MX2012000898A

MX2012000898A - Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.

Info

Publication number: MX2012000898A
Application number: MX2012000898A
Authority: MX
Inventors: Jean Xu; Jan Jensen
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2009-07-20
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2012-06-01
Also published as: ZA201201220B; US20110014703A1; CN102597219B; CN103952372A; CA2768720A1; AU2010276402B2; GB2485113A; WO2011011349A2; CA2768720C; GB201202848D0; RU2540016C2; CN103952372B; AR077766A1; US8785185B2; JP5819826B2; RU2012105924A; KR101786735B1; WO2011011349A3; SG177416A1; AU2010276402A1

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que coexpresan PDX1, NKX6.1, pero no expresan CDX2 ni NGN3.

Description

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUD RELACIONADA La presente invención redama prioridad a la solicitud con número de serie 61/226,929, presentada el 20 de julio de 2009.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un método es la generación de células ß funcionales a partir de células madre pluripotenciales, tales como, por ejemplo, las células madre embrionarias.

En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotencial da origen a un grupo de células que comprenden tres capas germinativas (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos, tales como, por ejemplo, la tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado, se desarrollan a partir del endodermo por medio de una etapa intermedia. La etapa intermedia de este proceso es la formación del endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan varios marcadores, tales como HNF3 beta, GATA4, MIXL1 , CXCR4 y SOX17.

La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la homeosecuencia pancreático-duodenal, PDX1. En ausencia de PDX1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de las yemas ventral y dorsal. Por ello, la expresión del Pdx1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos exocrino y endocrino surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.

Las células que portan las características de células de islotes se derivan, supuestamente, de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky y otros (Science 292:1389, 2001) describen la diferenciación de células madre embrionarias de ratón hacia estructuras secretoras de insulina similares a los islotes pancreáticos. Soria y otros (Diabetes 49:157, 2000) describen que las células secretoras de insulina derivadas de células madre embrionarias de ratón normalizan la glicemia de ratones con diabetes inducida por estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros (PNAS 99: 16105, 2002) describen que el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhibidores de fosfoinositido 3-quinasa (LY294002) produjo células que se asemejaban a las células ß.

En otro ejemplo, Blyszczuk y otros (PNAS 100:998, 2003) describen la generación de células productoras de insulina a partir de células madre embrionarias de ratón que expresan constitutivamente el Pax4.

Micallef y otros describen que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madre embrionarias para formar el endodermo pancreático y células positivas para PDX1. El ácido retinoico es más eficaz para inducir la expresión de Pdx1 cuando se agrega a los cultivos al día 4 de la diferenciación de las células madre embrionarias durante un período correspondiente al final de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54:301 , 2005).

Miyazaki y otros informan que una línea de células madre embrionarias de ratón sobreexpresan Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión exógena de Pdx1 mejoró, notablemente, la expresión de genes de insulina, somatostatina, glucocinasa, neurogenina 3, p48, Pax6 y HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).

Skoudy y otros informan que la activina A (un miembro de la superfamilia TGF-ß) regula a la alta la expresión de genes pancreáticos exocrinos (p48 y amilasa) y genes endocrinos (Pdx1 , insulina y glucagon) en células madre embrionarias de ratón. El efecto máximo se observó con el uso de 1 nM de activina A. También observaron que el nivel de expresión de insulina y del ARNm del Pdx1 no se vio afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con 3 nM de FGF7 produjo un aumento del nivel del transcrito para el Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

Shiraki y otros estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que mejoran, específicamente, la diferenciación de células madre embrionarias en células positivas para PDX1. Observaron que el TGF- 2 produjo, reproduciblemente, una proporción mayor de células positivas para PDX1 (Genes Cells junio 2005; 10(6): 503-16.).

Gordon y otros demostraron la iniciación de las células endodérmicas brachyura [positiva]/ HNF3 beta [positiva] a partir de células madre embrionarias de ratón en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de señalización de Wnt (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0003446A1 ).

Gordon y otros (PNAS, vol. 103, págs. 16806, 2006) afirman que: "se requirió la señalización simultánea de Wnt y TGF-beta/ nodal/ activina para generar la línea primitiva anterior".

Sin embargo, el modelo en ratones para el desarrollo de células madre embrionarias puede no imitar exactamente el programa evolutivo de mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, el ser humano.

Thomson y otros aislaron células madre embrionarias a partir de blastocistos humanos (Science 282:1 14, 1998). Concurrentemente, Gearhart y colaboradores derivaron líneas de células germinativas embrionarias humanas (hEG) a partir de tejido gonadal fetal (Shamblott y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 95:13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de ratón, cuya diferenciación puede evitarse simplemente mediante cultivos con el factor inhibidor de la leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), las células madre embrionarias humanas deben mantenerse en condiciones muy especiales (patente de los Estados Unidos núm. 6,200,806; patente núm. WO 99/20741 patente núm. WO 01/51616).

D'Amour y otros describen la producción de cultivos enriquecidos del endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y baja concentración de suero (Nature Biotechnology 2005). El transplante de estas células debajo de la cápsula renal de ratones produjo la diferenciación en más células maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células del endodermo definitivo derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse, además, en células positivas para Pdx1 después de la adición de FGF-10 (patente de los Estados Unidos núm. 2005/0266554A1 ).

