MX2013003907A - (r) - (e) -2- (4- (2- (5- (1- (3,5-dicloropiridin-4-il) etoxi) -1h-indazol-3-il) vinil) -1h-pirazol-1-il) etanol cristalino y su uso como inhibidor de fgfr. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5- dicloropiridin-4-iI)etoxi)-1H-indazol-3-iI)vinil)-1 H-pirazol-1-iI)etanol cristalino útil en el tratamiento de cáncer. (Ver Formula).

Description

(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-DICLOROPIRIDIN-4-IL)ETOXh-1H-INDAZOL- 3-ILiVINIL)-1H-PIRAZ0L-1-IL)ETAN0L CRISTALINO Y SU USO COMO INHIBIDOR DE FGFR El factor de crecimiento del fibroblasto (FGF) ha sido reconocido como un mediador importante de muchos procesos fisiológicos, tales como morfogénesis durante el desarrollo y angiogénesis. La familia del receptor del factor de crecimiento del fibroblasto (FGFR) consiste de cuatro miembros (FGFR1-FGFR4), los cuales son glicoproteínas compuestas de dominios similares a inmunoglobulina extracelular (Ig), una región hidrofóbica de la transmembrana y una parte citoplásmica que contiene un dominio de tirosina cinasa. El enlace de FGF conduce a dimerización de FGFR, seguido por autofosforilación del receptor y activación de trayectorias de señalización corriente abajo. La activación del receptor es suficiente para el reclutamiento y activación de patrones de señalización corriente abajo específicos que participan en la regulación de diversos procesos tales como crecimiento celular, metabolismo celular y supervivencia celular. De este modo, la trayectoria de señalización FGF/FGFR tiene efectos pleyotrópicos en muchos procesos biológicos críticos a la proliferación de células tumorales, migración, invasión y angiogénesis.

Los vinil indazoles se conocen en la técnica para el tratamiento de cáncer. Véase por ejemplo, los documentos WO200210137 y WO2003101968. Los inhibidores de FGFR también se conocen en la técnica. Véase por ejemplo, el documento El documento PCT/US201 0/033487 describe una forma amorfa de (R)-(E)-2-(4-(2-(5-( 1 -(3, 5-dicloropirid¡n-4-¡l)etox¡)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -il)etanol que es pobremente cristalina y es útil como un inhibidor de FGFR.

La presente invención proporciona un ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-( 1 -(3, 5-dicloropirid in-4-il)etox¡)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -i l)etanol cristalino que es un potente inhibidor de FGFR y puede ofrecer las propiedades ventajosas con relación a la forma previa de propiedades superiores de manejo de sólidos a gran escala, facilidad de purificación por cristalización, y estabilidad termodinámica bajo condiciones de procesamiento farmacéutico y almacenaje. En una modalidad , el ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-( 1 -(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -il)etanol cristalino es la forma de monohidrato.

La presente invención también proporciona (R)-(E)-2-(4-(2- (5-(1 -(3, 5-dicloropirid i n-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -il)etanol cristalino caracterizado por el patrón de difracción en polvo de rayos-X (radiación Cu, ? = 1 .54059 A) que comprende un pico a 14.65, y uno o más picos a 3.54, 12.51 , o 1 9.16 (2T +/- 0.1 °) .

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL), cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon, mieloma m últiple, cáncer hepático, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer de células renales, glioblastoma, y cáncer testicular en un mamífero que comprende administrar a un mam ífero en necesidad de tal tratamiento una cantidad efectiva de un compuesto o sal de la presente invención.

Esta invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto o sal de la presente invención en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una modalidad particular la composición además comprende uno o más de otros agentes terapéuticos.

Esta invención también proporciona un compuesto o sal de la presente invención para uso en terapia. Adicionalmente, esta invención proporciona el uso de un compuesto o sal de la presente invención en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer. Adicionalmente, esta invención proporciona el uso de un compuesto o sal de la presente invención para uso en el tratamiento de cáncer. En particular, estos cánceres se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon , mieloma múltiple AML, cáncer hepático, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer de células renales, glioblastoma, y cáncer testicular. Más particularmente, los cánceres se seleccionan del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon, mieloma múltiple, cáncer hepático, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer de células renales, glioblastoma, y cáncer testicular. Más particularmente el cáncer es cáncer de pulmón de células no pequeñas. Más particularmente el cáncer es cáncer gástrico. Más particularmente el cáncer es mieloma múltiple. Además, esta invención proporciona una composición farmacéutica para tratar cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon, mieloma múltiple, cáncer hepático, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer de células renales, glioblastoma, y cáncer testicular que comprende un compuesto o sal de la presente invención como un ingrediente activo.

Se entenderá por el lector experto que todos los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales. Los compuestos de la presente invención son aminas, y por consiguiente reaccionan con cualquiera de un número de ácidos orgánicos e inorgánicos para formar sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Tales sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable y metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2008); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal oí Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, Enero 1977.

