MX2007014390A - Composicion de vacuna que comprende subunidad b de termo toxina e. coli y antigeno y adyuvante. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una composicion de vacuna que comprende la subunidad B de toxina termo-labil de E. coli o un derivado de la misma con homologia igual o mayor de 90% compleja con un antigeno y adyuvante.

Description

COMPOSICIÓN DE VACUNA QUE COMPRENDE SUBUN1DAD DE TERMO TOXINA E. COL1 Y ANT1GENO Y ADYUVANTE Desc ppc?óm de la Invención La presente invención proporciona composiciones de vacuna mejoradas, métodos para hacerlas y su uso en medicina. En particular la presente invención proporciona composiciones de vacuna tratadas con adyuvante que comprenden un agente que puede mejorar la presentación de MHC clase I de un antígeno, y un antígeno formulado con un coadyuvante. El desarrollo de vacunas que requieren una inducción predominante de una respuesta celular sigue siendo un desafío. Debido a que las células T CD8 + , las células ejecutoras principales de la inmunorespuesta celular, reconocen antígenos que se sintetizan en células infectadas por patógenos, la vacunación acertada requiere la síntesis de antígenos inmur ogenéticos en células de la vacuna. Esto puede llevarse a cabo con vacunas vivo-atenuadas, no obstante también presenta limitaciones significativas. En primer lugar, e?iste un riesgo de infección, cuando las vacunas son inmunosupresadas, o cuando el patógeno por sí mismo puede inducir la inmunosupresión (por ejemplo Virus de la Inmunodeficiencia Humana). En segundo lugar, algunos patógenos son difíciles o imposibles de crecer en cultivos celulares (por ejemplo el Virus de Hepatitis C). Otras vacun ¡as existentes tal como vacunas de células completas inact vadas o adyuvante de aluminio, las vacunas de subunidades de p?oteína recombinante son inductores notablemente pobres de las respuestas de CD8. Por estas razones, se están desarrollando procesos alternativos: vacunas vivas vectorizadas, vacunas de ADN del plásmido, péptidos sintéticos o adyuvantes específicos. Las vacunas vivas vectorizadas son buenas en inducir una respuesta celular fuerte pero preexistente (por ejemplo adenovirus) o la inmunidad inducida por la vacuna contra el vector puede arriesgar la eficacia de la dosis de vacuna adicional (Casimiro y colab oradores, JOURNAL OF VIROLOGY, junio 2003, p. 6305- 6313)' Las vacunas de ADN del plásmido también pueden inducir una n espuesta celular (Casimiro y colaboradores, JOURNAL OF VIROLOGY, junio 2003, p. 6305-6313) pero sigue siendo débil en humanos (Me Conkey y colaboradores, Nature Medicine 9, 729-735, 003) y la respuesta anticuerpo es muy pobre. Además, los pépti los sintéticos se están evaluando actualmente en experimentos clínicos (Khong y colaboradores, J Immunother 2004;27:472-477), pero la eficacia de tales vacunas que codifican un número limitado de epítopos de células T puede obstaculizarse por e aspecto de los mutantes de escape a la vacuna o por la necesidad primero seleccionar pacientes acoplados a HLA. Los procesos alternativos dirigidos mejoran la presentación de la MHC clase I que también se han descrito, basados en la liberación del antígeno usando vectores no-vivos. Algún vectores no vi vos se derivan de toxinas bacterianas, por ejemplo Anthrax LFn toxin (Ballard y colaboradores (1996) PNAS USA 93 pp 12531-12534), B. pertussis adenylate cyclase toxin (Fayolle y colaboradores (1996) J. Immunology 156 p 4697-4706), Pseudomonas Exotoxin A (Donnelly y colaboradores PNAS USA (1992) 90 pp 3530-3534), o E. coli Heat-Labile toxin (Partidos y colaboradores. Immunology (1996) 89 pp 483-487). Las limitaciones de antígenos de vacuna y sistemas de liberación justifican la búsqueda para nuevas composiciones de vacuna. Los presentes inventores han encontrado que la inclusión de adyuvantes en composiciones que comprenden vectores no-vivos derivados de toxinas bacterianas puede tener un efecto benéfico en la inmunorespuesta resultante, en particular respuestas específicas de CD8. Se desea que este efecto benéflico es debido a la combinación de la activación de la inmu?orespuesta dada por el adyuvante con la liberación correcta de un antígeno proporcionado por el agente que marca la traye?toria de MHC1 en lugar de un efecto adyuvante adicional propojrcionado por tal agente. Los estudios anteriores utilizan composiciones de vacuna que contenían la subunidad B de LT y un an tígeno administrado con un adyuvante mostrado sin efecto sinércjíco para la fuerza de la inmunorespuesta (McCIuskie y I colaboradores 2000 Mol Medicine 6 pp 867-877; McCIuskie y colaboradores (2001) Vaccine 19 pp 3759- 3768). 'or lo tanto la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende la subunidad B de la toxina termo-lábil de E. coli o un derivado de la misma con homología igual o mayor de 90% compleja con un antígeno y adicionalmente comprende un adyuvante. En otra modalidad la subunidad B de la toxina termo-lábil de E. coli o un derivado con homología ¡gual o mayor de 90% puede ligar el receptor GM?- En una modalidad adicional la subunidad B de la toxina termo-lábil de E. coli o un derivado con homología igual o mayor de 90% puede marcar un antígeno en la trayectoria de MHC clase I como se midió por los métodos descritos en la sección 2.1. El término "composición de vacuna" usado en la presente se defin como la composición usada para obtener una inmunorespuesta contra un antígeno dentro de la composición para proteger o tratar un organismo contra enfermedad. En el contexto de la invención, se desea que la palabra "toxina" signifique toxinas que se han desintoxicado tal que no sean prolongadamente tóxicas a humanos, o una subunidad o fragmento de toxina que sea sustancialmente desprovista de actividad tóxica en humanos. El vector no vivo preferido basado en toxinas desinto?icadas son la subunidad B de la toxina lábil de E. coli (LT). En la modalidad preferida, el vector no-vivo es la subunidad de B de la toxina lábil de E. coli tipo I (LTI). Los vectores no vivos adicionales basados en toxinas desi? toxicadas incluyen el dominio terminal amino del factor mortal ántrax (LF), endotoxina A de P. aeruginosa, y la ciclasa A aden lada de B. pertussis. Por ejemplo, el vector no-vivo se deriv a de una toxina que es una familia de la familia AB5, por ejemplo, la toxina del cólera (CT), la toxina de Bordatella Pertussis (PT) así como citotoxinas de subtilasa recientemente ident ficadas. (Patón et a /, J Exp Med 2004, Vol 200 pp 35-46). La toxina lábil (LT) de E. coli consiste de dos subunidades, una subunidad B pentamérica y una subunidad A monomérica. La subunidad A es responsable de la toxicidad, mientras que la subunidad B es responsable del transporte en la célula. La LT une el receptor gangliosida GM1. Un derivado de toxina termo-lábil de E. coli con homología igual o mayor de 90% tiene mayor homología de 90% en el nivel del aminoácido. En otra modalidad la proteína tiene homología igual o mayor de 90%, por ejemplo 96, 97, 98 o 99%. Por ejempilo, las eliminaciones del aminoácido pueden hacerse que no afecten la función. En otra modalidad, un derivado todavía puede unir el receptor gangliosida GM?- En una modalidad adicional un deriv do todavía puede obtener una inmunorespuesta contra un antígeno complejo como se midió por los métodos descritos en la sección 2.1. Si un vector o equivalente une el receptor GM? puede determinarse, por ejemplo, siguiendo el protocolo indicado en el ejemplo 1.4 más adelante. i El dominio amino-terminal de LF de B. Anthracis (ántrax) se conoce como LFn. Esto es 255 aminoácidos N-terminal de LF. LF se ha encontrado que contiene la información necesaria para la unión al antígeno protector (PA) y translocación mediada. El dominio solamente carece de potencial mortal, que depende de la porción carboxilo-terminal de manera putativa enzimática (Arora and L.eppla (1993) J. Biol Chem 268 pp 3334-3341). Además, se encontró recientemente que una proteína de fusión del dominio de LFn con un antígeno extranjero puede inducir las inmunorespuestas de la célula T CD8 incluso en ausencia de PA (Kusriner y colaboradores (2003), PNAS 100 pp 6652-6657) sugiriendo que LFn puede utilizarse sin PA como portador para liberar antígenos en el citosol. jDonnelly y colaboradores (supra) demuestran que el dominio tóxico puede eliminarse de P. aeruginosa y el resto de la toxina pueden aún mediar el transporte de un antígeno en la célula. Además, la eliminación de aa de la toxina de longitud completa no deteriora su capacidad para tener acceso al citosol pero la hace no tóxica puesto que esta mutación elimina la actividad de ADP-ribosilación. Con base en este mutante, pueden construirse quimeras que codifiquen las secuencias antigénícas de varios tama 'ñ1os (Fitzgerald, J Biol Chem, Vol. 273, Issue 16, 9951-9958, 17 de abril de 1998). _a toxina de ciclasa adenilada une el receptor CD11b en la supericie de las células dendríticas. Los toxoides recombinantes que llevan epítopos de células T CD8+ pueden inducir las respuestas de CTL específicas en ratones y se ha demostrado la protección contra tumores experimentales (Fayolle y colaboradores, J Immunol 1999, 162 pp 4157-4162). La presentación superficial de los epítopos liberados ocurre vía la trayectoria de MHC clase I clásica. Otros vectores pueden derivarse usando un receptor o receptor imitador donde una toxina bacteriana se conoce por unir tamizando una biblioteca que exhibe el fago. Tal técnica propc rcionará los péptidos (por ejemplo hasta 20 aminoácidos o así en longitud) que podrá unir el mismo receptor como la toxina bacteriana, pero tendrá poca o ninguna similitud de secuencia a la toxina. Esta técnica ha mostrado ser una manera efectiva de generar péptidos que se unen al receptor GB3 (Miura y colaboradores Biochimica et Biphysica Acta 1673 (2004) pp 131 -138) el receptor GM1 (Matsubara y colaboradores FEBS letters 456 1999) 253-256). Es probable que tales péptidos puedan actuar como vectores en la misma manera como las toxinas bacterianas que unen a los mismos receptores. Se considera que tales péptidos caen dentro de la definición "vector derivado de una toxina bacteriana" puesto que se derivan identificando al mismo receptor como al que se une la toxina bacteriana. En una moda idad, sin embargo, el vector de la invención que es "deriv ado de una toxina bacteriana" es realmente una toxina bacte ¡ana o un equivalente inmunológicamente funcional del mismo No incluidos dentro del alcance de la presente invención son los ¡vectores no vivos o equivalentes inmunológicamente funcionales de los mismos que pueden unirse el receptor Gb3. Si un vector o equivalente unido al receptor Gb3 puede determinarse, por ejemplo, siguiendo el protocolo indicado en la sección 1.5 más adelante. Las composiciones de la invención son capaces de mejorar una ilnmunorespuesta específica de CD8 al antígeno complejo a una proteína de la invención. La mejora es medida observando la respuesta a una composición de la invención que comprende un antígeno complejo a una proteína de la invención y que comprende un adyuvante cuando se compara a la respuesta con una composición que comprende un antígeno complejo a una protelna de la invención sin adyuvante, o la respuesta a una formulación que comprende el antígeno con adyuvante La mejora puede definirse como un aumento en el nivel de la inmurjorespuesta, la generación de una inmunorespuesta equivalente con una dosis inferior de antígeno, un aumento en la calidad de la inmunorespuesta, un aumento en la persistencia de la inrmunorespuesta, o cualquier combinación de lo anterior. Tal mejora puede verse después de una primera inmunización, y/o puede verse después de inmunizaciones subsecuentes. Los adyuvantes particulares son los seleccionados del grupo de sales metálicas, emulsiones aceite en agua, Toll similar a i ligandos de receptores, (en particular Toll similar al ligando del receptor 2, Toll similar al ligando del receptor 3, Toll similar al ligando del receptor 4, Toll similar al ligando del receptor 7, Toll similar al ligando del receptor 8 y Toll similar al ligando del receptor 9), saponinas o combinaciones de las mismas. En una modalidad, el Toll similar al ligando del receptor es un agonista del receptor. En otra modalidad, el Toll similar al ligando del receptor es un antagonista del receptor. El término "ligando" como se utiliza a través de la especificación y las reivindicaciones se deseas para significar una entidad que pueda unir al receptor y tener un efecto, cualquier actividad sobre-reguliada o infra-regulada del receptor. El adyuvante se selecciona preferiblemente del grupo: sapoijiina, lípido A o un derivado del mismo, oligonucleótido inmupoestimulante, fosfato de alquilo glucosaminida, o comb naciones de los mismos. Un adyuvante preferido adicional es una sal metálica en combinación con otro adyuvante. Se prefie re que el adyuvante sea un Toll similar al ligando del recepjtor en particular al Toll similar al ligando de un receptor 2, 3, 4, 7, 8 ó 9, o una saponina, en particular Qs21. Se prefiere adicic nalmente que el sistema adyuvante comprenda dos o más adyuvantes de la lista anterior. En particular las combinaciones preferiblemente contienen un adyuvante de saponina (en particular Qs21) y/o un Toll similar al ligando del receptor 9 tal como un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene CpG u otros motivos inmunoestimulante tal como CpR donde R es un nucle ótido de guanosina no-natural. Otras combinaciones prefe ridas comprenden una saponina (en particular Qs21) y un Toll similar al ligando del receptor 4 tal como el monofosforil-lípidci A o su derivado desacilado 3, 3 D - MPL, o una saponina (en particular Qs21) y un Toll similar al ligando del receptor 4 tal como un fosfato de alquilo glucosaminida. Otras combinaciones preferidas comprenden un ligando 3 ó 4 de TLR en combinación con un ligando 8 ó 9 de TLR. Los adyuvantes particularmente preferidos son combinaciones de 3D-MPL y QS21 (documento EP 0 671 948 B1), emulsiones aceite en agua que comprenden 3D-MPL y QS21 (documentos WO 95/17210, WO 98/56414), o 3D-MPL formulado con otros portadores (documento EP 0 689 454 B1). Otros sistemas adyuvantes preferidos comprenden una combinación de 3 D MPL, QS21 y un oligonucleótido de CpG como se describe en los documentos US6558670, US6544518. En una modalidad el adyuvante es un Toll similar al ligando del receptor 4 (TLR), preferiblemente un ligando tal como un lípido A derivado particularmente del monofosforil-lípido A o más particularmente el monofosforil-lípido A desacilado (3 D - MPL). 3D-MPL es vendido bajo la marca registrada MPL® por GSK biolo icals y promueve principalmente las respuestas de células T CD4+ con un fenotipo de IFN-g (Th1). Puede producirse de acuerdo a los métodos descritos en el documento GB 2 220 211 A. Ouímicamente es una mezcla del monofosforil-lípido A 3- desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Preferiblemente en comp osiciones de la presente invención, se utiliza la partícula pequeña de 3D-MPL. La partícula pequeña de 3D-MPL tiene un tamaño de partícula tal que puede ser estéril-filtrado a través de un fi tro de 0.222 µm. Tales preparaciones se describen en la Solic tud de Patente Internacional No. WO 94/21292. Los derivados sintéticos del lípido A se conocen y desean por ser ligandos de TLR incluyendo, pero sin limitarse a: OW1174 (2-desoxi-6-o-[2-desoxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra-decanoilamino]-4-o-fosfono-ß-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3-hid roxi te tradecanoilamino]-a-D-glucopiranosildihidrogen fosfato), (WO ^5/14026) OM 294 DP (3S,9R)-3--[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1 , 1 O-d iol , 1 ,10-bis (dihicjrogenofosfato) (WO 99/64301 y WO 00/0462) OU 197 MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidro^itetradecanoilamino]decan-1,10-diol,1-dihidrogenofosfato 10-(6 -aminohexanoato) (WO 01/46127). Otros ligandos de TLR4 que pueden utilizarse son los fosfa ? o.s de alquilo glucosaminida (AGPs) por ejemplo como los descr itos en el documento WO9850399 o US6303347 (también se descr iben procesos para la preparación de AGPs), o sales farmacéuticamente aceptables de AGPs como se describe en el documento US6764840. Algunos AGPs son agonistas de TLR4, y algunos son antagonistas de TLR4. Ambos se desean por ser útiles como adyuvantes. Otro inmunoestimulante preferido para el uso en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A es una preparación de saponina aislada de South American tree Quilaja Saponaria Molinl a y primero se describió como que tiene actividad adyuvante por Dalsgaard y colaboradores en 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, p 243-254). Los fragmentos purificados de Quil A se han aislados con CLAR que conservan la actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento EP 0 362 278), por ejemplo QS7 y QS21 (también conocidas como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural derivada de la corteza de la Quillaja sapo?aria Molina que induce células T citotóxicas de CD8 + (CTLs), células Th1 y una respuesta anticuerpo lgG2a predominante y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención. Las formulaciones particulares de QS21 han descrito que son particularmente preferidas, estas formulaciones además comprenden un esterol (documento WO96/33739). Las saponinas que forman parte de la presente invención pueden separarse en la forma de micelas, micelas mezcladas (de preferencia, pero no exclusivamente con sales de bilis) o pueden estar en la forma de matrices de ISCOM (documento EP 0 109 942 B1), liposomas o estructuras coloidales relacionadas tal como complejos multiméricos similares a gusanos o similares a anillos o estructuras y laminillas lipídicas/revestidas cuando son formuladas con colesterol y lípido, o en la forma de un aceite en emulsión de agua (por ejemplo como en el documento WO 95/17210). Las saponinas pueden preferiblemente asociarse con una sal metálica, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de I aluminio (documento WO 98/15287). Preferiblemente, la saponina se presenta en la forma de una liposoma, ISCOM o un aceite en emulsión de agua. ¡También pueden utilizarse oligonucleótidos inmu?oestimulantes o cualquier otro Toll similar al ligando del recepjtor 9 (TLR). Los oligonucleótidos preferidos para uso en adyuvantes o vacunas de la presente invención son CpG que contienen oligonucleótidos, preferiblemente que contienen dos o más motivos dinucleótido CpG separados por lo menos tres, más prefepblemente por lo menos seis o más nucleótidos. Un motivo CpG és un nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanina. Los oligonucleótidos CpG de la presente invención son I normalmente desoxinucleótidos. En una modalidad preferida el intern'ucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace de fosforotioato, aunque el fosfodiéster y otros enlaces internucleótido están dentro del alcance de la invención. También se incluyen dentro del alcance de la invención oligonucleótidos con enlaces de internucleótido mezclados. Los métodos para producir oligonucleótidos de fosforoditioato o fosforotioato se describen en los documentos US5,666,153, US5,278,302 y WO95/26204. Los ejemplos de oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias preferiblemente contienen enlaces modificados fosforotioato de internucleótido. OLIGO 1 (SEC ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEC ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEC ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEC ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEC ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEC ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender las secuencias preferidas anteriores en que tienen eliminaciones o adiciones inconsecuentes a los mismos. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes alternativos pueden comprender modificaciones a los nucleótidos. Por ejemplo, los documentos WO0226757 y WO03507822 describen modificaciones a la porción C y G de un CpG que contiene oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes utilizados en la presente invención pueden sintetizarse por cualquier método indicado en la técnica (por ejemplo ver el documento EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automatizado.