D'Amour y otros (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) afirman: "Hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas: insulina, glucagon, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina. Este proceso imita la organogénesis pancreática "in vivo" al dirigir las células a través de etapas que se asemejan al endodermo definitivo, endodermo del tubo digestivo, endodermo pancreático y precursor endocrino hacia las células que expresan hormonas endocrinas." En otro ejemplo, Fisk y otros describen un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0040387A1). En este caso, la ruta de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero hacia el endodermo con el uso de una combinación de butirato de sodio y activina A. Después, las células se cultivaron con antagonistas del TGF-ß, tales como nogina, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo con nicotinamida.

En un ejemplo, Benvenistry y otros afirman: "Concluimos que la sobreexpresión de PDX1 , la expresión mejorada de genes pancreáticos enriquecidos y la inducción de la expresión de insulina pueden requerir señales adicionales que están presentes únicamente in vivo" (Benvenistry y otros, Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).

En otro ejemplo Grapin-Botton y otros declaran: "La activación temprana de Ngn3 indujo, casi exclusivamente, células glucagon+ mientras se redujo la fuente de progenitores del páncreas. A partir de E1 1 .5, los progenitores PDX1 se hicieron competentes para diferenciarse en células insulina [positivo] y PP [positivo]" (Johansson KA y otros, Developmental Cell 12, 457^165, marzo de 2007).

Por consiguiente, aún persiste la importante necesidad de generar condiciones para establecer líneas de células madre pluripotenciales que puedan expandirse para abordar las necesidades clínicas actuales y que al mismo tiempo retengan el potencial para diferenciarse en células pancreáticas endocrinas, células que expresan las hormonas pancreáticas o células secretoras de las hormonas pancreáticas. Hemos seleccionado un método alterno para mejorar la eficacia de diferenciar células madre embrionarias humanas en células pancreáticas endocrinas al generar una población de células que expresan los marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad la presente invención proporciona un método para diferenciar una población de células madre pluripotenciales en una población de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3; el método comprende las siguientes etapas: a. cultivar las células madre pluripotenciales, b. diferenciar las células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3 por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con un primer medio complementado con FGF7 y el cultivo posterior de las células en un segundo medio complementado con FGF7, un factor con la capacidad de inhibir BMP, activina A, ácido retinoico y un inhibidor de la vía de señalización Hedgehog.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto de la activina A en la expresión de NKX6.1 , PDX1 , PTF1 alfa y ARX en la etapa 3 del día 4 en las células tratadas de conformidad con los métodos descritos en el Ejemplo 1 . Los duplicados de las muestras se recolectaron para análisis de PCR en tiempo real. Los diagramas representan la iniciación para cada gen con relación al grupo control (franjas gris claro). Las franjas gris oscuro representan las células tratadas con FGF7, ciclopamina-KAAD, ácido retinoico, activina A a 20 ng/ml y nogina. Las franjas negras representan las células tratadas con FGF7, ciclopamina-KAAD, ácido retinoico, activina A a 50 ng/ml y nogina.

Las Figuras 2A-2F muestran imágenes de inmunofluorescencia que muestran la expresión de NKX6.1 (Figuras 2A, 2C y 2E) y NGN3 (Figuras 2B, 2D y 2F) en las células tratadas con FGF7 + nogina + ácido retinoico + KAAD-ciclopamina (Figuras 2A y 2B) o en las células tratadas con FGF7 + nogina + ácido retinoico + KAAD-ciclopamina + activina A a 20 ng/ml (Figuras 2C y 2D), así como en las células tratadas con FGF7 + nogina + ácido retinoico + KAAD-ciclopamina + inhibidor II Alk5 (Figuras 2E y 2F).

Las Figuras 3A-3D muestran imágenes de inmunofluorescencia que muestran la expresión de PDX1 (Figuras 3A y 3C), CDX2 (Figuras 3B y 3D) en las células tratadas con DMEM alto en glucosa con B27 al 1 % + FGF7 + nogina + ácido retinoico + KAAD-ciclopamina + activina A a 20 ng/ml (Figuras 3A y 3B) y en las células tratadas con DME /F12 alto en glucosa con B27 al 1 % + FGF7 + nogina + ácido retinoico + KAAD-ciclopamina + activina A a 20 ng/ml (Figuras 3C y 3D).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para una mayor claridad de la descripción, y no de manera limitante, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran determinadas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madre son células no diferenciadas que se definen por su habilidad en el nivel unicelular para autorrenovarse y diferenciarse para producir células de progenie, que incluyen progenitores con capacidad de autorrenovación, progenitores que no se renuevan y células terminalmente diferenciadas. Las células madre se caracterizan, además, por su habilidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de diversos linajes de células de múltiples capas germinativas (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como originar tejidos de múltiples capas germinativas después del trasplante y contribuir con prácticamente la mayor parte de los tejidos, si no todos, después de inyectados en los blastocistos.

Las células madre, según su potencial de desarrollo, se clasifican en: (1) totipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotenciales, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotenciales restringidos a glóbulos rojos y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo más restringido de linajes celulares que las células madre multipotenc'iales; y (5) unipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

Diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada, tal como por ejemplo, una célula del sistema nervioso o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida por diferenciación es aquella que ha asumido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometida", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en el trayecto de la diferenciación hasta un punto en donde, en circunstancias normales, seguirá diferenciándose en un tipo celular o un subconjunto de tipos celulares específicos y no podrá, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente ni revertirse a un tipo celular menos diferenciado. La "desdiferenciación" se refiere a un proceso en virtud del cual una célula se revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro de un linaje celular. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células vino y a qué células podrá dar origen. El linaje de una célula coloca la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico del linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida en un linaje de interés.