Como se usa en la presente, el término "aislado" significa (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol- -il)etanol cristalino que es 99% puro.

Los compuestos de la presente invención pueden ser preparados esencialmente como se ilustra en las preparaciones y ejemplos siguientes. El nombramiento de las siguientes preparaciones y ejemplos se hace usando la característica de nombramiento Estruct=Nombre en ChemDraw® Ultra 10.0.

Preparación 1 1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etanol A un matraz de fondo redondo de 12L de 3 cuellos se agregó tetrahidrofurano (THF, 3 L) y diisopropilamina (DIPA, 315 ml_, 2.24 mol) y se enfrió a -78 °C. Se agregó lentamente n-butillitio (1.6 M en hexanos, 1400 ml_, 2.24 mol). Después que la adición se completó y la temperatura se ha ajustado a -78 °C se agregó lentamente una solución de 3,5-dicloropiridina (296.7 g, 2.00 mol) la cual inmediatamente forma una solución amarilla que cambia a una suspensión de color óxido. Después que la adición se completó y la temperatura se ha ajustado a -78 °C se agregó lentamente acetaldehído (230 mL, 4.05 mol) en THF (600 ml_). Se continuó agitando a -78 °C. Después de 3 horas, se removió el baño de hielo seco y comenzó a apagarse la reacción por la adición por goteo de cloruro de amonio acuoso saturado (1 L). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente (RT) durante la noche con agitación. Se diluyó la mezcla con metil-ter-butiléter (MTBE, 2 L), cloruro de amonio acuoso saturado (1 L) y agua (2 L). Se dividió y lavó lo orgánico con cloruro de sodio acuoso saturado (salmuera). Se extrajo la fase acuosa con MTBE (1.5 L). Se combinaron las capas orgánicas, secaron sobre sulfato de sodio, filtraron y concentraron in vacuo. Se purificó el residuo por cromatografía en gel de sílice [25% de acetato de etilo (EA) en hexanos] para dar el compuesto del título como un aceite rojo. Rendimiento: 352 g (90%). MS (ES) m/z 192 [M+1] + .

Preparación 2 (S)-1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etanol Se separó la mezcla de estereoisómeros obtenida en la Preparación 1 en una columna CHIRALPAK® AD-H eluyendo con 90% de heptanos/10% de etanol. El pico 2 es el enantiómero deseado. Para establecer la configuración absoluta se disolvió una muestra del producto en CDCI3 (concentración final 100 mg/mL). Se obtiene el dicroísmo circular vibracional (VCD) y espectro infrarrojo (IR) con una resolución de 4 cm-1 usando un espectrómetro ChiralIR FT VCD (BioTools Inc ®) con una celda IR equipada con ventanas BaF2 y una longitud de trayectoria de 100 mm. Se recolectó el VCD y IR por 6 horas con 150 µ?_ de la muestra. Se presentaron los datos sin redondear o procesar datos adicionales. Se obtienen frecuencias vibracionales y absorción e intensidades de VCD optimizando el confórmero de energía más baja por Gaussian al nivel B3PW91/6-31G** en un agrupamiento Linux, y se simula el espectro correspondiente usando una anchura de banda Lorentzian de 1 dicroísmo circular vibracional de 6 cm. Los análisis anteriores muestran el producto por ser el isómero-S. Rendimiento: 84.37 g (27%). MS (ES) m/z 192 [M + 1]+.

Preparación 3 Metansulfonato de (S)-1 -(3,5-Dicloropiridin-4-il)etilo Se disolvió (S)-1-(3,5-dicloropiridin-4-il)etanol (5.02 g, 26.14 mmol) en diclorometano (DCM, 100 ml_) y se enfrió el matraz en un baño de hielo. Se agregó trietilamina (TEA, 3.5 ml_, 25.11 mmol) seguido por la adición por goteo de cloruro de metansulfonilo (2.2 ml_, 28.42 mmol). Se removió el baño de hielo y la reacción se dejó calentar a RT. Después de 4 horas, la reacción se apagó con agua (100 mL) y las capas se separaron. Se extrajo la capa acuosa con DCM (50 mL) seguido por 20% de alcohol isopropílico (IPA)/cloroformo (50 mL). Se combinaron los extractos orgánicos, secaron sobre sulfato de sodio anhidro, filtraron y concentraron in vacuo. Rendimiento: 7.15 g, (100%). MS (ES) m/z 270 [M + 1] + .