Los ejemplos de un ligando TLR 2 incluyen peptidoglicano o 11 pop roteína. Las imidazoquinolinas, tal como Imiquimod y Resiquimod son ligandos de TLR7 indicados. El ARN de hebra sene illa es también un ligando de TLR indicado (TLR8 en humanos y TLR7 en ratones), mientras que el ARN hebra doble e poly IC (ácido poliinosínico-policitidílico un mimético comercialmente sintético de ARN viral). Son ejemplares de ligandos de TLR 3. 3D-MPL es un ejemplo de un ligando de TLR4 mientras que CPG es un ejemplo de un ligando de TLR9. El vector no-vivo derivado de una toxina bacteriana o equivalente inmunológicamente funcional del mismo y el antígeno son formados complejos juntos. Por formarse complejos se significa que el vector no-vivo derivado de una toxina bacteriana o equivalente inmunológicamente funcional del mismo y el antígeno están físicamente asociados, por ejemplo vía una interacción electrostática o hidrofóbica o un enlace covalente. En una modalidad preferida el vector no-vivo derivado de una toxina bacteriana o equivalente inmunológicamente funcional del mismo están covalentemente ligados mientras que una proteína de fusión o químicamente acoplada, por ejemplo vía un residuo de cisteína. En las modalidades de la invención más de un antígeno se liga a cada vector no-vivo o equivalente inmunológicamente funcional del mismo por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6 moléculas del antígeno por vector. Cuando más de un antígeno está presente, estos antígenos pueden todos ser ¡guales, uno o más puede ser diferente a los otros, o todos los antígenos pueden ser diferentes entre sí. El antígeno por sí mismo puede ser un péptido, o una proteína que comprende uno o más epítopos de interés. Esta es modalidad preferida donde el antígeno es seleccionado tal que cuando es formulado de la manera contemplada por la invención proporciona la inmunidad contra patógeno intracelulares tal como VIH, tuberculosis, Clamidia, HBV, HCV e influenza. La presente invención también encuentra utilidad con antígenos que pueden elevar las inmunorespuestas relevantes contra trastornos benignos y proliferativos tal como cánceres. Preferiblemente las formulaciones vacunas de la presente invención contienen un antígeno o composición antigénicas capaz de ODtener una inmunorespuesta contra un patógeno humano, donde el antígeno o composición antigénicas se deriva de VIH-1, (tal como gag o fragmentos del mismo, por ejemplo p24, tat, nef, cubierta tal como gp120 o gp160, o fragmentos de cualquiera de éstos), virus del herpes humano, tal como gD o derivados de los mismos o proteína Temprana Inmediata tal como ICP27 de HSV1 o HS^ 2, citomegalovirus ((esp Human)(tal como gB o derivados de Icjs mismos), antígeno Rotaviral, virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados de los mismos), Virus Varicela Zoster (tal cbmo gpl, II y IE63), o forma de virus de la hepatitis tal como el vir us de la hepatitis B (por ejemplo el antígeno Superficial de al He patitis B o un derivado del mismo), o antígenos del virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis C y virus de la hepatitis E, o de otros patógeno virales, tal como paramixovirus Virus Sincitial Respiratorio (tal como proteínas F, G y N o derivados de los mismas), virus de parainfluenza, virus del sarampión, virus de las pape-as, virus del papiloma humano (por ejemplo HPV 6, 11, 16, 18) f avivirus (por ejemplo Virus de la Fiebre Amarilla, Virus del Deng iue, Virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas, Virus de la Encefalitis Japonesa) o virus de la influenza purificado o i prote linas recombinantes de los mismos, tal como proteínas HA, NP, NA o M, o combinaciones de las mismas), o derivado de patógeno bacterianos tal como Neissena spp, incluyendo N gonorrhea y N meningitidis (por ejemplo, proteínas de unión a transferpna, proteínas de unión a lactoferpna, PilC, adesinas), S piogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de las mismas, prote jasa C5A), S agalactiae, S mutans, H ducreyi, Moraxella spp, ncludmg M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesmas de peso molecular alto y bajo e invaginas), Bordetella spp, incluyendo B pertussis (por ejemplo pertactina, toxina pertussis o derivados de los mismos, hemaglutinina filamentosa, ciclasa adenilada, fimbria), B parapertussis y B bronchiseptica, Mycobacterium spp , incluyendo M tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M bovis, M leprae, M avium, M paratuberculosis, M smegmatis, Legionella spp, incluyendo L pneumophila, Eschenchia spp, incluyendo E coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina lábiles al calor o derivados de los mismos, toxina termoestables o derivados de los mismos), E coli enterohemorragica, E coll enteropatogenica Vibrio spp, incluyendo V cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma), Shigella spp, incluyendo S sonnei, S dysentenae, S flexnerii, Yersinia spp, incluyendo Y enterocolitica (por ejemplo una proteina Yop), V pestis, Y pseudotuberculosis, i Campilobacter spp, incluyendo C jejuní (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasmas) y C coli, Salmonella spp, incluyendo S typhi. S paratyphi, S choleraesuis, S ententidis, Listena spp , incluyendo L monocytogenes, Helicobacter spp, incluyendo H p?lor?\ (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina de vacuolación), Pseudomonas spp, incluyendo P aerugmosa, Staphylococcus spp , incluyendo S aureus, S epidermidis, Enterococcus spp , incluyendo E faecahs, E faecium, Clostridium spp , incluyendo C tetam (por ejemplo toxina del tétanos y derivados de la misma), C botulmum (por ejemplo toxina de botulmo y derivados de la misma), C difficile (por ejemplo toxinas de Clostpdium A o B y derivados de las mismas), Bacillus spp , incluyendo ß i anthracis (por ejemplo toxina de botulino y derivados de la misma), Corynebacterium spp , incluyendo C diphthenae (por ejemplo toxina de la difteria y derivados de la misma), Borrelia spp , incluyendo ß burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB ), B garinu (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), ß afzelh (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B andersonn (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente del Human Granulocytic Ehrliohiosis; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana externa rara), T. denticola, T. hyodysenteriae, o derivado de parásitos tal como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo ß. microti; Trypenosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivado de leivadura tal como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans. Otros antígenos específicos preferidos para la M. tuberculosis son por ejemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd fl4. DP , MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento WO 99/51748). Las proteínas para la M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas donde por lo menos dos, preferiblemente tres polipéptidos de M. tuberculosis están fusionados en una proteína mayor. Las typeáble H. influenzae, por ejemplo OMP26, adhesina de peso molecular alto, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (documento US 5,843,464) o varientes de copia múltiples o proteínas de fusión de los mismos.