Las "células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo", "células de la etapa 1" o "etapa 1", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: SOX-17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen células precursoras de la linea primitiva, células de la línea primitiva, células mesendodérmicas y células del endodermo definitivo.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, NKX6.1 o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen células del endodermo pancreático, células del tubo intestinal primitivo y células del intestino posterior.

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX 7, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1 .

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, la expresión diferencial se refiere a un nivel aumentado de un marcador positivo y un nivel disminuido de un marcador negativo. El nivel perceptible del ácido nucleico o polipéptido marcador es suficientemente mayor o menor en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés se puede identificar y distinguir de otras células con el uso de cualquiera de la gran variedad de métodos conocidos en la materia.

"Célula endocrina pancreática" o "célula que expresa la hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula con la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotenciales Caracterización de células madre pluripotenciales Las células madre pluripotenciales pueden expresar uno o más de los antigenos embrionarios específicos de la etapa (SSEA, por sus siglas en inglés) 3 y 4, y marcadores perceptibles con el uso de anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotenciales ¡n vitro produce la pérdida de expresión de SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81 (si está presente) y la expresión incrementada de SSEA-1. Las células madre pluripotenciales no diferenciadas tienen, típicamente, actividad de fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar al fijar las células con paraformaldehído al 4 % y, después, desarrollarlas con Vector Red como sustrato, tal como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Generalmente, las células madre pluripotenciales indiferenciadas expresan, además, Oct-4 y TERT, como se detecta por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotenciales propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinativas: tejido endodérmico, mesodérmico y ectodérmico. La piuripotencialidad de las células madre pluripotenciales se puede confirmar, por ejemplo, al inyectar las células en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID, por sus siglas en inglés), preparar los teratomas que se forman con el uso de paraformaldehído al 4 % y, después, examinarlos histológicamente para comprobar la presencia de los tipos de células de las tres capas germinativas. Alternativamente, se puede determinar la piuripotencialidad mediante la creación de cuerpos embrioides y análisis de estos cuerpos embrioides para comprobar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinativas.

Las líneas de células madre pluripotenciales propagadas se pueden cariotipar con el uso de una técnica estándar de bandas G y se pueden comparar con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un "cariotipo normal", lo que significa que las células sean euploides, en donde todos los cromosomas humanos estén presentes y no estén visiblemente alterados.

Fuentes de células madre pluripotenciales Los tipos de células madre pluripotenciales que se podrían usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotenciales derivadas del tejido formado después de la gestación, incluso del tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, generalmente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Los ejemplos no limitantes son líneas establecidas de células madre embrionarias humanas o células germinativas embrionarias humanas, tales como, por ejemplo las líneas de células madre embrionarias humanas H 1 , H7 y H9 (WiCell). Se considera, además, el uso de las composiciones de la presente invención durante el establecimiento inicial o estabilización de dichas células, en cuyo caso las células de origen serían las células pluripotenciales primarias tomadas directamente de los tejidos de origen. Son adecuadas, además, las células tomadas de la población de células madre pluripotenciales ya cultivada en ausencia de células alimentadoras. Son adecuadas, además, las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).

En una modalidad las células madre embrionarias humanas se preparan como se describe en Thomson y otros, (patente de los Estados Unidos núm. 5,843,780; Science 282:1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 92:7844, 1995).

Cultivo de células madre pluripotenciales En una modalidad las células madre pluripotenciales se cultivan, típicamente, sobre una capa de células alimentadoras que sustenta las células madre pluripotenciales de distintas maneras. Alternativamente, las células madre pluripotenciales se cultivan en un sistema de cultivo prácticamente libre de células alimentadoras, pero aún así, sustenta la proliferación de las células madre pluripotenciales sin experimentar una diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre pluripotenciales en cultivos libres de células alimentadoras sin diferenciación se sustenta con el uso de un medio condicionado mediante el cultivo previo con otro tipo de células. Alternativamente, el crecimiento de las células madre pluripotenciales en un cultivo libre de células alimentadoras sin diferenciación se sustenta con un medio químicamente definido.

Por ejemplo, Reubinoff y otros, (Nature Biotechnology 18: 399 -404 (2000)) y Thompson y otros, (Science 6 de noviembre de 1998: Vol. núm. 282, págs. 5391 1145 - 1147) describe el cultivo de líneas de células madre pluripotenciales a partir de blastocistos humanos con el uso de una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón.

Richards y otros (Stem Cells 21 : examinaron un grupo de once capas distintas de células alimentadoras humanas adultas, fetales y neonatales para analizar su capacidad de sustentar el cultivo de células madre pluripotenciales humanas. Richards y otros declaran: "las líneas de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre células alimentadoras de fibroblastos de piel adulta conservan la morfología de la célula madre embrionaria humana y permanecen pluripotenciales".

La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 17 describe las lineas celulares que producen medios que sustentan el crecimiento de células madre pluripotenciales de primates en cultivos libres de células alimentadoras. Las líneas celulares usadas son líneas de células mesenquimales y de células similares a fibroblastos obtenidas del tejido embrionario o diferenciadas a partir de las células madre embrionarias. La patente de los Estados Unidos núm. 200200721 17 describe, además, el uso de las líneas celulares como una capa primaria de células alimentadoras.

