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KR101920250B1 - 인간 온코스타틴 m 항체 및 이용 방법 - Google Patents

인간 온코스타틴 m 항체 및 이용 방법 Download PDF

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KR101920250B1
KR101920250B1 KR1020137011871A KR20137011871A KR101920250B1 KR 101920250 B1 KR101920250 B1 KR 101920250B1 KR 1020137011871 A KR1020137011871 A KR 1020137011871A KR 20137011871 A KR20137011871 A KR 20137011871A KR 101920250 B1 KR101920250 B1 KR 101920250B1
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주앙 카를로스 알마그로
윌리엄 듀벨
조한 프란스손
호세 파르디나스
라구나산 고파란
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

온코스타틴 M 생물학적 기능을 중화시킬 수 있는 항체 및 조성물이 온코스타틴 M과 관련된 질환 및 장애, 예컨대 골관절염 및 특발성 폐섬유증을 치료하는데 유용하다.

Description

인간 온코스타틴 M 항체 및 이용 방법{HUMAN ONCOSTATIN M ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
본 발명은 인간 세포 상의 막 수용체에 결합하는 온코스타틴 M에 의해 생성되는 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 인간 항체 및 용도에 관한 것이다.
온코스타틴 M(OSM)은 단핵구, 대식구, 호중구 및 활성화된 T-림프구에 의해 분비되는 사이토카인의 IL-6 패밀리의 28kDa의 다기능성 구성원이다(문헌[Tanaka & Miyajima, Rev Physiol Biochem Pharmacol 149: 39-53, 2003]). 분비된 OSM의 카르복시-말단 근처에서의 단백질 가수분해 절단에 의해, 2개의 N-결합 글리코실화 부위를 갖는 209개 아미노산 길이의 OSM의 완전 활성형이 생성된다. OSM은 공통 수용체 서브유닛, gp130 단백질을 공유하는 IL-6, IL-11, 백혈병 억제 인자(LIF), 카디오트로핀-1, 섬모 신경영양 인자(CNTF) 및 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC)을 포함하는 사이토카인의 IL-6 패밀리에 속한다. 인간에서, OSM은 gp130 및 LIFRα 서브유닛 또는 gp130 및 OSMRβ 서브유닛으로 이루어진 수용체 헤테로다이머를 통해 신호전달한다. IL-6 패밀리의 다른 사이토카인과 대조적으로, OSM은 직접적으로, 그리고 임의의 추가의 막-결합 공동-수용체의 부재 하에 gp130에 결합한다(문헌[Gearing et al., Science 255: 1434-1437, 1992]). gp130에 대한 OSM 결합 후에, OSMRβ 또는 LIFRα가 동원되어, 고-친화성 신호전달 복합체를 형성한다(문헌[Mosley et al., J Biol Chem 271: 32635-32643, 1996]). 어느 하나의 수용체의 활성화에 의해, JAK/STAT 경로를 통한 신호전달이 야기된다(문헌[Auguste et al., J Biol Chem 272: 15760-15764, 1997]).
OSM은 면역계 기원의 세포에 의해 주로 생성되며, 그의 신호전달 수용체의 광범위한 분포 때문에, 그는 세포 성장 조절, 신경 발생 및 세포외 기질 조성의 조절을 비롯한 다양한 생물학적 활성과 관련된다.
온코스타틴 M은 그의 명칭이 암시하는 바와 같이, 종양발생 과정과 관련된다. 그러나, OSM은 또한 유해한 증상, 예컨대 폐섬유증을 야기하는 비후성 경로 및 염증의 조기 사건에 수반된다. 따라서, 수용체 신호전달(gp130 신호전달) 사건을 차단할 수 있는 인간 OSM에 특이적인 인간 항체를 제공할 필요가 있으며, 신호 차단 항체는 gp130 발현 세포 상에서 임상적으로 유용한 세포독성, 세포분열억제(cytostatic) 또는 면역조절 효과를 가할 수 있다.
본 발명은 숙주 대상체에서 세포, 조직 또는 기관 상의 OSM 및 OSM 결합 수용체 상호작용과 관련된 하나 이상의 생활성과 관련된 활성을 차단할 수 있는 OSM 결합 모노클로널 항체를 제공한다. 예시적인 OSM 결합 모노클로널 항체의 아미노산 서열이 제공되며, 이는 숙주 세포에서의 발현을 위한 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 본 발명의 OSM 모노클로널 항체 중 하나 이상은 OSM의 표면 상의 에피토프를 한정하며, 이는 본 발명의 항체에 의해 점유되는 경우, 신호전달 복합체, gp130 및 LIFRα 또는 gp130 및 OSMRβ의 수용체 구성성분과의 상호작용을 방지하여, 리간드 라이게이션 주도의 신호전달 및 다운스트림의 생물학적 활성을 방지한다.
본 발명의 일 태양은 단독으로 또는 서열 번호 1 내지 3에 기재된 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3의 특정 위치에서 서열 번호 13 내지 18에 기재된 아미노산 서열 및 서열 번호 27 내지 29 및 47로 나타낸 CDR3을 포함하는 항원 결합 도메인; 또는 단독으로 또는 서열 번호 5 내지 8에 기재된 특정 위치에서 서열 번호 23 내지 26에 기재된 아미노산 서열 및 그의 변이체, 및 서열 번호 19 내지 22로 나타낸 CDR3을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하는 모노클로널 항체의 항원 결합 능력을 갖는 인간 OSM 단백질과 반응성인 단리된 항체이다. 특정 실시형태에서, 인간 OSM 결합 항체는 서열 번호 49 내지 55로부터 선택되는 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 전장 IgG 구조로 사용되는 모노클로널 항체 결합 도메인은 인간 IgG 불변 도메인 또는 그의 특이적 변이체 유래의 불변 도메인을 가지며, OSM 수용체 구성성분을 디스플레이하는 세포에 대한 OSM의 결합을 방지하기 위한 약제학적 제제에서 치료 분자로 사용된다. 다른 실시형태에서, 결합 도메인은 OSM 수용체 구성성분을 디스플레이하는 세포에 대한 OSM의 결합을 방지할 수 있는 치료 분자로 사용하기 위한 항체 단편으로 구성된다. 본 발명의 일 태양에서, 비제한적으로 서열 번호 13 내지 28 및 서열 번호 30 내지 46과 같은 본 발명의 OSM 결합 도메인 및 서열 번호 29 및 47에 의해 제공되는 변이체 중 하나 이상을 포함하는 약제학적으로 허용되는 제형, 전달 시스템, 또는 온코스타틴 M-관련 증상의 치료 키트 또는 방법이 제공된다.
도면의 간단한 설명
<도 1>
도 1은 pIX 코트 단백질 상에 디스플레이되는 Fab 라이브러리를 구축하기 위해 사용되는 생식계열 유전자 서열을 보여주며, 각각의 HV 도메인은 서열 번호 1 내지 3(1 = IGHV1-69, 2 = IGHV3-23 및 3 = IGHV5-51)에 따른 복합(variegated) FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3에 이어서, 다양한 길이의 복합 H-CDR3 영역 및 J-영역(FR4, 서열 번호 4)으로 이루어지며; 각각의 LV 도메인은 서열 번호 5 내지 8(5 = IGKV1-39 (O12), 6 = IGKV3-11 (L6), 7 - IGKV3-20 (A27) 및 8 = IGKV4-1 (B3))에 따른 복합 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3에 이은 서열 번호 9에 따른 CDR3에 이은 J-영역(FR4, 서열 번호 10)으로 이루어진다.
<도 2a>
도 2a는 BrdU 혼입으로 측정되고 단독의 비히클의 존재 하의 대조군에 대해 정규화되는 경우 A375-S2 세포의 증식의 억제에 있어서의 CHO 세포-유래의 재조합 인간 및 사이노몰구스 원숭이(cynomolgous monkey) 온코스타틴 M의 용량 반응의 그래프이다.
<도 2b>
도 2b는 L180(서열 번호 53) 및 H17(서열 번호 54) 가변 도메인으로 구성된 항체 M71이 OSM이 2 ng/㎖의 농도로 존재하는 경우, A375-S2 증식의 OSM 억제를 경감시키는 능력을 보여주는 그래프이다.
<도 3>
도 3은 항체의 부재 하에 관찰되는 수준을 초과하는, 증가된 프로테오글리칸 합성의 척도인 35SO4-흡수의 증가에 있어서 20 ㎍/㎖의 M64, M71, M55 및 M69의 효과를 보여주는 컬럼 그래프이며, 여기서, 비-특이적인 아이소타입 항체는 알긴산염 비드(bead) 내의 인간 연골세포와 OSM을 분비할 수 있는 인간 대식세포의 공동-배양물에서의 대조군이었다.
<도 4a>
도 4a는 NHLF 세포 내에서 인간 OSM 자극된 pSTAT3의 용량 반응을 보여주는 그래프이며, 여기서, EC50은 대략 1ng/㎖인 것으로 관찰되었다.
<도 4b>
도 4b는 항체 M71이 2 ng/㎖ OSM의 존재 하에서 pSTAT3 신호를 중화시키는 능력을 보여주는 그래프이다.
<도 5a 및 5b>
도 5a 및 5b는 지정된 농도의 M71 항체로의 사전 처리와 함께 또는 이것 없이, 그리고 OSM으로의 접종 후에 개별 마우스의 혈청에서 검출되는 IP-10(a) 및 MCP-1(b)의 양을 보여주는 산포도이다.
<도 6a 및 6b>
도 6a 및 6b는 3 ㎎/㎏의 M71 또는 M71의 Fc 변이체의 정맥내(a) 또는 피하(b) 투여 후에 사이노몰구스 원숭이에서의 시간에 따른 혈청 농도를 보여주는 그래프이다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 개시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
약어
BSA = 소 혈청 알부민; CDR = 상보성 결정 영역; Cyno = 사이노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)); DN = 당뇨병성 신장병증; ECD = 세포외 도메인; FR = 프레임워크; H = 중쇄; IPF = 간질성 폐섬유증; L = 경쇄; Ig = 면역글로불린; Mab = 모노클로널 항체; OSM = 온코스타틴 M; OA = 골관절염; PBS = 인산염 완충된 염수; RA = 류마티스성 관절염; VL = 가변 경쇄; VH = 가변 중쇄.정의
본 명세서에서 사용되는 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. 따라서, 항체는 면역글로불린 분자의 적어도 한 부분, 예컨대 비제한적으로 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역 또는 그의 임의의 부분 또는 본 발명의 항체 내로 혼입될 수 있는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 포함하는 분자를 함유하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 용어 "항체"는 추가로 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 하며 이는 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나 단쇄 항체 및 단일 도메인 항체 및 그의 단편을 포함하는, 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 기능성 단편은 사전선택된 표적에 대한 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 항체의 "항원 결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지(hinge) 영역에서 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일의 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여 이들이 단일 단백질 쇄로서 만들어지게 할 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 형성하여 1가 분자(단쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (I 988) Science 242:423-426] 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 또한, 이러한 단쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 이 단편은 무손상(intact) 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝된다. 역으로, scFv 구축물의 라이브러리를 사용하여 항원 결합 능력에 대하여 스크리닝한 다음, 통상의 기술을 사용하여 인간 생식계열 유전자 서열을 암호화하는 다른 DNA로 스플라이싱할 수 있다. 이러한 하나의 라이브러리의 일예는 "HuCAL: 인간 조합 항체 라이브러리"(문헌[Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000) 296(1):57-86])이다.
용어 "CDR"은 항원-결합에 참여하거나 이의 원인이 되는 항체의 상보성 결정 영역 또는 초가변 영역 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 인간 IgG 아형의 초가변 영역 또는 CDR은 카바트(Kabat) 등(문헌[1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.])에 의해 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 잔기 24-34 (L-CDR1), 50-56 (L-CDR2) 및 89-97 (L-CDR3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 31-35 (H-CDR1), 50-65 (H-CDR2) 및 95-102 (H-CDR3)로부터의 아미노산 잔기 및/또는 문헌[(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)]에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 내의 초가변 루프로부터의 잔기, 즉, 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 내의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 또는 52-57의 현재 H2 초티아(Chothia) 정의 및 96-101 (H3)로부터의 잔기를 포함한다. 초티아 및 레스크(Lesk)는 구조적으로 보존된 HV를 "정규 구조(canonical structure)"로 지칭한다. 프레임워크 또는 FR1-4 잔기는 기타 가변 도메인 잔기이고, 초가변 영역을 일괄한다. 초티아 및 레스크의 넘버링 시스템은 소문자 표기, 예를 들어, 30a, 30b, 30c 등으로 나타낸 특정 잔기에서의 확장을 보여줌으로써 루프 내의 잔기의 개수의 차이를 고려한다. 더욱 최근에는, 보편적인 넘버링 시스템을 개발하고, 인터내셔널 이뮤노지네틱스 인포메이션 시스템(international ImMunoGeneTics information system)(등록 상표)(IMGT)(문헌[LaFranc, et al. 2005. Nucl Acids Res. 33:D593-D597])을 널리 택하였다.
본 명세서에서, CDR은 순차적인 넘버링에 의한 경쇄 또는 중쇄 내의 위치 및 아미노산 서열 둘 모두의 면으로 나타낸다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 내의 CDR의 "위치"가 종들 간에 보존되고 루프로 지칭되는 구조에 존재함에 따라, 구조 특징에 따라 가변 도메인 서열을 정렬하는 넘버링 시스템을 사용함으로써 CDR 및 프레임워크 잔기가 용이하게 동정된다. 이러한 정보는 하나의 종의 면역글로불린으로부터의 CDR 잔기를, 전형적으로 인간 항체로부터의 수용 프레임워크 내로 그래프팅(grafting) 또는 대체하는데 사용된다.
용어 "성숙"은 폴리펩티드의 특성을 변경시키는 목적을 위한 항체 가변 영역의 지정된 변화에 적용된다. 당업계에 공지되고 본 명세서에 기재된 바와 같이, V-영역 서열 내의 다수의 위치가 항원의 인식에 영향을 미칠 수 있다. 자연 상에서, 항체는 점진적인 체세포 돌연변이의 과정에 의해 고 친화성 및 특이성을 달성한다. 이러한 과정은 시험관 내에서 모방하여, 친화성 또는 생물물리학적 파라미터, 예컨대 용해성 또는 내산화성을 증가시킴과 동시에, 각 항체 사슬의 서열 무결성을 유지하여, 그들이 종, 현재의 경우에는 인간 항체를 반영하게 하면서 병렬 선택과 표적화된 변이를 가능하게 할 수 있다. 지정된 변화 또는 "성숙"을 이루는 과정은 전형적으로 암호화 서열의 수준에서 수행되며, 증가된 특성의 선택을 위하여 하위라이브러리를 생성함으로써 달성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "OSM"은 온코스타틴 M 폴리펩티드 또는 OSM 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 인간 OSM은 인간 osm 유전자의 산물이다(문헌[Gene 5008]).
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 통상 특이적인 3차원 구조적 특징뿐 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다. 입체형태 및 비입체형태 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에서 소실되나 후자는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본 명세서에서 사용되는 KD는 해리 상수, 구체적으로, 소정의 항원에 대한 항체 KD를 지칭하며, 이는 특정 표적에 대한 항체의 친화성의 척도이다. 고 친화성 항체는 KD가 소정의 항원에 대하여 10-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10-9 M 이하, 더더욱 바람직하게는 10-10 M 이하이다. KD의 역수는 회합 상수인 KA이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "kdis" 또는 "k2" 또는 "kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. "KD"는 "온-속도(on-rate)(kon)" 또는 회합 속도(k1)에 대한 "오프-속도(off-rate)(koff)"로도 지칭되는 해리 속도(k2)의 비이다. 따라서, KD는 k2/k1 또는 koff/kon과 동일하며, 몰 농도(M)로 표현된다. 이것은 KD가 작을수록 결합이 더 강해진다는 것을 따른다. 따라서 10-6M(또는 1 mM)의 KD는 10-9 M(또는 1 nM)과 비교하여 약한 결합을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모노클로널 항체" 또는 "모노클로널 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로널 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 또한, 모든 항체가 재조합 수단, 예컨대 (a) 동물로부터 단리되는 항체 또는 항체 분비 동물 세포와 융합 파트너의 융합에 의해 제조되는 하이브리도마(hybridoma), (b) 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 인간 또는 다른 종 항체 조랍 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 단리된 항체에 의해 제조되거나 발현되거나, 생성되거나, 단리됨에 따라, 상기 용어는 "재조합 항체" 및 “재조합 모노클로널 항체”를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 그러나, 인간 OSM의 에피토프, 아이소형(isoform) 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예를 들어, 다른 종으로부터의 다른 관련 항원(예를 들어, OSM 종 동족체)에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 사실상 없을 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상이한 특이성을 갖는 "단리된" 모노클로널 항체의 조합은 잘 정의되어 있는 조성물에서 조합된다.
본 명세서에서 사용되는 "특이적인 결합", "면역특이적 결합" 및 "면역특이적으로 결합한다"는 소정의 항원에 대한 항체 결합을 말한다. 전형적으로, 항체는 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합하며, 소정의 항원 이외의 비특이적인 항원(예를 들어, BSA, 카세인, 또는 임의의 다른 특정 폴리펩티드)으로의 결합에 대한 그의 KD보다 적어도 2배 더 작은 KD로 소정의 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "고도로 특이적인" 결합은 특정 표적 에피토프에 대한 항체의 상대 KD가 다른 리간드에 대한 항체의 결합에 대한 KD보다 적어도 10배 더 작은 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 분류(예를 들어, IgA, IgE, IgM 또는 IgG)를 지칭한다. 일부 항체 분류는 하위분류, 또는 중쇄 불변 영역(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)에 의해서도 암호화되는 "아이소타입"을 추가로 포함한다. 항체는 불변 영역 도메인 내의 특정 잔기에서 단백질에 결합되는 올리고당류에 의해 추가로 수식될 수 있으며, 이는 항체의 생물학적 기능을 추가로 증진시킨다. 예를 들어, 인간 항체 아이소타입 IgG1, IgG3 및 더 적은 범위로 IgG2에서, 뮤린(murine) IgG2a 항체가 그러한 바와 같이, 이펙터 기능이 나타난다.
"이펙터" 기능 또는 "양성 이펙터"는 항체가 수용체 또는 기타 혈액 구성성분, 예컨대 보체와 상호작용하여 예를 들어 대식세포의 동원과 항체의 항원 결합 도메인에 의해 결합되는 세포의 파괴로 이어지는 사건을 야기할 수 있는 항원 특이적 결합 도메인과 별개의 도메인을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 이펙터 분자의 결합에 의해 매개되는 몇몇 이펙터 기능을 가진다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 항체에의 결합은 보체 시스템을 활성화시킨다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화(opsonisation) 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 염증 반응을 자극하며 또한 자가면역 과민성에 연루될 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하며, 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위가 세포 상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(에타 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)을 비롯한 상이한 항체 분류에 대해 특이적인 많은 Fc 수용체가 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에의 항체의 결합은, 항체-코팅된 입자의 포식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포(killer cell)에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 또는 ADCC로 불림), 염증 매개체의 분비, 태반 이동 및 면역글로불린 생성의 조절을 비롯한 많은 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발시킨다.
용어 "폴리펩티드"는 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다. 또한, 폴리펩티드는 "단백질"로 지칭될 수도 있다.
개관
본 발명은 OSM 단백질 및 절단 산물에 결합하고, 그의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 단리된 Mab를 제공한다. 특히, 본 발명의 OSM 결합 mAb는 gp130에 대한 OSM 결합을 차단시키거나, OSM 결합 gp130에 의한 LIFRa 또는 OSMRb의 동원을 방지할 수 있다. 어느 하나의 경우에, 본 발명의 OSM mAb는 OSM 주도의 gp130 수용체 신호전달을 차단할 수 있다.