Los derivados del antígeno superficial de la hepatitis B son bien ndicados en la técnica e incluyen, inter alia, los antígenos PreS1, PreS2 S indicados descritos en las solicitudes de Patente Europea EP-A-414 374; EP-A-0304 578 y EP 198-474. En uno aspecto preferido la formulación de vacuna de la invención comprende el antígeno VIH-1, gp120, especialmente cuando está expresado en las células CHO. En una modalidad adicional, la formulación de vacuna de la invención comprende gD2t como se definió anteriormente. En una modalidad preferida de la presente invención, las composiciones de vacuna comprenden el antígeno derivado del Virus del Papiloma Humano (HPV) considerado ser responsable de las verrugas genitales (HPV 6 o HPV 11 y otros), y los virus de HPV responsables del cáncer cervical (HPV16, HPV18 y otros). Las formas particularmente preferidas de vacuna profiláctica o terapéutica contra verruga genital, comprenden proteína L1 y prote ínas de fusión que comprenden uno o más antígenos selec cionados de las proteínas de HPV E1, E2, E5, E6, E7, L1 y L2. Las formas más preferidas de proteína de fusión son: L2E7 como se describe en el documento WO 96/26277, y la proteína D(1/3)-E7 descrita en el documento WO99/10375. Una infección cervical de HPV o cáncer preferido, profilaxis o composición de vacuna terapéutica pueden comprender los antígenos HPV 16 ó 18. Los antígenos HPV 16 particularmente preferidos comprenden las proteínas tempranas E6 o E7 en la fusión con un portador de proteína D para formar la Proteína D - fusiones E6 o E7 de HPV 16, o combinaciones de las mismas; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (documento WO 96/26277). Alternativamente las proteínas tempranas 16 ó 18 de HPV E6 y E7, pueden presentarse en una sola molécula, preferiblemente una Proteína D - fusión E6/E7. Tal vacuna opcionalmente puede contener cualquier proteína E6 y E7 de HPV 18, preferiblemente en la forma de una proteína D - E6 o proteína D - proteína de fusión E7 o Proteína D E6/proteína de fusión E7. La vacuna de la presente invención puede comprender adicionalmente antígenos de otras cepas de HPV, preferiblemente de cepas HPV 31 ó 33. Las composiciones de vacuna de la presente invención adicionalmente comprenden antígenos derivados de parásitos que causéin la Malaria, por ejemplo, antígenos de Plasmodia falcinarum incluyendo la proteína de circumsporozoita (proteína de ck), RTS,S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción C-terminal de la proteína de circumsporozoita (CS) de P. falciparum ligada vía cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno superficial de la hepatitis B al antígeno superficial (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la Solicitud de patente Internacional No. PCT/EP92/02591 , publicada bajo la prioridad reivindicada Número WO 93/10152 de la solicitud de patente Británica No. 9124390.7. Cuando se expresa en la levadura RTS se produce como una partícula de lípop'oteína, y cuando se co-expresa con el antígeno S de HBV se produce una partícula mezclada conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/GB89/00895, publicada bajo el documento WO 90/01496. Los antígenos de Plasmodia que son candidatos probéibles a ser componentes de una vacuna de Malaria de etapas múltiples son P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Secuestrina, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp. Una modalidad de la presente invención es una vacuna contra la malaria en donde la preparación del antígeno comprende la proteína RTS.S o CS o un fragmento de la misma tal como la porción CS de RTS,S, en combinación con uno o más antígenos de la malaria adicionales, cualquiera o ambos pueden unirse a la subunidad de toxina B Shiga de acuerdo con la invención. Uno o más antígenos de la malaria adicionales pueden seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste de MPS1, MSP3, AMA1, LSA1 o LSA3. Las formulaciones pueden también contener un antígeno antítujmoral y ser útiles para el tratamiento inmunoterapéutíco de cánceres. Por ejemplo, la formulación adyuvante encuentra utilidad con antígenos de rechazo del tumor tal como para los cánceres de próstata, mama, colorectal, pulmón, pancreático, renal o melanoma. Los antígenos ejemplares incluyen MAGE 1 y de MAGE 3 u otros antígenos MAGE (para el tratamiento del melanoma), PRAME, BAGE, o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde y colaboradores, International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentada en 1997); Corréale y colaboradores. (1997), Journal of the National Cáncer Institute 89, p 293. Actualmente estos antígenos se expresan en un ¡ntervalo amplio de tipos de tumores tal como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga. Otros antígenos de tumor específico son adecuados para uso con los adyuvantes de la presente invención e incluyen, pero no se restringen a gangliosidas de tumor específico, antígeno específico de próstata (PSA) o Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mamaglobina, MUC-1, antígeno carcinoembriónico (CEA) o p501S (prosteína). Por consiguiente en un aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende una composición adyuvante de acuerdo a la invención y un antígeno de rechazo del tumor. Es un aspecto particularmente preferido de la presente invención, que las vacunas comprendan un antígeno tumoral tal como cánceres de próstata, mama, colorectal, pulmón, pancreático, renal, ovárico o melanoma. Por consiguiente, las formu laciones pueden contener el antígeno de tumor-asociado, así como antígenos asociados con mecanismos de soporte al tumor (por ejemplo angiogénesis, invasión tumoral).

