MX2011004565A

MX2011004565A - Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas al linaje endocrino pancreatico.

Info

Publication number: MX2011004565A
Application number: MX2011004565A
Authority: MX
Inventors: Alireza Rezania; Benjamin Fryer
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2011-07-28
Also published as: WO2010051223A1; CN102272291A; US20100112693A1; RU2011121842A; ZA201103985B; CN102272291B; CN107904201B; RU2664226C2; US20170355963A1; US20160160182A1; KR101712085B1; CN107904201A; PL2346988T3; AU2009308967A1; RU2522001C2; EP2346988B1; AU2009308967B2; AU2018200452A1; KR20110077016A; EP2346988A1

Abstract

La presente invención provee un método para aumentar la expresión de MAFA en las células que expresan los marcadores característicos del linaje endócrino pancreático que comprende los pasos de cultivar las células que expresan los marcadores característicos del linaje endócrino pancreático en un medio que comprende una cantidad suficiente de un inhibidor de quinasa que depende de la cíclina para causar un aumento en la expresión de MAFA.

Description

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS AL LINAJE ENDOCRINO PANCREÁTICO La presente invención reivindica prioridad a la solicitud de patente de los EE.UU. núm. de serie 61/110,287, registrada el 31 de octubre de 2008.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes. Particularmente, la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes, han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un método es la generación de células funcionales ß a partir de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo, las células madre embrionarias.

En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotencial da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de gérmenes (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Los tejidos tales como, por ejemplo, tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso es la formación de endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan un número de marcadores, tales como HNF-3 beta, GATA4, MIXL1 , CXCR4 y SOX17.

La formación del páncreas se origina a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen homeótico pancreático duodenal, Pdxl En ausencia de Pdx1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de botones ventrales y dorsales. De este modo, la expresión de Pdx1 marca una etapa crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.

Las células que tienen las características de células de islotes se ha informado que se derivan de células embrionarias de ratón. Por ejemplo, Lumelsky y otros (Science 292: 1389, 2001 ) informan la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en estructuras que secretan insulina similares a islotes pancreáticos. Soria y otros (Diabetes 49:157, 2000) informan que las células que secretan insulina derivadas a partir de células madre embrionarias de ratón normalizan la glicemia en ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros (PNAS 99: 16105, 2002) describen que el tratamiento de células madre embrionarias de ratón con inhibidores de fosfoinositido 3-quinasa (LY294002) produjo células que se asemejaban a las células ß.

En otro ejemplo, Blyszczuk y otros (PNAS 100:998, 2003) informa la generación de células que producen insulina a partir de células madre embrionarias de ratón que expresan constitutivamente Pax4.

Micallef y otros informan que el ácido retinoico puede regular el compromiso de las células madre embrionarias para formar endodermo pancreático positivo para Pdx1 . El ácido retinoico es más efectivo para inducir la expresión de Pdx1 cuando se agrega a cultivos en el día 4 de diferenciación de células madre embrionarias, durante un período correspondiente a la finalización de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54:301 , 2005).

Miyazaki y otros informan una línea de células madre embrionarias de ratón que expresan Pdx1 en exceso. Sus resultados muestran que la expresión de Pdx1 exógeno claramente mejoró la expresión de los genes de insulina, somatostatina, glucoquinasa, neurogenina 3, P48, Pax6 y HNF6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).

Skoudy y otros informan que la adivina A (un miembro de la superfamilia TGF-ß) regula hacia arriba la expresión de genes pancreáticos exocrinos (p48 y amilasa) y genes endocrinos (Pdx1 , insulina, y glucagon) en células madre embrionarias de ratón. El efecto máximo se observó con el uso de adivina A 1 nM. También observaron que el nivel de expresión de insulina y Pdx1 ARNm no se vio afectado por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con FGF7 3 nM produjo un aumento en el nivel de transcripción para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).

Shiraki y otros estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que mejoran específicamente la diferenciación de células madre embrionarias en células positivas para Pdx1 . Observaron que el JGF- 2 produjo, reproduciblemente, una proporción más alta de células positivas para PDX1 (Genes Cells. junio 2005; 10(6): 503-16.).

Gordon y otros demostraron la inducción de Brachyury+/HNF-3beta+ en células endodérmicas a partir de células madre embrionarias de ratón en ausencia de suero y en presencia de activina junto con un inhibidor de la señalización de Wnt (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0003446A1 ).

Gordon y otros (PNAS, Vol. 103, página 16806, 2006) dicen: "Se requirió la señalización simultánea de Wnt y TGF-beta/ nodal/ activina para la generación de la línea primitiva anterior".

Sin embargo, el modelo de ratón de desarrollo de células madre embrionarias puede no imitar exactamente el programa de desarrollo en los mamíferos superiores, tales como, por ejemplo, los humanos.

Thomson y otros aislaron células madre embrionarias de blastocitos humanos (Science 282: 114, 1998). De forma coincidente, Gearhart y otros derivaron líneas de células embrionarias germinativas humanas (hEG) a partir de tejido gonadal fetal (Shamblott y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998). A diferencia de las células madre embrionarias de ratón, que se puede evitar que se diferencien simplemente cultivándolas con el factor de inhibición de leucemia (LIF), las células madre embrionarias humanas deben mantenerse en condiciones muy especiales (patente de los Estados Unidos núm. 6,200,806; WO 99/20741 ; WO 01/51616).

D'Amour y otros describen la producción de cultivos enriquecidos del endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y baja de suero (Nature Biotechnology 2005). Transplantar esas células debajo de la cápsula del hígado de ratones produjo la diferenciación en células más maduras con características de algunos órganos endodérmicos. Las células de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas pueden, además, diferenciarse en células positivas al Pdx1 después de la adición de FGF-10 (patente de los Estados Unidos núm. 2005/0266554A1 ).

D'Amour y otros (Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)) afirman: "Hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre embrionarias humanas (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas: insulina, glucagon, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina. Este proceso imita la organogénesis pancreática "¡n vivo" al dirigir las células a través de etapas que se asemejan al endodermo definitivo, endodermo del tubo digestivo, endodermo pancreático y precursor endocrino hacia las células que expresan hormonas endocrinas".

En otro ejemplo, Fisk y otros informan un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (patente de los Estados Unidos núm. 2006/0040387A1 ). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron primero hacia el endodermo por medio del uso de una combinación de butirato de sodio y activina A. Después, las células se cultivaron con antagonistas del TGF-ß, tales como nogina, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo mediante nicotinamida.

En un ejemplo, Benvenistry y otros dicen: "Concluimos que la sobreexpresión de Pdx1 mejoró la expresión de genes pancreáticos enriquecidos, la inducción de la expresión de insulina puede requerir señales adicionales que sólo están presentes in vivo" (Benvenistry y otros, Stem Cells 2006; 24: 1923-1930).

Las ciclinas han sido implicadas en la función de las células beta.

Por ejemplo, Lilja y otros informan que Cdk5 está presente en las células ß pancreáticas que secretan insulina (J. Biol. Chem., volumen 276, número 36, 34199-34205, 7 de septiembre de 2001 ). Lilja y otros afirman: "Cdk5 está presente en las células ß y actúa como un regulador positivo de la exotisosis de la insulina".

En otro ejemplo, Marzo y otros afirman: Los ratones knockin Cdk4 tienen una masa de células beta significativamente aumentada y son fisiológicamente funcionales, lo que indica que "Cdk4 es un blanco potencial para la regeneración de la masa de células beta pancreática en la diabetes Tipo 1 " (Diabetalogia, Vol. 47, número 4, 686-694, 1 de abril de 2004.) En otro ejemplo, Ubeda y otros informan que la inhibición de la actividad de la quinasa 5 que depende de ciclina protege las células beta pancreáticas de la glucotoxicidad (J. Biol. Chem., Volumen 281 , número 39, 28858-28864, 29 de septiembre de 2006).

En otro ejemplo, Wei y otros informan la regulación que depende de Cdk5 de la secreción de insulina estimulada por glucosa (Nature Medicine 1 1 , 1104- 108 (1 de octubre de 2005.) En otro ejemplo, Vanderford y otros afirman: "MafA es un factor de transcripción con cremalleras de leucina de carácter básico expresado dentro de las células beta del páncreas y se requiere para mantener la homeostasis normal de la glucosa involucrada en distintos aspectos de la biología de las células beta. Los niveles de proteina MafA se conocen que aumentan en respuesta a la glucosa alta a través de mecanismos que aún no han sido completamente caracterizados. Hemos investigado si distintos eventos de señalización intracelular controlan la expresión de mafA. Hemos encontrado que el inhibidor general de la quinasa estauroporina induce la expresión de nafA sin alterar la estabilidad de la proteina. La inhibición de JNK de la MAP-quinasa imita los efectos de la estauroporina en la expresión de mafA. La señalización de la calmodulina quinasa y calcio también son importante en la estimulación de la expresión de MafA por la glucosa alta. Sin embargo, la estauroporina, JNK, y quinasa calmodulina tienen diferentes efectos en la inducción de la expresión de insulina. Estos datos revelan que los niveles de MafA son controlados estrictamente por la acción coordinada de múltiples vías de quinasa". (Archives of Biochemistry and Biophysics (2008), doi: 10.1016/j.abb.2008.10.001).

Por ello, aún persiste la necesidad importante de desarrolla métodos para diferenciar células madre pluripotentes en células endocrinas pancreáticas, células que expresan hormonas pancreáticas, o células que secretan hormonas pancreáticas. La presente invención proporciona métodos para aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que comprende las etapas de cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en un medio que comprende una cantidad suficiente de un inhibidor de quinasa que depende de ciclina para causar un aumento en la expresión de MAF.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A muestra el efecto de los compuestos de la genoteca EMD Calbiochem de inhibidores de la quinasa en la relación de expresión de insulina a glucagon en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico, como se determina por PCR en tiempo real. La etiqueta alfanumérica corresponde a la identidad del compuesto como se muestra en el Cuadro 1 . La figura 1 B muestra el efecto de los compuestos de la genoteca EMD Calbiochem de inhibidores de la quinasa en la relación de la expresión de MAFA a ARX4 en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico, como se determina por PCR en tiempo real. La etiqueta alfanumérica corresponde a la identidad del compuesto como se muestra en el Cuadro 1 .

La Figura 2A muestra una micrografia de 4x de células tratadas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 , en el 4o. día del tratamiento de la etapa 6. La figura 2B muestra una micrografia de 4x de células tratadas con 0.5 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330812 en el 4o. día de tratamiento. La figura 2C muestra una micrografia de 4x de células tratadas con 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330812 en el 4o. día de tratamiento. La figura 2D muestra una micrografia de 20x dé células tratadas de acuerdo a los métodos descritos en el Ejemplo 1 , en el 6o. día del tratamiento de la etapa 6. La figura 2E muestra una micrografía de 20x de células tratadas con 0.5 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330812 en el 6o. día de tratamiento. La figura 2F muestra una micrografía de 20x de células tratadas con 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330812 en el 6°. día de tratamiento.

Las Figuras 3A-3W muestran la expresión de los 23 genes indicados, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con un tratamiento de cinco días de 0.5 µ? (barras oscuras) o 1.0 µ? (barras claras) del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330812. Los niveles de expresión se determinaron en el día 0, día 2 y día 5.

Las Figuras 4A-4I muestran el efecto de tratamiento de inhibidores de CDK III en la expresión de marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en células tratadas con la Etapa 7 del protocolo de diferenciación descrito en el Ejemplo 4.

Las Figuras 5A-5B muestran el efecto de tratamiento de inhibidores de CDK III en el teñido de ditazona de aglomerados tipo isletas.

Las Figuras 6A-6C muestran la expresión de insulina, sinaptofisina y glucagon en células productoras de insulina producidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 5. La expresión de las proteínas indicadas se determinó mediante FACS.