Preparación 4 4-Yodo-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1H-pirazol En un matraz de 3 cuellos de 1L equipado con barra agitadora magnética, manto de nitrógeno y sonda de temperatura interna se disolvió 2-(2-bromoetoxi)tetrahidro-2H-pirano (34 g, 156 mmol) en acetonitrilo (ACN, 400 mL). Se agregó 4-yodopirazol (29.34 g, 149.74 mmol) seguido por carbonato de cesio (73.4 g, 223.02 mmol). Se agitó la mezcla a RT por 18 horas. Se filtró la mezcla de reacción a través de CELITE®, se lavó la torta de filtro con ACN y se concentró lo filtrado a un aceite dorado. Se usó sin purificación adicional. Rendimiento: 47.819 g (99%). MS (ES) m/z 323 [M + 1] + .

Preparación 5 5-(ter-Butildimetilsililoxi)-1 H-indazol Se cargó un recipiente de reacción de 10 L con N,N-dimetilformamida (DMF, 2.50 L), 5-hidroxiindazol (150.20 g, 1.12 mol) y 1H-imidazol (114.35 g, 1.68 mol). Se enfrió la mezcla a 0 °C y se agregó ter-butildimetilclorosilano (253.16 g, 1.68 mol) durante 0.5 horas. Se agitó la mezcla a 18 °C por 3 horas. Se agregó agua (2.5 L) a la reacción lentamente con un baño de hielo a 5 °C para mantener una temperatura interna a aproximadamente 20 °C. Se transfirió la mezcla a un embudo separador y se extrajo con EA (2 x 2.5 L). Se combinaron los extractos y lavaron con agua (3 x 2.5 L) y salmuera. Se secaron las soluciones orgánicas sobre sulfato de sodio anhidro, filtraron, y evaporaron a un aceite rojo. El aceite se pasó a través de una almohadilla de gel de sílice y eluyó con eluyente (0% a 30% EA en hexano) para proporcionar el compuesto del título como un aceite anaranjado el cual cristaliza. Rendimiento: 300 g (100%). MS (ES) m/z 249 [M+1]+.

Preparación 6 5-(ter-Butildimetilsililoxi)-3-yodo-1 H-indazol Se enfrió una solución de 5-(ter-butildimetilsililoxi)-1 H-indazol (300.00 g, 1.21 mol) en DCM (4.00 L) a 10 °C en un recipiente de reactor enchaquetado de 10 L. A la solución resultante se agregó N-yodosuccinimida (298.89 g, 1.33 mol) en porciones durante 0.5 horas. Se agitó la mezcla a RT por 3 horas para dar conversión completa como se indica por espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS) y cromatografía de capa delgada (TLC). Se enfrió la mezcla a 10 °C y se apagó con agua (2.5 L). Se transfirió la mezcla a un embudo separador y se extrajo la capa acuosa en DCM (2.5 L). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con una solución acuosa de tiosulfato de sodio al 10% (5 L) y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, filtró y concentró in vacuo para proporcionar el compuesto del título como un sólido anaranjado. Rendimiento: 388 g (90%). MS (ES) m/z 375 [M + 1]+.

Preparación 7 5-(ter-Butildimetilsililoxi)-3-yodo-1 -(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1 H-indazol Se enfrió una solución de 5-(ter-butildimetilsililoxi)-3-yodo-1H-indazol (387.00 g, 1.08 mol) en DCM (2.50 L) y THF (1.00 L) a 10 °C en un recipiente de reactor enchaquetado de 10 L. A la mezcla resultante se agregó ácido metansulfónico (14.0 mL, 216.02 mmol), seguido por 3,4-dihidro-2H-pirano (296 mL, 3.24 mol) durante 0.5 horas, observando un ligero exoterma. Se agitó la mezcla a RT por 3 horas. Se enfrió la reacción a 10 °C y se apagó con bicarbonato de sodio acuoso saturado (2 L). Se diluyó la mezcla con agua (2 L) y se extrajo la capa acuosa con DCM (2 L). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2 L) y salmuera. Se secó la mezcla orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, filtró y concentró in vacuo. El residuo se eluyó a través de una almohadilla de gel de sílice con eluyente (0 a 10% de EA/hexanos) para dar el compuesto del título. Rendimiento: 150 g (31%). MS (ES) m/z 459 [M + 1] Preparación 8 (E)-1-(Tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(2-(1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1 H-pirazol-4-il)vinil)-1 H-indazol-5-ol Se roció con nitrógeno una mezcla de 5-(ter-butildimetilsililoxi)-3-yodo-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-1 H-indazol (14 g, 30.54 mmol) en DMF (150 mL) en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 500 mL equipado con agitador magnético, sonda de temperatura, y condensador con septo por 10 minutos. A la solución resultante se agregó tributilamina (TBA, 6.7 g, 36.1 mmol) y 4,4,5,5-tetrametil-2-vinil-1 ,3,2-dioxaborolano (7.0 g, 43.18 mmol) y se continuó rociando por 10 minutos. A la mezcla resultante se agregó cloruro de bis(trifenilfosfina)paladio (II) (0.45 g, 0.63 mmol) y se continuó rociando por unas 0.5 horas adicionales. Se calentó la mezcla a 95-100 °C por 18 horas. Se enfrió la mezcla de reacción por debajo de 40 °C y se cargó con 4-yodo-1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1H-pirazol (9.8 g, 30.42 mmol). A la mezcla resultante se agregó octahidrato hidróxido de bario (19.3 g, 60.3 mmol) y agua (13 mL) y se continuó rociando por 10 minutos. Se agregó complejo de DCM de cloruro de 1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno paladio (II) (1.3 g, 1.56 mmol) a la reacción y se continuó agitando 0.5 horas. Se calentó la mezcla a 95 °C bajo nitrógeno por 3 horas. Se diluyó la mezcla con EA y se filtró a través de una almohadilla de Celite®. Se lavó la almohadilla con salmuera (400 mL) y se separaron las capas filtradas. Se lavó la capa orgánica con salmuera y se extrajeron las capas acuosas combinadas con EA. Se combinaron las soluciones orgánicas y concentraron a un aceite marrón. Se disolvió el aceite en DCM (100 mL) y se agregó a una almohadilla de gel de sílice. Se eluyó la almohadilla con eluyente (50% de EA en hexanos seguido por 70% de EA en hexanos) para proporcionar un aceite ligeramente marrón. Se trituró con MTBE (100 mL) para proporcionar el compuesto del título como un sólido. Rendimiento: 5 g (37%). MS (ES) m/z 439 [M + 1]+.