Adici bnalmente, los antígenos particularmente relevantes para las vacunas en la terapia del cáncer también comprenden el antígeno próst ata-específico de la membrana (PSMA), Antígeno de Células Madre de la Próstata (PSCA), tirosinasa, survivina, NY-ESO1, prostasa, PS108 (documento WO 98/50567), p501S (prosteína), RAGI?, LAGE, HAGE. Adicionalmente el antígeno puede ser una hormona peptídica por sí misma tal como la hormona de Gonadotrofina de longitud completa que libera la hormona (GnRH, documento WO 95/20600), un péptido largo de 10 aminoácidos corto, útil en el tratamiento de muchos cánceres, o en la inmunocastración Las vacunas de la presente invención pueden utilizarse para la prffilaxis o terapia de la alergia. Tales vacunas comprenderán antígenos específicos alérgenos, por ejemplo Der p1. La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induzca una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos, adversos en véicunas normales. Tal cantidad variará dependiendo de cual inmunogen específico se utilice y cómo se presente. Generalmente, se espera que cada dosis humana comprenda 0.1-1000 µg de antígeno, preferíblemente 0.1-500 µg, preferiblemente 0.1-100 µg, más preferiblemente 0.1 a 50 µg. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede comprobarse por estudios estándares que involucran la observación de inmunorespuestas apropiadas en sujetos vacunados. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones reforzadas adec jadamente espaciadas. Tal formulación de vacuna puede aplicarse a una superficie mucosa de un mamífero en un régimen de vacunación por imprimación o reforzado; o alternativamente adminístrese sistémicamente, por ejemplo vía las rutas transdérmica, subcutánea o intramuscular. Se prefiere la administración intramuscular. La cantidad de 3 D MPL usada es generalmente pequeña, pero dependiendo de la formulación de vacuna puede estar en la región de 1-1000 µg por dosis, preferiblemente 1-500 µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 a 100 µg por dosis. La cantidad de CpG o oligonucleótidos inmunoestimulantes en los adyuvantes o vacunas de la presente invención es gene almente pequeña, pero dependiendo de la formulación de vacuna puede estar en la región de 1-1000 µg por dosis, preferiblemente 1-500 µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 a 100 µg por dosis. La cantidad de saponina para uso en las composiciones de la presente invención puede estar en la región de 1-1000 µg por dosis, preferiblemente 1-500 µg por dosis, más preferiblemente 1-250 µg por dosis, y más preferiblemente entre 1 a 100 µg por dosis. Las formulaciones de la presente invención pueden usarse para los propósitos profilácticos y terapéuticos. Por consiguiente la invención proporciona una composición de vacuna como se describe en la presente para uso en medicina. En una modalidad adicional se proporciona un método de tratarniento de un individuo susceptible a o que sufre de una enfermedad medíante la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente. También se proporciona un método para evitar que un indivi dúo contraiga una enfermedad seleccionada del grupo que comp rende enfermedades infecciosas, bacterianas y virales, enfer medades parásitas, particularmente enfermedad patógena intracelular, enfermedades proliferativa tal como cánceres de próst ata, mama, colorectal, pulmón, pancreático, renal, ovárico o melanoma; trastornos crónicos no-cancerosos, alergia que comprende la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente al individuo. Además, se describe un método para inducir la inmuhorespuesta específica del antígeno CD8+ en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una composición de la invención. Además se proporciona un método para la fabricación de una vacuna que comprende mezclar un antígeno en combinación con un vector no-vivo o equivalente funcional inmunológico del mismo con un adyuvante. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para uso en las combinaciones de la presente invención incluyen, entre otros, agua, salina amortiguadora de fosfato, soluciones amortiguadoras isotónicas. La presente invención es ejemplificada por la referencia a los s guientes ejemplos y figuras. En todas las figuras, el adeno-ova (vector de adenovirus que contiene proteína OVA) se utilizó como un control positivo en la primera inyección. P/B (cebador/refuerzo) es un control positivo con la primera inyección de Adeno-Ova, y en segundo lugar, la inyección de refuerzo de Ova en AS A. Las siguientes figuras muestran el efecto del Sistema Adyuvante A en la inpnunorespuesta a LT-ova y LTcys-Ova Figura 1: respuesta de CD8 - tetrámero 6 días post 1 -frecuencia de CD8 específica de Sünfekl (% dentro de CD8 + ) ¡Figura 2: respuesta de CD8- tetrámero 14 días post 1 -frecuencia de CD8 específica de Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 3: respuesta de CD8- tetrámero 6 días post 2 frecuencia de CD8 específica de Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 4: respuesta de CD8- tetrámero 60 días post 2 -frecuencia de CD8 específica de Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 5: respuesta de CD8- tetrámero 88 días post 2 -frecuencia de CD8 específica de Siinfekl (% dentro de CD8 + ) [Figura 6: respuesta de CD8 - ICS: 14 días post 1 -frecuencia de CD8 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD8 + ) Figura 7: respuesta de CD8 - ICS: 6 días post 2 - frecuencia que produce citocina específica de ova (% dentro de Figura 8: respuesta de CD8 - ICS: 60 días post 2 -frecuencia de CD8 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD8 + ) Figura 9: respuesta de CD8 - ICS: 88 días post 2 -frecu encia de CD8 que produce citocina específica de ova (% dentr o de CD8 + ) Figura 10: CD4 respuesta - ICS: 14 días post 1 - frecuencia de C D4 que produce citocina específica de ova (% dentro de - ICS: 6 días post 2 - frecuencia específica de ova (% dentro de - ICS: 60 días post 2 - frecuencia específica de ova (% dentro de - ICS: 88 días post 2 - frecuencia específica de ova (% dentro de respuesta de CD8 - actividad citotóxica detectada in vivo 18H después de la inyección objetivo: 12 días post 2 - lisis específica Siinfekl (%) Figura 15: Respuesta humoral - ELISA - suero reforzado: título de anticuerpo específico anti-ova (14 post 2) Figura 16: Respuesta humoral - ELISA - suero reforzado: título de anticuerpo específico anti-LTcys (14 post 2) Figura 17: Respuesta humoral - ELISA - suero individual: título de anticuerpo específico anti-ova (14 post 2) Figura 18: Respuesta humoral - ELISA - suero individual: título de anticuerpo específico anti-LTcys (14 post 2) Las siguientes figuras muestran el efecto del Sistema Adyu ivante A en Da inmunorespuesía a LT-ova y LTcys-Ova purif cado. Figura 19: respuesta de CD8 - tetrámero 6 días post 1 -frecuencia de CD8 específica Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 20: respuesta de CD8 - tetrámero 14 días post 1 -frecuencia de CD8 específica Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 21: respuesta de CD8 - tetrámero 6 días post 2 frecuencia de CD8 específica Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 22: respuesta de CD8 - tetrámero 58 días post 2 frecuencia de CD8 específica Siinfekl (% dentro de CD8 + ) Figura 23: respuesta de CD8 - ICS: 6 días post 1 -frecuencia de CD8 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD8 + ) Figura 24: respuesta de CD8 - ICS: 14 días post 1 -frecuencia de CD8 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD8 + ) Figura 25: respuesta de CD8 - ICS: 6 días post 2 -frecuencia de CD8 que produce citocína específica de ova (% Figura 28: CD4 respuesta - ICS: 14 días post 1 - frecuencia de C D4 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD4 + Figura 29: CD4 respuesta - ICS: 6 días post 2 - frecuencia de C D4 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD4 + ) Figura 30: CD4 respuesta - ICS: 58 días post 2 - frecuencia de CD4 que produce citocina específica de ova (% dentro de CD4 + ) Figura 31 : respuesta de CD8 - actividad citotóxica detectada in vivió 18H después de la inyección objetivo: 21 días post 1 - lisis específica Siinfekl (%) Figura 32: respuesta de CD8 - actividad citotóxica detectada m v?v\ o 18H después de la inyección objetivo: 65 días post 2 - lisis específica Siinfekl (%) Figura 33: Respuesta humoral - ELISA - suero reforzado: título de anticuerpo específico anti-ova (22 post 2) Figura 34: Respuesta humoral - ELISA - suero reforzado: título de anticuerpo específico anti-LTcys (22 post 2) Las siguientes figuras muestran el efecto de Dos Sistemas adyuvantes A, H y G en la inmunorespuesta a StxB- I Figura 36: respuesta cinética de CD8 - análisis de tetrámero en diferentes puntos de tiempo (7post1, 14post1, 6post2, 58poi5t2) para un ¡ntervalo de dosis de ambos vectores (LT vs STxB) - frecuencia de CD8 específica Siinfekl (% dentro de CD8 + ) ¡Las siguientes figuras muestran el efecto del Sistema Adyuvante A en la inmunorespuesta contra el conjugado Siinfekl a Dos vectores alternativos. Figura 37: Frecuencia CD 8 específica Siinfekl en PBLs 7 días ¡después de la primera inyección con la vacuna AS A LTSiinfekl iFigura 38: Frecuencia CD 8 específica Siinfekl en PBLs 15 días después de la primera inyección con la vacuna AS A LTSiihfekl I Figura 39: Frecuencia CD 8 específica Síinfekl en PBLs 7 días después de la segunda inyección con la vacuna AS A LTSiinfekl Figura 40: Frecuencia CD 8 específica Siinfekl en PBLs 7 días después de la primera inyección con la vacuna Exo-A-Siinfekl AS A o LF-Siinfekl AS A Figura 41 : Frecuencia CD 8 específica Siinfekl en PBLs 14 días después de la primera inyección con la vacuna Exo-A-Siinfeikl AS A o LF-Siinfekl AS A Figura 42: Frecuencia CD 8 específica Siinfekl en PBLs 7 días después de la segunda inyección con la vacuna Exo-A-Siinfekl AS A o LF-Siinfekl AS A Ejemplo 1: Reactivos y medios 1.1 iPreparación de los recombinantes LTB, LTB-cys y LTÍ Siinfekl ILOS LTB, LTB-cys (SEC ID No. 7) y LTB-Siinfekl (SEC ID No. 8) que codifican las secuencias se amplificaron por PCR y clonaron en vectores de expresión pET para la expresión en E Coli. ' Un extracto de proteína total se obtuvo de una pelotilla bacteriana en OD(62o) 60 usando la prensa Francesa. Después de la 30 * centrifugación a 15000 g, el sobrenadante se cosechó y precipitó agregando (NH )2SO (4.95 g/10 ml) e incubando por al menos 4 horas a 4°C. La pelotilla de proteína se cosechó despujés de la centrifugación, se disolvió en PBS (4 veces de conce|ntración), y se díalizó intensivamente contra el mismo amortiguador. La fracción insoluble se eliminó mediante centrifugación y 0.22 µm de filtraciones. El sobrenadante clarificado se cargó en una columna de XK16/15 cm de longitud que contenía 15 ml de PBS preequilibrado inmovilizado de resina AACATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGG ATG AAGG ACA CATT AAG AATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTG ATAAATTATG TGT TGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGG CAATCAGTATG GAAAACTGCTAA S E C | D N o . 8 ATGA'ATAAAGTAAAATGTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCTC I TCTATGTGCATACGGAGCTCCCCAGTCTATTACAGAACTATGTTCG GAATATCGC AAC ACAC AAATATATACGATAAATGACAAGATACTAT CATATACGGAATCGATGGCAGGCAAAAGAGAAATGGTTATCATTA CATTTAAGAGCGGCGC AAC ATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGC AGTC AAC ATATAGACTCCCAAAAAAAAGCCATTGAAAGG ATG AAGG ACA CATTAAG AATCACATATCTGACCGAGACCAAAATTG ATAAATTATG TGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCGGCAATCAGTATG GAAAACAGCCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTG AATGGCGCGGCCGCTAG El vector LTB y LTB-cys (SEC ID No. 7) se conjugó al antígano de Ovalbúmina de pollo de longitud completa disponible comercialmente como se describe en las siguientes secciones y se formuló en ASA, ASH o ASG. El ITB-Siinfekl (SEC ID No. 8) recombinante se formuló directamente en el sistema adyuvante A indicado más adelante. Preparación del conjugado LTB/OVA El antígeno de Ovalbúmina de pollo de longitud completa disponible comercialmente (5 mg) se redujo exponiendo los grupos SH mediante el tratamiento de DTT durante 2 horas a temperatura ambiente. DTT se eliminó usando una columna PD10 (Sephadex G-25, Amersham) (elución con 2 mM de amortiguador de fosfato pH 6.8, fracciones de 1 ml). El vector LTB descrito antes (8 mg) se activó usando un exceso molar diez veces de SGME.S durante 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de SGMEiS se eliminó usando una columna PD10 (elución con 100 mM de amortiguador de fosfato pH 7.2, fracciones de 1 ml). Para la conjugación, las cantidades equimolares de Ovalbúmina reduc da (OVA-SH) y LTB activado se hicieron reaccionar durante 1 hor a a temperatura ambiente. La conjugación resultante se purificó mediante filtración molecular en una columna Sephacryl S-300 HR (elución con 100 mM de amortiguador de fosfato pH 6.8, fracciones de 1 ml). El conjugado de LTB/OVA entonces se formuló en el sistema adyuvante A indicado más adelante. Este producto se indica como LT-ova en las gráficas. Preparación del conjugado de LTB-cys/OVA El antígeno Ovalbúmina de pollo de longitud completa disponible comercialmente (10 mg) se activó usando un exceso molar 80 veces de SGMBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El exceso de SGMBS se eliminó usando una columna PD10 (elución con 1 ml de fracciones de amortiguador de DPBS I (NaCI 136.87 mM, KCl 2.68 mM, Na2HPO4 8.03 mM, KH2PO4 1.47 mM pÍH 7.5), fracciones de 1 ml). ¡Para la conjugación, las cantidades equimolar de LTB-cys y la Ovalbúmina activada se hicieron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. La conjugación resultante se purificó mediente filtración molecular en una columna Sephacryl S-300 HR (elución con amortiguador de DPBS, fracciones de 4 ml). La conjugación de LTB-cys/OVA entonces se formuló en el sistema adyuvante A indicado más adelante. Este producto se indica como LTcys-ova en las gráficas. Método para purificar la subunidad LTB de E. coli lisado: 1 I de pelotilla bacteriana OD(620) 50 en DPBS s/o amort iguador de CaMg se extrajo mediante la prensa Francesa; Después de la 30' centrifugación 5000 g, el sobrenadante se cosec hó y trató con 50000 u de benzonasa 1h a temperatura ambiente. La fracción insoluble se eliminó mediante centrifugación 30' 15000 g y 0.22 µm de filtración. El sobrenadante clarificado se cargó en la columna XK16/20 que contiene 20 ml de DPBS c/o resina de galactosa inmovilizada preec u ¡librada de amortiguador de CaMg, y se lavó con el mismo amortiguador con gotas de OD hasta el nivel básico. LTB es eluido por galactosa 1 M en DPBS c/o amortiguador de CaMg. Finalmente, LTB se dializa intensivamente contra DPBS c/o amortiguador de CaMg. Las endotoxinas se eliminan mediante la incubación de la resina Acticlean.