Las Figuras 7A-7C muestran la expresión de insulina, sinaptofisina y glucagon en células productoras de insulina producidas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 5. La expresión de las proteínas indicadas se determinó mediante FACS.

Las Figuras 8A-8B muestran la expresión de MAFA (Figura 8A) e insulina (Figura 8B), en células productoras de insulina, producidas por los métodos de la presente invención. Se tomaron muestras de células para análisis por PCR en los días 1 , 2, 3, y 4. Después de 4 días de tratamiento con el inhibidor de CDK, se eliminó el inhibidor de CDK del cultivo y las células se cultivaron durante 4 días adicionales en DMEM-F12 + 1 % B27 + 20 ng/ml de activina A. Al final de los cuatro días, se tomaron muestras en triplicado para análisis por PCR.

La Figura 9 muestra el efecto de los compuestos de la genoteca EMD Calbiochem de inhibidores de la quinasa I en la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico, como se determina por PCR en tiempo real.

Las Figuras 10A-10D muestran el efecto de genesteina en la expresión del ARNm por insulina, glucagon, somatostatina y MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico, como se determina por PCR en tiempo real.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ¡lustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su capacidad a nivel de células únicas de autorrenovarse y diferenciarse para producir células progenitoras, que incluyen progenitoras que se autorrenuevan, progenitoras que no se renuevan y células diferenciadas de forma terminal. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección dentro de los blastocistos.

Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo, en: (1 ) totipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, que se refiere a la capacidad de originar todos los tipos de células embrionarias, (3) multipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotenciales restringidos a glóbulos rojos y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un subgrupo más restringido de linajes celulares que las células madre multipotenciales; y (5) unipotenciales, que se refiere a la capacidad de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula inducida a la diferenciación o diferenciada es una que toma una posición más especializada ("comprometida ") dentro del linaje de una célula. El término "comprometido", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La desdiferenciación se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.

"Linaje de células ß" se refiere a las células con expresión positiva de genes para el factor de transcripción PDX-1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4, o PAX6. Las células que expresan características del linaje de las células ß incluyen las células ß.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteina de la caja homeótica. tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, u OTX2. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo incluyen las células precursoras de la línea primitiva, células de la línea primitiva, células del mesendodermo y células del endodermo definitivo.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF-, o HB9. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático incluyen las células de endodermo pancréatico, las células primitivas del tubo intestinal, y las células del intestino proximal posterior.

"Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , PAX4, NGN3, o PTF1 alfa. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático incluyen las células endocrinas pancreáticas, las células que expresan hormonas pancreáticas y las células secretoras de hormonas pancreáticas y las células del linaje de las células ß.

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, o IXL1.

"Endodermo extraembrionario", como se usa en la presente descripción, se refiere a una población de células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: SOX7, AFP o SPARC.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de modo que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

"Células de mesendodermo", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX17, DKK4, HNF3 beta, GSC, FGF17 o GATA6.

"Célula endocrina pancreática", o "célula que expresa la hormona pancreática", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina o polipéptido pancreático.

"Célula del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar por lo menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , PAX4, o NKX2.2.

"Célula productora de hormonas pancreáticas", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula con la capacidad de producir por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina o polipéptido pancreático.

"Célula secretora de hormonas pancreáticas", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina, y polipéptido pancreático.

"Célula del intestino proximal posterior", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , HNF1 , PTF1 alfa, HNF6, HB9, o PROX1.

"Célula de la línea preprímitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: Nodal, o FGF8.

"Célula del tubo intestinal primitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de secretar por lo menos uno de los siguientes marcadores: HNF1 , o HNF4A.

"Célula de línea primitiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: Brachyury, proteína homeobox tipo Mix o FGF4.

Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes Caracterización de las células madre pluripotentes Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4 y los marcadores detectables por medio del uso de los anticuerpos designados Tra-1 -60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro produce la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra- 1 -60 y Tra-1-81 (si estuvieran presentes) y aumenta la expresión de SSEA-1. Generalmente, las células madre pluripotentes indiferenciadas tienen actividad de fosfatasa alcalina, que se puede detectar al fijar las células con paraformaldehído al 4 % y luego desarrollar con Vector Red como sustrato, como lo describe el fabricante (Vector Laboratories, Burlingame Calif.) Las células madre pluripotentes no diferenciadas expresan, además, típicamente, Oct-4 y TERT, según se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotentes propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre pluripotentes puede confirmarse, por ejemplo, al inyectarse células en ratones inmunodeficientes combinados graves (SCID, por sus siglas en inglés), fijar los teratomas que se forman por medio del uso de paraformaldehído al 4 % y luego examinarlas histológicamente para ver si hay evidencias de tipos de células de las tres capas de gérmenes. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo que significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados.

Fuentes de las células madre pluripotentes Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido pre-embrionario (tal como, por ejemplo, un blastocito), tejido embrionario, o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente 10-12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son las líneas de células madre embrionarias humanas establecidas o células de germen embrionario humano, tales como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 (WiCell). También se contempla el uso de las composiciones de esta descripción durante el establecimiento inicial o la estabilización de estas células, en cuyo caso la fuente primaria de las células serían las células pluripotentes primarias tomadas directamente a partir de los tejidos fuente. También adecuadas son las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivada, en ausencia de células alimentadoras. También son adecuadas las líneas de células madre embrionarias humanas mutantes, tales como, por ejemplo, BG01v (BresaGen, Athens, GA).

En una modalidad las células madre embrionarias humanas se preparan como se describen en Thomson y otros (patente de los Estados Unidos, núm. 5,843,780; Science 282:1 145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Nati. Acad. Sci. Estados Unidos 92:7844, 1995).

Cultivo de células madre pluripotentes En una modalidad las células madre pluripotentes se cultivan, típicamente, en una capa de células alimentadoras que soportan a las células madre pluripotentes de diferentes maneras. Alternativamente, las células madre pluripotentes se cultivan en un sistema de cultivo que está esencialmente libre de células alimentadoras pero, sin embargo, soporta la proliferación de las células madre pluripotentes sin sufrir una diferenciación sustancial. El crecimiento de las células madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta con el uso de un medio acondicionado mediante el cultivo previo de otro tipo de célula. Alternativamente, el crecimiento de las células madre pluripotentes en un cultivo libre de alimentador, sin diferenciación, se soporta por medio del uso de un medio definido químicamente.

Por ejemplo, Reubinoff y otros (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)) y Thompson y otros (Science 6 de noviembre de 1998: Vol. 282. núm. 5391 , págs. 1145 - 1147) describen el cultivo de líneas de células madre pluripotentes a partir de blastocitos humanos por medio del uso de una capa alimentadora de células de fibroblasto embrionario de ratón.

Richards y otros, (Stem Cells 21 : 546-556, 2003) evaluaron un panel de 1 1 capas alimentadoras de células diferentes de adultos, fetales y neonatales humanas para estudiar su capacidad para soportar el cultivo de células madre pluripotentes humanas. Richards y otros dicen: "las lineas de células madre embrionarias humanas cultivadas sobre alimentadores de fibroblastos de piel adulta retienen la morfología de la célula madre embrionaria humana y permanecen pluripotentes".

La patente de los Estados Unidos núm. 20020072117 describe líneas de células que producen medios que soportan el crecimiento de las células madre pluripotentes de primate en un cultivo libre de alimentador. Las líneas celulares empleadas son líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto, obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madre embrionarias. La patente de los Estados Unidos núm. 20020072117 también describe el uso de lineas de células como una capa alimentadora de células primaria.

En otro ejemplo, Wang y otros (Stem Cells 23: 1221 -1227, 2005) describe métodos para el crecimiento a largo plazo de células madre pluripotentes humanas sobre una capa alimentadora de células derivadas de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo, Stojkovic y otros (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) describen un sistema de células alimentadoras derivadas de la diferenciación espontánea de células madre embrionarias humanas.

En otro ejemplo, Miyamoto y otros (Stem Cells 22: 433-440, 2004) describen un origen de células alimentadoras obtenidas a partir de placenta humana.

Amit y otros (Biol. Reprod. 68: 2150-2156, 2003) describen una capa de células alimentadora derivada de prepucio humano.

En otro ejemplo, Inzunza y otros (Stem Cells 23: 544-549, 2005) describen una capa alimentadora de células a partir de fibroblastos de prepucio postnatal humano.

La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 describe los medios que soportan el crecimiento de las células madre pluripotentes de primate (pPS) en un cultivo libre de alimentador y las líneas de células útiles para la producción de tales medios. La patente de los Estados Unidos núm. 6642048 establece: "Esta invención incluye líneas de células mesenquimales y tipo fibroblasto obtenidas a partir de tejido embrionario o diferenciadas a partir de células madre embrionarias. Los métodos para derivar tales líneas de células, procesar los medios y hacer crecer las células madre por medio del uso de los medios acondicionados se describen e ilustran en esta descripción".

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005014799 describe el medio acondicionado para el mantenimiento, proliferación y diferenciación de células de mamíferos. La patente núm. WO2005014799 establece: "El medio de cultivo producido de acuerdo con la presente invención está acondicionado mediante la actividad de secreción celular de células murinas, en especial aquellas diferenciadas y hepatocitos transgénicos inmortalizados, llamados MH (hepatocito murino met, por sus siglas en inglés)".

En otro ejemplo, Xu y otros (Stem Cells 22: 972-980, 2004) describen un medio acondicionado obtenido a partir de derivados de células madre embrionarias humanas que han sido modificadas genéticamente para sobreexpresar la transcriptasa reversa telomerasa humana.

En otro ejemplo la patente de los Estados Unidos núm. 20070010011 describe un medio de cultivo definido químicamente para el mantenimiento de células madre pluripotentes.

Un sistema de cultivo alternativo emplea un medio libre de suero complementado con factores de crecimiento, capaz de promover la proliferación de células madre embrionarias. Por ejemplo, Cheon y otros (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, 19 de octubre de 2005) describen sistema de cultivo libre de alimentador y libre de suero, en el cual se mantienen las células madre embrionarias en un medio de reemplazo de suero (SR) sin acondicionar, complementado con diferentes factores de crecimiento, capaz de iniciar la autorrenovación de las células madre embrionarias.

En otro ejemplo, Levenstein y otros (Stem Cells 24: 568-574, 2006) describen métodos para el cultivo a largo plazo de células madre embrionarias humanas en ausencia de fibroblastos, o un medio acondicionado, por medio del uso de medios complementados con bFGF.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050148070 describe un método para cultivar células madre embrionarias humanas en medios definidos sin suero y sin células alimentadoras del fibroblasto; el método comprende: cultivar las células madre en un medio de cultivo que contiene albúmina, aminoácidos, vitaminas, minerales, por lo menos una transferina o sustituto de transferina, por lo menos un insulina o sustituto de insulina; el medio de cultivo está esencialmente libre de suero fetal de mamífero y contiene por lo menos aproximadamente 100 ng/ml de un factor de crecimiento del fibroblasto capaz de activar un receptor del señalizador del factor de crecimiento del fibroblasto, en donde el factor de crecimiento se suministra de otra fuente que sólo la capa alimentadora del fibroblasto, el medio soporta la proliferación de células madre en estado indiferenciado, sin células alimentadoras ni un medio acondicionado.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050233446 describe un medio definido útil para cultivar células madre, incluso células madre primordiales de primate indiferenciadas. En solución, el medio es sustancialmente isotónico en comparación con las células madre que se cultivan. En un cultivo determinado, el medio particular comprende un medio base y una cantidad de cada uno de bFGF, insulina y ácido ascórbico necesario para soportar el crecimiento indiferenciado de células madre primordiales.

