MX2013004209A - Anticuerpos de oscostatina m humana y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

Los anticuerpos y las composiciones capaces de neutralizar las funciones biológicas de la oncostatina M son útiles para tratar enfermedades y trastornos asociados con la oncostatina M, tales como osteoartritis y fibrosis pulmonar idiopática.

Description

ANTICUERPOS DE ONCOSTATINA M HUMANA Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un anticuerpo humano capaz de neutralizar la actividad biológica producida por la unión de la oncostatina M a los receptores de membrana en células humanas, y con los usos de este.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La oncostatina M (OSM) es un miembro multifuncional de 28 kDa de la familia IL-6 de citocinas secretadas por monocitos, macrófagos, neutrófilos y linfocitos T activados (Tanaka & Miyajima, Rev Physiol Biochem Pharmacol 149: 39-53, 2003). El clivaje proteolítico cercano al terminal carboxilo de la OSM secretada produce la forma de OSM totalmente activa, de 209 aminoácidos de longitud y dos sitios de glicosilación unidos a N. La OSM pertenece a la familia IL-6 de citocinas, que incluye (IL-6, IL-1 1 , factor inhibidor de leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), cardiotrofina-1 , factor neutotrófico ciliar (CNTF, por sus siglas en inglés) y citocina similar a la cardiotrofina (CLC, por sus siglas en inglés), las cuales comparten una subunidad receptora común, la proteína gp130. En seres humanos, la OSM señaliza a través de heterodimeros receptores que consisten de gp130 y la subunidad LIFRa o gp130 y la subunidad OSMRb. En contraposición con las otras citocinas de la familia IL-6, la OSM se une a la gp130 directamente y en ausencia de cualquier coreceptor unido a la membrana adicional (Gearing y otros, Science 255: 1434-1437, 1992). Después de que la OSM se une a la gp130, se reclutan las OSMRp o LIFRa para formar un complejo de señalización de afinidad alta (Mosley y otros, J Biol Chem 271 : 32635-32643, 1996) . La activación de cualquiera de los receptores resulta en la señalización mediante la ruta JAK/STAT (Auguste y otros, J Biol Chem 272: 15760-15764, 1997) .

La OSM es producida, principalmente, por células que se originan en el sistema inmune y, dada la distribución extendida de sus receptores de señalización, se ha asociado con una variedad de actividades biológicas, que incluyen la regulación del crecimiento celular, la regulación y el desarrollo neutral de composición de matriz extracelular.

Como su nombre implica, la oncostatina M está asociada con procesos oncogénicos. Sin embargo, la OSM está involucrada, además, en sucesos tempranos en las rutas inflamatoria e hipertrófica que llevan a trastornos deletéreos, tales como fibrosis pulmonar. Asi, existe la necesidad de proporcionar anticuerpos humanos específicos para OSM humana capaces de bloquear los eventos de señalización de receptores (señalización de gp130), cuyos anticuerpos bloqueadores de señal puedan producir efectos citotóxicos, citoestáticos o inmunomoduladores clínicamente útiles en las células que expresan gp130.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales de unión a OSM capaces de bloquear las actividades asociadas con una o más bioactividades asociadas con la interacción de la OSM y el receptor de unión a OSM en células, tejidos u órganos en un sujeto huésped. Se proporcionan secuencias de aminoácidos de anticuerpos monoclonales de unión a OSM ilustrativas que pueden ser codificadas por ácidos nucleicos para la expresión en una célula huésped. Uno o más de los anticuerpos monoclonales de la invención definen un epítopo en la superficie de la OSM que, cuando se acopla con un anticuerpo de la invención, evita la interacción de este con los componentes del receptor del complejo de señalización, gp130 y LIFRa, o gp130 y OSMRp, por lo cual se evita la señalización impulsada por ligadura de ligandos y la actividad biológica corriente abajo.

Un aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con la proteina OSM humana que tiene la capacidad de unión al antígeno de un cuerpo monoclonal que comprende un dominio de unión a antígeno que comprende secuencias de aminoácidos como se exponen en las SEQ ID NO. 13-18 solas o en posiciones especificadas de FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 como se expone en las SEQ ID NO: 1-3, una CDR3 como la representa la SEQ ID NO. 27-29 y 47, o un dominio de unión a antigeno que comprende secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 23-26 solas o en posiciones especificadas como se expone en las SEQ ID NO: 5-8 y variantes de estas, y una CDR3 como la representa la SEQ ID NO: 19-22, En una modalidad específica, el anticuerpo de unión a OSM humana comprende un dominio variable seleccionado de las SEQ ID NO: 49-55.

En otra modalidad de la invención, los dominios de unión al anticuerpo monoclonal usados como estructuras IgG de longitud completa tienen dominios constantes derivados de los dominios constantes de IgG humana o variantes especificas de estos, y se usan como moléculas terapéuticas en una preparación farmacéutica para evitar la unión de OSM a células que muestran componentes de receptor de OSM. En otra modalidad los dominios de unión se configuran como fragmentos de anticuerpos para usarse como una molécula terapéutica capaz de evitar la unión de la OSM a células que muestran componentes de receptor de OSM. En un aspecto de la invención, se proporciona una formulación farmacéuticamente aceptable, un sistema o kit de suministro, o un método para tratar los trastornos relacionados con la oncostatina M que comprende uno o más de los dominios de unión a OSM de la invención, tal como, pero sin limitarse a, 13-28 y 30-46 y las variantes como las proporcionan las SEQ ID NO: 29 y 47.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra las secuencias génicas de la línea germinal usadas para construir las genotecas de Fab mostradas en la proteína de cubierta pIX, en donde cada uno de los dominios HV consisten en una FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3 mixta de conformidad con la SEQ ID NO: 1-3 (1 = IGHV1-69, 2 = IGHV3-23 y 3 = IGHV5-51) seguido por una región de H-CDR3 mixta y de longitud variable, y una región J (FR4, SEQ ID NO: 4); y cada uno de los dominios LV consiste en una R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 mixta de conformidad con la SEQ ID NO: 5-8 (5 = IGKV1-39 (012), 6 = IGKV3-11 (L6), 7 - IGKV3-20 (A27) y 8 = IGKV4-1 (B3)) seguida por una CDR3 de conformidad con la SEQ ID NO: 9 seguida por una región J (FR4, SEQ ID NO: 10).

La Figura 2A es un gráfico de la respuesta a la dosis de oncostatina humana recombinante y de monocinomólogo derivada de células CHO en la supresión de la proliferación de células A375-S2, tal como se midió por incorporación de BrdU y normalizada al control en presencia solamente de vehículo.

La Figura 2B es un gráfico que muestra la capacidad del anticuerpo M71 , compuesto de los dominios variables L180 (SEQ ID NO: 53) y H17 (SEQ ID NO: 54) para mitigar la supresión de OSM de la proliferación de A375-S2, en donde la OSM estaba presente a una concentración de 2 ng/ml.

La Figura 3 es un gráfico en columna que muestra el efecto de M64, M71 , M55 y M69 a 20 pg/ml en el aumento de la captación de 35S04, una medida de síntesis de proteoglicano aumentada, por encima del nivel observado en ausencia de anticuerpo, y en donde el anticuerpo de isotipo no específico fue un control en cocultivos de condrocitos humanos en glóbulos de alginato y macrófagos humanos capaces de secretar OSM.

La Figura 4A es un gráfico que muestra la respuesta a la dosis de pSTAT3 estimulada por OSM humana en células NHLF, en donde se encontró que la EC50 era aproximadamente 1 ng/ml.

La Figura 4B es un gráfico que muestra la capacidad del anticuerpo M71 de neutralizar la señal de pSTAT3 en presencia de 2 ng/ml de OSM.

Las Figuras 5A y 5B son diagramas de dispersión que muestran la cantidad de IP-10 (figura 5A) y MCP-1 (figura 5B) detectada en el suero de ratones individuales después del desafío con OSM y con o sin tratamiento previo con la concentración de anticuerpo M71 indicada.

Las Figuras 6A y 6B son gráficos que muestran la concentración de suero en el tiempo en monos cinomólogos después de la administración intravenosa (figura 6A) o subcutánea (figura 6B) de 3 mg/Kg1 o una variante Fe de M71.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, que incluyen, sin limitarse a, las patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta descripción se incorporan en este documento como referencia como si se expusieran completamente.

Abreviaturas BSA = albúmina sérica bovina; CDR = región determinante de complementariedad; Cyno = mono cinomólogo (Macaca fascicularis); DN = nefropatía diabética; ECD = dominio extracelular; FR = marco; H = cadena pesada; IPF = artritis pulmonar intersticial; L = cadena liviana; Ig = inmunoglobulina.; Mab = anticuerpo monoclonal; OSM = oncostatina M; OA = osteoartritis; PBS = solución salina amortiguada con fosfato; RA = artritis reumatoide; VL = cadena liviana variable; VH = cadena pesada variable, Definiciones Como se usa en la presente descripción, un "anticuerpo" incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígenos o una cadena sencilla de estos. Así, el anticuerpo incluye cualquier molécula que contiene proteínas o péptidos que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, al menos una región determinante de complementariedad (CDR) de una cadena pesada o liviana o una porción de unión a ligandos de esta, una región variable de cadena pesada o cadena liviana, una región constante de cadena pesada o cadena liviana, una región de marco (FR) o cualquier porción de esta, o al menos una porción de una proteína de unión, la cual puede incorporarse en un anticuerpo de la presente invención. El término "anticuerpo" pretende abarcar, además, anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones especificada y variantes de estas, que incluyen miméticos del anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o función de un anticuerpo o un fragmento especificado o porción de este, que incluyen anticuerpos de dominio sencillo y cadena sencilla, y fragmentos de estos. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antigenos a un destino seleccionado previamente. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados por el término "porción de unión al antigeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en dominios VL, VH, CL y CH; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de bisulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y otros, (1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden unirse, por medio del uso de métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite formarse como una cadena sencilla de proteina en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird y otros (I 988) Science 242:423-426, y Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla pretenden abarcarse, además, dentro del término "porción de unión a antígenos" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen por medio del uso de técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la materia, y los fragmentos se ensayan con respecto a su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Contrariamente, las genotecas de constructos de scFv pueden usarse para explorar en busca de la capacidad de unión a antígenos y, después, mediante el uso de técnicas convencionales, cortarse y empalmarse a otro ADN que codifique las secuencias de genes de la línea germinal humana. Un ejemplo de una genoteca asi es la "HuCAL", (del inglés genoteca de anticuerpos humanos combinatorios) (Knappik, A. y otros, J Mol Biol (2000) 296(1):57-86).

El término "CDR" se refiere a los residuos de aminoácidos de la región hipervariable o la región determinante de complementariedad de un anticuerpo que participan en o son responsables de la unión a antígenos. Las regiones hipervariables o CDR del subtipo IgG humano del anticuerpo comprenden residuos de aminoácidos de los residuos 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) y 89-97 (L-CDR3) en el dominio variable de la cadena liviana y 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) y 95-102 (H-CDR3) en el dominio variable de la cadena pesada como lo describe Kabat y otros (1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.° ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) y/o aquellos residuos de un bucle hipervariable (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena liviana y 26-32 (H1 ), 53-55 (H2) o la definición de Chothia de H2 actual de 52-57, y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada como lo describe (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Chothia y Lesk se refieren a los HV conservados estructuralmente como "estructuras tradicionales". Los residuos de marco y FR1-4 son aquellos residuos de dominio variable distintos de las regiones hipervariables y que las encuadran. El sistema de numeración de Chothia y Lesk toma en cuenta las diferencias en el número de residuos en un bucle al mostrar la expansión en residuos especificados denotada por las letras en minúscula, por ejemplo, 30a, 30b, 30c, etc. Más recientemente, se ha desarrollado y adoptado ampliamente un sistema de numeración universal, International ImMunoGeneTics information system® (IMGT) (LaFranc, y otros 2005. Nucí Acids Res. 33:D593-D597).

En la presente descripción, se hace referencia a las CDR en términos de secuencia de aminoácidos y la ubicación dentro de la cadena liviana o pesada mediante numeración secuencial. Dado que la "ubicación" de las CDR dentro de la estructura de dominio variable de la inmunoglobulina se conserva entre las especies y se encuentra presente en estructuras denominadas bucles, mediante el uso de sistemas de numeración que alinean secuencias de dominio variable de conformidad con las características funcionales, los residuos de marco y CDR se identifican fácilmente. Esta información se usa en el injerto y reemplazo de residuos de CDR de inmunoglobulinas de una especie en un marco aceptor, típicamente, de un anticuerpo humano.

El término "maduración" se aplica a cambios dirigidos en la región variable de un anticuerpo con el fin de alterar las propiedades del polipéptido. Como se conoce en la materia y se describe en la presente invención, una gran cantidad de posiciones de las secuencias de la región V puede impactar en el reconocimiento del antígeno. En la naturaleza, los anticuerpos logran especificidad y afinidad altas mediante el proceso progresivo de mutación somática. Este proceso puede imitarse in vitro para permitir la selección paralela y la variación dirigida mientras se mantiene la integridad de la secuencia de cada cadena de anticuerpos, de manera que refleje la especie, en este caso, un anticuerpo humano, a la vez que aumenta la afinidad o un parámetro biofisico, tal como solubilidad o resistencia a la oxidación. El proceso de realizar cambios dirigidos o "maduración" se lleva a cabo, típicamente, al nivel de la secuencia codificante y puede lograrse mediante la creación de subgenotecas para la selección de la propiedad aumentada.

Como se usa en la presente descripción, "OSM" se refiere a un polinucleótido o polipéptido de oncostatina M, que comprende una secuencia codificante que codifica el polipéptido de OSM. La OSM humana es el producto del gen osm humano (Gen 5008).

El término "epítopo" significa un determinante de proteina capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten, usualmente, en agolpamientos de moléculas de superficie químicamente activa, tales como cadenas laterales de azúcar y aminoácidos y, usualmente, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga especificas. Los epítopos conformacionaies y no conformacionales se distinguen en que la unión del primero, pero no la del segundo, se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.

Como se usa en la presente descripción, KD se refiere a la constante de disociación, específicamente, la KD del anticuerpo para un antigeno predeterminado, y es una medida de afinidad del anticuerpo para un destino específico. Los anticuerpos de afinidad alta tienen una KD de 10" M o menor, con mayor preferencia, 10"9 M o menor, y, aún con mayor preferencia, 10 0 M o menor, para un antígeno predeterminado. La reciproca de KD es KA, la constante de asociación. El término "kdis" o "k2," o "kd", como se usa en la presente descripción, pretende denominar la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. La "KD" es la relación de la tasa de disociación (k2), denominada, además, "constante de disociación (k0ff)" de la tasa de la constante de asociación (k^ o "constante de asociación (kon)". Asi, KD equivale a k2/ki o k0ff / kon y se expresa como una concentración molar (M). Se deduce que mientras menor es la KD, más fuerte es la unión. Así, una KD de 10"6M (o 1 microM) indica una unión débil comparada con 10~9 M (o 1 nM).

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en la presente descripción, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una afinidad y especificidad de unión sencilla para un epítopo particular. El término incluye, además, "anticuerpo recombinante" y "anticuerpo monoclonal recombinante" ya que todos los anticuerpos se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados a partir de un animal o un hibridoma preparado por la fusión de células animales secretoras de anticuerpos y un compañero de fusión, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de una transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una genoteca de anticuerpos recombinantes, humanos o de otras especies, de combinación, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que involucre el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente descripción, pretende referirse a un anticuerpo que se encuentra prácticamente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, una isoforma o una variante de OSM humana podría tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especie de OSM). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" con distintas especificidades se combina en una composición bien definida.

Como se usa en la presente descripción, "unión específica", "unión inmunoespecífica" y "se une ¡nmunoespecíficamente" se refiere a un anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una constante de disociación (KD) de 10"7 M o menor, y se une al antígeno predeterminado con una KD que es al menos dos veces menor que su KD para la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína o cualquier otro polipéptido especificado) distinto del antígeno predeterminado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antigeno" se usan indistintamente con el término "un anticuerpo que se une, específicamente, a un antígeno." Como se usa en la presente descripción, unión "altamente específica" significa que la KD relativa del anticuerpo para el epítopo destino específico es al menos 10 veces menor que la KD para unir ese anticuerpo a otros ligandos.

Como se usa en la presente descripción, "tipo" se refiere a la clase del anticuerpo (por ejemplo, IgA, IgE, IgM o IgG) que es codificada por los genes de la región constante de cadena pesada. Algunas clases de anticuerpos abarcan, además, subclases o "isotipos", los cuales son codificados, además, por las regiones constantes de cadena pesada (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 y lgG4). Los anticuerpos pueden decorarse más aún por olígosacáridos unidos a la proteína en residuos específicos dentro de los dominios de la región constante, los cuales aumentan más aún las funciones biológicas del anticuerpo. Por ejemplo, en los isotipos de anticuerpos humanos lgG1 , lgG3 y, en menor grado, lgG2, muestran funciones efectoras como los anticuerpos lgG2a murinos.