Preparación 9 5-((R)-1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etoxi)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-((E)-2-(1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1H-pirazol-4-il)vinil)-1 H-indazol En un matraz de fondo redondo de 250 mL de 3 cuellos equipado con una sonda de temperatura interna, condensador a reflujo, manto de nitrógeno y barra agitadora magnética, se sometió a suspensión (E)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-(2-(1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1 H-pirazol-4-il)vinil)-1 H-indazol-5-ol (10.0 g, 22.83 mmol) y carbonato de cesio (7.88 g, 23.94 mmol) en ACN (92 mL) y se calentó a 60 "C. A la suspensión, se agregó metansulfonato de (S)-1-(3,5-dicloropiridin-4-il)etilo (7.03 g, 26.02 mmol) y se agitó durante la noche. Se enfrió la mezcla de reacción a RT, se filtró y lavaron los sólidos con ACN. Se concentró lo filtrado y se purificó el residuo por cromatografía en gel de sílice (2-4% (2 M amoníaco en metanol)/DCM). Se combinaron las fracciones del producto y concentraron in vacuo a una espuma blanca. Rendimiento: 12.5 g (86%). MS (ES) m/z 612 [M + 1]+.

Preparación 10 (la forma amorfa) (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etoxi)-1H-indazol-3-il) 1 H-pirazol-1-il)etanol Se cargó un matraz de fondo redondo de 250 mL de 3 cuellos, equipado con un embudo adicional, entrada de nitrógeno, sonda de temperatura interna y agitador magnético con metanol (57 mL) y se enfrió en un baño de hielo. A la solución resultante, se agregó cloruro de acetilo (20 mL, 281.03 mmol) lentamente a través de un embudo adicional. A la solución, se agregó 5-((R)-1 -(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1-(tetrahidro-2H-piran-2-il)-3-((E)-2-(1-(2-(tetrahidro-2H-piran-2-iloxi)etil)-1 H-pirazol-4-il)vinil)-1 H-indazol (7.1 g, 11.59 mmol) disuelto en metanol (40 mL) vía embudo de adición. Después que la adición se completó, se removió el baño de hielo, se calentó a RT y se agitó la mezcla por 4 horas. Se concentró la mezcla de reacción in vacuo a una espuma amarilla. Se disolvió la espuma amarilla en metanol (10 mL) y se agregó lentamente a una solución saturada de bicarbonato de sodio (120 mL). Se agitó la mezcla a RT por 30 minutos. Se filtró la mezcla, el sólido se lavó con agua (100 mL), y secó bajo vacío. Se recristalizó el sólido de EA/metanol/hexanos caliente para dar el compuesto del título como un sólido blanco. Rendimiento: 2.1 g (41%). MS (ES) m/z 444 [M + 1]+.