Preparación de STxB-Ova Tratada con adyuvante STxB se acopló a la Ovalbúmina de pollo de longitud completa: para permitir el acoplamiento químico de proteínas a un sitio definido del aceptador en STxB, una cisteína se agregó a C-terminal de la proteína tipo silvestre, produciendo STxB-Cys. La prote na STxB-Cys mutante recombinante se produjo como se describe previamente (Haicheur y colaboradores.; 2000, J. Immuhol.165, 3301). La concentración de endotoxina determinada por la prueba del análisis de Limulus fue por debajo de 0.5EU/ml. STxB ova se ha descrito previamente (HAICHEUR y colaboradores., 2003, Int. Immunol., 15, 1161-1171) y se propo rcionó amablemente por Ludger Johannes y Eric Tartour (Curie Institute) Preparación le LFn-Siinffekl LFn-OVA 161-291 recombinantes Se prepararon dos genes sintéticos que contenían los 255 aminoácidos amino terminal de la toxina Ántrax IF flanqueada por una cola 6 x His y cualquier secuencia de codificación Siinfekl o un fragmento de Ovalbúmina mayor que contenga este epítope (fragmento 161-291) (SEC ID No. 9 y 10, respectivamente). Los productos resultantes se clonaron en un vector de expresión pET para la expresión en E Coli. Las células se recuperaron mediante I centrifugación, se concentraron (25 a 40 x) y Usaron usando una prensa Francesa. Los agregados se disociados en urea 6 M duran|te la noche a 4°C. Para purificar las proteínas recombinantes, se agregaron 5 ml de resina Ni-NTA previamente equilibrada (Qiagen) al lisado, se incubaron 2 horas a 4°C en una ruedaj giratoria y se cargaron sobre una columna disponible de poliprep (BioRad). La columna se lavó tres veces con 15 ml de NaCI ¡300 mM, urea 6 M, imidazol 5 mM, amortiguador de fosfato 50 m|M pH8 antes de la elución con 4 x 2 ml del mismo amortliguador que contiene imidazol 500 mM. Las proteínas recup radas se visualizaron por SDS-Page, Coomassie manchado y Western blotting, y la urea se eliminó mediante diálisis. SEC ID No. 9 ATGGGCCACCATCACCATCACCATTCTTCTGGTGCGGGCG 40 GTCATGGTGATGTAGGTATGCACGTAAAAGAGAAAGAGAA 80 AAATAAAGATGAGAATAAGAGAAAAGATGAAGAACGAAAT 120 AAAACAC AG G AAG AGC ATTTAAAGGAAATC ATG AAAC ACA 1 60 TTGTAAAAATAGAAGTAAAAGGGGAGGAAGCTGTTAAAAA 200 AG AGGC AGC AGAAAAG CTACTTGAGAAAGTACCATCTGAT 240 GTTTTAGAGATGTATAAAGCAATTGGAGGAAAGATATATA 280 TTGTGGATGGTGATATTACAAAACATATATCTTTAGAAGC 320 ATT TCTG AAG ATAAGAAAAAAATAAAAGACATTTATGGG 360 AAAGATGCTTTATTACATGAACATTATGTATATGCAAAAG 400 AAGGATATGAACCCGTACTTGTAATCCAATCTTCGGAAGA 440 TTATGTAGAAAATACTGAAAAGGCACTGAACGTTTATTAT 480 GAAATAGGTAAGATATTATCAAGGGATATTTTAAGTAAAA 520 TTAATCAACCATATCAGAAATTTTTAGATGTATTAAATAC 560 C ATT AAAAATGCATCTGATTCAG ATGG ACAAGATCTTTTA 600 TTTACTAATCAGCTTAAGGAACATCCCACAGACTTTTCTG 640 TAG GTTCTTGGAACAAAATAG CAATGAGGTACAAGAAGT 680 ATTTGCGAAAGCTTTTG CATATTATATCGAGCCACAGCAT 720 CGTGATGTTTTACAGCTTTATGCACCGGAAGCTTTTAATT 760 ACAT GGATAAATTTAACG AAC AAG AAATAAATCTATCCGG 800 ATCCCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACT 840 GAATG GTGA 849 SEC D No . 1 0 ATG GGCC ACC ATC ACC ATC ACC ATTCTTCTGGTGCGGGCG 40 GTCATGGTGATGTAGGTATGCACGTAAAAGAGAAAGAGAA 80 AAATAAAGATGAGAATAAGAGAAAAGATGAAGAACGAAAT 1 20 AAAACACAG G AAG AGCATTTAAAGGAAATCATG AAAC ACA 1 60 TTGTAAAAATAGAAGTAAAAGGGGAGGAAGCTGTTAAAAA 200 AGAfGCAGCAGAAAAG CTACTTGAGAAAGTACCATCTGAT 240 GTTTTAGAGATGTATAAAGCAATTGGAGGAAAGATATATA 280 TTGTGGATGGTGATATTACAAAACATATATCTTTAGAAGC 320 ATT TCTG AAG ATAAGAAAAAAATAAAAGACATTTATGGG 360 AAAGATGCTTTATTACATGAACATTATGTATATG CAAAAG 400 AAGGATATGAACCCGTACTTGTAATCCAATCTTCGGAAGA 440 TTATGTAGAAAATACTGAAAAGGCACTGAACGTTTATTAT 480 GAAATAGGTAAGATATTATCAAGG GATATTTTAAGTAAAA 520 TTAATCAACCATATCAGAAATTTTTAGATGTATTAAATAC 560 C ATT AAAAATGCATCTGATTCAG ATGG ACAAGATCTTTTA 600 TTTACTAATCAGCTTAAGGAACATCCCACAGACTTTTCTG 640 TAG GTTCTTGGAACAAAATAG CAATGAGGTACAAGAAGT 680 ATTTGCGAAAG CTTTTG CATATTATATCGAGCCACAGCAT 720 CGTGATGTTTTACAGCTTTATG CACCGGAAGCTTTTAATT 760 ACAT GGATAAATTTAACG AAC AAG AAATAAATCTATCCGG 800 ATCC GTCCTTCAGCCAAGCTCCGTGGATTCTCAAACTGCA 840 ATGGTTCTGGTTAATGCCATTGTCTTCAAAGGACTGTGG G 880 AGAAAACATTTAAG GATG AAG ACACACAAGCAATGCCTTT 920 CAG GTG ACTG AG C AAG AAAGCAAACCTGTGCAG ATG ATG 960 TACOAGATTG GTTTATTTAGAGTGGCATCAATGG CTTCTG 1 000 AGAAAATGAAGATCCTG GAGCTTCCATTTG CCAGTGGGAC 1 040 AATGAGCATGTTGGTGCTGTTG CCTG ATG AAGTCTC AGG C 1 080 CTTGAGCAG CTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGA 1 1 20 CTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAAGAGAGGAAGAT 1 1 60 CAAAGTGTACTTACCTCGCATGAAGATGGAGGAAAAATGA 1 20 Los IFn-Siinfekl (SEC ID No. 9) y LFn-OVA161'291 (SEC ID No. 10) recombinantes entonces se formularon en el sistema adyuvante A indicado más adelante. LFn-Siinfekl se indica como LFSiinfekl en las gráficas. 1.3 Preparación de ExoA-Siinfekl recombinante Un gene sintético se preparó (SEC ID No. 11 - ver más adelante) que corresponde a una forma no tóxica de la Exotoxina A (e iminación de E553), en la cual se introduce el epítope Siinfekl de modo que sustituya la mayoría del dominio Ib de la toxina. El producto resultante se clonó en un vector de expresión pET y se expresó en E. coli. La proteína recombinante después se extrajo de los cuerpos de inclusión y se purificó esencialmente como se describe en FitzGeraid y colaboradores., J Biol Chem 273, ¿951, 1998. ! SEC D No. 11 ATGGCCGAGGAAGCCTTCGACCTCTGGAACGAATGCGCCAAAGC CTGCGTGCTCGACCTCAAGGACGGCGTGCGTTCCAGCCGCATGA GCGTCGACCCGGCCATCGCCGACACCAACGGCCAGGGCGTGCTG CACTACTCCATGGTCCTGGAGGGCGGCAACGACGCGCTCAAGCT GGCCATCGACAACGCCCTCAGCATCACCAGCGACGGCCTGACCA TCCGCCTCGAAGGCGGCGTCGAGCCGAACAAGCCGGTGCGCTAC AGCTACACGCGCCAGGCGCGCGGCAGTTGGTCGCTGAACTGGCT GGT CCGATCGGCCACGAGAAGCCCTCGAACATCAAGGTGTTCAT CCACGAACTGAACGCCGGCAACCAGCTCAGCCACATGTCGCCGA TCTACACCATCGAGATGGGCGACGAGTTGCTGGCGAAGCTGGCG CGCGATGCCACCTTCTTCGTCAGGGCGCACGAGAGCAACGAGAT GCAGCCGACGCTCGCCATCAGCCATGCCGGGGTCAGCGTGGTCA TGGCCCAGACCCAGCCGCGCCGGGAAAAGCGCTGGAGCGAATG GGCCAGCGGCAAGGTGTTGTGCCTGCTCGACCCGCTGGACGGGG TCT?CAACTACCTCGCCCAGCAACGCTGCAACCTCGACGATACCT GGG?AGGCAAGATCTACCGGGTGCTCGCCGGCAACCCGGCGAAG CATGACCTGGACATCAAACCCACGGTC ATC AGTC ATCGCCTGCAC TTTCJCCGAGGGCGGCAGCCTGGCCGCGCTGACCGCGCACCAGG CTTG CC ACCTG CCGCTGGAGACTTTCACCCGTCATCGCCAGCCG CGCGGCTGGG AAC AACTGGAGCAGTGCGGCTATCCGGTGC AGCG GCTGGTCGCCCTCTACCTGGCGGCGCGGCTGTCGTGGAACCAGG TCGACCAGGTGATCCGCAACGCCCTGGCCAGCCCCGGCAGCGGC GGCG ACCTG GGCG AAG CG ATC CGCG AGC AGCCGGAGCAGGCCC GTCTJG GCCCTGACCCTG GCCG CCGCCG AG AGCG AGCGCTTC GTC CGGCAGGGCACCGGCAACGACGAGGCCGGCGCGGCCAACCTGC ACTGCCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATG GTGGATGCAGGGCCCGGCGGACAGCGGCGACGCCCTGCTGGAG CGC^ACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGA CGTCAGCTTCAGCACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGC GGCTGCTCCAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTG TTCGJTCGGCTACCACGGCACCTTCCTCGAAGCGGCGCAAAGCAT CGTCTTCGGCGGGGTGCGCGCGCGCAGCCAGGACCTCGACGCG ATCTGGCGCGGTTTCTATATCGCCGGCGATCCGGCGCTGGCCTA CGGCJTACGCCCAGGACCAGGAACCCGACGCACGCGGCCGGATC CGCAIACGGTGCCCTGCTGCGGGTCTATGTGCCGCGCTCGAGCCT GCCGGGCTTCTACCGCACCAGCCTGACCCTGGCCGCGCCGGAGG TCGÁCCCGTCCAGCATCCCCGAC AAGG AAC AGGCGATCAGCGCC CTGGCGGACTACGCCAG CCAG CCCGGCAAACCGCCGCGCG AGG i ACC GAAGTGA lEI ExoA-Siinfekl recombinante (SEC ID No. 11) entonces se formuló en el sistema adyuvante A indicado más adelante. 1.4 Análisis de unión de galactosa El receptor GM1 de preferencia reconocido por la subunidad B de, las toxinasLT es una monosialogangliosida de superficie celular (Gal(ß1 -3)GalNAc(ß1 -4)(NeuAc(a2-3))Gal(ß1 -4)Glc(ß1 -1)cerámida), donde Gal es galactosa, GalNAc es N-acetilgalactosamina, NeuAc es ácido acetilneuramínico y Gle es glucoea. El método descrito más adelante involucra una cromajtografía de afinidad en un gel de agarosa unido a galactosa disponible comercialmente (Pierce). La galactosa es la porción de carbohidrato terminal de la porción de oligosacárido de GM1 y se desea para representar la estructura mínima reconocida por la subunidad B de la toxina LT (Sixma y colaboradores Nature 355 (1992), p. 561). Este método se utiliza para purificar la subunjidad B de ¡a toxina LT directamente del lisado de E coli (ver más adelante): puede por lo tanto asumirse que el análisis de unió? de galactosa puede utilizarse para identificar proteínas que unen el receptor GM 1. La proteína de interés (en DPBS c/o amortiguador de CaMg) se cargó bombeando en una columna XK16/20 (Amersham Biosoiences) empaquetada con 12 ml de resina de D-Galactosa inmovilizada (Pierce) previamente equilibrada en el mismo amorl iguador. Por lo menos 3 volúmenes del lecho de DPBS c/o amorliguador CaMg después se pasaron a través de la columna a una velocidad de flujo de operación de 0.5 ml/min. Después del lavadjo, la proteína de unión se eluyó de la resina con un flujo de D-galactosa 1 M (en DPBS c/o amortiguador de CaMg). Las fracciones 1-ml se recolectaron durante el lavado y la elución se anal¡2:ó por SDS-Page, Coomassie manchado y Western blotting.

