MX2011004247A - Formulaciones liofilizadas de vwf recombinante. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas estables de largo plazo del Factor de Von Willebrand recombinante liofilizado (rVWF) y métodos para la elaboración y administración de dichas formulaciones.

Description

FORMULACIONES LIOFILIZADAS DE VWF RECOMBINANTE Campo de la Invención Generalmente, la presente invención se refiere a formulaciones de VWF recombinantes liofilizadas y métodos para elaborar una composición liofilizada que comprende el VWF recombinante.

Antecedentes de la Invención El factor de Von Willebrand (VWF) es una glicoproteína que circula en el plasma en la forma de una serie de multímeros en un rango de tamaño de aproximadamente 500 kD a 20,000 kD. Las formas multiméricas del VWF están compuestas de subunidades de polipéptidos de 250 kD enlazadas juntas por medio de enlaces de disulfuro. El VWF es el portador de la adhesión inicial de las plaquetas al sub-endotelio de la pared de los vasos dañados. Solamente los multímeros más grandes exhiben actividad hemostática. Se supone que las células del endotelio segregan grandes formas poliméricas del VWF y aquellas formas de VWF que tienen un peso molecular bajo (VWF de peso molecular bajo) se originan de la disociación proteolítica. Los multímeros que tienen masas moleculares grandes son almacenados en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células del endotelio liberadas al momento del estímulo.

El VWF es sintetizado por las células del endotelio y los megacariocitos en la forma de prepro-VWF que consiste en alto grado de dominios repetidos. Al momento de la disociación del péptido de señal, el pro-VWF se dimeriza a través de los enlaces de disulfuro en su región de la terminal-C. Los dímeros sirven como promotores de la multimerización, la cual es regida por los enlaces disulfuro entre las terminales del extremo libre. El ensamble a los multímeros es seguido por una remoción proteolítica de la secuencia del propéptido (Leyte y asociados Biochem. J. 274 (1991), páginas 257 a 261).

El producto de traducción primario pronosticado de un cADN clonado de VWF es un polipéptido precursor de 2813 residuos (prepro-VWF). El prepro-VWF consiste de un péptido de señal de 22 aminoácidos y un propéptido de 741 aminoácidos, comprendiendo el VWF maduro 2050 aminoácidos (Ruggeri Z.A., y Ware, J., FASEB J., páginas 308 a 316 (1993)).

Los defectos en el VWF son los que causan la enfermedad de Von Willebrand (VWD), la cual se caracteriza por un fenotipo de sangrado más o menos pronunciado. El VWD de tipo 3 es la forma más severa en la cual el VWF está apartado completamente, y el VWD de tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa de VWF y su fenotipo puede ser muy ligero. El VWD de tipo 2 se refiere a defectos cualitativos del VWF y puede ser tan severo como el VWD de tipo 3. El VWD de tipo 2 tiene muchas subformas, estando algunas asociadas con la pérdida o la disminución de multímeros de alto peso molecular. El síndrome de Von Willebrand de tipo 2a (VWS-2A) se caracteriza por una pérdida de ambos multímeros intermedios y grandes. El VWS-2B se caracteriza por una pérdida de los multímeros de peso molecular más alto. Otras enfermedades y padecimientos relacionados con el VWF son conocidos en la técnica.

Las Patentes Norteamericanas Nos. 6,531,577, 7,166,709, y la Solicitud de Patente Europea No. 04380188.5, describen formulaciones de VWF derivadas del plasma. Sin embargo, además de los problemas de cantidad y pureza con el VWF derivado del plasma, también existe el riesgo de patógenos portados por la sangre (por ejemplo, virus y la Variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vCJD). Además, el VWF es sabido que forma agregados durante condiciones de estrés.

Por lo tanto existe una necesidad en la técnica del desarrollo de una formulación farmacéutica estable que comprende el VWF recombinante.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una formulación útil para la liofilización del VWF recombinante, dando como resultado una composición farmacéutica altamente estable. La composición farmacéutica estable es útil como un agente terapéutico en el tratamiento de individuos que sufren de enfermedades y padecimientos que se pueden beneficiar de la administración del VWF recombinante.

En una modalidad, se proporciona la formulación farmacéutica liofilizada estable de un Factor de Von Willebrand (rVWF) el cual comprende: (a) un rVWF; (b) uno o más agentes reguladores; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes de estabilización; y (e) uno o más tensioactivos; comprendiendo el rVWF un polipéptido seleccionado del grupo consistente de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a); c) un polipéptido codificado por un polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1; d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida al polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente severas; comprendiendo el regulador un agente de regulación de pH en un rango de aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 500 mM y el pH se encuentra en un rango de aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 12.0; el aminoácido se encuentra en una concentración de aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 500 mM; el agente de estabilización se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 1000 mM; y el tensioactivo se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.01 g/L hasta aproximadamente 0.5 g/L.

En otra modalidad, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3. Todavía en otra modalidad, el agente de regulación es seleccionado del grupo consistente de citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y combinaciones de estos agentes. Todavía en otra modalidad, el agente de regulación es citrato. En varias modalidades, el pH se encuentra en un rango de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.0, de aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5, o de aproximadamente 7.3. En otra modalidad, el pH es de aproximadamente 7.3.

En otra modalidad, el aminoácido anteriormente mencionado es seleccionado del grupo consistente de glicina, histidina, prolina, serina, alanina y arginina. En otra modalidad, el aminoácido se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0.5 mM hasta aproximadamente 300 mM. Todavía en otra modalidad, el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM.

En una modalidad de la presente invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; en donde el agente de regulación es citrato y el pH es de aproximadamente 7.3; y en donde el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM.

Todavía en otra modalidad de la invención, el uno o más agentes de estabilización anteriormente mencionados son seleccionados del grupo consistente de manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes de estabilización. En una modalidad, los agentes de estabilización son trehalosa en una concentración de aproximadamente 10 g/L mM y manitol en una concentración de aproximadamente 20 g/L.

Todavía en otra modalidad de la presente invención, el tensioactivo anteriormente mencionado es seleccionado del grupo consistente de digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de estos tensioactivos. Todavía en otra modalidad, el tensioactivo es TWEEN-80 en una cantidad de aproximadamente 0.01 g/L.

En otra modalidad de la presente invención, el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; en donde el agente de regulación es citrato en una concentración de aproximadamente 15 mM en un pH de aproximadamente 7.3; en donde el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM; en donde los agentes de estabilización son trehalosa en una concentración de aproximadamente 10 g/L y manitol en una concentración de aproximadamente 20 g/L; y en donde el tensioactivo es TWEEN-80 en una concentración de aproximadamente 0.1 g/L.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra el análisis ANCOVA de la actividad de VWFrRCo conjuntada en lotes evaluados por su estabilidad (almacenados en una temperatura de 5°C ± 3°C).

La figura 2 muestra el aumento en la humedad residual del rVWF FDP almacenado a una temperatura de 5°C ± 3°C.

La figura 3 muestra el aumento en la humedad residual del rVWF FDP almacenado a una temperatura de 40°C ± 2°C.

Descripción Detallada de la Invención Definición de los términos A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado entendido generalmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto en la técnica una definición general de muchos de los términos utilizados en la presente invención: "DICCIONARIO DE MICROBIOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR" (DICTION ARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY) de Singleton, y asociados. (2a edición. 1994); "EL DICCIONARIO DE CAMBRIDGE DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA" (THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY) (Walker ed., 1988); "GLOSARIO DE GENÉTICA" (THE GLOSSARY OF GENETICS), 5a Edición, R. Rieger, y asociados, (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale Y Marham, "EL DICCIONARIO DE BIOLOGÍA DE HARPER COLLINS" (THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY) (1991).

Cada publicación, solicitud de patente, patente, u otra referencia aquí citada está incorporada como referencia en su totalidad hasta el grado en que no sea inconsistente con la presente descripción.

Aquí se observa que, como se usa en la presente descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un", "una", y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Como se usa en la presente descripción, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos a menos que se especifique lo contrario.

El término "que comprende", con respecto a un compuesto péptido, significa que un compuesto puede incluir aminoácidos adicionales en cualquiera o ambas terminales amino y carboxi de una secuencia determinada. Por supuesto, estos aminoácidos adicionales no deben interferir de manera importante con la actividad del compuesto. Con respecto a una composición de la presente invención, el término "que comprende" significa que una composición puede incluir componentes adicionales. Estos componentes adicionales no deben de interferir de manera importante con la actividad de la composición.

El término "farmacológicamente activo" significa que una substancia así descrita se ha determinado que tiene la actividad que afecta un parámetro médico (por ejemplo, pero sin limitarse a la presión sanguínea, cuenta de células de la sangre, nivel de colesterol) o una condición de enfermedad (por ejemplo, pero sin limitarse a cáncer, enfermedades autoinmunes).

Como se usa en la presente descripción, los términos "expreso", "que expresa" y "expresión" significa que permite u ocasiona que la información de un gen o secuencia de ADN se haga manifiesta, por ejemplo, produciendo una proteína activando las funciones celulares comprendidas en la trascripción y traducción de un gen correspondiente o secuencia de ADN. Una secuencia de ADN es expresada en o por una célula para formar un "producto de expresión" tal como una proteína. El producto de expresión mismo, por ejemplo, la proteína resultante, se puede decir también que va a ser "expresada." Un producto de expresión puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El término "intracelular" significa dentro de una célula. El término "extracelular" significa fuera de una célula, tal como una proteína transmembrana. Una substancia es "secretada" por una célula si aparece en una medida importante fuera de la célula, desde alguna parte o dentro de la célula.

Como se usa en la presente descripción, un "polipéptido" se refiere a un polímero compuesto de residuos de aminoácido, variantes estructurales, variantes estructurales que ocurren de manera natural relacionadas, y análogos sintéticos que no ocurren de manera natural de los mismos enlazados por medio de los enlaces péptidos. Los polipéptidos sintéticos son preparados, por ejemplo, utilizando un sintetizador automático de polipéptidos. El término "proteína" generalmente se refiere a polipéptidos grandes. El término "péptido" generalmente se refiere a polipéptidos cortos.

Como se usa en la presente descripción, un "fragmento" de un polipéptido significa que se refiere a cualquier porción de un polipéptido o proteína más pequeño que el polipéptido de longitud total o producto de expresión de la proteína.