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6800480 establece: "En una modalidad se proporciona un medio de cultivo celular para el cultivo de células madre primordiales derivadas de primates en un estado ¡ndiferenciado sustancialmente, el cual incluye un medio básico bajo endotoxinas de baja presión osmótica, que es eficaz para soportar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates. El medio básico se combina con un suero nutriente eficaz para soportar el crecimiento de las células madre primordiales derivadas de primates y un sustrato seleccionado del grupo que consiste de células alimentadoras y un componente de la matriz extracelular derivado de las células alimentadoras. El medio además incluye aminoácidos no esenciales, un antioxidante y un primer factor de crecimiento, seleccionado del grupo formado por nucleósidos y una sal de piruvato".

En otro ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 20050244962 indica: "En un aspecto, la invención proporciona un método de cultivar células madre de embriones de primates. Se cultivan las células madre en un cultivo esencialmente libre de suero fetal de mamífero (preferentemente, además, esencialmente libre de cualquier suero animal) y en presencia del factor de crecimiento de fibroblastos que se suministra desde una fuente diferente de simplemente una capa alimentadora de fibroblastos. En una forma preferida, la capa alimentadora de fibroblastos, previamente requerida para mantener un cultivo de células madre es innecesaria por la adición de suficiente factor de crecimiento fibroblástico".

En aún otro ejemplo, la patente núm. WO2005065354 describe un medio de cultivo isotónico y definido, que está prácticamente libre de alimentador y libre de suero, que comprende: a. un medio basal; b. una cantidad suficiente de bFGF para soportar el crecimiento de células madre de mamífero prácticamente indiferenciadas; c. una cantidad suficiente de insulina para soportar el crecimiento de células madre de mamífero prácticamente indiferenciadas; y d. una cantidad suficiente de ácido ascórbico para soportar el crecimiento de células madre de mamífero prácticamente indiferenciadas.

En otro ejemplo, la patente núm. WO2005086845 describe un método para el mantenimiento de una célula madre indiferenciada, dicho método comprende exponer una célula madre a un miembro de la familia de proteínas del factor transformador del crecimiento beta (TGF-ß), un miembro de la familia de proteínas de crecimiento de fibroblastos (FGF), o nicotinamida (NIC) en una cantidad suficiente para mantener la célula en un estado indiferenciado durante un tiempo suficiente para lograr el resultado deseado.

Las células madre pluripotentes pueden colocarse en placas sobre un sustrato de cultivo adecuado. En una modalidad el sustrato de cultivo adecuado es un componente de matriz extracelular, tal como, por ejemplo, aquellos derivados de la membrana de base o que pueden formar parte de la adhesión molecular de los acoplamientos receptor-ligando. En una modalidad, el sustrato de cultivo adecuado es MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® es una preparación soluble de células tumorales Engelbreth-Holm Swarm que se hace gel a temperatura ambiente para formar una membrana basal reconstituida.

Otros componentes de la matriz extracelular y mezclas de componentes son adecuados como alternativa. Dependiendo del tipo de célula que se está proliferando, éste puede incluir laminina, fibronectina, proteoglican, entactina, sulfato de heparán y similares, solos o en diferentes combinaciones.

Las células madre pluripotentes pueden colocarse en placas sobre el sustrato en una distribución adecuada y en presencia de un medio que promueve la supervivencia, propagación y retención de las células con las características deseables. Todas estas características se benefician de la atención prestada en la distribución de sembrado y se puede determinar rápidamente mediante alguien con conocimiento en la materia.

Los medios de cultivo adecuados se pueden elaborar de los siguientes componentes, tales como, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), Gibco núm. 1 1965-092; el medio de Eagle modificado por Dulbecco Knockout (KO DMEM), Gibco núm. 10829-018; medio basal DMEM F12/50 % de Ham; 200 mM de L-glutamina, Gibco núm. 15039-027; solución de aminoácidos no esenciales, Gibco 1 1 140-050; ß-mercaptoetanol, Sigma núm. M7522; factor recombinante de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), Gibco núm. 13256-029.

Formación de células productoras de hormonas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes En una modalidad la presente invención proporciona un método para producir células productoras de hormonas pancreáticas a partir de células madre pluripotentes, en donde el método comprende las etapas de: a. cultivar células madre pluripotentes, b. diferenciar las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo; c. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo en las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, y d. diferenciar las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

Las células madre pluripotentes adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07), y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). También son adecuadas para el uso en la presente invención las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1-60, o Tra1-81 .

Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste de SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, Brachyury, proteína de la caja homeótica tipo Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-K¡t, CD99 y 0TX2. Una célula adecuada para su uso en la presente invención es la que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste de PDX1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 y PROX1. Para el uso en la presente invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático es una célula del endodermo pancreático.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste de NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , N X6.1 , PAX4, NGN3, y PTF1 alfa. En una modalidad una célula endocrina pancreática es capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagon, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores características del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que expresa la hormona pancreática. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormona pancreática.

En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa Pdx1 y al menos uno de los factores de transcripción siguientes: NGN3, NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4, o PAX6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de la célula ß es una célula ß.

Formación de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo medíante cualquier método en la materia o mediante cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Bíotechnology 23, 1534 - 541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en Shinozaki y otros, Development 131 , 1651 - 1662 (2004).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en McLean y otros, Stem Cells 25, 29 - 38 (2007).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden estar diferenciadas en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivar la células con activina A y suero, y luego cultivar las células con actívina A y suero de una concentración diferente. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre pluripotentes en un medio que contiene activina A en ausencia de suero, luego cultivar las células con adivina A y suero de diferente concentración. Un ejemplo de este método se describe D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2005.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo por medio de cultivar las células madre plunpotentes en un medio que contiene activina A y un ligando Wnt en ausencia de suero, luego eliminar el ligando Wnt y cultivar la células con activina A y suero. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 1 1/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 11/779,31 1 , cedida a LifeScan, Inc.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie 60/990,529.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,889.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,900.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,908.

Por ejemplo, las células madre pluripotentes se pueden diferenciar en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo mediante el tratamiento de las células madre pluripotentes de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos con núm. de serie núm. 61/076,915.

Diferenciación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo La formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se puede determinar por medio de pruebas en presencia de los marcadores antes y después de seguir un protocolo específico. Las células madre pluripotentes no expresan, típicamente, tales marcadores. Por lo tanto, la diferenciación de las células pluripotentes se detecta cuando las células comienzan a expresarlos.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar exponiendo una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expreso mediante células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de la transcriptasa inversa (RT-PCR), transferencias Northern, hibridación in situ (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Bíology (Ausubel y otros, eds., suplemento 2001 )), e inmunoensayos, tales como el análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia Western, y por marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p. ej., Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Las características de las células madre pluripotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y las características adicionales de las células madre pluripotentes continúan por ser identificadas. Los marcadores de las células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA3, SSEA4, Tra1 -60, o Tra1-81.

Después de tratar las células madre pluripotentes con los métodos de la presente invención, las células diferenciadas se pueden purificar mediante la exposición de una población de células tratadas en un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico, tal como CXCR4, expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo.

Formación de células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático mediante cualquier método en la materia o cualquier método propuesto en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al tratar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con un factor de crecimiento de fibroblastos y el inhibidor KAAD-ciclopamina de la vía de señalización hedgehog, luego, al eliminar el medio que contiene el factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina y, posteriormente, cultivar las células en un medio que contiene ácido retinoico, un factor de crecimiento de fibroblasto y la KAAD-ciclopamina. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 1 /736,908 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento de fibroblastos durante un período de tiempo, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 1 1/779,31 1 , cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo, de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/990,529.

Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje del endodermo pancreático todavía no han sido identificadas. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje del endodermo pancreático. Los marcadores específicos del linaje del endodermo pancreático incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, HLXB9, PTF1 alfa, PDX1 , HNF6, o HNF1 beta.

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar por medio de exponer una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador proteico expresado por las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa, membrana de Northern, hibridación ¡n situ (véase, por ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros., eds., suplemento 2001 )), e inmunoensayos, tal como el análisis inmunohistoquimico de material seccionado, transferencia Western, y por marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p. ej., Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático Las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino mediante cualquier método en la materia o mediante cualquier método explicado en esta invención.

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se pueden diferenciar en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático de acuerdo con los métodos descritos en D'Amour y otros, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al cultivar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendin 4, luego al eliminar el medio que contiene DAPT y exendin 4 y, posteriormente, al cultivar células en un medio que contiene exendin 1 , IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se explica en Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).

Por ejemplo, las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático al cultivar las células que expresan los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendin 4, luego al eliminar el medio que contiene exendin 4 y, posteriormente, al cultivar las células en un medio que contiene exendin 1 , IGF-1 y HGF. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col., Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático mediante el cultivo de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene DAPT y exendin 4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y col. , Nature Biotechnology, 2006.

Por ejemplo, las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian aún más en marcadores característicos del linaje endocrino pancreático por medio del cultivo de células que expresan marcadores característicos de la linaje del endodermo pancreático en un medio que contiene exendina-4. Un ejemplo de este método se describe en D' Amour y otros, Nature Biotechnology, 2006.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino, por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 11/736,908 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie /779,31 , cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático con un factor que inhibe la vía de señalización Notch, de acuerdo con los métodos descritos en la publicación de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/953,178 cedida a LifeScan, Inc.

En un aspecto de la presente invención las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se diferencian, además, en células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino por medio del tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático, de conformidad con los métodos descritos en la solicitud de patente de los EE.UU. núm. de serie 60/990,529.

En un aspecto de la presente invención la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático que comprende el tratamiento de las células que expresan los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con un medio que comprende una cantidad suficiente de un agonista del receptor de TGF-ß, para causar un aumento en la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. de serie 61/1 10,278.

Detección de células que expresan marcadores característicos del linaje pancreático endocrino.

Los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y los marcadores adicionales característicos del linaje pancreático endocrino continúan siendo identificados. Estos marcadores se pueden usar para confirmar que las células tratadas de acuerdo con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje pancreático endocrino. Los marcadores específicos del linaje pancreático endocrino incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción tales como, por ejemplo, NGN3, NEUROD, o ISL1.

Los marcadores característicos de las células del linaje celular ß son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia y los marcadores característicos del linaje celular ß continúan siendo identificados. Estos marcadores pueden usarse para confirmar que las células tratadas de conformidad con la presente invención se han diferenciado para adquirir las propiedades características del linaje de las células ß. Las características específicas del linaje de las células ß incluyen la expresión de uno o más factores de transcripción, tales como, por ejemplo, PDX1 , NKX2.2, NKX6.1 , ISL1 , PAX6, PAX4, NEUROD, HNF1 beta, HNF6, HNF3 beta, o MAFA, entre otros. Estos factores de transcripción se establecen bien en la materia para la identificación de las células endocrinas. Ver, p. ej., Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).

La eficiencia de la diferenciación se puede determinar mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (tal como un anticuerpo) que reconoce específicamente a un marcador proteico expresado por células que expresan los marcadores característicos del linaje pancreático endocrino. Alternativamente, la eficacia de la diferenciación puede determinarse mediante la exposición de una población de células tratadas a un agente (como un anticuerpo) que específicamente reconozca un marcador proteínico expresado por células que expresan marcadores característicos del linaje celular ß.

Los métodos para evaluar la expresión de los marcadores de ácido proteico y nucleico en células aisladas o cultivadas son estándares en la materia. Estos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR) cuantitativa, membrana de Northern, hibridación in situ (véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, eds., suplemento 2001)), e inmunoensayos, tal como el análisis inmunohistoquímico de material seccionado, transferencia Western, y por marcadores que son accesibles en células intactas, análisis de citometría de flujo (FACS) (véase, p. ej., Harlow and Lañe, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 998)).