STAT3의 인산화는 다양한 병리학적 맥락에서 섬유아세포에 의한 콜라겐의 과다 생성을 야기하는 것으로 보고되었다(문헌[Lim et al. Oncogene 23(39): 5416-25, 2006]; 문헌[Huang et al. J Cell Biochem 81(1): 102-13, 2001]). 이들 특성은 RA, OA에 대한, 그리고 특발성 폐 섬유증(IPF) 및 당뇨병성 신장병증(DN)과 같은 섬유성 징조에 대한 이들 항체의 유력한 치료적 가치를 나타낸다.
인간 OSM 유전자 산물인 OSM(NCBI 수탁 번호 NP_065391)은 25개 아미노산 길이의 신호 펩티드 및 잔기 234와 235 사이의 단백질 분해 절단 부위를 갖는 252개 아미노산 길이의 프레(pre)-프로(pro)-폴리펩티드(서열 번호 11)이다. 이는 5개의 시스테인 잔기를 가져, 잔기 31 내지 152 및 74 내지 192에서 2개의 내부 이황화물을 형성하는 분비된 단백질이다(문헌[Kallestad JC, et al. J Biol Chem. 1991 May 15; 266 (14):8940-5]). 잔기 100 및 217에서 2개의 유력한 N-결합 글리코실화 부위가 존재하며, 진핵 세포 내에서 생성되는 경우, 단백질은 글리코실화된다. 인간 OSM은 잔기 105에서 유리 설프하이드릴을 갖는다.
사이노몰구스 원숭이 OSM 단백질의 서열은 주석이 달린 게놈 서열(NW_001095169) 유래의 1867 bp mRNA(NCBI 번호 XM_001110148)에 대한 자동화된 계산에 의해 생성된 기록이 존재하지만, 사회 공유물로 입수할 수 없었다. 사이노몰구스 원숭이 OSM 서열을 수득하기 위하여, RNA를 사이노몰구스 원숭이 PBMC로부터 단리한 다음, 유전자를 RT-PCR에 의해 이러한 cDNA로부터 증폭시키고, 시퀀싱하였다. 클로닝된 서열(서열 번호 12)의 예측된 번역은 출원인의 동시계속 출원(미국 출원 제12/648430호)에 개시된 바와 같이, 예측된 마카카 물라타(Macaca mullata)(레수스(Rhesus)) 서열과 99.6% 동일하고, 인간 OSM 단백질 서열과 92% 동일하고, 마우스 OSM 단백질 서열과 41% 동일한 것으로 관찰되었다.
따라서, 본 발명은 OSM 결합 gp130 신호전달로부터 야기되는 다운스트림 생물학적 활성을 억제할 수 있는 인간 유래의 OSM-결합 Mab의 동정에 대한 것이며, 여기서, Mab는
OSM의 존재 하에서 세포의 증식을 복원시키는 능력, 조직 외식편 내의 관절내(관절) 기질의 OSM-주도의 연골세포 분해를 억제하는 능력,
인간 폐 섬유아세포에서 OSM-의존성 STAT3 인산화를 효율적으로 중화시키는 능력, 및 OSM 유도성 사이토카인 분비를 방지하는 능력을 나타낸다.
1. 본 발명의 항체의 조성물
본 발명의 OSM-중화 항체는 시험관 내에서, 동소에서, 및/또는 생체 내에서 적어도 하나의 OSM 활성 또는 OSM 수용체 결합을 억제하거나, 차단하거나 간섭하는 항체이며, 이는 OSM 활성 또는 리간드 결합을 증진시키지 않거나, 자극하지 않거나, 유도하지 않거나 또는 작용화(agonize)시키지 않거나, 또는 항체 결합은 숙주 세포 내에서의 신호 전달과 같은 OSM 수용체의 OSM-주도의 라이게이션, 특히 OSM과 gp130 상호작용의 다운스트림 효과를 모방하지 않는다. 또한, 적절한 OSM-중화 항체, 특정 부분 또는 변이체는 임의로 적어도 하나의 OSM 활성 또는 기능, 예컨대, 비제한적으로 RNA, DNA 또는 단백질 합성; 단백질 분비; 세포 활성화, 증식 또는 분화; 항체 분비; OSM 수용체 신호전달; OSM 절단; OSM 결합, OSM 또는 gp130 유도, 합성 또는 분비에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명은 OSM 결합 또는 OSM에 의한 LIFR 동원 후에 gp130 신호전달을 억제할 수 있는 항-인간 OSM 모노클로널 항체의 발견에 기초한다. pIX 코트 단백질에 결합된 사상 파지 입자 상에 디스플레이된 Fab 라이브러리 형태의 항체 결합 도메인(제WO29085462A1호 참조 및 하기에 추가로 기재)을 OSM과 결합하는 능력에 대하여 선택하였다. gp130을 사용한 경쟁 검정법을 사용하여 OSM에 결합하는 경우 OSM이 gp130에 결합하는 것을 방지하는 Fab를 구별하였다. 대안적으로, Fab는 OSM에 결합하는 경우 gp130 결합에 대한 LIFR 동원을 방지할 수 있었다. 세포-기반의(A375, 인간 흑색종 세포) 검정법을 사용하여 OSM 발현 숙주 세포의 gp130-매개의 pSTAT3 활성화를 억제할 수 있는 몇몇 후보 항체를 동정하였다.
본 명세서에 기재된 OSM-결합 항체는 인간 OSM 단백질 활성형 상의 적어도 2개의 별개의 영역을 인식하며, 이는 항체 또는 유사한 기능 차단 능력을 갖는 기타 화합물을 표적화하는데 적합한 OSM 상의 다수의 부위의 추가의 발견을 나타낸다. 따라서, 본 명세서에 아미노산 서열로 제공된 항체 결합 도메인의 발현 및 정제에 의해, OSM-중화 활성을 나타내는 신규한 분자의 선택 수단을 제공할 수 있는 도구가 추가로 제공된다.
일 실시형태에서, 항-인간 OSM 항체는 서열 번호 49 내지 55에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변(VL) 또는 중쇄 가변(VH) 영역을 포함하는 결합 영역을 가지며, 이러한 항체 또는 그의 결합 부분은 OSM에 면역특이적으로 결합한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 서열 번호 54 또는 55를 포함하는 중쇄 및 그의 항원 결합 부분을 포함하는 것은 OSM 단백질에 결합하며, 추가로, 다음과 같은 본 발명의 항체의 특정 기능적 특성을 갖는다:
1. 100 pM 미만의 KD로 인간 OSM과 결합하는 특성
2. 500 pM 미만의 KD로 사이노몰구스 원숭이 OSM과 결합하는 특성
3. 2 ng/㎖ 인간 OSM의 존재 하에서 A375-S2 세포의 증식을, OSM의 부재 하의 수준의 90%까지 복원시킬 수 있는 특성
4. 2 ng/㎖ 사이노몰구스 원숭이 OSM의 존재 하에서 A375-S2 세포의 증식을, OSM의 부재 하의 수준의 90%까지 복원시킬 수 있는 특성
5. 조직 외식편 내의 관절내(관절) 기질의 OSM-주도의 연골세포 분해를 억제하는 특성
6. 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF)에서 OSM-의존성 STAT3 인산화를 효율적으로 중화시키는 특성 또는
7. 마우스 내의 OSM의 전신 접종 후의 사이토카인 분비를 차단하는 특성.
본 발명의 다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 상기 참조된 생물학적 활성의 일부 또는 전부를 나타내는 항체, 특히, M55 및 M71 결합 도메인으로 명명된 Mab의 구조적 특징을 사용하여, OSM으로의 결합과 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 항-OSM 항체를 생성한다. 더욱 구체적으로, M55 및 M71의 하나 이상의 CDR 영역(예를 들어, 서열 번호 1 및 8의 특정 잔기)은 공지되어 있는 인간 프레임워크 영역 및 CDR, 예컨대 서열 번호 13 내지 28 및 30 내지 46과 재조합에 의해 조합되어, 추가의 재조합에 의해 엔지니어링된 본 발명의 인간 항-OSM 항체를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 항체는 IGVH1-69(서열 번호 1) 또는 IGVH5-51(서열 번호 3)의 FR1, 2 및/또는 3을 비롯한 서열을 가지며, 서열 번호 13 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR로부터의 하나 이상의 잔기는 서열 번호 1 또는 3의 CDR 위치에 존재하는 한편, 항체가 OSM에 결합하는 능력이 여전히 유지된다(예를 들어, 보존적 치환). 따라서, 다른 실시형태에서, 엔지니어링된 항체는 서열 번호 13 내지 22에 열거된 CDR과 예를 들어, 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDR 또는 서열 번호 29 또는 47로 제공되는 L-CDR3의 변이체로 이루어질 수 있다.
단순히 OSM에 결합하는 것에 더하여, 상술된 것과 같은 엔지니어링된 항체는 그들이 본 발명의 항체의 다른 기능적 특성, 예를 들어, OSM 단백질 또는 그의 절단 산물이 GP130 양성 세포에 결합(이러한 결합은 생체 내에서 GP130 양성 세포의 증식의 억제를 야기할 것이다)하는 것을 억제하는 능력을 보유하는 것에 대하여 선택될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로널 항체는 예를 들어 표준 ELISA에 의해 OSM으로의 결합에 대하여 시험될 수 있다.
2. OSM -중화 항체의 생성
라이브러리 프레임워크 서열 번호 1, 3, 8을 포함하며, 서열 번호 13 내지 28 및 30 내지 46의 CDR을 갖는 특정된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 본 명세서에서 M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71 및 M83으로 예시된 바와 같은 목적하는 생활성 스펙트럼을 나타내는 OSM-중화 항체는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다.
이에 따라, 다른 실시형태에서, 서열 번호 11의 잔기 51 내지 227 중 5개 만큼 적은 잔기 내지 모든 잔기를 포함하는 본 발명의 항체에 의해 결합되는 에피토프 또는 핵산 암호화 서열을 사용하여 대상체를 면역화시켜, OSM의 생성과 관련된 질환 또는 질환의 징후를 치료하거나, 예방하거나 완화시키려는 목적으로 숙주 내에서 직접 본 발명의 항체를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 그리고 본 명세서에서 예시된 바와 같이, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되며, 여기서 파지는 인간 면역글로불린 유전자를 포함하고, 라이브러리는 예를 들어 단쇄 항체(scFv)로서, Fab로서 또는 쌍을 형성하거나 쌍을 형성하지 않는 항체 가변 영역을 나타내는 일부 다른 구축물로서 인간 항체 결합 도메인을 발현한다(문헌[Vaughan et lo al Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]; 문헌[Sheets et al. PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998))]; 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌[Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 또한, 본 발명의 인간 모노클로널 항체는 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 당업계에 확립되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제5,403,484호; 및 미국 특허 제5,571,698호(Ladner et al.); 미국 특허 제5,427,908호 및 미국 특허 제5,580,717호(Dower et al.); 미국 특허 제5,969,108호 및 미국 특허 제6,172,197호(McCafferty et al.); 및 미국 특허 제5,885,793호; 미국 특허 제6,521,404호; 미국 특허 제6,544,731호; 미국 특허 제6,555,313호; 미국 특허 제6,582,915호 및 미국 특허 제6,593,081호(Griffiths et al.)를 참조한다.
파지 클론은 바이오패닝(biopanning)으로 공지되어 있는 다단계 절차에 의해 선택되고, 이를 통해 동정된다. 바이오패닝은 단백질 리간드 변이체를 디스플레이하는 파지(파지 디스플레이 라이브러리)를 표적과 함께 인큐베이션시키고, 세정 기술에 의해 미결합 파지를 제거하고, 결합 파지를 특이적으로 용리시킴으로써 수행된다. 표적에 대한 최적의 결합을 나타내는 항체 단편을 갖는 파지 클론을 위하여 특정 서열의 푸울(pool)을 농축시키는 추가의 결합 및 임의의 증폭 사이클을 통하여 취하기 전에, 용리된 파지를 임의로 증폭한다. 몇몇 회차(round) 후에, 개별 파지 클론을 특성화하고, 클론에 의해 디스플레이되는 펩티드의 서열은 파지 비리온(virion)의 상응하는 DNA를 시퀀싱함으로써 결정한다.
Fab 파지- pIX 라이브러리
파지 디스플레이 기술의 특정 실시형태에서, 문헌[Shi et al. J Mol Biol 397:385-396, 2010]; WO29085462A1호 및 미국 특허 출원 제12/546850호에 기재되고, 본 명세서에서 추가로 상세화된 pIX 파지 코트 단백질 상에 디스플레이된 합성 Fab 라이브러리를 사용하여 인간 생식계열 유전자 유래의 인간 IgG 서열의 레파토리로부터 결합제를 선택한다. 라이브러리를 서열이 천연의 공급원으로부터 단리된 인간 항체에 존재하는 것으로 관찰되는 빈도에 기초하여 선택된 공지되어 있는 IGV 및 IGJ 생식계열 서열에 의해 암호화된 4개의 VL 및 3개의 VH 도메인 상에 구축하였다. 선택된 VH는 IMGT 명명법으로, IGHV1-69(서열 번호 1), IGHV3-23(서열 번호 2), 또는 IGHV5-51(서열 번호 3)이다. VH 설계에 있어서의 다양성에 의해, CDR3 영역 내에 다양한 길이의 서열을 갖고, 불변의 길이로 유지되는 H-CDR1 및 H-CDR2에서 다양성 위치가 제한된 중쇄가 생성된다. 프레임워크 4(H-FR4)는 라이브러리(서열 번호 4)의 모든 구성원 중에 불변 유지된다.
VH169, IGHV1-69*01 길이 = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SYX 1 ISWVRQA PGQGLEWMGX 2 IX 3 X 4 X 5 X 6 GTANY AQKFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR (서열 번호 1)
여기서, 169 라이브러리에서, X1은 A 또는 G이고, X2는 G 또는 W이며, X3은 I 또는 S일 수 있고, X4는 P 또는 A일 수 있으며, X5는 I 또는 Y일 수 있고, X6은 F 또는 N일 수 있다.
VH323, IGHV3-23*01 길이 = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS X 1 YX 2 MX 3 WVRQA PGKGLEWVSX4 IX 5 X 6 X 7 GX 8 STYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAK (서열 번호 2)
여기서, 323 라이브러리에서, X1은 S, D, N 또는 T일 수 있고; X2는 A, G 또는 W일 수 있으며; X3은 S 또는 H일 수 있고; X4는 V, A, N 또는 G일 수 있으며; X5는 S, N, K 또는 W일 수 있고; X6은 Y, S, G 또는 Q일 수 있으며; X7은 S 또는 D일 수 있고; X8은 S 또는 G일 수 있다.
VH551, IGHV5-51*03 길이 = 98, CDR1 = 31-35, CDR2 = 50-66
EVQLVQSGAE VKKPGESLKI SCKGSGYSFT X 1 YWIX 2 WVRQM PGKGLEWMGX 3 IX 4 PX 5 DSX 6 TRY SPSFQGQVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR (서열 번호 3)
여기서, 551 라이브러리에서, X1은 S, N 또는 T일 수 있고; X2는 S 또는 G일 수 있으며; X3은 I 또는 R일 수 있고; X4는 D 또는 Y일 수 있으며; X5는 G 또는 S일 수 있고; X6은 D 또는 Y일 수 있다.
(11개 잔기), WGQGTLVTVSS(서열 번호 4)를 갖는 FR4 또는 JH 영역을 상기 서열에 결합시켜, 완전 중쇄 가변 영역을 형성하였다.
다양화를 위해 표적화된 H-CDR1 및 H-CDR2 위치는 1) 생식계열 유전자 내의 다양성; 및 2) 공지된 구조의 항체-항원 복합체에서 항원과 접촉하는 것으로 관찰되는 빈도(문헌[Almagro J Mol Recognit.17:132-143, 2004])에 의해 결정하였다. 선택된 위치에서의 아미노산 다양성을 1) 생식계열에서의 이용; 2) 인간 재배열된 V 유전자에서 가장 빈번하게 관찰되는 아미노산; 3) 단일 염기 체세포 돌연변이로부터 야기된 것으로 예측되는 아미노산; 및 4) 항원 인식에 기여하는 아미노산의 생화학적 및 생물물리학적 특성에 의해 결정하였다.
라이브러리는 전장이 7 내지 14개 잔기인 하기에 나타낸 바와 같은(화학식 I) 인간 항체의 레파토리(상기 문헌[Shi et al. 2010])를 모방하는 VH (H3)의 CDR3 내에 다양성을 포함한다. 5000개 초과의 인간 가변 영역의 CDR3 중에, 아미노산 글리신(G) 및 알라닌(A)은 모든 위치에서 빈번하게 사용된다. 또한, 아스파르트산(D)은 위치 95에서 빈번하게 사용되며, 티로신(Y)은 J 세그먼트의 정규 영역을 선행하는 위치에서 빈번하게 암호화된다. 아미노산 페닐알라닌(F), 아스파르트산(D) 및 티로신(Y)은 위치 99 내지 101에서 지배적이며, 이들 위치에서 IgG에서 사용된다. 이들 위치가 종종 H-CDR3에 대한 구조적 지지점으로 소용되고, 항원 및/또는 IgG의 표면에 대한 접근가능성이 더 적기 때문에, 위치 99에서의 아미노산 페닐알라닌 + 류신(50/50 비), 위치 100에서의 아스파르트산 및 위치 101에서의 티로신이 고정되었다. 따라서, 화학식 I의 서열은 서열 번호 1, 2 또는 3과 서열 번호 4 사이에 삽입되어, 완전한 VH를 생성한다.
[화학식 I]
-(D)-(N)n(N+O)m(F)DY-
상기 화학식 I에서,
(D) = Asp (D) 및 Gly (G) 풍부 위치.
(N)n = Ala (A) 및 Gly (G) 풍부 위치, n=3-7.
(O)m = Ala (A), Gly (G) 및 Y (Tyr) 풍부, m=1-4.
(F) = Phe (F) 우성 위치.
다양한 버전의 라이브러리는 또한 인간 생식계열 레파토리 유래의 고정된 또는 다양한 경쇄와 쌍을 형성하는 것을 포함한다. 본 발명에서, 4개의 경쇄 라이브러리 VL카파 유전자(문헌[Kawasaki et al. 2001. Eur J Immunol 31: 1017-1028 and after Schaeble & Zachau, 1993 Biol Chem Hoppe Seyler 374: 1001-1022])는 A27 (IGKV3-20*01), B3 (IGKV4-1*01), L6 (IGKV3-11*01) 및 O12 (IGKV1-39*01)이며, 여기서, 괄호 안의 유전자 명칭은 추정되는 해당 IMGT 유전자이다. Fab는 2시스트론성(dicistronic) 벡터의 발현을 통하여 pIX 상에 디스플레이되며, 여기서, VH-CH1 도메인은 코트 단백질 서열에 융합되고, VL-CL카파 또는 VL-CL람다는 유리 폴리펩티드로 발현되며, 이는 VH-CH1과 자가-회합된다. CDR 영역에 밑줄이 그어 있다.