Como se usa en la presente descripción, un "análogo" se refiere a cualquiera de dos o más polipéptidos substancialmente similares de estructura y que tienen la misma actividad biológica, pero que pueden tener grados variables de actividad, ya para la molécula entera o para un fragmento de la misma. Los análogos difieren en la composición de sus secuencias de aminoácidos basadas en una o más mutaciones que comprenden substituciones, eliminaciones, inserciones y/o adiciones de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos. Las substituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras basadas en la relatividad físico-química o funcional del aminoácido que está siendo reemplazado o el aminoácido que lo reemplaza.

Como se usa en la presente descripción, una "variante" se refiere a un polipéptido, proteína o análogo del mismo que es modificado para que comprenda porciones químicas adicionales que normalmente no son una parte de la molécula. Dichas porciones pueden modular la solubilidad, absorción, vida media biológica, etc., de la molécula. Las porciones pueden disminuir alternativamente la toxicidad de la molécula y eliminar o atenuar cualquier efecto secundario no deseable de la molécula, etc. Las porciones que tienen la capacidad de mediar dichos efectos se describen en el libro "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (Remington's Pharmaceutical Sciences) (1980). El procedimiento para el acoplamiento de dichas porciones a una molécula es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, y sin limitación, en un aspecto, la variante es un factor de coagulación de sangre que tiene una modificación química que confiere una vida media más larga in vivo a la proteína. En varios aspectos, los polipéptidos son modificados por glicosilación, pegilación, y/o polisialilación.

VWF Recombinante El polinucleótido y las secuencias de aminoácidos del prepro-VWF se establecen en las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, respectivamente, y se pueden conseguir en el GenBank con los Nos. de Acceso NM_000552 y NP_000543, respectivamente. La secuencia de aminoácidos que corresponde a la proteína VWF madura se establece en la SEQ ID NO: 3 (correspondiendo los aminoácidos del 764 al 2813 de la secuencia de aminoácidos prepro-VWF de longitud completa).

Una forma de rVWF útil tiene por lo menos la propiedad de estabilizar in vivo, por ejemplo, enlazándose, de por lo menos una molécula del Factor VIII (FVIII) y tiene opcionalmente un patrón de glicosilación el cual es farmacológicamente aceptable. Los ejemplos específicos del mismo incluyen VWF sin el dominio A2 resistente de este modo a la proteólisis (Lankhof y asociados, Thromb. Haemost. 77: páginas 1008 a 1013, 1997), y un fragmento de VWF del Val 449 al Asn 730 que incluye el dominio de enlace 1b de la glicoproteína y sitios de enlace para colágeno y heparina (Pietu y asociados, Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: páginas 1339 a 1347, 1989). La determinación de la capacidad de un VWF para estabilizar por lo menos una molécula de FVIII es, en un aspecto, llevada a cabo en mamíferos deficientes de VWF de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

El rVWF de la presente invención es producido por cualquier método conocido en la técnica. Un ejemplo específico se describe en el documento WO86/06096 publicado en Octubre 23, 1986 y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 07/559,509, presentada en Julio 23, 1990, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia con respecto a los métodos de producción del VWF recombinante. De este modo, los métodos son conocidos en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante mediante la ingeniería genética, por ejemplo, por medio de la transcripción inversa del ARN y/o la amplificación del ADN, (¡i) introducir el ADN recombinante en células procarióticas o eucarióticas por medio de la transfección, por ejemplo, por medio de electroporacion o microinyección, (iii) cultivar las células transformadas, por ejemplo, de una manera continua o de lote, (iv) expresar el VWF, por ejemplo, constitutivamente o al momento de la inducción, y (v) aislar el VWF, por ejemplo, de un medio de cultivo o recolectando las células transformadas, con el objeto de (vi) obtener el rVWF purificado, por ejemplo, por medio de cromatografía de intercambio de aniones o cromatografía de afinidad. Un VWF recombinante es, en un aspecto, hecho de células huésped transformadas utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte. Por ejemplo, las secuencias de codificación para el polipéptido podrían ser cortadas del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Alternativamente, la molécula de ADN es, en otro aspecto, sintetizada utilizando técnicas de síntesis química, tales como el método de fosforamidato. También, todavía en otro aspecto, se utiliza una combinación de estas técnicas.

La presente invención también proporciona vectores que codifican el polipéptido de la invención en un huésped apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido operativamente enlazado a una secuencia de control de expresión apropiada. Son bien conocidos los métodos para efectuar este enlace operativo, ya sea antes o después de que el polinucleótido es insertado dentro del vector. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, aumentadores, operadores, sitios de enlace del ribosoma, señales de inicio, señales de detención, señales de tapa, señales de poliadenilación, y otras señales comprendidas con el control de transcripción, o traducción. El vector resultante que tiene el polinucleótido en el mismo es utilizado para transformar un huésped apropiado. Esta transformación se puede realizar utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Cualquiera de un número más grande de células huésped bien conocidas y disponibles son utilizadas en la práctica de la presente invención. La selección de un huésped particular depende de un número de factores reconocidos por la técnica, incluyendo, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión seleccionado, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, el índice de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos, las características de expresión, la bio-seguridad y los costos. Un equilibrio de estos factores debe de ser comparado con el entendimiento de que no todas las células huésped son igualmente efectivas para la expresión de una secuencia particular de ADN. Dentro de estas instrucciones generales, las células huésped microbiales útiles incluyen, sin limitación, bacterias, levadura y otros hongos, insectos, plantas, células de mamífero en cultivo (incluyendo humanos), y otros huéspedes conocidos en la técnica.

Las células huésped transformadas son cultivadas bajo condiciones de fermentación convencional de modo que los compuestos deseados son expresados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Finalmente, los polipéptidos son purificados de los medios de cultivo o las células huésped mismas por métodos bien conocidos en la técnica .

Dependiendo de la célula huésped utilizada para expresar un compuesto de la presente invención, los grupos de carbohidratos (oligosacáridos) son enlazados opcionalmente a sitios que se conoce que son sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos enlazados-O son adheridos a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras que los oligosacáridos enlazados-N son adheridos a residuos de asparagina (Asn) cuando son parte de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X preferentemente es uno de los 19 aminoácidos que ocurren de manera natural sin contar la prolina. Las estructuras de los oligosacáridos enlazados-N y enlazados-O y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que es generalmente encontrado en ambos oligosacáridos enlazados-N y enlazados-O es el ácido N-acetilneuramínico (al que nos referimos como ácido siálico). El ácido siálico generalmente es el residuo de la terminal de ambos oligosacáridos enlazados-N y enlazados-O y, en virtud de su carga negativa, en un aspecto, confieren propiedades ácidas al compuesto glicosilado. Dichos sitios pueden ser incorporados en el enlazador de los compuestos de la presente invención y preferentemente son glicosilados por una célula durante la producción recombinante de los compuestos del polipéptido (por ejemplo, en células de mamífero tales como las células CHO, BHK, COS). En otros aspectos, dichos sitios son glicosilados mediante procedimientos sintéticos o semi-sintéticos conocidos en la técnica.

Alternativamente, los compuestos se hacen por métodos sintéticos que utilizan, por ejemplo, técnicas de síntesis de fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en el arte, e incluyen aquellas descritas por Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, páginas 335 a 361 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: página 2149; Davis y asociados. (1985), Biochem. Intl. 10: páginas 394 a 414; Stewart y Young (1969), (Solid Phase Peptide Síntesis) "Síntesis de Péptido de Fase Sólida"; Patente Norteamericana No. 3,941,763; Finn y asociados. (1976), "Las Proteínas" (The Proteins) (3a edición.) 2: páginas 105 a 253; y Erickson y asociados (1976), "Las Proteínas" (The Proteins) (3a edición.) 2: páginas 257 a 527. La síntesis de fase sólida es una técnica preferida para la elaboración de péptidos individuales ya que es el método más efectivo en costo para elaborar péptidos pequeños.

Fragmentos, variantes v análogos de VWF Los métodos para la preparación de fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos son bien conocidos en la técnica.

Los fragmentos de un polipéptido son preparados utilizando, sin limitación, la disociación enzimática (por ejemplo, tripsina, quimiotripsina) y también utilizando medios recombinantes para generar fragmentos de polipéptidos que tienen una secuencia específica de aminoácidos. Los fragmentos de polipéptido pueden ser generados de modo que comprendan una región de la proteína que tiene una actividad particular, tal como un dominio de multimerización y cualquier otro dominio VWF que se puede identificar conocido en la técnica.

Los métodos para la elaboración de análogos de polipéptidos también son bien conocidos. Los análogos de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido pueden ser de substitución, inserción, adición o eliminación. Los análogos de eliminación, incluyendo los fragmentos de un polipéptido, carecen de uno o más residuos de la proteína natural los cuales no son esenciales para la función o actividad inmunogénica. Los análogos de inserción comprenden la adición de, por ejemplo, aminoácidos en un punto que no es terminal en el polipéptido. Este análogo puede incluir, por ejemplo, y sin limitación, la inserción de un epítope inmuno-reactivo o simplemente un solo residuo. Los análogos de adición, incluyen fragmentos de un polipéptido, incluyen la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera o ambas terminales de una proteína e incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión. También son contempladas las combinaciones de los análogos anteriormente mencionados.

Los análogos de substitución generalmente intercambian un aminoácido de tipo natural por otro en uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden ser diseñados para regular una o más propiedades del polipéptido sin la pérdida completa de otras funciones o propiedades. En un aspecto, las substituciones son substituciones conservadoras. Una "substitución conservadora de aminoácidos" es una substitución de un aminoácido con un aminoácido que tiene una cadena lateral o un carácter químico similar. Los aminoácidos similares para la elaboración de substituciones conservadoras incluyen aquellos que tienen una cadena lateral ácida (ácido glutámico, ácido aspártico); una cadena lateral básica (arginina, lisina, histidina); una cadena lateral de amida polar (glutamina, asparagina); una cadena lateral hidrofóbica, alifática (leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); una cadena lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); una cadena lateral pequeña (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); o una cadena lateral hidroxilo alifática (serina, treonina).

En un aspecto, los análogos son substancialmente homólogos o substancialmente idénticos al VWF recombinante del cual son derivados. Los análogos incluyen aquellos que retienen por lo menos algo de la actividad biológica de un polipéptido de tipo natural, por ejemplo, actividad de coagulación de la sangre.

