BRPI0919693A2 - formulação farmacêutica estável liofilizada - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA ESTÁVEL LIOFILIZADA. A presente invenção fornece formulações farmacêuticas estáveis de longa duração do Fator de von-Willebrand recombinante (rVWF) liofilizadas e métodos para fabricar e administrar as ditas formulações

Description

“FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA ESTÁVEL LIOFILIZADA”

CAMPO DA INVENÇÃO No geral, a invenção diz respeito às formulações de VWF recombinante liofilizadas e métodos para fabricar uma composição liofilizada : 5 quecompreende VWF recombinante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO ' O Fator de Von Willebrand (VWF) é uma glicoproteína que circula no plasma como uma série de multímeros que variam no tamanho de cerca de 500 a 20.000 kD. As formas multiméricas de VWF são compostas de , 10 subunidades de polipeptídeo de 250 kD ligadas juntas pelas ligações de dissulfeto. VWF medeia a adesão de plaqueta inicial ao sub-endotélio da parede de vaso danificada. Apenas os multímeros maiores exibem atividade hemostática. É assumido que as células endoteliais secretam formas poliméricas grandes de VWF e aquelas formas de VWF que têm um peso molecular baixo (VWF de peso molecular baixo) surgem da clivagem proteolítica. Os multímeros tendo massas moleculares grandes são armazenadas nos corpos de Weibel-Pallade de células endoteliais e liberadas na estimulação.

O VWF é sintetizado pelas células endoteliais e —megacariócitos como prepro-VWF que consiste de uma grande extensão de domínios repetidos. Na clivagem do peptídeo de sinal, pro-VWF dimeriza através de ligações de dissulfeto na sua região de terminal C. Os dímeros servem como protômeros para a multimerização, que é controlada pelas ligações de dissulfeto entre os terminais de extremidade livre. A montagem de —multímeros é seguida pela remoção proteolítica da sequência de propeptídeo (Leyte et al., Biochem. J. 274 (1991), 257-261). O produto de tradução primária prognosticado a partir do cDNA clonado de VWF é um polipeptídeo precursor de 2813 resíduos (prepro-VWF). O prepro-VWF consiste de um peptídeo de sinal de 22 aminoácidos e um propeptídeo de 741 aminoácidos, com o VWF maduro que compreende 2050 aminoácidos (Ruggeri Z. A., e Ware, J., FASEB J., 308- 316 (1993)). Os defeitos no VWF são causa para a doença de Von . 5 —Willebrand(VWD), que é caracterizada por um fenótipo de hemorragia mais ou menos pronunciado. O VWD tipo 3 é a forma mais severa em que o VWF ' é completamente perdido, e o VWD tipo 1 diz respeito a uma perda quantitativa de VWF e o seu fenótipo pode ser muito brando. O VWD tipo 2 diz respeito aos defeitos qualitativos de VWF e pode ser tão severo quanto o . 10 VWD tipo 3. O VWD tipo 2 tem muitas subformas, algumas estando associadas com a perda ou a diminuição de multímeros de alto peso molecular. A síndrome de Von Willebrand tipo 2a (VWS-2A) é caracterizada por uma perda tanto dos multímeros intermediários quanto grandes. O VWS- 2B é caracterizado por uma perda dos multímeros de peso molecular mais alto. Outras doenças e distúrbios relacionados com o VWF são conhecidos na técnica. As Patentes US. Nº 6.531.577, 7.166.709, e Pedido de Patente Europeu Nº 04380188.5, descrevem formulações de VWF derivadas de plasma. Entretanto, além dos problemas de quantidade e pureza com o VWF derivado de plasma, existe também um risco de patógenos transportados pelo sangue (por exemplo, vírus e doença de Creutzfeldt-Jakob Variante (vCJD). Além disso, o VWF é conhecido formar agregados durante condições de estresse. Assim existe uma necessidade na técnica para desenvolver uma formulação farmacêutica estável que compreende VWF recombinante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece formulações úteis para a liofilização de VWF recombinante, resultando em uma composição farmacêutica altamente estável. A composição farmacêutica estável é útil como um agente terapêutico no tratamento de indivíduos que sofrem de distúrbios ou condições que podem se beneficiar da administração de VWF recombinante.

Em uma forma de realização, uma formulação farmacêutica . 5 — estável liofilizada de um Fator de von Willebrand recombinante (rVWF) é fornecida que compreende: (a) um rVWF; (b) um ou mais agentes de ' tamponação; (c) um ou mais aminoácidos; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais tensoativos; o rVWF que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: a) a sequência de . 10 aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; b) um análogo, fragmento ou variante de a) biologicamente ativo; c) um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo apresentado na SEQ ID NO: 1; d) um análogo, fragmento ou variante de c) biologicamente ativo; e e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza ao polinucleotídeo apresentado na SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização moderadamente severas; o tampão é que compreende de um agente de tamponação de pH em uma faixa de cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM e o pH está em uma faixa de cerca de 2,0 a cerca de 12,0; o aminoácido está em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 500 mM; o agente de estabilização está em uma concentração de cerca de 0,1 a —cercade 1000 mM; e o tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,01 &/L a cerca de 0,5 g/L.

Em uma outra forma de realização, o rVWF compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3. Ainda em uma outra forma de realização, o agente de tamponação é selecionado do grupo que — consiste de citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes. Já em uma outra forma de realização, o agente de tamponação é o citrato. Em várias formas de realização, o pH está na faixa de cerca de 6,0 a cerca de 8,0, de cerca de 6,5 a cerca de 7,5, ou de cerca de 7,3. Em uma outra forma de realização, o pH é de cerca de 7,3.

Em uma outra forma de realização, o aminoácido anteriormente mencionado é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, prolina, serina, alanina e arginina. Em uma outra forma de realização, o aminoácido está em uma faixa de concentração de cerca de 0,5 . 5 mM a cerca de 300 mM. Ainda em uma outra forma de realização, o aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM.

' Em uma forma de realização da invenção, o IVWF compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; em que o agente de tamponação é citrato e o pH é de cerca de 7,3; e em que o ' 10 aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM.

Ainda em uma outra forma de realização da invenção, o um ou mais agentes estabilizantes anteriormente mencionados são selecionados do grupo que consiste de manitol, lactose, sorbitol, xilitol, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose e combinações destes agentes estabilizantes. Em uma forma de realização, os agentes estabilizantes são trealose em uma concentração de cerca de 10 g/L mM e manitol em uma concentração de cerca de 20 g/L.

Já em uma outra forma de realização da invenção, o tensoativo anteriormente mencionado é selecionado do grupo que consiste de digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes tensoativos. Ainda em uma outra forma de realização, o tensoativo é TWEEN-80 a cerca de 0,01 g/L.

Em uma outra forma de realização da invenção, o rVWF — compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; em que o agente de tamponação é citrato em uma concentração de cerca de 15 mM a cerca de pH 7,3; em que o aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM; em que os agentes estabilizantes são trealose em uma concentração de cerca de 10 g/L e manitol em uma concentração de cerca de

20 g/L; e em que o tensoativo é TWEEN-80 a cerca de 0,1 g/L. .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a análise de ANCOVA da atividade de VWE:RCo agrupado em lotes avaliados quanto a estabilidade (armazenados a . 5 5ºC+3ºO). A Figura 2 mostra o aumento na umidade residual em FDP de ' 1TVWF armazenado a 5ºC + 3ºC. A Figura 3 mostra o aumento na umidade residual em FDP de i rVWF armazenado a 40ºC + 2ºC. : 10 DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definição de termos A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. As seguintes referências provêêm uma pessoa de habilidade com uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton, et al, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2º ed 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED, R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale e Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Cada publicação, pedido de patente, patente, e outras referências aqui citadas é incorporada por referência na sua totalidade até o —grauem que não seja incompatível com a presente divulgação. É aqui mencionado que, como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um,” “uma,” e “o”, “a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outro modo.

Como aqui usado, os seguintes termos têm os significados atribuídos a eles a menos que de outro modo especificado.

O termo “que compreende,” com respeito a um composto de peptídeo, significa que um composto pode incluir aminoácidos adicionais em . 5 —cadaum ou em ambos os terminais amino e carbóxi da sequência dada.

Naturalmente, estes aminoácidos adicionais não devem interferir significantemente com a atividade do composto. Com respeito a uma composição da presente invenção, o termo “que compreende” significa que uma composição pode incluir componentes adicionais. Estes componentes ' 10 adicionais não devem interferir significantemente com a atividade da composição.

O termo “farmacologicamente ativo” significa que uma substância assim descrita é determinada ter atividade que afeta um parâmetro médico (por exemplo, mas não limitado a pressão sanguínea, contagem de célula sanguínea, nível de colesterol) ou estado de doença (por exemplo, mas não limitado a câncer, distúrbios autoimunes).

Como aqui usados os termos “expressar,” “expressando” e “expressão” significam permitir ou fazer com que a informação em um gene ou sequência de DNA se torne manifesta, por exemplo, produzindo uma proteína pela ativação das funções celulares envolvidas na transcrição e tradução de um gene ou sequência de DNA correspondentes. Uma sequência de DNA é expressada em ou por uma célula para formar um “produto de expressão” tal como uma proteína. O próprio produto de expressão, por exemplo, a proteína resultante, também pode ser dita ser “expressada.” Um — produto de expressão pode ser caracterizado como intracelular, extracelular ou secretado. O termo “intracelular” significa dentro de uma célula. O termo “extracelular” significa fora de uma célula, tal como uma proteína de transmembrana. Uma substância é “secretada” por uma célula se a mesma aparece em medida significante fora da célula, de algum lugar na ou dentro da célula.

Como aqui usado um “polipeptídeo” refere-se a um polímero composto de resíduos de aminoácido, variantes estruturais, variantes estruturais que ocorrem naturalmente relacionadas, e análogos destas que não . 5 ocorrem naturalmente sintéticos ligados via ligações de peptídeo. Os polipeptídeos sintéticos são preparados, por exemplo, usando um sintetizador ' de polipeptídeo automatizado. O termo “proteína” tipicamente refere-se a polipeptídeos grandes. O termo “peptídeo” tipicamente refere-se a polipeptídeos curtos.

: 10 Como aqui usado um “fragmento” de um polipeptídeo é intencionado a referir-se a qualquer porção de um polipeptídeo ou proteína menor do que o produto de expressão de polipeptídeo ou proteína de tamanho natural.

Como aqui usado um “análogo” refere-se a qualquer um de —doisoumais polipeptídeos substancialmente similares em estrutura e tendo a mesma atividade biológica, mas pode ter graus variáveis de atividade, para a molécula inteira, ou a um fragmento deste. Análogos diferem na composição de suas sequências de aminoácido com base em uma ou mais mutações que envolvem substituição, deleção, inserção e/ou adição de um ou mais aminoácidos para outros aminoácidos. As substituições podem ser conservativas ou não conservativas com base na relacionabilidade físico- química ou funcional do aminoácido que está sendo substituído e o aminoácido que o substitui.