V카파(Vk) 생식계열 유전자에 기초한 경쇄 가변 라이브러리
012 ; IGKV1-39*01, IGKV1D-39*01 길이 = 88; CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS X 1 X 2 X 3 NWYQQKP GKAPKLLIYX 4 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC (서열 번호 5)
L6, IGKV3-11*01 길이 = 88, CDR1 = 24-34, CDR2 = 50-56
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSV X 1 X 2 X 3 LAWYQQKP GQAPRLLIYX 4 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC (서열 번호 6)
A27, IGKV3-20*01, 길이 = 89, CDR1 = 24-35, CDR2 = 51-57
EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVX 1 X 2 X 3 X 4 LAWYQQK PGQAPRLLIY X 5 ASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYC (서열 번호 7)
B3, DPK24, VKIVKlobeck; IGKV4-1*01 길이 = 94, CDR1 = 24-40, CDR2 = 56-62
DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKSSQSVL X 1 SSNNX 2 NX 3 LA WYQQKPGQPP KLLIYX 4 ASTR ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC (서열 번호 8)
각 가변 영역 스캐폴드에 대한 특정 위치에서의 다양성은 하기 표 1에 요약되어 있으며, 여기서, 아미노산 단일 문자 코드가 사용되고, 도 1에 나타낸 바와 같은 특정 위치에서 대안으로 존재한다.
Figure 112013040373230-pct00001
모든 라이브러리 내의 VL CDR3은 7개의 잔기를 가지며, 여기서, 처음의 2개의 잔기는 글루타민(Gln, Q)이고, 카바트 잔기 95에 해당하는 잔기는 프롤린(Pro, P)이다. L-CDR3에 대하여, 서열은 QQX1X2X3X4PX5T(서열 번호 9)에 해당하며, 변이형은 하기 표에서와 같고, 잔기 위치는 카바트에 따른다.
Figure 112013040373230-pct00002
가변 서열이 유전자 마다 길이가 다양하기 때문에, 초가변 루프 또는 CDR 내의 특정 잔기 위치에서의 다양성은 문헌[Al-Lazikani B, Lesk AM, Chothia C, 1997(Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. J Mol Biol 273: 927-948)]에 정의된 바와 같은 잔기 넘버링을 사용하여 수행되는 바와 같이 기재될 수 있다. 이러한 시스템에서, 초가변 루프의 길이의 변화는 주어진 잔기에 대한 하위위치 a, b, c 등의 명칭에 의해 맞춘다.
프레임워크 4(FR4) 세그먼트, 예컨대 JK4, FGQGTKVEIK(서열 번호 10)를 사용하여 완전 인간 경쇄 가변 영역을 형성하였다.
0.2 내지 20 nM의 다양한 단백질 표적에 대한 Fab 친화성은 초기의 선택에서 입증되었다.
VL 또는 VH 다양성의 리셔플링(reshuffling) 또는 대안적으로, 지정된 또는 제한된 VL 변형으로 이루어진 결합 파라미터를 향상시키기 위한 통합된 성숙 과정을 위한 방법은 참고 문헌에 기재된 바와 같으며, 본 명세서에서 교시된 바와 같은, 그리고 당업계에 공지되어 있는 것과 조합된 라이브러리를 위해 설계되고 사용되는 벡터 및 프라이머를 사용하여 달성된다.
OSM -결합 면역글로불린 도메인의 대안적인 공급원
본 명세서에 개시된 인간 Mab의 특징을 갖는 OSM 결합 항체는 제조되거나, 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술(하이브리도마 방법)을 비롯한 다수의 방법에 의해 형성되는 면역글로불린 도메인으로부터 얻은 결합 단편일 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물, 예를 들어 햄스터 또는 짧은 꼬리 원숭이(macaque monkey)는 본 명세서에 설명된 바와 같이 면역화되어 면역화에 사용되는 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)]).
또한, OSM-중화 항체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 및/또는 당업계에 공지된 바와 같이, 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 비-인간 영장류 등)의 면역화에 의해 임의로 생성될 수 있다. 인간 항-OSM 항체를 생성하는 세포는 상기 동물로부터 단리되고, 본 명세서에 기재된 방법과 같은 적합한 방법을 사용하여 무한증식될 수 있다. 대안적으로, 항체 암호화 서열은 본 명세서에 교시된 방법 및 당업계에 공지된 방법에 의한 항체의 발현 및 단리를 위하여 클로닝되고, 적합한 벡터 내로 도입되어 숙주 세포의 트랜스펙션을 위하여 사용될 수 있다.
인간 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 그의 생식계열 구성 내에 지니는 트랜스제닉 마우스의 사용은 정상적인 인간 면역계가 용인하는 인간 자기 항원을 비롯한 다양한 표적에 대하여 유도된 고 친화성 완전 인간 모노클로널 항체의 단리를 제공한다(예를 들어, 론버그, 엔.(Lonberg, N.) 등의 미국 특허 제5569825호, 미국 특허 제6300129호 및 문헌[1994, Nature 368:856-9]; 문헌[Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7:13-21]; 문헌[Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483-95]; 문헌[Lonberg, N and Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93]; 쿠체르라파티(Kucherlapati) 등의 미국 특허 제6713610호; 문헌[Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326]; 문헌[Fishwild, D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851]; 문헌[Mendez, M. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-156]; 문헌[Green, L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23]; 문헌[Yang, X. et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243]; 문헌[
Figure 112013040373230-pct00003
, M. and Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997]; 토미주카(Tomizuka) 등의 WO02043478호). 상기 마우스에서 내인성 면역글로불린 유전자좌는 파괴되거나 결실되어, 내인성 유전자에 의해 암호화되는 항체를 생성하는 동물의 능력을 제거할 수 있다. 게다가, 아브제닉스, 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 메다렉스(Medarex)(미국 캘리포니아주 새너제이 소재)와 같은 회사를 고용하여, 상기에 기재된 기술을 사용하여 선택 항원에 대하여 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.
패닝 전략에서 표적 리간드로서, 그리고 면역원성 항원으로 사용하기 위한 폴리펩티드의 제조는 임의의 적합한 기술, 예컨대 재조합 단백질 생성을 사용하여 수행될 수 있다. 정제된 단백질, 또는 전체 세포 또는 세포 또는 조직 추출물을 포함하는 단백질 혼합물의 형태의 표적 리간드 또는 그의 단편, 또는 면역화의 경우에 항원은 상기 항원 또는 그의 부분을 암호화하는 핵산으로부터 동물의 체내에서 새로이 형성될 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산은 당업계에 공지된 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 또는 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로널 항체를 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법을 사용하여(예를 들어, 인간 항체 영역의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용에 의해) 용이하게 단리되고 시퀀싱된다. 하이브리도마가 생성될 경우, 그러한 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열 및 번역 생성물이 결합된 디스플레이 기술, 예를 들어 파지 또는 리보좀 디스플레이 라이브러리를 사용하여, 결합제 및 핵산의 선택은 단순화된다. 파지 선택 후, 파지로부터의 항체 암호화 영역을 단리하고 이를 사용하여 인간 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전 항체를 생성하고, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현시킬 수 있다.
인간 항체
본 발명은 인간 OSM에 결합하는 인간 면역글로불린(또는 항체)을 추가로 제공한다. 또한, 이들 항체는 엔지니어링되거나 개조된 것을 특징으로 할 수 있다. 면역글로불린은 실질적으로 인간 생식계열 면역글로불린으로부터의 가변 영역(들)을 가지며, 항원 인식에 참여하는 것으로 공지되어 있는 잔기, 예를 들어, 구조적으로 정의된 바와 같은 초가변 루프 또는 카바트의 CDR 내의 지정된 변이를 포함한다. 불변 영역(들)은 또한, 존재하는 경우 실질적으로 인간 면역글로불린으로부터의 것이다. 인간 항체는 적어도 약 10-6 M(1 mM), 약 10-7 M(100 nM), 10-9 M(1 nM) 이하의 OSM에 대한 KD를 나타낸다. 친화성의 변화에 영향을 주기 위하여, 예를 들어, OSM에 대한 인간 항체의 친화성을 향상시키거나 KD를 감소시키기 위하여, CDR 잔기 또는 다른 잔기 중 어느 하나에서의 치환이 이루어질 수 있다.
OSM에 결합하는 인간 항체의 생성을 위한 공급원은 바람직하게는 가변 영역, 프레임워크 및/또는 인간 OSM에 결합하고 사상 파지 입자 상에 디스플레이된 인간 유래의 Fab의 레파토리를 사용하여 사이노몰구스 원숭이 OSM과 상호작용할 수 있는 것으로 동정된 서열 번호 13 내지 55로 나타낸 CDR도 본 명세서에 제공된 서열이다.
임의의 CDR의 임의의 인간 가변 도메인 프레임워크로의 치환은 인간 가변 도메인 프레임워크가 CDR이 비롯된 모 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 구조를 채용한다면, 그들의 올바른 공간 배향의 유지를 야기할 가능성이 크다. 최종 Mab에서 쌍을 형성하는 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 천연 발생 인간 항체의 서열이고/거나, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되거나 몇몇 인간 항체의 컨센서스(consensus) 서열 및/또는 생식계열 서열일 수 있다.
적합한 인간 항체 서열은 마우스 가변 영역의 아미노산 서열과 공지되어 있는 인간 항체의 서열의 컴퓨터 비교에 의해 동정한다. 비교는 중쇄 및 경쇄에 대하여 따로 수행하나, 원리는 각각에 대하여 유사하다.
실험 방법에 관해서는, 목적하는 활성, 결합 친화성 또는 특이성에 대하여 스크리닝될 수 있는 변이체 서열의 라이브러리를 생성하는 것이 특히 편리한 것으로 관찰되었다. 이러한 변이체의 라이브러리의 생성을 위한 하나의 형식은 파지 디스플레이 벡터이다. 대안적으로, 변이체는 가변 도메인 내의 표적화된 잔기를 암호화하는 핵산 서열을 무작위화하거나 다양하게 하기 위한 대안적인 공지되어 있는 방법을 사용하여 생성될 수 있다.
추가의 치환이 필요한지 여부를 결정하고, 치환을 위하여 아미노산 잔기를 선택하는 다른 방법은 컴퓨터 모델링을 사용하여 달성될 수 있다. 면역글로불린 분자의 3차원 이미지를 생성하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어는 광범위하게 이용할 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 사슬 또는 그의 도메인에 대하여 밝혀져 있는 구조로부터 시작하여 분자 모델을 생성한다. 모델링될 사슬을 아미노산 서열 유사성에 대하여 밝혀져 있는 3차원 구조의 사슬 또는 도메인과 비교하며, 가장 큰 서열 유사성을 보이는 사슬 또는 도메인은 분자 모델의 구축을 위한 출발점으로 선택한다. 밝혀져 있는 출발 구조를 변형시켜, 모델링될 면역글로불린 사슬 또는 도메인에서의 실제 아미노산과 출발 구조에서의 아미노산 간의 차이를 가능하게 한다. 이어서, 변형된 구조를 복합 면역글로불린으로 조립한다. 마지막으로, 모델은 에너지 최소화에 의해, 그리고 모든 원자가 서로 적절한 거리 내에 존재하며, 결합 길이 및 결합 각이 화학적으로 허용되는 한계 내에 있는 것을 입증함으로써 정교화시킨다.
코드의 축퇴성(degeneracy) 때문에, 다양한 핵산 서열은 각 면역글로불린 아미노산 서열을 암호화할 것이다. 목적하는 핵산 서열은 새로운 고체상 DNA 합성에 의해 또는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 조기에 제조된 변이체의 PCR 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 본 출원에 기재된 항체를 암호화하는 모든 핵산은 분명히 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 인간 항체의 가변 세그먼트는 전형적으로 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분에 결합된다. 본 항체는 경쇄 불변 영역 및 중쇄 불변 영역 둘 모두를 포함할 것이다. 중쇄 불변 영역은 일반적으로 CH1, 힌지, CH2, CH3을 포함하며, 때때로 CH4 도메인을 포함한다.
인간 항체는 임의의 분류의 항체로부터의 임의의 유형의 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE와, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 하위분류(subclass)(아이소타입)를 포함한다. 인간화 항체가 세포독성 활성을 나타내기를 원할 때, 불변 도메인은 일반적으로 보체-고정(complement-fixing) 불변 도메인이며 그 분류는 전형적으로 IgG1이다. 그러한 세포독성 활성이 바람직하지 않을 때에는, 불변 도메인은 IgG2 분류의 것일 수 있다. 인간화 항체는 한 가지 초과의 분류 또는 아이소타입으로부터의 서열을 포함할 수 있다.
선택적으로 불변 영역에 결합되는, 인간화 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 암호화하는 핵산을 발현 벡터 내로 삽입한다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 암호화하는 DNA 세그먼트는 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 보장하는 발현 벡터(들) 내의 조절 서열에 작동가능하게 결합된다. 그러한 조절 서열은 신호 서열, 프로모터, 인핸서, 및 전사 종결 서열을 포함한다 (모든 목적을 위하여 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)]; WO 90/07861호; 문헌[Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992)] 참조).
3. 항- OSM 항체의 사용 방법
하기에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명은 M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71 및 M83의 가변 도메인을 갖는 단리된 모노클로널 항체가 OSM 상의 오버랩핑 에피토프에 결합하며, 시험관 내 및/또는 생체 내에서 OSM 억제 활성을 나타내는 것을 입증한다. 유의미하게, 선택된 Mab의 반응성은 gp130과의 OSM 상호작용을 용량 의존적으로 차단하는 능력, gp130의 존재 하에서 OSM 신호전달을 감소시키는 능력, A375 세포의 OSM-자극된 증식을 감소시키는 능력, 대식세포-자극성 연골세포 콜라겐 생성을 방지하는 능력, 또는 생체 내에서 OSM에 의한 사이토카인 분비를 감소시키는 능력을 포함한다.
본 발명에 기재된 바와 같은 모노클로널 항체의 특성을 고려해 볼 때, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 및 동물에서 OSM-관련 증상을 치료하거나 예방하기 위한 치료제 및 예방제 둘 모두로서 적합하다.
일반적으로, 용도는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 하나 이상의 모노클로널 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 유사한 스펙트럼의 결합 활성 및 생물학적 활성을 갖도록 선택된 항체 또는 분자를 감수성 대상체 또는 OSM 활성이 병적 후유증을 갖는 것으로 알려져 있는 증상, 예컨대 면역 장애 또는 종양 성장 및 전이를 나타내는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 것이다. Fab 및 F(ab')2 단편을 비롯한 항체의 임의의 활성 형태가 투여될 수 있다.
바람직하게는, 사용된 항체는 수여 종과 상용성이어서 MAb에 대한 면역 반응은 허용할 수 없게 짧은 순환 반감기를 야기하거나 대상체에서 MAb에 대한 면역 반응을 유도하지 않게 한다. 투여된 MAb는 몇몇 부차적인 기능, 예컨대 대상체의 Fc 수용체에의 결합 및 ADCC 메카니즘의 활성화를 나타내어, 세포용해 또는 세포독성 메카니즘을 사용하여 표적 세포 집단을 고갈시킬 수 있거나, 그들은 표적 세포 집단을 보존하기 위하여 이들 부차적인 이펙터 기능이 제한되거나 이것이 없게 엔지니어링될 수 있다.
개체의 치료는 치료적 유효량의 본 발명의 항체의 투여를 포함할 수 있다. 항체는 후술하는 바와 같이 키트로 제공될 수 있다. 항체는 예를 들어, 동량으로 또는 개별적으로, 순차적으로 제공되거나 한꺼번에 투여되는 혼합물로 사용되거나 투여될 수 있다. 환자에게 OSM에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 또는 수여 환자에서 OSM에 대해 보호할 수 있는 항체를 제공함에 있어서, 투여되는 제제의 용량은 환자의 연령, 체중, 키, 성별, 일반적인 의학적 상태, 이전의 병력 등과 같은 인자에 따라 변할 것이다.
유사한 접근법에서, 본 발명의 모노클로널 항체의 다른 치료적 용도는 본 발명의 모노클로널 항체 중 하나에 대해 야기된 항-이디오타입(anti-idiotypic) 항체를 이용한 환자의 능동 면역이다. 에피토프의 구조를 모방하는 항-이디오타입을 사용한 면역화에 의해 활성 항-OSM 반응이 유도될 수 있었다(문헌[Linthicum, D. S. and Farid, N. R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), pp 1-5 and 285-300]).
이와 유사하게, 능동 면역은 백신의 한 성분으로서 하나 이상의 항원성 및/또는 면역원성 에피토프를 투여함으로써 유도될 수 있다. 백신접종은 수여자가 이러한 생물학적으로 기능성인 영역에 대한 보호성 항체를 생성하도록 하기에 충분한 양으로 경구로 또는 비경구로, 예방적으로 또는 치료적으로 수행될 수 있다. 숙주는 순수한 형태의 항원성/면역원성 펩티드, 펩티드의 단편, 또는 펩티드의 변형된 형태로 능동적으로 면역화될 수 있다. 원래의 단백질 서열에 상응하지 않는 하나 이상의 아미노산이 원래의 펩티드, 또는 절두형(truncated form)의 펩티드의 아미노 또는 카르복실 말단에 첨가될 수 있다. 그러한 여분의 아미노산은 펩티드를 다른 펩티드, 더 큰 캐리어 단백질, 또는 지지체에 커플링시키는데 유용하다. 이들 목적에 유용한 아미노산에는 티로신, 라이신, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인 및 그의 유도체가 포함된다. 펩티드를 다른 단백질 또는 펩티드 분자에 또는, 지지체에 커플링시키거나 융합시키기 위한 추가 수단을 제공하기 위하여, 대안적 단백질 변형 기술, 예를 들어, NH2-아세틸화 또는 COOH-말단 아미드화를 이용할 수 있다.
원치않는 OSM 생활성에 대하여 보호할 수 있는 항체는 수여 대상체에게 OSM-관련 징후 또는 병상의 감소, 해결 또는 경감을 달성하기에 충분한 양으로 제공되는 것으로 의도된다. 만일 제제의 용량, 투여 경로 등이 그러한 반응에 영향을 주기에 충분하면, 양은 징후의 감소를 "달성하기 위한" 충분한 양 또는 "치료적 유효량"이라고 말한다. 항체 투여에 대한 반응은 영상화 기술에 의해 또는 조직 시료의 생체 외(ex vivo) 분석에 의해서처럼 대상체의 영향받은 조직, 기관 또는 세포의 분석에 의해 측정될 수 있다. 제제는 그 존재가 수여 환자의 생리에서 검출가능한 변화를 야기한다면 생리학적으로 유의미하다.
치료적 응용
본 발명의 OSM-중화 항체, 그의 항원 결합 단편 또는 특정 변이체를 사용하여, OSM 또는 OSM을 발현하는 세포에 의하여 매개되거나 영향을 받거나 조절되는 증상을 진단하거나, 모니터링하거나, 조절하거나, 치료하거나, 경감시키거나, 그의 발생의 예방에 도움이 되거나, 그의 징후를 줄이는 세포, 조직, 기관 또는 동물(포유류 및 인간 포함)에서의 효과를 측정하거나 효과를 야기할 수 있다. 따라서, 본 발명은 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 적어도 하나의 OSM 항체를 사용하여 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서 적어도 하나의 OSM 관련 질환을 조절하거나 치료하기 위한 방법을 제공한다.
OSM은 염증을 포함하는 다양한 병태에서 상향 조절되며, 골 형성, 연골 분해, 콜레스테롤 흡수, 통증 및 염증을 비롯한 다양한 생물학적 역할에 연루되는 것으로 공지되어 있다. 특정 지시사항이 하기에 논의된다.
지시사항
본 발명자들은 OSM이 연골 파괴를 매개하는 것을 입증하고, OSM이 조직 외식편으로부터의 관절-내 기질의 연골세포 분해를 야기하는 것을 보여준다. OSM은 또한 사이토카인, 예컨대 문헌[T. Cawston et al (1998, Arthritis and Rheumatism, 41(10) 1760-1771)]에 나타낸 바와 같이 연골로부터의 콜라겐 분비를 증진시킬 수 있는 TNFα 분비를 증진시키며, 본 명세서에서 M71 결합 도메인으로 예시된 항체가 전신 사이토카인 분비를 차단할 수 있다. 본 발명의 항체, 즉, M55, M64, M69 및 M71에 의해, OSM-특이적 항체의 부재 하에서 관찰되는 수준을 초과하여, 대식세포-연골세포 공동-배양물 시스템에서의 프로테오글리칸 합성을 증가시키는 능력이 입증되었다.
