semanas de edad (4 a 6 por grupo) . Se dan las proteínas intraperitonealmente, con adyuvante de Freund completo (CEA) para la primera dosis y adyuvante de Freund incompleto (IFA) para el segundo (día 21) y tercero (día 35) dosis de refuerzo. Se toman muestras de sangrado en el día 49 y se usan para los análisis serológicos. Las manchas muestran una banda reactiva de alto peso molecular en cepas MC58 (Figura 14, banda 1), 90/18311 (banda 2) y 2996 (banda 3) . La banda está ausente en la cepa NG3/88 (banda 5) . La ebullición del amortiguador de muestra hasta 40 minutos no cambia el patrón. El tamaño diferente de las proteínas es consistente con el tamaño de los alelos. Dado el tamaño esperado que está en el intervalo de 35 a 40 kDa de proteínas monoméricas , el alto PM de la banda observada puede ser explicada por la presencia de una forma oligomérica de NadA. Esta posibilidad está soportada por el hecho de que en la cepa que contiene la inserción ISS1301, que codifica para una proteína más corta de 162 aminoácidos y que carece de la mayoría de la región de bobina embobinada, la banda reactiva de alto PM está ausente y se reemplaza por una banda de 14.5 kDa (Figura 14, banda 4) , consistente con el peso molecular predicho de la proteína monómerica procesada. Aunque la proteína oligomeica se encuentra en todas las cepas que contienen un gen funcional, los niveles de expresión varian de cepa a cepa (Tabla 1) . Por otra parte, la cantidad de la proteína NadA varía dentro de la misma cepa durante el crecimiento . Cuatro diferentes cepas (MC58, 2996, Cll, F6124) elegidas como representativas de diversos niveles de expresión NadA total, son seguidas durante el crecimiento a fase estacionaria. La Figura 15 muestra crecimiento de dos de las cepas probadas (15?; MC58, con baja expresión de NadA, 15B: 2996, con alta expresión de NadA) , con la curva que muestra ODe0o - Western blots de muestras tomadas en cada punto de la curva de crecimiento de OD6oo muestran que la banda NadA es apenas visible en el inicio del crecimiento y llega a ser más intensa durante crecimiento, hasta su máximo, en fase estacionaria. Todas las cepas analizadas muestran el mismo comportamiento dependiente a fase de crecimiento. NadA de alto PM se ve también en western blots de vesículas de membrana externa, consistente con NadA que se ancla a la membrana externa. Similarmente, el análisis FACS en bacterias vivas durante la fase log de crecimiento muestra que NadA está disponible para enlace de anticuerpo en la superficie de la bacteria. La intensidad de FACS en una cepa con una cápsula de polisacárido (cepa NMB) se reduce 1 log en comparación con una cepa mutante no encapsulada isogénica (M7) , pero la proteína es expuesta superficialmetne y disponible para enlace en ambas cepas (Figura 16) . NadA form oligómeros expuestos a superficie, los cuales son estables al calor, SDS y reducción con ß-mercaptoetanol . Como la forma madura carece de los residuos de cisteina, la formación de enlace disulfuro no puede ser implicada en este fenómeno; más aún esto es consistente con la estructura de bobina embobinada predicha y la presencia de patrones de cierre de leucina que pueden mediar las interacciones intermoleculares . entre monómeros (Lupas (1996) Trends Biochem. Sci . 21:375-382; O'S ea et al. (1991) Science 254:539-544). El tamaño de los oligómeros es aproximadamente 170 kDa, lo cual sugiere una estructura tetramérica (WO01/64922) . Sin embargo, una estructura de bobina embobinada rxgida es probable para tener una migración anómala es SDS PAGE y por lo tanto la forma de 170 kDa puede ser un trímero. Inmunogenicidad protectora Se prueba el suero anti-NadA policlonal para actividad bactericida como se describe previamente (Pizza et al. (2000); Peeters et al. (1999) Vaccine 17:2702-2712), con suero de conejo bebé agrupado (CedarLane) usado como fuente complemento. El título bactericida de suero, se define como la dilución sérica que resulta en una disminución de 50% en unidades formadoras de colonias (CFU) por mi después de 60 minutos de incubación de bacterias en la mezcla de reacción, comparado con la CFU de control por mi en el tiempo 0. Típicamente, bacterias incubadas con el anticuerpo de control negativo en la presencia de complemento muestra un incremento de 150 a 200% en CFU/ml durante los 60 minutos de incubación. Los resultados son como sigue: omo se muestra, el suero induce muerte mediada por complemento de todas las cepas que tienen el gen nadA, y es inactivo contra las cepas que no tienen el gen. Sin embargo, los títulos de bactericidas varían entre las cepas . Los títulos son superiores contra cepas que expresan cantidades superiores de proteína. Este resultado se confirma cuando los títulos se determinan en la fase temprana y tardía de crecimiento (Figura 15) . Para checar si las diferencias en la actividad bactericida son debido a diferentes secuencias de alelo, inmunosuero, originado contra los tres tipos de NadA, se produce y se usa en un ensayo bactericida cruzado. Los resultados obtenidos con el antisuero son similares a aquellos mostrados anteriormente, lo cual sugiere que la actividad bactericida no está influenciada por la diversidad de alelo sino más bien al nivel de expresión de antígeno. La capacidad del inmunosuero para proteger a los animales de bacteremia durante la infección se prueba también, uando el modelo de rata infante. El suero usado se obtiene por inmunizar cobayos con 50 µg de rNadA purificada (alelo 3) . La inmunización de ratas Wistar destetadas (5 a 7 días de edad) se realiza subcutáneamente junto con CFA para la primera dosis y IFA para las tres dosis adicionales (días 28, 56, 84) . Las muestras de sangrado se toman en el día 105 y se usan para el ensayo de protección animal . Dos experimentos se realizan usando dos cepas MenB diferentes (8047 y 2996) . Cada cepa ha sido pasada seriamente tres veces en ratas infantes. En el experimento 1, los grupos de cuatro ratas se retan intraperitonealmente con 100 µ? de una mezcla de (a) bacterias a partir de la cepa 8047 (7xl03 de CFU por rata) y (b) antisuero de cobayo inactivo por calor o mAb de control anticápsula (SEA 3 (Van Der Ley et al. (1992) Infect. Immun. 