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CN111333734B - 一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用 Download PDF

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CN111333734B CN202010242030.9A CN202010242030A CN111333734B CN 111333734 B CN111333734 B CN 111333734B CN 202010242030 A CN202010242030 A CN 202010242030A CN 111333734 B CN111333734 B CN 111333734B
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Abstract

本发明涉及一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用，所述融合蛋白以百日咳FHA氨基酸残基1877‑2250片段和StxB通过肽链连接构成，并以融合蛋白来构建亚单位疫苗，并在大肠杆菌中成功诱导表达，通过Western‑blot和ELISA鉴定了该融合蛋白的免疫原性；免疫小鼠后发现能产生高水平的抗体效价，为百日咳疫苗的研究提供了新思路。

Description

一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用。
背景技术
百日咳是由百日咳博德特氏菌引起的急性呼吸道传染病，是一种相对较新的人类传染病之一。这种疾病最早于1414年在法国出现，也是世界上使用疫苗控制效果最差的可预防疾病之一。百日咳的临床特征在于阵发性或爆发性的多次快速咳嗽，并伴有特征性的“鸡鸣”样吸气性吼声，最常见的并发症是继发性肺炎。该病多发于儿童及婴幼儿年龄段，特别是那些小于6个月的婴儿。尽管目前已有针对百日咳的预防性疫苗且疫苗的接种率高，但百日咳仍然是儿童死亡的主要病因之一。
天然的丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)是在细菌细胞表面表达的百日咳博德特氏菌粘附素，也会被分泌到细胞外环境中，它包含几个促进细菌粘附于纤毛呼吸道上皮细胞的结构域，包括保守的三肽序列RGD(Arg-Gly-Asp)，碳水化合物识别结合域和肝素结合域。FHA通过RGD与巨噬细胞和其他细胞表面的3型补体受体(Type3complement receptor,CR3)结合来启动吞噬作用，然后毒素介导的细胞内杀伤抑制作用可促进细菌存活。为探究FHA最具免疫原性的区域，Asgarian-Omran等人通过人血清抗体对FHA不同区域的测定证明了在FHA氨基酸残基1877-2250位置能够诱导最有效的免疫应答，是FHA的最具免疫显性区域。
志贺毒素B亚单位(shiga toxin B subunit,StxB)早期就被证实可作为载体蛋白在轮状病毒抗原刺激小鼠后提供保护性粘膜体液和细胞免疫反应。StxB作为抗原载体与特定细胞表面受体结合，使DC细胞以受体介导的内吞方式高效摄取抗原蛋白，显著活化初始T细胞进行增殖。同时StxB还为抗原提供了更加复杂的结构，更利于抗原提呈及淋巴结引流，有效诱导机体的免疫应答。因此在疫苗研发领域，StxB成为亚单位疫苗有效载体之一。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能产生高水平的抗体效价的百日咳丝状血凝素融合蛋白，为百日咳疫苗的研究提供了新思路。
本发明提供一种蛋白质，所述蛋白质为a)或b)或c)或d)：
a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)由SEQ ID No.2第37-503位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；
d)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由511个氨基酸残基组成，第1-36位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列，第37-126位为StxB,第127-130位为连接肽,第131-503位为Fha1877-2250，第504-511位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列。a)的蛋白质名称为His-StxB-Fha1877-2250，b)的蛋白质名称为StxB-Fha1877-2250。
本发明还要求保护与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
上述产品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，B1)为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第109-1509位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质。
SEQ ID No.1由1536个核苷酸组成，第1-108位为pET28a(+)上的序列，第109-378位为StxB基因,第379-390位为连接肽基因,第391-1509位为Fha1877-2250基因，第1510-1536位为pET28a(+)上的序列。a)的基因名称为His-StxB-Fha1877-2250基因，b)的基因名称为StxB-Fha1877-2250基因。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码StxB-Fha1877-2250的核酸分子的表达盒(StxB-Fha1877-2250基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达StxB-Fha1877-2250的DNA，该DNA不但可包括启动StxB-Fha1877-2250基因转录的启动子，还可包括终止StxB-Fha1877-2250转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。可用现有的动物表达载体构建含有所述StxB-Fha1877-2250基因表达盒的重组表达载体。
制备所述蛋白质的方法，包括使蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。
其中，所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。
其中，所述重组微生物为将pET28a-StxB-Fha1877-2250导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述重组微生物命名为BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250，所述pET28a-StxB-Fha1877-2250为将载体pET28a(+)的EcoRI和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第109-1509位所示的DNA片段得到的重组载体。
其中，所述表达为诱导表达。
本发明还提供一种预防动物百日咳的疫苗，所述疫苗包含所述的蛋白质或所述的生物材料。
所述蛋白质按照所述的方法制备；
所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2)编码序列是SEQ ID No.1的第109-1509位所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；
所述重组载体为上述pET28a-StxB-Fha1877-2250；
所述重组微生物为E1)或E2)：
E1)所述重组微生物为将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，所述受体微生物为C1)-C4)中的任一种:
C1)原核微生物；
C2)革兰氏阴性细菌；
C3)埃希氏菌属细菌；
C4)大肠杆菌BL21(DE3)；
所述重组微生物为将所述BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250。
所述预防动物百日咳的疫苗的活性成分为所述蛋白质或所述生物材料。
下述任一种应用也应在本发明的保护范围之内：
Y1)所述蛋白质在制备百日咳疫苗中的应用；