Las variantes de polipéptidos contemplados incluyen, sin limitación, polipéptidos modificados químicamente por dichas técnicas como ubicuitinación, glicosilación, incluyendo polisialación, conjugación para agentes terapéuticos o de diagnóstico, etiquetación, enlace de polímero covalente tal como pegilación (derivatización con polietilénglicol), introducción de enlaces que no se pueden hidrolizar, e inserción o substitución por medio de la síntesis química de aminoácidos tales como ornitina, las cuales no generalmente ocurren en las proteínas humanas. Las variantes retienen esencialmente las mismas propiedades de enlace de las moléculas no modificadas de la presente invención. Dicha modificación química puede incluir el enlace directo o indirecto (por ejemplo, por medio de un enlazador) de un agente al polipéptldo VWF. En el caso del enlace indirecto, está contemplado que el enlazador puede ser hidrolizable o no hidrolizable.

La preparación de los análogos pegilados del polipéptido en un aspecto comprenderán los pasos de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietilénglicol (tal como un éster reactivo o derivado aldehido de PEG) bajo condiciones por las cuales el polipéptido de construcción de enlace llega a quedar enlazado a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación son determinadas basadas en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, a una proporción más grande de PEG: más alto el porcentaje de proteína del producto poli-pegilado. En algunas modalidades, la construcción de enlace tiene una sola porción PEG en la terminal-N. El polietilénglicol (PEG) puede estar enlazado al factor de coagulación de la sangre para, por ejemplo, proporcionar una vida media más larga in vivo. El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y es lineal o ramificado. El peso molecular promedio de los rangos del PEG es de aproximadamente 2 kiloDaltons ("kD") hasta aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 50 kDa, o de aproximadamente 5 kDa hasta aproximadamente 10 kDa. En ciertos aspectos, los grupos PEG son enlazados al factor de coagulación de la sangre por medio de la acilación o alquilación reductiva a través de un grupo reactivo diseñado o natural en la porción PEG (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, tiol, o éster) para un grupo reactivo en el factor de coagulación de la sangre (por ejemplo, un grupo aldehido, amino, o éster) o mediante cualquier otra técnica conocida en el arte.

Los métodos para la preparación del polipéptido polisialilado son descritos en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20060160948, Fernandes y Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: páginas 26 a 34, 1997, y Saenko y asociados, Haemophilia 12: páginas 42 a 51, 2006. Brevemente, una solución de ácido colomínico (CA) que contiene Nal04 0.1 M es agitada a la oscuridad a temperatura ambiente para oxidar el CA. La solución de CA activada es dializada contra, por ejemplo, regulador de fosfato de sodio 0.05, pH 7.2 en la oscuridad y esta solución fue agregada a la solución rVWF e incubada durante 18 horas a temperatura ambiente en la oscuridad bajo agitación suave. Los reactivos libres son opcionalmente separados del conjugado de ácido polisiálico-rVWF mediante, por ejemplo, ultrafiltración/diafiltración. La conjugación de rVWF con ácido polisiálico es lograda utilizando glutaraldehído como reactivo de reticulación (Migneault y asociados, Biotechniques 37: páginas 790 a 796, 2004).

Está contemplado adicionalmente en otro aspecto que el polipéptido de la presente invención es una proteína de fusión con un segundo agente el cual es un polipéptido. En una modalidad, el segundo agente el cual es un polipéptido, sin limitación, es una enzima, un factor de crecimiento, un anticuerpo, una citocina, una quimiocina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular del receptor de superficie celular, una molécula de adhesión de células, o fragmento o dominio activo de una proteína descrita anteriormente. En una modalidad relacionada, el segundo agente es un factor de coagulación tal como el Factor VIII, Factor VII, Factor IX. La proteína de fusión contemplada se hace mediante técnicas recombinantes o químicas bien conocidas en el arte.

También está contemplado en otro aspecto, que los polipéptidos prepro-VWF y pro-VWF proporcionarán un beneficio terapéutico en las formulaciones de la presente invención. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 7,005,502 describe una preparación farmacéutica que comprende cantidades substanciales de pro-VWF que induce la generación de trombina in vitro. Además de fragmentos, variantes, u otros análogos biológicamente activos recombinantes del VWF maduro que ocurre de manera natural, la presente invención contempla el uso de fragmentos, variantes, o análogos biológicamente activos del prepro-VWF (establecido en la SEQ ID NO:2) o los polipéptidos pro-VWF (residuos de aminoácidos del 23 al 764 de la SEQ ID NO: 2) en las formulaciones aquí descritas.

Los fragmentos que codifican los polinucleótidos, variantes y análogos pueden ser fácilmente generados por un experto en la técnica para codificar fragmentos variantes, o análogos biológicamente activos de la molécula que ocurre de manera natural que posee una actividad biológica igual o similar a la molécula que ocurre de manera natural. En varios aspectos, estos polinucleótidos son preparados utilizando las técnicas PCR, digestión/ligación de la molécula que codifica el ADN, y similares. Por lo tanto, un experto en la técnica podrá generar cambios de una sola base en el hilo de ADN para que resulten en un codón alterado y una mutación sin sentido, utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la mutagénesis específica del sitio. Como se usa en la presente descripción, la frase "condiciones de hibridación moderadamente severas" significa, por ejemplo, la hibridación a una temperatura de 42°C en formamida al 50% y el lavado a una temperatura de 60°C en 0.1 x SSC, SDS al 0.1%. Deberá quedar entendido por aquellos expertos en la técnica que la variación en estas condiciones ocurre basada en la longitud del contenido básico de nucleótidos GC de la secuencia que va a ser hibridada. Las fórmulas estándar en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones exactas de hibridación. Consultar el libro de Sambrook y asociados, del 9.47 al 9.51 en "Clonación Molecular" (Molecular Cloning), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Liof ilización En un aspecto, las formulaciones que comprenden un polipéptido VWF de la invención son liofilizadas antes de la administración. La liof ilización se lleva a cabo utilizando técnicas comunes en el arte y deberán ser optimizadas para la composición que está siendo desarrollada [Tang y asociados, Pharm Res. 21: páginas 191 a 200, (2004) y Chang y asociados, Pharm Res. 13: páginas 243 a 249 (1996)].

Un ciclo de liofilización está, en un aspecto, compuesto de tres pasos: congelación, secado primario, y secado secundario [A. P. Mackenzie, Phil Trans R Soc London, Ser B, Biol 278: página 167 (1977)]. En el paso de congelación, la solución es enfriada para iniciar la formación de hielo. Además, este paso induce la cristalización del agente a granel. El hielo sublima en la primera etapa de secado primario, la cual es conducida mediante la reducción de la presión de la cámara debajo de la presión del vapor del hielo, utilizando un vacío e introduciendo calor para promover la sublimación. Finalmente, el agua adsorbida o enlazada es removida en la etapa de secado secundario bajo la presión reducida de la cámara y a una temperatura elevada en el almacén. El proceso produce un material conocido como una torta liofilizada. Posteriormente, la torta puede ser reconstituida con cualquiera de agua estéril o un diluyente adecuado para inyección.

El ciclo de liofilización no solamente determina la condición física final de los excipientes sino también afecta otros parámetros tales como el tiempo de reconstitución, la apariencia, la estabilidad y contenido final de humedad. La estructura de la composición en la condición congelada procede a través de varias transiciones (por ejemplo, transiciones al vidrio, humedecimientos, y cristalizaciones) que ocurren en temperaturas específicas y la estructura puede ser utilizada para entender y optimizar el proceso de liofilización. La temperatura de transición al vidrio (Tg y/o Tg') puede proporcionar información acerca de la condición física de un soluble y puede ser determinada por la calorimetría de exploración diferencial (DSC). El Tg y el Tg' son un parámetro importante que debe de ser tomado en cuenta cuando se diseñan ciclos de liofilización. Por ejemplo, el Tg' es importante para el secado primario. Además, en el estado seco, la temperatura de transición al vidrio proporciona información sobre la temperatura de almacenamiento del producto final.

Formulaciones v excipientes en general Los excipientes son aditivos que ya sea imparten o mejoran la estabilidad y la administración de un producto de un fármaco (por ejemplo, una proteína). Independiente de la razón para su inclusión, los excipientes son un componente integral de una formulación y por lo tanto necesitan ser seguros y bien tolerados por los pacientes. Para los fármacos de proteína, la elección de los excipientes es particularmente importante debido a que pueden afectar tanto la eficacia como la inmunogenicidad del fármaco. De ahí, que las formulaciones de proteína necesitan ser desarrolladas con una selección apropiada de excipientes que produzcan la estabilidad, seguridad, y capacidad adecuada para comercializarlos.

Una formulación liofilizada está, en un aspecto, comprendida por lo menos de uno o más de un regulador, un agente de volumen, y un estabilizador. En este aspecto, la utilidad de un tensioactivo es evaluada y seleccionada en casos en donde la agregación durante el paso de liofilización o durante la reconstitución llega a ser un problema. Un agente de regulación apropiado es incluido para mantener la formulación dentro de las zonas estables de pH durante la liofilización. Una comparación de los componentes del excipiente contemplado para las formulaciones líquidas y proteínas liofilizadas se proporciona en la Tabla A.

Tabla A : Componen tes de excipien tes de formulaciones de proteína liofilizada Regulador ó Mantener el pH de la formulación durante la liofilización y al momento de la reconstitución o Los estabilizadores incluyen crio y lioprotectores o Los ejemplos incluyen Polioles, azúcares y polímeros Agente de tonicidad/ estabilizador o Los crioprotectores protegen a las proteínas de los esfuerzos de congelación o Los lioprotectores estabilizan a. las proteínas en la condición de secado por congelación o Utilizado para mejorar la elegancia del producto y evitar que revienten Agente de volumen o Proporciona una resistencia estructural para la lio-torta o Los ejemplos incluyen manitol y glicina o Empleado si la agregación durante el proceso de liofilización es un problema Tensioactivo o Puede servir para reducir los tiempos de reconstitución o Los ejemplos incluyen polisorbato 20 y 80 o Generalmente no empleado, Anti-oxidante las reacciones moleculares en la lio-torta son muy retardados o Pueden ser incluidos si un ¡ón de metal especifico se incluye solo como un co-factor o en donde el metal es requerido para actividad de proteasa Iones de metal/agente de quelación o Los agentes de quelación son no necesarios generalmente eri las lio formulaciones o Solo para formulaciones multi-dosis o Se proporciona protección contra Conservadores la proliferación microbial n la formulación o Es usualmente incluido en el diluyeme de reconstitución (por ejemplo bWFI) El reto principal para desarrollar las formulaciones de proteínas es estabilizar el producto contra los esfuerzos de manufactura, embarque y almacenamiento. El rol de los excipientes de formulación es proporcionar la estabilización contra estos esfuerzos. Los excipientes también pueden ser empleados para reducir la viscosidad de formulaciones de proteína de alta concentración con el objeto de hacer posible su administración y mejorar la conveniencia del paciente. En general, los excipientes pueden ser clasificados en base al mecanismo por medio del cual estabiliza las proteínas contra varios esfuerzos químicos y físicos. Algunos excipientes son utilizados para aliviar los efectos de un estrés específico o para regular una susceptibilidad particular de una proteína específica. Otros excipientes tienen efectos más generales en las estabilidades de proteínas covalentes y físicas. Los excipientes aquí descritos son organizados ya sea por su tipo químico o su rol funcional en las formulaciones. Se proporcionan descripciones breves de los modos de estabilización cuando se explica cada tipo de excipiente.