60:3156)). En el experimento 2, se trata el grupo de seis ratas con el mAb control o con diferentes diluciones de antisuero de cobayo en el tiempo 0. Dos horas más tarde, se retan con las 2996 bacterias (5.6xl03 CFU por rata) . En ambos experimentos, se obtienen cultivos sanguíneos 18 horas después del reto por puncionar el corazón con una jeringa y aguja que contiene aproximadamente 25 U de heparina sin conservador. Los números de bacterias en los cultivos sanguíneos se obtiene por plaquear 1, 10 y 100 µ? de sangre en el agar de chocolate durante la noche. Para cálculo de media geométrica CFU/ml, se asignan los animales con cultivos estériles un valor de 1 CFü/itil: Los resultados son como sigue : Exp" Cultivo sanguíneo en 18 horas Tratamiento Positivo/ total CFU/ml (103) 1 mAb anticapsular 0/4 <0.001 (2µg/rata) antisuero anti-NadA 0/4 <0.001 (dilución 1:5) PBS+BSA al 1% 5/5 40.17 2 mAb ant i capsular 1/6 0.003 (20µg/rata) ant i suero anti-NadA 1/6 0.002 (dilución 1:5) ant i suero anti-NadA 3/6 0.035 (dilución 1:25) suero NadA preinmune 6/6 1.683 De esta forma el antisuero de NadA es altamente protector en este ensayo. Sobre todo, por lo tanto, NadA tiene varios atributos de ser un buen antígeno de vacuna; (i) es una molécula expuesta en la superficie, potencialmente implicada en adhesión bacteriana; (ii) está presente en por lo menos 50% de las cepas asociadas a enfermedad y en casi 100% de tres linajes hipervirulentos; (iii) produce anticuerpos protectores y bactericidas en animales de laboratorio; y (iv) cada alelo induce anticuerpos de bactericidas cruzados. ORF40 ORF40 muestra homología a Hsf y su variante alélica Hia, ambas adhesinas de Haemophilus influenzae . El tamaño diferente entre Hia, Hsf y ORF40 está en parte explicado por la presencia de tres copias de un dominio grande repetido en Hsf, el cual está presente en una copia sencilla en Hia y solo y parcialmente en ORF40 (Figura 7) . En MenB, ORF40 se encuentra en la membrana externa como una proteína de aproximadamente 200 kDa (por ej . PM predicho de 59 kDa para proteína madura) . App App muestra homología (Figura 8) a la proteína de adhesión y penetración Hap de H. Influenzae, la cual es una adhesina con una actividd de serina proteasa que sufre escisión autoproteolítica y liberación extracelular (Hendrixson et al. (1997) Mol Microbiol 26:505-518). Hap asociada a superficie no escindida media la adherencia a células epiteliales y promueve la agregación y colonización bacteriana . En N. meningitidis, App se exporta a la membrana externa, se procesa y secreta. Ambas Hap y App pertenecen a la familia autrotransportadora la cual comprende proteínas de bacterias gram negativas caracterizadas por un mecanismo distinto de secreción. Este sistema es descrito primero para IgAl proteasa de N. gonorrhoeae, la cual se considera el prototipo de esta familia. Las proteínas de la familia autotransportadora han sido implicadas en la virulencia de muchos patógenos gram negativos (Henderson & Mataro (2001) Infect Immun. 69:1231-1243). Se sintetizan como proteínas precursoras grandes que comprenden por lo menos tres dominios funcionales; una secuencia líder N terminal típica, un dominio interno (domino pasajero) y un dominio C terminal (dominio translocador o dominio ß) . La secuencia líder media la exportación (dependiente a sec) de la proteína al periplasmo. Subsecuentemente el dominio translocador se inserta en la membrana externa que forma un poro de barril ß para permitir la exportación del dominio pasajero. Una vez en la superficie bacteriana, el dominio pasajero puede ser escindido y liberado en el ambiente. La escisión puede ocurrir por un evento autoproteolítico dirigido por actividad de proteasa en el dominio pasajero por sí mismo. Los dominios de pasajero de autotransportadores son divergentes ampliamente, reflejando sus papeles disparados remare dablemente . Por el contrario los ß dominios exhiben alto grado de conservación consiste con su función conservada . App posee los dominios prevalescentes de las proteínas autotransportadoras así como también el patrón de proteasa de serina conservada (GDSGSP) . Se ha mostrado que este patrón es responsable para escisión de IgA humana por las IgAl proteasas de Neisseria y para escisión autoproteolítica de proteína Hap de H. Influenzae. App se ha mostrado para ser un antígeno conservado entre meningococci , para ser expuesto durante infección y portado, para estimular células B y células T, y para inducir una respuesta de anticuerpo bactericida (Hadi et al. (2001) Mol. Microbiol . 41:611-623; Van Ulsen et al. (2001) FEMS Immunol Med Microbiol 32:53-64) . En la cepa del serogrupo B 2996, App tiene 1454 aminoácidos y un PM predicho de 159,965 Da. La Figura 26 muestra las características estructurales predichas de la proteína. Tres dominios pueden ser observados: dominio 1 (aminoácidos 1-42) es el péptido de señal; dominio 2 es el dominio pasajero, el cual es la proteína activa funcionalmente; dominio 3 es el dominio translocador C terminal con estructura de pbarril . Como en la terminal N del dominio pasajero, His-115, Asp-158 y Ser-267 corresponde a la serina proteasa catalítica triad His-98, Asp-140 y Ser-243 de Hap (Fink et al. (2001) J Biol Chem 276:39492-39500). Los residuos 285-302 son un sitio de enlace ATP/GTP putativo (circuito P) , el cual sugiere un mecanismo de acoplamiento de energía para translocación de membrana externa. Hacia la terminal C del dominio pasajero, están presentes dos regiones ricas en Arg. La primera (RRSRR) tiene los residuos 934-938 y la segunda (RRARR) inicia en los residuos 1149. Dos patrones son reminiscentes de objetivos conocidos para sitios de escisión proteolíticos como tripsina tales como una en toxina difteria y aquellos corriente arriba de los sitios de autoescisión de Hap de H. Influenzae, IgA proteasa de N. gonorrhoeae y FhaB de B. Pertussis (Figura 26, Cuadro I) . Corriente abajo de las regiones ricas en Arg están los patrones 95NTL956 y 117SNSG1178, las cuales son idénticos o similares a los sitios de escisión en autotransportadores Ssp {Serratia marcescens) . Prn [Bordetella bronchiséptica) , Brka {Bordetella pertussis) (José et al. (1995) Mol. Microbiol 18:378-380) y Hap (H. Influsnzae) (Figura 26, cuadro 2) . Juntos, estos patrones de secuencia sugieren que los dos patrones 9S4NTL956 y 1176NSG1:1'78 y el patrón R (A, S , R) 2RR pueden actuar como señales para localización correcta de sitios de procesamiento corriente ab jo . Análisis adicional de la secuencia App muestra una región rica en prolina, donde el patrón dipéptido PQ es repetido cuatro veces iniciando en el residuo 1156. Una búsqueda para homología para secuencias de proteínas conocidas revela alguna similaridad a las proteínas superficiales de S. pneumonie Pspa y PspC y a una región rica en prolina de la proteína de membrana externa de B. Pertussis pertactin p69, donde el patrón (PQP) se ubica en un circuito