Estas técnicas analíticas permiten la identificación de si la i proteíina está unida a la galactosa, y por lo tanto unirán el receptor GM1. Las fracciones que contienen la proteína de interés pueden combinarse y dializarse contra DPBS c/o amortiguador CaMg para eliminarse la D-galactosa. 1.5 Análisis de unión de GaOabiosa i El receptor Gb3 de preferencia reconocido por la subunidad B de a toxina Shiga es un glicosfingolípido de superficie celular, globol riaosilceramida (Galal -4Galß1 -4 glucosilceramida), donde Gal es galactosa. El método descrito más adelante se basa en el descrito por byTarrago-Trani (Protein Extraction y Purification 38, pp 170- 176, 2004), e involucra una cromatografía de afinidad en un gel de agarosa unido a galabiosa disponible comercialmente (calb ochem). La galabiosa (Galal ->4Gal) es la porción de carbohidrato terminal de la porción de oligosacárido de Gb3 y se desea por representar la estructura mínima reconocida por la subunidad B de la toxina Shiga. Este método se ha utilizado exitosamente para purificar la toxina Shiga directamente del Usado de E. coli. Por lo tanto puede asumirse que las proteínas que unen esta porción unirán el receptor Gb3. La proteína de interés en el amortiguador de PBS (500 µl) se mezcla con 100 µl de la resina de galabiosa inmovilizada (Calbiochem) equilibrada previamente en el mismo amortiguador, e incubada durante 30 minutos a 1 hora a 4°C en una rueda giratoria. Después de una primera centrifugación a 5000 rpm durante 1 minuto, la pelotilla se lavó dos veces con PBS. El material de unión entonces se eluyó dos veces volviendo a suspender la pelotilla final en 2 x 500 µl de glicina 100 mM pH 2.5. Las muestras que corresponden al flujo pasante, los lavados combinados y los eluyentes combinados entonces se analizaron por SDS-Page, Coomassie manchado y Western blotting. Estas técnicas analíticas permiten la identificación de si la proteína está unida a la galabiosa, y por lo tanto unirá el receptor Gb3. 1.6 Preparación de sistemas adyuvantes 1.6.1 ['reparación del' sistema adyuvante A: QS21 y 3D-MPL. Una mezcla de lípido (tal como fosfatidilcolina de la yema de huevo o sintética) y colesterol y 3 D-MPL en solvente orga? ico, se secó bajo vacío (o alternativamente bajo una corriente de gas inerte). Una solución acuosa (tal como salina amor ¡guada de fosfato) entonces se agregó, y el recipiente se agitó hasta que todo el lípido estuvo en suspensión. Esta suspensión entonces se sometió a microfluidizado hasta que el tamaño de liposoma se redujo a aproximadamente 100 nm, y después se esterilizó filtrando a través de un filtro de 0.2 µm. La extrusión o sonicación puede sustituir esta etapa. Normalmente la relación colestero fosfatidilcolina fue 1:4 (p/p), y la solución acuosa se agregó para dar una concentración de colesterol final 5 a 50 mg/ml. Las liposomas tienen un tamaño alrededor de 100 nm. Las liposomas por sí mismas son estables durante cierto tiempo y no tienerji ninguna capacidad fusogénica. La cantidad estéril de liposomas se mezcló con QS21 en la solución acuosa con una proporción chol/QS21 ¡gual a 5/1 (p/p). Esta mezcla se refiere I como | DQMPLJn. La DQMPLJn entonces se diluye en PBS para llevar¡a cabo una concentración final de 10 µg/ml de 3D-MPL. La composición de PBS fue PO4: 50 mM; NaCI: 100 mM pH 6.1.

Entonces se agregó vector no-vivo. Entre cada adición del componente, el producto intermediario se agitó durante 5 minutos.

El pH¡ se comprobó y ajustó si era necesario a 6.1 +/- 0.1 con NaOH! o HCl. El volumen de la inyección de 50 µm correspondió a una dosis de antígeno determinada (dosis alta descrita en la tabla siguí é nte), 05 µg de 3 D-MPL y QS21 y 5 µg de CpG. Estas form laciones entonces se diluyeron en una solución de 3D-MPL y de QS21 (en una concentración de 10 y 10 µg/ml respi ctivamente) para obtener intervalos-dosis de antígeno como se de scribe en la tabla. Antígéno Intervalo-dosis de MPL(µg) QS21 Muestra en antígeno (µg) la figura LF-OVA (161-91) 5, 1 y 0.2 0.5 0.5 LF-Siinfekl 5, 1 y 0.2 0.5 0.5 40 a 42 LT OVA 2, 1 y 0.5 0.5 0.5 1 a 35 LT-Cy -OVA 2, 1 y 0.5 0.5 0.5 1 a 18 LT-Cyte-OVA-Gal 2, 1 y 0.5 0.5 0.5 19 a 34 ExoA Siinfekl 5, 1 y 0.2 0.5 0.5 40 a 42 LT-Siihfekl 1,0.1 y 0.05 0.5 0.5 39 1.6.2 Sistema adyuvante G: CpG2006 El CpG a granel estéril se agregó a la solución de PBS o NaCI 150 mM para llevar a cabo una concentración final de 100 µg/m ^l antígeno entonces se agregó para llegar a una concentración final de 10 µg/ml. El CpG usado fue 24-mers con la siguiente secuencia 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEC ID No. 4). Entre cada adición del componente, el producto intermediario se agitó durante 5 minutos. El pH se comprobó y ajustó|si es necesario a 6.1 a +/- 0.1 con NaOH o HCl.

El volumen de inyección de 50 µm corresponde a 0.5 µg de cada uno de los vectores conjugados (LT-OVA y StX-OVA) y 5 µg de CpG (). Los datos se muestran en la figura 35 y 36. 1.5.3 Sistema adyuvante H: QS21, 3D-SVIPL y CpG2006 El CpG a granel estéril se agregó a la solución de PBS para llevar a cabo una concentración final de 100 µg/ml. La composición de PBS fue PO4: 50 mM; NaCI: 100 mM pH 6.1. Los antígenos entonces se agregaron para alcanzar una concentración final de 20 µg/ml. Finalmente, QS21 y 3 D-MPL se agregjaron como una premezcla de liposomas a granel estériles que contienen 3 D-MPL y QS21 referidos como DQMPLin para alcanzar las concentraciones de 3D-MPL y QS21 finales de 10 µg/mlL El CpG usado fue 24-mers con la siguiente secuencia 5'- TCG tCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (SEC ID No. 4). Entre i cada ¡adición del componente, el producto intermediario se agitó durante 5 minutos. El pH se comprobó y ajustó si es necesario a 6.1 a '+/- 0.1 con NaOH o HCl. El volumen de la inyección de 50 µm correspondió a 1 µg de los vejctores conjugados (LT-OVA y STX-OVA), 0.5 µg de 3 D-MPL i y QS21 y 5 µg de CpG. Estas formulaciones entonces se diluyejron en una solución de 3D-MPL/QS21 y CpG (a una concentración de 10, 10 y 100 µg/ml respectivamente) para obtener dosis de 0.5, 0.1 y 0.02 µg de antígeno, (estas formul|aciones usadas para los experimentos mostrados en las figuras 35 y 36).