Debido a las enseñanzas y guía aquí proporcionadas, aquellos expertos en la técnica conocerán que las cantidades o rango de excipientes pueden ser incluidos en cualquier formulación particular para lograr una formulación biofarmacéutica de la presente invención que promueve la retención en la estabilidad del biofarmacéutico (por ejemplo, una proteína). Por ejemplo, la cantidad y tipo de una sal que va a ser incluida en una formulación biofarmacéutica de la presente invención es seleccionada basada en la osmolaridad deseada (por ejemplo, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la solución final así como las cantidades y osmolaridad de otros componentes que van a ser incluidos en la formulación.

A modo de ejemplo, la inclusión de aproximadamente el 5% de sorbitol puede lograr una isotonicidad mientras que aproximadamente el 9% del excipiente de sacarosa es necesario para lograr la isotonicidad. La selección de la cantidad o rango de concentraciones de uno o más excipientes que pueden ser incluidos dentro de una formulación biofarmacéutica de la presente invención han sido ejemplificados anteriormente haciendo referencia a las sales, polioles, y azúcares. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica entenderán que las consideraciones aquí descritas y además ejemplificadas como referencia para los excipientes específicos son igualmente aplicables a todos los tipos y combinaciones de excipientes incluyendo, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizadores, agentes de volumen, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones de metal, agentes de quelación y/o conservadores.

Además, en donde es reportado un excipiente particular en concentración molar, aquellos expertos en la técnica reconocerán que también está contemplado el porcentaje equivalente (%) p/v (por ejemplo, (gramos de substancia en una muestra de solución/mL de solución) X 100%) de solución.

Por supuesto, una persona experta en la técnica reconocerá que las concentraciones de los excipientes aquí descritos comparten una interdependencia con una formulación particular. A modo de ejemplo, la concentración de un agente de volumen puede ser disminuida en donde, por ejemplo, existe una alta concentración de proteína o en donde, por ejemplo, existe una alta concentración de un agente de estabilización. Además, una persona experta en la técnica reconocería que, con el objeto de mantener la isotonicidad de una formulación particular en la cual no existe agente de volumen, la concentración de un agente de estabilización sería ajustada de manera adecuada (por ejemplo, sería utilizada una cantidad "que imparte tonicidad" de estabilizador). Los excipientes comunes son conocidos en la técnica y se pueden encontrar en la publicación de Powell y asociados, Compendium of Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J. Pharm. Sci. Technology, 52: páginas 238 a 311.

Reguladores y agentes de regulación La estabilidad de una formulación de proteína activa farmacológicamente generalmente es observada como que es máxima en un rango estrecho de pH. Este rango de pH de estabilidad óptima necesita ser identificado temprano durante los estudios previos a la formulación. Varios métodos, tales como los estudios de estabilidad acelerada y estudios de selección calorimétrica, son útiles en este esfuerzo (Remmele R.L. Jr., y asociados, Biochemistry, 38(16): páginas 5241 a 5247 (1999)). Una vez que una formulación está finalizada, la proteína debe ser manufacturada y mantenida durante la vida en el almacén. De ahí, que los agentes de regulación son casi siempre empleados para controlar el pH de la formulación.

La capacidad del regulador de las especies de regulación es máxima en un pH igual al pKa y disminuye conforme aumenta o disminuye el pH lejos de este valor. El 90% de la capacidad de regulación existe dentro de una unidad de pH de su pKa. La capacidad del regulador también aumenta proporcionalmente con las concentraciones crecientes de regulador.

Necesitan considerarse varios factores cuando se selecciona un regulador. Primero y más importante, las especies reguladoras y sus concentraciones necesitan ser definidas basadas en su pKa y el pH de la formulación deseada. Igualmente importante es asegurar que el regulador sea compatible con la proteína y otros excipientes de la formulación, y no catalice reacciones de degradación algunas. Un tercer aspecto importante para ser considerado en la sensación de comezón e irritación que el regulador puede inducir al momento de la administración. Por ejemplo, es sabido que el citrato ocasiona comezón al momento de la inyección (Laursen T, y asociados, Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): páginas 218 a 221 (2006)). El potencial para la comezón e irritación es mayor para fármacos que son administrados por medio de rutas subcutánea (SC) o intramuscular (IM), en donde la solución del fármaco permanece en el sitio por un período de tiempo relativamente más largo que cuando es administrado por medio de la ruta IV en donde la formulación se llega a diluir rápidamente dentro de la sangre al momento de la administración. Para formulaciones que son administradas mediante la infusión directa IV, necesita ser monitoreada la cantidad total de regulador (y cualquier otro componente de la formulación). Se tiene que ser particularmente cuidadoso alrededor de los iones de potasio administrados en la forma del regulador de fosfato de potasio, el cual puede inducir efectos cardiovasculares en un paciente (Hollander-Rodriguez JC, y asociados, Am. Fam. Physician., 73(2): páginas 283 a 290 (2006)).

Los reguladores para las formulaciones liofilizadas necesitan consideraciones adicionales. Algunos reguladores como el fosfato de sodio pueden cristalizarse fuera de la fase amorfa de la proteína durante la congelación dando como resultado cambios en el pH. Otros reguladores comunes tales como el acetato y el imidazol pueden sublimar o evaporar durante el proceso de Iiofiiización, cambiando de esta manera el pH de la formulación durante la Iiofiiización o después de la reconstitución.

El sistema regulador presente en las composiciones es seleccionado para que sea fisiológicamente compatible y mantenga un pH deseado de la formulación farmacéutica. En una modalidad, el pH de la solución es entre pH 2.0 y pH 12.0. Por ejemplo, el pH de la solución puede ser 2.0, 2.3, 2.5, 2.7, 3.0, 3.3, 3.5, 3.7, 4.0, 4.3, 4.5, 4.7, 5.0, 5.3, 5.5, 5.7, 6.0, 6.3, 6.5, 6.7, 7.0, 7.3, 7.5, 7.7, 8.0, 8.3, 8.5, 8.7, 9.0, 9.3, 9.5, 9.7, 10.0, 10.3, 10.5, 10.7, 11.0, 11.3, 11.5, 11.7, ó 12.0.

Los compuestos de regulación de pH pueden estar presentes en cualquier cantidad adecuada para mantener el pH de la formulación en el nivel previamente determinado. En una modalidad, la concentración de regulación del pH es entre 0.1 mM y 500 mM (1 M). Por ejemplo, está contemplado que el agente de regulación de pH es de por lo menos 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, ó 500 mM.

Los agentes de regulación de pH de ejemplo utilizados para regular la formulación como aquí se establece incluyen pero no están limitados a ácidos orgánicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES, y aminoácidos o mezcla de aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a aspartato, histidina, y glicina. En una modalidad de la presente invención, el agente de regulación es citrato.

Estabilizadores y agentes de volumen En un aspecto de las presentes formulaciones farmacéuticas, un estabilizador (o una combinación de estabilizadores) es agregado para prevenir o reducir la agregación inducida en el almacenamiento y la degradación química. Una loción nebulosa o turbia al momento de la reconstitución indica que la proteína sea precipitada o al menos agregada. El término "estabilizador" significa un excipiente que tiene la capacidad de evitar la agregación o degradación física, incluyendo la degradación química (por ejemplo, autólisis, desamidación, oxidación, etc.) en una condición acuosa. Los estabilizadores contemplados incluyen, pero no están limitados a, sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa, manitol, sorbitol, glicina, HCL de arginina, compuestos de poli-hidroxi, incluyendo polisacáridos tales como dextrano, almidón, hidroxietil almidón, ciclodextrinas, N-metil pirolideno, celulosa y ácido hialurónico, cloruro de sodio, [Carpenter y asociados, Develop. Biol. Standard 74: página 225, (1991)]. En las formulaciones presentes, el estabilizador es incorporado en una concentración de aproximadamente 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ó 1000 mM. En una modalidad de la presente invención, se utilizan manitol y trehalosa como agentes de estabilización.

Si se desea, las formulaciones también incluyen cantidades apropiadas de agentes de regulación de osmolaridad y volumen. Los agentes de volumen incluyen, por ejemplo, y sin limitación, manitol, glicina, sacarosa, polímeros tales como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa, lactosa, sorbitol, trehalosa, y xilitol. En una modalidad, el agente de volumen es manitol. El agente de volumen es incorporado en una concentración de aproximadamente 0.1, 0.5, 0.7, 0.8 0.9, 1.0, 1.2, 1.5, 1.7, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ó 1000 mM.

Tensioactivos Las proteínas tienen una alta propensión a interactuar con superficies que las hacen susceptibles a la adsorción y desnaturalización en las interfases de aire-líquido, frasco-líquido, y líquido-líquido (aceite de silicona). Esta trayectoria de degradación ha sido observada como que es dependiente de manera inversa a la concentración de la proteína y da como resultado cualquiera de la formación de un soluble y los agregados de proteína insoluble o la pérdida de la proteína de la solución por medio de adsorción a las superficies. Además para contener la adsorción de la superficie, la degradación inducida por la superficie es exacerbada por la agitación física, como se podría experimentar durante el embarque y manejo del producto.