En un aspecto de la presente invención la eficacia de la diferenciación se determina al medir el porcentaje de células positivas a la insulina en un cultivo de células dado después del tratamiento. En una modalidad los métodos de la presente invención producen aproximadamente 100 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 80 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 70 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 60 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 50 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 40 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 30 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 20 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 10 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado. En una modalidad alterna los métodos de la presente invención producen aproximadamente 5 % de células positivas a la insulina en un cultivo determinado.

En un aspecto de la presente invención la eficacia de la diferenciación se determina al medir la secreción de insulina estimulada por glucosa, como se detecta al medir la cantidad del péptido C liberado por las células. En una modalidad las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 1000 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 800 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 700 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 600 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 500 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 400 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 300 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 200 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 100 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 90 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 80 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 70 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 60 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 50 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 40 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 30 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 20 ng de péptido C/pg de ADN. En una modalidad alterna las células producidas por los métodos de la presente invención producen aproximadamente 10 ng de péptido C/pg de ADN.

Aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático En una modalidad la presente invención proporciona un método para aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que comprende las etapas de cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en un medio que comprende una cantidad suficiente de un inhibidor de quinasa que depende en ciclina para causar un aumento en la expresión de MAFA.

El inhibidor de quinasa que depende en ciclina puede inhibir la quinasa 1 que depende de ciclina. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede inhibir la quinasa 2 que depende de ciclina. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede inhibir la quinasa 4 que depende de ciclina. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede inhibir quinasa 5 que depende de ciclina. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede inhibir la quinasa 9 que depende de ciclina. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede inhibir las múltiples isoformas de quinasa que depende de ciclina, y cualquier combinación de éstas.

El inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede ser una proteína. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede ser un péptido. Alternativamente, el inhibidor de quinasa que depende de ciclina puede ser una molécula pequeña. En una modalidad el inhibidor de quinasa que depende de ciclina de pequeña molécula se selecciona del grupo que consiste de 7-n-butil-6-(4-hidroxifenil)[5H]pirrolo[2,3-b]pirazina, 9-Nitro-7,12-dihidroindolo[3,2-d][1 ]benzazepin-6(5H)-ona, 3-(6-Oxo-9-nitro-5,6,7, 12-tetrahidroindolo[3,2-d][1]benzazepin-2-il)propionitrilo, (2R)-2-((6-((3-amino-5-clorofenil)amino)-9-(1-metiletil)-9H-purin-2-il)amino)-3-metil-1-butanol, arciraflavina A, [6-bencilam¡no-2-(3-hidroxipropilamino)-9-isoprop¡lpur¡na, butirolactona I, (Z)-1 -(3-etil-5-methoxy-2,3-dihidrobenzot¡azol-2-ilideno)propan- 2- ona, 2-(3-hidroxipropilamino)-6-(o-hidroxibencilamino)-9-¡sopropilpurina, 1 -(2,6-diclorofen¡l)-1 ,5-dih¡dro-6-((4-(2-h¡drox¡etoxi)fen¡l)met¡l)-3-(1-met¡let¡l)-4H-pirazolo[3,4-d]p¡rim¡din-4-ona, Cdk/péptido III inhibidor de la ciclina, 3-(2-cloro- 3- indolilmetileno)- ,3-dihidroindol-2-ona, etil-(6-hidroxi-4-fenilbenzo[4,5]furo[2,3-b])piridina-3-carboxilato, RO-3306, N-(cis-2-aminociclohexil)-N-(3-clorofenil)-9-etil-9H-purina-2,6-diamina, 6-ciclohexilmetoxi-2-(4'-sulfamoylanilino)purina, 5-Amino-3-((4-(aminosulfonil)fenil)amino)-N-(2,6-difluorofenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-1 -carbotioamida, 3-amino-1 H-pirazolo[3,4-b]quinoxalina, inhibidor I de Cdk2, inhibidor II de Cdk2, 2(bis-(hidroxietil)amino)-6-(4-metoxibencilamino)-9-isopropilpurina, 4-(6-ciclohexilmetoxi-9H-purin-2-ilamino)-N,N-dietilbenzamida, N4-(6-aminopirimidin-4-il)-sulfanilamida, (4-(2-amino-4-metiltiazol-5-il)pirimidin-2-il)-(3-nitrofenil)amina, 2-bromo-12, 13-dihidro-5H-indolo[2,3-a]pirrolo[3,4-c]carbazol-5,7(6H)-diona, 1 ,4-dimetoxiacridina-9(10H)-tiona, 5-(N-(4-metilfenil)amino)-2-metil-4,7-dioxobenzotiazol, 4-(3,5-diamino-1 Hpyrazol-4-ilazo)-fenol, 2-(2-hidroxietilamino)-6-(3-cloroanilino)-9-isopropilpurina, fscaplisina, indirubin-3'-monoxima, indirubin-3'-monoxima, 5-yodo-, ácido indirubin-3'-monoxima-5-sulfónico, isogranulatimida, 2-(2-hidroxietilamino)-6-bencilamino-9-metilpurina, 6-(2-hidroxibencilamino)-2-((1 R)- (hidroximetil)propil)amino)-9-isopropilpurina, 5-bromo-3-(2-(4-fluorofenil)-2-oxoetilidina)-1 ,3-dihidroindol-2-ona, N6,N6-dimetiladenina, 2-(1 R-isopropil-2- h¡droxietilamino)-6-(3-cloroan¡lino)-9-¡sopropil-purina, rapamicina, 2-(R)-(1 -etil-2-hidrox¡et¡lamino)-6-bencilam¡no-9-isopropilpurina, escitonemina, 3-[1 -(3H-imidazol-4-¡l)-met-(Z)-¡lideno]-5-metox¡-1 ,3-dihidroindol-2-ona, y 4-(3'-hidroxifenil)amino-6,7-dimetoxiquinazol¡na.

En una modalidad la quinasa que depende de ciclina es etil-(6-hidroxi-4-fenilbenzo[4,5]furo[2,3-b])piridina-3-carboxilato. En una modalidad el etil-(6-hidroxi-4-fenilbenzo[4,5]furo[2,3-b])piridina-3-carboxilato se añade a las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino a una concentración de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 10 µ? durante aproximadamente uno a siete días.

En una modalidad, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino se tratan con etil-(6-hid roxi-4-fenilbenzo[4,5]furo[2,3-b])piridina-3-carboxilato durante aproximadamente uno a aproximadamente siete días.

La presente invención se ilustra, pero no está limitada a, los siguientes ejemplos.

Ejemplos Ejemplo 1 Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1 a células endocrinas pancreáticas en ausencia de suero fetal bovino Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en el pasaje 52 se cultivaron en platos recubiertos de MATRIGEL® (dilución 1 :30) y expuestas al siguiente protocolo de diferenciación, a fin de diferencias las células a células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. a. Medio RPMI suplementado con BSA al 2 % (cat. núm. 52401 , MP Biomedical, Ohio), y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml WNT-3a (cat. núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (cat. núm. 100-18B, PeproTech, NJ), durante un día seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y 100 ng/ml de activina A más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (Etapa 1), después, b. DMEM/F12 + BSA al 2 % + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 µ? Ciclopamina-KAAD (núm. 239804, Calbiochem, CA) durante dos días (Etapa 2), después, c. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 50 ng/ml FGF7 + 0.25 µ? de ciclopamina- KAAD + 2 µ? de ácido retinoico (RA) (Sigma, MO) + 10O ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN) durante cuatro días (Etapa 3), después, d. DME /F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 100 ng/ml de Noggin + 1 µ? de DAPT (un inhibidor de gamma-secretasa) (cat. núm. 565784, Calbiochem, CA) + 1 µ de inhibidor II de ALK5 (cat. núm. 616452, Calbiochem, Ca) + 100 ng/ml de Netrin-4 (R&D Systems, MN) durante tres días (Etapa 4), después, e. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 1 µ? de inhibidor II de ALK5 (Calbiochem, Ca) durante siete días (Etapa 5).

El medio se cambió diariamente. En cada etapa se calculó el número de células usando un hemocitómetro y se tomó ARN para análisis de PCR. Todas las muestras se tomaron en triplicado.

Ejemplo 2 Evaluación de los efectos de compuestos a partir de la Genoteca II de inhibidores de quinasa EMD en células que han sido tratadas de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 1 Células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 44 fueron sembradas en platos de 24 pozos recubiertos de MATRIGEL™ (dilución 1 :30), y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 hasta la Etapa 5. Después, las células fueron tratadas durante cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1 % que contiene un compuesto de una Genoteca de compuestos EMD Calbiochem (cat. núm. 539745, Calbiochem, San Diego, Ca) a una concentración final de 1 µ?. Los pozos que contenían vehículo se incluyeron como un control. Durante todo el protocolo, el medio se cambió diariamente. Todas las muestras fueron tratadas en duplicado. Una vez terminado este tratamiento, se tomó ARN para análisis de PCR. Las muestras fueron analizadas por PCR en tiempo real, para expresión de insulina, glucano, MAFA, y Arx4. Los resultados se expresaron como una relación de insulina/glucagon (Figura 1A), o MAFA contra ARX4 (Figura 1 B) de las muestras tratadas con relación al control sin tratar, como se midió por PCR en tiempo real. El PubChem con núm. de ident. del compuesto para cada número de pozo se enumera en el Cuadro 1 .

El tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con los compuestos A6, B7, B8, o C2 a una concentración de 1 µ? resultó en una relación de expresión de insulina/glucagon de aproximadamente 3.0 o mayor (véase la Figura 1A).

Luego se examinó el efecto de estos compuestos en la relación de MAFA/ARX4, y se observó que el tratamiento de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con varios de los compuestos resultó en un cambio mucho mayor en la relación de MAFA a ARX4 que otros compuestos probados en la genoteca: las células tratadas con el compuesto C2 mostraron una relación de MAFA ARX4 de aproximadamente 1000. El tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el compuesto C2 resultó en una relación de MAFA/ARX4 de aproximadamente 100. (Ver la Figura 1 B).

Ejemplo 3 Los efectos del tratamiento del inhibidor de quinasa que depende de cíclina en la insulina y la expresión de MAFA en las células ha sido tratado de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 1 Varios de los compuestos que aumentaron la relación de expresión de insulina a glucagon, o la expresión de MAFA a ARX4 en el Ejemplo 2 fueron inhibidores de quinasa que depende de ciclina. Uno de estos compuestos fue el compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 (5-amino-3-((4-(aminosulfonil)fenil)amino)-N-(2,6-difluorofenil)-1 H-1 ,2,4-triazoM -carbotioamida) (cat. núm. 217714; Calbiochem, San Diego, Ca). Para confirmar estas observaciones, las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 42 se cultivaron en platos de 1 0 cm2 recubiertos de MATRIGEL® y se trataron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 hasta la Etapa 5. Después de la Etapa 5, las células se trataron con DMEM/F12 que contiene B27 al 1 % que contiene 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante seis días. El medio fue cambiado cada otro día. Antes del tratamiento con el compuesto se tomaron muestras de las células para análisis de PCR en tiempo real, y al segundo día y quinto día del tratamiento con el compuesto.

En las Figuras 2A-2F se muestran micrografías de las células al cuarto día o sexto día del tratamiento con el compuesto contra los controles sin tratar. Las células sin tratar están compactadas apretadamente (Figuras 3A y 3D) y es difícil de distinguir las células individuales. Sin embargo, después de tratamiento con 0.5 µ? o 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante seis días los núcleos individuales eran visibles (Figuras 2E y 2F) en comparación con el control sin tratar (Figura 2D), para indicar que hubo diferenciación en la población celular. Esto se acompañó, además, por alguna muerte celular, que puede verse por los espacios en la capa de células, como se muestra en las Figuras 2B y 2C.