"Funciones efectoras" o "efectora positiva" significa que el anticuerpo comprende dominios distintos de los dominios específicos de unión a antígenos capaces de interactuar con receptores u otros componentes de la sangre tal como complemento, lo que lleva, por ejemplo, al reclutamiento de macrófagos y eventos que llevan a la destrucción de células unidas por los dominios de unión a antigenos del anticuerpo. Los anticuerpos tienen varias funciones efectoras mediadas por la unión de moléculas efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a los anticuerpos activa el sistema del complemento. La activación del complemento es importante en la opsonisación y lisis de patógenos de la célula. La activación del complemento estimula la respuesta inflamatoria y puede, además, estar implicada en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a las células a través de la región Fe, con un sitio receptor de Fe en la región Fe del anticuerpo que se une a un receptor Fe (FcR) en una célula. Existen varios receptores Fe específicos para distintas clases de anticuerpos, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores eta), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fe en superficies celulares desencadena varias respuestas biológicas importantes y diversas que incluyen la envoltura y destrucción de partículas recubiertas con anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, la lisis de células destino recubiertas con anticuerpos por medio de las células de eliminación (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos o ADCC, por sus siglas en inglés), la liberación de mediadores inflamatorios, la transferencia placentaria y el control de la producción de ¡nmunoglobulina.

El término "polipéptido" significa una molécula que comprende residuos de aminoácidos unidos por un enlace péptido para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de una cantidad menor que 50 aminoácidos podrían denominarse "péptidos". Los polipéptidos podrían denominarse, además, "proteínas".

Descripción general La presente invención proporciona Mab aislados capaces de unir y neutralizar la actividad biológica de las proteínas OSM y los productos de clivaje. Particularmente, los mAb de unión a OSM de la invención son capaces de bloquear la unión de las OSM a gp130 o evitar el reclutamiento de LIFRa o OSMRb mediante gp130 unida a OSM. En cualquier caso, el mAb de OSM de la invención es capaz de bloquear la señalización del receptor de gp130 impulsada por OSM.

Se ha informado que la fosforilación de STAT3 lleva a que los fibroblastos superproduzcan colágeno en una variedad de contextos patológicos (Lim y otros, Oncogene 23(39): 5416-25, 2006; Huang y otros, J Cell Biochem 81 (1): 102-13, 2001). Estas propiedades demuestran el valor terapéutico potencial de estos anticuerpos para RA, OA y para indicaciones fibróticas, tales como fibrosis pulmonar idiopática (IPF, por sus siglas en inglés) y nefropatía diabética (DN, por sus siglas en inglés).

El producto génico de OSM humana, OSM (núm. de acceso al NCBI: NP 065391 ) es un prepro-polipéptido de 252 aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 11), que tiene un péptido señal de 25 aminoácidos de longitud y un sitio de clivaje proteolítico entre los residuos 234 y 235. Es una proteina secretada que tiene cinco residuos de cisteina que forman dos disulfuros internos entre los residuos 31 a 152 y 74 a 192 (Kallestad JC y otros, J Biol Chem. 15 de mayo de 1991 ; 266 (14):8940-5). Existen dos sitios potenciales de glicosilación unida por N en los residuos 00 y 217 y, cuando se producen en células eucariotas, la proteina se glicosila. La OSM humana tiene un sulfhidrilo libre en el residuo 105.

La secuencia de proteina OSM de cyno no estaba disponible en el dominio público aunque existía un registro automático generado por computadora para un ARNm de 1867 bp (núm. de NCBI: XM_001 10148) derivado de una secuencia genómica anotada (NW 001095169). Para obtener la secuencia de OSM de cyno, se aisló ARN de PBMC de cyno y el gen, después, se amplificó a partir de este ADNc por RT-PCR y se secuenció. Se encontró que la traducción predicha de la secuencia clonada (SEQ ID NO: era 99.6 % idéntica a la secuencia predicha de Macaca mullata (Rhesus), 92 % idéntica a la secuencia de la proteína OSM humana y 41 % idéntica a la secuencia de la proteina OSM de ratón, como se describe en la solicitud copendiente del solicitante (patente de los Estados Unidos con serie núm. 12/648430).

Por lo tanto, la presente invención se dirige a la identificación de Mab de unión a OSM de origen humano capaces de inhibir la actividad biológica corriente abajo que resulta de la señalización de gp130 unida a OSM, y en donde los Mab exhiben la capacidad de: restablecer la proliferación de células en presencia de OSM, inhibir la degradación de condrocitos impulsada por OSM de matriz intra-articular (articulación) en explantes de tejido, neutralizar eficazmente la fosforilación de STAT3 dependiente de OSM en fibroblastos de pulmón humano y evitar la liberación de citocina inducida por OSM. 1. Composición de un anticuerpo de la invención Un anticuerpo neutralizador de OSM de la invención es un anticuerpo que inhibe, bloquea o interfiere con al menos una actividad de OSM o una unión de receptor de OSM, in vitro, en el lugar y/o in vivo, y que no promueve, estimula o agoniza la actividad de OSM o la unión a ligandos. La unión a los anticuerpos tampoco imita los efectos corriente abajo de la ligadura impulsada por OSM de los receptores de OSM, particularmente, la interacción de gp130 con OSM, tal como la transducción de señal en una célula huésped. Un anticuerpo neutralizador de OSM adecuado, una porción especificada o una variante puede afectar, además, opcionalmente, al menos una actividad o función de OSM, tal como, pero sin limitarse a. síntesis de ARN, ADN o proteina; liberación de proteína; activación, proliferación o diferenciación celular; secreción de anticuerpos; señalización de receptor de OSM; clivaje de OSM; unión a OSM, inducción, síntesis o secreción de OSM o gp130.

La presente invención se basa en el descubrimiento de anticuerpos monoclonales OSM anti-humana capaces de inhibir la señalización de gp130 después de la unión a OSM o el reclutamiento de LIFR por OSM. Los dominios de unión a anticuerpos en la forma de una genoteca de Fab mostrados en partículas de fago filamentoso unidas a la proteina de cubierta pIX (ver la patente núm. WO29085462A1 y la descripción más detallada abajo) se seleccionaron por la capacidad de unirse a la OSM. Se usó un ensayo de competición mediante el uso de gp 30 para distinguir aquellos Fab que, cuando estaban unidos a la OSM, evitaron que la OSM se uniera a la gp130. Alternativamente, los Fabs eran capaces de evitar el reclutamiento de LIFR a la unión de gp130 cuando se encontraban unidos a OSM. Se usó un ensayo basado en células (A375, célula de melanoma humano) para identificar varios anticuerpos candidatos capaces de inhibir la activación de pSTAT3 mediada por gp130 de las células huésped que expresan OSM.

Los anticuerpos de unión a OSM descritos en la presente invención reconocen al menos dos regiones diferenciables en la forma activa de proteína OSM humana, lo que indica el descubrimiento adicional de múltiples sitios en OSM adecuados para destinar anticuerpos u otros compuestos con capacidades de bloqueo con función similar. Asi, la expresión y purificación de los dominios de unión a anticuerpos proporcionados en la presente invención como secuencias de aminoácidos proporcionan, además, una herramienta que puede proporcionar medios para la selección de moléculas novedosas que exhiben actividad neutralizante de OSM.

En una modalidad, el anticuerpo antihumano de OSM tiene una región de unión que comprende una región variable de cadena liviana (VL, por sus siglas en inglés) o una región variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 49-55, y cuyo anticuerpo o porción de unión de este se une inmunoespecificamente a la OSM. En otra modalidad de la invención, comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 54 o 55 una porción de unión a antígeno de esta y, adicionalmente, tiene las propiedades funcionales especificadas de anticuerpos de la invención, tales como: 1. se une a la OSM humana con una KD menor que 100 pM 2. se une a la OSM de cyno con una KD menor que 500 pM 3. Es capaz de restablecer la proliferación de células A375-S2 en presencia de 2 ng/ml de OSM humana por 90 % del nivel en ausencia de OSM, 4. Es capaz de restablecer la proliferación de células A375-S2 en presencia de 2 ng/ml de OSM de cyno por 90 % del nivel en ausencia de OSM, 5. inhibe la degradación de condrocitos impulsada por OSM de matriz intra-articular (articulación) en explantes de tejido, 6. neutraliza eficazmente la fosforilación de STAT3 dependiente de OSM en fibroblastos de pulmón humano normales (NHLF, por sus siglas en inglés), o 7. bloquea la liberación de citocina después del desafio sistémico con OS en ratones.

En otro aspecto de la invención, las características estructurales de los anticuerpos que exhiben algunas o la totalidad de las actividades biológicas mencionadas anteriormente y descritas en la presente descripción, particularmente, los Mab designados como dominios de unión M55 y M71 , se usan para crear anticuerpos anti-OSM humanos relacionados estructuralmente, que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a OSM. Más específicamente, una o más regiones CDR de M55 y M71 (tales como los residuos especificados de SEQ ID NO: 1 y 8) pueden combinarse recombinantemente con regiones de marco humanas conocidas y CDR, tales como las SEQ ID NO: 13-28, 30-46, para crear anticuerpos adicionales anti-OSM humanos modificados recombinantemente de la invención.

En una modalidad, los anticuerpos de la invención tienen secuencias, que incluyen FR1 , 2 y/o 3; de IGVH -69 (SEQ ID NO: 1) o de IGVH5-51 (SEQ ID NO: 3), en donde uno o más residuos de CDR seleccionadas del grupo que consiste en 13-22 se encuentran presentes en la posición de CDR de SEQ ID NO: 1 o 3, mientras que retienen la capacidad del anticuerpo a unirse a OSM (por ejemplo, sustituciones conservadoras). De conformidad, en otra modalidad, el anticuerpo modificado podría estar compuesto de una o más CDR que son, por ejemplo, 90 %, 95 %, 98 % o 99.5 % idénticas a las CDR enumeradas en las SEQ ID NO: 13-22 o las variantes de L-CDR3 como las brinda la SEQ ID NO: 29 o 47.

Adicionalmente a la unión simple a OSM, los anticuerpos modificados, tales como los descritos anteriormente, podrían seleccionarse por su retención de otras propiedades funcionales de anticuerpos de la invención, tal como la capacidad de inhibir la unión de la proteina OSM o un producto de clivaje de esta a las células positivas para GP130, cuya unión resultaría en la supresión de la proliferación de las células positivas para GP130 ¡n vivo.

Los anticuerpos humanos monoclonales de la invención se pueden probar en cuanto a la unión a la OSM, por ejemplo, por ELISA estándar. 2. Generación de anticuerpos neutralizadores de OSM Un anticuerpo neutralizador de OSM que exhibe el espectro de bioactividad deseado, como se ejemplifica en la presente descripción mediante M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71 y M83 que comprende las secuencias de cadena pesada y cadena liviana como se especificó, las cuales comprenden los marcos de genoteca de SEQ ID NO: 1 , 3, 8, y que tienen las CDR de SEQ ID NO: 3-28, 30-46 puede generarse mediante una variedad de técnicas.

En otra modalidad, el epítopo unido por los anticuerpos de la invención, que comprende solo cinco de todos los residuos 51-227 de la SEQ ID NO: 1 1 o una secuencia codificadora de ácido nucleico puede usarse, por lo tanto, para inmunizar un sujeto con el propósito de producir los anticuerpos de la invención directamente en el huésped con el objetivo de tratar, prevenir, mejorar enfermedades o síntomas de enfermedades asociadas con la producción de OSM.

En una modalidad, y como se ilustra en la presente invención, el anticuerpo humano se selecciona de una genoteca de fagos, en donde el fago comprende genes de inmunoglobulina humana y la genoteca expresa dominios de unión al anticuerpo humano como, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla (scFv), como Fabs, o algún otro constructo que exhibe regiones variables del anticuerpo apareadas o no apareadas (Vaughan y otros, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets y otros, PITAS (Estados Unidos) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden prepararse, además, mediante el uso de métodos de exhibición de fagos para la exploración de genotecas de genes de inmunoglobulina humanos. Esos métodos de exhibición de fagos para aislar anticuerpos humanos se establecieron en la materia. Ver, por ejemplo: las patentes de los Estados Unidos núm. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571 ,698 otorgadas a Ladner y otros; las patentes de los Estados Unidos núm. 5,427,908 y 5,580,717 otorgadas a Dower y otros; las patentes de los Estados Unidos núm. 5,969,108 y 6,172,197 otorgadas a McCafferty y otros; y las patentes de los Estados Unidos núm. 5,885,793; 6,521 ,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 otorgada a Griffiths y otros.

Los clones de fagos se seleccionan e identifican a través de un procedimiento de múltiples etapas conocido como ciclos de selección. Los ciclos de selección se llevan a cabo al incubar variantes de ligandos de proteínas que exhiben fagos (una genoteca de exhibición de fagos) con un destino, al eliminar el fago no unido mediante una técnica de lavado y, específicamente, al eluir el fago unido. El fago eluido se amplifica, opcionalmente, antes de someterlo a ciclos adicionales de unión y amplificación opcional que enriquecen el grupo de secuencias específicas en favor de aquellos clones de fagos que tienen fragmentos de anticuerpos que exhiben la mejor unión al destino. Después de varias rondas, se caracterizan los clones de fagos individuales y se determinan las secuencias de los péptidos exhibidos por los clones mediante la secuenciación del ADN correspondiente del virión del fago.

Genoteca de fago Fab-plX En una modalidad especifica de la tecnología de exhibición de fagos, una genoteca de Fab sintético exhibida en la proteína de cubierta del fago pIX, descrita en Shi y col, J Mol Biol 397:385-396, 2010; patente núm. WO29085462A1 y la patente de los EE. UU. con serie núm. 12/546850, que se detallará más aún en la presente descripción, se usa para seleccionar el aglutinante a partir de un repertorio de secuencias de IgG humanas derivadas de genes de la línea germinal humana. Las genotecas se construyeron en cuatro dominios VL y tres dominios VH codificados por secuencias de líneas germinales de IGV e IGJ conocidas, seleccionadas sobre la base de la frecuencia a la cual se ha observado que las secuencias se encuentran presentes en anticuerpos humanos aislados a partir de fuentes naturales. Los VH, nomenclatura de IMGT, seleccionados son IGHV1-69 (SEQ ID NO: 1), IGHV3-23 (SEQ ID NO: 2), o IGHV5-51 (SEQ ID NO: 3). La diversidad en el diseño de VH produce cadenas pesadas con secuencia de longitud variable en la región de CDR3 con posiciones de diversidad limitada en la H-CDR1 y H-CDR2, las cuales permanecen a una longitud constante. El marco cuatro (H-FR4) se mantiene constante entre todos los miembros de la genoteca (SEQ ID NO: 4).

VH169, IGHV1-69*01 Longitud = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYXilSWVRQA PGQGLEWMGX2 IX GX-XiGTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR (SEQ ID NO: 1) en donde, en la genoteca 169, X1 es A o G, X2 es G o W, X3 podría ser I o S, X4 podría ser P o A, X5 podría ser I o Y, y X& podría ser F o N.

VH323, IGHV3-23*01 Longitud = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS X1YX2MX3WVRQA PGKGLEVWSX4 IXsXfiX7GX8STYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK (SEQ ID NO: 2) en donde, en la genoteca 323, podría ser S, D, N o T; X2 podría ser A, G o W; X3 podría ser S o H; X4 podría ser V, A, N o G; X5 podría ser S, N, K o W; X6 podría ser Y, S, G o Q; X7 podría ser S o D; y X8 podría ser S o G.

VH551 , IGHV5-51 *03 Longitud = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66 EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT XiYWlX?WVRQM PGKGLEWMGX3 I .PX DSXfiTRY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR (SEQ ID NO: 3) en donde en la genoteca 551 , Xi podría ser S, N o T; X2 podría ser S o G, X3 podría ser I o R; X4 podría ser D o Y; X5 podría ser G o S; X6 podría ser D o Y.

Una región JH o FR4 que tiene ( 1 residuos), WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 4), se unió a las secuencias mencionadas anteriormente para formar una región variable de cadena pesada completa.

Las posiciones H-CDR1 y H-CDR2 destinadas para díversificación se determinaron mediante 1) diversidad en los genes de la línea germinal; y 2) frecuencia encontrada en contacto con antigeno en complejos anticuerpo-antígeno de estructura conocida (Almagro J Mol Recognit. 17:132-143, 2004). La diversidad de aminoácidos en las posiciones seleccionadas se determinó mediante 1) uso en línea germinal; 2) aminoácidos que se observan más frecuentemente en genes V rearreglados humanos; 3) aminoácidos que se predijo eran el resultado de mutaciones somáticas de base sencilla; y 4) propiedades bioquímicas y biofísicas de aminoácidos que contribuyen al reconocimiento de antígenos.