본 발명자들은 본 발명의 중화성 항-OSM 항체의 투여에 의해, 생체 내에서 IL-6, IP-10 및 KC와 같은 OSM 주도의 사이토카인 및 케모카인 분비가 억제될 것을 추가로 입증하였다. IP-10, 즉, 인터페론 감마-유도 단백질 10 kDa 또는 작은-유도성 사이토카인 B10은 인간에서 CXCL10 유전자(C-X-C 모티브 케모카인 10(CXCL10))에 의해 암호화되는 단백질이다. CXCL10은 단핵세포/대식세포, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포에 대한 화학적 유인(chemoattraction) 및 내피 세포에 대한 T 세포 접착의 증진과 같은 몇몇 역할의 원인이 된다. 이제 케모카인(C-X-C 모티브) 리간드 1(CXCL1)로 공지되어 있는 KC는 이전에 GRO1 암유전자, GROα, 호중구-활성화 단백질 3(NAP-3) 및 흑색종 성장 자극 활성, 알파(MSGA-α)로 지칭되었던 CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. 인간에서, 이러한 단백질은 CXCL1 유전자에 의해 암호화된다. CXCL1은 대식세포, 호중구 및 상피 세포에 의해 발현되며, 호중구 화학적 유인 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명에 따르면, 관절 프로테오글리칸 분해 질환, 예컨대 골관절염, 염증성 관절증, 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방용 약제의 제조에서의 M5, M6, M9, M10, M42, M45, M53, M54, M55, M62, M63, M65, M66, M67, M68, M69, M71, 및 M83 군으로부터 선택되는 항체 또는 항체 단편의 용도가 제공된다. 연골로부터의 콜라겐 분비를 방지하거나 감소시키는 약제의 제조에서의 OSM의 길항제의 특정 용도가 존재한다. 본 발명은 추가로, gp130으로의 OSM 결합을 차단하는 이러한 항체를 유효량으로 염증성 관절증 또는 염증성 장애를 앓고 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 염증성 관절증 또는 염증성 장애의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 OSM이 직접적으로, 또는 염증성 사이토카인의 분비를 통해서와 같이 간접적으로 조직 또는 기관에서, 특히 피부, 폐 및 관절에서 발병을 야기하는 전-염증성 과정의 치료를 위한 제제에서 사용될 수 있다. 이러한 병상은 골관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 신경병성 관절증, 반응성 관절염, 회전근개 파열 관절증(rotator cuff tear arthropathy), 류마티스성 열, 라이터 증후군, 진행성 전신 경화증, 원발성 담즙 경화증, 천포창, 유사천포창, 괴사성 맥관염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 다발성 근염, 유육종증, 육아종증, 맥관염, 악성 빈혈, CNS 염증성 장애, 항원-항체 복합체 매개의 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 레이나드 증후군, 사구체신염, 피부근염, 만성 활동성 간염, 셀리악병, AIDS 의 자가면역 합병증, 위축성 위염 및 에디슨병, 내독소혈증 또는 패혈성 쇼크(패혈증) 또는 패혈증 및 다른 유형의 급성 염증 및 만성 염증의 징후 중 하나 이상을 포함한다. 더욱 자세히, 본 발명의 방법으로부터 이익이 될 수 있는 환자는 이. 콜라이(E. coli), 해모필루스 인플루엔자 비(Haemophilus influenza B), 네이세리아 메닌지티데스(Neisseria meningitides), 스타필로콕시(staphylococci) 또는 뉴모콕시(pneumococci)에 의한 감염을 앓고 있는 환자이다. 패혈증의 위험이 있는 환자는 화상, 상처, 신부전 또는 간부전, 외상, 화상, 면역손상(HIV), 조혈 종양, 다발성 골수종, 캐슬만씨병 또는 심장점액종(cardiac myxoma)을 앓고 있는 환자를 포함한다.
OSM과 관련이 있고, 본 발명의 항체를 사용한 치료 또는 예방 요법을 받아들일 수 있는 다른 증상은 섬유성 질환, 예컨대 폐섬유증, 당뇨병성 신장병증, 특발성 폐섬유증, 전신 경화증 및 경변증을 포함한다. 후근절의 뉴런을 수반하는 침해성 통증의 치료 또는 예방에서 본 발명의 항체의 사용을 위한 다른 지시사항이 존재한다.
투여 및 용량
본 발명은 약제학적으로 허용되는 제형 중의 적어도 하나의 OSM-중화 항체를 포함하는 바람직하게는 수성 인산염 완충된 염수 또는 혼합된 염 용액뿐 아니라 보존 용액 및 제형뿐 아니라 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존 제형인 OSM-중화 항체의 안정한 제형을 제공한다. 기타 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함하는 적절한 비히클 및 그들의 제형은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092](특히 pp. 958-989를 참조한다)에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 안정한 또는 보존된 제형 또는 용액 중 어느 하나 중의 OSM-중화 항체는 정맥내(I.V.); 근육내(I.M.); 피하(S.C.); 경피; 폐; 경점막(transmucosal); 이식물, 삼투 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내의 제형의 사용; 또는 당업계에 널리 알려져 있는 바와 같은 당업자에게 인식되는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통하여 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
예를 들어, 부위 특이적 투여는 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단과 같은 신체 구획 또는 공동으로 이루어질 수 있다.
일반적으로, 항체의 전신 용량을 투여한다면, 약 1 ng/㎏ 내지 100 ng/㎏, 100 ng/㎏ 내지 500 ng/㎏, 500 ng/㎏ 내지 1 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏ 내지 500 ㎍/㎏, 500 ㎍/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 50 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 내지 500 ㎎/㎏ (수여자의 체중)의 범위의 항체 용량을 수여자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 더 낮거나 더 높은 용량이 투여될 수 있다. 물론, 본 발명의 길항제의 적합한 용량은 치료할 질환 또는 장애, 투여 경로 및 치료할 개체의 연령 및 체중 및 길항제의 성질과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 임의의 특정 용량에 의해 제한되지 않고, 예를 들어, 비경구 투여를 위하여, 본 발명의 항체(또는 다른 큰 분자)(통상 상기에 지시된 바와 같은 약제학적 조성물의 부분으로 존재) 0.01 내지 20 ㎎/㎏의 1일 용량은 보통의 성인을 치료하는데 적합할 수 있는 것으로 여겨진다.
치료는 단일 용량 스케줄로, 또는 바람직하게는 다중 용량 스케줄로 주어질 수 있으며, 다중 용량 스케줄에서는 치료의 일차 코스는 1 내지 10개의 별도 용량으로 이루어질 수 있으며, 이어서 반응을 유지하고/하거나 강화하는데 필요한 후속 시간 간격에, 예를 들어, 제2 용량을 위해 1 내지 4개월에 다른 용량이 주어지며, 그리고 필요하면, 몇 개월 후 후속 용량(들)이 주어진다. 적합한 치료 스케줄의 예는 (i) 0, 1개월 및 6개월, (ii) 0, 7일 및 1개월, (iii) 0 및 1개월, (iv) 0 및 6개월, 또는 질환 징후를 감소시키거나 질환의 중증도를 감소시킬 것으로 예상되는 바람직한 반응을 유도하는데 충분한 다른 스케줄을 포함한다.
본 발명의 항체는 단독으로 또는 면역억제제, 예컨대 스테로이드(프레드니손 등), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A 또는 퓨린 유사체(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린 등) 또는 항체, 예컨대 항-림프구 항원 항체, 항-백혈구 항원 항체, TNF 길항제, 예를 들어, 항-TNF 항체 또는 TNF 억제제, 예를 들어, 용해성 TNF 수용체, 또는 NSAID 또는 기타 사이토카인 억제제와 같은 제제와 병용하여 사용될 수 있다.
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이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
실시예 1: 시약 및 검정법
OSM-결합 항체를 선택하고 특성화하기 위하여, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OSM의 구축물을 포유류 세포 발현을 위해 생성하였다. 인간 OSM(NM_020530에 의해 암호화되는 NP_065391)은 더욱 완전하게 활성인 성숙 형태 아미노산 1 내지 184로 추가로 처리되는 프로단백질인 227개 아미노산(서열 번호 11)의 전장 분비 단백질로 처리되는 252개 아미노산 전구체이다. 인간 OSM cDNA를 오리진(OriGene)(카달로그 번호 SC121421)으로부터 주문하였으며, 오리진 클론으로부터의 인간 OSM의 ORF를 PCR로 증폭시켰으며, 신호 펩티드(뮤린 IgG1)를 단백질 정제를 위해 6-His 태그 및 위치 지정 단백질 비오티닐화를 위해 AviTag(서열 번호 56)와 함께 도입하였다. 후자는 수용체와 상호작용하는 OSM의 부근에 존재하는 라이신 잔기의 무작위 화학적 비오티닐화를 피하도록 선택하였다.
사이노몰구스 원숭이 OSM을 미국 특허 출원 제12/648430호에 기재된 바와 같이, 슈퍼스크립트(Superscript) III 제1 가닥 합성 시스템(인비트로겐(InVitrogen))을 사용하여 사이노몰구스 원숭이 PBMC의 RNA로부터 클로닝하여, cDNA를 수득한 다음, 인간 OSM 서열로부터 설계된 UTR 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 발현되는 전장 단백질은 서열 번호 12에 나타나 있으며, 절단된 활성 형태는 184개 잔기, 즉 51 내지 227로 나타내어진다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 OSM의 전구체 및 성숙 형태를 HEK 293에서 발현시켰으며, 표준 방법을 사용하여 정제하였다. 이. 콜라이 유래의 상용으로 입수가능한 인간 OSM(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카달로그 번호 295-OM)을 대조군으로 사용하여 A375-S2 세포 증식 및 pSTAT3 신호전달 검정법에서 단백질의 기능적 활성을 시험하였다.
Mab
대조군 항체를 사용하는 경우, CNTO6234로 명명된 인간 IgG1 아이소타입 항체를 사용하였다.
화학적 비오티닐화
재조합 인간 OSM을 사이토카인 상의 아민 잔기를 표적화하는 NHS-에스테르 화학물질(EZ-링크(Link) 설포(Sulfo)-NHS-LC-비오티닐레이션(Biotinylation) 키트, 피어스(Pierce), #21435)을 사용하여 비오티닐화하였다. 비오틴-커플링 반응을 항원 몰당 비오틴 1몰의 표적 표지 효능에 대하여 최적화시켰다. 후자는 결합 및 기능 활성의 소실을 최소화시키면서, 단백질 집단의 거의 완전한 표지를 보장한다. 반응의 완료 시에, 단백질을 EZ-링크 설포-NHS-LC-비오티닐레이션 키트(피어스)에 포함되는 제바 데솔트 스핀 컬럼(Zeba Desalt Spin Column)을 사용하여 유리 비오틴 시약 및 잔류 이탈기로부터 정제하였다. 출발 물질의 대략 80%를 회수하였다. HABA 검정법(피어스 비오틴 정량화 키트, #28005)을 사용하여 비오틴 혼입 수준을 측정하였으며, 이는 인간 OSM의 몰당 대략 1몰의 비오틴을 나타낸다. 옥테트(Octet) 기기(포르테바이오(
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))를 사용하여 비오티닐화된 단백질에 대한 gp130-Fc(알앤디 시스템즈, 카달로그 번호 671-GP) 결합 및 스트렙트아비딘 커플링 둘 모두를 입증하였다. 옥테트 측정에 의해, 비오티닐화된 인간 OSM이 미표지 출발 물질의 것과 본질적으로 동일한 프로파일로 gp130에 결합하는 것이 나타났다.
시험관 내 표적화된 비오티닐화
15개 잔기의 AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE)(서열 번호 56)는 내인성 BirA 기질 BCCP(문헌[Beckett et. al. 1999, Protein Science])와 유사한 비오틴-수용체 반응속도론을 갖는다. 하나의 수용체 라이신 잔기를 갖는 AviTag가 대상 단백질에 계류되는 경우, 오직 하나의 위치에서 비오티닐화될 것이다. 재조합 사이노몰구스 원숭이 OSM을 아비디티(Avidity)로부터 상용으로 입수가능한 비오틴-단백질 리가제(ligase) 및 시약을 사용하여 시험관 내에서 위치 특이적으로 비오티닐화시켰다. 비오티닐화 사이노몰구스 원숭이 OSM을 1가의 스트렙트아비딘 친화성 수지를 사용하여 정제하였다. 생성된 단백질의 양을 SDS-PAGE 및 SEC-HPLC로 평가하였다. HABA 검정법(피어스 비오틴 정량화 키트, #28005)을 사용하여 비오틴 혼입 수준을 측정하였으며, 이는 사이노몰구스 원숭이 OSM의 몰당 대략 1몰의 비오틴을 나타낸다. 옥테트 기기(포르테바이오)를 사용하여 비오티닐화 단백질에 대한 gp130-Fc 키메라 결합 및 스트렙트아비딘 커플링 둘 모두를 입증하였다. 옥테트 측정에 의해, 비오티닐화 사이노몰구스 원숭이 OSM이 미표지 출발 물질의 것과 본질적으로 동일한 프로파일로 gp130에 결합하는 것이 나타났다.
고체상 면역검정법
초기 파지-Fab 패닝은 TMS 중의 2 ㎍/㎖ 비오티닐화 인간 OSM 또는 사이노몰구스 원숭이 OSM으로 코팅된 뉴트라비딘(NEUTRAVIDIN)(상표명) ELISA 플레이트(피어스)를 사용하였다. 4℃에서의 하룻밤 인큐베이션, 블로킹(blocking) 및 세정 후에, 각 회차의 패닝으로부터의 폴리클로널 파지 푸울의 1:100 희석액을 첨가하였다. 결합 파지를 pVIII, 즉, M13 파지 주요 코트 단백질(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 카달로그 번호 27-9421-01)에 특이적인 HRP-컨쥬게이트된 모노클로널로 검출하고, 화학발광 기질 POD(로슈(Roche), 카달로그 번호 11582950001)의 첨가 및 퍼킨엘머(PerkinElmer) 기기에서의 판독으로 이어졌다.
이. 콜라이 상층액으로부터의 분비된 용해성 Fab-His 단백질을 사용하여 개별 클론의 일차 스크리닝을 수행하였다. 용해성 Fab-His 단백질을 함유하는 박테리아 상층액을 사용하여 ELISA 형식으로 결합을 수행하였다. 블랙 맥시소르프(Black MaxiSorp) 플레이트(넌크(Nunc), 카달로그 번호 437111)를 1 ㎍/㎖ 양(sheep) 항-인간 Fd (CH1) 항체(더 바인딩 사이트(The Binding Site), 카달로그 번호 PC075)로 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세정하고 블로킹한 후에, 50 ㎕의 희석되지 않은 박테리아 상층액(Fab-His 단백질 함유)을 첨가하고, 온건하게 쉐이킹하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되게 하였다. 플레이트를 세정하고, 비오티닐화 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 OSM 20 nM을 포획된 Fab에 첨가하였다. 실온에서 1시간 후에, SA-HRP(인비트로겐, 카달로그 번호 43-4323)를 첨가하고 화학발광 검출을 상술된 바와 같이 수행하였다. 20 nM의 농도의 인간 OSM을 사용한 일차 결합 ELISA 스크리닝에 의해, 나노몰 친화성 범위의 친화성으로 클론의 검출이 가능하게 될 것으로 계산되었다.
에피토프 비닝( Binning )
에피토프 비닝은 인간 IgG1 전환된 mAb 및 상용의 항체, 즉, OSMRβ/LIFRα 동원-차단제(R-차단제)로 공지되어 있는 MAB29를 사용하여 수행한 결합 특징에 기초하여 MAb를 분류하기 위하여 수행한 경쟁 검정법이다.
384-웰 멀티-어레이(multi-array) 플레이트(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery(MSD), L25XA-4))의 각 웰에, 인산염 완충된 염수(PBS) pH7.4(시그마(Sigma), P3813) 중의 2.5 ㎍/㎖ 항-인간 Fc(문헌[Jackson Immuno, 709-005-149])를 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 50㎕의 MSD 블로커 A로 블로킹하였다. 384 멀티-어레이 플레이트를 3회(PBS pH7.4, 0.05% Tween 20(사이텍(Scytek), PBT010)) 세정하고, 각 웰에, 1.0 ㎍/㎖의 시험 mAb 용액을 첨가하고, 이어서, 실온에서 1시간 동안 타이터 플레이트 쉐이커(titer plate shaker) 상에서 레벨 6으로 쉐이킹하였다. 플레이트를 이전과 같이 3회 세정하였다.
병행하여, 5 ㎍/㎖의 경쟁 mAb 용액 및 1 ㎍/㎖의 비오티닐화 OSM(알앤디 시스템즈, 295-OM-010/CF)을 개별 96-웰 플레이트(코스타(COSTAR), 3357)에서, MSD 검정 완충액(1:3의 블록 완충액과 PBS pH7.4, 0.05% Tween 20) 중에 합하고, 실온에서 1시간 동안 타이터 플레이트 쉐이커 상에서 레벨 3으로 쉐이킹하였다. 경쟁 항체 및 비오티닐화 OSM의 사전-복합체를 384 멀티-어레이 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 쉐이킹하였다(타이터 플레이트 쉐이커 상에서 레벨 6). 플레이트를 3회 세정하고, 각 웰에 스트렙트아비딘 설포 TAG(MSD, R32Ad-S)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 쉐이킹하였다(타이터 플레이트 쉐이커 상에서 레벨 6). 플레이트를 3회 세정하고, 각 웰에, 증류수로 1:4 희석한 판독 완충액 T(MSD, R92TC-1)를 첨가하였다. 플레이트를 MSD S6000 기기 상에서 판독하였다.
데이터를 경쟁적 mAb가 존재하지 않는(최대 신호) 비오티닐화 OSM의 존재 하에서 시험 mAb에 대하여 달성되는 신호와 함께, 자기 경쟁으로부터의 신호(최대 신호의 2 내지 4배 감소)에 기초하여 해석하였다. 경쟁적 mAb의 존재 하의 값이 자기 경쟁으로부터의 것의 값의 3 표준 편차 이내인 경우 에피토프 경쟁을 지정하였다.
A375 세포
A375 세포(ATCC; CRL-1619)는 악성 흑색종 유래의 인간 상피 세포이다. A375-S2 세포(ATCC; CRL-1872, IL-1에 민감성인 CRL-1619의 하위 세포주)를 T-175 배양 플라스크(코닝(Corning); 카달로그 번호 431080) 내에서 10% FBS(집코(Gibco))가 보충된 완전 성장 배지(DMEM/글루타맥스(GlutaMax)-I, 집코)에서 배양하고, 3 내지 4일마다 대략 80% 컨플루언트(confluent)에 이르면, 1:20의 계대배양 비로 계대배양하였다.
A375- S2 세포 증식( BrdU -혼입) 검정법
인간 또는 사이노몰구스 원숭이 OSM에 의한 A375-S2 세포 증식의 감소를 화학발광 ELISA를 사용하여 BrdU-혼입에 의해 측정하였다. 온코스타틴 M은 A375-S2 인간 흑색종 세포주에서의 증식을 감소시킨다(문헌[Zarling et al. PNAS 83:9739-9743]). 이러한 세포주를 사용하여 모든 항체 발견 단계에서 항-온코스타틴 M 항체를 평가하였다 A375-S2 세포를 95% O2 - 5% CO2에서 37℃에서 T-150 조직 배양 플라스크(비디 팔콘(BD Falcon) 35-5001)에서, DMEM(집코 11995) + 10% FBS(집코 16140) + 1% 페니실린/스트렙토마이신(집코 15140) 중에 유지시키고, 주마다 1:10으로 분할하였다.