El tratamiento de las células con el compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 resultó en el aumento en la expresión de insulina, glucagon, MAFA, MAFB y somatostatina, aunque en grados diferentes. La inducción relativa de la presión de genes por tratamiento, en comparación con los cultivos del día 0 (pretratamíento), se muestra en las Figuras 3A-3V. Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que fueron tratadas con 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 resultó en un aumento de 1.5 veces en la expresión de glucagon a 48 horas de tratamiento. Esta expresión disminuyó a los niveles de pretratamíento después de 5 días de tratamiento. No se observó aumento en la expresión de glucagon con el tratamiento de 0.5 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797. (Ver la Figura 3A).

Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que fueron tratadas con 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante cinco días, resultaron en un aumento de 1.5 veces en la expresión de insulina, (véase la Figura 3B).

Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que fueron tratadas con 1 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante cinco días, resultaron en un aumento de aproximadamente 200 veces en la expresión de MAFA. (véase la Figura 3D).

Las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que fueron tratadas con 0.5 µ? del compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante cinco días, resultó en un aumento de 1.5 veces en la expresión de MAFB. (Ver la Figura 3C). Se observó un aumento que depende en la dosis en la expresión de somatostatína (Figura 3E).

No se observó cambio en la expresión de amilasa en las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático que fueron tratadas con el compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 durante cinco días, (véase la Figura 3F). Sin embargo, se observaron disminuciones en el nivel de expresión de PAX4 (Figura 3H), NKX6.1 (Figura 3K), PDX1 (Figura 3L), NEUROD (Figura 30), y BRN4 (Figura 3Q).

Ejemplo 4 Tratamiento inhibidor de quinasa que depende de ciclina aumentó la expresión de MAFA en aglomerados tipo isletas.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 52 se cultivaron en platos recubiertos de MATRIGEL® (dilución 1 :30) y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Se añadió una etapa adicional (Etapa 6), para madurar aún más las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. La Etapa 6 en este ejemplo consistió de un tratamiento de siete días en DMEM/F 2 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 %. El medio se cambió diariamente.

Después de la Etapa 6, las células se trataron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 1 X de Accutase (Sigma, MO). Se eliminó el Accutase, y DMEM/12 + B27 al 1 % se añadió a las células. Se eliminaron las células unidas con una rasqueta para células, y se resuspendieron nuevamente y pasaron a través de un colador de células de 40 pm. Las células retenidas en el colador se eliminaron al enjuagar en un medio basal y se cultivaron en suspensión en placas de cultivo Ultra-Low (cat. núm. 3471 , Corning, Ma). después, las células se trataron como sigue: Las células se cultivaron en DMEM/F12 + B27 al 1 %, que contiene 20 ng/ml de activina A (AA), 1 pm de inhibidor III CDK (cat. núm. 217714, Calbiochem, Ca) durante 10 días (Etapa 7). Las células tratadas con el vehículo se incluyeron como controles. Se tomaron muestras los días 7 al 10 para análisis de PCR y teñido de ditizona. Las células cultivadas en suspensión de acuerdo con los métodos esbozados en este ejemplo asumieron una morfología similar a aglomerados pancreáticos tipo isletas. El tratamiento con el inhibidor de CDK III no parece afectar la morfología de los aglomerados tipo isletas.

En las Figuras 4A-4I se muestra el efecto de tratamiento de inhibidores de CDK III en el perfil de expresión de los genes de los clústeres celulares. El tratamiento con el inhibidor CDK III aumentó la expresión de marcadores asociados con el linaje endocrino pancreático y, particularmente, aumentó la expresión del factor de transcripción de proinsulina, MAFA.

En las Figuras 5A-5B se muestra el efecto del inhibidor CDK III en el manchado con ditazona (DTZ) de los clústeres. Los clústers de células tratadas con el inhibidor de CDK y teñidos con DTZ, mostraron un patrón de manchado más rojizo en comparación con los clústers no tratados con el inhibidor de CDK III.

Ejemplo 5 Análisis de FACS de células productoras de insulina por los métodos de la presente invención.

Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 42 se cultivaron en placas recubiertas de MATRIGEL®, y diferenciadas en células productoras de insulina con el siguiente protocolo: a. medio RPMI suplementado con BSA al 2 % (cat. núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio), y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT-3a (cat. núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (cat. núm. 100-18B, PeproTech, NJ), durante un día seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y 100 ng/ml de activina A más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (Etapa 1 ), después, b. DMEM/F12 + BSA al 2 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? Ciclopamina-KAAD (núm. 239804, Caíbiochem, CA) durante dos días (Etapa 2), después, c. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? de Ciclopamina-KAAD + 2 µ? de ácido retinoico (RA) (Sigma, MO) + 00 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN) durante cuatro días (Etapa 3), después, d. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 100 ng/ml de Noggin + 1 µ? de DAPT (un inhibidor de la gamma-secretasa) (cat. núm. 565784, Caíbiochem, CA) + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (cat. núm. 616452, Caíbiochem, Ca) + 100 ng/ml de Netrin-4 (R&D Systems, MN) durante tres días (Etapa 4), después, e. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Caíbiochem, Ca) durante siete días (Etapa 5), después, f. DMEM/F12 + 1 % B27 durante siete días (Etapa 6), después, g. Tratamiento con Accutase durante 5 minutos, seguido por raspado para eliminar cualquier célula unida. Después, se pasó la suspensión de células a través de un colador celular de 40 pm. Las células retenidas en el colador se eliminaron al enjuagar en un medio basal y se cultivaron en suspensión en placas de cultivo en DMEM-alta glucosa (cat. núm. 1 1995-073, Invitrogen, Ca) + B27 al 1 % + 20 ng/ml de activina A (AA) 1 pm de inhibidor de CDK III (cat. núm. 217714, Calbiochem, Ca) durante 5 días (Etapa 7).

Los clústers tipo isletas se dispersaron en células únicas usando TrypLE Express (Invitrogen, Carlsbad, CA) y lavados en PBS frío. Para fijación, las células se suspendieron nuevamente en 200-300 µ? de regulador Cytofix/Cytoperm (BD 554722, BD, Ca) y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron dos veces en 1 mi de solución de regulador Perm/Wash (Perm./Lavado) (BD 554723) y se suspendieron nuevamente en 100 pl de solución de teñido/bloqueo que contiene 2 % de suero normal de cabra en regulador Perm/Wash (Perm./Lavado). Para el análisis citométrico de flujo, las células se mancharon con los siguientes anticuerpos primarios: antiinsulina (mAb de conejo, Cell Signaling núm. C27C9; 1 : 100 dilución); anti-glucagon (Mouse Mab, Sigma No. G2654, 1 : 100); anti-sinaptofisina (anticuerpo policlonal de conejo, DakoCytomation No A0010, 1 :50). Las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C seguido por dos lavadas en regulador Perm/Wash buffer y 30 minutos adicionales de incubación en anticuerpos secundarios adecuados como sigue: cabra anti-conejo Alexa 647 (Invitrogen núm. A21246) o cabra anti-ratón 647 (Invitrogen núm. A21235); cabra anti-conejo R-PE (BioSource No. ALI4407). Todos los anticuerpos secundarios se usaron en una dilución de 1 :200. Las células se lavaron al menos una vez en regulador Perm/Wash y se analizaron con BD FACSArray. Al menos 10,000 eventos se adquirieron para el análisis. Los controles incluyeron las células H1 no diferenciadas y la línea celular ß-TC (CRL- 1506™ ATCC, VA).

En las Figuras 6A-6C se muestra el por ciento de células insulina positivo, sinaptofisina positivo, y glucagon positivo en las células después de tratamiento con la Etapa 7, en un vehículo que contiene el medio. En las Figuras 7A-7C se muestra el por ciento de células insulina positivo, sinaptofisina positivo, y glucagon positivo después del tratamiento con la Etapa 7 en un medio que contiene 1 µ? de inhibidor de CDK III durante 5 días. El número de células insulina positivo hormonales individuales aumentó de 3 % a 8 % después del tratamiento con el inhibidor de CDK. Además, el por ciento de células (insulina y glucano positivo) hormonales disminuyó después del tratamiento con el CDK inhibidor.

Ejemplo 6 Cinética de la expresión de MAFA inducido por inhibidor de CDK.

Células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 42 se cultivaron en placas recubiertas de MATRIGEL®, y se diferenciaron en células productoras de insulina con el siguiente protocolo: a. medio RPMI suplementado con BSA al 2 % (cat. núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio), y 100 ng/ml de adivina A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT-3a (cat. núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (cat. núm. 100-18B, PeproTech, NJ), durante un día seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y 100 ng/ml de activina A más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (Etapa 1 ), después, b. DMEM/F12 + BSA al 2 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? de ciclopamina- KAAD (#239804, Calbiochem, CA) durante dos días (Etapa 2), después, c. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? de ciclopamina- KAAD + 2 µ? de ácido retinoico (RA) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN) durante cuatro días (Etapa 3), después, d. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 100 ng/ml de Noggin + 1 µ? de DAPT (un inhibidor de gamma-secretasa) (cat. núm. 565784, Calbiochem, CA) + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (cat. núm. 616452, Calbiochem, Ca) + 100 ng/ml de Netrin-4 (R&D Systems, MN) durante tres días (Etapa 4), después, e. DMEM/F12 + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Calbiochem, Ca) durante siete días (Etapa 5), después, f. DMEM/F12 + B27 al 1 % durante siete días (Etapa 6), después, g. tratamiento con Accutase durante 5 minutos, seguido por raspado para eliminar cualesquiera células unidas restantes. Después, se pasó la suspensión a través de un colador de 40 pm. Las células retenidas en el colador se eliminaron enjuagando en un medio basal y se cultivaron en suspensión en placas de cultivo Ultra-Low en DMEM-Alta glucosa (cat. núm. 1 1995-073, Invitrogen, Ca) + B27 al 1 % + 20 ng/ml de activina A (AA) 2 pm de inhibidor de CDK III (cat. núm. 217714, Calbiochem, Ca) durante 1-8 días (Etapa 7).

Se tomaron muestras para análisis de PCR en los días 1 , 2, 3, y 4. Después de 4 días de tratamiento con inhibidor de CDK, el inhibidor de CDK se eliminó del cultivo y las células se cultivaron 4 días adicionales en DMEM-F12 + B27 al 1 % + 20 ng/ml de activina A. Al final de los cuatro días se tomaron muestras en triplicado para análisis de PCR.

En las Figuras 8A-8B se muestra el patrón de expresión de MAFA e insulina en diversos momentos específicos de la Etapa 7. El tratamiento con inhibidor de CDK resultó en un aumento significativo en la expresión de MAFA e insulina que aumentó como una función del tiempo. Sin embargo, la eliminación del inhibidor de CDK resultó en una caída significativa de tanto la expresión de MAFA e insulina en las muestras obtenidas cuatro días después de la eliminación del compuesto.

Ejemplo 7 Evaluación de los efectos de compuestos de la Genoteca de inhibidores de quinasa BIQ OL™ en las células que han sido tratadas de acuerdo con el protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 1 .