La genoteca incorpora diversidad en la CDR3 de VH (H3) e imita el repertorio de anticuerpos humanos (Shi y otros, 2010, arriba), como se muestra abajo (FÓRMULA), en donde la longitud final se encuentra entre 7 y 14 residuos. Entre la CDR3 de aproximadamente 5.000 regiones variables humanas, se usan glicina (G) y alanina (A) de aminoácidos en todas las posiciones. Adicionalmente, frecuentemente, se usa ácido aspártico (D) en la posición 95 y la tirosina (Y) se codifica, frecuentemente, en las posiciones que preceden a la región canónica del segmento J. La fenilalanina (F), el ácido aspártico (D) y la tirosina (Y) de los aminoácidos predominan en las posiciones 99-101 usadas en IgG en estas posiciones. Dado que estas posiciones sirven, frecuentemente, como soporte estructural para H-CDR3 y son menos accesibles para el antígeno y/o la superficie de IgG, se fijaron la fenilalanina más leucina de los aminoácidos (relación 50/50) en la posición 99, el ácido aspártico en la posición 100 y la tirosina en la posición 101. Así, la secuencia de la Fórmula I se inserta entre las SEQ ID NO: 1 , 2 o 3 y la SEQ ID NO: 4 para crear una VH completa.

-(D)-(N)n(N+0)m<F)DY- (I) en donde: (D) = posición rica en Asp (D) y Gli (G).

(N)n = posición rica en Ala (A) y Gli (G), n =3-7.

(O)m = rica en Ala (A), Gli (G) y Y (Tir), m= 1-4.

(F) = la posición dominante de Phe (F).

Varias versiones de la genoteca abarcan acoplamientos con cadenas livianas diversificadas o fijadas derivadas, además, del repertorio de línea germinal humana. En la presente invención, los cuatro genes VLkaPPa de la genoteca de cadena liviana (Kawasaki y otros, 2001. Eur J Immunol 31 : 1017-1028 y después de Schaeble & Zachau, 1993 Biol Chem Hoppe Seyler 374: 1001-1022) son A27 (IGKV3-20O1), B3 (IGKV4-1*01), L6 (IGKV3-1 *01) y 012 (IGKV1 -39*01), en donde el nombre del gen entre paréntesis es el que se presume el gen IMGT correspondiente. Los Fabs se exhiben en pIX a través de la expresión de un vector dicistrónico, en donde el dominio VH-CH1 se fusiona con la secuencia de la proteína de cubierta y el VL-CLkappa o VL-CLIambda se expresa como un polipéptido libre que se asocia con el VH-CH1. Las regiones CDR están subrayadas.

Genoteca variable de cadena liviana basada en genes de la linea germinal Vkappa (Vk) 012; IGKV1-39*01 , IGKV1D-39*01 Longitud = 88; CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56 DlQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS X^X^NWYQQKP GKAPKLLIYX4 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC (SEQ ID NO: 5) L6, IGKV3-11*01 Longitud = 88, CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSV XiX?X^LAWYQQKP GQAPRLLIY , ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC (SEQ ID NO: 6) A27, IGKV3-20*01 , Longitud = 89, CDR1 = 24-35, CDR2 = 51-57 EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVXi X2X3X4LAWYQQK PGQAPRLLIY X5ASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC (SEQ ID NO: 7) B3, DPK24, VKIVKIobeck; IGKV4-1 *01 Longitud = 94, CDR1 = 24-40, CDR2 = 56-62 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL X^SNNXpNX^LA WYQQKPGQPP KLLIYX4ASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC (SEQ ID NO: 8) La diversidad en las posiciones especificadas para cada supercóntigo de región variable se resume en la Tabla 1 abajo, en donde se usa el código de una letra de los aminoácidos y se encuentra presente en la alternativa en las posiciones especificadas como se muestra en la Figura 1.

Tabla 1 CDR Posición 012 L6 A27 B3 Kabat (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8) 1 30 Xi SRNAD Xl SRNAD Xl SRNTD L 30a - - Xz SNR Xl YSHFA 30e - - - 30f X2 KTNE 31 X2 SNKDG x2 NSKD Xa SNRADH N 32 Xa YHNDWF x3 YWDFH X4 YFHQSEK Xa YFHNWD SAV SAN AS 2 50 XA FYTNKA x< ADKGY Xs ADGS x< WSRDYA DG FTN La VL CDR3 en la totalidad de las genotecas tiene siete residuos, en donde los dos primeros residuos son glutamina (GIn, Q) y el residuo correspondiente al residuo Kabat 95 es prolina (Pro, P). Para L-CDR3 la secuencia corresponde a QQX1X2X3 4PX5T (SEQ ID NO: 9), en donde la variación es como en la tabla que figura a continuación y las posiciones de residuos son de conformidad con Kabat.

Tabla 2 Residuo Posición CDR3 de 012 L6 A27 B3 Kabat XT 91 SAYHPD RYSGF YSHA YSHA X2 92 FIYHNDKGRE RHNSL YNDSHIFKG YNDSHIFKG X3 93 STHNDRG NDKR SNTDGHR SNTDGHR X< 94 TYLVFSRGPI WA TYLVFAS TYLVFAS Xs 96 LWRFYIN WYFLIR WYFLIR WYFLIR A medida que la secuencia variable varía en longitud de gen a gen, la diversidad en una ubicación de residuo particular dentro de un bucle hipervariable o CDR puede describirse como figura a continuación, mediante el uso de la numeración de residuos como se define en Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C, 1997(Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol 273: 927-948). En este sistema, los cambios en longitud de los bucles hipervariables se acomodan por la designación de subposiciones a, b, c, etc. para un residuo dado.

Un segmento de marco 4 (FR4), tal como JK4, FGQGTKVEIK (SEO. ID NO: 10) se usó para formar una región variable de cadena liviana humana completa.

Se ha demostrado la afinidad de Fab para diversos destinos de proteínas de 0.2 a 20 nM.

Los métodos para un proceso de maduración integrado para mejorar los parámetros de unión que consisten en el reajuste de la diversidad de VL o VH o, alternativamente, la modificación de VL dirigida o limitada se logran mediante el uso de los vectores e iniciadores diseñados y usados para genotecas, como se describe en la publicación mencionada, como se enseña en la presente descripción, y combinada con lo que se conoce en la materia. Fuentes alternativas de dominios de inmunoglobulina de unión a OSM Los anticuerpos de unión a OSM con las características de los Mab humanos descritos en la presente descripción podrían ser fragmentos elaborados o de obtenidos de dominios de inmunoglobulina formados por una cantidad de métodos, que incluyen la técnica de hibridación de células somáticas estándar (método del hibridoma) de Kohier y Milstein (1975) Nature 256:495. En el método del hibridoma, un ratón un otro animal huésped, tal como un hámster o mono macaco se inmuniza como se describe en la presente descripción para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos podrían inmunizarse ¡n vitro. Después, los linfocitos se fusionan con células de mieloma mediante el uso de un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pág. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Un anticuerpo neutralizador de OSM puede generarse, además, opcionalmente, por la inmunización de un animal transgénico (por ejemplo, ratón, rata, hámster, primate no humano, y similares) capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos, como se describe en la presente invención y/o se conoce en la materia. Las células que producen un anticuerpo anti-OSM humano pueden aislarse de tales animales e inmortalizarse mediante el uso de métodos adecuados, tales como los métodos descritos en la presente invención. Alternativamente, el anticuerpo de secuencias codificantes se puede clonar, introducir en un vector adecuado, y usar para transfectar una célula huésped para la expresión y aislamiento del anticuerpo por métodos que se enseñan en la presente descripción y aquellos conocidos en la materia.

El uso de ratones transgénicos que tienen loci de imnunoglobulina (Ig) humana en su configuración de línea germinal permite el aislamiento de anticuerpos monoclonales totalmente humanos de afinidad alta dirigidos contra una variedad de destinos, que incluyen antígenos propios humanos a los cuales el sistema inmune humano es tolerante (Lonberg, N. y otros, patentes de los EE. UU. núm. US5569825, US6300129 y 1994, Nature 368:856-9; Green, L. y otros, 1994, Nature Genet. 7: 13-21 ; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483-95; Lonberg, N y Huszar, D., 1995, Int.

Rev. Immunol. 13:65-93; Kucherlapati, y otros, US6713610; Bruggemann, M. y otros, 1991 , Eur. J. Immunol. 21 :1323- 1326; Fishwild, D. y otros, 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851 ; Méndez, M. y otros, 1997, Nat. Genet. 15:146-156; Green, L, 1999, J. Immunol. Methods 231 :11-23; Yang, X. y otros, 1999, Cáncer Res. 59:1236-1243; Bruggemann, M. y Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997; Tomizuka y otros, patente núm. WO02043478). Los loci de inmunoglobulina endógenos en esos ratones , se pueden interrumpir o eliminar para eliminar la capacidad del animal para producir anticuerpos codificados por los genes endógenos. Adicionalmente, las compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) y Medarex (San José, Calif.) se pueden encargar de proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado por medio del uso de la tecnología, como se describió anteriormente.

La preparación de polipéptidos para usarse como ligandos destino en estrategias de ciclos de selección y como antígenos inmunogénicos puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier técnica adecuada, tal como la producción de proteína recombinante. El ligando destino o fragmento de este en la forma de proteina purificada, o mezclas de proteínas que incluyen células completas o extractos de tejidos o células o, en el caso de inmunización, el antígeno puede formarse de novo en el cuerpo del animal a partir de ácidos nucleicos que codifican el antigeno o una porción de este.

Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden elaborar por medio del uso de (a) métodos recombinantes, (b) técnicas sintéticas (c) técnicas de purificación, o combinaciones de estos, como se conocen bien en la materia. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente mediante el uso de métodos conocidos en la . materia (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de regiones de anticuerpos humanos). En donde se produce un hibridoma, tales células pueden servir como una fuente de ese ADN. Alternativamente, por medio del uso de técnicas de exhibición en donde la secuencia codificante y el producto de la traducción se unen, tal como un fago o genotecas de exhibición ribosomal, la selección del aglutinante y el ácido nucleico se simplifican. Después de la selección del fago, las regiones codificantes del anticuerpo del fago se pueden aislar y usar para generar anticuerpos completos, que incluyen anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y que se expresan en cualquier huésped deseado, que incluyen células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levadura, y bacteria.

Anticuerpos humanos La invención proporciona, además, inmunoglobulinas (o anticuerpos) que se unen a la OSM humana. Estos anticuerpos pueden caracterizarse, además, como modificados o adaptados. Las inmunoglobulinas tienen región(es) variable(s) prácticamente de una inmunoglobulina de linea germinal humana e incluyen variaciones dirigidas en residuos que se sabe participan en el reconocimiento de antígenos, por ejemplo, las CDR de Kabat o los bucles hipervariables como se definen estructuralmente. La(s) región(es) constante(s), de estar presente(s), es(son) prácticamente de una inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos exhiben KD para OSM dé al menos aproximadamente ??^ ? (1 microM), aproximadamente 10"7 M (100 nM), 10~9 M (1 nM), o menor. Para permitir un cambio en afinidad, por ejemplo, mejorar la afinidad o reducir la KD, del anticuerpo humano para OSM, podrían hacerse sustituciones en los residuos de CDR u otros residuos.

La fuente de producción de anticuerpo humano que se une a OSM es, preferentemente, las secuencias proporcionadas en la presente invención como las regiones variables, los marcos y/o las CDR, anotadas como SEQ ID NO: 13-55 identificadas como capaces de unirse a OSM humana y que presentan reactividad cruzada con OSM de mono cinomólogo mediante el uso de un repertorio de Fab derivados de seres humanos mostrados en partículas de fagos filamentosos.

La sustitución de cualquiera de las CDR en cualquier marco de dominio variable humano tiene muchas probabilidades de resultar en la retención de su orientación espacial correcta, si el marco de dominio variable humano adopta la misma conformación que, o una conformación similar a, el marco variable original a partir del cual se originaron las CDR. Las regiones de marco variable de cadena pesada y liviana a aparearse en el Mab final pueden derivarse a partir de las mismas secuencias de anticuerpos humanos o de secuencias de anticuerpos humanos diferentes. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos de origen natural, pueden derivarse de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana o pueden ser secuencias consenso de varias secuencias de linea germinal y/o anticuerpos humanos.

Las secuencias de anticuerpos humanos adecuadas se identifican mediante comparaciones hechas en computadora de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ratón con las secuencias de anticuerpos humanos conocidos. La comparación se lleva a cabo separadamente para cadenas pesadas y livianas, pero los principios son similares para cada una.

Con respecto al método empírico, se ha descubierto que resulta particularmente conveniente crear una genoteca de secuencias variantes que pueda explorarse en busca de la actividad, la afinidad de unión o la especificidad deseadas. Un formato para la creación de tales genotecas de variantes es un vector de exhibición de fagos. Alternativamente, las variantes pueden generarse mediante el uso de métodos conocidos y alternos para la aleatorización o variación de una secuencia de ácido nucleico que codifica los residuos destino dentro del dominio variable.

Otro método para determinar si se requieren más sustituciones, y la selección de los residuos de aminoácidos para la sustitución, puede lograrse mediante el uso de modelado por computadora. Los equipos y programas de computadora para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina se encuentran disponibles ampliamente. Generalmente, los modelos moleculares se producen a partir de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de estas. Las cadenas a modelarse se comparan en busca de similitud de la secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran la mayor similaridad de secuencia se selecciona como punto de partida para la construcción del modelo molecular. Las estructuras iniciales resueltas se modifican para permitir las diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas o los dominios de inmunoglobulina que se modelan y aquellos en la estructura inicial. Las estructuras modificadas, después, se ensamblan en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina por minimización energética y mediante la verificación de que todos los átomos se encuentran dentro de las distancias adecuadas entre si, y que las longitudes y los ángulos de las uniones se encuentran dentro de los límites químicamente aceptables.

Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico codificará cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse mediante la síntesis de ADN en fase sólida nova o mediante la mutagénesis de PCR de una variante preparada previamente del polinucleótido deseado. Todos los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos descritos en esta solicitud se incluyen expresamente en la invención.

Los segmentos variables de anticuerpos humanos producidos como se describe en la presente descripción se unen, típicamente, a al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana. El anticuerpo contendrá regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada. La región constante de cadena pesada incluye, usualmente, dominios CH1 , articulación, CH2, CH3, y, algunas veces, CH4.

Los anticuerpos humanos pueden comprender cualquier tipo de dominios constantes de cualquier clase de anticuerpo, que incluye IgM, IgG, IgD, IgA y IgE, y cualquier subclase (isotipo), que incluye lgG1 , lgG2, lgG3 y lgG4. Cuando se desea que el anticuerpo humanizado exhiba actividad citotóxica, el dominio constante es usualmente un dominio constante de fijación al complemento y la clase es típicamente IgG-i . Cuando no se desea tal actividad citotóxica, el dominio constante puede ser de la clase lgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo.

Los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena liviana y pesada humanizadas, opcionalmente unidas a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y pesadas se pueden clonar en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina se unen operablemente a las secuencias control en el(los) vector(es) de expresión que aseguran la expresión de los polipéptidos de inmunoglobulina. Tales secuencias control incluyen una secuencia señal, un promotor, un potenciador, y una secuencia de terminación de la transcripción (ver Queen y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989); patente núm. WO 90/07861 Co y otros, J. Immunol. 148, 1 149 (1992), las cuales se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad para todos los propósitos). 3. Método de uso de un anticuerpo anti-QSM Como se describe detalladamente abajo, la presente invención demuestra que los anticuerpos monoclonales aislados que tienen los dominios variables de M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71 y M83 se unen a epítopos traslapados en OSM y muestran actividades inhibidoras de OSM in vitro y/o in vivo. Significativamente, la reactividad de los MAb seleccionados incluye la capacidad de bloquear dependientemente de la dosis la interacción de OSM con gp130, reducir la señalización de OSM en presencia de gp130, reducir la proliferación estimulada por OSM de células A375, evitar la producción de colágeno de condrocito estimulada por macrófagos o reducir la liberación de citocina por OSM in vivo.

Dadas las propiedades de los anticuerpos monoclonales como se describen en la presente descripción, los anticuerpos o fragmentos de unión a antigenos de estos son adecuados como agentes terapéuticos y profilácticos para tratar o prevenir enfermedades asociadas con OSM en seres humanos y animales.

Generalmente, el uso comprenderá administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígenos de la presente invención, o un anticuerpo o una molécula seleccionado para que tenga espectros de unión y actividad biológica similares, a un sujeto susceptible o a uno que exhiba una enfermedad en la cual se sepa que la actividad de OSM tiene secuelas patológicas, tal como trastornos inmunológicós o crecimientos tumorales o metástasis. Cualquier forma activa del anticuerpo se puede administrar, incluso los fragmentos Fab y F(ab')2.