En otro ejemplo Wang y otros (Stem Cells 23: describen los métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotenciales humanas sobre capas de células alimentadoras derivadas de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo Stojkovic y otros (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) describen un sistema de células alimentadoras derivadas de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.

En un ejemplo más, Miyamoto y otros (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen una fuente de células alimentadoras que se obtienen a partir de la placenta humana.

Amit y otros, (Biol. Reprod 68: describen una capa de células alimentadoras derivadas de prepucio humano.

En otro ejemplo Inzunza y otros (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa de células alimentadoras a partir de fibroblastos de prepucio postnatal.

La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 describe los medios que sustentan el crecimiento de células madre pluripotenciales de primates (pPS, por sus siglas en inglés) en un cultivo libre de células alimentadoras, así como líneas celulares útiles para la producción de tales medios. La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 declara: "la presente invención incluye líneas de células mesenquimales y de células similares a fibroblastos obtenidas del tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madre embrionarias. Los métodos para obtener tales líneas celulares, procesar los medios y cultivar las células madre con el uso de los medios condicionados se describen y se ilustran en la presente descripción." En otro ejemplo, la patente núm. WO20050 4799 describe el medio acondicionado para el mantenimiento, proliferación y diferenciación de células de mamíferos. La patente núm. WO2005014799 establece: "El medio de cultivo producido de conformidad con la presente invención está acondicionado mediante la actividad de secreción celular de células murinas, particularmente aquellas diferenciadas y hepatocitos transgénicos inmortalizados llamados hepatocitos murinos met (MMH, por sus siglas en inglés)." En otro ejemplo Xu y otros (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describen un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificadas genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa inversa de la telomerasa humana.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 200700100 1 describe un medio de cultivo químicamente definido para el mantenimiento de células madre pluripotenciales.

Un sistema de cultivo alterno usa un medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento capaces de promover la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen un sistema de cultivo libre de células alimentadoras y libre de suero, en el cual las células madre embrionarias se mantienen en un medio no condicionado de reemplazo de suero (RS) suplementado con distintos factores de crecimiento capaces de activar la autorrenovación de las células madre embrionarias.

En otro ejemplo Levenstein y otros (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias en ausencia de fibroblastos o de un medio condicionado, con el uso de medios suplementados con bFGF.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070 describe un método para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras de fibroblastos; el método comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, por lo menos una transferrina o sustituto de transferrina, por lo menos una insulina o sustituto de insulina, con el medio de cultivo prácticamente libre de suero fetal de mamíferos y con por lo menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento de fibroblastos con la capacidad de activar el receptor de señalización del factor de crecimiento de fibroblastos, en donde el factor de crecimiento proviene de una fuente diferente a únicamente la capa alimentadora de fibroblastos, el medio sustenta la proliferación de las células madre en un estado indiferenciado sin células alimentadoras o un medio condicionado.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 20050233446 describe medios definidos útiles para cultivar células madre, incluso células madre primordiales primarias indiferenciadas. En solución los medios son sustancialmente isotónicos en comparación con las células madre que se están cultivando. En un cultivo específico el medio en particular comprende un medio base y una cantidad necesaria de bFGF, insulina y ácido ascórbico para sustentar el crecimiento sustancialmente indiferenciado de las células madre primordiales.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 6800480 declara: "En una modalidad se proporciona un medio de cultivo de células para cultivar células madre primordiales derivadas de primates en un estado sustancialmente indiferenciado que incluye una baja presión osmótica, un medio básico bajo en endotoxinas efectivo para sustentar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates. El medio básico está combinado con un suero nutritivo efectivo para sustentar el crecimiento de células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en células alimentadoras y un componente de matriz extracelular derivado de células alimentadoras. El medio incluye, además, o aminoácidos no esenciales, un antioxidante, un primer factor de crecimiento seleccionado del grupo que consiste en nucleósidos y una sal de piruvato." En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 20050244962 declara: "En un aspecto la invención proporciona un método para cultivar células madre embrionarias de primates. Se cultivan las células madre en un cultivo prácticamente libre de suero fetal de mamíferos (preferentemente, prácticamente también libre de cualquier suero animal) y en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos que se obtiene de una fuente diferente a únicamente una capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida la capa alimentadora de fibroblastos, requerida previamente para sustentar un cultivo de células madre, se hace innecesaria por la adición de suficiente factor de crecimiento de fibroblastos." En un ejemplo más la patente núm. WO2005065354 describe un medio de cultivo definido e isotónico prácticamente libre de células alimentadoras y libre de suero; el medio de cultivo comprende: a. un medio basal; b. una cantidad de bFGF suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente indiferenciadas; c. una cantidad de insulina suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente ¡ndiferenciadas; y d. una cantidad de ácido ascórbico suficiente para sustentar el crecimiento de células madre de mamíferos sustancialmente ¡ndiferenciadas.

En otro ejemplo la patente núm. WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada; el método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor transformador del crecimiento beta (TGF-ß), un miembro de la familia de proteínas de crecimiento de fibroblastos (FGF) o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.

Las células madre pluripotenciales se pueden sembrar en un sustrato de cultivo adecuado. En una modalidad el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, los derivados de la membrana basal o que podrían formar parte de los acoplamientos de moléculas de adhesión ligando-receptor. En una modalidad el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se hace gel a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como una alternativa. Según el tipo de células que se está proliferando, este puede incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano y similares, solos o en combinaciones diversas.