Células de la linea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 51 se sembraron sobre platos de 24 pozos recubiertos con MATRIGEL® (dilución 1 :30), y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descrito en el Ejemplo 1 hasta la Etapa 5. Después, las células se cultivaron durante un día en DMEM/F12 + B27 al 1 % y, después, se trato durante seis días en DMEM/F12 + B27 al 1 % que contiene un compuesto de la Genoteca de compuestos BIOMOL™ (cat. núm. 2832, BIOMOL, Plymouth Meeting, Pa) a una concentración final de 4 µ?. Los pozos que contenían vehículo se incluyeron como un control. Durante el protocolo de tratamiento, el medio de protocolo que contiene vehículo o compuesto se cambio cada otro día. Todas las muestras se trataron en duplicado. Al finalizar este tratamiento, se tomó ARN para análisis de PCR. Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real, para expresión de insulina, glucagon, MAFA, y ARX4. Los resultados se expresan como una relación de insulina/glucagon (Cuadro 2), o MAFA contra Arx4 (Cuadro 2) de las muestras tratadas con relación al control sin tratar, como se mide por PCR en tiempo real. El número de cat. correspondiente, el número CAS, y el nombre del compuesto o número de identificación alfa numérico para cada pozo se enumeran en el Cuadro 3.

El tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con compuestos C8 o F1 a una concentración de 4 µ? resultó en una relación de expresión de insulina/ glucagon de aproximadamente 10.0 o mayor. Las células tratadas con D9 tuvieron una relación de expresión de insulina / glucagon de aproximadamente 1840.0 (Cuadro 2).

Después, examinamos el efecto de estos compuestos en la relación de MAFA/ARX4, y observamos que el tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con varios de los compuestos resultó en un cambio mucho mayor en la relación de MAFA a ARX4 que otros compuestos probados en la genoteca: Las células tratadas con el compuesto B6 o F1 mostraron una relación de MAFA/ARX4 de aproximadamente mayor de 10. El tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el compuesto C8 resultó en una relación de MAFA/ ARX4 de aproximadamente 84, mientras que las células tratadas con D9 tuvieron una relación MAFA/ ARX4 de aproximadamente 212. (Cuadro 2).

Ejemplo 8 Efecto del inhibidor de quinasa que depende de ciclina en la expresión de insulina y MAFA en células tratadas de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 1.

Células de la linea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 51 se sembraron sobre platos de 24 pozos recubiertos con MATRIGEL™ (dilución 1 :30), y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 hasta la Etapa 5. Después, las células se cultivaron durante ocho días en DMEM/F12 + B27 al 1 % y después, se trataron durante cuatro días en DMEM/F12 + B27 al 1 % que contiene un inhibidor de quinasa que contiene ciclina a una concentración final de 0.6125, 1 .25, o 5.0 µ?. Probamos 6 inhibidores: PubChem con núm. de ident. 5330812 (EMD cat. núm. 217714), PubChem con núm. de ident. 4566 (EMD cat. núm. 217713), PubChem con núm. de ident. 5330797 (EMD cat. núm. 219476), PubChem con núm. de ident. 73292 (EMD cat. núm. 341251 ), PubChem con núm. de ident. 4592 (EMD cat. núm. 495620), y PubChem con núm. de ident. 160355 (EMD cat. núm. 557360). Pocilios que contienen vehículo se incluyeron como un control. Por todo el protocolo de tratamiento, el medio que contiene vehículo o compuesto se cambió cada otro día. Todas las muestras se trataron en duplicado. Al finalizar este tratamiento se tomó ARN para análisis de PCR. Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real con respecto a la expresión de insulina, glucagon, MAFA, y ARX4. Los resultados se expresan como cambio múltiple con relación al control tratado con vehículo, como se mide por la PCR en tiempo real.

Hemos observado que los compuestos PubChem con núm. de ident. 5330812, PubChem con núm. de ident. 4566, PubChem con núm de ident. 5330797, y PubChem con núm. de ident. 73292 todos estimularon la expresión de MAFA en las concentraciones probadas (Cuadro 4). PubChem con núm. de ident. 4592 y PubChem con núm. de ident. 160355 no estimularon MAFA en las concentraciones probadas (Cuadro 4). Los compuestos PubChem con núm. de ident. 5330812, PubChem con núm de ident. 4566, PubChem con núm. de ident. 5330797, PubChem con núm de ident. 4592 y PubChem con núm. de ident. 160355 todos parecen estimular la expresión de insulina (Cuadro 4). El compuesto PubChem con núm. de ident. 5330797 redujo tanto la expresión de glucagon como Arx4 (Cuadro 4) mientras que estimuló la expresión de MAFA.

Ejemplo 9 Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la linea celular H1 a células endocrinas pancreáticas con DMEM que contiene 25 mM de glucosa (DMEM-HG), carentes de suero bovino fetal Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se cultivaron en platos recubiertos con MATRIGEL®(dilución 1 :30) y se diferenciaron en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con el siguiente protocolo: a. medio RPMI suplementado con BSA al 2 % (cat. núm. 152401 , MP Biomedical, Ohio), y 100 ng/ml de activina A (R&D Systems, MN) más 20 ng/ml de WNT-3a (cat. núm. 1324-WN-002, R&D Systems, MN) más 8 ng/ml de bFGF (cat. núm. 100-18B, PeproTech, NJ), durante un día seguido de tratamiento con medio RPMI suplementado con BSA al 2 % y 100 ng/ml activina A más 8 ng/ml de bFGF durante dos días adicionales (Etapa 1 ), después, b. medio RPMI suplementado con BSA al 2 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? de Ciclopamina- KAAD (núm. 239804, Calbiochem, CA) durante dos días (Etapa 2), después, c. DMEM-HG + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 50 ng/ml de FGF7 + 0.25 µ? de Ciclopamina- KAAD + 2 µ? de ácido retinoico (RA) (Sigma, MO) + 100 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN) durante seis días (Etapa 3), después, d. DMEM-HG + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 100 ng/ml de Noggin + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (cat. núm. 616452, Calbiochem, Ca) durante tres días (Etapa 4), después, e. DMEM-HG + B27 (Invitrogen, CA) al 1 % + 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Calbiochem, Ca) durante siete días (Etapa 5).

El medio se cambió diariamente. En cada etapa se calculó en número de células con un hemocitómetro y se tomó ARN para análisis de PCR. Todas las muestras se tomaron en triplicado.

Ejemplo 10 Evaluación de los efectos de compuestos de la genoteca I de inhibidores de quinasa EMD en células tratadas de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 9 Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 45 se sembraron sobre platos de 24 pocilios recubiertos con MATRIGEL® (dilución 1 :30), y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9 hasta la Etapa 5. Después, las células se alimentaron y trataron en los días 1 , 3, y 5 de la Etapa 5 con un medio que comprende DMEM-HG, B27 (Invitrogen, CA) al 1 %, 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Calbiochem, Ca) y un compuesto de la genoteca de compuestos EMD Calbiochem solubilizados en DMSO (cat. núm. 539744, Calbiochem, San Diego, Ca) y se trataron a una a una concentración final de 2.5 µ?. Los pocilios que contienen vehículo se incluyeron como un control. Por todo el protocolo, el medio se cambió diariamente excepto en la Etapa 4 cuando el medio se cambió cada otro día. Todas las muestras se trataron en duplicado.

Al finalizar este tratamiento se tomó ARN para análisis de PCR. Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real para expresión de MAFA. Los resultados se expresan como el aumento múltiple en la expresión de MAFA contra células madre embrionarias humanas H1 sin tratar (Cuadro 5), como se mide por PCR en tiempo real.

El tratamiento de las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con compuestos A4 (cat. núm. 124001 , inhibidor de Akt IV), E8 (cat. núm. 527450, inhibidor de PKR), y F9 (cat. núm. 539648, estauroporina, N-benzoil-) a una concentración de 2.5 µ?, resultó en un aumento en la expresión de MAFA al menos 4 veces que los controles tratados con vehículo (Cuadro 5). El tratamiento con el compuesto E6 (cat. núm. 521233, PDGF inhibidor del receptor de la tirosina quinasa IV) a una concentración de 2.5 µ? resultó en un aumento de la expresión de MAFA al menos 2.5 veces mayor que los controles tratados con vehículo (Cuadro 5).

Ejemplo 11 Evaluación de los efectos de compuestos de la qenoteca de inhibidores de quinasa II en células tratadas de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 9 Las células de la línea H1 de células madre embrionarias humanas en el pasaje 46 se sembraron sobre platos de 24 pocilios recubiertos con MATRIGEL® dilución 1 :30), y se diferenciaron de acuerdo con los métodos descrito en el Ejemplo 9 hasta la Etapa 5. Después, las células se alimentaron y se trataron en los días 1 , 3, y 5 de la Etapa 5 con un medio que comprende DMEM-HG, B27 (Invitrogen, CA) al 1 %, 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Calbiochem, Ca) (Etapa 5) y un compuesto de la genoteca de compuestos EMD Calbiochem II solubilizados en DMSO (Cuadros 1 y 6, Calbiochem, San Diego, Ca) se trataron a una concentración final de 2.5 µ?. Los pocilios que contenían vehículo se incluyeron como control. Por todo el protocolo, el medio se cambio diariamente excepto en la Etapa 5, cuando el medio se cambió cada otro día. Todas las muestras se trataron en duplicado.

Al finalizar este tratamiento se recolectó ARN para análisis de PCR. Las muestras se analizaron por PCR en tiempo real para expresión MAFA. Los resultados para los compuestos que estimularon la expresión de MAFA se muestran y expresan como el aumento múltiple en la expresión de MAFA contra las muestras de control (Figura 9), como se mide por PCR en tiempo real.

Tratamiento de células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático con cualquiera de: alsterpaullone, 2-cianoetilo; SU9516; alsterpaullone; inhibidor III de Cdk1/2; inhibidor de caseína quinasa I, D4476; o inhibidor de MEK1/2 a una concentración de 2.5 µ?, resultó en un aumento de 4.5 veces en la expresión de MAFA en comparación con los controles sin tratar (Cuadro 7).

Ejemplo 12 La inhibición de la progresión del ciclo celular en marcadores que expresan células característicos del linaje endocrino pancreático con inhibidores de molécula pequeña promueve la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático El crecimiento celular resultante de la progresión del ciclo celular puede activarse y mantenerse al estimular las células con factores de crecimiento extracelulares. Los factores de crecimiento se enlazan a los dominios extracelulares de los receptores de factores de crecimiento, que inducen un conmutador de conformación en el dominio intracelular del receptor. Este desplazamiento inicia la dimerización del receptor y la activación de las tirosinas quinasas ubicada en el dominio intracelular del receptor que conduce a la fosforilación y activación de múltiples serinas/treoninas quinasas corriente abajo, que resulta finalmente en la progresión del ciclo celular y la proliferación celular.

Bajo condiciones fisiológicas normales, las células beta pancreáticas maduras, caracterizadas por la expresión de insulina y el factor de transcripción MAFA, están inactivas y tienden a permanecer en G0 del ciclo celular. Sin embargo, para generar suficientes células para formar un órgano funcional y llenar las necesidades de un animal maduro, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático de la presente invención debe ser el ciclaje celular. Por consiguiente, en algún momento en el desarrollo embrionario, las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático de la presente invención se diferencian a células beta y transicionan a partir de una célula que se multiplica activamente en ciclos celulares, a una célula inactiva.

Nuestros datos indican que inhibiendo la progresión del ciclo celular bloqueando las cascadas de señalización con inhibidores de quinasa de molécula pequeña, podemos inducir las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático a expresar MAFA, un marcador de las células beta pancreáticas maduras. Los inhibidores de quinasa dirigidos a un receptor de factor de crecimiento, (inhibidor de receptor de tirosina quinasa PDGF IV), o inhibidores que interrumpen las quinasas corriente abajo de los receptores de tirosina quinasa (inhibidor de MEK1/2, inhibidor de PKR, o inhibidor de Akt IV) interrumpen el factor de crecimiento multiplicador/quinasa basado en la señalización que resulta en la detención del ciclo celular y la inducción de la expresión de MAFA. El uso de un inhibidor de amplio espectro, tal como la estaurosporina, puede inducir eficazmente MAFA; sin embargo, es, además, citotóxico en concentraciones efectivas. Los compuestos más dirigidos, tal como inhibidores de quinasa dependientes de ciclina (Alsterpaullone, 2-Cianoetilo; SU9516; Alsterpaullone; o inhibidor de Cdk1/2 III) inducen MAFA con menos toxicidad que el inhibidor de amplio espectro como la estauroporina.