Preferentemente, los anticuerpos que se usan son compatibles con las especies receptoras, de manera que la respuesta inmune a los MAb no resulte en una vida media circulante inaceptablemente corta o induzca una respuesta inmune a los MAb en el sujeto. Los MAb administrados podrían exhibir algunas funciones secundarias, tales como unión a receptores Fe del sujeto y activación de mecanismos de ADCC, con el propósito de disminuir la población de células destino mediante el uso de mecanismos citolíticos o citotóxicos o podrían modificarse para que estén limitados por o desprovistos de estas funciones efectoras secundarias con el propósito de preservar la población celular destino.

El tratamiento de los individuos puede comprender la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos se pueden proporcionar en un kit, como se describe a continuación. Los anticuerpos pueden usarse o administrarse como una mezcla, por ejemplo, en cantidades iguales, o individualmente, proporcionarse en secuencia o administrarse todos de una vez. Al proporcionar a un paciente anticuerpos, o fragmentos de este, capaces de unirse a la OSM, o un anticuerpo capaz de proteger contra la OSM en un paciente receptor, la dosis del agente administrado variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, el tamaño, el género, la condición médica general, la historia médica anterior del paciente, etc.

En una aproximación similar, otro uso terapéutico de los anticuerpos monoclonales de la presente invención es la inmunización activa de un paciente por medio del uso de un anticuerpo anti-idiotípico, que se potencia contra uno de los presentes anticuerpos monoclonales. La inmunización con un anti-idiotipo, que imita la estructura del epítopo, podría eliminar una respuesta anti-OSM activa (Linthicum, D. S. y Farid, N. R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), pág. 1-5 y 285-300).

De igual manera, la inmunización activa se puede inducir al administrar uno o más epítopos inmunogénicos y/o antigénicos como un componente de una vacuna. La vacunación se puede realizar por vía oral o parenteral en cantidades suficientes para permitir que el receptor genere anticuerpos protectores contra la región biológicamente funcional profilácticamente o terapéuticamente. El huésped se puede inmunizar activamente con el péptido antigénico/inmunogénico en forma pura, un fragmento del péptido, o una forma modificada del péptido. Uno o más aminoácidos, que no corresponden con la secuencia de la proteína original, se pueden añadir a los terminales amino o carboxilo del péptido original, o la forma truncada del péptido. Tales aminoácidos extras son útiles para acoplar el péptido a otro péptido, a una proteína portadora grande, o a otro soporte. Los aminoácidos útiles para estos propósitos incluyen: tirosina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína y derivados de estos. Podrían usarse técnicas de modificación de proteínas alternativas, por ejemplo, acetilación de NH2 o amidación de terminal COOH, para proporcionar medios para acoplar o fusionar el péptido a otra proteína o molécula péptido o a un soporte.

Los anticuerpos capaces de proteger contra bioactividad de OSM indeseada pretenden proporcionarse a los sujetos receptores en una cantidad suficiente para efectuar una reducción, resolución o mejora en la patología o el síntoma relacionado con OSM. Se dice que una cantidad es suficiente o una "cantidad terapéuticamente eficaz" para "efectuar" la reducción de síntomas si la dosificación, la ruta de administración, etc. del agente son suficientes para influenciar tal respuesta. Las respuestas a la administración del anticuerpo se pueden medir por análisis de los tejidos, órganos, o células afectados del sujeto, como por técnicas de imágenes o por análisis de muestras de tejidos ex vivo. Un agente es fisiológicamente importante si su presencia resulta en un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor.

Aplicaciones terapéuticas Los anticuerpos neutralizadores de OSM de la presente invención, los fragmentos de unión a antigenos o variantes especificadas de estos pueden usarse para medir o causar efectos en una célula, un tejido, un órgano o un animal (que incluyen mamíferos y seres humanos), para diagnosticar, monitorear, modular, tratar, aliviar, ayudar a evitar la incidencia de o reducir los síntomas de una condición mediada, afectada o modulada por OSM o células que expresan OSM. Así, la presente invención proporciona un método para modular o tratar al menos una enfermedad relacionada con OSM en una célula, un tejido, un órgano, un animal o un paciente, como se conoce en la materia o como se describe en la presente descripción, mediante el uso de al menos un anticuerpo de OSM de la presente invención.

Se conoce que la OSM está regulada en una variedad de estados de enfermedades que involucran inflamación y se ha implicado en diversos roles biológicos que incluyen la formación de hueso, degradación de cartílago, captación de colesterol, dolor e inflamación. Las indicaciones particulares se tratan abajo.

Indicaciones Los presentes inventores han demostrado que la OSM media en la destrucción de cartílago y han mostrado que la OSM causa degradación de condrocitos en la matriz intra-articular de explantes de tejidos. La OSM promueve, además, la liberación de citocina, tal como TNFa, capaz de promover la liberación de colágeno del cartílago como muestran T. Cawston y otros (1998, Arthritis and Rheumatism, 41 (10) 1760-1771 ) y que, actualmente, un anticuerpo ejemplificado como dominios de unión M17 es capaz de bloquear la liberación de citocina sistémica. Un anticuerpo de la presente invención; M55, M64, M69 y M71 demostró la capacidad de aumentar la síntesis de proteoglicano en un sistema de cocultivo de macrófagos-condrocitos por encima del nivel observado en ausencia de un anticuerpo especifico de OSM.

Los presentes inventores han demostrado, además, que la administración de un anticuerpo neutralizador anti-OSM de la invención inhibirá la liberación de quimocina y citocina impulsada por OSM ¡n vivo, tal como IL-6, IP-10 y KC. IP-10, proteína inducida por interferón gamma de 10 kDa o citocina inducible pequeña B10, es una proteína que, en humanos, está codificada por el gen CXCL10 (quimocina motivo C-X-C 10 (CXCL10). A la CXCL10 se le han atribuido varios roles, tales como la quimioatracción para monocitos/macrófagos, células T, células NK y células dendríticas, y la promoción de la adhesión de células T a células endoteliales. La KC, ahora conocida como ligando de quimocina 1 (motivo C-X-C) (CXCL1 ), es una citocina pequeña que pertenece a la familia de quimocina CXC, previamente denominada oncogen GRO1 , GROa, proteína activadora de neutrófilos 3 (NAP-3) y actividad de estimulación del crecimiento del melanoma, alfa (MSGA-a). En seres humanos, esta proteína está codificada por el gen CXCL1. El CXCL1 está expresado por macrófagos, neutrófilos y células epiteliales, y tiene actividad quimioatrayente de neutrófilos.

De conformidad con la presente invención, se proporciona, por lo tanto, el uso de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71 y M83 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad degradativa de proteoglicano articular, tal como osteoartritis, una artropatia inflamatoria o un trastorno inflamatorio. Un uso particular de un antagonista de OSM es en la fabricación de un medicamento para evitar o reducir la liberación de colágeno del cartílago. La invención proporciona, además, un método para el tratamiento o la profilaxis de una artropatia inflamatoria o un trastorno inflamatorio; el método comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo que bloquee la unión de la OSM a la gp130 a un paciente que padece un trastorno asi.

Un anticuerpo de la invención podría usarse en una preparación para el tratamiento de un proceso proinflamatorio en el cual la OSM lleva directa o indirectamente, tal como mediante la liberación de citocinas inflamatorias, a la patogénesis en tejidos u órganos, especialmente, en la piel, los pulmones y las articulaciones. Las patologías incluyen osteoartritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artropatia neuropática, artritis reactiva, artropatia por desgarro del manguito rotador, fiebre reumática, síndrome de Reiter, esclerosis sistémica progresiva, cirrosis biliar primaria, pénfigo, penfigoide, vasculitis necrotizante, miastenia gravis, esclerosis múltiple, lupus eritematoso, polimiositis, sarcoidosis, granulomatosis, vasculitis, anemia perniciosa, trastorno inflamatorio del SNC, enfermedades mediadas por complejos antigeno-anticuerpo, anemia hemolítica autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, síndrome de Reynard, glomerulonefritis, dermatomiositis, hepatitis activa crónica, enfermedad celíaca, complicaciones autoimunes del SIDA, gastritis atrófica, enfermedad de Addison, endotoxemia o choque séptido (sepsis), o uno o más de los síntomas de la sepsis y otros tipos de inflamación aguda o crónica. Los pacientes que son más particularmente capaces de beneficiarse con el método de la invención son los que padecen infecciones por E. coli, influenza hemofílica tipo B, Neisseria meningitides, estafilococos o neumococos. Los pacientes en riesgo de sepsis incluyen los que padecen quemaduras, heridas, insuficiencia renal o hepática, (trauma, los Í inmunocomprometidos (VIH), los que padecen neoplasias hematopoyéticas, mieloma múltiple, enfermedad de Castleman o mixoma cardiaco.

Otras condiciones que se asocian con la OSM y que pueden someterse a tratamiento o terapia preventiva con los anticuerpos de la invención incluyen enfermedades fibróticas, tales como fibrosis pulmonar, nefropatía diabética, fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica y cirrosis. Otra indicación para usar anticuerpos de la invención es en el tratamiento o la prevención del dolor nociceptivo que incluye neuronas de los ganglios de la raíz dorsal.

Administración y dosificación La invención proporciona formulaciones estables de un anticuerpo neutralizador de OSM que, preferentemente, son una solución salina amortiguada con fostato acuosa o una solución salina mezclada, así como formulaciones y soluciones conservadas, así como también soluciones conservadoras multiuso adecuadas para uso farmacéutico o veterinario, que comprenden al menos un anticuerpo neutralizador de OSM en una formulación aceptable farmacéuticamente. Los vehículos adecuados y sus formulaciones, inclusive otras proteínas humanas, por ejemplo, la albúmina de suero humano, se describen, por ejemplo, en E.G. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21.° edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing pág. 691-1092, ver, especialmente, las pág. 958-989.

El anticuerpo neutralizador de OSM en las formulaciones o soluciones estables o conservadas descritas en la presente descripción pueden administrarse a un paciente de conformidad con la presente invención mediante una variedad de métodos que incluyen por vía intravenosa (I.V.); intramusclular (I.M.); subcutánea (S.C.); transdérmica; pulmonar; transmucosa; mediante el uso de una formulación en un implante, una bomba osmótica, un cartucho, una microbomba; u otros medios apreciados por la persona con experiencia y conocidos en la materia.

Por ejemplo, la administración a un sitio especifico puede ser a una cavidad o compartimiento del cuerpo tal como mediante un medio intrarticular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavidad, intraceliaco, intracelebelar, ¡ntracerebroventricular, intracólico, ¡ntracervical, intragástrico, ¡ntrahepático, intramiocardiaco, intraosteal, intrapélvico, intrapericardiaco, intraperitoneal, ¡ntrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmico.

Generalmente, si se administra una dosis sistémica del anticuerpo, es deseable proporcionar al receptor una dosis del anticuerpo que se encuentre en el intervalo de desde aproximadamente 1 ng/kg- 100 ng/kg, 100 ng/kg-500 ng/kg, 500 ng/kg- 1 ug/kg, 1 ug/kg-100 ug/kg, 100 ug/kg-500 ug/kg, 500 ug/kg-1 mg/kg, 1 mg/kg-50 mg/kg, 50 mg/kg-100 mg/kg, 100 mg/kg-500 mg/kg (peso corporal del receptor), aunque se puede administrar una dosis menor o mayor. Por supuesto, las dosificaciones adecuadas de un antagonista de la presente invención variarán dependiendo de factores tales como la enfermedad o el trastorno que se va a tratar, la ruta de administración, la edad y el peso del individuo que se va a tratar y la naturaleza del antagonista. Sin limitarse a ninguna dosificación particular, se cree que, por ejemplo, para la administración parenteral, una dosificación diaria de 0.01 a 20 mg/kg de un anticuerpo (u otra molécula grande) de la presente invención (usualmente presente como parte de una composición farmacéutica como se indicó anteriormente) podría ser adecuada para tratar a un adulto típico.

El tratamiento se puede realizar en un programa de una sola dosis o, preferentemente, un programa de dosis múltiples en el que un curso primario de tratamiento puede ser con 1-10 dosis separadas, seguido por otras dosis dadas a intervalos de tiempo posteriores requeridos para mantener y o reforzar la respuesta, por ejemplo, en 1-4 meses para una segunda dosis y, si es necesario, una(s) dosis(s) posterior(es) después de varios meses. Los ejemplos de programas de tratamiento adecuados incluyen: (i) 0, 1 mes y 6 meses, (ii) 0, 7 días y 1 mes, (iii) 0 y 1 mes, (iv) 0 y 6 meses, u otros programas suficientes para obtener las respuestas deseadas esperadas para reducir los síntomas de la enfermedad, o reducir la gravedad de la enfermedad.

Los anticuerpos de la presente invención podrían usarse solos o en conjunto con agentes inmunosupresores tales como esteroides (prednisona, etc.), ciclofosfamida, ciclosporina A o una análogo de purina (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, o similares), o anticuerpos tales como un anticuerpo de antígeno antilinfocitos, un anticuerpo de antigeno antileucocitos, un antagonista de TNF, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNF o un inhibidor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF soluble, o agentes tales como medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID, por sus siglas en inglés) u otros inhibidores de citocina.

Tabla de secuencias 5 10 20 5 10 20 La presente invención será descrita con referencia a los siguientes ejemplos específicos, no limitantes.

Ejemplo 1: Reactivos y ensayos A fin de seleccionar y caracterizar los anticuerpos de unión a OSM, se generaron constructos de OSM humana y de cyno para la expresión celular de mamíferos. La OSM humana (NP 065391 codificado por NM_020530) es un precursor de 252 aminoácidos procesado en una proteína secretada de longitud completa de 227 aminoácidos (SEQ ID NO: 11), la cual es una proproteína procesada más aún en la forma más completamente activa, aminoácidos, 1-184. Se pidió ADNc de OSM humana a OriGene (núm. de cat. SC121421), el ORF de OSM humana del clon de OriGene se amplificó por PCR y se introdujo un péptido señal (lgG1 murino) junto con una etiqueta de hexa-His para la purificación de proteínas y una AviTag (SEQ ID NO: 56) para la biotinilación de proteínas dirigida al sitio: La última se seleccionó para evitar la biotinilación química aleatoria de residuos de lisina presentes en las cercanías de la interacción de la OSM con los receptores.

Se clonó OSM de mono cinomólogo a partir de ARN de PBMC mediante el uso del sistema de síntesis de primera hebra Superscript III (InVitrogen) para obtener el ADNc y, después, se amplificó por PCR mediante el uso de iniciadores de UTR designados a partir de la secuencia de OSM humana como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 12/648430. La proteína de longitud completa expresada se muestra en la SEQ ID NO: 12 con la forma activa clivada representada por 184 residuos, 51-227.

El precursor y las formas maduras de la OSM humana y de cyno se expresaron en HEK 293 y se purificaron mediante el uso de tecnologías estándar. Las actividades funcionales de las proteínas se probó en los ensayos de señalización de pSTAT3 y proliferación celular A375-S2 mediante el uso, como control, de OSM humana derivada de E. coli, disponible comercialmente (R&D Systems, núm. de cat. 295-OM).

Mab En donde se usó un anticuerpo de control, se usó un anticuerpo de isotipo lgG1 designado CNTO6234.

Biotinilación química La OSM humana recombinante se biotiniló mediante el uso de química de éster de NHS (kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation, Pierce, núm. 21435) dirigida a residuos de amina en la citocina. La reacción de acoplamiento de biotina se optimizó para una eficacia de etiquetado destino de un mol de biotina por mol de antígeno. El último minimiza la pérdida de unión y actividad funcional al mismo tiempo que asegura el etiquetado casi completo de la población de proteínas. Una vez completada la reacción, la proteína se purifica a partir del reactivo de biotina libre y los grupos salientes residuales mediante el uso de columnas para desalar Zeba Desalt Spin Columns incluidas en el kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation (Pierce). Se recuperó aproximadamente 80 % de la materia prima. El ensayo de HABA (kit de cuantificación de biotina de Pierce núm. 28005) se usó para medir el nivel de incorporación de biotina, lo que indicó aproximadamente un mol de biotina por mol de OSM humana. Se usó un instrumento Octet (FortéBIO) para verificar el acoplamiento de estreptavidina y la unión a gp130-Fc (R&D Systems, núm. de cat. 671-GP) para la proteina biotinilada. Las mediciones de Octet mostraron que la OSM humana biotinilada se unió a gp130 con un perfil prácticamente idéntico al de la materia prima sin etiquetar.