Los tensioactivos generalmente son utilizados en formulaciones de proteínas para evitar la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos son moléculas anfifáticas con la capacidad de no competir con las proteínas por las posiciones interfaciales. Las porciones hidrofóbicas de las moléculas del tensioactivo ocupan posiciones interfaciales (por ejemplo, aire/líquido), mientras que las porciones hidrofílicas de las moléculas permanecen orientadas hacia el solvente a granel. En concentraciones suficientes (generalmente alrededor de la concentración micelar crítica del detergente), una capa de la superficie de las moléculas del tensioactivo sirven para evitar que las moléculas de proteína se adsorban en la interfase. De este modo, se minimiza la degradación inducida por la superficie. Los tensioactivos contemplados en la presente invención incluyen, sin limitación, esteres de ácido graso polietoxilados de sorbitan, por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80. Los dos difieren solamente en la longitud de la cadena alifática que imparte el carácter hidrofóbico a las moléculas, C- 2 y C-18, respectivamente. Por consiguiente, el polisorbato-80 es más activo en la superficie y tiene una concentración micelar crítica más baja que el polisorbato-20.

Los detergentes también pueden afectar la estabilidad de conformación termodinámica de las proteínas. Aquí nuevamente, los efectos de un excipiente de detergente determinados será específico para la proteína. Por ejemplo, los polisorbatos han mostrado que reducen la estabilidad en algunas proteínas y aumentan la estabilidad de otras. La desestabilización de proteínas del detergente puede ser racionalizada en términos de las colas hidrofóbicas de las moléculas de detergente que pueden engancharse en el enlace específico con condiciones de proteínas no duplicadas completamente o parcialmente duplicadas. Estos tipos de interacciones podrían ocasionar un cambio en el equilibrio de conformación hacia las condiciones más expandidas de la proteína (por ejemplo, aumentando la exposición de las porciones hidrofóbicas de la molécula de proteína en complemento con el enlace de polisorbato). Alternativamente, si el estado natural de la proteína exhibe algunas superficies hidrofóbicas, el enlace del detergente a la condición natural puede estabilizar dicha conformación.

Otro aspecto de los polisorbatos es que son inherentemente susceptibles para la degradación oxidativa. Con frecuencia, conforme la materia prima, contiene suficientes cantidades de peróxidos para ocasionar la oxidación de las cadenas laterales de residuo de proteína, especialmente la metionina. El potencial de daño oxidativo que se origina de la adición del estabilizador enfatiza el punto en que las concentraciones efectivas más bajas de excipientes deberán ser utilizadas en las formulaciones. Para los tensioactivos, la concentración efectiva para una proteína determinada dependerá del mecanismo de estabilización.

Los tensioactivos también son agregados en cantidades apropiadas para evitar el fenómeno de agregación relacionado con la superficie durante la congelación y secado [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85: página 1325, (1996)]. Por lo tanto, los tensioactivos de ejemplo incluyen, sin limitación, tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos, zwiteriónicos, y anfotéricos que incluyen tensioactivos derivados de aminoácidos que ocurren de manera natural. Los tensioactivos aniónicos incluyen, pero no están limitados a, sulfato laurilo de sodio, sulfosuccinato dioctilo de sodio y sulfonato dioctilo de sodio, ácido quenodesoxicólico, sal N-laurilsarcosina de sodio, sulfato dodecilo de litio, sal sódica de ácido 1 -octanosulfónico, hidrato de colato de sodio, desoxicolato de sodio, y sal sódica de ácido glicodesoxicólico. Los tensioactivos catiónicos incluyen, pero no están limitados a, cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio, monohidrato de cloruro de cetilpiridinio, y bromuro hexadeciltrimetilamonio. Los tensioactivos zwiteriónicos incluyen, pero no están limitados a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, y SB3-12. Los tensioactivos no iónicos incluyen, pero no están limitados a, digitonina, Tritón X-100, Tritón X- 114, TWEEN-20, y TWEEN-80. Los tensioactivos también incluyen, pero no están limitados a lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino de polioxietileno hidrogenado 10, 40, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, lecitina de soya y otros fosfolípidos tales como dioleil fosfatidil colina (DOPC), dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidil colina (DMPC), y (dioleil fosfatidil glicerol) DOPG; éster de ácido graso de sacarosa, metil celulosa y carboximetil celulosa. Las composiciones que comprenden estos tensioactivos, ya sea individualmente o como una mezcla en diferentes proporciones, son proporcionados adicionalmente. En una modalidad de la presente invención, el tensioactivo es TWEEN-80. En las presentes formulaciones, el tensioactivo es incorporado en una concentración de aproximadamente 0.01 g/L hasta aproximadamente 0.5 g/L. En las formulaciones proporcionadas, la concentración del tensioactivo es de 0.005, 0.01, 0.02, 0.03, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 Ó 1.0 g/L.

Sales Las sales con frecuencia son agregadas para aumentar la resistencia iónica de la formulación, la cual puede ser importante para la solubilidad de la proteína, estabilidad física, e isotonicidad. Las sales pueden afectar la estabilidad física de las proteínas en una variedad de modos. Los iones pueden estabilizar la condición natural de las proteínas enlazándolas a residuos cargados en la superficie de las proteínas. Alternativamente, las sales pueden estabilizar la condición desnaturalizada mediante el enlace a grupos péptidos a lo largo de la estructura de la proteína (-CONH-). Las sales también pueden estabilizar la conformación natural de la proteína protegiendo las interacciones electrostáticas repulsivas entre los residuos dentro de una molécula de proteína. Las sales en formulaciones de proteína también pueden proteger las interacciones electrostáticas atractivas entre moléculas de proteína que pueden conducir a la agregación de proteína y la insolubilidad. En las formulaciones proporcionadas, la concentración de sal es entre 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, y 500 m .

Otros componentes de excipientes comunes Aminoácidos Los aminoácidos son encontrados en uso versátil en las formulaciones de proteínas como reguladores, agentes de volumen, estabilizadores y antioxidantes. Por lo tanto, en un aspecto la histidina y el ácido glutámico son empleados para regular las formulaciones de proteína en un rango de pH de 5.5 a 6.5 y de 4.0 a 5.5, respectivamente. El grupo imidazol de histidina tiene un pKa = 6.0 y el grupo carboxilo de la cadena lateral de ácido glutámico tiene un pKa de 4.3 el cual hace que estos aminoácidos sean adecuados para la regulación en sus rangos de pH respectivos. El ácido glutámico es particularmente útil en dichos casos. La histidina generalmente es encontrada en formulaciones de proteínas comercializadas, y estos aminoácidos proporcionan una alternativa para el citrato, un regulador que es conocido que causa comezón después de la inyección. De manera interesante, la histidina también ha sido reportada que tiene un efecto de estabilización, con respecto a la agregación cuando es utilizada en concentraciones altas tanto de líquidos como de presentaciones liofilizadas (Chen B, y asociados, Pharm Res., 20(12): páginas 1952 a 1960 (2003)). La histidina también fue observada por otros que reducen la viscosidad de una formulación de concentración alta de proteína. Sin embargo, en el mismo estudio, los autores observaron una agregación y decoloración aumentada en las formulaciones que contienen histidina durante los estudios de congelado-descongelado del anticuerpo en contenedores de acero inoxidable. Otra nota de precaución con la histidina es que pasa por la foto-oxidación en la presencia de iones de metal (Tomita M, y asociados, Biochemistry, 8(12): páginas 5149 a 5160 (1969)). El uso de metionina como un antioxidante en las formulaciones parece promisorio; ha sido observado que es efectivo contra un número de esfuerzos oxidativos (Lam XM, y asociados, J Pharm Sci, 86(11): páginas 1250 a 1255 (1997)).

En varios aspectos, se proporcionan formulaciones las cuales incluyen uno o más de los aminoácidos de glicina, prolina, serina, arginina y alanina que han mostrado estabilizar las proteínas mediante el mecanismo de exclusión preferencial. La glicina también es utilizada generalmente como agente de volumen en formulaciones liofilizadas. La arginina ha mostrado que es un agente efectivo para inhibir la agregación y ha sido utilizada tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas.

En las formulaciones proporcionadas, la concentración de aminoácidos es entre 0.1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, y 500 mM. En una modalidad de la presente invención, el aminoácido es glicina.

Antioxidantes La oxidación de los residuos de proteína se origina de un número de fuentes diferentes. Más allá de la adición de los antioxidantes específicos, la prevención del daño oxidativo de la proteína comprende el control cuidadoso de un número de factores en todo el proceso de manufactura y almacenamiento del producto tal como el oxígeno atmosférico, temperatura, exposición a la luz, y contaminación química. La presente invención por lo tanto contempla el uso de los antioxidantes farmacéuticos incluyendo, sin limitación, agentes de reducción, limpiadores de oxígeno/radical libre, o agentes de quelación. Los antioxidantes en las formulaciones terapéuticas de proteínas son, en un aspecto, solubles en agua y permanecen activos en toda la vida en el almacén del producto. Los agentes de reducción y los limpiadores de oxígeno/radical libre funcionan ablando especies de oxígeno activo en la solución. Los agentes de quelación tales como EDTA son efectivos por medio del enlace de contaminantes de metal de trazas que promueven la formación de radical libre. Por ejemplo, el EDTA fue utilizado en una formulación líquida del factor de crecimiento de fibroblasto ácido para inhibir la oxidación catalizada por ión de metal de los residuos de cisteína.

Además de la efectividad de los diferentes excipientes para evitar la oxidación de proteína, el potencial para los antioxidantes mismos para inducir otros cambios covalentes o físicos para las proteínas son una preocupación. Por ejemplo, los agentes de reducción pueden ocasionar la interrupción de los enlaces disulfuro intramoleculares, la cual puede conducir a la evasión del disulfuro. En la presencia de iones de metal de transición, el ácido ascórbico y el EDTA se ha mostrado que promueven la oxidación de metionina en un número de proteínas y péptidos. (Akers MJ, y Defelippis MR. "Péptidos y Proteínas como Soluciones Parenterales" (Peptídes and Proteins as Parenteral Solutions). En: "Desarrollo de Formulación Farmacéutica de Péptidos y Proteínas" (Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins). de Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores. Pharmaceutical Science. Taylor y Francis, RU (1999)); Fransson J.R., J. Pharm. Sci. 86(9): páginas 4046 a 1050 (1997); Yin J, y asociados, Pharm Res., 21(12): páginas 2377 a 2383 (2004)). Ha sido reportado que el tiosulfato de sodio reduce los niveles de oxidación alta de metionina inducida por temperatura en el rhuMab HER2; sin embargo, la formación de un aducto de proteína de tiosulfato también se reportó en este estudio (Lam XM, Yang JY, y asociados, J Pharm Sci. 86(11): páginas 1250 a 1255 (1997)). La selección de un antioxidante apropiado se hace de acuerdo con los esfuerzos y sensibilidades específicos de la proteína. Los antioxidantes contemplados en ciertos aspectos incluyen, sin limitación, agentes de reducción y limpiadores de radical libre/oxígeno, EDTA, y tiosulfato de sodio.