Para determinar si un inhibidor de quinasa de amplio espectro podría inducir la expresión de MAFA y un fenotipo más maduro en las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático de la presente invención, diferenciamos las células H1 ES humanas de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 9 y las tratamos en los días 1 , 3, y 5 de la Etapa 5 con el inhibidor de proteína tirosina quinasa Genistein, que se ha demostrado que induce la detención de fase G2 en líneas celulares humanas y murinas e inhiben múltiples quinasas. En dosis de 10 y 30 ng/ml, las hormonas endocrinas insulina, somatostatina, y el factor de transcripción MAFA, todas mostraron un aumento de expresión contra los controles sin tratar, mientras que a 10 ng/ml la hormona endocrina glucagon tuvo un aumento de expresión (Figuras 10A-10D). Observamos toxicidad significativa a una dosis de 100 ng/ml de genistein que se correlaciona con pérdida de expresión de insulina, glucagon y somatostatina.

Estos datos indican que al inhibir la progresión del ciclo celular al bloquear las cascadas de señalización con inhibidores de quinasa de molécula pequeña dirigidos a inhibir la transducción de señal a partir de un receptor de factor de crecimiento de tirosina quinasa a través de quinasas de señalización intracelular al núcleo y quinasa que dependen de ciclina, podemos inducir las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático de la presente invención a expresar MAFA, un marcador de células beta pancreáticas maduras.

Las publicaciones citadas en este documento se incorporan como referencias en su totalidad. Aunque los diferentes aspectos de la invención se ilustraron anteriormente con referencia a los ejemplos y las realizaciones preferidas, se apreciará que el alcance de la invención no se define por la descripción anterior, sino por las siguientes reivindicaciones redactadas bajo los principios de la ley de patentes.

CUADRO 1.

Etiqueta alfanumérica del pocilio y el número de identificación PubChem correspondiente para la genoteca de compuestos de inhibidores de quinasa II EMD Calbiochem® Pocilio PubChem con Pocilio PubChem con Pocilio PubChem con Pocilio PubChem con núm. de ident. núm. de ident. núm. de ident. núm. de ident.

A2 16760529 B2 16760303 C2 5330797 D2 9797929 A3 5278396 B3 5326739 C3 3004085 D3 11493598 A4 6605258 B4 5353431 C4 481747 D4 16760417 A5 5005498 B5 2422 C5 1893668 D5 73292 A6 16760286 B6 5472558 C6 9969021 D6 4124851 A7 5326843 B7 2794188 C7 2856 D7 6539732 A8 3641059 B8 5330812 C8 6918386 D8 44801 A9 6604931 B9 438981 C9 10202471 D9 5287844 A10 11524144 B10 6419753 C10 9549301 D10 6538818 A11 9549303 B11 16760346 C11 5339183 D11 10020713 E2 5312137 F2 1 382492 G2 6419739 H2 176155 E3 6419766 F3 11624601 G3 4665 H3 16219471 E4 6419741 F4 490561 G4 4713 H4 3387354 E5 3674 F5 3820 G5 4712 H5 5174 E6 9903786 F6 5312122 G6 5164 H6 5228 E7 6419764 F7 9951490 G7 4987 H7 16760659 E8 8515 F8 389898 G8 9549289 H8 451705 E9 11665831 F9 9549284 G9 5702541 H9 16760660 E10 11422035 F10 1 1644425 G10 5162 H10 5289419 E 11 16760525 F11 509554 G11 5353940 H1 1 9549300 CUADRO 2.

El efecto de los compuestos de la genoteca de compuestos inhibidores BIOMOL en la relación de insulina/glucagon y la expresión de MAFA7Arx4 como se determina por PCR en tiempo real en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. La etiqueta alfanumérica del pocilio corresponde a la identidad del compuesto en el Cuadro 3.

Relación en comparación con Control Pocilio núm. Insulina a glucagon MAFA a Arx4 B1 1.6 0.9 B2 2.4 1.3 B3 2.9 2.9 B4 1.1 2.0 B5 1.3 1.3 B6 1.6 16.3 B7 1.3 0.5 B8 1.6 0.5 B9 1.1 1.5 B10 1.2 1.5 B11 1.1 2.1 B12 1.0 2.0 C1 0.7 0.8 C2 0.9 1.0 C3 1.3 0.9 C4 1.2 1.7 C5 1.0 1.1 C6 1.6 1.2 C7 4.3 0.2 C8 40.2 84.3 C9 0.8 0.5 C10 2.3 1.9 C1 1 1.1 0.4 C12 1.0 0.4 D1 2.7 1.2 D2 3.4 1.3 D3 1.7 2.1 D4 5.8 6.4 D5 1.4 1.1 D6 1.8 3.9 D7 1.7 0.6 D8 2.8 5.1 D9 1842.5 212.6 D10 0.9 1.3 D11 1.0 0.7 D12 1.1 2.5 E1 1.1 0.9 E2 0.8 0.8 E3 1.2 1.0 E4 2.1 1.3 E5 1.3 1.1 E6 2.0 1.5 15 E7 4.8 0.2 E8 3.7 0.0 E9 1 0 0.8 E10 0.6 0.2 E11 1.0 0.3 E12 0.8 0.2 F1 10.3 9.5 F2 2.9 1.9 20 F3 2.6 2.5 F4 1.5 2.7 F5 1.9 1.4 F6 1.6 1.2 F7 1.9 0.6 F8 1.5 0.6 F9 1.0 1.4 F10 5.4 3.4 F11 0.8 1.9 F12 1.0 1.4 G1 0.8 1.2 G2 0.6 1.1 G3 2.0 1.6 G4 1.3 1.6 G5 1.7 1 5 G6 1.5 1.3 G7 4.6 0.2 G8 3.9 0.4 10 G9 1.0 0.7 G10 1.3 0.7 G11 1.9 0.6 G12 1.4 0.8 H1 3.1 0.6 H2 1.8 3.5 H3 1.8 3.9 H4 1.2 4.0 15 H5 1.8 2.0 H6 1.4 2.9 H7 1.5 0.6 H8 2.1 0.8 control vehículo 1.0 1.0 CUADRO 3.

Etiqueta alfanumérica del pocilio y el número de cat. correspondiente, CAS núm.. v el nombre del compuesto o número de identificación para la genoteca de compuestos inhibidores de quinasa BIOMOL UBICACION DE LA Cat núm. CAS núm. NOMBRE DEL COMPUESTO O NUMERO DE PLACA IDENT.

B1 EI-360 167869-21-8 PD-98059 B2 EI-282 10951 1-58-2 U-0126 B3 EI-286 152121-47-6 SB-203580 B4 EI-148 84477-87-2 H-7 B5 EI-195 84468-17-7 H-9 B6 EI-156 62996-74-1 Estaurosporina B7 EI-228 133550-35-5 AG^194 B8 EI-267 AG-825 B9 EI-185 125697-92-9 Lavendustina A B10 EI-253 136831-49-7 RG-14620 B11 EI-191 118409-57-7 Tirfostina 23 B12 EI-187 118409-58-8 Tirfostina 25 C1 EI-257 122520-85-8 Tirfostina 46 C2 EI-188 122520-86-9 Tirfostina 47 C3 EI-189 122520-90-5 Tirfostina 51 C4 EI-190 2826-26-8 Tirfostina 1 C5 EI-335 116313-73-6 Tirfostina AG 1288 C6 EI-277 63177-57-1 Tirfostina AG 1478 C7 AC-1133 71897-07-9 Tirfostina AG 1295 C8 EI-215 10537^17-0 Tirfostina 9 C9 EI-247 HNMPA (Ácido hidroxi-2 naftalenilmetilfosfónico) C10 EI-370 120685-11-2 PKC-4 2 C11 EI-271 10083-24-6 Piceatanol C12 EI-275 172889-26-8 PP1 D1 EI-272 133550-35-3 AG-490 D2 EI-263 AG-126 D3 EI-229 AG-370 D4 EI-258 AG-879 D5 ST-420 154447-36-6 LY 294002 D6 ST-4 5 19545-26-7 Wortmannin D7 EI-246 133052-90-1 GF 109203X D8 EI-226 548-04-9 Hipericina D9 EI-283 138489-18-6 Ro 31-8220 D10 EI-155 123-78-4 Esfingosina D1 1 EI-196 127243-85-0 H-89 D12 EI-158 84478-11-5 H-8 E1 EI-184 91742-10-8 HA-1004 E2 EI-233 103745-39-7 HA-1077 E3 EI-232 HDBA (Ácido 2-h¡drox¡-5-(2,5- dihidroxibenzilamino)benzoico) E4 EI-230 127191-97-3 KN-62 E5 EI-268 KN-93 E6 EI-197 109376-83-2 ML-7 E7 EI-153 105637-50-1 ML-9 E8 CC- 00 452-06-2 2-Aminopurina E9 CC-202 158982-15-1 N9-lsopropil-olomoucina E10 CC-200 101622-51-9 Olomoucina E11 CC-201 101622-50-8 iso-Olomoucina E12 CC-205 186692-46-6 Roscovitina F1 EI-293 24386-93-4 5-lodotubercidina F2 EI-295 62004-35-7 LF -A13 F3 EI-294 152121-30-7 SB-202190 F4 EI-297 172889-27-9 PP2 F5 EI-298 208260-29-1 ZM 336372 F6 EI-306 5812-07-7 SU 4312 F7 EI-303 146535-11-7 AG-1296 F8 EI-307 220904-83-6 GW 5074 F9 AC-1 121 6865-14-1 Palmitoil-DL-carnitina Cl F10 EI-270 82-08-6 Rottlerina F11 EI-147 446-72-0 Genisteina F12 ST-1 10 486-66-8 Daidzeina G1 EI-146 63177-57-1 Análogo de erbstatina G2 AC-1142 6151-25-3 Dihidrato de quercetina G3 AC-1293 SU 1498 G4 EI-357 4452-06-6 ZM 449829 G5 EI-278 195462-67-7 BAY 11-7082 G6 EI-231 53-85-0 DRB (5,6-Dicloro-1- -D- ribofuranosylbenzimidazole) G7 EI-273 HBDDE (2,2',3,3',4,4,-Hexahidroxi-1,' bifenilo-6,6'-dimetanol dimetll éter) G8 EI-305 129-56-6 SP 600125 G9 CC-206 479-41-4 Indirubina G10 CC-207 160807-49-8 lndirubin-3'-monoxima G11 EI-299 146986-50-7 Y-27632 G12 EI-310 142273-20-9 Kenpaullona H1 EI-328 121-40-4 Ácido terreico H2 EI-332 35943-35-2 Triciribina H3 EI-336 BML-257 H4 EI-343 SC-514 H5 EI-344 BML-259 H6 EI-345 520-36-5 Apigenina H7 EI-346 BML-265 (Análogo de erlotinib) H8 A-275 53123-88-9 Rapamicina CUADRO 4.