Como aqui usado uma “variante” refere-se a um polipeptídeo, — proteína ou análogo destes que são modificados para compreender porções químicas adicionais não normalmente uma parte da molécula. Tais porções podem modular a solubilidade, absorção, meia vida biológica, etc. da molécula. As porções podem alternativamente diminuir a toxicidade da molécula e eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis da molécula, etc.

As porções capazes de mediar tais efeitos são divulgados em Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Procedimento para ligar tais porções a uma molécula são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo e sem limitação, em um aspecto a variante é um fator de coagulação sanguínea , 5 tendo uma modificação química que confere uma meia-vida mais longa in vivo para a proteína.

Em vários aspectos, os polipeptídeos são modificados ' pela gilcosilação, peguilação, e/ou polissialilação.

VWF recombinante As sequências do polinucleotídeo e de aminoácido de prepro- - 10 VWF são apresentadas nas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente, e são disponíveis nos Acessos do GenBank Nos.

NM 000552 e NP 000543, respectivamente.

A sequência de aminoácido que corresponde à proteína VWF madura é apresentada na SEQ ID NO: 3 (que corresponde aos aminoácidos 764 a 2813 da sequência de aminoácido prepro-VWF de tamanho natural). Uma forma de rVWF útil tem pelo menos a propriedade de estabilização in vivo, por exemplo, ligação, de pelo menos uma molécula do Fator VIII (FVIII) e tendo opcionalmente um padrão de glicosilação que seja farmacologicamente aceitável.

Os seus exemplos específicos incluem VWF sem o domínio A2 resistente assim à proteólise (Lankhof et al., Thromb.

Haemost. 77: 1008-1013, 1997), e um fragmento de VWF de Val 449 a Asn 730 que inclui o domínio de ligação 1b da glicoproteína e sítios de ligação para colágeno e heparina (Pietu et al., Biochem.

Biophys.

Res.

Commun. 164: 1339-1347, 1989). A determinação da capacidade de um VWF para — estabilizar pelo menos uma molécula FVIII é, em um aspecto, realizado em mamíferos deficientes em VWF de acordo com os métodos conhecidos no estado da técnica.

O rVWF da presente invenção é produzido por qualquer método conhecido na técnica.

Um exemplo específico é divulgado na

WO86/06096 publicada em 23 de outubro de 1986 e Pedido de Patente U.S.

No. 07/559.509, depositado em 23 de julho de 1990, que são aqui incorporada por referência com respeito aos métodos de produzir VWF recombinante.

Assim, os métodos são conhecidos na técnica para (1) a produção de DNA , 5 — recombinante pelo engenheiramento genético, por exemplo, via transcrição reversa de RNA e/ou amplificação de DNA, (ii) introduzir DNA recombinante em células procarióticas ou eucarióticas pela transfecção, por : exemplo, via eletroporação ou microinjeção, (iii) cultivar as células transformadas, por exemplo, em uma maneira contínua ou por batelada, (iv) ' 10 expressar VWF, por exemplo, constitutivamente ou na indução, e (v) isolar o VWF, por exemplo, a partir do meio de cultura ou pela colheita das células transformadas, de modo a (vi) obter rVWF purificado, por exemplo, via cromatografia de troca aniônica ou cromatografia de afinidade. Um VWF recombinante é, em um aspecto, fabricado em células hospedeiras transformadas usando Técnicas de DNA recombinantes bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as sequências que codificam o polipeptídeo podem ser excisadas do DNA usando enzimas de restrição adequadas. Alternativamente, a molécula de DNA é, em um outro aspecto, sintetizado usando técnicas de síntese química, tais como o método do fosforamidato. Também, ainda em um — outro aspecto, uma combinação destas técnicas é usada.

A invenção também fomece vetores que codificam polipeptídeos da invenção em um hospedeiro adequado. O vetor compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo operativamente ligado a sequências de controle de expressão apropriadas. Métodos de efetuar esta ligação operativa, antes ou depois que o polinucleotídeo seja inserido no vetor, são bem conhecidos. As sequências de controle de expressão incluem promotores, ativadores, realçadores, operadores, sítios de ligação de ribossoma, sinais de partida, sinais de parada, sinais de capeamento, sinais de poliadenilação, e outros sinais envolvidos com o controle de transcrição ou tradução. O vetor resultante tendo o polinucleotídeo nele é usado para transformar um hospedeiro apropriado. Esta transformação pode ser realizada usando métodos bem conhecidos na técnica.

Qualquer uma de um número grande de células hospedeiras . 5 — disponíveis e bem conhecidas é usada na prática desta invenção. A seleção de um hospedeiro particular é dependente de vários fatores reconhecidos pela ' técnica, que inclui, por exemplo, compatibilidade com o vetor de expressão escolhido, toxicidade dos peptídeos codificados pela molécula de DNA, taxa | de transformação, facilidade de recuperação dos peptídeos, características de ' 10 expressão, bio-segurança e custos. Um equilíbrio destes fatores deve estar de acordo com o entendimento de que nem todas as células hospedeiras são igualmente eficazes quanto a expressão de uma sequência de DNA particular.

Dentro destas diretrizes gerais, as células hospedeiras microbianas úteis incluem, sem limitação, células de bactérias, levedura e outros fungos, insetos, plantas, mamíferos (que incluem o ser humano) em cultura, ou outros hospedeiros conhecidos na técnica.

As células hospedeiras transformadas são cultivadas sob condições de fermentação convencionais de modo que os compostos desejados sejam expressados. Tais condições de fermentação são bem — conhecidos na técnica. Finalmente, os polipeptídeos são purificados a partir do meio de cultura ou das próprias células hospedeiras pelos métodos bem conhecidos na técnica.

Dependendo da célula hospedeira utilizada para expressar um composto da invenção, grupos de carboidrato (oligossacarídeo) são — opcionalmente ligados aos sítios que são conhecidos ser sítios de glicosilação em proteínas. No geral, oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto que os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da sequência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente não contando prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado nos . 5 — oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O é o ácido N- acetilneuramínico (aludido como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente i o resíduo terminal dos oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em . O e, em virtude da sua carga negativa, em um aspecto, confere propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ' 10 ligador dos compostos desta invenção e são preferivelmente gilcosilados por uma célula durante a produção recombinante dos compostos de polipeptídeo (por exemplo,, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Em outros aspectos, tais sítios são glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.

Alternativamente, os compostos são fabricados pelos métodos sintéticos usando, por exemplo, técnicas de síntese de fase sólida. As técnicas adequadas são bem conhecidas no ramo, e incluem aquelas descritas em Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335-61 (Katsoyannis e Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), —Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart e Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; Pat. U.S. No. 3.941.763; Finn et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 105-253; e Erickson et al. (1976), The Proteins (3a ed.) 2: 257-527. A síntese de fase sólida é a técnica preferida de fabricar peptídeos individuais visto que a mesma é o método mais eficaz em custo de fabricar peptídeos pequenos.

— Fragmentos, variantes e análogos de VWE Os métodos para preparar fragmentos, variantes ou análogos de polipeptídeo são bem conhecidos na técnica.

Os fragmentos de um polipeptídeo são preparados usando, sem limitação, a clivagem enzimática (por exemplo, tripsina, quimiotripsina) e também usando meios recombinantes para gerar um fragmento de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido específica. Os fragmentos de polipeptídeo podem ser gerados compreendendo uma região da proteína tendo uma atividade particular, tal como um domínio de multimerização ou . 5 — qualquer outro domínio VWF identificável conhecido na técnica. Os métodos de fabricar análogos de polipeptídeo também são i bem conhecidos. Os análogos de sequência de aminoácido de um polipeptídeo . podem ser análogos de substituição, inserção, adição ou deleção. Os análogos de deleção, que incluem fragmentos de um polipeptídeo, carecem de um ou ' 10 mais resíduos da proteína nativa que não são essenciais para a função ou atividade imunogênica. Os análogos insercionais envolvem a adição, por exemplo, de aminoácido(s) em um ponto não terminal no polipeptídeo. Este análogo pode incluir, por exemplo e sem limitação, a inserção de um epítopo imunorreativo ou simplesmente um resíduo único. Os análogos de adição, que 15º incluem fragmentos de um polipeptídeo, incluem a adição de um ou mais aminoácidos em cada um ou em ambos os terminais de uma proteína e incluem, por exemplo, proteínas de fusão. As combinações dos análogos anteriormente mencionados são também considerados.

Os análogos de substituição tipicamente trocam um — aminoácido do tipo selvagem por um outro em um ou mais sítios dentro da proteína, e podem ser designados para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo sem a perda completa de outras funções ou propriedades. Em um aspecto, as substituições são substituições conservativas. A “substituição de aminoácido conservativa” é a substituição de um aminoácido com um aminoácido tendo uma cadeia lateral ou um caráter químico similar. Os aminoácidos similares para fabricar substituições conservativas incluem aquelas tendo uma cadeia lateral ácida (ácido glutâmico, ácido aspártico); uma cadeia lateral básica (arginina, lisina, histidina); uma cadeia lateral de amida polar (glutamina, asparagina); uma cadeia lateral hidrofóbica, alifática

(leucina, isoleucina, valina, alanina, glicina); uma cadeia lateral aromática (fenilalanina, triptofano, tirosina); uma cadeia lateral pequena (glicina, alanina, serina, treonina, metionina); ou uma cadeia lateral de hidroxila alifática (serina, treonina). . 5 Em um aspecto, análogos são substancialmente homólogos ou substancialmente idênticos ao VWF recombinante a partir do qual eles são i derivados. Análogos incluem aqueles que retêm pelo menos alguma da : atividade biológica do polipeptídeo do tipo selvagem, por exemplo, atividade de coagulação sanguínea.

' 10 As variantes de polipeptídeo consideradas incluem, sem limitação, polipeptídeos quimicamente modificadas por tais técnicas como ubiquitinação, gilcosilação, que incluí polissialação, conjugação aos agentes terapêuticos ou de diagnóstico, rotulação, ligação de polímero covalente tal como peguilação (derivação com polietileno glicol), introdução de ligações 15º não hidrolisáveis, e inserção ou substituição pela síntese química de aminoácidos tais como ornitina, que normalmente não ocorrem em proteínas humanas. As variantes retêm as mesmas ou essencialmente as mesmas propriedades de ligação de moléculas não modificadas da invenção. Tal modificação química pode incluir a ligação direta ou indireta (por exemplo, via um ligador) de um agente para o polipeptídeo de VWF. No caso de ligação indireta, é considerado que o ligador pode ser hidrolisável ou não hidrolisável.