Biotinilación dirigida in vitro El AviTag de 15 residuos (GLNDIFEAQKIEWHE) (SEQ ID NO. 56) tiene una cinética de aceptor de biotina similar al sustrato de BirA endógeno BCCP (Beckett y otros 1999, Protein Science). Cuando está unido a una proteina de interés, el AviTag, que tiene un residuo de lisina aceptor, se biotinilará solamente en una posición. La OSM recombinante de cyno se biotiniló específicamente al sitio in vitro mediante el uso de biotina-proteína ligasa y reactivos comercialmente disponibles de Avidity. La OSM de cyno biotinilada se purificó mediante el uso de resina de afinidad de estreptavidina monovalente. La calidad de la proteína resultante se evaluó por SDS-PAGE y SEC-HPLC. El ensayo de HABA (kit de cuantificación de biotina de Pierce núm. 28005) se usó para medir el nivel de incorporación de biotina, lo que indicó aproximadamente un mol de biotina por mol de OSM de cyno. Se usó un instrumento Octet (FortéBIO) para verificar el acoplamiento de estreptavidina y la unión a quimera gp130-Fc para la proteína biotinilada. Las mediciones de Octet mostraron que la OSM de cyno biotinilada se unió a gp130 con un perfil prácticamente idéntico al de la materia prima sin etiquetar. Inmunoensavos de fase sólida Cribado inicial de fago Fab mediante el uso de placas de ELISA NEUTRAVIDIN™ (Pierce) recubiertas con 2 pg/ml de OSM humana u OSM de cyno biotinilada en TBS. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, el bloqueo y el lavado, se adicionaron diluciones 1 : 100 de grupos de fagos policlonales de cada ronda de cribado. Se detectó el fago unido con un monoclonal conjugado por HRP específico para pVIII, la proteína de cubierta principal del fago M13 (GE Healthcare, núm. de cat. 27-9421 -01 ), seguido por la adición de sustrato quimioluminiscente POD (Roche, núm. de cat. 1 1582950001 ), y se leyó en un instrumento PerkinElmer.

El cribado primario de clones individuales se llevó a cabo mediante el uso de la proteína Fab-His soluble secretada de sobrenadantes de E. coli. Los sobrenadantes bacterianos, que contienen proteína Fab-His soluble, se usaron para llevar a cabo la unión en un formato de ELISA. Se recubrieron placas negras MaxiSorp (Nunc, núm. de cat. 4371 1 1 ) con 1 pg/ml de anticuerpo Fd (CH 1 ) antihumano de oveja (The Binding Site, núm. de cat. PC075) y se incubaron a 4 °C durante la noche. Después de que las placas se lavaron y se bloquearon, se adicionó 50 µ? de sobrenadante bacterial no diluido (que contiene proteína Fab-His) y se dejó incubar durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave. Las placas se lavaron y se adicionó 20 nM de OSM humana o de cyno biotinilada a los Fabs capturados.

Después de 1 hora a temperatura ambiente, se adicionó SA-HRP (Invitrogen, núm. de cat. 43-4323) y se llevó a cabo la detección quimioluminiscente como se mencionó anteriormente. Se calculó que la unión primaria del cribado ELISA con OSM humana a una concentración de 20 nM permitiría la detección de clones con afinidades en el intervalo de afinidad nanomolar.

Preclasificación de epítopos La preclasificación de epítopos es un ensayo de competición llevado a cabo con el propósito de agrupar los MAb sobre la base de la unión de características llevada a cabo mediante el uso de mAb convertidos lgG1 y el anticuerpo comercial, MAB29, el cual se conoce que es un bloqueador de reclutamiento (bloqueador R) OSMR /LIFRa.

A cada pocilio de una placa de matriz múltiple de 384 pocilios (Meso Scale Discovery (MSD), L25XA-4) se adicionó 2.5 pg/ml de FC antihumano (Jackson Immuno, 709-005-149) en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) pH7.4 (Sigma, P3813). La placa se incubó a 4 °C durante la noche, después, se bloqueó con 50 µ? de bloqueador A MSD a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa de matriz múltiple y 384 pocilios se lavó tres veces (PBS pH7.4, 0.05 % de Tween 20 (Scytek, PBT010) y a cada pocilio se adicionó 1.0 pg/ml de solución de mAB de prueba seguido por agitación a nivel 6 en un agitador de placa de titulación a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó tres veces como antes.

En paralelo, se combinó una solución de 5 pg/ml de un mAb competidor y 1 pg/ml de OSM biotinilada (R&D Systems, 295-OM-010/CF) en una placa individual de 96 pocilios (COSTAR, 3357) en amortiguador de ensayo MSD (1 :3 de amortiguador de bloque con PBS pH7.4, 0.05 % de Tween 20) y agitación a nivel 3 en un agitador de placa de titulación a temperatura ambiente durante 1 hora. El precomplejo de anticuerpo competidor y OSM biotinilada se adicionó a cada pocilio de la placa de matriz múltiple 384 y se agitó (nivel 6 en un agitador de placa de titulación) a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó tres veces y a cada pocilio se adicionó estreptavidina sulfo TAG (MSD, R32Ad-S) y se agitó (nivel 6 en un agitador de placa de titulación) a temperatura ambiente durante 30 minutos. La placa se lavó tres veces y a cada pocilio se le adicionó amortiguador de lectura T diluido 1 :4 con agua destilada (MSD, R92TC-1 ). La placa se leyó en un instrumento MSD S6000.

La información se interpretó sobre la base de la señal obtenida para un mAb de prueba en presencia de OSM biotinilada sin mAb competidor presente (señal máxima) junto con la señal de autocompetición (reducción de 2-4 veces en señal máxima). La competición de epítopos se asignó cuando el valor en presencia de un mAb competidor se encontraba dentro de tres desviaciones estándar del valor del de la autocompetición.

Células A375 Las células A375 (ATCC; CRL-1619) son células epiteliales humanas derivadas de melanoma maligno. Las células A375-S2 (ATCC; CRL-1872, una sublínea de CRL-1619 sensible a IL-1 ) se cultivan en medio de crecimiento completo (DMEM/GlutaMax-l, Gibco) complementado con 10 % de FBS (Gibco) en frascos de cultivo T-175 (Corning; núm. de cat. 431080) y se subcultivaron cuando fueron aproximadamente 80 % confluentes cada tres a cuatro días en una relación de subcultivo de 1 :20.

Ensayo de proliferación de células A375-S2 (incorporación de BrdU) La reducción en la proliferación de células A375-S2 por OSM humana o de mono cinomólogo se midió por la incorporación de BrdU mediante el uso de ELISA quimioluminiscente. La oncostatina M reduce la proliferación en la linea de células de melanpma humano A375-S2 (Zarling y otros, PNAS 83:9739-9743). Esta línea celular se usó para evaluar los anticuerpos anti-oncostatina M en todas las etapas de descubrimiento de anticuerpos. Las células A375-S2 se mantuvieron en frascos de cultivo de tejido T-150 (BD Falcon 35-5001) en DMEM (Gibco 1 1995) +10 % de FBS (Gibco 16140) +1 % de Pen/Strep (Gibco 15140) a 37 °C en 95 % de 02 -5 % de CO2 y se dividieron 1 :10 dos veces por semana.

Para llevar a cabo el ensayo de proliferación, las células se tripsinizaron (0.25 %, Gibco 25200) para eliminarlas de los frascos T150 y, después, se sembraron en placas a una densidad de 2000 células/pocilio en los 48 pocilios interiores de placas negras recubiertas con TC (BD Falcon 353948) en 200 µ? de DMEM/FBS/Pen-Strep. Después de la incubación durante la noche a 37 °C/95 % O2 - 5 % CO2, el medio sé eliminó y se reemplazó con 180 µ? de medio fresco. Se preparó una placa individual que contenia la totalidad de las soluciones de prueba a 10X de concentraciones finales. De esta placa, se transfirieron 20 µ? a al pocilio correspondiente en la placa de células para generar las condiciones experimentales adecuadas. Cada condición experimental se probó por triplicado. En cada experimento que evaluó la neutralización, el anticuerpo y la oncostatina M se incubaron juntos durante al menos 1 hora adicionados a células. Las placas, después, se incubaron a 37 X/95 % 02 - 5 % CO2 durante 72 horas adicionales. En este momento se llevó a cabo ELISA de proliferación celular con BrdU quimioluminiscente (Roche 11669915001). El reactivo de etiquetado de BrdU se adicionó al cultivo durante 4 horas. Después, se eliminó el medio y se adicionó 100 pL de solución de fijación a cada pocilio. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, la solución se quitó y se adicionó 100 pIJpocillo de solución anti-BrdU-POD. Después de 2 horas a temperatura ambiente, la placa se lavó con PBS-Tween y se adicionó 100 pL de Super Signal Pico (Thermo Scientific 37069) a cada pocilio. Después, se leyó la luminiscencia mediante el uso de un instrumento Perkin Elmer Victor3.

Los experimentos iniciales se realizaron para determinar la respuesta a la dosis de oncostatina M de mono cinomólogo y humana recombinante derivada de células CHO generadas en el laboratorio en la supresión de la proliferación. La Osm se probó a partir de una concentración inicial de 100 ng/ml con 1 a 5 diluciones a una concentración final de 0.0244 ng/ml. El porcentaje de inhibición de proliferación se calculó comparado con células tratadas con el control vehículo. Los resultados de un experimento así se muestran en la Figura 2A. A medida que aumenta la concentración de oncostatina M humana o de cyno, hay una reducción correspondiente en la incorporación de BrdU. La actividad antiproliferativa de la oncostatina M humana y de mono cinomólogo es indistinguible, sobre la base del grado de actividad antiproliferativa y la EC50 del efecto.

Sobre la base de estos experimentos, se usó una concentración de 2 ng/ml de oncostatina M para evaluar y comparar los anticuerpos anti-oncostatina M porque esta concentración inhibió la proliferación aproximadamente 80 %, lo que da una gran ventana en la cual determinar las respuestas a la dosis de anticuerpos. Se evaluó un intervalo de dosis completa de anticuerpos en presencia de 2 ng/ml de oncostatina M humana o de cyno. Adicionalmente, se incluyó un control de isotipo en el experimento a la concentración más alta de anticuerpo anti-oncostatina M usada. La ventana de ensayo se definió por la diferencia entre los pocilios de control no tratados (proliferación máxima) y los pocilios incubados con 2 ng/ml de oncostatina M sola (proliferación mínima); el porcentaje de neutralización a cualquier concentración de anticuerpos se definió dentro de esta ventana.

Señalización de pSTAT3 mediante el uso de ensayo Phospho-STAT3 de A375-S2 La OSM inhibe el crecimiento de células A375-S2 al unirse al receptor de superficie celular gp130 e inducir la heterodimerización del receptor con OSMRp para iniciar una cascada de señalización intracelular que incluye activación (fosforilación) de la moléculas de señalización STAT3 (Kortylewski y otros, Oncogene 18: 3742-3753, 1999). La interrupción de la señalización de STAT3 suprime la inhibición de crecimiento de OSM de las células A375-S2, lo que demuestra que la activación de STAT3 es una etapa clave en la señalización de OSM (Heinrich y otros, Biochem. J. 374: 1-20, 2003). Se ha mostrado que ta fosforilación de STAT3 en células A375-S2 es dependiente de la concentración de OSM y se encuentran disponibles kits comerciales para medirla en células estimuladas. La neutralización de la fosforilación de STAT3 inducida por OSM en células A375-S2 fue seleccionada como un ensayo de cribado primario para candidatos de Mab.

Para la neutralización de anticuerpos de fosforilación de STAT3 inducida por OSM, se siembran células A375-S2 en placas de cultivo tisular de 96 pocilios (Corning; núm. de cat. 3596) a 25,000 células/pocilio en 200 µ? en medio de crecimiento completo y se incuban durante 24 horas. Las células se tratan con una solución que contiene 5 ng/ml de OSM humana (recombinante, derivada de células de mamíferos, OSMN1-1 ), la cual se ha incubado previamente durante 3 horas a temperatura ambiente con mAb experimental diluido serialmente a 1:5 con un inicio a 10 pg/ml. Los controles incluyen células no tratadas, células estimuladas (5 ng/ml de OSM solamente) y un mAb control de isotipo hlgG1. Todos los tratamientos se llevan a cabo por triplicado a menos que se indique de cualquier otra forma.

El análisis de contenido de pSTAT3 se lleva a cabo mediante el uso del kit de lisado de células completas Phospho-STAT3 (MSD; núm. cat. K150DID-1 , Lote núm. K0010570) por medio de seguir el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se tratan en un volumen de 200 µ?/pocillo durante 10 minutos; se quitan las soluciones de tratamiento y se adiciona 50 µ? de amortiguador de lisis MSD de células mediante pipeta multicanal. La placa se coloca sobre un agitador orbital (a 300 RPM) durante 5 minutos. Después, se transfiere 30 µ? de cada lisado a la placa de 96 pocilios de phospho-STAT3 MSD. La placa se sella y se coloca en un agitador orbital (a 300 RPM) durante 1 hora, se lava tres veces con 150 µ? de amortiguador de lavado MSD, y se adiciona 25 µ? de conjugado de anticuerpo de detección secundario (anti-pSTAT3-Ru(bpy)32+) a cada pocilio, se sella nuevamente y se incuba en un agitador orbital (a 3000 RPM) durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lava como anteriormente y se adiciona 50 µ? de amortiguador de lectura MSD (solución de tripropilamina) a cada pocilio. La placa se lee en un instrumento MSD SECTOR Imager 6000.

Se obtuvieron curvas de respuesta a la dosis de EC50 completas para mAb madurados en serie, parentales y de control y se representaron como señal de pSTAT3 de porcentaje normalizado.

Medida de afinidad mediante resonancia de plasmón superficiaKBiacore) Las afinidades de unión se midieron mediante el uso de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) con un biosensor óptico Biacore 3000 (Biacore) mediante el usó de constructos de OSM humana o de cyno como se describió. Se preparó una superficie de biosensor al acoplar mezcla de anticuerpo Fe anti-lgG de anti-ratón (Jackson, núm. de cat. 315-005-046) y anti-humano (Jackson, núm. de cat. 109-005-098) a la superficie de dextrano carboximetilado de un chip CM-5 (Biacore, núm. de cat. BR-1000-14) mediante el uso de las instrucciones del fabricante para química de acoplamiento de aminas. Aproximadamente 19,000 RU (unidades de respuesta) de anticuerpos anti-OSM se inmovilizaron en cada una de las cuatro celdas de flujo. Los experimentos de cinética se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador fresco (DPBS + 0.005 % P20 + 3 mM EDTA). Se prepararon diluciones seriales de ECD de OSM humana y de cyno de 100 nM a 0.412 nM en amortiguador fresco. Se capturó aproximadamente 200 RU de mAb en las celdas de flujo 2 a 4 del chip del sensor. La celda de flujo 1 se usó como superficie de referencia. La captura del mAb se siguió con una inyección de tres minutos (fase de asociación) de antígeno a 50 µ?/min, seguido por 10 minutos de flujo de amortiguador (fase de disociación). La superficie del chip se regeneró mediante dos pulsos de inyecciones de 18 segundos de 100 mM de H3PO4 (Sigma, núm. de cat. 7961) a 50 µ?/min.

La información recolectada se procesó mediante el uso del programa de computadoras BIAevaluation (Biacore, versión 3.2). En primer lugar, la sustracción de la doble referencia de los datos se realizó por la sustracción de las curvas que se generan por la inyección del amortiguador de las curvas que se sustraen de la referencia para las inyecciones de analitos. El análisis cinético de los datos se realizó usando modelo de unión 1 : 1 con un ajuste global. El resultado para cada mAb se reportó en el formato de Ka (constante de asociación), Kd (constante de disociación) y KD (constante de afinidad).

Ejemplo 2: Selección de fabs de unión a osm Las genotecas de Fab-plX de novo se describen en Shi y otros, J Mol Biol 397:385-396, 2010; patente núm. WO09085462A1 ; patente de los Estados Unidos con serie núm. 12/546850; y se designan, en la presente descripción, 169, 323 y 551 que hace referencia al marco de línea germinal humana de cadena pesada usado IGHV1 -69 (SEQ ID NO: 1 ), IGHV3-23 (SEQ ID NO: 2), o IGHV5-51(SEQ ID NO: 3) en nomenclatura de IMGT. Los tres marcos de genoteca de cadena pesada se combinan con cuatro marcos VLkappa de genoteca de cadena liviana: A27 (IGKV3-20*01 (SEQ ID NO: 5)), B3 (IGKV4-1*01 (SEQ ID NO: 6)), L6 (IGKV3-1 1 *01 (SEQ ID NO: 7)), y O12 (IGKV1 -39*01 (SEQ ID NO: 8)). En las genotecas, las regiones V de Fab se completan mediante la adición de una región J (FR4) que comprende la SEQ ID NO: 4 en las cadenas pesadas y la SEQ ID NO: 10 en las cadenas livianas. La CDR3 de cadena pesada es de longitud variable de 7-14 residuos. Los ejemplos de las regiones V completas para cada genoteca se muestran en la Figura 1 y se numeran, las regiones de CDR se muestran de conformidad con Kabat.