Ejemplo 1 (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etoxi)-1H-indazol-3-il)v¡nil)-1 H-pirazol-1-il)etanol Forma de monohidrato 1: Un recipiente de reacción se purgó con nitrógeno y cargó con (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-dicloropiridin-4-M)etoxi)-1H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1-il)etanol y una mezcla de solvente que consiste de 11% de agua/acetonitrilo. La suspensión resultante se calentó a una temperatura interna de 66- 68 °C produciendo una solución. La solución se enfrió lentamente a 56-58 °C, después se sembró con una suspensión de cristales sembrados en 11% de una mezcla de agua/acetonitrilo y se agitó lentamente. La mezcla de reacción se enfrió inicialmente hasta 48-50 °C y después a 19-20 °C. El producto se aisló por filtración en la presencia de corriente de nitrógeno con una humedad relativa de al menos 80% pasando a través de la torta sólida. El nivel de humedad en la corriente de nitrógeno es entonces subsecuentemente cambiado a 40% y el secado continúa, resultando en la producción del compuesto del titulo. Se observa que el cristal sembrado es similarmente obtenido como sigue: Un recipiente de reacción se purgó con nitrógeno y cargó con (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1 -(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -iljetanol y una mezcla de solvente que consiste de 11% de agua/acetonitrilo. La suspensión resultante se calentó a una temperatura interna de 70 °C produciendo una solución. La solución es entonces enfriada lentamente, dejada cristalizar, filtrada y secada. Este compuesto es un potente inhibidor de FGFR y puede tener las propiedades ventajosas relativas a la forma previa de propiedades superiores de manejo de sólidos a gran escala, facilidad de purificación por cristalización, y estabilidad termodinámica bajo condiciones de procesamiento farmacéutico y almacenaje.

El Compuesto del Ejemplo 1, XRPD Se recolectó el patrón de XRPD usando un difractómetro PANalytical X'Pert™ Pro MPD PW3040 Pro, equipado con una radiación CuKa (? = 1.54059 A (voltaje: 45kV y amperaje: 40 mW)) producida usando una fuente de enfoque fino larga Optix. El espécimen es intercalado entre películas de 3 mieras de espesor, analizado en geometría de transmisión, y rotado a 1 revolución por segundo para optimizar las estadísticas de orientación. Previo al análisis, un espécimen de silicio (material de referencia estándar de NIST 640c) se analizó para verificar la posición del pico 111 de silicona. Se analizó un patrón analítico para este material, y se valoraron la orientación preferida y efectos estáticos de partícula a través de la comparación del patrón de XRPD simulado de análisis de cristal único. Se usó un espejo de capas múltiples de grado elíptico para enfocar los rayos-X de Cu Ka de la fuente a través del espécimen y sobre el detector. Los patrones de difracción se recolectaron usando un detector sensible a la posición de exploración (X'Celerator) localizado 240 mm del espécimen. Los datos son recolectados de 1.01 a 39.99 grados 2T con un tamaño de etapa de 0.017 grados 2T y una velocidad de exploración de 1.2 grado/min y con una apertura de divergencia de 0.5 grados y una apertura de dispersión de 0.25 grados. Se usó una parada de haz para minimizar el antecedente generado por dispersión de aire. Las ranuras de Soller se ) usaron para los haces incidentes y de difracción para minimizar la divergencia axial. Los picos observados se muestran en la Tabla 1. Se usó un umbral de intensidad de 5%.

Tabla 1. Picos observados para el Compuesto del Ejemplo 1, XRPD Tabla 1 cont.

De este modo, una muestra apropiadamente preparada del Ejemplo 1 puede ser caracterizada por el patrón de difracción de rayos-X usando radiación CuKa ya que tiene picos de difracción (valores 2-teta) como se describe en la Tabla 1, y en particular que tiene picos a 14.65 en combinación con uno o más de los picos a 3.54, 12.51, y 19.16; y más particularmente que tiene un pico a 14.65; con una tolerancia para los ángulos de difracción de 0.1 grados, más preferiblemente 0.01 grados.

La regulación aberrante de la trayectoria de FGF/FGFR ha estado implicada en muchas formas de malignidades humanas. Los FGFRs y FGFs son a menudo sobre-expresados en numerosos cánceres, y su expresión a menudo se correlaciona con mal pronóstico. La activación de mutaciones en el dominio cinasa de FGFR se ha encontrado en varios tipos de tumores, que incluyen mama, NSCLC, vejiga, gástrico, próstata, colon y mieloma múltiple. La amplificación genómica del locus FGFR también se detectó en muchos pacientes con cáncer de mama, gástrico y de pulmón. La sobre-expresión de FGFRs o FGFs se ha encontrado en muchos tipos diferentes de tumores tales como cáncer de vejiga, mieloma múltiple, próstata y de pulmón. Otros cánceres que podrían beneficiarse de la terapia inhibidora de la trayectoria de la familia del FGFR incluyen AML, cáncer hepático, melanoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de tiroides, cáncer pancreático, cáncer de células renales, glioblastoma, y cáncer testicular. Además de sus papeles en la formación y progreso del tumor, los FGF y FGFRs también son reguladores clave de angiogénesis, especialmente durante el crecimiento del tumor. El eje FGF/FGFR también juega un papel importante en el aumento de otras células estromales del tumor tales como fibroblastos asociados a cáncer. La regulación ascendente de FGFs también conduce a resistencia a quimioterapias anti-angiogénicas y otras. Finalmente, los inhibidores de molécula pequeña de FGFRs han demostrado actividades anti-tumorales en varios modelos de tumor preclínicos y están siendo explorados en la clínica. Tomados en conjunto, la trayectoria FGF/FGFR es esencial a varios procesos celulares importantes en células de cáncer. Por estas razones, terapias basadas en la señalización de FGFRs/FGF objetivos puede afectar tanto las células tumorales directamente como de angiogénesis tumoral.