Ejemplo 2; vacunación de ratones C57/B6 con vacunas de Da nvención: Las formulaciones descritas antes se utilizaron para vacunar ratones hembra (H2Kb) de 6-8 semanas de edad C57BL/B6, (10/grupo). Los ratones recibieron dos inyecciones espaciadas 14 días aparte y se sangraron en los puntos de tiempo específico entre la semana 1 y la semana 12 como se indica en las gráficas. Los ratones se vacunaron intramuscularmente (inyección en el múscilo gastrocnemio izquierdo de un volumen final de 50 µm) con formulación ex-tiempo. El adenovirus recombinantes antigenico se inyectó en una dosis de 108 a 5.108VP. En varios puntos de tiempo después de la inmunización, varias lecturas-externas inmunológicas se realizaron como se describe más adela nte. 2.1 Ensayos inmunológicos: PRINCIPIO TECNOLÓGICO • PRINCIPIO DEL TETRAMERO: ?l ensayo del tetrámero es la medida de la frecuencia del TCD8 epítope-específico mediante citometría de flujo. Este procedimiento tiene la ventaja de analizar células linfoides sin ninguna etapa de cultivo in vitro. Las células linfoides se incubéiron con un anticuerpo anti-CD8 así como con un tetrámero de péptido/MHC (que contiene los péptidos SIINFEKL inmun Ddominantes unidos al tetrámero H-2Kb, un complejo capaz de la unión de TCR específica), ambos fluoro-marcados. Los resultados se expresan como frecuencia del linfocito T tetrámero + CD8+ dentro de la población de células TCD8 + . PRINCIPIO DE ICS: El ICS (Intracellular Cytokine Staining (Manchado de Citocina Intracelular)) es la tecnología que permite la cuantificación de los linfocitos T específicos de antígenos en base de la producción de citocina. Las células linfoides son 18H reestlmuladas m vitro con el péptido(s) en presencia de un inhibidor de secreción (brefeldina). Estas células entonces son procesadas por el procedimiento de inmunofluorescencia convencional usando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFNg, IL2 ylTNFa). Los resultados se expresan como frecuencia de la célula positiva de citocina dentro las células T CD4 y CD8. • PRINCIPIO DE CMC CMC in vivo (detección de Citotoxicídad Mediada de Células in vivo) es un ensayo que supervisa la actividad citotóxica específica del antígeno sin ninguna manipulación de la célula ejecutora. Se confía en la inyección intravenosa de dos poblaciones celulares marcads CFSE - células marcadas control y objetivo células pulsadas con el péptido de unión de MHC clase I derivado del antígeno - en la corriente sanguínea de animales vacunados (Aichele y colaboradores. 1997). Los objetivos son célula s linfoides de ratones na'ive que son marcados con 2 difereihtes concentraciones de CFSE. 18H después de la inyecc ¡ón de células objetivo, los ratones se sacrifican, la muestra de sangre de ratones vacunados se recolecta. Los PBLs entonces se analizan usando citometría de flujo. El porcentaje de activ dad citotóxica es calculado considerando el número de objetivos específicos del antígeno sobreviviente comparado con el objetivo control no específico. Más precisamente, el análisis de FACS en parámetros dados del histograma tal como M1 y M2 que son respectivamente el número de objetivos no específicos (-) y objet vos específicos ( + ). El porcentaje de lisis específico del péptido se calcula como sigue: ' objetivo específico corregido (+) ¡Lisis % = roo - ( X ,oo) l objetivo control no especifico (-) objetivo Ojetiyo corregido* = ; preiny . -) (preiny .. ) lEI objetivo corregido ( + ) = número de FACS objetivo del péptido pulsado adquirido después de la inyección in vivo, "normalizado" con respecto a las células objetivo preinyectadas. preiny. = mezcla del objetivo pulsado del péptido ( + ) y FACS no pulsado (-) adquirida antes de la inyección in vivo. PROTOCOLOS DETALLADOS (modelo Ova) o Recolección del órgano o aislamiento de PBLs La sangre se tomó de la vena retro-orbital (50 µm por ratón, 10 ratones por grupo) y diluida directamente en medio de RPMl + hepar na 1/10 (LEO). PBLs se aislaron con un gradiente de linfop ep (CEDERLANE). Las células después se lavaron, contéiron y finalmente se volvieron a suspender en dilusión ad hoc en un amortiguador ad hoc (ver más adelante). Aislamiento de Da célula del bazo Brevemente, las células totales se extrajeron por intepiupción del bazo, las células entonces se volvieron a suspender dentro de un volumen mayor de RPMl (5 bazos en 35 ml). Las células del bazo se aislan a través de un gradiente de linfoprep (CEDERLANE). Los linfocitos entonces se lavaron, se contaron y finalmente se volvieron a suspender en dilusión ad hoc en un amortiguador ad hoc (ver más adelante) lavado, o Aislamiento de células del nodo linfático ¡Brevemente, las células totales se extrajeron por la interrupción de los nodos linfáticos drenados. Estas células se lavaron cuidadosamente dos veces, se contaron y finalmente se volvieron a suspender en dilusión ad hoc en un amortiguador ad hoc (ver más adelante) lavado. ° Lectura Dnmunológica o TETRAMERO El aislamiento de PBLs y el método de manchado del tetrárr¡?ero es el siguiente: la sangre se tomó de la vena retro-orbita (50 µm por ratón, 10 ratones por grupo) y se diluyó directamente en medio de RPMl + heparina (LEO). PBLs se aislaron a través de un gradiente de linfoprep (CEDERLANE). Las células después se lavaron, contaron y finalmente 1-5 105 célula s se volvieron a suspender en 50 µm de amortiguador FACS (PBS, FCS 1%, 0.002% de NaN3) que contienen el anticuerpo CD16/CD32 (BD Biosciences) en 1/50 de concentración final (f e). Después de 10 minutos, 50µm de la mezcla del tetrámero se agregó a la suspensión celular. La mezcla del tetrámero contiene 1 µm de tetrámero-PE Siinfekl-H2Kb de Immunomics Coulter. Anti-CD8a-PercP (1/100 f.c.) y anti-CD4-APC (1/200 f.c.) (BD Biosoiences), los anticuerpos también se agregaron en la prueba. Las células entonces se dejaron durante 10 minutos a 37°C antes de lavarse una vez y se analizaron usando un FACS Calibur™ con software CELLQuest™. 3000 eventos en la barrera de CD8 vivos se ad ¡quirieron por prueba o ¡MANCHADO DE CITOCINA INTRACELULAR (ICS). ¡El ICS se realizó en muestras de sangre tomadas como se describen antes. Este análisis incluye dos etapas: estimulación ex de| vivo y manchado. La estimulación del linfocito ex-vivo se realizó en el medio completo que es RPMl 1640 (Biowitaker) complementado con 5% de FCS (Harían, Holanda), 1 µg/ml (mezcjla:1/500) de cada anticuerpo anti-ratón CD49d y CD28 (BD, Biosciences), 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 10 µg/ml¡de sulfato de estreptamicina, 10 unidades/ml de sodio de penicijlina G (Gibco), 10 µg/ml de estreptomicina, 50 µM de B-merca|ptoetanol y 100X de aminoácidos no-esenciales diluidos, todos i estos aditivos son de Gibco Life technologies. Las estimulaciones del péptido se realizaron siempre a 37°C, 5% de CO2. 1. I Estimulación ex vivo: Modelo Ova: 5 a 105 de PBLs se volvieron a suspender en medi? completo complementando un conjunto de 17 péptidos 15-mer ova (que comprenden 11 péptidos restringidos del MHC clase I diferentes y 6 péptidos restringidos del MHC clase II aquí nombrados conjunto 17) presente en una concentración de cada 1 µg/ml (= 1/5000 en mezcla). Después de 2 horas, 1 µg/ml (1/50 en mezc a) Brefeldin-A (BD, Biosciences) se agregó durante 16 horas y las células se recolectaron después de un total de 18 horas. 2. Mane hado: Las células se lavaron una vez después se mancharon con anticuerpos anti-ratón todas adquiridas de BD, Biosciences; todas las otras etapas se realizados en hielo. Las células primero se incubaron durante 10 minutos en 50 µm de solución CD16/32 (1/50 f.c, amortiguador FACS). Se agregaron 50 µm de la mezcla marcada de superficie de células T (1/100 f.c. CD8a perCp, 1/100 f.c.CD4 APC Cy7) y las células se incubaron durante 20 minutos antes de lavarse. Las células se fijaron y permeabilizaron en 200 µm de solución perm/fijado (BD, Biosciences), se lavaron una vez en a mortiguador perm/lavado (BD, Biosciences) antes de mancharse a 4°C con anti IFNg-APC (1/50), anti-TNFa-PE (1/100) y anti IL2-FITC (1/50) durante 2 horas o durante la noche. Los datos se analizaron usando un FACS Calibur™ con software CELLQuest™. 3000 eventos en la barrera de CD8 vivos se adquirieron por prueba. o CÉLULA MEDIADA POR ACTIVIDAD CITOTOXICA DETEiCTADA IN VIVO (CMC in vivo) Para determinar la citotoxicidad de Sunfekl-específica, se inmuniza y los ratones control se inyectan con una mezcla de objet vos pulsados y no pulsados El pulso objetivo es obviíimente diferente de acuerdo al modelo anttigénico mien ras el etiquetado objetivo es idéntico para todo el modelo antigénico. Modelo Ova: la mezcla del objetivo consiste de 2 poblaciones de esplenocito y linfoide singenéticos de CFSE-marcado de un modo diferente, cargadas o no con 1 ng/ml del péptido Snnfekl un péptido 8-mers conocido por ser epítope restppgido de clase I inmuno-dominante ¡Para el etiquetado de un modo diferente, carboxifluorescema succinimidil éster (CFSE, Molecular Probes - Palmoski y colaboradores, 2002, J Immunol 168, 4391-4398) se utilizo en una concentración de 02 µM ó 2 5 µM Ambos tipos de objetivos se reunieron en una proporción 1/1 y se volvió a suspender en una concentración de 1 O8 objetivos/ml 200 µm del objetivo mezclado se inyectaron por ratón en la vena de la cola en unjpunto de tiempo definido La citotoxicidad se determinó por el análisis de FACSR en la sangre (vena yugular) o bazo tomado del animal sacrificado 18 H después de la inyección del objetivo) La lis s del porcentaje promedio de las células objetivo Snnfekl-cargadas se calculó con relación a los controles antígeno- (premy-) objetivo corregido + = objetivo + x (preiny +) Células objetivo pre-inyectadas = mezcla de objetivos de pépti do-pulsado (preiny. + ) y no pulsado (preiny.-) objetivos adqu ridos por FACS antes de la inyección in vivo. El objetivo corregido ( + ) = número de objetivos de péptido-pulsado adquirido por FACS después de la inyección in vivo, corregido para considerar el número de células preiny+ en la mezcla preinyectada (ver antes) o Título de anticuerpo específico AG (análisis del suero i reunido o suero individual de IgG total): ELISA. El análisis serológico se determinó 15 días después de la segunda inyección. Los ratones (10 por grupo) se sangrados por picadura retro-orbital. Las placas que se utilizaron fueron placas de 96 pozos (NUNC, placas Immunosorbant), su revestimiento es diferente de acuerdo al modelo de antígeno: ¡El IgG total de anti-ova y anti-LTcys se midió por ELISA.