Preparar polipeptídeos análogos peguilados em um aspecto compreenderá as etapas de (a) reagir o polipeptídeo com polietileno glicol (tal —comoum éster ou aldeído reativos derivados de PEG) sob condições por meio das quais o polipeptídeo da construção de ligação torna-se ligado a um ou mais grupos PEG, e (b) obter o(s) produto(s) de reação. No geral, as condições de reação ótimas para as reações de acilação são determinadas com base nos parâmetros conhecidos e os resultados desejados. Por exemplo,

quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a porcentagem de produto poli- peguilado. Em algumas formas de realização, a construção de ligação tem uma única porção de PEG no terminal N. Polietileno glicol (PEG) pode ser ligado ao fator de coagulação sanguínea, por exemplo, para fornecer uma ' 5 meia-vida mais longa in vivo. O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e é linear ou ramificado. O peso molecular médio das ' faixas de PEG de cerca de 2 quiloDalton (“kD”) a cerca de 100 kDa, de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, ou de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Em certos aspectos, os grupos PEG são ligados ao fator de coagulação sanguínea : 10 via acilação ou alquilação redutiva através de um grupo reativo natural ou engendrado na porção PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol, ou éster) a um grupo reativo no fator de coagulação sanguínea (por exemplo, um grupo aldeído, amino, ou éster) ou por qualquer outra técnica conhecida no ramo.

Os métodos para preparar polipeptídeo polisialilado são descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos 20060160948, Fernandes et Gregoriadis; Biochim. Biophys. Acta 1341: 26-34, 1997, e Saenko et al., Haemophilia 12: 42-51, 2006. Em resumo, uma solução de ácido colomínico (CA) contendo 0,1 M de NalO, é agitada no escuro na temperatura ambiente para oxidar o CA. A solução de CA ativada é dialisada contra, por exemplo, 0,05 M de tampão de fosfato de sódio, pH 7,2 no escuro e esta solução foi adicionada a uma solução de rVWF e incubadas por 18 h na temperatura ambiente no escuro sob agitação suave. Os reagentes livres são opcionalmente separados do conjugado de rVWrF-ácido polissiálico, por exemplo, pela ultrafiltração/diafiltração. A conjugação de rVWF com ácido polissiálico é obtida usando glutaraldeído como reagente de reticulação (Migneault et al., Biotechniques 37: 790-796, 2004). É ainda considerado em um outro aspecto que um polipeptídeo da invenção é uma proteína de fusão com um segundo agente que é um polipeptídeo. Em uma forma de realização, o segundo agente que é um polipeptídeo, sem limitação, é uma enzima, um fator de crescimento, um anticorpo, uma citocina, uma quimiocina, um receptor de superfície de célula, o domínio extracelular de um receptor de superfície de célula, uma molécula , 5 — de adesão de célula, ou fragmento ou domínio ativo de uma proteína descrita acima. Em uma forma de realização relacionada, o segundo agente é um fator de coagulação sanguínea tal como o Fator VIII, Fator VII, Fator IX. À proteína de fusão considerada é fabricada pelas técnicas químicas ou recombinantes bem conhecidas na técnica.

' 10 Também é considerado em um outro aspecto que OS polipeptídeos prepro-VWF e pro-VWF fornecerão um benefício terapêutico nas formulações da presente invenção. Por exemplo, a Patente US No.

7.005.502 descreve uma preparação farmacêutica que compreende quantidades substanciais de pro-VWF que induz a geração de trombina in

15. vitro. Além de recombinantes, fragmentos, variantes, ou outros análogos biologicamente ativos da VWF madura que ocorre naturalmente, a presente invenção considera o uso de fragmentos, variantes, ou análogos recombinantes “biologicamente ativos dos polipeptídeos prepro-VWF (apresentado na SEQ ID NO: 2) ou pro-VWF (resíduos de aminoácido 23 a 764daSEQID NO: 2) nas formulações aqui descritas.

Os polinucleotídeos que codificam fragmentos, variantes e análogos podem ser facilmente gerados por um trabalhador de habilidade para codificar fragmentos, variantes, ou análogos biologicamente ativos da molécula que ocorre naturalmente que possuí a mesma atividade biológica ou similar à molécula que ocorre naturalmente. Em vários aspectos, estes polinucleotídeos são preparados usando técnicas de PCR, digestão/ligação da molécula que codifica o DNA, e outros. Assim, uma pessoa de habilidade na técnica será capaz de gerar mudanças de base únicas no filamento de DNA para resultar em um códon alterado e uma mutação de sentido errado, usando qualquer método conhecido na técnica, que inclui, mas não limitado à mutagênese específica para local.

Como aqui usada, a frase “condições de hibridização moderadamente severas” significa, por exemplo, hibridização a 42ºC em 50 % de formamida e lavagem a 60ºC em 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS. : 5 —É entendido por aqueles de habilidade na técnica que a variação nestas condições ocorre com base no comprimento e teor de base de nucleotídeo GC ' das sequências a serem hibridizadas.

As fórmulas padrão na técnica são apropriadas para determinar as condições de hibridização exatas.

Ver ' Sambrook et al., 9.47-9.51 em Molecular Cloning, Cold Spring Harbor . 10 Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989). Liofilização Em um aspecto, as formulações que compreendem um polipeptídeo de VWF da invenção são liofilizados antes da administração.

À liofilização é realizada usando técnicas comuns no ramo e deve ser otimizada —paraa composição que é desenvolvida [Tang er al., Pharm Res. 21: 191-200, (2004) e Chang et al., Pharm Res. 13: 243-9 (1996)]. Um ciclo de liofilização é, em um aspecto, composto de três etapas: congelamento, secagem primária, e secagem secundária [A.

P, Mackenzie, Phil Trans R Soc Londres, Ser B, Biol 278: 167 (1977)]. Na etapa — de congelamento, a solução é esfriada para iniciar a formação de gelo.

Além disso, esta etapa induz a cristalização do agente de volume.

O gelo sublima no estágio de secagem primário, que é conduzido pela redução da pressão da câmara abaixo da pressão de vapor do gelo, usando um vácuo e introduzindo calor para promover a sublimação.

Finalmente, a água absorvida ou ligada é removida no estágio de secagem secundária sob pressão de câmara reduzida e em uma temperatura de prateleira elevada.

O processo produz um material conhecido como uma torta liofilizada.

Depois disso a torta pode ser reconstituída com água estéril ou diluente adequado para injeção.

O ciclo de liofilização não apenas determina o estado físico final dos excipientes mas também afeta outros parâmetros tais como tempo de reconstituição, aparência, estabilidade e teor de umidade final.

A estrutura da composição no estado congelado processa-se através de várias transições (por exemplo, transições vítreas, umectações, e cristalizações) que ocorrem nas , 5 — temperaturas específicas e a estrutura pode ser usada para entender e otimizar o processo de liofilização.

A temperatura de transição vítrea (Tg e/ou Tg”) | pode fornecer informação a cerca do estado físico de um soluto e pode ser . determinada pela calorimetria de varredura diferencial (DSC). A Tg e Tg são um parâmetro importante que deve ser levado em conta quando da designação ' 10 do ciclo de liofilização.

Por exemplo, a Tg é importante para a secagem primária.

Além disso, no estado seco, a temperatura de transição vítrea fornece informação sobre a temperatura de armazenagem do produto final.

Formulações e excipientes no geral Os excipientes são aditivos que comunicam ou realçam a estabilidade e liberação de um produto medicamentoso (por exemplo, proteína). Independente da razão para a sua inclusão, excipientes são um componente integral de uma formulação e portanto necessita ser seguro e bem tolerado pelos pacientes.

Para os medicamentos de proteína, a escolha de excipientes é particularmente importante porque a mesma pode afetar tanto a eficácia quanto a imunogenicidade do medicamento.

Consequentemente, as formulações de proteína precisam ser desenvolvidas com seleção apropriada de excipientes que proporcionam estabilidade, segurança, e comerciabilidade adequadas.

Uma formulação liofilizada é, em um aspecto, pelo menos — compreendida de um ou mais de um tampão, um agente de volume, e um estabilizante.

Neste aspecto, a utilidade de um tensoativo é avaliada e selecionada em casos onde a agregação durante a etapa de liofilização ou durante a reconstituição torna-se um problema.

Um agente de tamponação apropriado é incluído para manter a formulação dentro de zonas estáveis de pH durante a liofilização.

Uma comparação dos componentes de excipiente considerados para as formulações de proteína líquidas e liofilizadas é fornecida na Tabela A.

Tabela A: Componentes de excipiente de formulações de proteína liofilizadas ' o Manter o pH da formulação Tampão durante a liofilização e na . reconstituição o Os estabilizantes incluem crio e lioprotetores o Os exemplos incluem Polióis, « açúcares e polímeros Agente de tonicidade/ estabilizante o otimas dos astresses de ” . congelamento o Os lioprotetores estabilizam as proteínas no estado secado por congelamento o Usado para realçar a elegância do produto e para prevenir o escape repentino de ar ou vapor Agente de volume o Fornece força estrutural para a torta liofilizada o Os exemplos incluem manitol e glicina O Utilizado se a agregação durante o processo de liofilização for um problema Tensoativo o Pode servir para reduzir os tempos de reconstituição o Os exemplos incluem polissorbato 20 e 80 o Usualmente não utilizado, as ão reações moleculares na torta Ant-oidante liofilizada são enormemente retardadas o Podem ser incluídos se um fon metálico específico é incluído apenas) como um co-fator ou onde o metal é Íons metálicos/agente quelante requerido para a atividade da protease o Os agentes quelantes no geral não são necessários nas formulações liofilizadas O Apenas para as formulações de dose múltipla o Fornece proteção contra o Conservante crescimento microbiano na , formulação o É usualmente incluído no diluente de reconstituição (por exemplo, bWFI

O desafio principal no desenvolvimento de formulações para as proteínas é estabilizar o produto contra os estresses de fabricação, transporte e armazenagem. O papel dos excipientes de formulação é fornecer estabilização contra estes estresses. Os excipientes também devem ser ' 5 utilizados para reduzir a viscosidade de formulações de proteína de alta concentração de modo a permitir a sua liberação e realçar a conveniência do i paciente. No geral, os excipientes podem ser classificados com base nos . mecanismos pelos quais eles estabilizam as proteínas contra vários estresses químicos e físicos. Alguns excipientes são usados para aliviar os efeitos de um estresse específico ou para regular uma suscetibilidade particular de uma proteína específica. Outros excipientes têm efeitos mais gerais sobre as estabilidades físicas e covalentes de proteínas. Os excipientes aqui descritos são organizados pelo seu tipo químico ou seu papel funcional nas formulações. As descrições resumidas dos modos de estabilização são fornecidas quando do exame de cada tipo de excipiente.

Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão que a quantidade ou faixa de excipiente pode ser incluída em qualquer formulação particular para se obter uma formulação biofarmacêutica da invenção que promove a retenção na estabilidade do produto biofarmacêutico (por exemplo, uma proteína). Por exemplo, a quantidade e tipo de um sal a ser incluído em uma formulação biofarmacêutica da invenção é selecionada com base na osmolalidade desejada (isto é, isotônica, hipotônica ou hipertônica) da solução final assim como nas quantidades e osmolalidade de outros componentes a serem — incluídosna formulação.

Por via de exemplo, a inclusão de cerca de 5 % de sorbitol pode alcançar isotonicidade enquanto que cerca de 9 % de um excipiente de sacarose é necessário para se alcançar isotonicidade. A seleção da quantidade ou faixa de concentrações de um ou mais excipientes que podem ser incluídos dentro de uma formulação biofarmacêutica da invenção foi exemplificada acima pela referência aos sais, polióis e açúcares.