증식 검정법을 수행하기 위하여, 세포를 트립신처리하여(0.25%, 집코 25200) 그들을 T150 플라스크로부터 제거한 다음, 200 ㎕의 DMEM/FBS/페니실린-스트렙토마이신 중에 블랙 TC-코팅된 플레이트(비디 팔콘 353948)의 내부 48웰에 2000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 37℃/95% O2 - 5% CO2에서의 하룻밤 인큐베이션 후에, 배지를 제거하고, 180 ㎕의 신선한 배지로 교체하였다. 10X 최종 농도로 모든 시험 용액을 함유하는 개별 플레이트를 준비하였다. 이러한 플레이트로부터, 20 ㎕를 세포 플레이트 내의 해당하는 웰로 옮겨, 적절한 실험 조건을 생성하였다. 각 실험 조건을 3벌로 시험하였다. 중화를 평가하는 임의의 실험에서, 항체 및 온코스타틴 M을 세포에 첨가하여 적어도 1시간 동안 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 37℃/95% O2 - 5% CO2에서 추가 72시간 동안 인큐베이션시켰다. 이 때, 화학발광 BrdU 세포 증식 ELISA(로슈(Roche) 11669915001)를 수행하였다. BrdU 표지 시약을 4시간 동안 배양물에 첨가하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 100 ㎕의 고정 용액을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 30분 후에, 용액을 제거하고, 100 ㎕/웰의 항-BrdU-POD 용액을 첨가하였다. 실온에서 2시간 후에, 플레이트를 PBS-Tween으로 세정하고, 100 ㎕의 슈퍼 시그널 피코(Super Signal Pico)(써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 37069)를 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 발광을 퍼킨 엘머 빅터(Victor)3 기기를 사용하여 판독하였다.
초기 실험을 행하여, 증식의 억제에서의 사내에서 생성한 CHO 세포-유래의 재조합 인간 및 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M의 용량 반응을 결정하였다. Osm을 100 ng/㎖의 출발 농도로부터, 0.0244 ng/㎖의 최종 농도로의 1 대 5 희석을 사용하여 시험하였다. 증식 억제 백분율을 비히클 대조군으로 시험한 세포에 비하여 계산하였다. 이러한 실험의 결과는 도 2a에 나타나 있다. 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M의 농도가 증가함에 따라, 상응하는 BrdU 혼입의 감소가 존재한다. 항증식 활성의 정도 및 효과의 EC50 둘 모두에 기초한 인간 및 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M의 항증식 활성은 분명하지 않다.
이들 실험에 기초하여, 2ng/㎖의 온코스타틴 M의 농도를 사용하여, 항-온코스타틴 M 항체를 평가하고 비교하였는데, 이는 이러한 농도가 증식을 대략 80% 억제하여, 항체 용량 반응을 결정하기 위한 큰 창(window)을 제공하기 때문이다. 전체 용량-범위의 항체를 2 ng/㎖의 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M의 존재 하에 평가하였다. 또한, 아이소타입 대조군을 사용되는 가장 높은 항-온코스타틴 M 항체의 농도에서 실험에 포함시켰다. 검정법 창을 미처리 대조군 웰(최대 증식)과 단독의 2ng/㎖ 온코스타틴 M과 함께 인큐베이션시킨 웰(최소 증식) 간의 차이에 의해 정의하였으며, 임의의 항체 농도에서의 중화 백분율을 이러한 창 내에서 정의하였다.
A375- S2 포스포 - STAT3 검정법을 사용한 pSTAT3 신호전달
OSM은 세포 표면 수용체 gp130에 결합하고, OSMRβ와의 수용체 이종이량체화를 유도하여, 신호전달 분자 STAT3의 활성화(인산화)를 포함하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시함으로써 A375-S2 세포의 성장을 억제한다(문헌[Kortylewski et al., Oncogene 18: 3742-3753, 1999]). STAT3 신호전달의 파괴에 의해, A375-S2 세포의 OSM 성장 억제가 없어졌으며, 이는 STAT3 활성화가 OSM 신호전달의 주요 단계임을 입증한다(문헌[Heinrich et al., Biochem. J. 374: 1-20, 2003]). A375-S2 세포에서의 STAT3 인산화는 OSM 농도 의존적인 것으로 보이며, 자극된 세포에서 이를 측정하기 위한 상용의 키트가 입수가능하다. A375-S2 세포에서의 OSM-유도된 STAT3 인산화의 중화를 Mab 후보물질에 대한 일차 스크리닝 검정법으로 선택하였다.
OSM-유도된 STAT3 인산화의 항체 중화를 위하여, A375-S2 세포를 완전 성장 배지 중의 200㎕ 중에 25,000개 세포/웰로 96-웰 조직 배양 플레이트(코닝; 카달로그 번호 3596)에 씨딩하고 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 세포를 5 ng/㎖ 인간 OSM(재조합, 포유류-세포 유래, OSMN1-1)을 함유하는 용액으로 처리하고, 10 ㎍/㎖에서 시작하는 1:5 연속 희석된 실험 mAb와 함께 실온에서 3시간 동안 사전-인큐베이션시킨다. 대조군은 미처리 세포, 자극된 세포(단독의 5 ng/㎖ OSM) 및 hIgG1 아이소타입 대조군 mAb를 포함한다. 모든 처리는 달리 나타내지 않는 한, 3벌로 수행한다.
pSTAT3 함유량의 분석을 제조처의 프로토콜에 따라 포스포-STAT3 전세포 용해물 키트(MSD; 카달로그 번호 K150DID-1, 롯트(Lot) 번호 K0010570)를 사용하여 수행한다. 약술하면, 세포를 10분 동안 200 ㎕/웰 부피로 처리하고; 처리 용액을 제거하고, 50㎕의 세포 MSD 용해 완충액을 멀티채널 피펫(multichannel pipette)을 통해 첨가한다. 플레이트를 5분 동안 오비탈 쉐이커(orbital shaker)(300 RPM에서)에 둔다. 이후에, 각 용해물 30 ㎕를 MSD 포스포-STAT3 96-웰 플레이트로 옮긴다. 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커(300 RPM에서)에 두고, 150 ㎕의 MSD 세정 완충액으로 3회 세정하고, 25㎕의 2차 검출 항체 컨쥬게이트(항-pSTAT3-Ru(bpy)32+)를 각 웰에 첨가하고, 다시 밀봉하고, 실온에서 1시간 동안 오비탈 쉐이커(300 RPM에서)에서 인큐베이션시킨다. 플레이트를 이전과 같이 세정하고, 150㎕의 MSD 판독 완충액(트라이프로필아민 용액)을 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 MSD SECTOR 이미저(Imager) 6000 기기 상에서 판독한다.
인라인의 성숙 mAb, 모 mAb 및 대조군 mAb에 대한 전체 EC50 용량-반응 곡선을 수득하고, 정규화된 pSTAT3 신호 백분율로서 플롯팅하였다.
표면 플라스몬 공명( 비아코어 ( Biacore ))에 의한 친화성 측정
결합 친화성을 기재된 바와 같은 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 OSM 구축물을 사용하여 비아코어 3000 광학 바이오센서(비아코어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 측정하였다. 항-마우스(잭슨(Jackson), 카달로그 번호 315-005-046) 및 항-인간(잭슨, 카달로그 번호 109-005-098)의 항-IgG Fc 항체 혼합물을 아민-커플링 화학에 대한 제조처의 지시를 사용하여 CM-5 칩(비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-14)의 카르복시메틸화 덱스트란 표면에 커플링시킴으로써 바이오센서 표면을 준비하였다. 대략 19,000 RU(반응 유닛)의 항-OSM 항체를 4개의 유동 셀 각각에 고정시켰다. 동역학 실험을 25℃에서 런닝 완충액(DPBS + 0.005% P20 + 3mM EDTA)에서 수행하였다. 100nM로부터 0.412nM로의 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OSM ECD의 연속 희석물을 런닝 완충액에서 제조하였다. 약 200 RU의 mAb를 센서 칩의 유동 셀 2 내지 4 상에서 포획하였다. 유동 셀 1을 참조 표면으로 사용하였다. mAb의 포획 후에, 50 ㎕/분에서 항원의 3분 주입(회합 상태)에 이어서 10분의 완충액 유동(해리 상태)으로 이어졌다. 칩 표면을 50 ㎕/분으로 100 mM H3PO4(시그마, 카달로그 번호 7961)의 18초 주입의 2회 펄스(pulse)에 의해 재생시켰다.
수집된 데이터를 BIAevaluation 소프트웨어(비아코어, 버전 3.2)를 사용하여 처리하였다. 먼저, 피분석물 주입에 대한 참조물질-감산된 곡선으로부터 완충액 주입에 의해 생성된 곡선을 감산함으로써, 데이터의 이중 참조 감산을 수행하였다. 전체적인 적합도(fit)를 갖는 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터의 동력학적 분석을 수행하였다. 각각의 mAb에 대한 결과를 Ka(온-속도), Kd(오프-속도) 및 KD(친화성 상수)의 형식으로 기록하였다.
실시예 2: OSM 결합 FAB 의 선택
새로운 Fab-pIX 라이브러리는 문헌[Shi et al. J Mol Biol 397:385-396, 2010]; WO09085462A1호; 미국 특허 출원 제12/546850호에 기재되며; 본 명세서에서 상기에서, 사용되는 중쇄 인간 생식계열 프레임워크를 참조하여, 169, 323 및 551로 명명된다: IMGT 명명법으로, IGHV1-69(서열 번호 1), IGHV3-23(서열 번호 2) 또는 IGHV5-51(서열 번호 3). 3가지 중쇄 라이브러리 프레임워크를 하기의 4가지 경쇄 라이브러리 VL카파 프레임워크와 조합한다: A27(IGKV3-20*01(서열 번호 5)), B3(IGKV4-1*01(서열 번호 6)), L6(IGKV3-11*01(서열 번호 7)) 및 O12(IGKV1-39*01(서열 번호 8)). 라이브러리에서, Fab V-영역은 중쇄에서 서열 번호 4 및 경쇄에서 서열 번호 10을 포함하는 J-영역(FR4)의 첨가에 의해 완성된다. 중쇄 CDR3은 7 내지 14개 잔기의 가변적인 길이의 것이다. 각 라이브러리에 대한 완전 V-영역의 예는 도 1에 나타나 있고, 카바트에 따라 넘버링되고 CDR 영역이 나타나 있다.
항-OSM 파지 디스플레이 힛트(hit)의 초기 세트를 상업적으로 입수가능한 비글리코실화 인간 OSM을 사용하여 동정하였다. Fab-pIX 파지 디스플레이 라이브러리를 파지 선택을 위해 공개된 프로토콜(문헌[Marks and Bradbury, Antibody Engineering, Vol. 248: 161-176, Humana Press, 2004])에 따라 상자성 스트렙트아비딘(SA) 비드(인비트로겐, 카달로그 번호 112.05D) 상의 비오티닐화 인간 OSM(알앤디 시스템즈, 카달로그 번호 295-OM) 포획을 사용하여 패닝시켰다. 약술하면, 비오티닐화 인간 OSM을 비컨쥬게이트된 비드 상에 사전 흡수시킨 파지 라이브러리에 100 nM의 최종 농도로 첨가하고, 온건하게 회전시키면서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 블로킹된 SA 비드를 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션시켜, 결합 파지와 함께 비오티닐화 OSM을 포획하였다. 상자성-포획된 파지/항원/비드 복합체를 1 ㎖의 TBST로 5회, 그리고 1 ㎖ TBS로 1회 세정하였다. 최종 TBS 세정액의 제거 후에, 1 ㎖의 지수적으로 성장하는 TG1 세포(스트라타진, 카달로그 번호 200123)를 첨가하고, 쉐이킹하지 않고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 감염된 박테리아를 LB/아가(Agar)(1% 글루코스/100 ㎍/㎖ 카르베니실린) 플레이트(테크노바(Teknova), 카달로그 번호 L5804) 상에 스프레딩하고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 박테리아 론(lawn)을 긁어내고, 글리세롤 스톡(stock)을 제조하고[15% 글리세롤/카르베니실린(100 ㎍/㎖)/2xYT], -80℃에서 보관하였다. 2차 패닝을 위한 파지를 제조하기 위하여, 25 ㎖의 2xYT/카르베니실린(100 ㎍/㎖)에 25 ㎕의 박테리아 글리세롤 스톡을 접종시키고, 대략 0.5의 OD600까지 37℃에서 성장시켰다. 헬퍼(Helper) 파지 VCSM13(스트라타진, 카달로그 번호 200251)을 대략 10:1의 감염 다중도로 배양물에 첨가하고, 인큐베이션을 쉐이킹 없이 37℃에서 30분 동안 수행하였다. 박테리아를 스핀 다운하고, 펠렛을 유도 배지(2xYT/Carb/Kan/IPTG)에 재현탁화시키고, 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. 파지를 2% PEG/0.25M NaCl(최종 농도)을 사용하여 침전시키고, 2 ㎖의 PBS에 재현탁화시켰다. 1차 파지를 4℃에서 보관하고, 이를 사용하여 2차 패닝을 수행하였다. 패닝 파라미터는 다음과 같았다: 1차, 100 nM 항원, 실온에서 1시간 인큐베이션, TBST를 사용한 5회 세정에 이은 TBS를 사용한 1회 세정; 2차, 10 nM 항원, 실온에서 1시간 인큐베이션, TBST를 사용한 10회 세정/TBS를 사용한 1회 세정; 및 3차, 1 nM 항원, 4℃에서 16시간(하룻밤) 인큐베이션, TBST를 사용한 10회 세정/TBS를 사용한 1회 세정.
Fab를 항-인간 Fd (CH1) 항체로 포획하고, 비오티닐화 인간 OSM을 20 nM로 첨가하고, 결합 OSM을 SA-HRP로 검출하는 ELISA를 사용하여 성과를 모니터링하였다.
디스플레이된 Fab로서 삼십(30)개의 독특한 중쇄-경쇄의 쌍형성을 동정하였으며, 이는 ELISA에 의해 사이노몰구스 원숭이 OSM과 교차 반응하는 것으로 나타났다. 중쇄는 169(IGHV1-69 유래) 및 551(IGHV5-51 유래) 라이브러리로부터의 서열을 나타내며, 경쇄 가변 영역과 조합하여, 모두 4개의 라이브러리 생식계열 기원(A27, B3, L6 및 O12)을 나타냈다.
실시예 3: osm 결합 MAB 의 특성화
4-나선 번들 구조 OSM은 상대적으로 비구조화된 루프로 결합된 A, B, C 및 D로 명명된 4가지 α 나선 세그먼트를 특징으로 한다. OSM은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 Q16, Q20, G120, N123, N124에 의한 접점을 포함하는 것으로 결정된 나선 A 및 C(부위 II)에 위치한 표면을 통하여 gp130과 상호작용한다(문헌[Deller et al. Structure 8(8): 863-874, 2000; Liu et al. Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009]). OSMRβ 및 LIFRα(부위 III)와의 OSM 상호작용의 원인이 되는 표면은 대부분 나선 D에 위치한 잔기에 의해 한정되는 것으로 여겨진다(문헌[Deller et al. ibid]).
gp130에 대한 OSM 결합의 방지(부위 II 또는 B-차단제) 또는 LIFRa 또는 OSMRb의 OSM 결합 gp130 동원의 방지(부위 III 또는 R-차단제) 중 어느 하나를 통하여 OSM 주도의 gp130 신호전달을 방지할 수 있는 OSM에 대한 고 친화성 결합제를 선택하는 것이 목적이었다.
30개의 초기에 선택된 OSM-결합 Fab 중에, 29개를 전장 인간 IgG1 Mab로의 전환을 위하여 벡터 내로 클로닝하였다. 특성화 검정법은
(1) 에피토프 그룹 또는 "빈(bin)"을 동정하기 위한 경쟁적 결합, (2) 표면 플라스몬 공명(비아코어)에 의한 친화성 측정, 및 (3) pSTAT3 신호전달의 차단능이었다. 모든 스크린 및 검정법을 실시예 1에 기재된 바와 같은 포유류 세포 생성된(글리코실화된) 인간 및 사이노몰구스 원숭이 단백질을 사용하여 수행하였다.
결과
pSTAT3 및 ELISA 결합 검정법에서 대조군 MAB295(알앤디 시스템즈)에 비한 그들의 순위에 기초하여 선택된 mAb의 서브셋에 대한 친화성 측정 데이터를 표 3에 나타내었다.
Figure 112013040373230-pct00010
Figure 112013040373230-pct00011
비닝 검정법의 결과에 의해, M5, M6 및 M9가 서로 경쟁하나 MAB295와 경쟁하지 않는 것이 나타났다. M10은 MAB295와 경쟁하였다. 또한, 이들 4개의 mAb는 pSTAT3 검정법에 의해, gp130 신호전달의 기능성 중화제인 것으로 나타났다. 따라서, M10은 R-차단제가 되고, M5, M6 및 M9은 gp130에 대한 OSM 결합을 차단하게 된다(B-차단제).
치료적 선도물질(therapeutic lead)에 대한 표적 친화성은 친화성(KD)이 대략 1 nM인 것으로 측정된 OSM-gp130 상호작용과 결정적으로 경쟁하고자 함에 의해 좌우된다. 따라서, 100 pM 이하의 KD의 OSM에 대한 표적 친화성이 바람직하였다.
OSM-gp130 상호작용 차단제인 것으로 관찰된 중화 MAb M5, M6 및 M9 + M10을 인라인 성숙을 위해 선택하여, 치료 후보물질에 대한 100 pM 친화성 요건을 만족시키는 유도체를 생성하였다. mAb가 인간 OSM에 대한 친화성(500 pM 이하의 KD)의 5배 이내의 친화성으로 사이노몰구스 원숭이 OSM과 결합하는 것은 추가의 원하는 특성이었다.
이들 4개의 Mab에 대한 결합 도메인의 조성은 표 4에 나타낸 바와 같이 명명된 4개의 독특한 중쇄 및 경쇄 쌍을 나타내는 것으로 관찰되었다.
Figure 112013040373230-pct00012
완전한 가변 영역 서열은 본 명세서에서 상기에 기재된 바와 같은 파지 라이브러리를 생성하는데 사용되는 생식계열 서열을 포함하며, 이에 따라, 고정된 잔기는 돌연변이되지 않은 모 생식계열 잔기와 매치된다. 이와 같이, 각 V-영역은 서열 번호 1 내지 3 또는 5 내지 8로 지정된 스캐폴드(scaffold) 내의 지정된 CDR1 및 CDR2에 이어서; CDR3(표 3 및 4)에 이어서, 각각 경쇄 가변 영역에 대하여(LC에 대해서는 표 5 및 HC에 대해서는 표 6), 중쇄에 대해서는 서열 번호 4 및 경쇄에 대해서는 서열 번호 10으로서의 J-영역으로 구성된다.
Figure 112013040373230-pct00013
HC 가변 영역 H2는 서열 번호 1 유래의 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하며, 여기서, X1은 A이고, X2는 G이며, X3은 I이고, X4는 P이며, X5는 I이고, X6은 F이며, H-CDR2 내의 추가의 돌연변이가 있다. 라이브러리 551로부터의 HC(H14, H17 및 H135)는 서열 번호 3 유래의 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 포함하며, 여기서, X1은 S이고, X2는 S 또는 G이며, X3은 I이고, X4는 Y이며, X5는 G이고, X6은 Y 또는 D이다. 각 4개의 HC는 독특한 CDR3(서열 번호 19-22)으로 구성된다.