El efecto de los compuestos de la Genoteca de compuestos inhibidores BIOMOL en la expresión de insulina, qlucaqon, MAFA y Arx4 en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático Concentración y PubChem con núm. de ident. MAFA Insulina Glucagon Arx4 0.61 µ 5330812 46.3 0.9 0.26 0.68 1.25 µ? 5330812 209.2 1.3 0.31 0.66 5.0 µ 5330812 2909.9 66.3 4.71 0.92 0.61 µ? 4566 1.0 1.0 0.77 0.78 1.25 µ? 4566 0.8 1.1 0.90 0 78 5.0 µ? 4566 1.0 1.1 0.96 0.69 0.61 µ 5330797 0.7 0.6 0.34 0.36 1.25 µ 5330797 1.5 0.8 0.25 0.37 5.0 µ? 5330797 6.3 1.3 0.04 0.16 0.61 µ? 73292 0.7 0.7 0.29 0.38 1.25 µ? 73292 1.3 1.0 0.25 0.42 5.0 µ? 73292 3.1 0.8 0.13 0 33 0.61 µ 73292 0.7 0.7 0.29 0.38 1.25 µ? 73292 1.3 1.0 0.25 0 42 5.0 µ? 73292 3.1 0.8 0.13 0.33 0.61 µ 4592 0.9 0.9 0.81 0.61 1.25 µ? 4592 1.0 1.0 0.70 0.54 5.0 µ? 4592 0.6 1.3 1.08 0.77 0.61 µ 160355 0.9 0.9 0.76 0.77 1.25 µ? 160355 0.7 1.0 0.61 0.65 5.0 µ? 160355 0.8 1.1 0.59 0.86 Vehículo tratado 1.0 1.0 1.00 1.00 CUADRO 5.

Etiqueta alfanumérica del pocilio y el número de identificación correspondiente cat. núm., y nombre del compuesto o número de ident. para la qenoteca de compuestos inhibidores de quinasa EMD Calbiochem I Inducción del gen en Placa comparación con Ubicación Cat. núm. Nombre del compuesto H 1 : MAFa A10 197221 Inhibidor de Bcr-abl 1.5 A11 203290 Bisindolilmaleimida I 0.8 A12 DMSO Control 1.5 A2 121767 AG 1024 0.8 A3 121790 AGL 2043 0.8 A4 124011 Inhibidor de Akt IV 45.7 A5 124012 Inhibidor de Akt V, Triciribina 0.9 A6 124018 Inhibidor de Akt VIII, Isozima-selectivo, Akti-1/2 1.6 A7 124020 Inhibidor de Akt X 1.4 A8 521275 Inhibidor de doble ruta PDK1/Akt/Flt 2.1 A9 189404 Inhibidor de Aurora quinasa II 1.3 B10 317200 DMBI 1.9 B11 324673 Inhibidor de EGFR/ErbB-2 2.4 B12 DMSO Control 1.9 B2 203297 Bisindolilmaleimida IV 1.9 B3 203696 BPIQ-I 1.6 B4 220285 Cloruro de queleritrina 2.3 B5 234505 Compuesto 56 1.8 B6 260961 Inhibidor de DNA-PK II 2.0 B7 260962 Inhibidor de DNA-PK III 2.2 B8 528100 PI-103 1.9 B9 266788 Inhibidor de diacilglicerol quinasa II 1.5 C10 375670 Herbimycin A, Streptomyces sp. 1.3 C11 343022 Inhibidor de Flt-3 III 1.1 C12 DMSO Control 1.1 C2 324674 Inhibidor de EGFR 3.5 C3 324840 Inhibidor de EGFR/ErbB-2/ErbB-4 0.9 C4 343020 Inhibidor de Flt-3 0.6 C5 343021 Inhibidor de Flt-3 II 0.5 C6 344036 Inhibidor de receptor de tirosina quinasa cFMS 2.2 C7 365250 Gó 6976 1.9 C8 365251 Go 6983 1.0 C9 371806 GTP-14564 0.7 D10 440203 LY 303511 1.7 D1 1 448101 Inhibidor de et quinasa 2.1 D12 Blanco 1.7 D2 407248 Inhibidor de IGF-1 R II 1.6 D3 407601 Inhibidor de IRAK-1/4 2.2 D4 420099 Inhibidor de JAK I 1.4 D5 420104 Inhibidor de JAK3 II 2.0 D6 420121 Inhibidor de JAK3 IV 1.7 D7 420126 Inhibidor de JAK3 VI 1.9 D8 428205 Inhibidor de Lck 1.9 D9 440202 LY 294002 2.3 E10 528106 Inhibidor de Pl 3-Kg 1.6 E11 528108 Inhibidor de Pl 3-Kb II 1.4 E12 Blanco 1.6 E2 513035 PD 158780 0.8 E3 513040 PD 174265 1.0 E4 521231 Inhibidor de receptor de tirosina quinasa PDGF II 0.8 E5 521232 Inhibidor de receptor de tirosina quinasa PDGF III 1.7 E6 521233 Inhibidor de receptor de tirosina quinasa PDGF IV 5.5 E7 521234 Inhibidor de PDGF RTK 1.9 E8 527450 Inhibidor de PKR 24.6 E9 527455 Inhibidor de PKR, control negativo 1.5 F10 567805 Inhibidor de Src quinasa I 2.3 F11 572660 SU1 1652 1.7 F12 DMSO Control 2.1 F2 529574 PP3 1.3 F3 529581 Análogo de PP1 II, 1 M-PP1 2.3 F4 539652 Inhibidor de PKCbll/EGFR 1.8 F5 539654 Inhibidor de PKCb 1.6 F6 553210 Rapamicina 1.2 F7 555553 Inhibidor de Rho quinasa III, Rockout 1.7 F8 555554 Inhibidor de Rho quinasa IV 2.3 F9 539648 Estauroporina, N-benzoil- 11.7 G10 658550 AG 1295 1.4 G11 658551 AG 1296 1.1 G12 DMSO Control 1.2 G2 574711 Inhibidor de Syk 1.2 G3 574712 Inhibidor de Syk II 0.8 G4 574713 Inhibidor de Syk III 1.1 G5 ' 616451 Inhibidor de TGF-b Rl quinasa 1.1 G6 616453 Inhibidor de TGF-b Rl III 1.6 G7 658390 AG 9 1.5 G8 658401 AG 490 1.4 G9 658440 AG 1 12 1.4 H10 189405 Inhibidor de Aurora quinasa III 2.0 H11 569397 Estaurosporina, Streptomyces sp. 0.0* H12 DMSO Control 1.5 H2 658552 AG 1478 2.7 H3 676480 Inhibidor de receptor VEGF de quinasa 2 I 1.7 H4 676481 Inhibidor de receptor VEGF de tirosina quinasa II 1.0 H5 676482 Inhibidor de receptor VEGF de tirosina quinasa III, KRN633 1.6 H6 676485 Inhibidor de receptor VEGF de quinasa 2 II 1.0 H7 676487 Inhibidor de receptor VEGF de quinasa 2 III 1.1 H8 676489 Inhibidor de receptor VEGF de quinasa 2 IV 2.1 H9 260964 Inhibidor de DNA-PK V 1.5 CUADRO 6.

Etiqueta alfanumérica del pocilio, correspondiente al cat. núm., y compuesto núm. para la genoteca de compuestos inhibidores que quinasa II EMD Calbiochem® Pocilio núm. Cat. núm. Compuesto núm.

A1 DMSO A2 422706 KN-62 A3 118500 Inhibidor de quinasa ATM A4 118501 Inhibidor de quinasa ATM/ATR A5 126870 Alsterpaullona A6 126871 Alsterpaullona, 2-Cianoetilo A7 128125 Aloisina A, RP107 A8 128135 Aloisina, RP106 A9 164640 Aminopurvalanol A A10 171260 Inhibidor de AMPK, Compuesto C A11 189405 Inhibidor de Aurora quinasa III A12 Blanco B1 DMSO B2 189406 Inhibidor de Aurora quinasa/Cdk B3 402085 lndirubin-3'-monoxima B4 196870 BAY 11-7082 B5 203600 Bohemina B6 217695 Inhibidor de Cdk1 B7 217696 Inhibidor de Cdk1 , CGP74514A B8 217714 Inhibidor de Cdk1/2 III B9 217720 Inhibidor de Cdk1/5 B10 218696 Inhibidor caseína quinasa I, D4476 B1 1 218710 Inhibidor III caseína quinasa II, TBCA B12 Blanco C1 DMSO C2 219476 Inhibidor de Cdk4 C3 219477 Inhibidor de Cdk4 II , NSC 625987 C4 219478 Inhibidor de Cdk4 III C5 219479 Inhibidor de quinasa tipo Cdc2, TG003 C6 220486 Inhibidor de Chk2 II C7 234503 Compuesto 52 C8 238803 Inhibidor de Cdk2 III C9 238804 Inhibidor de Cdk2 IV, NU6140 C10 219491 Inhibidor de Cdk/Crk C11 328009 Inhibidor de ERK III C12 Blanco D1 DMSO D2 688000 Inhibidor ROCK, Y-27632 D3 328007 Inhibidor de ERK II, FR180204 D4 328008 Inhibidor de ERK II, control negativo D5 341251 Fascaplisina, sintético D6 361540 Inhibidor de GSK-3b I D7 361541 Inhibidor de GSK-3b II D8 361549 Inhibidor de GSK-3b VIII D9 36 550 Inhibidor de GSK-3 IX D10 361551 Inhibidor de GSK-3 D11 361553 Inhibidor de GSK-3b XI D12 Blanco E1 DMSO E2 572635 SU6656 E3 361555 Inhibidor de GSK-3 XIII E4 371957 Isogranulatimida E5 400090 IC251 E6 401481 Inhibidor de IKK-2 IV E7 402081 Derivado de indirubina E804 E8 420119 Inhibidor de JNK II E9 420123 Inhibidor de JNK, control negativo E10 420129 Inhibidor de JNK V E11 420136 Inhibidor de JNK IX E12 Blanco F1 DMSO F2 475863 Inhibidor de MK2a F3 420135 Inhibidor de JNK VIII F4 420298 K-252a, Nocardiopsis sp.

F5 422000 Kenpaullona F6 422708 KN-93 F7 444937 Inhibidor de MEK I F8 444938 Inhibidor de MEK II F9 444939 Inhibidor de MEK1/2 F10 454861 Inhibidor de MNK1 F11 481406 NF-K Inhibidor de activación B F12 Blanco G1 DMSO G2 506121 Inhibidor de quinasa p38 MAP III G3 506126 Inhibidor de quinasa p38 MAP G4 513000 PD 98059 G5 513030 PD 169316 G6 559396 SB220025 G7 540500 Purvalanol A G8 361554 Inhibidor de GSK3b XII, TWS119 G9 371963 H-89, diclorhidrato G10 559387 SB 202474, control negativo para los estudios de inhibición de p38 MAPK G1 1 559388 SB 202190 G12 Blanco H1 DMSO H2 559389 SB 203580 H3 371970 HA 1077, diclorhidrato Fasudil H4 559402 SB 218078 H5 565625 SC-68376 H6 567305 SKF-86002 H7 567731 Inhibidor de esfingosina quinasa H8 569397 Estaurosporina, Streptomyces sp.

H9 570250 STO-609 H10 572650 SU9516 H1 1 616373 Inhibidor de quinasa Tpl2 H12 Blanco CUADRO 7.

Inducción de expresión en múltiplos de MAFA por varios compuestos de la qenoteca de inhibidores de quinasa EMD II en las células tratadas de acuerdo al protocolo de diferenciación resumido en el Ejemplo 9 Pocilio Múltiple en comparación con Cat. núm. control núm. Nombre de fármaco A6 24.8 126871 Alsterpaullona, 2-Cianoetil H10 18.0 572650 SU9516 A5 15.3 126870 Alsterpaullona B8 8.2 217714 Inhibidor de Cdk1/2 III Inhibidor de caseína B10 5.7 218696 quinasa I, D4476 F9 4.92 444939 Inhibidor de MEK1/2

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 . Un método para aumentar la expresión de MAFA en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, el método comprende las etapas de cultivar las células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático en un medio que comprende una cantidad suficiente de un inhibidor de quinasa que depende de ciclina para causar un aumento en la expresión de MAFA.