Iones de metal En general, los iones de metal de transición no son deseados en las formulaciones de proteína debido a que ellos pueden catalizar las reacciones de degradación química y física de la proteína. Sin embargo, se incluyen los iones de metal específicos de las formulaciones cuando ellos son co-factores a las proteínas y en las formulaciones de suspensión de proteínas en donde forman complejos de coordinación (por ejemplo, suspensión de zinc de insulina). Recientemente, se ha propuesto el uso de iones de magnesio (de 10 mM a 120 mM) para inhibir la isomerización del ácido aspártico en ácido isoaspártico (documento WO 2004039337).

Dos ejemplos en donde los iones de metal confieren estabilidad o actividad aumentada son la desoxiribonucleasa humana (rhDNase, Pulmozyme®), y el Factor VIII. En el caso de la rhDNase, los iones de Ca + 2 (hasta de 100 mM) aumentaron la estabilidad de la enzima a través del sitio de enlace específico (Chen B, y asociados, J Pharm Sci., 88(4): páginas 477 a 482 (1999)). De hecho, la remoción de los iones de calcio de la solución con EGTA ocasionó un aumento en la desamidación y agregación. Sin embargo, este efecto fue observado solamente con los iones Ca+2; se observó que los otros cationes divalentes Mg + 2, Mn+2 y Zn+2 estabilizaban la rhDNase. Se observaron efectos similares en el Factor VIII. Los Ca + 2 y Sr+2 son iones estabilizados de la proteína mientras que otros como Mg + 2, Mn+2 y Zn+2, Cu*2 y Fe+2 desestabilizaron la enzima (Fatouros, A., y asociados, Int. J. Pharm., 155, páginas 121 a 131 (1997). En un estudio separado con el Factor VIII, fue observado un aumento importante en el índice de agregación en la presencia de los iones de ? 3 (Derrick TS, y asociados, J. Pharm. Sci., 93(10): páginas 2549 2557 (2004)). Los autores observaron que otros excipientes como las sales reguladoras con frecuencia son contaminadas con los iones de ? 3 e ilustran la necesidad de utilizar excipientes de calidad apropiada en los productos formulados.

Conservadores Los conservadores son necesarios cuando se desarrollan formulaciones parenterales de uso múltiple que comprenden más de una extracción del mismo contenedor. Su función primaria es inhibir la proliferación de microbios y asegurar la esterilidad del producto en toda la vida en el almacén en términos de uso del producto del fármaco. Los conservadores utilizados generalmente incluyen, sin limitación, alcohol bencílico, fenol y m-cresol. Aunque los conservadores tienen una larga historia de uso, el desarrollo de formulaciones de proteínas que incluyen conservadores puede ser un desafío. Los conservadores casi siempre tienen un efecto desestabilizador (agregación) en las proteínas, y esto se ha convertido en un factor principal para limitar su uso en las formulaciones de proteínas de dosis múltiples (Roy S, y asociados, J Pharm Sci, 94(2): páginas 382 a 396 (2005)).

Hasta la fecha, la mayor parte de los fármacos de proteína han sido formulados para un solo uso solamente. Sin embargo, cuando son posibles las formulaciones de dosis múltiples, ellas tienen la ventaja agregada de hacer posible la conveniencia del paciente, y aumentar su capacidad de comercialización. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento humano (hGH) en donde el desarrollo de las formulaciones conservadas ha conducido a la comercialización de presentaciones de pluma de inyección de uso múltiple más convenientes. Por lo menos cuatro de dichos aparatos de pluma que contienen las formulaciones conservadas de hGH están disponibles actualmente en el mercado. Norditropin® (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQ® (líquido, Genentech) y Genotropina (liofilizada - cartucho de cámara doble, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol mientras que el Somatrope® (Eli Lilly) está formulado con m-cresol.

Diferentes aspectos necesitan ser considerados durante el desarrollo de la formulación de las formas de dosificación conservadas. Debe ser optimizada la concentración efectiva del conservador en el producto del fármaco. Esto requiere la prueba del conservador dado a la forma de dosificación con rangos de concentración que confieren efectividad anti-microbial sin comprometer la estabilidad de la proteína. Por ejemplo, se seleccionaron exitosamente tres conservadores en el desarrollo de una formulación líquida para el receptor de interleucina-1 (Tipo I), utilizando la calorimetría de exploración diferencial (DSC). Los conservadores fueron ordenados de acuerdo a su clasificación basados en su impacto sobre la estabilidad en las concentraciones generalmente utilizadas en los productos comercializados (Remmele RL Jr., y asociados, Pharm Res., 15(2): páginas 200 a 208 (1998)).

El desarrollo de formulaciones líquidas que contienen conservadores es más desafiante que las formulaciones liofilizadas. Los productos congelados-secados pueden ser liofilizados sin conservadores y reconstituidos con un diluyente que contiene el conservador al momento del uso. Esto acorta el tiempo por el cual está en contacto el conservador con la proteína minimizando de una manera importante los riesgos asociados de estabilidad. Con formulaciones líquidas, la efectividad y estabilidad de los conservadores tiene que ser mantenida en la vida en el almacén completa del producto (de ~18 a 24 meses). Un punto importante para observar es que la efectividad del conservador tiene que ser demostrada en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los componentes del excipiente.

Algunos conservadores pueden ocasionar reacciones en el sitio de la inyección, lo cual es otro factor que necesita consideración cuando se le selecciona un conservador. Los ensayos clínicos que se enfocaron en la evaluación de los conservadores y reguladores de la Norditropina, se observó que la percepción del dolor era más baja en las formulaciones que contienen fenol y alcohol bencílico comparadas con las formulaciones que contienen m-cresol (Kappelgaard A.M., Horm Res. 62 Suppl 3: páginas 98 a 103 (2004)). De manera interesante, entre los conservadores más generalmente utilizados, el alcohol bencílico posee propiedades anestésicas (Minogue SC, y Sun DA., Anesth Analg., 100(3): páginas 683 a 686 (2005)). En varios aspectos, el uso de conservadores proporciona un beneficio que contrarresta cualesquiera efectos secundarios.

Métodos de Preparación La presente invención contempla además métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas.

Los métodos actuales comprenden además uno o más de los siguientes pasos: agregar un agente de estabilización como aquí se describe a dicha mezcla antes de la liofilización, agregando por lo menos un agente seleccionado de un agente de volumen, un agente de regulación de osmolaridad, y un tensioactivo, cada uno de los cuales como aquí se describieron, para mezclarlos antes de la liofilización.

La práctica estándar de reconstitución para el material liofilizado se debe de agregar nuevamente a un volumen de agua pura o agua estéril para inyección (WFI) (generalmente equivalente al volumen removido durante la liofilización), aunque las soluciones diluidas de agentes antibacteriales algunas veces son utilizadas en la producción de productos farmacéuticos para la administración parenteral [Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, 18: páginas 1311 a 1354 (1992)]. Por consiguiente, se proporcionan métodos para la preparación de composiciones de rVWF reconstituidas que comprenden el paso de agregar un diluyente a la composición de rVWF liofilizada de la presente invención.

El material liofilizado puede ser reconstituido como una solución acuosa. Una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, agua estéril para inyección, agua con conservadores para el uso de dosis múltiples, o agua con cantidades apropiadas de tensioactivos (por ejemplo, una suspensión acuosa que contiene el compuesto activo en mezcla con excipientes adecuados para la manufactura de las suspensiones acuosas). En varios aspectos, dichos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo, y sin limitación, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma de acacia; agentes de humedecimiento o dispersión que son fosfatidas que ocurren de manera natural, por ejemplo, y sin limitación, lecitina, o productos de condensación de óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, y sin limitación, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, y sin limitación, heptadecaetil-eneoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como mono-oleato de sorbitol polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, y sin limitación, mono-oleato de sorbitan polietileno. En varios aspectos, las suspensiones acuosas también contienen uno o más conservadores, por ejemplo, y sin limitación, etilo, o n-propilo, p-hidroxibenzoato.

Administración Para administrar las composiciones a los humanos y animales de prueba, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Las frases "farmacéuticamente" o "farmacológicamente" aceptables se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de la proteína tal como productos de agregación y disociación, y además no producen reacciones adversas alérgicas, o de otro tipo cuando son administradas utilizando rutas bien conocidas en la técnica, como se describe más adelante. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos los solventes útiles clínicamente, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifúngicos, isotónicos y agentes de demora de absorción y similares, incluyendo aquellos agentes descritos anteriormente.

Las formulaciones farmacéuticas son administradas oralmente, tópicamente, transdérmicamente, parenteralmente, por medio de rocío de inhalación, vaginalmente, rectalmente, o por inyección intracraneal. El término parenteral como se usa en la presente descripción incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intracisternales, o técnicas de infusión. También está contemplada la administración por inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar o un implante quirúrgico en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que podrían ser peligrosas para el receptor.

Las administraciones solas o múltiples de las composiciones se llevan a cabo por los niveles de dosis y patrones que están siendo seleccionados por el médico que imparte el tratamiento. Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosificación apropiada depende del tipo de enfermedad que va a ser tratada, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea si un fármaco es administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al fármaco, y la discreción del médico que atiende al paciente.

Equipos Como un aspecto adicional, la presente invención incluye equipos que comprenden una o más composiciones liofilizadas empacadas de una manera similar la cual facilita su uso para la administración a los sujetos. En una modalidad, dicho equipo incluye la formulación farmacéutica aquí descrita (por ejemplo, una composición que comprende una proteína o péptido terapéutico), empacada en un contenedor tal como una botella o recipiente sellado, con una etiqueta fijada al contenedor o incluida en el empaque que describe el uso del compuesto o composición al practicar el método. En una modalidad, la formulación farmacéutica es empacada en el contenedor de modo que la cantidad del espacio superior en el contenedor (por ejemplo, la cantidad de aire entre la formulación líquida y la parte superior del contenedor) es muy pequeña. Preferentemente, la cantidad del espacio superior no tiene importancia (por ejemplo, casi ninguna). En una modalidad, el equipo contiene un primer contenedor que tiene una composición de proteína o péptido terapéutica y un segundo contenedor que tiene la solución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición. En un aspecto, la formulación farmacéutica es empacada en una forma de dosificación unitaria. El equipo puede incluir además un aparato adecuado para la administración de la formulación farmacéutica de acuerdo con una ruta de administración específica. Preferentemente, el equipo contiene una etiqueta que describe el uso de las formulaciones farmacéuticas.