Figure 112013040373230-pct00014
선택된 Fab의 LC 가변 영역은 모두 B3 라이브러리로부터 유래되며, 본 명세서에, 그리고 참조된 공개문헌에 기재된 바와 같은 라이브러리 다양성에 대한 출발 서열로 사용되었던 IGKV4-1 (B3)과 같은 IMGT 데이터베이스에 나타낸 큐레이트된(curated) 생식계열 서열을 포함한다. 4개의 경쇄 중 3개는 CDR1에서 차이를 가지며, 동일한 H-CDR2를 갖는다. 서열 번호 8 유래의 4개의 선택된 LC 가변 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3에 대한 컨센서스 서열에서, X1은 Y, S 또는 A이고; X2는 K, E 또는 N이며; X3은 Y, W 또는 F이고; X4는 항상 W이다.
2개의 독특한 CDR3 서열을 동정하였다. L-CDR3은 식 Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT로 나타낸 컨센서스 서열(서열 번호 29)로 나타낼 수 있다.
실시예 4. 친화성 재선택
실시예 3에 기재된 4개의 V-영역 쌍형성, OSMM5, OSMM6, OSMM9 및 OSMM10을 경쇄 재선택을 위해 선택하여, 친화성을 향상시켰다. 효율적이며 신속한 방식으로 일차 선택으로부터 다수의 항체를 친화성 성숙시키기 위하여, 문헌[Shi et al. J Mol Biol 397:385-396, 2010] 및 WO09085462A1호 및 미국 출원 제12/546850호에 기재된 "인-라인" 성숙 과정을 사용하였다. 약술하면, 초기 선택 회차에서 수득된 항원-특이적 클론의 VH 영역을 해당하는 VL 스캐폴드의 라이브러리, 이 경우에는 B3 기반의 V-영역(서열 번호 8)과 조합하였다.
신규한 3개의 라이브러리를 생성하였으며, 하나는 다양한 VL 사슬의 공급원으로서 초기 선택에서 사용되는 VL 라이브러리를 사용한 것이고, 2개의 추가의 라이브러리는 공지되어 있는 구조의 항원-항체 복합체의 최근의 분석에 기초하여 설계한 것이다(문헌[Raghuanthan et al., J. Mol. Recognit, 2010]). 특이성 결정 잔기 사용(SDRU)으로도 지칭되는 표적 단백질의 결합에 수반될 가능성이 큰 잔기에 기초하여 다양화를 위하여 잔기를 선택하였다. V카파 경쇄에서, 3개의 접점 영역이 초티아 및 레스크에 의해 정의된 바와 같은 초가변 루프 주위에 집중되고, 이는 표적이 단백질인지, 펩티드인지, 작은 합텐인지의 여부에 따라 약간 상이한 것으로 결정되었다. 표 5는 친화성 성숙을 위해 사용되는 VL 라이브러리를 보여주며, 여기서, B3은 발견 단계 동안 사용되는 것과 동일한 라이브러리이고, 라이브러리 2 "SDRM focused"는 SDRU 잔기에 기초하고 다양성에 집중되며, NNK는 무작위화 라이브러리이다. 표에서, "X"는 NNK 믹스에 의해 생성된 임의의 아미노산 + 하나의 정지 코돈을 의미한다.
표 7은 라이브러리 1, 2 및 3의 다양성을 요약한 것이다. 최종 라이브러리의 분석 동안, 원래 설계의 부분이 아니며 이에 따라 합성 방법의 결과로 도입된 몇몇 아미노산이 동정되었다. 다이뉴클레오티드를 사용하여 합성된 라이브러리 2에 대하여, 이들 아미노산은 하기와 같았다: S(위치 30c), T(위치 30d), EK(위치 30f), IW(위치 32), TV(위치 50), I(위치 92), D(위치 93) 및 F(위치 96).
Figure 112013040373230-pct00015
Fab-His 단백질을 3차 패닝 아웃풋(output)으로부터 제조하고, 모노클로널 Fab-His ELISA를 사용하여 상응하는 모 Fab보다 결합 신호가 더 높은 개별 힛트를 동정하였다. 하기의 2가지 농도의 비오티닐화 인간 항원을 이들 랭킹 ELISA에서 사용하였다: 2 nM 및 0.2 nM. 각 모 클론에 대한 결합 신호를 100%로 설정하였다. 원래의 중쇄 및 경쇄 V-영역을 포함하는 모 Fab에 비하여 최대 9배(900%) 향상된 결합을 보이는 M6 및 M9의 친화성 성숙으로부터 22개의 힛트가 존재하였다. 중쇄 및 경쇄의 이들 신규한 쌍형성의 일부는 추가의 평가를 위해 선택하였다.
MAB295 대조군 및 모 mAb M6 및 M9의 친화성에 비한 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OSM에 대한 인라인 성숙된 mAb의 친화성(KD)을 표 8에 요약하였으며, 이들 mAb의 CDR 조성을 표 9에 나타내었다. 일부 경우에, LCV는 H14 및 H17 둘 모두와 쌍을 형성하였다. mAb의 생물물리학적 특성 및 기능적 효력에 기초하여, 후보 치료 선도물질로 지정된 소정의 mAb를 회색으로 강조표시하였다.
Figure 112013040373230-pct00016
Figure 112013040373230-pct00017
선택된 후보물질에서 LC-CDR3 다양성 Q-Q-(S,Y)-(F,Y)-S-(F,T)-PLT(서열 번호 29)이 감소되었으며, 다시 선택된 고친화성 LC-CDR3에 대한 컨센서스 서열을 QQY-(F,Y)-STP-(L,I)-T(서열 번호 47)로 나타내었다.
다시 선택된 mAb에 대하여, H14 및 H17의 VH는 서열 번호 48로 제공되며, 서열 번호 14(CDR1) 및 서열 번호 17(CDR2)을 포함하는 공통 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3을 공유한다.
인간 및 사이노몰구스 원숭이 A375- S2 세포 증식을 감소시키는 능력
인-라인 성숙 항체를 평가하기 위하여, 5 ㎍/㎖ 또는 1 ㎍/㎖로 시작하고, 각각 0.0016 또는 0.00032 ㎍/㎖로 1 대 5 희석을 사용하여 용량-반응을 행하였다. M71에 의한 중화는 도 2b에 나타나 있다. 항체의 농도가 증가함에 따라, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M 둘 모두의 항증식 효과는 중화된다. 용량-반응 곡선을 인간(흰색 기호) 및 사이노몰구스 원숭이(검정색 기호) 온코스타틴 M을 사용한 3개의 개별 실험으로부터의 데이터를 사용하여 계산하였다. 표 10은 인간 및 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M에 대한 M55, M64, M69 및 M71의 IC50(95% 신뢰 구간과 함께)을 요약한 것이다.
Figure 112013040373230-pct00018
인간 gp130 경쟁
실시예 1에 기재된 바와 같은 비아코어 3000 광학 바이오센서(비아코어)와 함께 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여, 인라인 성숙을 위해 선택된 항-OSM mAb + 상기 표로부터 선택된 신규한 결합제와 인간 gp130 간의 경쟁 실험을 수행하였다.
각 시험 mAb를 제조처의 지시에 따라 CM-5 칩(비아코어, 카달로그 번호 BR-1000-14)의 카르복시메틸화 덱스트란 표면에 커플링시킴으로써 바이오센서 표면을 준비하였다. 대략 4,000-15,000 RU(반응 유닛)의 각 시험 mAb를 기기의 4개의 유동 셀에 고정화시켰다. 경쟁 실험을 25℃에서 런닝 완충액(DPBS+0.005% P20 + 3 mM EDTA)에서 수행하였다. 인간 OSM(사내, OSMN1-1)을 런닝 완충액에서 30 nM로 희석하고, 고정화된 mAb가 있는 각 유동 셀에 대하여 3분 동안 3 ㎕/분으로 주입하였다. 인간 OSM 포획 후에, 300 nM의 경쟁 mAb 또는 인간 gp130-Fc 중 어느 하나의 3분 주입(회합 상태)에 이어서 3분 동안의 완충액 유동(해리 상태)이 존재하였다. 칩 표면을 50 ㎕/분으로 100 mM H3PO4(시그마, 카달로그 번호 7961)의 2회의 12초 펄스에 의해 재생시켰다. 수집된 데이터를 BIAevaluation 소프트웨어 버전 3.2(바이아코어)를 사용하여 처리하였다. 먼저, 센서그램(sensorgram)을 인간 OSM의 주입에 따라 정렬하였다. 이어서, 인간 OSM, 경쟁적 mAb 또는 gp130-Fc에 대한 결합 수준(RU)을 기록하였다. 경쟁 mAb 또는 gp130-Fc를 OSM 표면에 주입하는 경우 결합(RU)의 증가는 고정화된 시험 mAb와의 경쟁이 존재하지 않고, 그 반대도 그러함을 나타낸다. 유동-셀(Fc1 등) 고정화된 mAb는 표 10의 가로줄의 시료를 따라 나타내었다.
M2는 OSM에 결합하는 gp130과 경쟁하지 않는 것으로 공지되어 있는 상용의 항체 MAB295와 경쟁하는 것으로 이전에 나타났다. 경쟁 결합 검정법의 결과에 의해, M54, M55, M64, M69 및 M71이 OSM 항원에 대하여 인간 gp130-Fc와 경쟁하는 것으로 나타났다(표 11).
Figure 112013040373230-pct00019
A375 세포에서 pSTAT3 를 차단하는 능력
M6 및 M9, 및 이들 Mab의 인-라인 성숙 변이체를 위한, 5 ng/㎖ hOSM의 존재 또는 부재 하에서 A375 세포에서 수행한 pSTAT3 억제에 대하여 계산한 EC50 값은 표 12에 나타나 있다.
Figure 112013040373230-pct00020
실시예 5. 생물학적 활성
대식세포-연골세포 공동-배양물 검정법
M71은 대식세포-연골세포 공동-배양 시스템에서 평가하였다. 분화된 대식세포는 온코스타틴 M을 생성하는 것으로 알려져 있다(문헌[Hasegawa et al. Rheumatology 38:612-617, 1999]). OSM은 상당한 연골 기질 부분을 구성하는 고도로 황화된 프로테오글리칸 아그레칸(GAG)의 합성을 감소시킬 수 있다.
항-인간 온코스타틴 M 항체는 재조합 HEK-생성된 His-Avi 태그화된(tagged) 인간 및 사이노몰구스 원숭이 온코스타틴 M을 사용하여 발견하였으며, 이들 항체의 활성을 이들 분자뿐 아니라 알앤디 시스템즈로부터 박테리아-유래의 재조합 인간 온코스타틴 M(295-OM)을 사용하여 평가하였다. 이들 중 어느 것도 천연의 내인성 인간 온코스타틴 M과 동일하지 않았는데, 이는 his-avi 태그(HEK-생성된 Osm) 또는 글리코실화의 결여(박테리아 재조합 Osm) 중 어느 하나 때문이다. 대식세포는 온코스타틴 M을 분비하는 것으로 공지되어 있으며(문헌[Grove et al., J Lipid Res 32:1889-97, 1991]), 온코스타틴 M은 인간 연골세포 내의 프로테오글리칸 합성을 감소시킨다(문헌[Sanchez et al. OA and Cart. 12:810-10, 2004]). 따라서, 대식세포-연골세포 공동-배양 시스템을 사용하여, 내인성 또는 천연의 인간 온코스타틴 M을 중화하는 항-인간 온코스타틴 M 항체의 능력을 결정하였다. 약술하면, 40,000개의 정상 인간 관절 연골세포를 함유하는 단일 알기네이트 비드를 분화된 인간 대식세포의 존재 하에서 72시간 동안 배양하였다. 이들 실험을 소정의 용량 범위의 항-온코스타틴 M 항체의 존재 하에서 행하였다. 실험 마지막에, 프로테오글리칸 합성을 방사성 35SO4의 혼입에 의해 측정하였다.
CD14+ 말초 혈액 단핵세포를 올셀즈(AllCells)로부터 수득하였다. 단핵세포를 48-웰 플레이트 상에 0.5 ㎖의 대식세포 배지(RPMI + 글루타민과 함께 10% 열 불활성화 FBS, 1% NEAA 및 1% 페니실린-스트렙토마이신) 내에서 2.5 × 105개 세포/웰로 배양하였다. 세포를 100ng/㎖의 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF)로 처리하였다. 48시간 후에, 배지를 교체하여 비부착 세포를 제거하였다. 6일에, M-CSF를 함유하는 대식세포 배지를 M-CSF가 없는 대식세포 배지로 교체하였다. 8일에, 대식세포 배지를 연골세포 배지(50% 햄즈(Ham's) F-12/50% DMEM과 함께 10% 우태아혈청)로 교체하고, 단일 알기네이트 비드 연골세포 배양물(아티큘라 엔지니어링(Articular Engineering) #CDD-H-2200)을 각 웰에 첨가하였다. 조절된 대식세포 배지의 분취물을 알앤디 시스템즈 인간 온코스타틴 M 듀오셋(DuoSet)(DY295)을 사용하는 온코스타틴 M 수준의 분석을 위하여 -80℃에서 보존 및 보관하였다.
알기네이트 비드-대식세포 공동-배양물을 20 ㎍/㎖의 항-인간 온코스타틴 M 항체(M64, M71, M55, M69)의 존재 하에 또는 소정의 용량-범위(5 ㎍/㎖ 내지 0.00076 ㎍/㎖; 1 대 3 희석)의 항체(M71 및 M55)의 존재 하에 유지하였다. 또한, 인간 IgG1 아이소타입 대조군(CNTO6234)을 시험한 항-온코스타틴 M 항체의 가장 높은 농도에서 플레이트 상에 포함시켰다. 다른 대조군은 단독의 연골세포(공동-배양 없음) 및 2 ng/㎖의 인간 온코스타틴 M의 존재 하의 연골세포였다. 또한, 온코스타틴 M 생성을 측정하기 위하여 대식세포만을 함유하는 웰을 유지하였다. 72시간의 공동-배양 후에, 10 μCi/㎖ 방사성 35SO4(퍼킨-엘머 NEX041H002MC)를 추가 20시간 동안 각 웰에 첨가하였다.
35SO4의 혼입을 CPC 침전 기술(엠피 바이오메디컬즈(MP BIomedicals) (#190177))을 사용하여 측정하였다. 35SO4와의 20시간의 인큐베이션 후에, 표지된 배지를 제거하고, 각 비드를 Ca 및 Mg가 있는 DPBS로 2회 세정하였다. 2차 세정 후에, 200㎕의 시트르산염 완충액(150 mM NaCl, 55 mM NaCitrate, ph 6.8)을 각 비드에 첨가하였다. 비드가 해리될 때까지 플레이트를 37℃에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션시켰다. 각 웰로부터의 100㎕ 분취액을 1% CPC가 사전습윤된 밀리포어 멀티스크린(Millipore Multiscreen) 96-웰 필터 플레이트로 옮긴 다음, 10 ㎕의 10% CPC를 각 웰에 5분 동안 첨가하였다. 이어서, 필터가 건조될 때까지 진공을 플레이트에 가하였다. 이어서, 각 웰을 200 ㎕의 1% CPC로 2회 세정하고, 필터가 건조될 때까지 각 시간에 진공을 가하였다. 이어서, 플라스틱 바닥을 플레이트로부터 제거하고, 씰러(sealer)(퍼킨 엘머 #6005185로 교체하였다. 신틸레이션 액(Scintillation fluid)(50 ㎕, 퍼킨 엘머 #6013621)을 각 웰에 첨가하고, 플레이트 씰러를 플레이트의 상측에 적용하였다. 이어서, 플레이트를 탑 카운트 리더(Top Count reader) 상에서 계수하였다.
M64, M71, M55 및 M69는 20 ㎍/㎖에서, 항체의 부재 하에 관찰되는 수준을 초과하여 프로테오글리칸 합성을 증가시키는 한편, 아이소타입 대조군을 효과를 갖지 않는다(도 3). 개별 실험에서, M71은 프로테오글리칸 합성을 30 ng/㎖의 EC50과 함께 단독의 연골세포에 의해 나타나는 수준까지 증가시키고(100% 중화로 정의), 아이소타입 대조군을 효과를 갖지 않았다. 이들 데이터는 대식세포-유래의 Osm이 공동-배양된 연골세포에서 프로테오글리칸 합성을 감소시키며, 항-인간 온코스타틴 M 항체가 천연의 온코스타틴 M을 중화시킴을 보여준다.
인간 폐 섬유아세포 포스포 - STAT3 검정법
OSM은 정상 인간 폐 섬유아세포에서 증식 및 콜라겐 생성을 유도한다(문헌[Scaffidi et al., Br. J. Pharmacol 136: 793-801, 2002]). 섬유아세포에 의한 콜라겐의 과다생성은 수많은 병상의 주요 특징이다(문헌[Lim et al. Oncogene 23(39): 5416-25, 2006]; 문헌[Huang et al. J Cell Biochem 81(1): 102-13, 2001]). 온코스타틴 M 수용체 신호전달은 JAK-STAT 경로를 활성화시키며, STAT3의 인산화는 신호전달 경로의 조기 사건이다(문헌[Auguste et al. (1997) Signaling of Type II Oncostatin M Receptor. J Biol Chem 272:15760-15764]). 온코스타틴 M이 pSTAT3을 생성하는 능력을 알앤디 시스템즈 인간/마우스 pSTAT3 듀오셋(DYC4607-5)을 사용하여 정상 인간 폐 섬유아세포(NHLF)에서 결정하였다. 이어서, 이러한 검정법을 사용하여 M55 및 M71이 온코스타틴 M 신호전달을 중화시키는 능력을 결정하였다.
이들 실험을 론자(Lonza) 소유의 FGM-2 (CC-3132) 배지에서 성장시킨 론자(CC-2512)로부터의 NHLF를 사용하여 수행하였다. 약술하면, 세포를 FGM-2에서 25,000개 세포/웰로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 세포를 온코스타틴 M 또는 항체 + 온코스타틴 M으로 10분 동안 처리하였다. 이러한 10분 동안 온도 의존적인 효과를 피하기 위하여, 처리하기 위해 사용되는 모든 용액을 37℃에서 사전 가온시키고 이 온도로 유지하였다. 10분의 처리 후에, 배지를 흡인시키고, 완전 용해 완충액으로 교체하였다. 용해 완충액(pH= 7.2)은 1% NP-40, 1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.15M NaCl 및 0.01M 인산나트륨으로 이루어지며, 이는 4℃에서 보관하였다. 사용 시에, 1개의 정제의 프로테아제 억제제 칵테일(로슈, 11836153001) 및 110 ㎕ HALT 포스파타제 억제제(써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 78420)를 11 ㎖의 용해 완충액에 첨가함으로써 완전 용해 완충액을 제조하였다. 10분의 용해 단계 후에, 생성된 용해물은 pSTAT3 검출을 위한 준비가 되었다.