que contiene el epitopo inmunoprotector principal . Finalmente, los últimos tres aminoácidos de App (YRW) son idénticos a aquellos de Hap donde han sido descritos como cruciales para ubicación de membrana externa y estabilidad de proteína (Hendrixson et al. 1997) . Expresión en E. coli sin patrones de fusión Se clonan genes de ORF40, App y NadA de longitud completa en pET21b+ vector y los plásmidos se transforman en BL21 (DE3) de E.coli con el fin de expresar los genes bajo contol del promotor T7. Se logra la expresión activando el promotor con IPTG o bajo condiciones no inducidas. La localización y exposición superficial de las proteínas se ensayan por experimentos de f accionamiento celular (SDS-PAGE y Western blot) , análisis FACS e inmunoblot de célula entera. Como se muestra en las Figuras 1 a 3, todas las tres proteínas se translocan a la superficie de E. coli. -ORF40 se expresa como forma monomérica y posiblemente forma también multimeros (Figura 1) . - App se exporta a membrana externa de E. coli como un precursor de aproximadamente 160 kDa, que se procesa y secreta en el sobrenadante de cultivo (Figura 2) . NadA se encuentra para estar presente en la fracción de membrana externa como una banda de peso molecular alto sencilla de aproximadamente 180 kDa. Esto corresponde probablemente a una forma oligomérica de la proteína. Tal banda está ausente en JE?, coli que expresa NadA intracelular (Figura 3) . Se estudia la expresión de App con más detalle Se prepara el ADN genómico de la cepa 2996 de N. meningitidis como se describe previamente (Tinsley & Nassif (1996) PNAS USA 93:11109-11114). El ADN carece de la secuencia que codifica para el péptido de señal (aminoácidos 1 a 42) y el codón de terminación se amplifica usando cebadores PCR SEQ ID 18 y 19 seguido por digestión con Nhel y Xhol e inserción en los sitios Nhel/Xhol del vector de expresión pET-21b, para dar "pET-App-His" (Figura 27) . Se introduce este plásmido en BL21(DE3) de JE?, coli y se usa para la expresión de proteina de fusión objetivada con His C terminal la cual se purifica y se usa para originar anticuerpos. Se amplifica el gen app de longitud completa y se clona en una forma similar, usando los cebadores de PCR SEQ ID 20 y 21, para dar el plásmido pET-App" . Se introducen los plásmidos en BL21 (DE3) de E. coli y expresión inducida de IPTG 1 mM. Se detecta la proteína expresada por western blottxng (Figura 28, banda 1) . Para verificar eso la proteina se exporta a la superficie de E. coli, se usan FACS (Figura 29) y microscopía de inmunofluorescencia (Figura 30) . El análisis FACS muestra expresión superficial positiva en los transformantes pET-App (gen de longitud completa) pero no expresión superficial con App-His (sin péptido de señal) o con el vector vacío. Los resultados de inmunofluorescencia están de acuerdo con FACS . Por lo tanto la expresión del gen app de longitud completa resulta en la exportación de App a la superficie de E. coli, pero la deleción de los primeros 42 aminoácidos abolió la localización de superficie El análisis Western blot de proteínas de membrana externa a partir de transformantes pET-App revela una banda reactiva específica de ~160 kDa (Figura 28, banda 1), que corresponde al peso molecular predicho de la proteína de longitud completa. Una banda correspondiente está olvidada en la fracción de membrana externa a partir de controles no transformados (banda 3) . El análisis Western blot de sobrenadantes de cultivo revela una proteína secretada de ~100 kDA con pET-App (banda 2) que está ausente con los controles no transformados (banda 4) . Algunas veces se detecta también una banda muy débil en ~140 kDa en transformatnes pET-App. Por lo tanto el gen app de longitud completa cuando se introduce en E. coli induce la expresión de una proteína App la cual se exporta a la membrana externa, se escinde y libera en el sobrenadante de cultivo. La expresión nativa puede influir en la calidad de la respuesta inmune Para evaluar el papel de la conformación de proteína en inducción de una respuesta inmune, las vesículas de membrana externa a partir de E. coli que expresa ORF40, App o NadA se aislan y se usan para inmunizar ratones. Se prueban los sueros para actividad bactericida y los resultados se comparan con aquellos obtenidos con las proteínas de fusión. La respuesta bactericida (cepa 2996) se mejora 5-10 veces cuando las proteínas se producen en su forma "nativa" en OMV. Antígeno Títulos bactericidas* Proteína de fusión OMV de E coli ORF40 256 2048 App 64 1024 NadA 32768 >65536 *Los títulos expresados como el reciproco de la dilución sérica que produce ~50% de muerte bacteriana Escisión autoproteolítica de App Transformantes de pET-App de E. col! secretan un producto de 100 kDa en el sobrenadante de cultivo y muestran un producto superficial de 160 kDa. Para probar si el producto App secretado se deriva de un proceso autoproteolítico, un residuo catalítico putativo (Ser-267) se reemplaza con Ala. Se obtiene el mutante pEt-AppS267A por mutagenesis dirigida a sitio usando el equipo QuikChange (Stratagene) y cebadores SEQ ID 22 y 23. El análisis SDS-PAGE de proteínas totales a partir de transformantes pET-AppS267A (Figura 31, banda 2) muestra una proteína similar en tamaño para los transformantes de pET-App (banda 1) . La proteína se muestra para ser expuesta superficialmente por análisis FACS (Figura 29) . El análisis Western blot de sobrenadantes de cultivo muestra App en transformantes pET-App (Figura 32, banda 1) pero no en transformantes pET-AppS267A (banda 2) . La mutación de Ser-267 a Ala abóle de esta forma procesamiento y secreción del precursor App, el cual permanece asociado a célula. Estos datos sugieren que App tiene una actividad de serina proteasa que es responsable para procesamiento autoproteolítico y liberación en el sobrenadante del dominio App secretado. La escisión en 95NTLS5S puede dejar un fragmento con peso molecular predicho de 104190 Da. La escisión en 117SNSG1:L78 puede dar un fragmento de 128798 Da. Estos dos fragmentos predichos pueden acoplar las dos bandas de ~140 y ~100 kDa observadas en sobrenadantes de cultivo. La escisión puede ocurrir primero para dar el fragmento de -140 kDa y después para dar el fragmento de 100 kDa. El dominio ß de App puede de esta forma empezar en el residuo 1177. NadA, ORF40 y App funcionan como adhesinas El ejemplo 22 de la solicitud de patente Internacional O 01/64922 describe que la expresión de NadA en E. coli hace a la bacteria transformada adherirse a células epiteliales humanas . El fenotipo adherente ha sido además estudiado para NadA y también para App y ORF40. Las bacterias BL21 de E. coli (108 CFU) , crecidas bajo condiciones no inducidas o inducidas, se inoculan en monocapas epiteliales humanas Chang (105 células) y se incuban en 37°C por 1 ó 2 horas. Las células se incuban entonces con anticuerpo secundario conjugado a PE y antifí. Coli de conejo. Se detecta la adhesión por FACS como intensidad de fluorescencia específica asociada con células Chang. Los controles positivos son DH5 de E. coli que expresa hsf (DH5/pDC601) ; los controles negativos BL21 (DE3 ) (pET21b y DH5a/pT7-7. Los resultados en la Figura 4 muestran que la capacidad de las cepas de E. coli recombinantes para adherirse a células epiteliales cultivas se asocian con expresión de estas tres proteínas . Para confirmar que estas tres proteínas son capaces de promover la interacción con células huésped, las proteínas recombinantes por sí mismas son investigadas para enlace a células epiteliales. 