Las células madre pluripotenciales pueden se pueden sembrar en el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia de las células, la propagación y la retención de las características deseadas. Todas estas características se benefician de una atención cuidadosa de la distribución de la siembra y pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la materia.

Un medio de cultivo adecuado se puede hacer a partir de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 1 1965-092; Medio Eagle modificado de Dulbecco para bloqueo (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; Medio base Ham F12/DMEM al 50 %; 200 mM de L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácido no esencial, Gibco 11140-050; ß-mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF), Gibco núm. 13256-029.

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático a partir de células madre pluripotenciales En una modalidad la presente invención proporciona un método para producir células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático a partir de células madre pluripotenciales; el método comprende las siguientes etapas: a. cultivar células madre pluripotenciales; b. diferenciar las células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo y c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX-2 ni NGN3.

Diferenciación de las células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar por medio de pruebas en presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Típicamente, las células madre pluripotenciales no expresan dichos marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotenciales se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.

Las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por cualquier método en la materia o por cualquier método propuesto en la presente invención.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de conformidad con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de conformidad con los métodos descritos en Shinozaki y otros, Development 131 , 1651 - 1662 (2004).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de conformidad con los métodos descritos en McLean y otros, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de conformidad con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotenciales en medios que contienen activina A en ausencia de suero, luego se cultivan las células con activina A y suero, y luego se cultivan las células con activina A y suero en una concentración diferente. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos de la linaje de endodermo definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotenciales en medios que contiene activina A en ausencia de suero y luego se cultivan las células con activina A con suero de otra concentración. Un ejemplo de este método se explica en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2005.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo mediante el cultivo de células madre pluripotenciales en medios que contienen activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero; después, mediante la eliminación del ligando Wnt y el cultivo de las células con activina A con suero. Un ejemplo de este método se describe en Nature Biotechnology, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 1 1/779,311 , cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,889.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,900.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,908.

Por ejemplo, las células madre pluripotenciales se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotenciales de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,915.

Diferenciación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático En una modalidad las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3 por medio del cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en un primer medio complementado con FGF7 y el cultivo posterior de las células en un segundo medio complementado con FGF7, un factor con la capacidad de inhibir BMP, activina A, ácido retinoico y un inhibidor de la vía de señalización Hedgehog.

En una modalidad se puede usar FGF7 a una concentración de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml. En una modalidad se usa FGF7 a una concentración de 50 ng/ml.

En una modalidad el factor con la capacidad de inhibir BMP es nogina. La nogina se puede usar a una concentración de aproximadamente 500 ng/ml a aproximadamente 500 pg/ml. En una modalidad la nogina se usa a una concentración de 100 ng/ml.

La activina A se puede usar a una concentración de aproximadamente 2 ng/ml a 100 ng/ml. En una modalidad la activina A se usa a una concentración de 20 ng/ml. En una modalidad alterna la activina A se usa a una concentración de 50 ng/ml.

El ácido retinoico se puede usar en una concentración de aproximadamente 1 n a aproximadamente 1 mM. En una modalidad el ácido retinoico se usa a una concentración de 1 µ?.

En una modalidad el inhibidor de la vía de señalización Hedgehog es ciclopamina-KAAD. La ciclopamina-KAAD se puede usar a una concentración de aproximadamente 0.025 mM a aproximadamente 2.5 µ?. En una modalidad la ciclopamina-KAAD se usa a una concentración de 0.25 µ?.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar por medio de exponer una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son los habituales en la materia. Estos incluyen reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa cuantitativa (RT-PCR), membrana de Northern, hibridación in situ (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds. 2001 supplement)) e inmunoensayos, tales como análisis inmunohistoquímico de material seccionado, Transferencia (de tipo) Western y para marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, por ejemplo, Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Las características de las células madre pluripotenciales son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y las características adicionales de las células madre pluripotenciales continúan por ser identificadas. Los marcadores de las células madre pluripotenciales incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1 -81.

Después de tratar las células madre pluripotenciales con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Las células madre pluripotenciales adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embnonarias humanas H1 (código NIH: WA01 ), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07) y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). Son adecuadas, además, para el uso en la presente invención las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotenciales: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, brachyura, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alterno una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alterno una célula que expresa los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula de endodermo definitivo.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 y PROX1 . Para el uso en la presente invención es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula endodérmica pancreática.

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático En una modalidad las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3, que se producen por los métodos de la presente invención pueden diferenciarse, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.

Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por cualquier método en la materia o cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendina 4 y la eliminación posterior del medio que contiene exendina 4 y, posteriormente, medíante el cultivo de las células en un medio que contiene exendina 1 , IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se explica en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT (Sigma-Aldrich, MO) y exendina 4. Un ejemplo de este método se explica en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendina 4. Un ejemplo de este método se explica en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. de serie 11/736,908, otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente Invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. de serie 1 1/779,311 , otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. de serie 60/953,178, otorgada a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático obtenidas de conformidad con los métodos de la presente invención se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. de serie núm. 60/990,529, otorgada a LifeScan, Inc.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , PAX4, NGN3 y PTF-1 alfa. En una modalidad una célula endocrina pancreática tiene la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático.