La Preparación 10 es probada esencialmente como se describe abajo en los siguientes ensayos: Ensayo de Enzima FGFR1 (Enlace de Filtro), el Ensayo de Enzima FGFR3 (Enlace de Filtro), p-ERK inducido por FGF9 en ensayo a base de células RT-112 (en la presencia de BSA) y la Detección AlphaScreen SureFire de fosforilación ERK (Thr202/Tyr204) en ensayos a base de células de las Células Endoteliales de la Vena Umbilical Humana (HUVEC). Estos ensayos demuestran que la Preparación 10 es un inhibidor de la trayectoria de la familia FGFR y tiene actividad anti-cancerígena. De este modo, resultados con la forma amorfa de (R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-Dicloropiridin-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1-il)etanol son indicativos de resultados con el compuesto de la presente invención. Formas cristalinas del compuesto son todavía ventajosas debido a que pueden ofrecer las propiedades relativas a la forma previa de propiedades superiores de manejo de sólidos a gran escala, facilidad de purificación por cristalización, y estabilidad termodinámica bajo condiciones de procesamiento farmacéutico y almacenaje.

Ensayo de Enzima FGFR1 y FGFR3 (Enlace de Filtro) Se incuba cinasa FGFR1 o FGFR3 (0.15 ng/µ?. de FGFR1 humano o 0.32 ng/µ? de FGFR3 humano) en 50 µ?_ de un amortiguador que contiene 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetan-sulfónico (HEPES) pH 7.5, 8 mM de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCI), pH 7.5, 5.0 mM de d iti otreitol (DTT), 10.0 µ? de adenosina trifosfato (ATP), 10 mM de MnCI2, 150 mM de NaCI, 0.01% de TRITON®' X-100, 0.5 pCi de 33P-ATP, y 0.05 g/µL de Poly(Glu-Tyr). La reacción se llevó a cabo en un volumen de 50 iL a RT por 30 minutos y después se apagó agregando 130 µ? de 10% de H3P04. La reacción (120 pL) se transfirió a una placa de filtro de fibra de vidrio de 1.0 µ?t? de 96 cavidades, incubó a RT por 20-30 minutos y después se lavó 3x en un Zoom TITERTEK® con 0.5% de H3P04. Las cavidades se secaron en aire antes de la adición de 40 p L de MicroScint 20 (Packard) y después se contaron en un contador Wallac Micobeta. Para inhibición del compuesto, el compuesto se proporcionó como pilas de 1 0 m M en dimetil sulfóxido (DMSO). El compuesto es diluido serialmente 1 : 3 en 20% de DMSO para crear una curva de respuesta de concentración de 1 0 puntos y se diluye 1 : 5 (20 µ ? a 0.001 µ? final en 4% de concentración final de DMSO) en la placa de reacción previo a la adición de la mezcla de reacción en la placa de filtro para determinar la actividad del compuesto. Las cavidades de control contienen 4% de DMSO solamente mientras la línea base se establece por cavidades de control que contienen 0. 1 M de ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) . Los valores de porcentaje de inhibición para cada una de las 1 0 concentraciones se calculan de las cavidades de control en cada placa y los datos de respuesta de concentración de 10 puntos son analizados subsecuentemente usando software ActivityBase (I DBS) usando una ecuación logística de 4 parámetros y se estiman los valores I Cso absolutos a partir del ajuste de curva resultante . Los ensayos de enzima FGFR1 y FGFR3 tienen Relaciones Significantes Mínimas (MSR) para el I C50 estimado de 1 .38 y 1 .47 , respectivamente. Los resultados I C50 para la Preparación 1 0 para FGFR1 y FGFR3 en estos ensayos son estimados por ser 0.0077 y 0.0064 µ ? , respectivamente. Estos datos demuestran que la Preparación 1 0 es un inhibidor de enzima FGFR 1 y FGFR3 potente. p-ERK inducido por FGF9 con BSA Se sembraron células de carcinoma de vejiga humana RT112 a una densidad de 5,000 células por cavidad en 100 µ?_ de RPMI 1640 (Gibco 11875-085) suplementadas con 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco 10082-147) y 1% de una solución de penicilina/estreptomicina (Gibco 15140-122) en placas de 96 cavidades CELLBIND® (Corning 3340) e incuban durante la noche a 37 °C. A la siguiente mañana el medio de crecimiento se elimina y reemplaza con 100 µ?_ de RPMI 1640 suplementado con 20 mg/mL de albúmina de suero bovino (BSA). Después de 3 horas de incubación a 37 °C, 20 µ? de compuestos diluidos serialmente 3x en RPMI 1640 con 20 mg/mL BSA en 6% de DMSO se agregan a cada cavidad. Esto proporciona una curva de respuesta de dosis de 10 puntos que varía desde 10 - 0.005 µ? en 1% de DMSO. La incubación se continúa por 1 hora a 37 °C. Las células son estimuladas con 50 iL de una solución FGF9 de 50 µg mL (R&D Systems 273-F9) en RPMI libre de suero para dar una concentración final de 500 ng/mL de FGF9. Las células son fijadas por la adición de 30 µ? de una solución de formaldehído al 25% en salina amortiguada de fosfato (PBS) (3.7% de concentración final de formaldehído), e incubadas 30 minutos a RT. Las células son lavadas 3x con PBS, seguido por la adición de 100 iL de metanol frío e incuban por 30 minutos a -20 °C. El metanol se elimina y las células son tratadas con PBS que contiene 0.1% de TRITON® X-100 (PBST), se lavan 3x con PBS, e incuban por 15 minutos a RT. Las células son entonces incubadas durante la noche a 4 °C con agitación vigorosa en 50 \ L de una dilución 1:400 del anticuerpo primario MAPK p-p44/42 (Señalización Celular 9101S) en PBS suplementado con 2% de BSA, 0.01% de Cóctel 1 Inhibidor de Fosfatase (Sigma P2850) , 0.01 % de Cóctel 2 I nhibidor de Fosfatasa (Sigma P5726), y 0.01 % de Cóctel I nhibidor de Proteasa (Sigma P8340). A la siguiente mañana, las placas son lavadas 2x con PBST y 2x con PBS, seguido por incubación de 1 hora a RT en la oscuridad en 80 uL de una dilución 1 : 1 000 de anticuerpo secundario H + L anti-conejo IgG de cabra Alexa Fluor 488 (I nvitrogen A1 1034) en PBS con 1 % de BSA y 0.1 % de Cóctel 1 I nhibidor de Fosfatasa, 0.01 % de Cóctel 2 I nhibidor de Fosfatasa , y 0.01 % de Cóctel I nhibidor de Proteasa. Las células se lavaron 3x con PBS, seguido por la adición de 100 \i l de una dilución 1 : 200 de yoduro de propidio (Pl ) (Sonda Molecular P-3566) en PBS y después incubadas en la oscuridad por 1 hora. Se identifican células positivas p-ERK y células totales por cavidad con el ACUMEN EXPLORER™ (TTP LabTech Ltd) usando filtro óptico de 500-530 nM y 575-640 nM para Alexa 488 y Pl , respectivamente. La intensidad media total para pERK/cavidad usando los valores Alexa 488 se convierten subsecuentemente a porcentaje de inhibición usando valores obtenidos de corridas de control MI N ( 1 0 µ? de compuesto de control positivo en DM SO) y MAX (DMSO solo) en la misma placa. Los valores de porcentaje de inhibición y los datos de respuesta de concentración de 1 0 puntos son subsecuentemente analizados usando una ecuación de respuesta de dosis sig moidal de 4 parámetros y los valores IC50 relativos son estimados a partir de la cuerva resultante. El p-ERK inducido por FGF9 con ensayo BSA tiene una Relación Significante Mínima (MSR) para el I C50 estimado de 2.7. El IC5o para la Preparación 10 en este ensayo se estima por ser 0.0004 µ?.