105 células epiteliales humanas de Chang (derivado de Wong-Kilbourne, clon l-5c-4, conjuntiva humana) se incuban en 4°C por 30 minutos con medio solo o con diferente concentración de ORF40 (150 µg/ml) , App (150 g/ml) , o NadA (300 µg/ml) , o con GNA2132 (300 g/ml) como control negativo (Véase Pizza et al. (2000)). Se detecta el enlace por FACS usando antisueros policlonales contra las proteínas recombinantes sencillas y un anticuerpo conjugado a PE secundario. Los cambios de señal FACS (Figura 5) muestran que las tres proteínas son capaces de enlazar a células epiteliales humanas, mientras que no lo hace GNA2132 (control negativo) . La Figura 6A muestra que el enlace se incrementa en una forma dependiente a dosis. El enlace de NadA alcanza una meseta alrededor de 200 µg/ml. GNA2132 falla para enlazar incluso en 400 µg/ml (Figura 6B) . Los datos en la Figura 6 son valores de intensidad fluorescente media (MFI) graficados contra concentración de proteína ^g/ml) . Usando FACS, se observa también el enlace de NadA a células con Hep-2 y células MOLT-4, pero no con células HeLa, A549, Hec-1B, Hep-G2, CHO o HUVEC . La adhesión a células Chang puede ser abolida por tratar las células con pronasa, lo cual indica que el receptor humano para NadA es una proteína. Se observa también la adhesión de la proteína NadA purificada a células conjuntivas Chang observadas usando microscopía inmunofluorescente . Se incuba la proteín (que carece de su dominio de anclaje C terminal) con células Chang en 37°C en medio de cultivo completo por 3 horas en varias concentraciones. Las células se lavan entonces, se fijan y se analizan por microscopía confocal láser después de teñir con anticuerpos policlonales de ratón anti-NadA y anticuerpos IgG antiratón de rojo Texas secundario. No se observa ningún enlace en 0 nM (Figura 17A) , pero el enlace es evidente en 170 nM (17B) y 280 nM (17C) , con aglomeramiento evidente en concentraciones superiores. En contraste, no se observa enlace de NadA con células Hela, incluso en 280 nM de proteína (17D) . El enlace es mucho más evidente en 37°C (Figura 18A) que en 4°C (Figura 18B) . Las estructuras como punto observadas en 4°C, comparadas con glomérulos en 37°C, sugiere que las interacciones laterales entre los monómeros NadA son dependientes temperaturas (influenciadas por fluidez de membrana) .

Para distinguir la proteína superficial y endocitosada, se agrega detergente de saponina durante el procedimiento de tinción. Los glomérulos intracelulares que tienen el tamaño de endosomas son más evidentes (flecha) cuando se usa saponina, pero una alta proporción de proteína permanece en la superficie celular (Figura 19) . La inmunofluorescencia también revela que NadA enlaza a los monocitos (Figura 20A) . NadA sola (sin anticuerpo de tinción; 20B) y NadA teñida con preinmunosuero (20C) no son visibles. En amplificación alta, se observa evidencia de captación en vesículas (ya sea endosomas o fagosomas) . La Figura 21 muestra que los macrófagos de murina . (línea 264.7) enlazan y endocitosan NadaA (125 nM, 3 horas, 37°C, células cultivadas en DME ) . Calentar NadA en 95 °C por 15 minutos antes a la incubación remueve su capacidad para enlazar a monocitos, como se mide por secreción de IL- por las células (Figura 22) . La actividad estimulatoria de preparaciones de NadA es de esta forma lábil al calor. La actividad estimulatoria es también bloqueada por el uso de anti-CD14 (Figura 23) o por la remoción de NadA a partir de las preparaciones usando anti-NadA inmovilizada con perla. Se usa también microscopía de inmunofluorecencia para detectar enlace de E. coli que expresa NadA. E. coli transformada enlaza fuertemente (Figura 24A) mientras que bacterias no transformadas no enlazan (24B) . Liberación de IL-oc por monocitos es más de 1.5x superior usando la E. coli transformada que las bacterias no transformadas en una relación de bacteria/monocitos de 40:1. Se enlaza E. coli transformada a portaobjetos de vidrio, se fijan y tiñen doble con anticuerpos anti-NadA (Figura 25A) y anti-E. coli (25B) . Cuando se usan ambos, los parches de anti-NadA. son visibles, lo cual sugiere que NadA tiende a formar agregados en la superficie bacteriana, lo cual obstaculiza la interacción de anticuerpos con otros antigenos superficiales . Viendo App, se incuban cepas de E. coli recombinantes con monocapas de células epiteliales de conjuntiva de Chang (derivado Wong-Kilbourne, clon l-5c-4 (conjuntiva humana), ATCC CCL 20.2) y se analiza la adhesión usando FACS . Las células obtenidas a partir de monocapas confluyentes se siembran en 105 células por pozo en placas de cultivo de tejido de 12 pozos y se incuban por 24 horas. Los cultivos de bacterias después de inducción con IPTG se lavan dos veces en PBS y se vuelven a suspender en D EM + 1% de FBS a una concentración de 5xl08 bacterias por mi. Las alícuotas de 1 mi de cada cepa se agregan a cultivos de monocapa de células Chang y se incuban por 3 horas en 37°C en C02 al 5%. Se remueven las bacterias no adherentes por lavar tres veces con PBS, y se agrega 300 µ? de solución de disociación celular (Sigma) a cada pozo de raicrotitulo. Se continúa la incubación en 37°C por 10 minutos. Se cosechan las células y después se incuban por 1 hora en 4°C con antisuero anti-E.Coli policlonal de conejo (DA O) . Las células se lavan dos veces en PBS+FBS al 5% y se incuban por 30 minutos en 4°C con IgG anticonejo conjugado a R-ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch Laboratories) . Se lavan entonces las células en PBS + FBS al 5% y se vuelve a suspender en PBS 