J Adecuada para usar en la presente invención es una célula que exprese por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática que expresa hormonas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática secretora de hormonas.

En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células b. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa PDX1 y por lo menos uno de los factores de transcripción siguientes: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

Terapias En un aspecto, el presente invento brinda un método para el tratamiento de pacientes que sufren de, o con riesgo de desarrollar, diabetes de Tipo 1. En una modalidad el método implica el cultivo de células madre pluripotenciales, la diferenciación in vitro de células madre pluripotenciales en un linaje de células ß y la implementación en un paciente de células de un linaje de células ß. En una modalidad alterna el método implica cultivar células madre pluripotenciales, diferenciar las células madre pluripotenciales in vitro en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3, e implantar las células del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 pero no expresan CDX2 ni NGN3 en un paciente.

En otro aspecto adicional la presente invención proporciona un método para el tratamiento de pacientes que sufren de, o con riesgo de desarrollar, diabetes del Tipo 2. En una modalidad el método implica el cultivo de células madre pluripotenciales, la diferenciación in vitro de células madre pluripotenciales en un linaje de células ß y la implementación en un paciente de células de un linaje de células ß. En una modalidad alterna el método implica cultivar células madre pluripotenciales, diferenciar las células madre pluripotenciales in vitro en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 pero no expresan CDX2 ni NGN3, e implantar las células del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 pero no expresan CDX2 ni NGN3 en un paciente.

Si es conveniente, además puede tratarse el paciente con agentes farmacéuticos o bioactivos que facilitan la supervivencia y función de las células trasplantadas. Estos agentes pueden incluir, por ejemplo, insulina, miembros de la familia de TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, proteínas moríogénicas del hueso (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -1 1 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II), factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de las células endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, glucagon como péptido I (GLP-1 ) y II, compuestos que mimetizan GLP-1 y GLP-2, exendina-4, ácido retinoico, hormona paratiroidea, inhibidores MAPK como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y la solicitud publicada en Estados Unidos núm. 2004/0132729.

Las células madre pluripotenciales pueden diferenciarse en una célula productora de insulina antes de ser trasplantadas al receptor. En una modalidad específica, las células madre pluripotenciales son plenamente diferenciadas en células ß antes de ser trasplantadas al receptor. Alternativamente, las células madre pluripotenciales pueden trasplantarse al receptor en un estado indiferenciado o parcialmente diferenciado. Una diferenciación mayor puede llevarse a cabo en el receptor.

Las células endodérmicas definitivas o bien las células endodérmicas pancreáticas o bien las células ß pueden implantarse como células dispersas o formarse en grupos que puedan infundirse en la vena porta hepática. Alternativamente, las células pueden proporcionarse en soportes polímeros degradables biocompatibles, dispositivos porosos no degradables o encapsulados para la protección contra la respuesta inmune del huésped. Las células pueden implantarse en un sitio apropiado en un receptor. Los sitios de implantación incluyen, por ejemplo, el hígado, el páncreas natural, espacio subcapsular renal, epiplón, peritoneo, espacio subserosal, intestino, estómago o un bolsillo subcutáneo.

Para promover una mayor diferenciación, supervivencia o actividad de las células implantadas pueden administrarse factores adicionales, como factores de crecimiento, antioxidantes o agentes antiinflamatorios antes, durante o después de la administración de las células. En ciertas modalidades los factores de crecimiento se usan para diferenciar las células administradas in vivo. Estos factores se pueden segregar mediante células endógenas y exponer a las células administradas in situ. Las células implantadas pueden inducirse para diferenciación mediante la administración de cualquier combinación de factores de crecimiento endógenos y exógenos conocidos en la materia.

La cantidad de células usadas en la implantación dependen del número de varios factores que incluyen la condición del paciente y la respuesta a la terapia y pueden determinarse por una persona con experiencia en la materia.

En un aspecto, esta invención brinda un método para el tratamiento de pacientes que sufren de, o con riesgo de desarrollar, diabetes. Este método implica el cultivo de células madre pluripotenciales, la diferenciación de células cultivadas in vitro en un linaje de células ß y la incorporación de células en un soporte tridimensional. Las células se pueden mantener in vitro en este soporte antes de ser implantadas en el paciente.

Alternativamente, es posible implantar el soporte que contiene las células directamente en el paciente sin previo cultivo in vitro adicional. El soporte puede, opcionalmente, incorporarse con al menos un agente farmacéutico que facilite la supervivencia y función de las células trasplantadas.

Algunos materiales de soporte apropiados para el uso en los propósitos de la presente invención incluyen plantillas tejidas, conductos, barreras y reservónos útiles para la reparación tisular. Particularmente, los materiales sintéticos y naturales en la forma de espumas, esponjas, geles, hidrogeles, textiles y estructuras de telas no tejidas, que se han usado in vitro e in vivo para reconstruir o regenerar tejidos biológicos, además de liberar agentes quimiotácticos para inducir el crecimiento de tejidos, son apropiados para usarse en la práctica de los métodos de la presente invención. Véase, por ejemplo, los materiales descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 5,770,417, la patente de los Estados Unidos núm. 6,022,743, la patente de los Estados Unidos núm. 5,567,612, la patente Estados Unidos núm. 5,759,830, la patente de los Estados Unidos núm. 6,626,950, la patente de los Estados Unidos núm. 6,534,084, la patente de los Estados Unidos núm. 6,306,424, la patente de los Estados Unidos núm. 6,365,149, la patente de los Estados Unidos núm. 6,599,323, la patente de los Estados Unidos núm. 6,656,488, la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0062753 A1 , la patente de los Estados Unidos núm. 4,557,264 y la patente Estados Unidos núm. 6,333,029.