Estos datos demuestran que la Preparación 10 es un potente inhibidor de fosforilación ERK inducida por FGF9 en células de cáncer humano.

Detección por AlphaScreen SureFire de fosforilación de ERK (Thr202/Tyr204) en Células Endoteliales de la Vena Umbilical Humana (HUVEC) El efecto del compuesto en la inhibición del receptor 1 de FGF se mide monitoreando la fosforilación de ERK (pERK) en respuesta a la estimulación del factor de crecimiento del Fibroblasto básico en células Endoteliales Umbilicales Humanas (HUVEC). Los niveles de pERK formados se miden usando el sistema ALPHASCREEN® SUREFIRE® (TGR Biosciences, TGRES50K). Este es un formato de ensayo homogéneo utilizando la captura inmuno-intercalación del analito fosforilado seguido por detección usando perlillas ALPHASCREEN® (Perkin Elmer) recubiertas de anticuerpo para generar una señal amplificada.

Se recuperaron células HUVEC y mantuvieron en medio de crecimiento que consiste de medio basal de células endoteliales (Clonetics, CC-3132) suplementado con 10% de FBS 0.4% de extracto de cerebro bovino, 0.1% de hidrocortisona, 0.1% de anfotericina-B de sulfato de gentamicina y 0.1% de factor de crecimiento epidermal, recombinación humana hasta el pasaje 7. Para el ensayo, las células se recolectaron por procedimientos estándares y después se contaron. Las células (20,000/cavidad) se plaquearon en 100 µ? de medio de crecimiento en placas recubiertas de Poli-D-lisina de 96 cavidades (BD, 354640). Las placas se incuban durante la noche a 37 °C, 5% de C02.