100 µ? . Se mide la fluorescencia con citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson) . Para cada perfil de fluorescencia, se analizan 10000 células. Los resultados reportados en la Figura 33 muestran que transformantes pET-App son capaces de adherirse a células Chang, dando un cambio de fluorescencia de 90.3%. Los transformantes S267A son también capaces de adherirse (91.0%) . E. coli no transformada es incapaz de adherirse a células Chang (gráfica FACS de fondo) . Como para NadA, los resultados de FACS están de acuerdo con datos de microscopía de inmunofluorescencia . Como se muestra en las Figuras 34A y 34B, los transformantes pET-App incubados con monocapas demuestran altos niveles de adhesión a células epiteliales y agregación de bacteria bacteria visible. Para el mutante S267A, se incrementan la adhesión y agregación bacteriana (34C y 34D) . Los controles no transformados no muestran adhesión (34G) . La deleción de los primeros 42 aminoácidos también abóle la adhesión. En contraste a las células epiteliales, no se observa adhesión cuando las células endoteliales HUVEC se prueban con transformantes pEt-App. Para provocar sepsis y meningitis, N. meningitidis tiene que interactuar con células endoteliales humanas. App puede de esta forma estar implicada en la primera etapa de colonización en el nivel de mucosa epitelial respiratoria humana, más que en colonización endotelial patológica. Localización y especificidad de actividad de enlace App Para identificar la región de enlace de App, se usa una proteína quimérica nombrada ?? ß . Esta proteína consiste del dominio C terminal de App (aminoácidos 1077 a 1454) fusionados al péptido líder de la IgAl proteasa de N. gonorrhoeae. Se elige la secuencia líder gonococcal porque ha sido bien caracterizada y es funcional en E. col!. El plásmido ???-???ß contiene un fragmento de 1.1 kbp de ADN ampliicado por PCR usando SEQ ID 26 y 27. Se introduce la construcción ???-???ß en BL21 (DE3) de E. coli . Los estudios de localización de FACS confirman que ???ß se ubica en la superficie de E. coli. El ensayo de adhesión in vitro usando células epiteliales Chang muestra adhesión por inmunofluorescencia (Figura 34E y 34F) .

El análisis de FACS muestra que los transformantes ???-???ß son todavía capaces de adherirse a células epiteliales pero en niveles inferiores (74.2% de cambio) que los transformantes pET-App. Estos resultados indican que el dominio de enlace App se ubica en su región G terminal, en el fragmento lOOmer entre los residuos 1077 y 1176. Las proteínas recombinantes purificadas se estudian también. ???-a-His consiste de la porción N terminal de App (aminoácidos 43-1084) fusionada a una etiqueta poli-His. El plásmido ???-???a-His contiene un fragmento Nhel/Xhol 3.1 kbp amplificado por PC con SEQ ID 24 y 25. La actividad de enlace de ???-a-His recombinante purificado se compara con aquella de App-His por los ensayos de enlace FACS. Se incuban las células Chang con concentraciones incrementadas de proteínas App recombinantes o lipoproteína N B2132-HÍS (control negativo) . El enlace de App-His ( ) se incrementa en una forma dependiente a dosis y alcanza una meseta en una concentración de ~50 µ9/p?1 mientras el enlace de ???a-his ( ) es muy bajo (Figura 35) . El control MB2132-His ( ) falla para enlazar a células Chang. Para explorar la naturaleza bioquímica de la molécula implicada en interacción con App, las células Chang se tratan con pronasa o fosfolipasa A2 antes de los experimentos de enlace. 105 células por pozo se colocan en microplacas y se incuban en DMEM libre de FCS en 37°C en C02 al 5% por 30 minutos con (a) pronasa en 250, 500 ó 1000 |jg/ml o (b) fosfolipasa A2 en 50, 200 ó 800 µg/tl. Después de la incubación enzimática, se agrega un volumen igual de medio completo a cada pozo para detener la reacción. Se mezclan las células subsecuentemente con 100 µ-g/ml de App-His o medio solo y se incuba por 1 hora en 4°C. Como se muestra en la Figura 36, el tratamiento con pronasa (columna del lado izquierdo) reduce marcadamente el enlace de proteina App-His a células Chang, mientras que el tratamiento con fosfolipasa A2 (columna del lado derecho) no reduce el enlace. El receptor para App en células Chang es de esta orma proteináceo . Se prueba también la adhesión a líneas celulares diferentes (Figura 37) . Después de la incubación de células cultivadas con tres concentraciones diferentes de App-His (100, 25 y 6.25 g/ml) se observa enlace de alto nivel a células Chang y células HepG2, un nivel moderado de enlace a células A-549, y enlace mínimo a células HeLa. No se observa enlace a líneas celulares epiteliales Hec-l-B, hep-2, 16HBE14o o a células endoteliales HUVEC. Bloqueo de App Después del trabajo en E. coli que sugiere un papel de adhesión para App, se construye una cepa mutante isogenica de N. meningitidis . La cepa de partida es MC58. Su gen de app se trunca y reemplaza con un cásete antibiótico por transformar la cepa progenitora con el plásmido pBSUDAppERM, el cual contiene un gen app truncado y el gen ermC (resistencia a eritromicina) para intercambio alélico. Brevemente, 600 pb de la región de flanqueo corriente arriba que incluye el codon de inicio y 700 pb de la región de flanqueo corriente abajo que incluye el codón de terminación se amplifican a partir de MC58 usando cebadores SEQ ID 28 a 31. Se clonan los fragmentos en pBluescript y se transfoma en DH5 de E. colí usando técnicas estándar. Una vez que se completa toda la subclonación, se transforma la cepa MC58 de N. meningitidis competente naturalmente por seleccionar unas cuantas colonias crecidas durante la noche en placas de agar GC y se mezclan con 20 µ? de 10 mM TrisHCl pH 8.5, que contiene 1 µg de ADN de plásmido. Se hacen manchas con la mezcla en una placa de agar GC, se incuban por 6 horas en 37°C, 002 al 5% después se diluye en PBS y se esparse en placas de agar GC que contienen 5 µ?