Las placas de 96 pozos se cubrieron con el antígeno durante la noche a 4°C (50 µm por pozo de soluciones del antígeno respejctivamente ova 10 µg/ml y LTxB-cys 2 µg/ml en PBS). Las placas después se lavaron en amortiguador (PBS / 0.1 de Tween 20 (Merck) y se saturó con 100 µm ó 200 µm de amortiguador de saturación (PBS / 0.1% de Tween 20 / 1% de BSA 10% de FCS) durante 1 hora a 37°C. Después de 3 lavados adicionales en el amortiguador de lavado, se agregaron 50 µm o 100 µm (función del modelo) o suero de ratón diluido y se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Después de otros tres lavadlos, las placas se incubaron durante otras 37 horas a 37°C con IgG total de anti-ratón biotinilado diluido 1000 veces en amortiguador de saturación. Después de la saturación las placas de 96 pozos se lavaron otra vez como se describe antes. Revelación de ELISA de anti-Ova Las placas después se lavaron en amortiguador de lavado (PBS / 0.1% de Tween 20 (Merck)) y se saturaron 100 µm ó 200 µm de amortiguador de saturación (PBS / 0.1% de Tween 20 / 1% de BSA / 10% de FCS) durante 1 hora a 37°C. Después de 3 lavados adicionales en el amortiguador de lavado, se agregaron 50 µm (función del modelo) de suero de ratón diluido y se incubaron durante 60 minutos a 37°C. Después de otros tres lavados, las placas se incubaron por otra hora a 37°C con IgG total de anti-ratón biotinilado diluidas 1000 veces en amortiguador de saturación. Después de la saturación las placas de 96 pozos se lavaron otra vez como se describe antes. Se agregó una solución de estreptavidina-peroxidasa (Amersham) diluida 1000 veces en amortiguador de saturación, 50 µm por pozo. El último lavadp fue un lavado de 5 etapas en amortiguador de lavado. Finalmente, se agregaron 50 µm de TMB (3, 3', 5, 5'- tetrarnetilbencidina en una concentración de amortiguador acídico de H2O2 es 0.01% - BIORAD) por pozo y las placas se mantuvieron en oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para detener la reacción, se agregaron 50 µm de H2SO4 0.4N por pozo. La absorbencia se leyó en una longitud de onda de 450/630 nm por un lector de placa de Elisa de BIORAD. Los resultados se calcularon usando el software softmax-pro. B. Revelación de ELISA de anti-LTxBcys Las placas después se lavaron en el amortiguador de lavado (PBSe 0.1% de Tween 20 (Merck)) y se saturaron con 100 µm ó 200 µm de amortiguador de saturación (PBS / 0.1% de Tween 20 / 1% BSA / 10% de FCS) durante 1 hora a 37°C. Después de 3 lavadlos adicionales en el amortiguador de lavado, de agregaron 100 µm del suero de ratón diluido y se incubaron durante 60 minut|os a 37°C. Después de otros tres lavados, las placas se incubaron durante otra hora a 37°C con IgG total de anti-ratón biotinjilado diluido 1000 veces en amortiguador de saturación. Después de la saturación las placas de 93 pozos se lavaron otra vez como se describe antes. Se agregó una solución de estreptavidina-peroxidasa (Amersham) diluida 2000 veces en amortiguador de saturación, 100 µm por pozo. El último lavado fue un lavado de 5 etapas en amortiguador de lavado. Finalmente, se agregaron 100 µm de OPDA (se agregaron extemlporal 37.5 µm de Citrato de Na - 0.05% de Tween - pH 4.5 + 15 Img de OPDA + 37.5 µm de H2O2) por pozo y la placa se mantjvo en oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minulos. Para detener la reacción, se agregaron 100 µm de H2SO4 2N por pozo. La absorbencia se leyó en una longitud de onda de 490/630 nm por un lector de placa de Elisa de BIORAD. Los resultados se calcularon usando el software softmax-pro. Resultados Los resultados descritos más adelante muestran que usando cualquiera de LT-ova, LTcys-ova o LTSiinfekl, la eficacia de un sistema de vector no vivo en inducir las respuestas de CD8 puede mejorarse combinándolo con el sistema adyuvante A, H o G. Evaluación de Da respuesta con el sistema adyuvante A Las Figuras 1 a 5 y 19 a 22 muestran la respuesta de CD8 + a Ova cuando se conjuga a LT o LTcys con y sin el adyuvante ASA. j Las gráficas muestran que una inmunorespuesta mejorada Las Figuras 6 a 9 y 23-26 muestran que las frecuencias de células T CD8+ que producen citocina del antígeno-específico se incrementan cuando la ovalbúmina se conjuga al vector LTB o LTBcys e inyectado en combinación con el adyuvante ASA con respecto a la respuesta inducida por la ovalbúmina conjugada sola o la ovalbúmina no-vectorizada administrada con el sistema adyuvante A. Esta mejora es más marcada los 6 a 60 días después de la segunda inyección (figuras 7 y 8). Las figuras 10-13 y 27-30 ¡lustran las células T CD4 + mejoiadas cuando el antígeno vectorizado se utiliza en combinación con ASA comparado con las composiciones no-vectorizadas o no-tratadas con adyuvantes. El porcentaje más mejorado de células T CD4+ específicas de Ova se ven 14 días después de la primera inyección (figuras 10 y 28) y 6 días después de la segunda inyección (figuras 11 y 29). Las Figuras 14, 31 y 32 muestran que la actividad citotóxica de Siinfekl-específica detectada in vivo está mejorada cuando el antígeno es vectorizado y administrado con un adyuvante como se probo 21 días después de la primera inyección (figura 31) o 12 (figura 14) o 65 (figura 32) días después de la segunda inyección.

¡Las figuras 15, 17 y 33 muestran a respuesta humoral a Ova 14 días después de la segunda inyección. La respuesta del anticuerpo contra ova detectada solamente cuando el antígeno vectorizado es tratado con adyuvante. No se observa ninguna respuesta mejorada del anticuerpo contra ova cuando el antígeno se conjugó a LT o LTcys y se administrado con el ASA con respecto a la ovalbúmina sin conjugar adyuvantaza. Las figuras 16, 18 y 34 muestran que una respuesta del anticuerpo anti-LT es elevada por el antígeno vectorizado tratado con adyuvante. Evaluación de la respuesta a LTcys-ova de galactosa-purificada Los productos de conjugación son generalmente heterogéneos y pueden por ejemplo contener cantidades variables de cc njugaciones de LT que han perdido la capacidad de unir al receptor GM1. Las figuras 19-26 muestran que los conjugados LTcys-ova purificados por filtración molecular pueden purificarse adicionalmente por afinidad de galactosa y todavía muestran una respuesta de CD8 mejorada comparada con la ovalbúmina tratada con adyuvante sin conjugar, que es mejor vista los 14 días después de la primera inyección (figura 20). Además, las figuras 31 y 32 muestran que un conjugado purificado induce una actividad citotóxica de Siinfekl-específica mejorada detectada in vivo cuando se administra con un adyuvante como se probó 21 días después de la primera inyecpión (figura 31) o 65 días (figura 32) después de la segunda inyección. La figura 33 muestra que la respuesta del anticuerpo no mejorada se observó contra ova cuando el antígeno se conjugó a LT o LTcys y se administró con ASA con respecto a la ovalbúmina no conjugada tratada con adyuvante. La figura 34 muestra que una r espuesta del anticuerpo anti-LT es elevada cuando el antígeno vectorizado es tratado con adyuvante.

Evaluación de la respuesta con el sistema adyuvante H y G Las figuras 35 y 36 comparan StxB-ova y LT-ova con y sin sisternas adyuvantes A, H y G. Los datos muestran claramente que a respuesta al antígeno conjugado o a StxB o LT-B es aumentada cuando se administra con estos tres sistemas adyuvantes (figura 35) y en diferentes dosis con ASH (figura 36).

Los d atos demuestran, junto con los resultados anteriores, que el efecto de incluir cualquier sistema adyuvante aumenta la respuesta a LT-ova similarmente a StxB-Ova. Es por lo tanto posible, con referencia a la Solicitud de patente WO2005/112991 , extrapolar que la adición de los adyuvantes listados en el docunento WO2005/112991 mostrarán la inmunorespuesta mejorada con los antígenos conjugados LTB similarmente a los vistos' con StxB. Evaluación de la respuesta utilizando vectores no-vivos alternativos con el sistema adyuvante A Los resultados (métodos realizados como en 1, 1-3 anteriores) muestran que, la medición en los 7 días después de una primera inyección, una respuesta CD8 creciente es mejor vista con LT-Siinfekl tratado con adyuvante con AS que la que se ve con Siinfekl no-vectorizado adjuvantado o LT-Siinfekl solamente (figura 37). Esta mejora se ve en dosis de hasta sólo 0.1 µ^ de LT-Siinfekl. La misma se ve con LF-Siinfekl (figura 40), y con ExoA-Siinfekl (figura 42). Sin embargo, esta mejora no se ve cuando se midió 15 días después de la 1a dosis (figuras 38 y 41). iCuando se observó 7 días después de la segunda inyección, se ve una mejora con LT-Siinfekl (figura 39), LF-Siinfekl y ExoA-Siinfokl (figura 42) cuando se combina con el sistema adyuvante A, en comparación con cualquier adyuvante no-vectorizado o Siinfekl LFn o LT o ExoA de Siinfekl sin adyuvante.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de vacuna que comprende la subuhidad B de toxina termo-lábil de E. coli o de un derivado de la misma con homología igual o mayor de 90% compleja con un antígeno y un adyuvante. 2. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde la subunidad B de toxina termo-lábil de E. coli o un derivado de la misma con homología igual o mayor de 90% que une el receptor GMe 3. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde el adyuvante se selecciona del grupo de sales metálicas, emulsiones aceite en agua, Toll similar a ligandos de receptor, saponinas o combinaciones de los mismos. ¡4. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 3, en donde el adyuvante es un Toll similar al ligando del receptor. 5. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 4, en donde el Toll similar al ligando del receptor es un agonista. ¡6. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antígeno y la subunidad B de toxina termo lábil de E. coli o un derivado de los mismos con homología igual o mayor de 90% están covalentemente unidos. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde el antígeno y la subunidad B de toxina termf-lábil de E. coli o un derivado de los mismos con homología igual o mayor de 90% se unen como una proteína de fusión. 8. Una composición de vacuna de conformidad con cualduier reivindicación precedente, en donde el adyuvante se selecciona del grupo de: sales metálicas, saponina, lípido A o derivado de los mismos, un aminoalquilo glucosaminida fosfato, un oligonucleótido inmunoestimulante o combinaciones de los mismos. 9. Composiciones de vacuna de conformidad con la ?12. Una composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el adyuvante es una combinación de por lo menos un representante de dos de los siguientes grupos, i) una saponina, ¡ii) un Toll - similar al ligando del receptor 4, y | iii) un Toll - similar al ligando del receptor 9. ¡ 13. Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 12, en donde la saponina es QS21 y el Toll similar al ligando del receptor 4 es monofosforil lípido A 3 desacilado y el Toll similar al Ugando del receptor 9 es CpG que contiene el oligonucleótido inmunoestimulante. ?14. Una composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el antígeno se selecciona del grupo de antígenos que proporcionan la inmunidad contra el grupo de enfermedades seleccionadas de, patógeno intracelulares o enfermedades proliferativas. 15. Una composición de vacuna que comprende un vector no-vivo derivado de una toxina bacteriana o un derivado inmunológicamente funcional de la misma con un antígeno y un adyuvante para el uso en medicina. [16. Uso de la subunidad B de toxina termo-lábil de E. coli o de un derivado de la misma con homología ¡gual o mayor de 90% que une el receptor GM? complejo con un antígeno y un adyuvante para la fabricación de una vacuna para la prevención o tratamiento de la enfermedad. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, para elevar una respuesta CD8 específica del antígeno. ¡18. Un método para tratar o prevenir la enfermedad que comprende administrar a un paciente que sufre o es susceptible a la en fermedad, una composición de vacuna de conformidad con cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 14. ?19. Un método para elevar una inmunorespuesta de CD8 espe?ífica de antígeno que comprende la administración a un paciejnte de una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivinjdicaciones 1 a 14. l20. Un proceso para la producción de una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde, un antígeno complejo con la subunidad B de toxina termo-lábil de E. coli o de un derivado del mismo con homología ¡gual o mayor de 90% que une el receptor GM?, se mezcla con un adyuvante. RESUME! La presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende la subunidad B de toxina termo-lábil de E coli o un derivado de la misma con homología igual o mayor de 90% compleja con un antígeno y adyuvante.