El conjunto inicial de coincidencias de exhibición de fagos anti-OSM se identificó mediante el uso de OSM humana aglicosilada disponible comercialmente. Las genotecas de exhibición de fagos Fab-plX se cribaron mediante el uso de captura de OSM humana biotinilada (R&D Systems, núm. de cat. 295-OM) en glóbulos de estreptavidina (SA, por sus siglas en inglés) paramagnéticos (Invitrogen, núm. de cat. 1 12.05D) seguido por un protocolo publicado para selección de fagos (Marks and Bradbury, Antibody Engineering, Vol. 248: 161-176, Humana Press, 2004). Brevemente, se adicionó OSM humana biotinilada a las genotecas de fagos que se habían absorbido previamente en glóbulos no conjugadas, a una concentración final de 100 nM y se incubaron durante 1 hora con rotación suave. Se adicionaron glóbulos de SA bloqueados y se incubaron durante 15 minutos para capturar la OSM biotinilada con fago unido. El complejo de fago/antígeno/glóbulo capturado magnéticamente se lavó 5 veces con 1 mi de TBST y una vez con 1 mi de TBS. Después de la eliminación del lavado de TBS final, se adicionó 1 mi de células TG1 crecientes exponencialmente (Stratagene, núm. de cat. 200123) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos sin agitación. Se esparcieron bacterias infectadas sobre placas de LB/Agar (1 % de glucosa/100 pg/ml de carbenicilina) (Teknova, núm. de cat. L5804) y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se rasparon las capas bacterianas y se prepararon materias primas de glicerina [15 % de glicerina/carbenicilina (100 pg/ml)/2xYT] y se almacenaron a -80 °C. Para preparar el fago para el cribado de segunda ronda, se inoculó 25 mi de 2xYT/Carbenicilina (100 g/ml) con 25 µ? de materia prima de glicerina y se cultivó a 37 °C hasta una OD600 de aproximadamente 0.5. Se adicionó fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, núm. de cat. 200251) al cultivo a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10:1 y se llevó a cabo la incubación durante 30 minutos a 37 °C sin agitación. La bacteria se centrifugó, las bolillas se volvieron a suspender en medio de inducción (2xYT/Carb/Kan/IPTG) y se cultivaron a 30 °C durante la noche. El fago se precipitó con 2 % de PEG/0.25M de NaCI (concentraciones finales) y se volvió a suspender en 2 mi de PBS. El fago de primera ronda se almacenó a 4 °C y se usó para llevar a cabo el cribado de segunda ronda. Los parámetros de cribado fueron: Ronda 1 : 100 nM de antigeno, 1 hora de incubación a temperatura ambiente, 5x lavados con TBST seguido por 1x lavado con TBS; Ronda 2: 10 nM de antígeno, 1 hora de incubación a temperatura ambiente, 10x lavados con TBST/ 1x lavado con TBS; y Ronda 3, 1 nM de antígeno, 16 horas (durante la noche) de incubación a 4 °C, 10x lavados con TBST/1x lavado con TBS.

El éxito se monitoreó mediante el uso de un ELISA, en donde los Fab se capturaron con anticuerpo Fd antihumano (CH1), se adicionó OSM humana biotinilada a 20 nM y se detectó la OSM unida con SA-HRP.

Se identificaron treinta (30) acoplamientos de cadena pesada-cadena liviana como Fab exhibidos; y se mostró que presentaban reactividad cruzada con OSM de cyno mediante ELISA. Las cadenas pesadas representaban secuencias de las genotecas 169 (derivada de IGHV1-69) y 551 (derivada de IGHV5-51 ) y se combinaron con regiones variables de cadena liviana que representan los cuatro orígenes de la línea germinal de la genoteca (A27, B3, L6 y O12).

Ejemplo 3. Caracterización de mab de unión a osm La OSM de arquitectura de grupo de cuatro hélices se caracteriza por cuatro segmentos helicoidales a designados A, B, C y D unidos por bucles relativamente no estructurados. La OSM interactúa con la gp130 mediante una superficie ubicada en las hélices A y C (sitio II) que se determinó que incluía contacto por parte de los residuos de aminoácidos Q16, Q20, G120, N123, N124 de SEQ ID NO: 1 (Deller y otros, Structure 8(8): 863-874, 2000; Liu y otros, Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009). Se cree que la superficie responsable de la interacción de la OSM con OSMR y LIFRa (Sitio III) está definida en gran parte por residuos ubicados en la hélice D (Deller y otros, ibid).

El objetivo fue seleccionar aglutinantes de gran afinidad con OSM capaces de evitar la señalización de gp130 impulsada por OSM al evitar que la OSM se una a gp130 (Sitio II o bloqueador B) o al evitar el reclutamiento de gp130 unida a OSM de LIFRa o OSMRb (Sitio III o bloqueador R).

De los 30 Fab de unión a OSM seleccionados inicialmente, 29 se clonaron en vectores para la conversión a Mab lgG1 humanos de longitud completa. Los ensayos de caracterización fueron (1 ) unión competitiva para identificar "datos en clases" o grupos de epitopos, (2) mediciones de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial (Biacore) y (3) capacidad para bloquear la señalización de pSTAT3. Todos los análisis y ensayos se llevaron a cabo mediante el uso de las proteínas de cyno y humanas (glicosiladas) producidas de células de mamíferos como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados La información para las mediciones de afinidad para un subconjunto de los mAb seleccionados sobre la base de su clasificación en relación con MAB295 control (R&D Systems) en los ensayos de unión pSTAT3 y ELISA se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Afinidad de subconjunto seleccionado de mAb anti-OSM de primera Los resultados del ensayo de preclasificación mostraron que M5, M6 y M9 competían entre si, pero no con MAB295. M10 compitió con MAB295. El ensayo de pSTAT3 mostró, además, que estos cuatro mAb son neutralizadores funcionales de señalización de gp130. Por lo tanto, resulta que M10 es un bloqueador R y que M5, M6 y M9 bloquean la unión de OSM a gp130 (bloqueadores B).

La afinidad destino para una derivación terapéutica estaba dictada por la necesidad de competir decisivamente con la interacción de OSM-gp130 cuya afinidad (KD), según se midió, era de aproximadamente 1 nM. Por lo tanto, se deseaba una afinidad destino para OSM de 100 pM de KD o menor.

Los MAb neutralizadores M5, M6 y M9, que según se descubrió eran bloqueadores de la interacción de OSM-gp130, más M10 se seleccionaron para la maduración en línea con el propósito de producir derivados que cumplan con el requerimiento de afinidad de 100 pM para un candidato terapéutico. Una propiedad deseada adicional era que los mAb se unan a OSM de mono cinomólogo con una afinidad dentro de cinco veces la de la OSM humana (KD de 500 pM o inferior).

Se descubrió que las composiciones de los dominios de unión para estos cuatro Mab representan cuatro pares únicos de cadena liviana y pesada designados como en la Tabla 4.

Tabla 4.

Las secuencias de región variable completas comprenden las secuencias de la línea germinal usadas para crear la genoteca de fagos como se describió anteriormente y, por lo tanto, los residuos fijos coinciden con los residuos de la linea germinal original no mutados. Asi, cada región V está compuesta por las CDR1 y CDR2 designadas dentro del supercóntigo designado como SEQ ID NO: 1 -3 o 5-8; seguido por CDR3 (Tabla 3 y 4) y para la región variable de cadena liviana, respectivamente, (Tabla 5 para LC y Tabla 5 para HC) seguido por una región J como SEQ ID NO: 4 para la cadena pesada y SEQ ID NO: 10 para la cadena liviana.

Tabla 5.

La región variable de HC H2 comprende FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3 derivado de la SEQ ID NO: 1 , en donde X = A, X2 = G, X3 = I, X4 = P, X5 = I y X6 = F con una mutación adicional en H-CDR2. La HC de la genoteca 551 (H14, H17 y H135) comprende FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 derivado de la SEQ ID NO: 3, en donde X, = S, X2 = S o G, X3 = I, X4 = Y, X5 = G y X6 = Y o D. Cada una de las cuatro HC estaban compuestas de una CDR3 única (SEQ ID NO: 19-22).

Tabla 6.

Las regiones variables de LC de los Fab seleccionados derivan, todas, de la genoteca B3 e incluyen la secuencia de linea germinal curada representada en la base de datos de IMGT como IGKV4-1 (B3) que se usó como secuencia inicial para la diversificación de la genoteca como se describe en la presente descripción y en las publicaciones de referencia. Tres de las cuatro cadenas livianas tenían diferencias en CDR1 y H-CDR2 idéntica. Una secuencia consenso para las cuatro FR1-CDR1 -FR2-CDR2-FR3 variables de LC derivó de la SEQ ID NO: 8, en donde X1 es Y, S o A; X2 es K, E o N; X3 es Y, W o F; y X4 es siempre W.

Se identificaron dos secuencias CDR3 únicas. La L-CDR3 puede representarse por una secuencia consenso (SEQ ID NO: 29) representada por la fórmula Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT.

Ejemplo 4. Reselección de afinidad Los cuatro apareamientos de la región V, OSMM5, OSMM6, OSMM9 y OSMM10, descritos en el Ejemplo 3 se seleccionaron para la reselección de cadena liviana con el propósito de mejorar la afinidad. Para madurar por afinidad cantidades grandes de anticuerpos de selecciones primarias de una forma eficaz y expeditiva, se usó un proceso de maduración en línea descrito en Shi y otros, J Mol Biol 397:385-396, 2010 y WO09085462A1 y la patente de los Estados Unidos núm. de serie 2/546850. Brevemente, las regiones de VH de los clones específicos de antígeno obtenidos en las rondas iniciales de selección se combinaron con genotecas del supercóntigo de VL correspondiente, en este caso la región V basada en B3 (SEQ ID NO: 8).

Se crearon tres nuevas genotecas, una mediante el uso de la genoteca de VL usada en las selecciones primarias como fuente de cadenas de VL diversas, y dos genotecas adicionales designadas sobre la base de un análisis reciente de los complejos antígeno-anticuerpo de estructura conocida (Raghuanthan y otros, J. Mol. Recognit, 2010). Se seleccionaron residuos para diversificación sobre la base de aquellos residuos con mayores posibilidades de estar involucrados en la unión de la proteína destino denominado, además, uso de residuo de determinación de especificidad (SDRU, por sus siglas en inglés). En las cadenas livianas Vkappa, se ha determinado que es tres regiones de contactos centradas alrededor de los bucles hipervariables como lo definen Chothia y Lesk que difieren levemente dependiendo de si el destino es una proteina, un péptido o un hapteno pequeño. La Tabla 5 muestra las genotecas de VL usadas para la maduración por afinidad, en donde B3 es la misma genoteca usada durante la fase de descubrimiento, la Genoteca 2 "centrada en SDRM" se basa en los residuos de SDRU y la diversidad focalizada, y NNK es una genoteca aleatorizada. En la tabla, "X" significa cualquier aminoácido más un codón de terminación generado por una mezcla de NNK.

La Tabla 7 resume la diversidad en las genotecas 1 , 2 y 3. Durante el análisis de la genoteca final, se identificaron algunos aminoácidos que no eran parte del diseño original y, por lo tanto, se introdujeron como una consecuencia del método de síntesis. Para la genoteca 2, sintetizada mediante el uso de dinucleótidos, estos aminoácidos fueron: S (posición 30c), T (posición 30d), EK (posición 30f), IW (posición 32), TV (posición 50), I (posición 92), D (posición 93) y F (posición 96).

Tabla 7 Genoteca CD Posición 1 2 3 Secuencial Kabat Enfocada en pIX B3 de novo SORM NNK SDRM L1 30 30 L L L 31 30a YSHFA RNDGHSY X 32 ' 30b S S S 33 30c S RNDGHWSY X 34 30d N RNDGHSTY X 35 30e N N N 36 30f KTNE EKRNDGHWY X 37 31 N N N 38 32 YFHNWDAS IRNDWY X L2 56 50 WSRDYA YWNKTV X L3 97 91 YSHA SYGH X 98 92 YNDSHIFKG ISYGN X 99 93 SNTDGHR DSTER X 100 94 TYLVFAS YSHT X 102 96 WYFLIR FYRWL X Se preparó la proteína Fab-His a partir de los resultados de la preclasificación de la tercera ronda y los ELISA de Fab-His monoclonal empleados para identificar coincidencias individuales con señal de unión más alta que el Fab original correspondiente. Se usaron dos concentraciones de ántígeno humano biotinilado en estos ELISA de clasificación: 2 nM y 0.2 nM. La señal de unión para cada clon original se fijó como 100 %. Hubo 22 coincidencias de la maduración por afinidad de M6 y M9 que muestra una unión mejorada hasta 9 veces (900 %) cuando se compara con el Fab original que comprende las regiones V de cadena liviana y pesada originales. Algunos de estos nuevos acoplamientos de cadenas liviana y pesada se seleccionaron para una evaluación mayor.

La afinidad (KD) de los mAb madurados en linea para OSM humana y de mono cinomólogo comparada con la de MAB295 control y mAb M6 y 9 originales se resume en la Tabla 8 y la composición de CDR de aquellos mAb se muestra en la Tabla 9. En algunos casos, se acopló una LCV con H14 y H17. Ciertos mAb que se designaron derivaciones terapéuticas candidatas sobre la base de sus propiedades biofísicas y potencias funcionales se resaltan en gris.

Tabla 8 Tabla 9. Tabla de LC-CDR para Mab de afinidad alta La diversidad de LC-CDR3 Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT (SEQ ID NO: 29) en los candidatos seleccionados se redujo, y la secuencia consenso para la LC-CDR3 de alta afinidad reseleccionada se representa como QQY-(F,Y)-STP-(L,I)-T (SEQ ID NO: 47).

Para los mAb reseleccionados, la VH de H14 y H17 comparten una FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 común dada por la SEQ ID NO: 48 y que comprende la SEQ ID NO: 14 (CDR1 ) y la SEQ ID NO: 17 (CDR2).

Capacidad de reducir la proliferación de células A375-S2 humanas y de cyno Para evaluar los anticuerpos madurados en linea, se condujeron respuestas a la dosis con un inicio en 5 pg/ml o 1 pg/ml con 1 a 5 diluciones hasta 0.0016 o 0.00032 pg/ml, respectivamente. La neutralización por M71 se muestra en la Figura 2B. A medida que aumenta la concentración del anticuerpo, el efecto antiproliferativo de la oncostatina M humana y de mono cinomólogo se neutraliza. Las curvas de respuesta a la dosis se calcularon mediante el uso de información de tres experimentos individuales con oncostatina M humana (símbolos abiertos) y de mono cinomólogo (símbolos cerrados). La Tabla 10 resume la IC5o (con 95 % de intervalos de confianza) de M55, M64, M69 y M71 contra oncostatina M humana y de mono cinomólogo.

Tabla 10 Competición de qp130 humana Se llevaron a cabo experimentos de competición entre los mAb anti-OSM elegidos para la maduración en linea más los nuevos aglutinantes seleccionados de la tabla que figura anteriormente y gp130 humana mediante el uso de Resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) con un biosensor óptico Biacore 300 (Biacore), como se describe en el Ejemplo 1.

La superficie del biosensor se preparó mediante el acoplamiento de cada mAb de prueba a la superficie de dextrano carboximetilado de un chip CM-5 (Biacore, catálogo núm. BR-1000-14) siguiendo las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 4.000-15.000 RU (unidades de respuesta) de cada mAb de prueba se inmovilizaron en una de las cuatro celdas de flujo del instrumento. Los experimentos de competición se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador fresco (DPBS+0.005 % P20 + 3 mM EDTA). Se diluyó OSM humana (en el laboratorio, OSMN1-1 ) a 30 nM en amortiguador fresco y se inyectó a 3 µ?/min durante 3 minutos sobre cada una de las celdas de flujo con mAb inmovilizado. Después de la captura de OSM humana, se realizó una inyección de tres minutos (fase de asociación) de un mAb competidor o una gp130 humana-Fc a 300 nM, seguido por flujo de amortiguador (fase de disociación) durante 3 minutos. La superficie del chip se regeneró por dos pulsos de 12 segundos de 100 mM de H3P04 (Sigma, catálogo núm. 7961) a 50 µ?/min. Los datos obtenidos se procesaron mediante el uso del software BIAevaluation, versión 3.2 (Biacore). Primero, se alinearon los sensorgramas una vez inyectada la OSM humana. Después, se registraron los niveles de aglutinante (RU) para OSM humana, mAb competidor o gp130-Fc. Un aumento en el aglutinante (RU) cuando se inyectó un mAb competidor o una gp130-Fc sobre una superficie de OSM indica que no hay competencia con el mAb de prueba inmovilizado y viceversa. Los mAb de celda de flujo (Fc1 , etc.) inmovilizados aparecen a lo largo de las filas de muestras horizontales de la Tabla 10.