/ml de eritromicina. El gen app de deleción en el genoma de MC58 se confirma por PCR. Se confirma la carencia de expresión de App por análisis Western blot. Se evalúa la adhesión de MC58 del tipo silvestre y la cepa mutante MC58Aapp isogénica en células Chang. Hay una reducción de ~10 veces (en el intervalo de 3- a 27 veces en diferentes experimentos) de la asociación del mutante knockout comparado con la cepa del tipo silvestre (Figura 38) . No se observa ninguna diferencia entre el mutante app" y la cepa progenitora con líneas celulares Hep2 y 16HBE14o y con células endoteliales HUVEC, lo que confirma que App no medía la adhesión a estas células. No han sido previamente reportadas las adhesinas no pilosas las cuales contribuyan a la adhesión de N. meningitidis en un antecedente capsulado. Se estudia la expresión de App en MC58 de N. meningitidis. Se hacen crecer colonias a partir de placas durante la noche y se diluyen en caldo GC y se incuban en 37°C con C02 al 5%. Se toman muestras cuando ODS2o nm=0.5 (fase log mid) y 0.8 (fase estacionaria) y se analizan por western blot . Se detectan dos bandas con pesos moleculares aparentes ~160 y ~140 kDa en lisados de células enteras de bacterias de fase log (Figura 39, banda 1) , mientras las bacterias de fase estacionaria muestran solamente una banda tenue en ~140 kDa (banda 3) . Como se espera, no se observa App en el mutante ???? (bandas 2 y 4) . En contraste marcado, las muestras de sobrenadante de MC58 del tipo silvestre muestran una banda de ~140 kDa y su cantidad es superior en fase estacionaria que en fase log (Figura 40, bandas 3 y 1) . La muestra de fase estacionaria también muestra una banda reactiva en ~100 kDa. Se entenderá que la invención es descrita anteriormente por la forma de ejemplo solamente y pueden hacerse modificaciones mientras permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.

TABLA I : Características de 26 cepas de N. in&zujgitidis y su alelo de gen de nadA Cepa Serogrupo Grupo Alelo Repeticiones Expresión tipo : subtip clonal nadA (TAAAT) de NadA o 64/69 NG:15:P1.7, ET-5 1 4 + 16 BZ83 B:15 ET-5 1 5 +++ CU385 B:4:P1.15 ET-5 1 6 ++ MC58 B:15 :P1.7,1 ET-5 1 9 + 6b BZ169 B:15:P1.16b ET-5 1 12 ++ 95330* B: :P1.15 ET-5 1 9 ND ISS1104 B:15:P1.7,1 Nd 1 4 + 6 ISS1071 B:15 :P1.7, 1 Nd 1 5 +++ 6 ISS832 B:15 :P1.7 Nd 1 5 ++ NM119 B.4P1.15 Nd 1 6 Nd NM066 B:15:P1.7,1 Nd 1 12 Nd 6 90/18311 C:NT:P1.5 ET-37 2 9 ++ NGP165 B:NT:P1.2 ET-37 2 9 ++ FAM18 C:2a :P1.5,2 ET-37 2 9 Nd 986 B:2a :P1.5,2 ET-37 2 12 ++ ISS1024* C:2b:P1.5 Nd 2 9 ++ ISS838 C:2a:Pl .5,2 Nd 2 6 ++ PMC8 C Nd 2 10 ++++ 961-5945 B:2b:Pl .21, A4 2 12 +++ 16 ISS759* C:2b:P1.2 Nd 3 8 ++++ F6124 A Subgru 3 9 + po III NMB B:2b:Pl .5, 2 Nd 3 12 ++ 8047 B:2b:P1.2 Nd 3 12 +++ 2996 B:2b:P1.5- Nd 3 12 +++ 1.2 CU C:NT:P1.1 Nd 3 12 +++ 973-1720* C:2b:Pl .2 A4 3 12 +++ *indica que la cepa porta una variante menor del alelo relevante d=no hecho TABLA II: Características de las cepas de N. meningitidis analizadas por expresión de NadA ST ET cepa año Serogrupo : tipo : país enfermedad Gen subtipo NadA 74 ET5 MC58 1985 B : 15 : Pl .7 , 16t> GB Caso + 32 ET5 H44/76 1976 B:15:P1.6,16 Noruega Caso + 32 ET5 BZ169 1985 B:15:P1.16 Holanda Caso + 32 ET5 30/00 2000 B:15:P1.7,16 Noruega Caso + 33 ET5 N44/89 1989 B:4,7:P1.19,15 Brasil Caso + 34 ET5 BZ83 1984 B:15 Holanda Caso + - ??5 72/00 2000 B:15:P1.7,13 Noruega Caso + - ET5 39/99 1999 C:15:P1.7,16 Noruega Caso + - ET5 M4102 1996 B ND USA Caso + - ET5 95330 1995 B:4:P1.15 Canadá Caso + - ET5 2201731 1993 NG:4:P1.15 Islanda Portador + - ET5 64/96 1996 NG:15:P1.17,16 Noruega Portador + - ET5 CU385 1980 B: :P1.15 Cuba caso + - ??5 8680 1987 B Chile Caso + - ??5 204/92 1992 B Cuba Caso + - ET5 EG329 1985 B Alemania Caso + - ET5 NG080 1981 B Noruega Caso + - ET5 NG144/82 1982 B Noruega Caso + - ET5 NGPB24 1985 B Noruega Caso + - ??5 196/87 1987 C Noruega Caso + — ET5 k521/99 1999 B Costa Caso + ivory - ET5 GR4/00 2000 - Grecia Caso + 11 ET37 FAM18 1983 C:2a :P1.52 Usa Caso + 11 ??37 L93/4286 1993 C RU Caso + - ET37 NGP165 1974 B:NT:P1.2 Noruega - + - ET37 M986 1962 B:2a:P1.5,2 USA Caso + - ET37 C4678 1998 C:2S --P1.52 lemania caso + - ET37 95N477 1995 B:2S :P1.2 Australia Caso - - ET37 BRAZ10 1976 C Brasil caso + - ET37 F1576 1984 C Ghana Caso - ET37 M597 1988 C Israel caso + - ET37 500 1984 C Italia Caso + - ET37 DI 1989 C Mali Caso + - ET37 NGP20 1969 B Noruega Caso + - ET37 MA-5726 1985 C España Caso + - ET37 38VI 1964 B USA Portador + - ET37 Nl/99 1999 C:2a Noruega Caso + - ET37 N28/00 2000 -135 :2a Noruega Caso + 66 ?4 973-1720 1997 C:2b:P1.2 Australia Caso + 153 A4 961-5945 1996 B:2b:P1.21,16 Australia Caso + - A4 5/99 1999 B:2b:P1.5,2 Noruega Caso + - ?4 312294 1995 C::2b:P1.5, 2 U Caso + - A4 96217 1996 B: :2b:P1.5, 10 Canadá Caso + - A4 G2136 1986 B RU Caso + - A4 312901 1996 c RU Caso + - A4 A 22 1992 B Grecia Caso + - A4 BZ10 1967 B Holanda Caso + - A4 BZ163 1979 B Holanda Caso + - A4 B6116/77 1977 B Islandia Caso + - A4 95/155 1994 C Nueva Caso + Zelanda - A4 SB25 1990 C Sudáfrica Caso + - A4 N53/00 2000 C: :2b:P1.5, 2 Noruega Caso + - A4 N62/00 2000 C: :2b:P1.5, 2 Noruega Caso + 41 Lin. III BZ198 1986 B: :NT Holanda Caso - 42 Lin. III M198/254 1998 B: :4:P1.4 Nueva Caso - Zelanda 158 Lin. III 972-0319 1997 B: :NT:P1.4 Australia Caso - 159 Lin. III 980-2543 1998 B: :NT:P1.4 Australia Caso - 1127 Lin. III 67/00 2000 B: :4.7 Noruega Caso - - Lin. III 93/114 1993 C: :4 :P1.4 Bélgica Caso - - Lin. III M198/172 1998 B; :4 :P1.4 Nueva caso _ zelanda - Lin. III 347/97 1997 B: :4 :P1.4 Nueva Caso zelanda - Lin. III 386/98 1998 B: :4 :P1.4 Nueva Caso _ zelanda - Lin. III 289/98 1998 B: ¦? :P1.4 Nueva Caso zelanda - Lin. III 392/98 1998 B: :4:P1.4 Nueva caso _ zelanda - Lin. III 394/98 1998 B: :4:P1.4 Nueva caso zelanda - Lin. III 400 1991 B Austria Caso - - Lin. III 40/94 1994 B Chile Caso _ - Lin. III A 50 1992 B Grecia Caso - Lin. III M-101/93 1993 B Islandia caso - - Lin. III 931905 1993 B Holanda Caso - - Lin. III 91/40 1991 B Nueva Caso Zelanda - Lin. III 50/94 1994 B Noruega Caso - - Lin. III N45/96 1996 B Noruega Caso - - Lin. III 88/03415 1988 B Escocia Caso - 1 sl BZ133 1977 B: :NT Holanda Caso - 5 sIII F6124 1988 A Chad Caso + 4 sIV-1 205900 1990 A4,21:P1.7 :1 ali Caso _ 4 sIV-1 Z2491 1983 A Gambia Caso - 12 otro NG3/88 1988 B: :8 (2) :P1. 