Para formar un soporte con un agente farmacéutico, el agente farmacéutico puede mezclarse con la solución de polímero antes de formar el soporte. Alternativamente, un agente farmacéutico puede cubrir un soporte fabricado, preferentemente, en presencia de un portador farmacéutico. El agente farmacéutico puede presentarse como un líquido, un sólido finamente dividido u otra forma física apropiada Alternativamente, se pueden agregar excipientes al soporte para alterar la velocidad de desprendimiento del agente farmacéutico. En una modalidad alterna se incorpora el soporte con al menos un compuesto farmacéutico que es un compuesto antiinflamatorio tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,509,369.

El soporte puede incorporarse a al menos un compuesto farmacéutico que sea un compuesto anti-apoptótico tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,793,945.

El soporte puede incorporarse, además, a al menos un compuesto farmacéutico que sea un inhibidor de fibrosis tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la patente de los Estados Unidos núm. 6,331 ,298.

El soporte puede incorporarse, además, a al menos un compuesto farmacéutico que sea con la capacidad de mejorar la angiogénesis tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0220393 y la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0209901.

El soporte puede incorporarse, además, a al menos un compuesto farmacéutico que sea un compuesto inmunosupresivo como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0171623.

El soporte puede incorporarse, además, a al menos un compuesto farmacéutico que sea un factor de crecimiento tal como, por ejemplo, los miembros de la familia TGF-ß, que incluyen TGF-ß? , 2 y 3, proteínas morfogénicas del hueso (BMP-2, -3,-4, -5, -6, -7, -11 , -12 y -13), factores de crecimiento de los fibroblastos -1 y -2, factor de crecimiento derivado de plaquetas -AA y -BB, plasma rico en plaquetas, factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II) factor de diferenciación y crecimiento (GDF-5, -6, -8, -10, -15), factor de crecimiento derivado de las células endoteliales vasculares (VEGF), pleiotrofina, endotelina, entre otros. Otros compuestos farmacéuticos pueden incluir, por ejemplo, nicotinamida, factor inducíble por hipoxia 1 -alfa, glucagon como péptido-l (GLP-1 ), compuestos que mimetizan GLP- y GLP-2 y II, exendina-4, nodal, nogina, NGF, ácido retinoico, hormona paratiroidea, tenascina-C, tropoelastina, péptidos derivados de la trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, péptidos biológicos que contienen dominios de unión a la célula y a la heparina de proteínas de matriz extracelular adhesiva tal como la fibronectina y la vitronectina, inhibidores MAPK tal como, por ejemplo, los compuestos descritos en la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0209901 y la solicitud publicada en los Estados Unidos núm. 2004/0132729.

La incorporación de las células de la presente invención en un supercóntigo puede lograrse simplemente por medio de depositar las células en el supercóntigo. Las células pueden entrar al supercóntigo mediante simple difusión (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3-9 (1988)). Se han desarrollado varios enfoques para mejorar la eficiencia del sembrado de las células. Por ejemplo, se ha usado un matraz de agitación en el sembrado de condrocitos en supercóntigos de ácido poliglicolico (Biotechnol. Prog. 14(2): 193-202 (1998)). Otro enfoque para el sembrado de células se basa en el uso de la centrifugación, que produce un mínimo esfuerzo a las células plantadas y mejora la eficiencia del sembrado. Por ejemplo, Yang y otros desarrollaron un método de siembra de células (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 379-86 (2001 )) denominado inmovilización celular centrífuga (CCI).

Se ilustra la presente invención aún más, pero sin limitarse a, los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Diferenciación de células madre pluripotenciales humanas en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1. pero no expresan CDX2 ni NGN3 Este ejemplo demuestra que la activina A puede usarse en combinación con nogina y ácido retinoico para facilitar la regulación a la alta de la expresión de NKX6.1. En resumen, las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se cultivaron en placas recubiertas de MATRIGEL™ (dilución de 1 :30) y medio RPMI complementado con BSA al 2 %, activina A a 100 ng/ml, WNT-3a a 20 ng/ml, 8 ng/ml de bFGF por un día seguido de tratamiento con medio RPMI complementado con BSA al 2 %, activina A a 100 ng/ml, 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (etapa 1), después, a. DMEM/F12 + 2 % BSA + FGF7 a 50 ng/ml + 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD durante tres días (etapa 2), después, b. DMEM alto en glucosa + B27 al 1 % + FGF7 a 50 ng/ml + 0.25 µ? de cíclopamina-KAAD + 2 µ? de ácido retinoíco (RA) + 100 ng/ml de nogina + activina A a 20 ng/ml o activina A a 50 ng/ml durante cuatro días (etapa 3).

Como control, poblaciones separadas de células se trataron con DMEM alto en glucosa, complementado con B27 al 1 %, FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA) y 100 ng/ml de nogina.

Se tomó muestras de los cultivos por duplicado en la etapa 3 y día 4 y se analizaron para detectar la expresión de los marcadores pancreáticos con el uso de PCR en tiempo real.