Dosificaciones El régimen de dosificación comprendido en un método para el tratamiento de un padecimiento aquí descrito será determinado por el médico que atiende al paciente, considerando varios factores los cuales modifican la acción del fármaco, por ejemplo, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. A modo de ejemplo, una dosis típica de un VWF recombinante de la presente invención es de aproximadamente 50 U/kg, igual a 500 g/kg.

En un aspecto, las formulaciones de la presente invención son administradas mediante un bolo inicial seguido por una infusión continua para mantener los niveles de circulación terapéuticos del producto del fármaco. Como otro ejemplo, el compuesto de la invención es administrado como una dosis de una sola vez. Aquellos expertos en la técnica apreciarán fácilmente como optimizar las dosis efectivas y los regímenes de administración determinados por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual. La frecuencia de dosificación depende de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y la ruta de administración. La formulación farmacéutica óptima es determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Ver por ejemplo, "Ciencias Farmacéuticas de Remington" (Remington's Pharmaceutical Sciences), 18a Edición. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435 a 1712, cuya descripción está incorporada al presente documento como referencia. Dichas formulaciones incluyen la condición física, estabilidad, cantidad de liberación in vivo, y cantidad de disociación in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, se calcula una dosis adecuada de acuerdo con el peso corporal, el área de superficie del cuerpo o tamaño del órgano. Las dosificaciones apropiadas pueden ser aseguradas a través del uso de ensayos establecidos para determinar las dosificaciones del nivel sanguíneo en conjunto con los datos de respuesta a la dosis apropiados. El régimen de dosificación final es determinado por el médico que atiende al paciente, considerando varios factores que modifican la acción del fármaco, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, la severidad del daño y la capacidad de respuesta del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Debido a que los estudios son conducidos, la información adicional emergerá con respecto a los niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento para diferentes enfermedades y padecimientos.

Los ejemplos siguientes no pretenden ser limitativos sino únicamente de ejemplo de las modalidades específicas de la presente invención.

Ejemplo 1 Experimentos de agitación Con el objeto de determinar la cantidad de precipitación del rVWF en varias formulaciones, el grado de agregación del rVWF después de una agitación turbulenta fue probado bajo una variedad de condiciones.

Como se muestra en la Tabla 1 siguiente, varias formulaciones de rVWF fueron evaluadas en 20 mM de regulador de citrato, pH 7.3. Los experimentos de agitación fueron diseñados para simular las condiciones de esfuerzo mecánico. Se agitaron de 1 mi a 2 mi de cada formulación con un agitador de laboratorio durante 10 minutos a una velocidad de 1200 rpm.

TABLA 1 Usina Hlstldlna Glicina Serina Manltol PEG T een Sacarosa Trehalosa aflnosa 1500 80 30mM 5gL 30mM 5g/L 30mM Sg/L 30mM 5g/I. 30mM 5gL. 30mM 5gL 30mM 5gL 30mM 5g/L 30mM O.lg/L 30mM O.lg/L 30mM O.lg/L 30mM O.lg/L 30mM Sg/L 5gL. 30mM 5g/L 5gL 30mM 5g/L Sg/L ????? 5g/L SgL 30mM SgL O.lg/L 30mM 5g/L O.lg/L 30mM 5g/L O.lg/L 30m Sg/L o.iga 30mM 5g/L 5g/L O.lg/L 30mM 5g/L Sg/L o.ig/L 30mM 5g/L Sg/L O.lg/L 30ní 5g/L 5g/L o:ig/L 5g/L 5g/L 5gL Sg/L 5g/L S&/L 5g/L 5g/L 5g/L Sg/L 5g/L Sg/L Sg/L O.lg/L O.lg/L 5g/L O.lg/L 5g/L O.lg/L SgL La evaluación de los agregados visibles de VWF se hizo de acuerdo con el esquema que se muestra a continuación. "Agregados visibles", en la mayor parte de los casos, son fibras gelatinosas en un rango de tamaño de aproximadamente 100 nm de 1 cm a 2 cm.

ESQUEMA Los resultados de los experimentos de agitación se muestran en la Tabla 2, siguiente.

TABLA 2 En resumen, los experimentos de agitación descritos anteriormente indican que las formulaciones que contienen Tween-80 y Manitol proporcionan los mejores resultados (por ejemplo, la menor cantidad de agregación).

Ejemplo 2 Experimentos de congelado-descongelado Los experimentos de congelado-descongelado fueron diseñados para evaluar el impacto del esfuerzo ocasionado por el congelado y descongelado repetido. Además de las formulaciones descritas anteriormente para los experimentos de agitación (Tabla 1), se evaluaron las siguientes formulaciones (Tabla 3 y Tabla 4): TABLA 3 TABLA 4 Todas las formulaciones fueron congeladas a una temperatura de -20°C en un congelador por aproximadamente 1 hora y luego descongeladas a temperatura ambiente. Los resultados se muestran en la Tabla 5 siguiente.

TABLA 5 Como se mostró anteriormente, la Trehalosa proporcionó los mejores resultados (por ejemplo, la menor cantidad de agregación).

Ejemplo 3 Experimentos de liofilización Los experimentos de liofilización fueron diseñados para evaluar la capacidad de diferentes formulaciones para permitir la formación de una torta de liofilizado la cual se disuelve en menos de 10 minutos y da como resultado una solución clara. El estudio de estabilidad acelerada también se realizó para demostrar que no había una pérdida importante de actividad biológica.

Las formulaciones mostradas en la Tabla 6 siguiente fueron liofilizadas con un liofilizador de nitrógeno TS20002 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tiempo total para la liofilización fue de aproximadamente 72 horas. Cada una de las formulaciones siguientes también contenían 20 g/L de Manitol y 0.1 g/L de Tween-80.

TABLA 6 Los resultados de los experimentos de Mofilización se muestran en la Tabla 7 siguiente.

TABLA 7 Como se muestra anteriormente, ya sea el Citrato o el regulador HEPES en combinación con un aminoácido produjeron la solución más clara.

Con el objeto de evaluar la estabilidad del rVWF liofilizado reconstituido, se realizaron pruebas en VWF:Ag y VWF:RCo. El VWF:Ag corresponde a la cantidad de VWF la cual puede ser detectada en una prueba de ELISA específica para VWF utilizando un anticuerpo policlonal anti-VWF, mientras que el VWF.RCo corresponde a la cantidad de VWF que ocasiona la aglutinación de las plaquetas estabilizadas en la presencia de ristocetina. Las muestras fueron almacenadas a una temperatura de 40°C. Suponiendo que la aplicabilidad de la ecuación de Arrhenius, un mes de estabilidad a una temperatura de 40°C es equivalente a aproximadamente un año a una temperatura de 4°C. Los resultados de los experimentos de estabilidad se muestran en la Tabla 8 y la Tabla 9 siguientes.

TABLA 8 TABLA 9 La desviación estándar para el análisis de ELISA se encuentra en un rango del 10% al 20%. Los resultados anteriores indican que todas las formulaciones probadas proporcionan una buena estabilidad por un período de 8 semanas a una temperatura de 40°C.

Los experimentos adicionales de estabilidad se realizaron en donde fueron usados diferentes aminoácidos en las formulaciones (por ejemplo, glicina, Usina o histidina en 15 mMor 20 m), y en donde fue variado el regulador de citrato (por ejemplo, 15, 20 ó 25 mM). Como se describió anteriormente, la estabilidad del rVWF fue monitoreada utilizando el ensayo de actividad VWF:RCo. Aún después de 13 meses no se observaron diferencias importantes para los valores de actividad del VWF:RCo de las muestras de estabilidad del rVWF almacenadas a una temperatura de 40°C. La importancia de las mediciones fue probada con una Prueba-t. La precisión del intermediario del ensayo fue determinada calculando el Coeficiente de Variación. En todas las series de los datos de estabilidad del CV fue debajo del 20% y cumplió con los criterios de validación de un CV<20%. Basado en lo anterior, se puede concluir que el rVWF es estable en todos los sistemas de regulador de citrato probados, independiente de la molaridad del regulador y los aminoácidos agregados. El rVWF permanece estable por al menos 13 meses aún cuando es almacenado a una temperatura de 40°C. La determinación de la potencia utilizando el ensayo de actividad VWF:RCo muestra una buena precisión intermedia con valores CV debajo del 20%.

Por lo tanto, en vista de los datos aquí presentados, se propuso una formulación para el rVWF que incluye 15 mM de citrato (Citrato Na3 x 2 H20), 15 mM de glicina, 10 g/L de Trehalosa, 20 g/L de Manitol, 0.1 g/L de Tween-80, pH 7.3.

Ejemplo 4 Estabilidad a largo plazo Pruebas de estabilidad a largo plazo y acelerada Los estudios se realizaron para evaluar la estabilidad del producto del fármaco final rVWF (FDP) almacenado tanto en las condiciones de almacenamiento recomendadas como elevadas.

Los datos de las condiciones de almacenamiento elevadas proporcionan el aseguramiento de que las desviaciones en la temperatura no impactarán la calidad del rVWF FDP y serán utilizadas para extrapolar las condiciones de expiración aceptables del material en la ausencia de datos de estabilidad de condición real en tiempo real.

La especificación actual es de = 3.0% de humedad residual (determinada utilizando el Método de Karl Fischer). Se liberaron lotes de rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC con niveles de humedad de 1.2%, 1.3%, 1.2%, y 1.5% respectivamente. Basados en la experiencia pasada con otros productos con configuraciones similares del frasco y el tapón, se espera que cualquier lote de rVWF liberado con aproximadamente una humedad residual de 1.3% cubrirá los limites de especificación de = 3.0% al final de la vida en el almacén propuesta (por ejemplo, 24 meses a la temperatura de almacenamiento pretendida de 5°C ± 3°C).