Previamente, se mostró que M2 compite con el anticuerpo comercial MAB295, el cual se sabe que no compite con la gp130 que se une a la OSM. Los resultados demostrados de los ensayos de unión de competición mostraron que M54, M55, M64, M69 y M71 compiten con la gp130-Fc humana por el antígeno de OSM (Tabla 11 ).

Tabla 1 1. mAb candidatos maduros iniciales de competencia de qp130 humana Habilidad de bloquear pSTAT3 en células A375 Los valores EC50 calculados para la inhibición de pSTAT3 llevada a cabo en células A375 en presencia o ausencia de 5 ng/ml de hOSM para M6 y M9, y variantes maduros en linea de estos Mab, se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Inhibición de pSTAT3 Ejemplo 5. Actividad biológica Ensayo de cocultivo de condrocitos-macrófaqos Se evaluó el M71 en un sistema de cocultivo de condrocitos-macrófagos. Se sabe que los macrófagos diferenciados producen oncostatina M (Hasegawa y otros, Rheumatology 38:612-617, 1999). La OSM puede disminuir la síntesis de la agrecano proteoglicano altamente sulfatada (GAG) que compone una porción significativa de la matriz de cartílago.

Los anticuerpos anti-oncostatina M humana se descubrieron mediante el uso de una oncostatina M recombinante generada por HEK y marcada con His-Avi humana y de mono cinomólogo, y se evaluó la actividad de estos anticuerpos mediante el uso de estas moléculas, así como oncostatina M humana recombinante derivada de bacterias de R&D Systems (295-OM). Ninguna de estas es idéntica a la oncostatina M humana endógena nativa, tanto por la etiqueta de his-avis (OSM generada por HEK) o la ausencia de glicosilación (OSM recombinante bacterial). Se sabe que los macrófagos secretan oncostatina M (Grove y otros, J Lipid Res 32:1889-97, 1991) y la oncostatina M disminuye la síntesis de proteoglicano en condrocitos humanos (Sánchez y otros, OA y Cart. 12:810-10, 2004). Asi, un sistema de cocultivo de macrófago-condrocito se usó para determinan la capacidad de los anticuerpos de oncostatina M anti-humana para neutralizar la oncostatina M humana nativa o endógena. Brevemente, se cultivaron glóbulos de alginato sencillos que contenían 40,000 condrocitos articulares humanos normales durante 72 horas en presencia de macrófagos humanos diferenciados. Estos experimentos se condujeron en presencia de un intervalo de dosis de anticuerpo anti-Oncostatina M. Al final del experimento, se midió la síntesis de proteoglicano por la incorporación de 35S04 radioactivo.

Se obtuvieron monocitos CD1 + de sangre periférica de AlICells. Los monocitos se cultivaron en placas de 48 pocilios a 2.5 x 105 células/pocilio en 0.5 mi de medio de macrófago (RPMI + glutamina con 10 % de FBS desactivado por calor, 1 % de NEAA y 1 % de Pen-Strep). Las células se trataron con 100 ng/ml de factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF, por sus siglas en inglés). Después de 48 horas, los medios se reemplazaron para eliminar células no adherentes. En el día 6, el medio de macrófagos que contenía M-CSF se reemplazó por medio de macrófagos sin M-CSF. En el día 8, el medio de macrófagos se reemplazó con medio de condrocitos (50 % de F- 2 de Ham/50 % de DMEM con 10 % de suero fetal de ternero) y se adicionó un cultivo de glóbulo de alginato sencillo (Articular Engineering núm. CDD-H-2200) a cada pocilio. Las alícuotas de medio de macrófagos acondicionado se reservaron y almacenaron a -80 °C para el análisis de niveles de Oncostatina M mediante el uso del DuoSet de Oncostatina M humana (DY295) de R&D Systems.

Los cocultivos de glóbulos de alginato-macrófagos se mantuvieron en presencia de 20 pg/ml de anticuerpos anti-Oncostatina M humana (M64, M71 , M55, M69) o en presencia de un intervalo de dosis (5 pg/ml a 0.00076 pg/ml; 1 a 3 diluciones) de anticuerpo (M71 y M55). Adicionalmente, el control del isotipo lgG1 humano (CNT06234) se incluyó en la placa a la concentración más alta de anticuerpo anti-oncostatina M probada. Otros controles fueron solamente condrocitos (no cocultivo) y condrocitos en presencia de 2 ng/ml de oncostatina M humana. Adicionalmente, se mantuvieron pocilios que contenían macrófagos solamente con el propósito de medir la producción de oncostatina M. Después de 72 horas de cocultivo, se adicionaron 10 pCi/ml de 35SO4 radioactivo (Perkin-Elmer NEX041 H002MC) a cada pocilio durante 20 horas adicionales.

Se midió la incorporación de 35S04 mediante el uso de la técnica de precipitación CPC (MP Blomedicals (núm. 190177). Después de 20 horas de incubación con 35SO4, el medio marcado se eliminó y cada glóbulo se lavó dos veces con DPBS con Ca y Mg. Después del segundo lavado, se adicionaron 200 pl de amortiguador de citrato (150 mM de NaCI, 55 mM de citrato de Na, ph 6.8) a cada glóbulo. Las placas se incubaron durante 10 a 15 minutos a 37 °C hasta que los glóbulos se disolvieron. Se transfirió una alícuota de 100 µ? de cada pocilio a una placa de filtro de 96 pocilios Millipore Multiscreen mojada previamente con 1 % de CPC y, después, se adicionaron 10 µ? de CPC al 10 % a cada pocilio, durante 5 minutos. Después, se aplicó vacío a la placa hasta que los filtros estuvieron secos. Después, cada pocilio se lavó 2 veces con 200 pl de CPC al 1 %, y se aplicó vacío cada vez hasta que los filtros estuvieron secos. Después, se quitó el fondo de plástico de la placa y se reemplazó con un sellador (Perkin Elmer núm. 6005185). Se adicionó fluido de escintilación (50 pl, Perkin Elmer núm. 6013621) a cada pocilio y se aplicó un sellador de placa a la parte superior de la placa. Después, se realizó el conteo de la placa en un lector Top Count.

A 20 pg/ml, M64, M71 , M55 y M69 aumentaron la síntesis de proteoglicano por encima del nivel observado en ausencia de anticuerpo, mientras que el control del isotipo no se vio afectado (Figura 3). En un experimento separado, M71 aumentó dependientemente de la dosis la síntesis de proteoglicano al nivel exhibido por los condrocitos solos (definido como 100 % de neutralización), con un EC50 de 30 ng/ml, y el control del isotipo no se vio afectado. Esta información demuestra que la OSM derivada de macrófagos disminuye la síntesis de proteoglicano en los condrocitos cocultivados y que los anticuerpos anti-Oncostatina M humana neutralizan la Oncostatina M nativa.

Ensayo de fosfo-STAT3 de fibroblastos de pulmón humano La OSM induce la proliferación y la producción de colágeno en fibroblastos de pulmón humano normales (Scaffidi y otros, Br. J. Pharmacol 136: 793-801 , 2002). La superproducción de colágeno por parte de los fibroblastos es una característica clave de una cantidad de trastornos patológicos (Lim y otros, Oncogene 23(39): 5416-25, 2006; Huang y otros, J Cell Biochem 81(1): 102-13, 2001 ). La señalización del receptor de Oncostatina M activa la ruta de JAK-STAT y la fosforilación de STAT3 es un suceso temprano en la ruta de señalización (Auguste y otros, (1997) Signaling of Type II Oncostatin M Receptor. J Biol Chem 272:15760-15764). Se determinó la capacidad de la Oncostatina M para generar pSTAT3 en fibroblastos de pulmón humano normales (NHLF, por sus siglas en inglés) mediante el uso del Duoset de pSTAT humano/de ratón de R&D Systems (DYC4607-5). Este ensayo se usó, después, para determinar la capacidad de M55 y M71 para neutralizar la señalización de la Oncostatina M.

Estos experimentos se llevaron a cabo mediante el uso de NHLF de Lonza (CC-2512) cultivado en medios FGM-2 (CC-3132) propiedad de Lonza. En resumen, las células se sembraron en placas a 25,000 células/pocilio en FGM-2 y se cultivaron durante 24 horas. Después, las células se trataron con Oncostatina M o anticuerpo más Oncostatina M durante 10 minutos. A fin de evitar efectos dependientes de la temperatura durante esta incubación de 10 minutos, todas las soluciones usadas para preparar los tratamientos se calentaron previamente y se mantuvieron a 37 °C. Después del tratamiento de 10 minutos, se aspiró el medio y se reemplazó con amortiguador de lisis completo. El amortiguador de lisis (pH= 7.2) consistía en 1 % de NP-40, 1 % de desoxicolate sódico, 0.1 % de SDS, 0.15 M de NaCI y 0.01 M de fosfato sódico, y se almacenó a 4 °C. En el momento de uso, el amortiguador de lisis completo se preparó al adicionar 1 tableta de cóctel de inhibidor de proteasa (Roche, 1 1836153001) y 110 µ? de inhibidor de fosfatasa HALT (Thermo Scientific 78420) a 1 1 mi de amortiguador de lisis. Después de la etapa de lisis de 10 minutos, el lisado resultante estuvo lista para la detección de pSTAT3.

Para determinar la respuesta a la dosis de la Oncostatina M, se trataron células NHLF con un intervalo de dosis de OSM (100 ng/ml a 0.024 ng/ml el 1 a 4 diluciones, pocilios triplicados). Se preparó una placa de dilución en PBS calentado previamente + 1 % de BSA, en la cual la concentración de Osm en cada pocilio era 10X más alta que la concentración final necesaria para el tratamiento, con pocilios de medios solamente incluidos como controles no tratados. Los medios se eliminaron completamente de la placa de cultivo y se reemplazaron con 180 µ? de FGM-2 precalentado. Se inició un cronómetro durante 10 minutos y, después, se transfirieron 20 µ? de cada pocilio en la placa de dilución al pocilio correspondiente en la placa de cultivo. Después de 10 minutos, las soluciones de tratamiento en la placa de células se eliminaron completamente por aspiración y se reemplazaron con 100 l de amortiguador de lisis completo. A fin de minimizar las diferencias en el tiempo de incubación, el amortiguador de lisis se adicionó en el mismo orden que los tratamientos. Después, la placa de ensayo se colocó en un agitador, durante 10 minutos. Después de agitar, los lisados se congelaron a -80 °C para, después, probarlos o transferirlos directamente a una placa de ELISA recubierta con anti-pSTAT3. Se llevó a cabo el ensayo ELISA (Duoset de pSTAT3 humano/de ratón R&D Systems) de conformidad con las instrucciones del fabricante con las excepciones de que 1 ) se adicionaron solamente 90 pl de lisado o estándar a cada pocilio y 2) Se usó SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) como el sustrato HRP. La placa de ELISA se leyó por luminiscencia en un lector de placa Victor3.

A fin de evaluar la capacidad de M55 y M71 para neutralizar la señalización de OSM en NHLF, las células se trataron con un intervalo de dosis de anticuerpo anti-OSM (pocilios triplicados, 500 ng/ml a 0.005 ng/ml con 1-10 diluciones o 50 ng/ml a 1.563 ng/ml con 1 a 2 diluciones) en presencia de 2 ng/ml de Osm humana. Se preparó una placa de dilución en PBS para el tratamiento de respuesta a la dosis del anticuerpo a 20X de concentración final, con pocilios incluidos para el control de isotipo (a la concentración del anticuerpo anti-OSM) así como sin anticuerpo para el control no tratado y las células tratadas con OSM solamente. Se preparó oncostatina M humana separadamente a 40 ng/ml (20X de concentración final) en FGM-2. Las soluciones de anticuerpo 20X y OSM se mezclaron en volúmenes iguales en la placa de dilución para generar soluciones de tratamiento 10X, y la placa se incubó durante 1 hora a 37 °C para permitir que la OSM se una al anticuerpo. Después de 1 hora, los medios se eliminaron de la placa de cultivo y se reemplazaron con 180 pl de FGM-2 precalentado. Se inició un cronómetro durante 10 minutos y se transfirieron 20 pl de cada pocilio en la placa de dilución al pocilio correspondiente en la placa de cultivo. Después de 10 minutos, las soluciones en la placa de células se eliminaron completamente por aspiración y se reemplazaron con 100 µ? de amortiguador de lisis completo. A fin de minimizar las diferencias en el tiempo de incubación, el amortiguador de lisis se adicionó en el mismo orden que los tratamientos. Después, la placa de ensayo se colocó en un agitador, durante 10 minutos. Después de agitar, los lisados se congelaron a -80 °C para, después, probarlos o transferirlos directamente a una placa de ELISA recubierta con anti-pSTAT3. Se llevó a cabo el ensayo ELISA (Duoset de pSTAT3 humano/de ratón R&D Systems) de conformidad con las instrucciones del fabricante con las excepciones de que 1 ) se adicionaron solamente 90 µ? de lisado o estándar a cada pocilio y 2) se usó SuperSignal Pico (ThermoScientific 37069) como el sustrato HRP. La placa de ELISA se leyó por luminiscencia en un lector de placa Victor3.

La Oncostatina M humana aumentó el pSTAT3 en células NHLF con una EC50 de aproximadamente 1 ng/ml. Un ejemplo de una respuesta a la dosis de una Oncostatina M se proporciona en la Figura 4A. Para este ejemplo, la EC50 fue de 0.90 ng/ml con un intervalo de 95 % de confianza de 0.70 a 1.17 ng/ml. Se determinó la capacidad de neutralizar de los anticuerpos anti-oncostatina M en presencia de 2 ng/ml de Oncostatina M y toda la información se normalizó a la luminiscencia en presencia de 2 ng/ml de OSM sin ningún anticuerpo presente. La Figura 4B muestra la neutralización dependiente de la dosis de la fosforilación de STAT3 inducida por OSM por parte del M71. A medida que la concentración de M71 se aumenta, el grado de fosforilación de STAT3 disminuye. La curva de respuesta a la dosis se calculó a partir de la información obtenida de seis experimentos individuales y la IC50 calculada para M71 fue de 8.9 ng/ml con un intervalo de 95 % de confianza de 6.9 a 1 1.6 ng/ml.

Ejemplo 6. Actividad in vivo Se evaluó M71 por su capacidad para bloquear la producción de citocinas in vivo después de la administración sistémica de oncostatina M humana. La inyección intraperitoneal de oncostatina M humana aumenta los niveles de ciertas citocinas séricas, presumiblemente, mediante una interacción con el receptor de factor inhibitorio de leucemia murina.

La administración sistémica (i.p.) de oncostatina M humana a ratones se desarrolló como un modelo para evaluar la capacidad para neutralizarse de los anticuerpos monoclonales de antioncostatina M en un contexto in vivo. Los ratones se inyectaron i.p. con 10 pg de oncostatina M humana en 200 µ? de PBS o control de vehículo de PBS. Después de 1 hora, los ratones se anestesiaron con CO2 y se recolectó sangre mediante punción cardiaca terminal. Las muestras de sangre individuales se dejaron coagular sobre hielo durante 20 minutos y, después, se centrifugaron a 3500 rpm durante 10-15 minutos. Las muestras de suero se mantuvieron congeladas hasta que se analizaron, según las instrucciones del fabricante, con el panel de citocina MAP murina Milliplex/quimocina Multiplex (32). Los análisis de las muestras demostraron que, comparada con un control vehículo, la oncostatina M humana aumentó los niveles de suero de KC, IP-10, MCP-1 , IL-6 murina y eotaxina, sin efecto sobre las otras citocinas del panel. Esta información demuestra que la inyección de oncostatina M humana induce la liberación de citocina, presumiblemente, a través de una interacción con el receptor del factor inhibidor de leucemina murina (Richards y otros, J Immunol. 159:2431-37, 1997; Lindberg y otros, Mol Cell Biol 18:3357-3367, 1988) que puede usarse para probar la capacidad de los anticuerpos anti-oncostatina M para neutralizarse in vivo.

M71 y M55 se evaluaron en el modelo de administración sistémica de ratón. Brevemente, los ratones se dosificaron subcutáneamente con M71 o M55 (Osm anti-humana lgG1 a 20, 2.0 o 0.2 mg/kg), CNTO6234 (control de isotipo hulgGI , 20 mg/kg) o PBS en un volumen de 10 µ?/g. Después de 24 horas, cada ratón se inyectó i.p. con 10 pg de la oncostatina humana recombinante derivada de células CHO generadas en el laboratorio en PBS (Sigma núm. D8357) con 0.1 % de albúmina sérica de ratón (Sigma núm. A3559) o con control vehículo de MSA-PBS solo (200 pl de volumen total). Después de 1 hora, los ratones se anestesiaron con CO2 y se recolectó sangre mediante punción cardíaca terminal. Las muestras de sangre individuales se dejaron coagular sobre hielo durante 20 minutos y, después, se centrifugaron a 3500 rpm durante 10-15 minutos. Las muestras de suero se mantuvieron congeladas hasta que se analizaron mediante el uso del panel de citocina MAP murina Milliplex/ quimocina Multiplex (32). Las muestras de suero se analizaron según las instrucciones del fabricante.