1 Noruega Caso - 13 Otro NG6/88 1988 B: ;NT:P1.1 Noruega Caso - 14 Otro NGF26 1988 B : ;NT:P1.16 Noruega Portador - 15 Otro NGE31 1988 B: :NT Noruega Portador - 18 Otro 528 1989 B: :nd Rusia Caso 20 Otro 1000 1988 B:NT:P1.5 Rusia ' Caso - 22 Otro A22 1986 W-135 Noruega Portador - 26 Otro NGE28 1988 B:4 Noruega Portador + 29 Otro 860800 1986 y Holanda Caso - 31 Otro E32 1988 Z Noruega Portador - 35 Otro SWZ107 1986 B:4 :P1.2 Suiza Caso - 36 Otro NGH38 1988 B:NT:P1.3 Noruega Portador - 38 Otro BZ232 1964 B:NT:P1.2 Holanda Caso - 39 Otro E26 1988 X Noruega Portador - 43 Otro NGH15 1988 B:8 :P1.15 Noruega Portador - 47 Otro NGH36 1988 B:8:P1.2 Noruega Portador - 48 Otro BZ147 1963 B:NT Holanda Caso - 49 Otro 297-0 1987 B: :P1.15 Chile Portador - 540 Otro 2996 1975 B:2b:P1.5~1.2 RU Caso + 1034 Otro 96/1101 1996 C:14:P1.1, 7 Bélgica caso - - Otro 15 1990 B:14,19:P1.9,15 Eslovenia caso - - Otro M1090 1996 B:4 Israel Caso - - Otro M1096 1996 C:NT:P1.5 Israel Caso - - Otro B3937 1995 B:22 :P1.16 Alemania Caso + - Otro 31 1993 B:4 Finlandia Caso - - Otro 95074 1995 B:NT:P1.13 Canadá Caso + - Otro 660/94 1994 B:4 :P1.6 Algeria Caso - - Otro 30/93 1993 B:14:P1.14 Argentina Caso - - Otro 24370 1996 B:ND Sudáfrica Caso - - Otro 2411751 1993 NG:21:P1.16 Islandia portador - - Otro 1712741 1993 NG:15 Islandia portador - - Otro 65/96 1996 B:4 :P1.14 Noruega portador + - Otro 66/96 1996 B:17:P1.15 Noruega portador - - Otro 149/96 1996 B:1.19:P1.52 Bélgica portador + - Otro 16060 1991 B:4:P1.14 Bélgica portador - - Otro 16489 1991 NG:21:P.1.1 Noruega portador - - Otro 16990 1991 NG:14 :P1.5,2, 6 Noruega portador - - Otro 2022 1991 NG:4:P1.10 Noruega portador + - Otro M136 1968 B:11:P1.15 EUA Caso - - Otro 860060 1988 X Holanda Caso - Otro NGH41 1986 B Noruega portador - - Otro NGG40 1988 B Noruega portador - - Otro NG4/88 1988 B Noruega Caso - - otro EG3 7 1985 B DDR Caso - - Otro EG328 1985 B DDR Caso - - Otro 3906 1977 B China Caso - - Otro NGE30 1988 B Noruega - - Otro 71/94 1994 y Noruega Caso - - Otro DK2 1940 B Dinamarca Caso - - - Cll 1965 C:16:P1.7S,1 Alemania - + - - Pmc8 - C - - + - - NMB 1968 B:2b:P1.52 EUA Caso + - - 8047 1978 B:2b:P1.2 EUA Caso + S3446 1972 B :14:P1.23,14 EUA Caso ISS749 1996 B :14:P1.13 Italia Caso ISS759 1996 C :2b:P1.2 Italia Caso + ISS832 1997 B; :15:P1.7 Italia Caso + ISS838 1997 C: :2a :P1.5r2 Italia Caso + ISS1001 1999 B: :14:P1.13 Italia Caso ISS1024 2000 C :2b:P1.5 Italia Caso + ISS1026 2000 B :4:P1.13 Italia Caso ISS1071 2000 B :15:P1.7,16 Italia Caso + ISS1102 2000 B: : 15 : Pl . Italia Caso ISS1104 2000 B: :15:P1.7, 16 Italia Caso + ISS1106 2000 B: :4 :P1.4 Italia Caso ISS1113 2000 C: :2a:P1.5 Italia Caso + N1002/90 - - Brasil - + I C2135 - - Brasil - + MOOl - B; : ;P1.4 RU Caso M002 - B: :NT:P1.16 RU Caso NM004 - B : :NT:P1.14 RU Caso NM008 - B : : :P1.4 RU Caso NM009/10 - B: :4:P1.3.6 RU Caso NM021 - B : : :P1.16 RU Caso NM036 - C: :2a:Pl .10 RU Caso + N 037 - B : :2b:P1.10 RU Caso + NM050 - B: :NT:P1.9 RU Caso NM058 - B : :SrT:WST RU Caso NM066 - B: :15:P1.7,16 RU Caso + NM067 - C; :2a:NST RU Caso + M069 - B: :15:P1.7,16 RU Caso + M081 - C: :2a :P1.5,2 RU Caso + M088 - C: :2a:P1.5,2 RU Caso + NM092 - B: : :P1.4 RU Caso N 106 - B: :NT:P1.4 RU Caso NM107/8 - B: : :P1.4 RU Caso N 117 - B: 121-.P1.9 RU Caso M119 - B; :4:P1.15 RU Caso + M131 - B RU Caso NM145 - C RU Caso + N 154 - C: :NT:P1.52 RU Caso + NM156 - B : :15:P1.16 RU Caso + NM167 - B RU Caso 184 - B: :NT:P1.5,2 RU Caso M186 - B RU Caso 188 - B RU Caso + N 200 - B: :4 :P1.4 RU Caso TABLA III- listado de secuencia Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones -. 1. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de una o más de SEQ ID 1 a 14. 2. Una proteina caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% de identidad de secuencia a una o más de SEQ ID 1 a 14. 3. Una proteína caracterizada porque comprende un fragmento de una o más de SEQ ID 1 a 14. . La proteína de conformidad con la reivindicación 1, reivindicación 2 ó reivindicación 3, caracterizada porque incluye la secuencia heptad {??1??2??3?4??5??6??7) r, en donde ??? es Leu, lie, Val o Met ; cada uno de ??2 AA3 AA4 AA5 AA6 AA7 pueden ser independientemente cualquier aminoácido; y r es un entero de 1 ó más . 5. La proteína de conformidad con la reivindicación 3 , caracterizada porque comprende los aminoácidos 24 a 351 de SEQ ID 3. 6. El ácido nucleico caracterizado porque codifica una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. . Una composición inmunogénica caracterizada porque comprende (a) una proteína NadA Neisserial y/o (b) un ácido nucleico que codifica una proteína NadA Neisserial. 8. Un método para originar una respuesta anticuerpo en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 7 al mamífero. 9. Un método para proteger a un mamífero contra una infección Neisserial, caracterizado porque comprende administrar al mamífero la composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 7. 10. El uso de una proteína NadA Neisserial, o ácido nucleico que codifica una proteína NadA, en la fabricación de un medicamento para prevenir la infección Neisserial en un mamífero. 11. La proteína NadA Neisserial, o ácido nucleico que codifica la proteína NadA, para uso como un medicamento. 12. El método, uso o proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la proteína NadA comprende la secuencia de aminoácidos de una o más de SEQ ID 1 a 12. 13. El método, uso o proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque la infección Neisserial es una infección con N. meníngitidis de linajes hipervirulentos ET-5, EY-37 y cluster A4. 14. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque adicionalmente comprende un antígeno el cual, cuando se administra a un mamífero, produce una respuesta inmune la cual es protectora contra la cepa del linaje III de N. meningitidis . 15. Un método para purificar proteína App procesada, caracterizado porque comprende las etapas de: expresar un gen que codifica la proteína App en una célula huésped no Neisserial; y purificar la proteína App procesada a partir del medio de cultivo. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la célula huésped no Neisserial es E. coli. 17. La proteína purificada caracterizada porque es obtenible por el proceso de conformidad con la reivindicación 15 ó reivindicación 16. 18. Un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, caracterizado porque la capacidad de una o más App, ORF40 y/o NadA para enlazar a la célula epitelial es bloqueada. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el enlace se bloquea usando un anticuerpo específico para App, ORF40 y/o NadA. 20. Un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, caracterizado porque se inhibe la expresión de proteína a partir de una o más de App, ORF40 y/o NadA. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la expresión se inhibe usando técnicas antisentido. 22. El ácido nucleico caracterizado porque comprende un fragmento de x o más nucleótidos a partir del ácido nucleico el cual codifica App, ORF40, o NadA, en donde x es por lo menos 8. 23. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque tiene la fórmula 5'- (N) a- (X) - (N) b-3 ' , en donde 0>a>15, 0>b>15, N es cualquier nucleótido, y X es un fragmento de por lo menos 8 nucleótidos contiguos a partir de un ácido nucleico el cual codifica App, ORF40 o NadA. 24. Una bacteria Neisserial caracterizada porque una o más de App, ORF40 y/o nadA ha sido bloqueada. 