Entretanto, aqueles habilitados na técnica entenderão que as considerações aqui descritas e ainda exemplificadas por referência aos excipientes específicos são igualmente : 5 — aplicáveis a todos os tipos e combinações de excipientes que incluem, por exemplo, sais, aminoácidos, outros agentes de tonicidade, tensoativos, estabilizantes, agentes de volume, crioprotetores, lioprotetores, antioxidantes, ,: íons metálicos, agentes quelantes e/ou conservantes.

Além disso, onde um excipiente particular é relatado em ' 10 concentração molar, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que o percentual equivalente (%) p/v (por exemplo, (gramas de substância em uma amostra em solução/ml de solução) X 100 %) da solução também é considerado.

Naturalmente, uma pessoa tendo habilidade comum na técnica — reconheceria que as concentrações dos excipientes aqui descritos compartilham uma interdependência dentro de uma formulação particular.

Por via de exemplo, a concentração de um agente de volume pode ser diminuída onde, por exemplo, existe uma alta concentração de proteína ou onde, por exemplo, existe uma alta concentração de agente de estabilização.

Além disso, uma pessoa tendo habilidade — comum na técnica reconheceria que, de modo a manter a isotonicidade de uma formulação particular em que não existe agente de volume, a concentração de um agente de estabilização seria ajustada consequentemente (isto é, uma quantidade de “tonificação” de estabilizante seria usada). Os excipientes comuns são conhecidos na técnica e podem ser encontrados em Powell et al., Compendium of — Excipients fir Parenteral Formulations (1998), PDA J.

Pharm.

Sci.

Technology, 52: 238-311. Tampões e agentes de tamponação A estabilidade de uma formulação de proteína farmacologicamente ativa é usualmente observada ser máxima em uma faixa de pH estreita. Esta faixa de pH de estabilidade ótima necessita ser identificada no início durante os estudos de pré-formulação. Vários métodos, tais como estudos de estabilidade acelerada e estudos de triagem calorimétrica, são úteis neste esforço (Remmele R.. L. Jr., et al., Biochemistry, . 5 38(16):5241-7(1999)). Uma vez que uma formulação é finalizada, a proteína deve ser fabricada e mantida por toda a sua vida de prateleira. Consequentemente, os agentes de tamponação são quase sempre utilizados . para controlar o pH na formulação.

A capacidade de tampão das espécies de tamponação é máxima ' 10 emum pH igual ao pKa e diminui conforme o pH aumenta ou diminui fora deste valor. Noventa por cento da capacidade de tamponação existe dentro de uma unidade de pH do seu pKa. A capacidade de tamponação também aumenta proporcionalmente com o aumento da concentração de tampão. Vários fatores precisam ser considerados quando da escolha de um tampão. Primeiramente e antes de tudo, a espécie de tampão e a sua concentração precisam ser definidos com base no seu pKa e o pH da formulação desejado. Igualmente importante é garantir que o tampão seja compatível com a proteína e outros excipientes de formulação, e não catalisem nenhuma reação de degradação. Um terceiro aspecto importante a ser considerado é a sensação de ardência e irritação que o tampão pode induzir na administração. Por exemplo, o citrato é conhecido causar ardência na injeção (Laursen T, et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol., 98(2): 218-21 (2006)). O potencial para ardência e irritação é maior para os medicamentos que são administrados por intermédio das vias subcutânea (SC) ou intramuscular (IM), onde a solução medicamentosa permanece no local por um período relativamente mais longo de tempo do que quando administrada pela via IV onde a formulação torna-se diluída rapidamente no sangue na administração. Para as formulações que são administradas pela infusão IV direta, a quantidade total de tampão (e qualquer outro componente da formulação) necessita ser monitorada. Deve-se ser particularmente cuidadoso a cerca dos íons potássio administrados na forma do tampão de fosfato de potássio, que podem induzir efeitos cardiovasculares em um paciente (Hollander-Rodriguez JC, et al., Am. Fam. Physician., 73(2): 283-90 (2006)). . 5 Os tampões para as formulações liofilizadas necessitam de : consideração adicional. Alguns tampões como fosfato de sódio pode cristalizar da fase amorfa da proteína durante o congelamento resultando em : mudanças no pH. Outros tampões comuns tais como acetato e imidazol podem sublimar ou evaporar durante o processo de liofilização, mudando deste modo o pH da formulação durante a liofilização ou depois da reconstituição.

O sistema de tampão presente nas composições é selecionado para ser fisiologicamente compatível e para manter um pH desejado da formulação farmacêutica. Em uma forma de realização, o pH da solução está entreopH2,0eopH 12,0. Por exemplo, o pH da solução pode ser 2,0, 2,3, 2,5, 2,7, 3,0, 3,3, 3,5, 3,7, 4,0, 4,3, 4,5, 4,7, 5,0, 5,3, 5,5, 5,7, 6,0, 6,3, 6,5, 6,7, 7,0, 7,3, 71,5, 7,7, 8,0, 8,3, 8,5, 8,7, 9,0, 9,3, 9,5, 9,7, 10,0, 10,3, 10,5, 10,7, 11,0, 11,3, 11,5, 11,7, ou 12,0. O composto de tamponação de pH pode estar presente em — qualquer quantidade adequada para manter o pH da formulação em um nível pré-determinado. Em uma forma de realização, a concentração de tampão de pH está entre 0,1 mM e 500 mM (1 M). Por exemplo, é considerado que o agente de tamponação de pH é de pelo menos 0,1, 0,5, 0,7, 0.8 0.9, 1,0, 1.2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25,30, —40,50,60,70,80,90,100,200, ou 500 mM.

Os agentes de tamponação de pH exemplares usados para tamponar a formulação como aqui apresentada incluem, mas não são limitadas aos ácidos orgânicos, glicina, histidina, glutamato, succinato, fosfato, acetato, citrato, Tris, HEPES, e aminoácidos ou misturas de aminoácidos, que inclui, mas não limitado a aspartato, histidina, e glicina. Em uma forma de realização da presente invenção, o agente de tamponação é citrato. Estabilizantes e agentes de volume * 5 Em um aspecto das presentes formulações farmacêuticas, um . estabilizante (ou uma combinação de estabilizantes) é adicionado para prevenir ou reduzir a agregação e degradação químicas induzidas pela : armazenagem. Uma solução turva ou túrbida na reconstituição indica que a proteína precipitou ou pelo menos agregou. O termo “estabilizante” significa um excipiente capaz de prevenir a agregação ou degradação física, que inclui a degradação química (por exemplo, autólise, desamidação, oxidação, etc.) em um estado aquoso. Os estabilizantes considerados incluem, mas não são limitados a, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose, manitol, —sorbitol, glicina, arginina HCl, compostos de poli-hidróxi, que inclui polissacarídeos tais como dextrano, amido, hidroxietil amido, ciclodextrinas, N-metil pirrolideno, celulose e ácido hialurônico, cloreto de sódio, [Carpenter et al., Develop. Biol. Standard 74: 225, (1991)]. Nas presentes formulações, o estabilizante é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0.8

0.9,1,0,1.2,1,5, 1,7, 2,3,4,5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ou 1000 mM. Em uma forma de realização da presente invenção, manitol e trealose são usados como agentes estabilizantes. Se desejado, as formulações também incluem quantidades — apropriadas de agentes que regulam o volume e a osmolaridade. Agentes de volume incluem, por exemplo e sem limitação, manitol, glicina, sacarose, polímeros tais como dextrano, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulose, lactose, sorbitol, trealose, ou xilitol. Em uma forma de realização, o agente de volume é manitol. O agente de volume é incorporado em uma concentração de cerca de 0,1, 0,5, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,5, 1,7, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 700, 900, ou 1000 mM.

Tensoativos . 5 As proteínas têm uma alta propensão para interagir com superfícies que as tornam suscetíveis à absorção e desnaturação nas interfaces ] de ar-líquido, frasco-líquido, e líquido-líquido (óleo de silicona). Este caminho de degradação foi observado ser inversamente dependente da i concentração de proteína e resulta na formação de agregados de proteína : 10 solúveis e insolúveis ou a perda de proteína da solução via absorção pelas superfícies.

Além da absorção pela superfície do recipiente, a degradação induzida pela superfície é exacerbada com a agitação física, como seria experienciado durante o transporte e manuseio do produto.

Os tensoativos são habitualmente usados nas formulações de proteína para prevenir a degradação induzida pela superfície.

Os tensoativos são moléculas anfipáticas com a capacidade das proteínas fora da competição quanto as posições interfaciais.

As porções hidrofóbicas das moléculas do tensoativo ocupam as posições interfaciais (por exemplo, ar/líquido), enquanto que as porções hidrofílicas das moléculas permanecem orientadas parao solvente volumoso.

Nas concentrações suficientes (tipicamente em torno da concentração micelar crítica do detergente), uma camada de superfície de moléculas de tensoativo serve para impedir as moléculas de proteína de absorver na interface.

Deste modo, a degradação induzida pela superfície é minimizada.

Os tensoativos aqui considerados incluem, sem limitação, ésteres de ácido graxo de polietoxilatos de sorbitano, isto é polissorbato 20 e polissorbato 80. Os dois diferem apenas no comprimento da cadeia alifática que comunica caráter hidrofóbico às moléculas, C-12 e C-18, respectivamente.

Consequentemente, o polissorbato-80 é mais ativo na superfície e tem uma concentração micelar crítica mais baixa do que o polissorbato-20.

Os detergentes também podem afetar a estabilidade conformacional termodinâmica de proteínas. Mais uma vez aqui, os efeitos de um dado excipiente detergente serão específicos da proteína. Por exemplo, . 5 —polissorbatos mostraram reduzir a estabilidade de algumas proteinas e : aumentar a estabilidade de outras. A desestabilização pelos detergentes de proteínas pode ser racionalizada em termos das caudas hidrofóbicas das . moléculas de detergente que podem engatar na ligação específica com estados de proteína parcial ou totalmente desdobradas. Estes tipos de interações ' 10 podem causar uma mudança no equilíbrio conformacional na direção dos estados de proteína mais expandidos (isto é que aumentam a exposição de porções hidrofóbicas da molécula de proteína em complemento à ligação de polissorbato). Alternativamente, se o estado nativo da proteína exibe algumas superfícies hidrofóbicas, ligação de detergente ao estado nativo pode estabilizar esta conformação.

Um outro aspecto dos polissorbatos é que eles são inerentemente suscetíveis à degradação oxidativa. Frequentemente, como matérias primas, eles contêm quantidades suficientes de peróxidos para causar a oxidação de cadeias laterais de resíduo de proteína, especialmente metionina. O potencial para o dano oxidativo que surge da adição de estabilizante enfatiza o ponto que as concentrações eficazes mais baixas de excipientes devem ser usadas nas formulações. Para os tensoativos, a concentração eficaz para uma dada proteína dependerá do mecanismo de estabilização.