온코스타틴 M 용량-반응을 결정하기 위하여, NHLF 세포를 소정의 용량 범위의 OSM(1대 4 희석으로 100 ng/㎖ 내지 0.024 ng/㎖, 3벌의 웰)으로 처리하였다. 희석 플레이트를 사전 가온된 PBS + 1% BSA에서 제조하였으며, 각 웰에서의 Osm의 농도는 처리를 위해 필요한 최종 농도보다 10X 더 높았으며, 오직 배지만의 웰을 미처리 대조군으로 포함시켰다. 배지를 배양 플레이트로부터 완전하게 제거하고, 180 ㎕의 사전 가온된 FGM-2로 교체하였다. 타이머(timer)를 10분으로 작동시키고, 20 ㎕을 희석 플레이트 내의 각 웰로부터 배양 플레이트의 해당하는 웰로 옮겼다. 10분 후에, 세포 플레이트 내의 처리 용액을 흡인에 의해 완전하게 제거하고, 100 ㎕의 완전 용해 완충액으로 교체하였다. 인큐베이션 시간의 차를 최소화하기 위하여, 용해 완충액을 처리와 동일한 순서로 웰에 첨가하였다. 이어서, 검정 플레이트를 쉐이커에 10분 동안 두었다. 쉐이킹 후에, 용해물을 이후의 시험을 위해 -80℃에서 동결시키고, 항-pSTAT3이 코팅된 ELISA 플레이트로 바로 옮겼다. ELISA(알앤디 시스템즈 인간/마우스 pSTAT3 듀오셋)를 1) 오직 90 ㎕의 용해물 또는 표준물질을 각 웰에 첨가하고, 2) 슈퍼시그널 피코(SuperSignal Pico)(써모사이언티픽 37069)를 HRP 기질로 사용하였음을 제외하고 제조처의 지시에 따라 수행하였다. ELISA 플레이트를 빅터(Victor)3 플레이트 리더 상에서 발광에 대하여 판독하였다.
M55 및 M71이 NHLF 내의 OSM 신호전달을 중화시키는 능력을 평가하기 위하여, 세포를 2 ng/㎖ 인간 Osm의 존재 하에 소정의 용량 범위의 항-OSM 항체(3벌의 웰, 1 대 10 희석으로, 500 ng/㎖ 내지 0.005 ng/㎖ 또는 1 대 2 희석으로 50 ng/㎖ 내지 1.563 ng/㎖)로 처리하였다. 희석 플레이트를 20X 최종 농도로 항체 용량 반응 처리를 위하여 PBS 중에 준비하고, 웰에는 아이소타입 대조군(항-OSM 항체의 가장 높은 농도에서)을 포함시켰을 뿐 아니라, 미처리 대조군 및 OSM만으로 처리한 세포 둘 모두에 대해서는 항체가 없었다. 인간 온코스타틴 M을 FGM-2 중에 40 ng/㎖(20X 최종 농도)로 따로 제조하였다. 20X 항체 및 OSM 용액을 희석 플레이트에서 동일 부피로 혼합하여, 10X 처리 용액을 생성하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켜, OSM이 항체에 결합되게 하였다. 1시간 후에, 배지를 배양 플레이트로부터 제거하고, 180 ㎕의 사전 가온한 FGM-2로 교체하였다. 타이머(timer)를 10분으로 작동시키고, 20 ㎕을 희석 플레이트 내의 각 웰로부터 배양 플레이트의 해당하는 웰로 옮겼다. 10분 후에, 세포 플레이트 내의 용액을 흡인에 의해 완전하게 제거하고, 100 ㎕의 완전 용해 완충액으로 교체하였다. 인큐베이션 시간의 차를 최소화하기 위하여, 용해 완충액을 처리와 동일한 순서로 웰에 첨가하였다. 이어서, 검정 플레이트를 쉐이커에 10분 동안 두었다. 쉐이킹 후에, 용해물을 이후의 시험을 위해 -80℃에서 동결시키고, 항-pSTAT3이 코팅된 ELISA 플레이트로 바로 옮겼다. ELISA(알앤디 시스템즈 인간/마우스 pSTAT3 듀오셋)를 1) 오직 90 ㎕의 용해물 또는 표준물질을 각 웰에 첨가하고, 2) 슈퍼시그널 피코(써모사이언티픽 37069)를 HRP 기질로 사용하였음을 제외하고 제조처의 지시에 따라 수행하였다. ELISA 플레이트를 빅터3 플레이트 리더 상에서 발광에 대하여 판독하였다.
인간 온코스타틴 M은 대략 1ng/㎖의 EC50으로 NHLF 세포 내의 pSTAT3을 증가시킨다. 일 예의 온코스타틴 M 용량 반응이 도 4a에 제공되어 있다. 이러한 예에 대하여, EC50은 0.90 ng/㎖이었으며, 95% 신뢰 구간은 0.70 내지 1.17 ng/㎖이었다. 항-온코스타틴 M 항체의 중화 능력을 2 ng/㎖의 온코스타틴 M의 존재 하에 결정하였으며, 모든 데이터를 항체 없이, 2ng/㎖의 OSM이 존재 하의 발광에 대하여 정규화시켰다. 도 4b는 M71에 의한 OSM-유도된 STAT3 인산화의 용량-의존적 중화를 보여준다. M71의 농도가 증가함에 따라, STAT3 인산화 정도가 감소한다. 용량-반응 곡선을 6개의 개별 실험으로부터의 데이터로부터 계산하고, M71에 대하여 계산한 IC50은 8.9 ng/㎖이었으며, 95% 신뢰 구간은 6.9 내지 11.6 ng/㎖이었다.
실시예 6: 생체 내 활성
M71은 인간 온코스타틴 M의 전신 투여 후에 생체 내에서 사이토카인의 생성을 차단하는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 인간 온코스타틴 M의 복강내 주사는 아마도 뮤린 백혈병 억제 인자 수용체와의 상호작용을 통하여 특정 혈청 사이토카인의 수준을 증가시켰다.
인간 온코스타틴 M의 마우스로의 전신(복강내) 투여를 생체 내 셋팅에서 항-온코스타틴 M 모노클로널 항체의 중화 능력을 평가하기 위한 모델로 개발하였다. 마우스에 200 ㎕의 PBS 중의 10 ㎍의 인간 온코스타틴 M 또는 PBS 비히클 대조군을 복강내 주사하였다. 1시간 후에, 마우스를 CO2로 마취시키고, 말단 심장 천공에 의해 혈액을 수집하였다. 20분 동안 개별 혈액 시료가 얼음에서 응고되게 한 다음, 3500rpm에서 10 내지 15분 동안 회전시켰다. 혈청 시료를 제조처의 지시에 따라 밀리플렉스(Milliplex) 뮤린 MAP 사이토카인/케모카인 멀티플렉스(Multiplex) (32) 패널을 사용하여 분석할 때까지 동결하여 유지하였다. 시료의 분석에 의해, 비히클 대조군에 비하여 인간 온코스타틴 M이 뮤린 KC, IP-10, MCP-1, IL-6 및 에오탁신의 혈청 수준을 유의미하게 증가시켰으며, 패널 내의 다른 사이토카인에는 영향을 갖지 않는 것이 입증되었다. 이들 데이터에 의해, 인간 온코스타틴 M이 아마도 뮤린 백혈병 억제 인자 수용체와의 상호작용을 통하여 사이토카인 분비를 유도하는 것이 입증되었으며(문헌[Richards et al. J Immunol. 159:2431-37, 1997]; 문헌[Lindberg et al., Mol Cell Biol 18:3357-3367, 1988]), 이는 생체 내에서의 항-오노스타틴 M의 중화 능력을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
M71 및 M55를 마우스 전신 투여 모델에서 평가하였다. 약술하면, 마우스에 M71 또는 M55(20, 2.0 또는 0.2 ㎎/㎏의 인간 IgG1 항-인간 Osm), CNTO6234(huIgG1 아이소타입 대조군, 20 ㎎/㎏) 또는 PBS를 10 ㎕/g의 부피로 피하 투여하였다. 이어서, 24시간 후에, 각 마우스에 0.1% 마우스 혈청 알부민(시그마 A3559)과 함께, 사내에서 생성한 CHO 세포-유래의 재조합 인간 온코스타틴 M 10 ㎍ 또는 단독의 PBS-MSA 비히클 대조군(200 ㎕의 전체 부피)을 복강내 주사하였다. 1시간 후에, 마우스를 CO2로 마취시키고, 말단 심장 천공에 의해 혈액을 수집하였다. 20분 동안 개별 혈액 시료가 얼음에서 응고되게 한 다음, 3500rpm에서 10 내지 15분 동안 회전시켰다. 혈청 시료를 밀리플렉스 뮤린 MAP 사이토카인/케모카인 멀티플렉스(32) 패널을 사용하여 분석할 때까지 동결하여 유지하였다. 혈청 시료를 제조처의 지시에 따라 분석하였다.
인간 오노스타틴 M은 키트에 의해 검출되는 하기의 5개의 사이토카인의 혈청 수준의 유의미한 증가를 유도하였다(언페어드 스튜던트 t-검정(unpaired Student's t-test)): 에오탁신, IL-6, IP-10, KC 및 MCP-1. 20 ㎎/㎏의 아이소타입 대조군 CNTO6234의 사전-투여는 오노스타틴 M-유도된 사이톼인 분비에 효과를 갖지 않았다. 그러나, M71의 사전-투여는 IP-10, MCP-1, IL-6 및 에오탁신의 혈청 수준을 2.0 및 20 ㎎/㎏으로, 그리고 KC를 20 ㎎/㎏으로 유의미하게 감소시켰다. 0.2 ㎎/㎏의 M71에서는 임의의 사이토카인에 대한 효과가 없었다. P-10 및 MCP-1에 대한 M71 및 아이소타입 대조군의 효과를 각각 도 5a 및 도 5b로 나타내었다. 20 및 2.0 ㎎/㎏ 둘 모두에서의 중화가 오직 IP-10에서만 관찰되었기 때문에, 보다 덜 강력한 중화가 M55를 사용하여 관찰의 되었다. IL-6, 에오탁신 및 MCP-1의 혈청 수준은 20 ㎎/㎏의 M55에서 감소하였으나, 어떠한 용량의 M55에서도 KC 수준의 감소가 관찰되지 않았다. 이들 데이터에 의해, 뮤린 전신 투여 모델에서 외인성 인간 온코스타틴 M의 생물학적 효과를 중화시키는 항-온코스타틴 M 항체의 능력이 입증되었다.
IP-10, 즉, 인터페론 감마-유도 단백질 10 kDa 또는 작은-유도성 사이토카인 B10은 인간에서 CXCL10(C-X-C 모티브 케모카인 10(CXCL10)) 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CXCL10은 단핵세포/대식세포, T 세포, NK 세포 및 수지상 세포에 대한 화학적 유인 및 내피 세포에 대한 T 세포 접착의 증진과 같은 몇몇 역할의 원인이 된다. 이제 케모카인(C-X-C 모티브) 리간드 1(CXCL1)로 공지되어 있는 KC는 이전에 GRO1 암유전자, GROα, 호중구-활성화 단백질 3(NAP-3) 및 흑색종 성장 자극 활성, 알파(MSGA-α)로 지칭되었던 CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. 인간에서, 이러한 단백질은 CXCL1 유전자에 의해 암호화된다. CXCL1은 대식세포, 호중구 및 상피 세포에 의해 발현되며, 호중구 화학적 유인 활성을 갖는다.
실시예 7. 공동-결정학
V-영역 H17(서열 번호 51) 및 L180(서열 번호 55)을 포함하는 Fab 단편을 인간 OSM(서열 번호 10) 잔기 26 내지 212와 결정화시켰다.
OSM은 그의 4-나선 번들 3차원 구조를 gp130 사이토카인 패밀리의 다른 구성원과 공유한다. 4-나선 번들 구조는 상대적으로 비구조화된 루프에 의해 결합된 A(잔기 10-37), B(잔기 67-90), C(잔기 105-131) 및 D(잔기 159-185)로 명명된 4개의 α 나선 세그먼트를 특징으로 한다. OSM은 헬릭스 A 및 C에 위치한 아미노산 잔기(Q16, Q20, G120, N123, N124)를 포함하는 부위 II로 명명된 에피토프를 통하여 gp130과 상호작용한다(문헌[Deller et al. Structure 8(8): 863-874, 2000]; 문헌[Liu et al. Int. J. Mol. Med. 23: 161-172, 2009]). OSMRβ 및 LIFRα와의 OSM의 상호작용의 원인이 되는 에피토프인 부위 III은 대부분 나선 D에 위치한 잔기에 의해 정의되는 것으로 여겨진다(문헌[Deller et al. Structure 8(8): 863-874, 2000]).
결정화
복합체의 결정화를 동일 부피의 0.2 ㎕의 단백질 복합체(10.95 ㎎/㎖) 및 0.2 ㎕의 저장소 용액을 분배하는 Oryx4 단백질 결정화 로봇(도우글라스(Douglas) 기기)을 사용하는 20℃에서의 시팅-드롭 증기 분산(sitting drop vapor diffusion) 방법에 의해 수행하였다. 다수의 결정화 스크린을 수행하였다. 다수의 액적은 투명하게 남아있었으며, 이는 복합체의 높은 용해성을 반영한다. 결정을 0.1 M MES pH 6.5, 2.4 M 황산암모늄 및 0.1 M Tris pH 8.5, 3.5 M 포름산나트륨으로부터 수득하였다.
결정 구조 용액의 결과
H14/L180 Fab와 접촉하는 OSM 잔기는 결합 에피토프를 구성한다. OSM과 접촉하는 항체 잔기는 결합 파라토프(paratope)를 구성한다. 2개의 가변 도메인의 모든 6개의 CDR은 OSM 결합에 수반된다. 접촉 잔기는 표 13에 제공되어 있으며, 도 5에 나타나 있다. 중쇄 가변 영역 H1의 CDR과 함께 긴 CDR-L1은 바닥에 작은 리지(ridge)를 갖는 밸리(valley)-유사 항원 결합 부위를 형성한다(도 4c, 좌측 패널). 결합 시에, 밸리의 2개의 측은 나선 A 및 C를 따른 OSM 4-나선 번들을 포괄하며, 바닥의 리지 결합은 2개의 나선 사이에 존재한다(도 4c, 우측 패널). 항체 및 항원 결합 경계면은 용매가 접근할 수 있는 표면의 2,514 Å2에 매립된다(Ab에 대해서는 1225 Å2 및 Ag에 대해서는 1298 Å2). 경계면에서 다수의 전하 잔기가 존재하지만, 전하-전하 쌍형성이 존재하지 않으며, 이는 vdw 및 H-결합이 항체 및 항원 상호작용에서 가장 중요한 역할을 수행함을 시사한다.
Figure 112013040373230-pct00021
이에 따라, H17/L180 Fab는 이전에 gp130과 접촉하는 것으로 밝혀진 잔기, Q20 및 G120과, A 및 C 나선을 따라 OSM과 접촉한다.
실시예 8: 약동학
OSM은 세포 상의 세포-표면 디스플레이된 표적과 대조적으로, 염증 과정과 관련된 용해성 표적이다. 이에 따라, 본 명세서에서 발견된 결합 영역을 포함하며, 추가로 Fc 도메인을 갖는 완전 IgG의 성질은 FcR 결합의 변경을 부여하는 돌연변이를 사용하여 Fc를 엔지니어링하는 방법을 사용하여 목적 및 그의 사용과 관련된 치료 상세사항에 맞춤화될 수 있다.
본 조성물에서, 지속적 활성 및 순환의 영속성은 치료적 모노클로널 IgG의 유익한 사양이다. 따라서, Fc-도메인은 신생아 수용체(neonatal receptor, FcRn)에 대한 증가된 친화성을 갖는다.
이전에 기재된 돌연변이를 사용하여, N434S(미국 특허 제7371826호, WO2006/053301호)와 병용한 M428L(메드이뮨(MedImmune) 미국 특허 제7670600호), 돌연변이 항체 및 야생형 항체를 표준 재조합 기술을 사용하여 구축하였다. 이들 2개의 Mab, 즉, M71 및 M71 L/S를 표준 활성 검정법에서 비교하고, 비-인간 영장류의 순환의 영속성에 대하여 비교하였다.
검정법
A375-S2 증식 검정법에서 M71 및 M71 L/S를 나란히 비교하였다. 용량-반응을 1 ㎍/㎖의 출발 농도와, 0.00032 ㎍/㎖로의 1 대 5 희석으로부터 평가하였다. 1 ㎍/㎖의 농도에서, 이들 항체에 대한 아이소타입 대조군, CNTO3930 및 CNTO8852는 각각 증식을 억제하는 2 ng/㎖의 인간 온코스타틴 M의 능력에 대하여 효과를 갖지 않았다. M71 및 M71 L/S는 둘 모두 1 ㎍/㎖에서 온코스타틴 M의 효과를 완전하게 중화시켰으며, 측정가능한 IC50의 차이가 없었다.
M71 및 M71 L/S를 마우스 전신 투여 모델에서 비교하였다. 약술하면, 마우스에 M71 및 M71 L/S(20, 10 또는 5.0 ㎎/㎏), CNTO3930(huIgG1 아이소타입 대조군, 20 ㎎/㎏), CNTO8852(Fc 돌연변이된 버전에 대한 아이소타입 대조군, 20 ㎎/㎏) 또는 PBS를 10 ㎕/g의 부피로 피하 투여하였다. 24시간 후에, 각 마우스에 0.1% 마우스 혈청 알부민(시그마 A3559)과 함께, 사내에서 생성한 CHO 세포-유래의 재조합 인간 온코스타틴 M 10 ㎍ 또는 단독의 PBS-MSA 비히클 대조군(200 ㎕의 전체 부피)을 복강내 주사하였다. 1시간 후에, 마우스를 CO2로 마취시키고, 말단 심장 천공에 의해 혈액을 수집하였다. 20분 동안 개별 혈액 시료가 얼음에서 응고되게 한 다음, 3500rpm에서 10 내지 15분 동안 회전시켰다. 혈청 시료를 IL-6, MCP-1, 에오탁신, KC 및 IP-10에 특이적인 비드로 이루어진 맞춤 밀리포어 뮤린 멀티플렉스를 사용하여 분석할 때까지 동결 보존하였다. 아이소타입 대조군 중 어느 것도 인간 온코스타틴 M에 의해 유도되는 사이토카인 분비에 대하여 어떠한 효과를 갖지 않았다. 그러나, M71 및 M71 L/S 둘 모두는 온코스타틴 M-유도 사이토카인 분비를 중화시켰으며, 능력 또는 효능의 명백한 차이는 없었다.
약동학적 분석
M71 및 M71 L/S의 혈청 반감기를 비-말기 사이노몰구스 원숭이 약동학적 연구에서 비교하였다. 총 12마리의 사이노몰구스 원숭이를 연구에 포함시키고, 각 항체에 대한 피하(s.c., n=3) 및 정맥내(i.v., n=3) 투여를 평가하였다. 항체를 3 ㎎/㎏으로 투여하고, 연구를 60일에 걸쳐 수행하였다. 혈액 시료를 1시간(IV 그룹만) 및 6시간 및 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 30, 37, 45 및 60일에 취하였다. 시료로부터의 혈청을 시험할 때까지 -80℃에서 동결시켰다. 혈청 중의 항체 수준을 메소스케일 디스커버리(MesoScale Discovery) 플랫폼에 대해 사이노몰구스 원숭이 혈청에서 최적화된 ELISA를 사용하여 결정하였다. 비오티닐화 포획 항체는 M71에 대하여 유도된 항-이디오타입 항체였다(마우스 항-M71). 검출 항체는 루테늄-표지된 항-인간 IgG였으며, 판독은 메소스케일 디스커버리 화학발광이었다.
연구의 결과는 도 6a 및 6b에 나타나 있다. 도 6a는 정맥내 투여로부터의 플롯을 보여주며, 여기서, M71의 혈청 반감기는 15.21 +/- 3.0일이고, M71 L/S의 혈청 반감기는 29.4 +/- 2.3일이었다. 유사한 결과를 피하 투여로부터 수득하였으며(도 6b), 혈청 반감기는 M71에 대하여 15.4 +/- 4일이고, M71 L/S에 대하여 32.0 +/- 5.9일이었다.