Los estudios de estabilidad a largo plazo en las condiciones de almacenamiento recomendadas (por ejemplo, de 5°C ± 3°C) y temperaturas elevadas (por ejemplo, de 40°C ± 2°C) se realizaron con cuatro lotes de rVWF FDP que habían sido manufacturados. Estos estudios han proporcionado datos suficientes para comparar el comportamiento de estabilidad de los lotes clínicos individuales.

El protocolo de estabilidad, incluyendo una descripción de los ensayos que indican la estabilidad y los criterios de aceptación de estabilidad, se pueden encontrar en la Tabla 10 la cual también contiene información relacionada con los lotes rVWF FDP evaluados en los estudios de estabilidad.

Tabla 10 Resumen y explicación de la estabilidad general (24 Meses) Los datos de estabilidad del rVWF FDP presentados comprenden lo siguiente: 1. Datos de 24 meses en el estudio de largo plazo a una temperatura de 5°C ± 3°C (prueba completa) y datos intermedios de 6 meses a una temperatura de 30°C ± 2°C (prueba completa) para el lote de rVWF#1FC; 2. Datos de 6 meses a una temperatura de 5°C ± 3°C (prueba completa) para el lote de rVWF#2FC; 3. Datos de 24 meses para estudios de largo plazo a una temperatura de 2°C a 8eC (prueba completa), datos de 6 meses a una temperatura de 30°C ± 2°C y datos de 3 meses a una temperatura de 40°C ± 2°C (prueba completa) para el lote de rVWF#3FC; 4. Datos de estabilidad de 24 meses a una temperatura de 5°C ± 3°C y datos de 9 meses a una temperatura de 40°C ± 2°C para el lote de rVWFF#4FC; 5. Datos de estabilidad de 24 meses a una temperatura de 5°C ± 3°C y datos de 9 meses a una temperatura de 40°C ± 2°C para el lote de rVWFF#5FC; 6. Datos de estabilidad de 12 meses a una temperatura de 5°C ± 3°C y datos de 9 meses a una temperatura de 40°C + 2°C para el lote de rVWFF#6FC; y 7. Datos de estabilidad de 12 meses a una temperatura de 5°C ± 3°C y datos de 9 meses a una temperatura de 40°C ± 2°C para el lote de rVWFF#7FC.

La variación observada en la humedad residual para los lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC ha permanecido bien debajo de los criterios de aceptación = 3%, y no ha sido impactada por su actividad funcional (VWF:RCo). No existe un cambio que se pueda observar en los resultados de estabilidad para las técnicas analíticas cualitativas (por ejemplo, apariencia, análisis SDS-PAGE, etc.) para los lotes manufacturados para que sean adecuados para utilizarse tanto en estudios clínicos como no clínicos. De un modo similar, no existe una tendencia de disminución de la estabilidad para el análisis de proteína total, el análisis VWF:Ag o el número observado de multímeros de VWF durante el almacenamiento.

La variación de ambas la proporción de la actividad de VWF:RCo a la actividad de VWF:Ag y los datos de VWF:RCo presentados para los lotes rVWF#1FC, rVWF#2FC y rVWF#3FC fue probablemente el resultado de la variación del método de prueba, el hecho de que los resultados de la prueba de estabilidad individual del VWF:RCo consistió de datos de una sola determinación de una muestra de estabilidad, y/o los datos de la metodología de ensayo del método que conforma la no Ph. Eur. Todos los puntos de tiempo de la prueba para los lotes no clínicos subsecuentes a la modificación de la metodología de ensayo al Ph. Eur. que conforman el ensayo fueron probados utilizando la metodología original como el nuevo ensayo.

El rVWF FDP manufacturado en larga escala exhibió características similares de estabilidad para los lotes de rVWF FDP manufacturados en una escala experimental. Estos lotes de rVWF FDP mantuvieron la actividad de VWF:RCo por hasta 24 meses de almacenamiento en una temperatura de 5°C ± 3°C. No hubo cambio en el patrón del multímero VWF en muestras de los lotes de gran escala actualmente en la estabilidad, aún después de 6 meses de almacenamiento a una temperatura de 30°C ± 2°C o 9 meses de almacenamiento a una temperatura de 40°C ± 2°C. La Tabla 11 muestra los resultados para VWF:RCo, VWF:Ag y el patrón del multímero de VWF de los lotes rVWF#4FC, rVWF#5FC, rVWF#6FC y rVWF#7FC almacenados bajo condiciones de esfuerzo a una temperatura de 40°C ± 2°C. Los resultados indican estabilidad en condiciones de almacenamiento en temperatura elevada por 9 meses la cual puede ser extrapolada dentro de la vida en el almacén de más de 3 años a temperaturas ambiente o aún bajo condiciones más refrigeradas.

Tabla 11 Un análisis de covariación (análisis ANCOVA) demostró que las diferencias en las inclinaciones de las líneas de regresión (lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC almacenados a una temperatura de 5°C ± 3°C) no es importante (p = 0.906), permitiendo que los datos de actividad del VWF:RCo fueran conjuntados como se describen en ICH QIA (R2). La diferencia en elevación de las líneas de tendencia de los lotes individuales tampoco es importante. La extrapolación de la inclinación del peor caso conjuntado, como se muestra en la figura 1, muestra que los intervalos de confianza están bien dentro de los criterios de aceptación para un mínimo de 24 meses. El intervalo de confianza más bajo para la curva del promedio disminuye a 80% de la actividad inicial a 51 meses (80% también es la diferencia máxima entre la potencia estimada y la potencia manifestada para el Factor de Von Willebrand Humano en Ph.Eur). La inclinación de peor caso conjuntado muestra una disminución de 0.0344 U VWF:RCo por mes. Esta comparación muestra que las características de estabilidad del rVWF FDP, específicamente la actividad de VWF:RCo, no cambia como resultados de los cambios en el proceso de producción. La extrapolación anterior soporta la extensión de la vida en el almacén provisional del rVWF FDP a 24 meses cuando es almacenado en la temperatura de almacenamiento recomendada.

La transferencia de la humedad del tapón del producto liofilizado es dependiente del material del tapón y es influenciado por la humedad residual del tapón después de la esterilización, la humedad en la cual la muestra es almacenada y la cantidad de transferencia de humedad intrínseca del tapón. La humedad residual en los lotes rVWFF#4FC, rVWFF#5FC, rVWFF#6FC y rVWFF#7FC almacenados a una temperatura de 5°C ± 3°C fue comprable (siendo la diferencia en comparación con las inclinaciones no importante, con p = 0.734), como se muestra en la figura 2. Los lotes almacenados en condiciones de temperatura elevada de 40°C ± 2°C también mostraron un aumento comparable en la humedad residual después de 9 meses (figura 3). El análisis de ANCOVA demuestra aquí que la diferencia en la inclinación de las líneas de regresión se puede comparar (p = 0.546). La figura 3 muestra la extrapolación de la inclinación conjuntada del peor caso hasta por 24 meses.

Estos son datos suficientes para soportar el uso de los lotes de rVWFF#6FC y rVWFF#7FC por la duración del período de expiración descrito de 24 meses cuando es almacenado a una temperatura de 5°C ± 3°C.

Condiciones Propuestas de Almacenamiento y Vida en el Almacén Las condiciones de almacenamiento recomendadas para el rVWF FDP son de 5°C ± 3°C. Una vida en el almacén provisional de 24 meses para el rVWF FDP por lo tanto es propuesta cuando es almacenada a las condiciones de almacenamiento recomendadas. La vida en el almacén para los lotes de rVWF FDP probablemente pueden ser extendidos adicionalmente basados en los datos adicionales que van a ser generados para períodos de almacenamiento más largos.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica liofilizada estable de un Factor de Von Willebrand recombinante (rVWF) que comprende: (a) un rVWF; (b) uno o más agentes de regulación; (c) uno o más aminoácidos; (d) uno o más agentes de estabilización; y (e) uno o más tensioactivos; comprendiendo dicho rVWF un polipéptido seleccionado del grupo consistente de: a) la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; b) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de a); c) un polipéptido codificado por el polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1; d) un análogo, fragmento o variante biológicamente activo de c); y e) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida al polinucleótido establecido en la SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de hibridación moderadamente severas; comprendiendo dicho regulador un agente de regulación de pH en un rango de aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 500 mM y dicho pH se encuentra en un rango de aproximadamente 2.0 hasta aproximadamente 12.0; dicho aminoácido se encuentra en una concentración de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM; dicho agente de estabilización se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 1000 mM; y dicho tensioactivo se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.01 g/L hasta aproximadamente 0.5 g/L.

2. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3.

3. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de regulación es seleccionado del grupo consistente de citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris y combinaciones de estos agentes.

4. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de regulación es citrato.

5. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el pH se encuentra en un rango de aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 8.0.

6. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizada porque el pH se encuentra en un rango de aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 7.5.

7. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 4, caracterizada porque el pH es de aproximadamente 7.3.

8. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de regulación es citrato y el pH es de aproximadamente 7.3.

9. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido es seleccionado del grupo consistente de glicina, histidina, prolina, serina, alanina y arginina.

10. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizada porque el aminoácido se encuentra en un rango de concentración de aproximadamente 0.5 mM hasta aproximadamente 300 mM.

11. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 10, caracterizada porque el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM.

12. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; en donde el agente de regulación es citrato y el pH es de aproximadamente 7.3; y en donde el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM.

13. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el uno o más agentes de estabilización son seleccionados del grupo consistente de manitol, lactosa, sorbitol, xilitol, sacarosa, trehalosa, mañosa, maltosa, lactosa, glucosa, rafinosa, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, arabinosa, glucosamina, fructosa y combinaciones de estos agentes de estabilización.

14. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 13, caracterizada porque los agentes de estabilización son trehalosa en una concentración de aproximadamente 10 g/L mM y manitol en una concentración de aproximadamente 20 g/L.

15. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el tensioactivo es seleccionado del grupo consistente de digitonina, Tritón X-100, Tritón X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 y combinaciones de estos tensioactivos.

16. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 15, caracterizada porque el tensioactivo es TWEEN-80 en una cantidad de aproximadamente 0.01 g/L.

17. La formulación tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque el rVWF comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 3; en donde el agente de regulación es citrato en una concentración de aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente pH 7.3; en donde el aminoácido es glicina en una concentración de aproximadamente 15 mM; en donde los agentes de estabilización son trehalosa en una concentración de aproximadamente 10 g/L y manitol en una concentración de aproximadamente 20 g/L.; y en donde el tensioactivo es TWEEN-80 en una cantidad de aproximadamente 0.1 g/L.