Tensoativos também são adicionados em quantidades apropriadas para prevenir o fenômeno de agregação relacionada com a superfície durante o congelamento e secagem [Chang, B, J. Pharm. Sci. 85: 1325, (1996)]. Assim, os tensoativos exemplares incluem, sem limitação, tensoativos aniônicos, catiônicos, não iônicos, zuiteriônicos, e anfotéricos que incluem tensoativos derivados de aminoácidos que ocorrem naturalmente. Tensoativos aniônicos incluem, mas não são limitados a, lauril sulfato de sódio, dioctil sulfossuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio, ácido chenodesoxicólico, sal sódico de N-lauroilsarcosina, dodecil sulfato de lítio, . 5 sal sódico do ácido l-octanossulfônico, colato de sódio hidratado, : desoxicolato de sódio, e sal sódico do ácido glicodesoxicólico. Os tensoativos catiônicos incluem, mas não são limitados ao, cloreto de benzalcônio ou . cloreto de benzetônio, cloreto de cetilpiridínio monoidratado, e brometo de hexadeciltrimetilamônio. Os tensoativos zuiteriônicos incluem, mas não são ' 10 limitadas a, CHAPS, CHAPSO, SB3-10, e SB3- 12. Os tensoativos não iônicos incluem, mas não são limitados a, digitonina, Triton X-100, Triton X- 114, TWEEN-20, e TWEEN-80. Os tensoativos também incluem, mas não são limitados a lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, polioxietileno óleo de mamona hidrogenado 10, 40, 50 e 60, monoestearato de glicerol,

15. —polissorbato 40, 60, 65 e 80, lecitina de soja e outros fosfolipídeos tais como dioleil fosfatidil colina (DOPO), dimiristoilfosfatidil glicerol (DMPG), dimiristoilfosfatidil colina (DMPC), e (dioleil fosfatidil glicerol) DOPG; éster do ácido graxo de sacarose, metil celulose e carboximetil celulose. As composições que compreendem estes tensoativos, individualmente ou como uma mistura em razões diferentes, são portanto ainda fornecidas. Em uma forma de realização da presente invenção, o tensoativo é TWEEN-80. Nas presentes formulações, o tensoativo é incorporado em uma concentração de cerca de 0,01 a cerca de 0,5 g/L. Nas formulações fornecidas, a concentração de tensoativo é de 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8, 0,9 ou 1,0 g/L. Sais Os sais são frequentemente adicionados para aumentar a concentração iônica da formulação, que pode ser importante para a solubilidade da proteína, estabilidade física, e isotonicidade. Os sais podem afetar a estabilidade física de proteínas em uma variedade de modos.

Os íons podem estabilizar o estado nativo de proteínas pela ligação aos resíduos carregados na superfície da proteína.

Alternativamente, os sais podem estabilizar o estado desnaturado pela ligação aos grupos de peptídeo junto . 5 coma cadeia principal da proteína -CONH-). Os sais também podem . estabilizar a conformação nativa da proteína pela proteção das interações eletrostáticas repulsivas entre resíduos dentro de uma molécula de proteína. . Os sais nas formulações de proteína também podem proteger das interações eletrostáticas atrativas entre as moléculas de proteína que podem levar à agregação e insolubilidade da proteína.

Nas formulações fornecidas, a concentração salina está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, e 500 mM.

Outros aminoácidos componentes de excipiente comum Aminoácidos Os aminoácidos têm encontrado uso versátil nas formulações de proteína como tampões, agentes de volume, estabilizantes e antioxidantes.

Assim, em um aspecto a histidina e o ácido glutâmico são utilizados para tamponar as formulações de proteína na faixa de pH de 5,5 a 6,5 e 4,0 a 5,5 respectivamente.

O grupo imidazol da histidina tem um pKa = 6,0 e o grupo —carboxilada cadeia lateral do ácido glutâmico tem um pKa de 4,3 o que torna estes aminoácidos adequados para tamponar em suas respectivas faixas de pH.

O ácido glutâmico é particularmente útil em tais casos.

A histidina é habitualmente encontrada nas formulações de proteína comercializadas, e este aminoácido fornece uma alternativa para o citrato, um tampão conhecido —arderna injeção.

De modo interessante, a histidina também foi relatada ter um efeito estabilizante, com respeito à agregação quando do uso em concentrações altas nas apresentações tanto líquidas quanto liofilizadas (Chen B, et al., Pharm Res., 20(12): 1952-60 (2003)). A histidina também foi observada por outros por reduzir a viscosidade de uma formulação de concentração de proteína alta.

Entretanto, no mesmo estudo, os autores observaram agregação e descoloração aumentadas em formulações contendo histidina durante estudos de congelamento- descongelamento do anticorpo em recipientes de aço inoxidável.

Uma outra nota de cautela com a histidina é que ' 5 —amesma sofre foto-oxidação na presença de íons metálicos (Tomita M, et al., . Biochemistry, 8(12): 5149-60 (1969)). O uso de metionina como um antioxidante nas formulações parece promissor; foi observado ser eficaz : contra vários estresses oxidativos (Lam XM, et al., J Pharm Sci., 86(11): 1250-5 (1997)). Em várias aspectos, formulações são fornecidas que incluem um ou mais dos aminoácidos glicina, prolina, serina, arginina e alanina foram mostradas estabilizar proteínas pelo mecanismo de exclusão preferencial.

À glicina também é um agente de volume habitualmente usado em formulações liofilizadas.

A arginina foi mostrada ser um agente eficaz na inibição da agregação e foi usada tanto em formulações líquidas quanto liofilizadas.

Nas formulações fornecidas, a concentração de aminoácido está entre 0,1, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 120, 150, 200, 300, e 500 mM.

Em uma forma de realização da presente invenção, o aminoácido é glicina.

Antioxidantes A oxidação de resíduos de proteína surge de várias fontes diferentes.

Além da adição de antioxidantes específicos, a prevenção de dano oxidativo da proteína envolve o controle cuidadoso de vários fatores por todo o processo de fabricação e armazenagem do produto tais como oxigênio atmosférico, temperatura, exposição à luz, e contaminação química.

À invenção portanto considera o uso dos antioxidantes farmacêuticos que incluem, sem limitação, agentes redutores, descontaminantes de oxigênio/radical livre, ou agentes quelantes.

Os antioxidantes nas formulações de proteína terapêutica são, em um aspecto, solúveis em água e permanecem ativos por toda a vida de prateleira do produto.

Os agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre funcionam pela remoção das espécies de oxigênio ativo em solução.

Os agentes quelantes tais como EDTA são eficazes pela ligação de contaminantes metálicos traço que promovem a formação de radical livre.

Por exemplo, o EDTA foi utilizado na formulação . 5 — líquida de fator de crescimento de fibroblasto ácido para inibir a oxidação . catalisada por íon metálico de resíduos de cisteína.

Além da eficácia de vários excipientes para prevenir a . oxidação da proteína, o potencial para os próprios antioxidantes induzirem outras mudanças covalentes ou físicas à proteína é de interesse.

Por exemplo, os agentes redutores podem causar o rompimento de ligações de dissulfeto intramoleculares, que pode levar ao embaralhamento de dissulfeto.

Na presença de íons de metal de transição, o ácido ascórbico e o EDTA mostraram promover a oxidação da metionina em várias proteínas e peptídeos (Akers MJ, e Defelippis MR.

Peptides and Proteins as Parenteral Solutions. 15º Em: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins.

Sven Frokjaer, Lars Hovgaard, editores.

Pharmaceutical Science.

Taylor e Francis, UK (1999)); Fransson J.

R., J.

Pharm.

Sci. 86(9): 4046-1050 (1997); Yin ], ef al., Pharm Res., 21(12): 2377-83 (2004)). O tiossulfato de sódio foi relatado reduzir os níveis de oxidação da metionina induzidos por luz e temperatura —emrhuMab HER2; entretanto, a formação de um aduto de tiossulfato-proteína também foi relatada neste estudo (Lam XM, Yang JY, et al., J Pharm Sci. 86(11): 1250-5 (1997)). A seleção de um antioxidante apropriado é feita de acordo com os estresses e sensibilidades específicos da proteína.

Os antioxidantes considerados em certos aspectos incluem, sem limitação, — agentes redutores e descontaminantes de oxigênio/radical livre, EDTA, e tiossulfato de sódio.

Íons Metálicos No geral, os íons de metal de transição são indesejados nas formulações de proteína porque eles podem catalisar reações de degradação física e química em proteínas.

Entretanto, os íons metálicos específicos são incluídos nas formulações quando eles são co-fatores para as proteínas e em formulações de suspensão de proteínas onde eles formam complexos de coordenação (por exemplo, suspensão de zinco de insulina). Recentemente, o -« 5 use de íons de magnésio (10 a 120 mM) foi proposto para inibir a isomerização do ácido aspártico para o ácido isoaspártico (WO 2004039337). i Dois exemplos onde os íons metálicos conferem estabilidade : ou atividade aumentada em proteínas são desoxirribonuclease humana (rhDNase, PulmozymeO), e Fator VIII.

No caso de rhDNase, os íons Ca” (até ' 10 100mM) aumentaram a estabilidade da enzima através de um sítio de ligação específico (Chen B, et al., J Pharm Sci., 88(4): 477-82 (1999)). De fato, a remoção de íons cálcio da solução com EGTA causou um aumento na desamidação e agregação.

Entretanto, este efeito foi observado apenas com íons Ca?; outros cátions bivalentes Mg"”?, Mn"? e Zn”? foram observados desestabilizar a rhDNase.

Efeitos similares foram observados no Fator VIII.

Os íons Ca”? e Sr”? estabilizaram a proteína enquanto que outros como Mg”, Mn”? e Znº, Cu”? e Fe”? desestabilizaram a enzima (Fatouros, A., et al., Int.

J.

Pharm., 155, 121-131 (1997). Em um estudo separado com Fator VIII, um aumento significante na taxa de agregação foi observado na presença de íons AI? (Derrick TS, et al., J.

Pharm.

Sci., 93(10): 2549-57 (2004)). Os autores mencionam que outros excipientes como sais de tampão são frequentemente contaminados com íons Al”? e ilustram a necessidade de usar excipientes de qualidade apropriada em produtos formulados.

Conservantes Os conservantes são necessários quando do desenvolvimento de formulações parenterais de uso múltiplo que envolve mais do que uma extração do mesmo recipiente.

A sua função primária é inibir o crescimento microbiano e garantir a esterilidade do produto por toda a vida de prateleira ou prazo de uso do produto medicamentoso.