En el día del ensayo, las células son desprovistas de suero en 100 µ?_ de medio EBM (célula endotelial basal) que contiene 1.5% de FBS y 20 mg/mL de BSA por 3 horas a 37 °C, 5% de C02, después son tratadas con 20 µ? de compuesto diluido serialmente 3x en medio de inanición por 1 hora a 37°C. Esto proporciona una curva de respuesta de concentración de 10 puntos variando de 10-0.005 µ? en 1% de DMSO. Después de 1 hora de tratamiento con compuesto, las células son estimuladas con 50 µ?. de b-FGF (Sigma, F0291, concentración final de b-FGF 50 ng/mL) a 37 °C por 15 minutos. En las cavidades que contienen las células y 50 µ?. de estimulador de b-FGF proporcionan la señal MAX, y células con 10 µ? de compuesto de control positivo y 50 µ? de estimulador b-FGF como MIN. El medio es entonces removido y se agregan/cavidad 50 µ?_ de amortiguador de Lisis 1x SUREFIRE® (Componente de Kit TGR Biosciences SUREFIRE®) y la incubación continua a RT por 10 minutos con agitación vigorosa. Para detección de pERK, se transfieren 6 µ?_ de lisado y 10 µ?_ de mezcla de reacción (60 partes de amortiguador de reacción/10 partes de amortiguador de activación/0.6 partes de cada una de las perlillas donadoras y aceptoras, Perkin Elmer, 6760617R) a una proxiplaca de 384 cavidades (Perkin Elmer, 6006280). La placa se sella e incuba a RT por 2 horas con sacudimiento vigoroso y después se lee en el lector de placa Perkin Elmer EnVision equipado con un TurboModule usando ajustes ALPHASCREEN® estándares (Ex68onm y EmS2o-62onm)- Los datos de emisión se convierten a porcentaje de inhibición determinado de controles MAX (DMSO solo) y MIN (10 µ? de compuesto de control positivo en DMSO) en cada placa y los datos de concentración de compuesto de diez puntos son entonces ajustados a una ecuación logística de cuatro parámetros usando ACTIVITYBASE® 4.0 y se estima el IC50. La Detección ALPHASCREEN® SUREFIRE® del ensayo de fosforilación ERK ((Thr202/Tyr204) tiene una Relación Significante Mínima (MSR) para el IC50 de 2.1. El IC50 de la Preparación 10 en este ensayo se estima por ser 0.0006 µ?. Estos datos demuestran que la Preparación 10 es un potente inhibidor de fosforilación ERK inducida por bFGF en Células Endoteliales Umbilicales Humanas.

El compuesto de la presente invención es preferiblemente formulado como una composición farmacéutica administrada por una variedad de rutas. Muy preferiblemente, tales composiciones son para administración intravenosa u oral. Tales composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Idéase, por ejemplo., REMINGTON: THE SCIENCE y PRACTICE OF PHARMACY (D. Troy, et al., eds., 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005).

Los compuestos de la presente invención son en general efectivos sobre un amplio intervalo de dosificaciones. Por ejemplo, dosificaciones por día normalmente caen dentro del intervalo de aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En algunos casos los niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo mencionado anteriormente pueden ser más que adecuados, mientras en otros casos dosis todavía más grandes pueden ser empleadas sin causar algunos efectos secundarios peligrosos, y por lo tanto el intervalo de dosificación anterior no se pretende para limitar el alcance de la invención en cualquier forma. Se entenderá que la cantidad del compuesto actualmente administrado será determinada por un especialista, en vista de las circunstancias relevantes, incluyendo la condición a ser tratada, la ruta de administración elegida, el compuesto actual o compuestos administrados, la edad, peso y respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto caracterizado porque es ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il)vin¡l)-1 H-pirazol-1 -il)etanol cristalino.

2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es monohidrato de ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-dicloropiridin-4-il)etoxi)-1 H-indazol-3-il) vi ni l)-1 H-pirazol-1 -i l)etanol cristalino.

3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque es aislado.

4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el compuesto es distinguido por el patrón de difracción en polvo de rayos-X (radiación Cu, ? = 1.54059 A) que comprende un pico a 14.65.

5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque además comprende un pico a 3.54 (2T +/- 0.1°).

6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4 o reivindicación 5, caracterizado porque además comprende un pico a 12.51 (2T +/- 0.1°).

7. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque además comprende un pico a 19.16 (2T +/- 0.1°).

8. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. RESUM EN La presente invención se refiere a (R)-(E)-2-(4-(2-(5-( 1 -(3, 5-dicloropiridin-4-il)etox¡)-1 H-indazol-3-il)vinil)-1 H-pirazol-1 -il)etanol cristalino útil en el tratamiento de cáncer.