25. Un método para prevenir la unión de una célula Neisserial a una célula epitelial, caracterizado porque una o más de App, ORF40 y/o NadA tiene una mutación la cual inhibe su actividad. 26. Una proteína imitante, caracterizada porque la proteína mutante comprende la secuencia de aminoácidos de App, ORF40 y/o NadA, o un fragmento de los mismos, pero en donde uno o más aminoácidos de las secuencias de aminoácidos es/son mutados. 27. El ácido nucleico caracterizado porque codifica la proteína mutante de conformidad con la reivindicación 26. 28. Un método para producir el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico fuente que codifica App, ORF40 o NadA, y (b) realizar mutagénesis en el ácido nucleico fuente para proporcionar un ácido nucleico que codifica una protelna mutante. 29. Un método para tamizar los compuestos los cuales inhiben el enlace de una célula Neisserial a una célula epitelial, caracterizado porque comprende las etapas de (a) incubar la proteína App, ORF40 y/o NadA con una célula epitelial y un compuesto de prueba; (b) probar la mezcla para determinar si ha sido inhibida la interacción entre la proteína y la célula epitelial . 30. Un compuesto caracterizado porque esidentificado usando el método de conformidad con la reivindicación 29. 31. Una composición caracterizada porque comprende (a) una bacteria E. coli la cual expresa App y/o ORF40 (y opcionalmente, NadA) y (b) una célula epitelial. 32. Un método para preparar una vesícula de membrana externa (O V) a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizado porque la célula expresa un gen que codifica la proteína App, ORF40 o NadA. 33. Un método para preparar una OMV a partir de una célula huésped no Neisserial, caracterizado porque la célula expresa un gen que codifica una o más de las siguientes proteínas: (A) incluso SEQ ID 2-892 de la solicitud WO 99/24578; (B) incluso SEQ ID 2-90 de la solicitud WO 99/36544; (C) incluso SEQ ID 2-3020 de la solicitud WO 99/57280; (D) incluso SEQ ID 3040-3114 de la solicitud WO 99/57280; (E) incluso SEQ ID 3115-3241 de la solicitud WO 99/57280; (F) las 2160 proteínas NMB0001 a MB2160 de Tettelin et al . (supra) . (G) Una proteína la cual comprende la secuencia de aminoácidos de una o más de (A) a (F) ; (H) Una proteína que comparte la identidad de secuencia con la secuencia de- aminoácidos de uno o más de (A) a (F) ; y (I) Una proteína la cual comprende un fragmento de uno o más de (A) a (F) . 34. El método de conformidad con la reivindicación 32 ó reivindicación 33, caracterizado porque la célula huésped No Neisserial es E. coli . 35. OMV caracterizado porque es obtenible por el proceso de conformidad con la reivindicación 32, reivindicación 33 ó reivindicación 34. 36. Una vesícula de membrana externa de una célula huésped no Neisserial, caracterizada porque la célula expresa un gen que codifica la proteína App, ORF40 o nadA. 37. Una vesícula de membrana externa de una célula huésped no Neisserial, caracterizada porque la célula expresa un gen que codifica una o más de las proteínas (A) a (I) de conformidad con la reivindicación 33. 38. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de App, excepto que el aminoácido Asp-158, His-115 y/o Ser-267 se muta. 39. La proteína de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque Ser-267, Asp-158 o His-115 se reemplaza con uno de los 19 aminoácidos que se encuentran en forma natural diferentes . 40. Una protelna caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de App, excepto que uno o más aminoácidos entre Ser-1064 y Arg-1171 se muta. 41. La proteína de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la mutación es una deleción, una inserción, un truncamiento o substitución. 42. La protelna de conformidad con la reivindicación 40 ó reivindicación 41, caracterizada porque el residuo que se muta es S-1064, D-1065, K-1066, L-1067, G-1068, K-1069, A-1070, E-1071, A-1072, -1073, K-1074, Q-1075, A-1076, E-1077, -1078, D-1079, N-1080, A-1081, Q-1082, S-1083, L-1084, D-1085, A-1086, L-1087, 1-1088, A-1089, A-1090, G-1091, R-1092, D-1093, A-1094, V-1095, E-1096, K-1097, T-1098, E-1099, S-1100, V-1101, A-1102, E-1103, P-1104, A-1105, R-1106, Q-1107, A-1108, G-1109, G-1110, E-llll, N-1112, V-1113, G-1114, 1-1115, M-1116 , Q-1117 , A-1118, E-1119, E-1120, E-1121, -1122, K-1123, R-1124, V-1125, Q-1126, A-1127, D-1128, K-1129, D-1130, T-1131, A-1132, L-1133, A-1134, K-1135, Q-1136, R-1137, E-1138, A-1139, E-1140, T-1141, R-1142, P-1143, A-1144, T-1145, T-1146, A-1147, F-1148, P-1149, R-1150, A-1151, R-1152, R-1153, A-1154, R-1155, R-1156, D-1157, L-1158, P-1159, Q-1160, L-1161, Q-1162, P-1163, Q-1164, P-1165, Q-1166, P-11S7, Q-1168, P-1169, Q-1170 y/o R-1171. 43. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de App, excepto que uno o más de los aminoácidos Phe-956, Asn-957, Ala-1178 y Asn-1179 (numerados de acuerdo a SEQ ID 32 en la presente) se muta. 44. La proteina de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la mutación es un deleción, una inserción, un truncamiento o una substitución. 45. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la App procesada no comprende el dominio de terminal C el cual está corriente abajo de un sitio de escisión autoproteolítico en App de longitud completa. 46. La proteína de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque comprende una o más de SEQ ID 33 a 36. 47. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la terminación C de la App procesada es Phe-956 (numerada de acuerdo a la SEQ ID 32 de la presente) . 48. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de una App procesada, en donde la terminación C de la App procesada es Ala-1178 (numerada de acuerdo a la SEQ ID 32 de la presente) . 49. Una protelna caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. 50. Una proteína caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos con por lo menos 50% de identidad de secuencia a una o más de las SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. 51. Una proteína caracterizada porque comprende un fragmento de una o más de las SEQ ID 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39. 52. El ácido nucleico . caracterizado porque codifica la proteína de conformidad con cualquiera de las rei-vindicaciones 38 a 51. 53. Un método para producir el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido nucleico fuente que codifica App, ORF40 o NadA, y (b) realizar mutagénesis en el ácido nucleico fuente para proporcionar el ácido nucleico que codifica una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 51.