Tal como se muestra en la Figura 1 , el tratamiento con activina A produjo un incremento de la expresión de NKX6.1 en la etapa 3 día 4 que fue mayor que la expresión de las células que no recibieron activina A. El incremento en la expresión de NKX6.1 , mediado por activina A, incrementó en proporción a la dosis de activina A. Además, se observó una regulación a la baja de la expresión de NGN3 en las células en la etapa 3 día 4.

Para determinar si la vía de TGF-beta facilitó la formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 , pero no expresan CDX2 ni NGN3, las células se trataron de la siguiente manera: Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución de 1 :30) y se diferenciaron con el uso del siguiente protocolo: a. Medio RPMI (catálogo núm. 22400, Invitrogen, Ca) suplementado con BSA al 2 % (catálogo núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio) y activina A a 100 ng/ml (R&D Systems, MN) más WNT-3a a 20 ng/ml (catálogo núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (catálogo núm. 100-18B, PeproTech, NJ) durante un día, seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y activina A a 100 ng/ml más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (etapa 1), después, b. DMEM/F12 (catálogo núm. 11330, Invitrogen, Ca)+ BSA al 2 % + FGF7 a 50 ng/ml durante tres días (etapa 2), después, c. ya sea el Tratamiento 1 : DMEM (alto en glucosa) + B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA) y 100 ng/ml de nogina durante cuatro días, o d. Tratamiento 2: DMEM (alto en glucosa) + B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina- KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA), 100 ng/ml de nogina, activina A a 20 ng/ml durante cuatro días, o e. Tratamiento 3: DMEM (alto en glucosa) + B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina- KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA), 100 ng/ml de nogina, 1 µ? de inhibidor II de ALK5 durante cuatro días.

Se tomó muestras de los cultivos por duplicado en la etapa 3 y día 4 y se analizaron para detectar la expresión de los marcadores pancreáticos con el uso de PCR en tiempo real. Los cultivos se arreglaron, además, en paralelo para un análisis de ¡nmunofluorescencia.

El Cuadro 1 muestra los niveles de expresión relativos de NKX6.1 , NGN3 y PDX1 en la etapa .3 día 4 al normalizarlos a la condición mínima en este experimento (tratamiento 1).

CUADRO 1 El tratamiento 1 (FGF7, ácido retinoico y nogina) indujo la expresión de NKX6.1 y NGN3. Véase las Figuras 2A y 2B. Sin embargo, la adición de activina A (tratamiento 2) bloqueó la expresión de NGN3 e incrementó significativamente la cantidad de células que expresan NKX6.1. Véase las Figuras 2C y 2D. Estos datos sugieren que la activación de la vía del receptor TGF3 durante la formación de una población de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático produce la población de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que no expresan NGN3.

La incubación de células con el inhibidor del receptor TGF3, el inhibidor II de Alk5, confirmó esta hipótesis (véase el tratamiento 3). El tratamiento de células en DMEM (alto en glucosa) complementado con B27 al 1 % (Invitrogen, CA), FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA), 100 ng/ml de nogina, 1 mM de inhibidor II de ALK5 produjo una reducción en el nivel de expresión de NKX6.1. El nivel de expresión observado fue menor que el de las células que recibieron el tratamiento 1. Véase el Cuadro 1 y la Figura 2E. Por otro lado, la cantidad de células que expresan NGN3 se redujo significativamente. Véase el Cuadro 1 y la Figura 2F. No se observó ningún efecto significativo en la expresión de PDX1 . Estos resultados sugieren que la combinación de nogina, ácido retinoico y activina A actúa sinérgicamente para especificar una población de células precursoras pancreáticas positiva para la expresión de NKN6.1 y PDX1 , pero negativa para la expresión de NGN3.

Tal como se muestra en las Figuras 3A y 3B, la mayoría de células que expresan PDX1 generadas con el uso de DMEM (tratamiento 2 -DMEM (alto en glucosa) + B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA), 100 ng/ml de nogina, activina A a 20 ng/ml) no expresó CDX2 en la etapa 3 día 4. A diferencia de las células que expresan PDX1 generadas con el uso de DMEM/F12 complementado con B27 al 1 % (Invitrogen, CA) + FGF7 a 50 ng/ml, 0.25 µ? de ciclopamina-KAAD, 2 µ? de ácido retinoico (RA), 100 ng/ml de nogina, activina A a 20 ng/ml, en donde la mayor parte de células que expresan PDX1 expresaron, además, CDX2. Véase las Figuras 3C y 3D.

Las publicaciones citadas a lo largo de este documento se incorporan en su totalidad como referencia a la presente. Aunque los diversos aspectos de la invención han sido ilustrados anteriormente como referencia a los ejemplos y modalidades preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción descrita anteriormente pero sí por las cláusulas a continuación interpretadas apropiadamente bajo los principios de la ley de patentes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para diferenciar una población de células madre pluripotenciales en una población de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX-1 , NKX-6.1 pero no expresan CDX-2 ni NGN-3; el método comprende las siguientes etapas: a. cultivar las células madre pluripotenciales, b. diferenciar las células madre pluripotenciales en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático que coexpresan PDX1 , NKX6.1 pero no expresan CDX2 ni NGN3, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un primer medio complementado con FGF7, y el cultivo posterior de las células en un segundo medio complementado con FGF7, un factor con la capacidad de inhibir BMP, activina A, ácido retinoico y un inhibidor de la vía de señalización hedgehog.