Os conservantes habitualmente usados incluem, sem limitação, álcool benzílico, fenol e m-cresol. Embora os conservantes tenham uma longa história de uso, o desenvolvimento de formulações de proteína que incluem conservantes pode ser desafiador. Os conservantes quase sempre têm um efeito desestabilizador (agregação) sobre ' 5 —asproteínas, e isto tem se tornado um fator principal na limitação do seu uso . em formulações de proteína de dose múltipla (Roy S, et al., J Pharm Sci., 94(2): 382-96 (2005)). . Até agora, a maioria dos medicamentos de proteína foram formulados apenas para o uso individual. Entretanto, quando formulações de dose múltipla são possíveis, elas têm a vantagem adicionada de possibilitar a conveniência do paciente, e comerciabilidade aumentada. Um bom exemplo é aquele do hormônio do crescimento humano (hGH) onde o desenvolvimento de formulações preservadas tem levado à comercialização de apresentações de caneta de injeção de dose múltipla mais conveniente,. Pelo menos quatro detais dispositivos de caneta contendo formulações preservadas de hGH estão correntemente disponíveis no mercado. Norditropin& (líquido, Novo Nordisk), Nutropin AQB (líquido, Genentech) & Genotropin (liofilizada — cartucho de câmara dupla, Pharmacia & Upjohn) contêm fenol enquanto Somatrope€& (Eli Lilly) é formulada com m-cresol.

Diversos aspectos necessitam ser considerados durante o desenvolvimento da formulação de formas de dosagem preservadas. À concentração de conservante eficaz no produto medicamentoso deve ser otimizada. Isto requer testar um dado conservante na forma de dosagem com faixas de concentração que conferem a eficácia anti-microbiana sem — comprometer a estabilidade da proteína. Por exemplo, três conservantes foram triados com êxito no desenvolvimento de uma formulação líquida para o receptor de interleucina-l (Tipo D, usando a calorimetria de varredura diferencial (DSC). Os conservantes foram classificados com base no seu impacto sobre a estabilidade nas concentrações habitualmente usadas em à2 produtos comercializados (Remmele RL Jr., et al., Pharm Res., 15(2): 200-8 (1998)). O desenvolvimento de formulações líquidas contendo conservantes são mais desafiadoras do que as formulações liofilizadas.

Os ' 5 — produtos secados por congelamento podem ser liofilizados sem o conservante . e reconstituído com um diluente contendo o conservante no memento de uso.

Isto encurta o tempo para que um conservante esteja em contato com a . proteína minimizando significantemente os riscos de estabilidade associados.

Com as formulações líquidas, a eficácia e a estabilidade do conservante têm que ser mantida durante a vida de prateleira inteira do produto (— 18 a 24 meses). Um ponto importante a mencionar é que a eficácia do conservante tem que ser demonstrada na formulação final contendo o medicamento ativo e todos os componentes excipientes.

Alguns conservantes podem causar reações no local da injeção, que é um outro fator que necessita consideração quando da escolha de um conservante.

Em testes clínicos que focalizam na avaliação dos conservantes e tampões em Norditropina, a percepção da dor foi observada ser mais baixa nas formulações contendo fenol e álcool benzílico quando comparada com uma formulação contendo m-cresol (Kappelgaard A.

M., Horm Res. 62 Supl 3: 98-103 (2004)). De maneira interessante, entre os conservantes habitualmente usados, o álcool benzílico possui propriedades anestésicas (Minogue SC, e Sun DA., Anesth Analg., 100(3): 683-6 (2005)). Em vários aspectos o uso de conservantes fornece um benefício que supera quaisquer efeitos colaterais. — Métodos de Preparação A presente invenção considera ainda métodos para a preparação de formulações farmacêuticas.

Os presentes métodos compreendem ainda uma ou mais das seguintes etapas: adicionar um agente de estabilização como aqui descrito à dita mistura antes da liofilização, adicionar pelo menos um agente selecionado de um agente de volume, um agente que regula a osmolaridade, e um tensoativo, cada um dos quais como aqui descrito, à dita mistura antes da liofilização. . 5 A prática da reconstituição padrão para o material liofilizado é : adicionar de volta um volume de água pura ou água estéril para injeção (WFD) (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), embora . soluções diluídas de agentes antibacterianos sejam algumas vezes usadas na produção de produtos farmacêuticos para a administração parenteral [Chen, ! 10 Drug Development and Industrial Pharmacy, 18: 1311-1354 (1992)]. Consequentemente, os métodos são fornecidos para a preparação de composições de rVWF reconstituídas que compreendem a etapa de adicionar um diluente a uma composição de rV WF liofilizada da invenção. O material liofilizado pode ser reconstituíido como uma

15. solução aquosa. Uma variedade de carregadores aquosos, por exemplo, água estéril para injeção, água com conservantes para uso de dose múltipla, ou água com quantidades apropriadas de tensoativos (por exemplo, uma suspensão aquosa que contém o composto ativo em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas). Em vários aspectos, tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo e sem limitação, carboximetilcelulose — sódica, “metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes de dispersão ou umectação são um fosfatíideo que ocorre naturalmente, por exemplo e sem limitação, lecitina, ou produtos de — condensação de um óxido de alquileno com ácido graxos, por exemplo e sem limitação, estearato de polioxietileno, ou produtos de condensação de óxido de etileno com alcoóis alifáticos de cadeia longa, por exemplo e sem limitação, heptadecaetileno-oxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como mono-oleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo e sem limitação, mono-oleato de polietileno sorbitano. Em várias aspectos, as suspensões aquosas também contêm um ou * 5 —mais conservantes, por exemplo e sem limitação, p-hidroxibenzoato de etila, : ou n-propila. Administração . Para administrar composições aos seres humanos ou animais de teste, em um aspecto, as composições compreendem um ou mais ' 10 carregadores farmaceuticamente aceitáveis. As frases “farmaceuticamente” ou “farmacologicamente” aceitáveis referem-se às entidades moleculares e composições que são estáveis, inibem a degradação da proteína tal como agregação e produtos de clivagem, e além disso, não produzem reações alérgicas, ou outras reações adversas quando administradas usando vias bem conhecidas na técnica, como descrito abaixo. “Carregadores Farmaceuticamente aceitáveis” incluem qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de absorção demorada clinicamente úteis e outros, que incluem aqueles agentes divulgados acima.

As formulações farmacêuticas são administradas oral, tópica, transdérmica, parenteralmente, pela pulverização de inalação, vaginal, retalmente, ou pela injeção intracraniana. O termo parenteral como aqui usado inclui injeções subcutânea, intravenosa, intramuscular, intracistérnica, ou técnicas de infusão. A administração pela injeção intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar e ou implantação cirúrgica em um sítio particular também é considerada. No geral, as composições são essencialmente isentas de pirógenos, assim como outras impurezas que podem ser nocivas ao receptor.

As administrações únicas ou múltiplas das composições são realizadas com os níveis de dose e padrão que são selecionados pelo médico tratante.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada depende do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da severidade e do curso da doença, se o medicamento é administrado para propósitos A 5 — preventivos ou terapêuticos, a terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao medicamento, e do discernimento do médico atendente. | Kits . Como um aspecto adicional, a invenção inclui kits que compreendem uma ou mais composições liofilizadas embaladas em uma ' 10 maneira que facilite o seu uso para a administração aos pacientes.

Em uma forma de realização, um tal kit inclui a formulação farmacêutica aqui descrita (por exemplo, uma composição que compreende uma proteína ou peptídeo terapêuticos), embalada em um recipiente tal como uma garrafa ou vaso selados, com um rótulo afixado ao recipiente ou incluído no pacote que descreve o uso do composto ou composição na prática do método.

Em uma forma de realização, a formulação farmacêutica é embalada no recipiente tal que a quantidade de topo livre no recipiente (por exemplo, a quantidade de ar entre a formulação líquida e o topo do recipiente) seja muito pequena.

Preferivelmente, a quantidade de topo livre é negligenciável (isto é, quase nenhum). Em uma forma de realização, o kit contém um primeiro recipiente tendo uma proteína terapêutica ou composição de peptídeo e um segundo recipiente tendo uma solução de reconstituição fisiologicamente aceitável para a composição.

Em um aspecto, a formulação farmacêutica é embalada em uma forma de dosagem unitária.

O kit pode incluir ainda um dispositivo — adequado para administrar a formulação farmacêutica de acordo com uma via específica de administração.

Preferivelmente, o kit contém um rótulo que descreve o uso das formulações farmacêuticas.

Dosagens O regime de dosagem envolvido em um método para tratar uma condição aqui descrita será determinada pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo, da idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, da severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores . 5 — clínicos.

Por via de exemplo, uma dose típica de um VWF recombinante da . presente invenção é de aproximadamente 50 U/Kkg, igual a 500 ug/kg.

Em um aspecto, as formulações da invenção são administradas . por um bolo inicial seguido por uma infusão contínua para manter níveis terapêuticos circulantes de produto medicamentoso.

Como um outro exemplo, —ocomposto da invenção é administrado como uma dose de uma vez.

Aqueles de habilidade comum na técnica facilmente otimizarão as dosagens eficazes e os regimes de administração como determinados pela boa prática médica e a condição clínica do paciente individual.

A frequência de dosagem depende dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e da via de administração.

À formulação farmacêutica ótima é determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo da via de administração e dosagem desejada.

Ver por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, a divulgação da qual é por meio deste incorporado por referência.

Tais formulações influenciam o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo, e taxa de depuração in vivo dos agentes administrados.

Dependendo da via de administração, uma dose adequada é calculada de acordo com o peso corporal, área de superfície corporal ou tamanho do órgão.

As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de ensaios estabelecidos para determinar as — dosagens de nível sanguíneo em conjunção com dados de dose-resposta apropriados.

O regime de dosagem final é determinado pelo médico atendente, considerando vários fatores que modificam a ação de medicamentos, por exemplo, a atividade específica do medicamento, a severidade do dano e a responsividade do paciente, a idade, condição, peso corporal, sexo e dieta do paciente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros fatores clínicos. Visto que estudos são conduzidos, informação adicional emergirá com respeito aos níveis de dosagem apropriados e duração de tratamento para as várias doenças e condições.

. 5 Os seguintes exemplos não são intencionados a serem limitantes mas apenas exemplares das formas de realização específicas da invenção.

. Exemplo 1 Experimentos de agitação ' 10 De modo a determinar a quantidade de precipitação de rV WF em várias formulações, o grau de agregação de rVWF a seguir da agitação turbulenta foi testado sob uma variedade de condições.

Como mostrado na Tabela 1 abaixo, várias formulações de rVWF foram avaliadas em um tampão de citrato a 20 mM, pH 7,3. Os experimentos de agitação foram planejados para simular as condições de estresse mecânico. 1 a 2 ml de cada formulação foram agitados com um agitador de laboratório por 10 minutos a 1200 rpm. TABELA | Lyo25 | Lisina Glicina Manitol | PEG | Tween | Sacarose | Trealose | Rafinose [19935 [5 [Am [ Gere | seia | Manto! [75 | Mage | Meemers Imestose | Rates" | o Cs a a ps a am Ps a som rs Fe a Br o O aa Ds Os aa Po so es o se LAIIDLLLAILAO Oo AP uu [x pm DD o Er so Po un eg BP so eg La TE se ge oo 3 Bam gg see are Res Ps La o E som e se gi La Bose or

ELIJILLIAIIL LAIO» . FLITIAO>L Ao LIL LAoIAIILAOoAI O [FB TEL PT ro tr E Esse | | as To LL To II tl od | 58! A avaliação dos agregados de VWF visíveis foi feita de acordo com o esquema mostrado abaixo. “Agregados visíveis,” na maioria dos casos, são fibras gelatinosas que variam no tamanho em cerca de 100 nm a 1 a 2 cm.