결과는 M71 L/S t ½이 M71에 비해 약 2배 증가한 것을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. <120> Human Oncostatin M Antibodies and Methods of Use <130> CEN5306WOPCT <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> X may be Ala or Gly <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> X may be Gly or Trp <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> X may be Ile or Ser <220> <221> VARIANT <222> (53)..(53) <223> X may be Ala or Pro <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> X may be Ile or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (55)..(55) <223> X may be Asn or Phe <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Xaa Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Asp, Asn, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> X may be Asp, Gly, or Trp <220> <221> VARIANT <222> (35)..(35) <223> X may be His or Ser <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> X may be Ala, Asn, Gly, or Val <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> X may be Asn, Lys, Ser, or Trp <220> <221> VARIANT <222> (53)..(53) <223> X may be Gln, Gly, Ser, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> X may be Asp or Ser <220> <221> VARIANT <222> (56)..(56) <223> X may be Gly or Ser <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Xaa Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Asn or Ser <220> <221> VARIANT <222> (35)..(35) <223> X may be Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> X may be Arg or Ile <220> <221> VARIANT <222> (52)..(52) <223> X may be Asp or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (54)..(54) <223> X may be Gly or Ser <220> <221> VARIANT <222> (57)..(57) <223> X may be Asp or Tyr <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Xaa Tyr 20 25 30 Trp Ile Xaa Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asp Ser Xaa Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> X may be Ala, Asp, Asn, Ser or Arg <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Asp, Gly, Lys, Asn, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> X may be Ala, Asp, Phe, His, Asn, Ser Trp, Val or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> X may be Ala, Asp, Phe, Gly, Asn, Lys, Thr or Tyr <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 <210> 6 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> X may be Ala, Asn, Asp, Arg, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Asn, Asp, Lys, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> X may be Ala, Asn, Asp, His, Phe, Ser, Trp, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (50)..(50) <223> X may be Ala, Asn, Asp, Gly, Lys, Phe, Thr, or Tyr <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Xaa Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85 <210> 7 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (30)..(30) <223> X may be Asn, Asp, Arg, Ser, or Thr <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Asn, Arg, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (32)..(32) <223> X may be Ala, Asp, Asn, Arg, His, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (33)..(33) <223> X may be Glu, Gln, His, Lys, Phe, Ser, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (51)..(51) <223> X may be Ala, Asp, Gly or Ser <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Xaa Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85 <210> 8 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (31)..(31) <223> X may be Ala, His, Phe, Ser, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (36)..(36) <223> X may be Asn, Glu, Lys, or Thr <220> <221> VARIANT <222> (38)..(38) <223> X may be Ala, Asp, Asn, His, Phe, Ser, Trp, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (56)..(56) <223> X may be Ala, Asp, Arg, Ser, Trp, or Tyr <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Xaa Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Xaa Asn Xaa Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Xaa Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X may be Ala, Asp, Arg, Gly, His, Phe, Pro, Ser, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X may be Asp, Asn, Arg, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Ser, or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X may be Asp, Asn, Arg, Gly, His, Lys, Thr, or Ser <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X may be Ala, Arg, Gly, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, or Val <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X may be Asn, Arg, Ile, Leu, Phe, Trp, or Tyr <400> 9 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Ala Ile Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Val Leu Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 25 30 Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp Val Pro Lys Leu Arg Glu His 35 40 45 Cys Arg Glu Arg Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gln Arg Leu Pro Lys Ala Gln 85 90 95 Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln 100 105 110 Met Ala Arg Pro Asn Ile Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120 125 Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Thr Ala Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135 140 Arg Gly Ala Ser Gln Pro Pro Thr Pro Thr Pro Ala Ser Asp Ala Phe 145 150 155 160 Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Arg Phe Leu His Gly Tyr His Arg Phe 165 170 175 Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185 190 Arg Ser Arg Arg His Ser Pro His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg 195 200 205 Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys Gly Lys Arg Leu Met Thr Arg Gly Gln 210 215 220 Leu Pro Arg 225 <210> 12 <211> 227 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 12 Ala Ala Met Gly Ser Cys Ser Lys Glu Tyr Arg Met Leu Leu Gly Gln 1 5 10 15 Leu Gln Lys Gln Thr Asp Leu Met Gln Asp Thr Ser Arg Leu Leu Asp 20 25 30 Pro Tyr Ile Arg Ile Gln Gly Leu Asp Ile Pro Lys Leu Arg Glu His 35 40 45 Cys Arg Glu Ser Pro Gly Ala Phe Pro Ser Glu Glu Thr Leu Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Arg Arg Gly Phe Leu Gln Thr Leu Asn Ala Thr Leu Gly Arg 65 70 75 80 Val Leu His Arg Leu Ala Asp Leu Glu Gln His Leu Pro Lys Ala Gln 85 90 95 Asp Leu Glu Arg Ser Gly Leu Asn Ile Glu Asp Leu Glu Lys Leu Gln 100 105 110 Met Ala Arg Pro Asn Val Leu Gly Leu Arg Asn Asn Ile Tyr Cys Met 115 120 125 Ala Gln Leu Leu Asp Asn Ser Asp Met Thr Glu Pro Thr Lys Ala Gly 130 135 140 Arg Gly Thr Pro Gln Pro Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Asp Val Phe 145 150 155 160 Gln Arg Lys Leu Glu Gly Cys Ser Phe Leu Arg Gly Tyr His Arg Phe 165 170 175 Met His Ser Val Gly Arg Val Phe Ser Lys Trp Gly Glu Ser Pro Asn 180 185 190 Arg Ser Arg Arg His Ser Pro His Gln Ala Leu Arg Lys Gly Val Arg 195 200 205 Arg Thr Arg Pro Ser Arg Lys Gly Asn Arg Leu Met Pro Arg Gly Gln 210 215 220 Leu Pro Arg 225 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Tyr Trp Ile Ser 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Asn Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Tyr Gly Ala Lys Gly Leu Leu Asp Tyr 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Ser Val Phe Glu Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Pro Val Ser Pro Ala Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Phe Gly Ala Ser Tyr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Ser Asn Asn Glu Asn Trp Leu 1 5 10 15 Ala <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ala Ser Ser Asn Asn Asn Asn Phe Leu 1 5 10 15 Ala <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Gln Ser Phe Ser Phe Pro Ile 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X may be Ser or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X may be Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X may be Phe or Thr <400> 29 Gln Gln Xaa Xaa Ser Xaa Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Gly Asn Asn Gly Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Gly Ser Asn His Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Arg Gly Asn Asn Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Trp Gly Asn Asp Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Gly Gly Asn Gly Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Trp Gly Asn Gly His Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Asn Gly Asn His Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser Asp Gly Asn His Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Ser Ser Asn Ile Asn Phe Leu 1 5 10 15 Ala <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Gly Asp Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Gly Tyr Asn Arg Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser Trp His Asn Asp Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Lys Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ser Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Asn Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Gln Gln Tyr Ser Thr Thr Pro Leu Thr 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Gln Tyr Phe Ser Thr Pro Ile Thr 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X may be Phe or Tyr <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X may be Ile or Leu <400> 47 Gln Gln Tyr Xaa Ser Thr Pro Xaa Thr 1 5 <210> 48 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 <210> 49 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser 20 25 30 Arg Gly Asn Asn Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu 100 <210> 50 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser 20 25 30 Asp Gly Asn His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu 100 <210> 51 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Gly Ser 20 25 30 Ser Ser Asn Ile Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Thr Pro Ile 100 <210> 52 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Asn Trp Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Thr Thr Pro Leu 100 <210> 53 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Ser 20 25 30 Gly Ser Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu 100 <210> 54 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Val Phe Glu Ala Tyr Phe Asp Tyr 100 105 <210> 55 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Pro Val Ser Pro Ala Tyr Leu Asp Tyr 100 105 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence for enzymatic biotinylation <400> 56 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 1 5 10 15

Claims (42)

  1. 인간 OSM 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서,
    a. 서열번호 23 내지 25 및 30 내지 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 영역 1(L-CDR1) 아미노산 서열;
    b. 서열번호 26 및 42 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 영역 2(L-CDR2) 아미노산 서열;
    c. 서열번호 27 내지 29 및 45 내지 47로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 상보성 결정 영역 3(L-CDR3) 아미노산 서열;
    d. 서열번호 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 1(H-CDR1) 아미노산 서열;
    e. 서열번호 16 내지 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 2(H-CDR2) 아미노산 서열; 및
    f. 서열번호 19 내지 22로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 상보성 결정 영역 3(H-CDR3) 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR1;
    서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR2;
    서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 H-CDR3;
    서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR1;
    서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR2; 및
    서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는 L-CDR3을 포함하는, 단리된 항체.
  3. 인간 OSM 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체로서, 서열번호 49 내지 53으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열; 및 서열번호 54 및 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 51의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 55의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  5. 제3항에 있어서, 서열번호 53의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 및 서열번호 54의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  6. 제1항에 있어서, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 단리된 항체.
  7. 제6항에 있어서, 불변 영역이 인간 IgG 아이소타입(isotype)을 포함하는, 단리된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 아이소타입이 IgG1인, 단리된 항체.
  9. 제8항에 있어서, 불변 영역이 돌연변이되어 항체가 비-용해성이 되는, 단리된 항체.
  10. 제7항에 있어서, 불변 영역이 돌연변이되어 야생형 IgG1 불변 도메인 서열을 갖는 항체와 비교하여 신생아 수용체(neonatal receptor, FcRn)에 대한 항체의 친화성이 증가되는, 단리된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 카바트(Kabat) EU 넘버링에 따를 때 불변 영역이 위치 428 및 434에서 돌연변이되는, 단리된 항체.
  12. 제11항에 있어서, 카바트 EU 넘버링에 따를 때 돌연변이가 M428L 및 N434S인, 단리된 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 단편이 Fab, Fab', Fd, F(ab)2 및 ScFv로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항원 결합 단편.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 질환 또는 장애가 골관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 신경병성 관절증, 반응성 관절염 및 회전근개 파열 관절증(rotator cuff tear arthropathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 관절증인, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 질환 또는 장애가 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 홍반성 낭창, 염증성 폐질환, 특발성 폐섬유증, 패혈증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제학적 조성물로서,
    상기 질환 또는 장애가 죽상 동맥경화증, 당뇨병성 신장병증, 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 전신 경화증 및 경변증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 섬유성 질환인, 약제학적 조성물.
  18. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제로서,
    상기 질환 또는 장애가 골관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 신경병성 관절증, 반응성 관절염 및 회전근개 파열 관절증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 관절증인, 약제.
  19. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제로서,
    상기 질환 또는 장애가 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 홍반성 낭창, 염증성 폐질환, 특발성 폐섬유증, 패혈증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제.
  20. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 약제로서,
    상기 질환 또는 장애가 죽상 동맥경화증, 당뇨병성 신장병증, 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 전신 경화증 및 경변증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 섬유성 질환인, 약제.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 멸균 제제, 및 상기 항체의 투여를 필요로 하는 대상체로의 상기 항체의 투여에 대한 설명서(instruction)를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 키트로서,
    상기 질환 또는 장애가 골관절염, 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 신경병성 관절증, 반응성 관절염 및 회전근개 파열 관절증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 관절증인, 키트.
  22. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 멸균 제제, 및 상기 항체의 투여를 필요로 하는 대상체로의 상기 항체의 투여에 대한 설명서를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 키트로서,
    상기 질환 또는 장애가 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 건선, 홍반성 낭창, 염증성 폐질환, 특발성 폐섬유증, 패혈증 및 다발성 경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  23. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 멸균 제제, 및 상기 항체의 투여를 필요로 하는 대상체로의 상기 항체의 투여에 대한 설명서를 포함하는, 인간 OSM 단백질과 인간 gp130 단백질 간의 상호작용의 조절에 반응하는 질환 또는 장애의 치료용 키트로서,
    상기 질환 또는 장애가 죽상 동맥경화증, 당뇨병성 신장병증, 폐섬유증, 특발성 폐섬유증, 전신 경화증 및 경변증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 섬유성 질환인, 키트.
  24. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편을 암호화하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  25. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 벡터.
  26. 제24항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 안정적으로 형질전환되거나(transformed) 트랜스펙션된(transfected) 재조합 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, 서열번호 53의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터; 및 서열번호 54의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 안정적으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포.
  28. 제26항에 있어서, 서열번호 51의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터; 및 서열번호 55의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 안정적으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포.
  29. 제26항에 있어서,
    서열번호 38의 L-CDR1 아미노산 서열;
    서열번호 43의 L-CDR2 아미노산 서열; 및
    서열번호 46의 L-CDR3 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터; 및
    서열번호 14의 H-CDR1 아미노산 서열;
    서열번호 17의 H-CDR2 아미노산 서열; 및
    서열번호 21의 H-CDR3 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 안정적으로 형질전환되거나 트랜스펙션된 재조합 숙주 세포.
  30. 제27항에 있어서, 포유류 세포인, 숙주 세포.
  31. 제28항에 있어서, 포유류 세포인, 숙주 세포.
  32. 제29항에 있어서, 포유류 세포인, 숙주 세포.
  33. 제30항에 있어서, CHO 세포인, 숙주 세포.
  34. 제31항에 있어서, CHO 세포인, 숙주 세포.
  35. 제32항에 있어서, CHO 세포인, 숙주 세포.
  36. 제30항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 상기 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  37. 제31항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 상기 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
  38. 제32항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 상기 세포로부터 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX392780B (es) * 2010-10-13 2025-03-24 Janssen Biotech Inc Polinucléotidos que condifican anticuerpos de oncostatina m humana
SI2643352T1 (sl) * 2010-11-23 2018-12-31 Glaxo Group Limited Antigen-vezavni proteini na onkostatin M (OSM)
US9062120B2 (en) 2012-05-02 2015-06-23 Janssen Biotech, Inc. Binding proteins having tethered light chains
US9550828B2 (en) 2013-09-05 2017-01-24 Boise State University Oncostatin M (OSM) antagonists for preventing cancer metastasis and IL-6 related disorders
CN104083754A (zh) * 2014-07-08 2014-10-08 武汉大学 Ⅱ型抑瘤素m受体（osmr）在脑卒中疾病中的功能和应用
EP3197480A1 (en) * 2014-09-24 2017-08-02 Universita' Degli Studi Di Padova Composition to induce bone marrow stem cell mobilization
CN104258396A (zh) * 2014-09-29 2015-01-07 武汉大学 Ⅱ型抑瘤素m受体在治疗动脉粥样硬化中的功能和应用
CN107530431B (zh) 2015-01-29 2022-01-07 牛津大学创新有限公司 生物标志物
JP2019502698A (ja) * 2015-12-17 2019-01-31 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｈｌａ−ｄｒに特異的に結合する抗体及びその使用
GB201614627D0 (en) * 2016-08-30 2016-10-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Antigen binding proteins
EP4467565A3 (en) 2016-12-21 2025-03-12 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
WO2019084307A1 (en) * 2017-10-26 2019-05-02 Celldex Therapeutics, Inc. ANTI-MERTK ANTIBODIES AND METHODS OF USE
FR3090637A1 (fr) * 2018-12-21 2020-06-26 Universite De Poitiers Protéine de liaison spécifique capable de se lier spécifiquement à l’oncostatine M humaine (hOSM) et ses utilisations.
CN109884320A (zh) * 2019-03-29 2019-06-14 重庆医科大学 抑瘤素m作为生物标志物在制备脓毒症诊断试剂中的应用
US11633457B2 (en) 2019-04-11 2023-04-25 Boise State University Pharmaceutical compositions comprising oncostatin m (OSM) antagonist derivatives and methods of use
CN113678044A (zh) 2019-04-12 2021-11-19 住友电气工业株式会社 光纤带芯线、模具及光纤带芯线的制造方法
TW202221039A (zh) 2020-10-19 2022-06-01 美商碩騰服務公司 犬及貓抑瘤素Ｍ受體β之抗體及其用途
CN118909077A (zh) * 2024-10-10 2024-11-08 江苏凯基生物技术股份有限公司 一种抑瘤素m的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070286861A1 (en) * 2004-03-30 2007-12-13 Ellis Jonathan H Immunoglobulins

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5618715A (en) 1985-12-20 1997-04-08 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
US5681930A (en) 1985-12-20 1997-10-28 Bristol-Myers Squibb Company Anti-oncostatin M monoclonal antibodies
US5451506A (en) 1985-12-20 1995-09-19 Oncogen Limited Partnership Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
US5120535A (en) 1986-11-26 1992-06-09 Oncogen Oncostatin M and novel compositions having anti-neoplastic activity
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5202116A (en) 1989-04-10 1993-04-13 Oncogen Methods for controlling human endothelial cell proliferation and effector functions using oncostatin m
ZA909842B (en) 1989-12-08 1991-09-25 Oncogen Proteins with oncostatin m activity and process for their preparation
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
NZ237533A (en) 1990-03-29 1992-12-23 Bristol Myers Squibb Co Monoclonal antibodies which bind to oncostatin m, cell lines producing them
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9019553D0 (en) * 1990-09-07 1990-10-24 Unilever Plc Specific binding agents
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
US5585793A (en) 1994-06-10 1996-12-17 Digital Equipment Corporation Order preserving data translation
US5874540A (en) * 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
US20030044772A1 (en) * 1997-08-04 2003-03-06 Applied Molecular Evolution [Formerly Ixsys] Methods for identifying ligand specific binding molecules
US5958442A (en) 1997-10-24 1999-09-28 Bristol-Myers Squibb Company Oncostatin M for treating inflammation
GB9806530D0 (en) * 1998-03-26 1998-05-27 Glaxo Group Ltd Inflammatory mediator
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
US20050208558A1 (en) * 1999-10-19 2005-09-22 Applera Corporation Detection kits, such as nucleic acid arrays, for detecting the expression or 10,000 or more Drosophila genes and uses thereof
US6696620B2 (en) * 2000-05-02 2004-02-24 Epicyte Pharmaceutical, Inc. Immunoglobulin binding protein arrays in eukaryotic cells
CN1487996B (zh) 2000-11-30 2010-06-16 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
DE60143544D1 (de) 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
DE60231475D1 (de) * 2001-01-12 2009-04-23 Molecules Of Man Ab Materialien und methoden zur behandlung von hepatitis c
US7319142B1 (en) * 2004-08-31 2008-01-15 Monsanto Technology Llc Nucleotide and amino acid sequences from Xenorhabdus and uses thereof
EP2314618A3 (en) 2004-11-12 2011-10-19 Xencor Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
AU2006210606B2 (en) * 2005-02-03 2012-03-22 Macrogenics West, Inc. Antibodies to Oncostatin M receptor
US20070124833A1 (en) * 2005-05-10 2007-05-31 Abad Mark S Genes and uses for plant improvement
RS60616B1 (sr) * 2005-12-29 2020-09-30 Janssen Biotech Inc Humana anti-il-23 antitela, kompozicije, postupci i upotrebe
KR101368596B1 (ko) * 2006-08-18 2014-03-17 조마 테크놀로지 리미티드 Ｐｒｌｒ 특이적 항체 및 그 용도
HRP20171741T1 (hr) * 2007-08-21 2017-12-29 Amgen, Inc Proteini koji se vežu na ljudski antigen c-fms
WO2009085462A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Design and generation of human de novo pix phage display libraries via fusion to pix or pvii, vectors, antibodies and methods
EP2235059B1 (en) * 2007-12-26 2015-02-18 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to fcrn
AR070315A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
JP2013508287A (ja) * 2009-10-14 2013-03-07 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体を親和性成熟する方法
MX392780B (es) * 2010-10-13 2025-03-24 Janssen Biotech Inc Polinucléotidos que condifican anticuerpos de oncostatina m humana
SI2643352T1 (sl) 2010-11-23 2018-12-31 Glaxo Group Limited Antigen-vezavni proteini na onkostatin M (OSM)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070286861A1 (en) * 2004-03-30 2007-12-13 Ellis Jonathan H Immunoglobulins

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