La oncostatina M humana indujo aumentos significativos (prueba t de Student no pareada) en los niveles de suero de las cinco citocinas detectadas por el kit: eotaxina, IL-6, IP-10, KC y MCP-1. La dosificación previa con el control de isotipo CNTO6234 a 20 mg/kg no tuvo efecto sobre la liberación de citocina inducida por oncostatina M. Sin embargo, la dosificación previa con M71 redujo significativamente los niveles de suero de IP-10, MCP-1 , IL-6 y eotaxina a 2.0 y 20 mg/kg y KC a 20 mg/kg. No hubo efecto sobre ninguna de las citocinas a 0.2 mg/kg de M71. El efecto de M71 y el control de ¡sotipo sobre IP-10 y MCP-1 se muestra en la Figura 5A y 5B, respectivamente. Se observó una neutralización menos robusta con M55 dado que la neutralización a 20 y 2.0 mg/kg se observó solo con IP-10. Los niveles de suero de IL-6, eotaxina y MCP-1 se redujeron a 20 mg/kg de M55, pero no se observó reducción en los niveles de KC a ninguna dosis de M55. Esta información demuestra la capacidad de los anticuerpos de anti-oncostatina M para neutralizar los efectos biológicos de la onocostatina M humana exógena en el modelo .de administración sistémica murina.

IP-10, proteína inducida por interferón gamma de 10 kDa o citocina inducible pequeña B10, es una proteína que, en humanos, está codificada por el gen CXCL10 (quimocina motivo C-X-C 10 (CXCL10). A la CXCL10 se le han atribuido varios roles, tales como la quimioatracción para monocitos/macrófagos, células T, células NK y células dendríticas, y la promoción de la adhesión de células T a células endoteliales. La KC, ahora conocida como ligando de quimocina 1 (motivo C-X-C) (CXCL1 ), es una citocina pequeña que pertenece a la familia de quimocina CXC, previamente denominada oncogen GR01 , GROa, proteína activadora de netrófilos 3 (NAP-3) y actividad de estimulación del crecimiento del melanoma, alfa (MSGA-a). En seres humanos, esta proteína está codificada por el gen CXCL1. El CXCL1 está expresado por macrófagos, neutrófilos y células epiteliales, y tiene actividad quimioatrayente de neutrófilos.

Ejemplo 7. Cocristalografía Un fragmento Fab que comprende las regiones V H17 (SEQ ID NO: 51) y L180 (SEQ ID NO: 55) se cristalizó con los residuos 26-212 de OS humana (SEQ ID NO: 10).

La OSM comparte su estructura tridimensional de grupo de cuatro hélices con otros miembros de la familia de citocina gp 30. La arquitectura de grupo de cuatro hélices se caracteriza por cuatro segmentos helicoidales a designados A (residuos 10-37), B (residuos 67-90), C (residuos 105-131 ) y D (residuos 159-185) unidos por bucles relativamente no estructurados. La OSM interactúa con gp130 mediante un epitopo denominado Sitio II, el cual incluye residuos de aminoácidos (Q16, Q20, G120, N123, N124) ubicados en las hélices A y C (Deller y otros, Structure 8(8): 863-874, 2000; Liu y otros, Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009). Se cree que el Sitio III, el epitopo responsable de la interacción de OSM con OSMRp y LIFRa, está definido en gran parte por los residuos ubicados en la hélice D (Deller y otros, Structure 8(8): 863-874, 2000).

Cristalización La cristalización del complejo se llevó a cabo mediante el método de difusión de vapor por gota posada a 20 °C mediante el uso del robot de cristalización de proteína Oryx4 (Douglas Instruments), al dispensar volúmenes iguales de 0.2 mi de complejo de proteínas (10.95 mg/mL) y 0.2 µ? de solución de receptáculo. Se llevaron a cabo múltiples cribados de cristalización. La mayoría de las gotículas permanecieron transparentes, lo que refleja la alta solubilidad del complejo. Los cristales se obtuvieron de 0.1 M de MES pH 6.5, 2.4 M de sulfato amónico y 0.1 M de Tris pH 8.5, 3.5 M de formiato sódico.

Resultado de la solución de estructura cristalina Los residuos de OSM en contacto con Fab H14/L180 constituyen el epitopo de unión. Los residuos de anticuerpos en contacto con OSM constituyen el parátopo de unión. Las seis CDR de los dos dominios variables están involucrados en la unión de OSM. Los residuos en contacto se dan en la Tabla 13 y se muestran en las Figuras 5A-5B. La CDR-L1 larga junto con las CDR de la región variable de cadena pesada H1 , forman un sitio de unión al antigeno tipo valle con un pequeño puente en el fondo (Figura 4C, panel izquierdo). Después de la unión, los dos lados del valle abrazan el grupo de cuatro hélices de la OSM a lo largo de las hélices A y C, y el borde inferior se une entre las dos hélices (Figura 4C, panel derecho). La interfaz de unión de anticuerpo y antigeno esconde 2,514 Á2 de superficie accesible al solvente (1225 A2 para Ab y 1298 A2 para Ag). Aunque existe una cantidad de residuos de cargas en la interfaz, no hay apareamiento carga-carga, lo que sugiere que el cohesionado de H y el vdw juegan los roles más importantes en las interacciones de anticuerpo y antigeno.

Tabla 13 Q16 Y32, R98 K19 Y105 Y55, E61 Q20 S31 , P100, V101 D22 I36 L23 P100, V101 , A104, Y105 Y97 Q25 S34 D26 G31 , S32, S33 T27 S32, S33 S28 S32, F38, F98 29 F38, Y97, F98 D32 S32 1105 R59 E106 T100 E109 Y57, R59 K1 10 F98, S99 Q1 12 Y57 M1 13 Y57, R59, S102 T100 P1 16 W33, Y52 N1 17 W33, V101 , S102 L1 19 Y52, D55 G120 T30, Y52 * Los cortes de distancia son 3.3 A para enlaces H (resaltados en negrita) y 3.9 A para contactos vdw.

El Fab H17/L180, así, hace contacto con la OSM en los residuos que se mostró anteriormente que eran contactados por gp130; Q20 y G120, y a lo largo de las hélices A y C.

Ejemplo 8: Farmacocinética La OSM es un destino soluble asociado con los procesos inflamatorios, en oposición a un destino mostrado en la superficie celular de una célula. La naturaleza de un fgG completo que comprende las regiones de unión como se descubrieron en la presente invención y que, adicionalmente, tienen un dominio Fe pueden, asi, adaptarse al objetivo y la especificación terapéutica relacionados con su uso mediante el uso de métodos de modificación de Fe con mutaciones que confieren unión a FcR alterada.

En la presente composición, una actividad sostenida y la persistencia en la circulación es una especificación beneficiosa de un IgG monoclonal terapéutico. Por lo tanto, un dominio Fe que tiene afinidad aumentada para el receptor neonatal (FcRn).

Mediante el uso de las mutaciones descritas anteriormente, M428L (Medlmmune, patente de los Estados Unidos núm. 7670600), en conjunto con N434S (patente de los EE. UU. núm. US 7371826, patente núm. WO2006/053301), se construyó un anticuerpo mutado y uno silvestre mediante el uso de técnicas recombinantes estándar. Estos dos Máb, M71 y M71 US se compararon en ensayos de actividad estándar y se compararon en cuanto a la persistencia en la circulación de un primate no humano.

Ensayos Los M71 y M71 L/S se compararon lado a lado en el ensayo de proliferación de A375-S2. Se evaluaron las respuestas a la dosis a partir de una concentración inicial de 1 pg/ml, con diluciones de 1 a 5 hasta 0.00032 pg/ml. A una concentración de 1 pg/ml, los controles de isotipo para estos anticuerpos, CNTO3930 y CNT08852, respectivamente, no tuvieron efecto sobre la capacidad de 2 ng/ml de oncostatina M humana para inhibir la proliferación. Ambos, M71 y M71 US, neutralizaron completamente el efecto de la oncostatina M a 1 pg/ml, sin diferencia medible en IC50.

M71 y M71 US se compararon en el modelo de administración sistémica en el ratón. Brevemente, los ratones se dosificaron subcutáneamente con M71 y M71 US (20, 10 o 5.0 mg/kg), CNTO3930 (control de isotipo hulgd , 20 mg/kg), CNT08852 (control de isotipo para la versión mutada de Fe, 20 mg/kg) o PBS en un volumen de 10 µ?/g. Después de 24 horas, cada ratón se inyectó i.p. con 10 pg de la oncostatina M humana recombinante derivada de células CHO generadas en el laboratorio en PBS (Sigma núm. D8357) con 0.1 % de albúmina sérica de ratón (Sigma núm. A3559) o con control vehículo de MSA-PBS solo (200 pl de volumen total). Después de 1 hora, los ratones se anestesiaron con C02 y se recolectó sangre mediante punción cardíaca terminal. Las muestras de sangre individuales se dejaron coagular sobre hielo durante 20 minutos y, después, se centrifugaron a 3500 rpm durante 10-15 minutos. Las muestras de suero se mantuvieron congeladas hasta que se analizaron mediante el uso de un multiplex murino Millipore personalizado que consiste en glóbulos específicos para IL-6, MCP-1 , eotaxina, KC y IP-10. Ningún control de isotipo tuvo efecto sobre la liberación de citocina inducida por oncostatina M humana. Sin embargo, el M71 y el M71 US neutralizaron la liberación de citocina inducida por oncostatina M, sin diferencias aparentes en la potencia o la eficacia.

Análisis farmacocinético La vida media del suero de M71 y M71 L/S se comparó en un estudio de farmacocinética de mono cinomólogo no terminal. El estudio incluyó un total de 12 monos cinomólogos y evaluó la administración subcutánea (s.c, n=3) e intravenosa (i.v., n=3) para cada anticuerpo. Los anticuerpos se dosificaron a 3 mg/kg y el estudio se llevó a cabo durante 60 días. Se tomaron muestras de sangre a 1 (solo grupos IV) y 6 horas, y en los días 1 , 2, 4, 6, 8, 12, 16, 30, 37, 45 y 60. El suero de las muestras se congeló a -80 °C hasta la prueba. Los niveles de anticuerpo en el suero se determinaron mediante el uso de ELISA optimizado en suero de mono cinomólogo para la plataforma MesoScale Discovery. El anticuerpo de captura biotinilado era un anticuerpo anti-idiotipo dirigido contra M71 (anti-M71 de ratón). El anticuerpo de detección fue IgG anti-humano etiquetado con rutenio y la lectura fue quimiluminiscencia MesoScale Discovery.

Los resultados del estudio se muestran en las Figuras 6A y 6B. La Figura 6A muestra los gráficos de la dosificación intravenosa, en donde la vida media del suero de M71 fue 15.21 +/- 3.0 días y la vida media de M71 US fue 29.4 +/- 2.3 días. Se obtuvieron resultados similares de la dosificación s.c. (Fig. 6B) con una vida media de suero de 15.4 +/- 4 días para M71 y 32.0 +/-5.9 días para M71 L/S.

Los resultados mostraron que el t ½ de M71 US aumentó aproximadamente dos veces comparado con M71.

Claims (41)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína OSM humana y modula la interacción entre la proteína OSM humana y la proteína gpl30; que comprende una región determinante de complamentariedad de cadena pesada 3 (H-CDR3) seleccionada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 y 21.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende, además, una secuencia de marco 1 de cadena pesada, secuencia H-CDR1 , una secuencia de marco 2, secuencia H-CDR2 y una secuencia de marco 3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el residuo de cadena pesada S31 hace contacto con la proteína OSM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 en la posición Q20 y los residuos de cadena pesada T30 y Y52 contactan la proteína OSM que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 11 en la posición G 120.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque los residuos del marco de cadena liviana variable humana se derivan de un gen de la línea germinal Vkappa humana.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el gen de la linea germinal Vkappa es una secuencia génica de la línea germinal IGKV4.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende, además, una región variable de cadena liviana que comprende la SEQ ID NO: 8, en donde Xi es Y, S o A; X2 es K, E o N; X3 es Y, W o F; y X4 es W.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la secuencia L-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la secuencia L-CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27, 28, 45 y 46.

9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque la secuencia L-CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23-25 y 30-41.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la secuencia L-CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26 y 42-44.

11. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la OSM humana y modula la interacción entre la proteína OSM humana y gp I30 humana; que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena liviana seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 49-53 y/o una secuencia de aminoácido de región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 54 y 55.

12. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena liviana de SEQ ID NO: 51 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 55.

13. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena liviana de SEQ ID NO: 53 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.

14. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque un parátopo del anticuerpo contacta residuos de epítopo de OSM humana que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 en las posiciones Q16, Q20 y G120.

15. El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado además porque comprende, además, una región constante de cadena pesada humana seleccionada del grupo que consiste en IgAl, lgA2, IgD, IgE, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4 e IgM.

16. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la región constante comprende un isotipo IgG humano.

17. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el isotipo es IgGI.

18. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la región constante se muta para hacer que el anticuerpo sea no lítico.

19. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la región constante se muta para aumentar la afinidad del anticuerpo con el receptor neonatal (FcRn) comparado con un anticuerpo con la secuencia de dominio constante IgGI tipo silvestre.

20. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la región constante se muta en las posiciones 428 y 434, en donde la numeración es de conformidad con la numeración EL) de Kabat.

21. El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque las mutaciones son M428L y N434S, en donde la numeración es de conformidad con la numeración EU de Kabat

22. Un fragmento de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos de las reivindicaciones 1-21.

23. El fragmento de unión a antígeno de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el fragmento se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', Fd, F(ab)2 y ScFv.

24. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o un fragmento de unión a antigeno del anticuerpo de las reivindicaciones 22-23, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

25. El uso de la composición de la reivindicación 24, en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente humano que padece una enfermedad o un trastorno que responde a la modulación de la interacción entre proteína OSM humana y gpl30 humana.

26. El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde la enfermedad o el trastorno es una artropatía seleccionada del grupo que consiste en osteoartritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, artropatía neuropática, artritis reactiva y artropatía por desgarro del manguito rotador.

27. El uso de la composición de la reivindicación 24, en la fabricación de un medicamento para tratar un paciente humano que padece una enfermedad o un trastorno, que se representa por la liberación de quimocinas y citocinas proinflamatorias por macrófagos y monocitos.

28. El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde la enfermedad o el trastorno se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, artritis de inicio juvenil, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, psoriasis, enfermedad de placas crónica, lupus eritematoso, enfermedad pulmonar inflamatoria, fibrosis pulmonar idiopática, sepsis, preeclampsia, EPOC, asma y esclerosis múltiple.

29. El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el paciente padece una enfermedad fibrótica seleccionada del grupo que consiste en aterosclerosis, nefropatia diabética, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica y cirrosis.

30. Un polinucleótido aislado que codifica la cadena pesada y/o la cadena liviana del anticuerpo terapéutico de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o del fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 22-23.

31. Una célula huésped recombinante transfectada o transformada establemente que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 30.

32. La célula huésped recombinante transfectada o transformada establemente de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos variable de cadena liviana de SEQ ID NO: 53 y un segundo polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.

33. La célula huésped recombinante transfectada o transformada establemente de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque comprende un vector que comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos variable de cadena liviana de SEQ ID NO: 51 y un segundo polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 55.

34. La célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 o 33, caracterizada además porque la célula es mamífera.

35. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque la célula es CHO.

36. Un proceso para fabricar un anticuerpo; que comprende las etapas de cultivar una célula huésped de la reivindicación 34 y recuperar el anticuerpo de la célula

37. Un kit que comprende una preparación estéril de un anticuerpo aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-21 o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 22-23 e instrucciones para la administración del anticuerpo a un sujeto que lo necesite.

38. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la proteína OSM humana, que comprende: a. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena liviana 1 (L-CDR1) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23-25 y 30-41 ; b. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena liviana 2 (L-CDR2) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 42-44; y c. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena liviana 3 (L-CDR3) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 27-29, 45, 47.

39. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a OSM; que comprende: a. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (H-CDR1) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14 y 15; b. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena pesada 2 (H-CDR2) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16-18; y c. una secuencia de aminoácidos de región determinante de complementariedad de cadena pesada 3 (H-CDR3) seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO. 19-22.

40. Un anticuerpo aislado que comprende la L-CDRI, 2 y 3 de cadena liviana de la reivindicación 38 y la H-CDR1 , 2 y 3 de cadena pesada de la reivindicación 39.

41. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a OSM; que comprende, una H-CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una H-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; una H-CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ; una L-CDRI que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; una L-CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43; y una L-CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.