ESQUEMA [Partíeuzas UU | B Várias partículas, raramente visíveis (pontos) muitas partículas, raramente visíveis (pontos) árias partículas, facilmente visíveis (fibras | D jmuitaspartículas, facilmente visíveis (fibras | E partículas visíveis (fibras>1m | EI Precipitado branco felpudo (nada na superfície Os resultados dos experimentos de agitação são mostrados na Tabela 2, abaixo. TABELA 2 Amostra | Lisina Serina PEG | Tween | Agitação 1 a de Lyo 25 1500] 80 | 2ml1200 rpm 30 min Las 1 Demos e Pa PT sm | seg | | | me | La PP sm se | | | e | ar sa PN se E | a o sr Pc se | La Po 1] Jam |] so e | [a | 1 1 leem] sl | 69 |)

as Ta va og] E2grande | La DD see loprgL| E2-6mM | La DOT TO Gomm| | forgrjE2SmM| ao Tai PC Ser ser | e | [a | jsem |] |] seg selo | e | Em resumo, os experimentos de agitação descritos acima indicam que as formulações contendo Tween-80 e Manitol fornecem os melhores resultados (isto é, a quantidade mínima de agregação). Exemplo 2 — Experimentos de congelamento-descongelamento Os experimentos de congelamento-descongelamento foram planejados para avaliar o impacto do estresse causado pelo congelamento e descongelamento repetidos. Além das formulações descritas acima para os experimentos de agitação (Tabela 1), as seguintes formulações foram

10. avaliadas (Tabela 3 e Tabela 4): TABELA 3 Lyo 25 1500 80 as a uu uv e | a see as SEL | as a NO aa

TABELA 4 FA a a a E a de Lyo25 Todas as formulações foram congeladas a -20ºC em um congelador por aproximadamente 1 hora e depois descongelada na temperatura ambiente. Os resultados são mostrados na Tabela 5 abaixo. TABELA 5 Lyo 25 80 descongelamento Idescongelamento) (4 vezes) (10 VEZES) o ss a o is uv a sas A a rm a rs a BE E ci Bi E a a o se uu ve a PB a cs vv A a om A gas | E o O A TA IE Id Ri CO O E | Br sn A O uv pe po FB ID aa e A uv vg ag BI ao o o A uv a Lo gv LELLO: E A a

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ELOI RO PE TA re TITLE BZ IDR go LB DOI AO LAIO» Io op AB Fa To Io oo is e as Como mostrado acima, a Trealose forneceu os melhores ] resultados (isto é, a quantidade mínima de agregação). - Exemplo 3 Experimentos de liofilização Os experimentos de liofilização foram planejados para avaliar a capacidade das várias formulações para permitir a formação de uma torta liofilizada que se dissolve em menos do que 10 minutos e resulta em uma solução clara. Um estudo de estabilidade acelerada também foi realizado para demonstrar que não houve nenhuma perda significante de atividade biológica.

As formulações mostradas na Tabela 6 abaixo foram liofilizadas com um liofilizador de nitrogênio TS20002 de acordo com as instruções do fabricante. O tempo total para a liofilização foi de aproximadamente 72 horas. Cada uma das formulações abaixo também contiveram 20 g/L de Manitol e 0,1 g/L de Tween-80.

TABELA 6 Epp, PEER 26 e Lo lo o II to eZi | Lim Do Lo Doe og BEM Do LoL Pe demo og] | G[hmbo Lo Lo ol lol 1. lóenleg | | GoheMPD Dolo o IP ol les sm og | Elmo Do e Dor og Gem Do Lo PIE E EE | 102) Bbm Lo do III ode TO ng) LL BE Lo PL PIE = To eg | Lp bBnmDo Lo o IE og | mp leo Lol PL PL ll leem i [og | Br emb Lo Lo PI Io = bsembeg | Br EM Do L | = les Jem og | Mp eo Do Do Ds sem [108 | BL BD PII ag ED Poem TT TT 1 16 (o)

[mL IL OI EM TT IT IT IT E res | BL e LL BCs] Br TT IT EMP] sm sm og] | Ro o o sem sm sm bio | | BP es]Wisov [o sem Po | | Os resultados dos experimentos de liofilização são mostrados na Tabela 7 abaixo. ' TABELA 7 — esp E ps e A Es ee e] 26 Leo o dt o see Lemos Los IT sem og | Gl Do Lo e BM To og Leno Do o II tos | [re leem Lo Lo Lo lol Io 1-smP | [10 BEI as pg uu og Loco en DD DDD ua nc ldem Do Lo Io lo 1 sm jog Ber em Do IT Ts og | | [Br lemMPbo Do Lo lo = seem ——TOsem aegg | | [up em Do DP | | hempb sem] [108 ) RE a A uu og rs as Pas og Io IO OCT ag BE e Dn OTTO og |) e Le e e EMP VT hem sem og | | Lo To IT bee Dose sem [og | Br Po IL EI Temos Ts o | Como mostrado acima, um tampão de Citrato ou HEPES em —combinaçãocom um aminoácido forneceu a solução mais clara.

De modo a avaliar a estabilidade da rVWF liofilizada reconstituída, testes de VWF:Ag e VWF:RCo foram realizados. VWF:Ag corresponde à quantidade de VWF que pode ser detectada em um ELISA específico de VWF usando anticorpo anti-VWF policlonal, enquanto que VWEF:RCo corresponde à quantidade de VWF que causa aglutinação de plaquetas estabilizadas na presença de ristocetina. As amostras foram armazenadas a 40ºC. Assumindo a aplicabilidade da equação de Arrhenius, estabilidade de um mês a 40ºC é equivalente a aproximadamente um ano a 4ºC. Os resultados dos experimentos de estabilidade são mostrados na Tabela 8eTabela9 abaixo.

TABELA 8 [CO] | Semanssago»C — =" Formul: EEE as a eo Pra Ta gg | 130 | 1066 | Bo org 100] 1u40 | 1128 | oa | 119 [100] 1050 | 113,7 | La 1 Tu 100] 1080 | 1144 | . Los | [| 12 982] num | 1749 | [os | | 18 | 966| 100 | —- | [oi | | | 152 [966] 10 | 124 | oa 1 JT 1mo ]5| 1040 | 1070 | o a e 060 | 107,7 | Eu 1 | 1793 |95| uso | 142 | ' Ee Td | 1242 J100| 100 | 1034 | LB 1 | n62 |93| 1060 | 1624 | : tou 1 JJ 1689 [100] 1060 | 1090 |) TABELA 9 [O] |] SemansadoºC —) Formula: EE Oo RIP ag ano | 930 | [2 | | ss 1% | so | 80 | : Lo3 | 1 ss (10 | so | 930 | Lo 4 do E ti] s0 | 980 | [5 | | 8 1 | so | 980 | Le 1— 1 ss Je] src PS) rot - [| || 90 | 950 | [og 1d 1 ss 11 | 60 | 1040 | Ls dd 1 Ta] o | 1000 | a Cu uv ga | 80 | Eu | 1 3 |) so | 9%0 | Re DB go | 950 | LB | 1 | | 0 |) 8% | aa nv nº g6O ) 920 | O desvio padrão para o ELISA está na faixa de 10 a 20 %. Os resultados acima indicam que todas das formulações testadas fornecem boa —estabilidadeem$ semanas a 40ºC.

Os experimentos de estabilidade adicionais foram realizados onde aminoácidos diferentes foram usados nas formulações (por exemplo, glicina, lisina ou histidina a 15 MM ou 20 mM, e onde o tampão de citrato foi variado (por exemplo, 15,20 ou 25 mM). Como descrito acima, a estabilidade derVWF foi monitorada usando o ensaio de atividade de VWF:RCo. Mesmo depois de 13 meses nenhuma diferença significante foi observada para os valores de atividade de VWF:RCo de amostras de estabilidade de rVWF armazenadas a 40ºC a significância das medições foram testadas com um

Teste t.

A precisão intermediária do ensaio foi determinada calculando-se o Coeficiente de Variação.

Em todas as séries dos dados de estabilidade o CV foi abaixo de 20 % e atingiu os critérios de validação de um CV <20 %. Com base no acima, pode ser concluído que rVWF é estável em todos os sistemas ' 5 —de tampão de citrato testados, independente da molaridade do tampão e . aminoácidos adicionados. rV WF permanece estável por pelo menos 13 meses mesmo quando armazenado a 40ºC.

A determinação potencial usando o . ensaio de atividade de VWEF:RCo mostra boa precisão intermediária com valores CV abaixo de 20 %. Assim, em vista dos dados aqui apresentados, uma formulação foi proposta para rVWF que inclui 15 mM de citrato (NasCitrato x 2 HO), 15 mM de glicina, 10 g/L de Trealose, 20 g/L de Manitol, 0,1 g/L de Tween-80, pH 7,3. Exemplo 4 Estabilidade de longa duração Teste de estabilidade acelerada e de longa duração Estudos foram conduzidos para avaliar a estabilidade do produto medicamentoso final (FDP) de rVWF armazenado em ambas as condições de armazenagem recomendada e elevada.

Os dados das condições — de armazenagem elevada fornece garantia de que os desvios na temperatura não impactarão a qualidade da FDP de rVWF e serão usados para extrapolar a condição de expiração aceitável do material na ausência de dados de estabilidade em tempo real, condição real.

A especificação corrente é <3,0 % de umidade residual (como — determinado usando o Método de Karl Fischer). Os lotes rVWFF4FC, rVWEFFH5FC, rVWFFH6FC e rVWFFk7FC foram liberados com níveis de umidade de 1,2 %, 1,3 %, 1,2 %, e 1,5 % respectivamente.

Com base na experiência passada com outros produtos com configurações de frasco e tampa similares, é esperado que qualquer um dos lotes de rVWF liberados com aproximadamente 1,3 % de umidade residual atingirá o limite da especificação de < 3,0 % no final da meia vida proposta (isto é 24 meses na temperatura de armazenagem pretendida de 5ºC + 3ºC). Os estudos de estabilidade de longa duração na condição de . 5 — armazenagem recomendada (isto é 5ºC + 3ºC) e temperaturas elevadas (isto é . 40ºC + 2ºC) foram conduzidos com quatro lotes de FDP de rVWF que foram fabricados. Estes estudos forneceram dados suficientes para comparar o . comportamento de estabilidade dos lotes clínicos individuais. O protocolo de estabilidade, que inclui uma descrição dos ensaios que indicam a estabilidade e os critérios de aceitação de estabilidade, podem ser encontrados na Tabela 10 que também contém informação relacionada com os lotes FDP de rVWF avaliados nos estudos de estabilidade. Tabela 10 Condições de Número do Lote | Intervalos de Teste Armazenagem Completados (PO) (e Propostos) meses SºCE3%C | rvWFH2FEC | 0,1,2,3,6meses | meses 24, (30) meses (24, 30) meses 18, 24, 30) meses Sm (18, 24, 30) meses Sumário e debate de estabilidade global (24 Meses) Os dados de estabilidade de FDP de rVWF apresentados é compreendido dos seguintes:

1. Dados de 24 meses de estudos de longa duração a 5ºC + 3ºC (teste completo) e dados intermediários em 6 meses a 30ºC + 2ºC (teste completo) para o lote rV WFt&1FC;

2. Dados de 6 meses a 5ºC + 3ºC (teste completo) para o lote TV WFi2FC;

3. Dados de 24 meses de estudos de longa duração de 2 a 8º . 5 — (teste completo), dados de 6 meses a 30ºC + 2ºC e dados de 3 meses a 40ºC + 2ºC (teste completo) para o lote rV WF$3FC; ' 4. Dados de estabilidade em 24 meses a 5ºC + 3ºC e dados de : 9 meses a 40ºC + 2ºC para o lote r(V WFFt4FC;

5. Dados de estabilidade em 24 meses a 5ºC + 3ºC e dados de ' 10 —9mesesa40ºC+2ºC para o lote rVWFFA5FC;

6. Dados de estabilidade em 12 meses a 5ºC + 3ºC e dados de 9 meses a 40ºC + 2ºC para o lote rV WFFiH6FC; e

7. Dados de estabilidade em 12 meses a 5ºC + 3ºC e dados de 9 meses a 40ºC + 2ºC para o lote rVWFFt7FC A variação observada na umidade residual para os lotes TV WFFH4FC, rVWFFH5FC, rVWFFHX6FC e rVWFFH7FC tem permanecido bem abaixo do critério de aceitação < 3 %, e não impactou a atividade funcional (VWEF:RCo). Não houve nenhuma mudança observável nos resultados de estabilidade para as técnicas analíticas qualitativas (isto é aparência, análise de SDS-PAGE, etc.) para os lotes fabricados para serem adequados para o uso nos estudos não clínicos e clínicos. Similarmente, Não houve nenhuma tendência em diminuir a estabilidade para a análise de proteína total, a análise de VWF:Ag ou o número observado de multímeros de VWEF durante a armazenagem.

Variação tanto na razão da atividade de VWF:RCo para a atividade de VWF:Ag quanto os dados de VWF:RCo apresentados para os lotes rVWFt1FC, rVWFt2FC e rVWFt3FC foi provavelmente o resultado da variação do método de teste, o fato de que os resultados de teste de estabilidade de VWF:RCo individuais consistiram de dados de uma única determinação de uma amostra de estabilidade, e/ou dados da metodologia de ensaio do método não em conformidade com a Ph. Eur. Todos os pontos de tempo do teste para os lotes não clínicos subsequentes à modificação da metodologia de ensaio para o ensaio não em conformidade com a pH. Eur. + 5 — foram testados usando tanto a metodologia original quanto a do novo ensaio. . O FDP de 1VWF fabricado em uma escala grande exibiu características de estabilidade similares aos lotes de FDP de rVWF fabricados em . uma escala experimental. Estes lotes de FDP de rVWF mantiveram a atividade de VWEF:RCo por até 24 meses de armazenagem a 5ºC + 3ºC. Não houve nenhuma — mudança no padrão de multímero de VWF nas amostras dos lotes em larga escala correntemente sobre a estabilidade, mesmo depois de 6 meses de armazenagem a 30ºC + 2ºC ou 9 meses de armazenagem a 40ºC + 2ºC, A Tabela 11 mostra os resultados para VWF:RCo, VWF:Ag e padrão de multímero de VWF dos lotes TV WEH4FC, rVWFK5SFC, rVWFH6FC e rVWFt7FC armazenados sob condição — de estresse a 40ºC + 2ºC. Os resultados indicam estabilidade nas condições de armazenagem em temperatura elevada por 9 meses que pode ser extrapolada em uma vida de prateleira de mais do 3 anos nas temperaturas ambientes ou ainda mais sob condições refrigeradas. Tabela 11 leses LI Is VWEF:RÇo E na VWF:A) Resultad Ex 7 81 79 les] em

ESECIMNMMLMLA multímero relatado de VWF Meses) LI IL sp Atividade de TO-150 107 120 2 34 Dr o Eu VWRF:A: Resultad. E 79 Issa | ma se | si [a multímero de relatado

VWE leses, LI IPs pn Atividade de 70150 Tm 126 129 130 e ml ELISA (U/ml relatado Análise de Resultado 20 20 20 20 . multimero de relatado

VWEF ses, LEI a Da dd Atividade de 70150 Tn TI5 122 105 TR . VWF: RÇo mi] . ELISA (U/mD)| relatado Análise de Resultado 21 20 20 19 19 multímero de relatado

VWE Uma análise de covariação (análise ANCOVA) demonstrou que a diferença nas inclinações das linhas de regressão (lotes rYVWFFtH4FC, TV WFEFX5FC, rVWFFt$6FC e rVWFFA47FC armazenados a 5ºC + 3ºC) não é significante (p = 0,906), permitindo que os dados da atividade de VWF:RCo — fossem agrupados como descrito em ICH QI A (R2). A diferença na elevação das linhas de tendência dos lotes individuais também não é significante. À extrapolação da inclinação do pior caso agrupado, como mostrado na Figura 1, mostra que os intervalos de confiança estão bem dentro dos critérios de aceitação por um mínimo de 24 meses. O intervalo de confiança mais baixo —paraa curva média diminui para 80 % de atividade inicial em 51 meses (80 % é também a diferença máxima entre a potência estimada e a potência estabelecida para o Fator de von Willebrand Humano na Ph. Eur). À inclinação do pior caso agrupado mostra uma diminuição de 0,0344 U de VWF:RCo por mês. Esta comparação mostra que as características de estabilidade do FDP de rVWF, especificamente a atividade de VWF:RCo, não mudou como um resultado das mudanças no processo de produção. À extrapolação acima sustenta a extensão da vida de prateleira temporária do FDP de rVWF para 24 meses quando armazenado na temperatura de armazenagem recomendada.

A transferência de umidade da tampa para o produto liofilizado é dependente do material da tampa e é influenciada pela umidade residual da tampa depois da esterilização, pela umidade na qual a amostra é armazenada e pela taxa de transferência de umidade intrínseca da tampa.

À 7 5 umidade residual nos lotes rVWFFH4FC, rVWFFtA5FC, rVWFFt6FC e ; IVWFFA7FC armazenados a 5ºC + 3ºC foi comparável (a diferença na comparação das inclinações não sendo significante, com p = 0,734), como . mostrado na Figura 2. Os lotes armazenados na condição de temperatura elevada 40ºC + 2ºC também mostrou um aumento comparável na umidade residual em 9 meses (Figura 3). A análise de ANCOVA demonstra aqui que as diferenças na inclinação das linhas de regressão são comparáveis (p = 0,546). À Figura 3 mostra a extrapolação do pior caso agrupado de inclinação em até 24 meses.

Estes são dados suficientes para sustentar o uso dos lotes 15º rVWEFH6FC e rVWFFH$7FC para a duração do período de expiração descrito de 24 meses quando armazenado a 5ºC + 3ºC.

Condições de Armazenagem Propostas e Vida de Prateleira A condição de armazenagem recomendada para o FDP de TV WF é de 5ºC + 3ºC.

Uma vida de prateleira temporária de 24 meses para o FDP de rVWF é portanto proposta quando armazenado na condição de armazenagem recomendada.

A vida de prateleira para os lotes de FDP de 1VWF provavelmente podem ser ainda mais prolongados com base nos dados adicionais a serem gerados para períodos de armazenagem mais longos.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação farmacêutica estável liofilizada de um Fator de von Willkebrand recombinante (rVWF), caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um rVWF; (b) um ou mais agentes de tamponação; (co) um : 5 —oumais aminoácidos; (d) um ou mais agentes estabilizantes; e (e) um ou mais . tensoativos; o dito r(VWF compreendendo um polipeptídeo selecionado do - grupo que consiste de: a) a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; b) um análogo, fragmento ou variante de a) biologicamente ativo; c) um polipeptídeo codifiado pelo polinucleotídeo apresentado na SEQ ID NO: 1; d) um análogo, fragmento ou variante de c) biologicamente ativo;e e) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza ao polinucleotídeo apresentado na SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização moderadamente severas; o dito tampão é que compreende de um agente de tamponação depHem uma faixa de cerca de 0,1 mM a cerca de 500 mM e o dito pH está em uma faixa de cerca de 2,0 a cerca de 12,0; o dito aminoácido está em uma concentração de cerca de 1 a cerca de 500 mM; o dito agente de estabilização está em uma concentração de —cercade0,lacercade 1000 mM; e o dito tensoativo está em uma concentração de cerca de 0,01 £/L a cerca de 0,5 g/L.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o rVWF compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3.

3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponação é selecionado do grupo que consiste de citrato, glicina, histidina, HEPES, Tris e combinações destes agentes.

i 5 4. Formulação de acordo com a reivindicação 3, caracterizada ' pelo fato de que o agente de tamponação é o citrato.

5. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada r pelo fato de que o pH está na faixa de cerca de 6,0 a cerca de 8,0.

6. Formulação de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fatodequeo pH está na faixa de cerca de 6,5 a cerca de 7,5.

7. Formulação de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o pH é de cerca de 7,3.

8. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponação é o citrato e o pH é de cerca de 7,3.

9. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o aminoácido é selecionado do grupo que consiste de glicina, histidina, prolina, serina, alanina e arginina.

10. Formulação de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o aminoácido está em uma faixa de concentração de cerca de 0,5mMacercade300mM.

11. Formulação de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM,

12. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada — pelo fatodequeorVWF compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; em que o agente de tamponação é o citrato e o pH é de cerca de 7,3; e em que o aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM.

13. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o um ou mais agentes estabilizantes são selecionados do grupo que consiste de manitol, lactose, sorbitol, xilitol, sacarose, trealose, manose, maltose, lactose, glicose, rafinose, celobiose, gentiobiose, isomaltose, arabinose, glicosamina, frutose e combinações destes agentes ' 5 estabilizantes. '

14. Formulação de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que os agentes estabilizantes são trealose em uma - concentração de cerca de 10 g/L mM e manitol em uma concentração de cerca de 20 g/L.

15. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado do grupo que consiste de digitonina, Triton X-100, Triton X-114, TWEEN-20, TWEEN-80 e combinações destes tensoativos.

16. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é TWEEN-80 a cerca de 0,01 g/L.

17. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o rVWF compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 3; em que o agente de tamponação é citrato em uma concentração de cerca de 15 mM em torno do pH 7,3; em que o aminoácido é glicina em uma concentração de cerca de 15 mM; em que os agentes estabilizantes são trealose em uma concentração de cerca de 10 g/L e manitol em uma concentração de cerca de 20 g/L; e em que o tensoativo é TWEEN-80 a cerca de 0,1 g/L.