Y2)所述生物材料在制备百日咳疫苗中的应用；
Y3)所述的方法在制备百日咳疫苗中的应用；
Y4)所述蛋白质在制备百日咳诊断抗原中的应用；
Y5)所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。
本发明以百日咳FHA氨基酸残基1877-2250片段和StxB作为融合蛋白来构建亚单位疫苗，并在大肠杆菌中成功诱导表达，通过Western-blot和ELISA鉴定了该融合蛋白的免疫原性；免疫小鼠后发现能产生高水平的抗体效价，为百日咳疫苗的研究提供了新思路。
附图说明
图1重组蛋白的SDS-PAGE表达分析(A)及western blot鉴定(B)。图中，M表示Marker，1表示大肠杆菌BL21(DE3)的蛋白表达情况，2表示大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250的蛋白表达情况，3表示大肠杆菌/pET28a-StxB-Fha1877-2250的蛋白表达情况)。
图2纯化产物SDS-PAGE分析。图中，1为BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-FHA1877-2250；2为BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250。
图3ELISA检测免疫小鼠血清中的抗体IgG。
图4不同稀释度血清补体杀菌活性。
图5攻毒后小鼠存活情况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中表达载体pET-28a(+)(优宝生物，VT1207)，pGEX-4T-1(优宝生物，VT1253)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(北京TransGen Biotech有限公司)，百日咳ptx P1菌株(姚开虎,贾举.加强百日咳研究和防控,维护公众疫苗接种信心关注效价指标不合格疫苗事件及其长期影响[J].中国当代儿科杂志,2018,20(01):1-4)
下述实施例中1×PBS(pH8.0)的组成如下：溶质为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L；溶剂为水；pH8.0。
动物病毒：公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1预防动物百日咳疫苗的制备
本发明涉及3蛋白质的基因，分别为核苷酸序列是SEQ ID No.1的His-StxB-Fha1877-2250基因(编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质
His-StxB-Fha1877-2250)，核苷酸序列是SEQ ID No.1的第109-1509位的StxB-Fha1877-2250基因(编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的第37-503位的蛋白质StxB-Fha1877-2250)和作为对照的作为对照的His-Fha1877-2250基因(编码蛋白质His-Fha1877-2250)。
SEQ ID No.1由1536个核苷酸组成，第1-108位为pET28a(+)上的序列，第109-378位为StxB基因,第379-390位为连接肽基因,第391-1509位为Fha1877-2250基因，第1510-1536位为pET28a(+)上的序列。a)的基因名称为His-StxB-Fha1877-2250基因，b)的基因名称为StxB-Fha1877-2250基因。
其中，SEQ ID No.2由511个氨基酸残基组成，第1-36位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列，第37-126位为StxB,第127-130位为连接肽,第131-503位为Fha1877-2250，第504-511位为pET28a(+)上相应序列编码的氨基酸序列。a)的蛋白质名称为His-StxB-Fha1877-2250，b)的蛋白质名称为StxB-Fha1877-2250。
His-Fha1877-2250基因是将SEQ ID No.1所示的His-StxB-Fha1877-2250基因的第109-390位缺少保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。
1、表达His-StxB-Fha1877-2250的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250的构建
用化学合成的方法合成出SEQ ID No.1的第109-1509位所示的StxB-Fha1877-2250基因(编码SEQ ID No.2的第37-503位氨基酸残基所示的蛋白质)。
进行PCR扩增，以StxB-Fha1877-2250基因作为模板，利用上游引物F1(序列为5’-CGGAATTCAAAAAAACATTATTAATAGCTGC-3’)和下游引物R1(序列为5’-GCCTCGAGACCATCCGCCAGGCTGGTCTGCGCCGCACCAATA-3’)在StxB-Fha1877-2250基因的两端加上EcoR I位点(带下划线的序列)和XhoI识别位点(带下划线的序列)，得到包含SEQ ID No.1的第109-1509位所示的StxB-Fha1877-2250基因的PCR产物。
将上述包含StxB-Fha1877-2250基因的PCR产物用EcoR I和XhoI酶切，回收目的片段(StxB-Fha1877-2250基因)；同时用EcoR I和XhoI酶切载体pET28a(+)，回收载体大片段；将回收的目的片段与回收的载体大片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，于37℃培养箱培养过夜。次日挑取单克隆经PCR验证后得到的阳性单克隆送至天一辉远公司测序。将测序结果表明是用SEQ ID No.1的第109-1509位所示的StxB-Fha1877-2250基因替换pET28a(+)的EcoR I和XhoI识别位点间的片段，保持pET28(+)的其它序列不变得到的重组表达载体，命名为pET28a-StxB-Fha1877-2250。pET28a-StxB-Fha1877-2250含有His-StxB-Fha1877-2250基因(带His标签的StxB-Fha1877-2250基因)。
His-StxB-Fha1877-2250基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250。将含有pET28a-StxB-Fha1877-2250的重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250。BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250可诱导表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250。
2、表达His-Fha1877-2250的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250的构建
参照步骤1，将pET28a-Fha1877-2250导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有His-Fha1877-2250基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250。
His-Fha1877-2250基因是将SEQ ID No.1所示的His-StxB-Fha1877-2250基因的第109-390位缺少保持SEQ ID No.1的其它核苷酸不变得到的DNA分子。
BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250可诱导表达蛋白质His-Fha1877-2250。蛋白质His-Fha1877-2250是将氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250第37-130位进行缺失并保持SEQ ID No.2的其它氨基酸残基不变得到的蛋白质。
其中，pET28a-Fha1877-2250是将pET28a-StxB-Fha1877-2250中的His-StxB-Fha1877-2250基因替换为His-Fha1877-2250基因并保持pET28a-StxB-Fha1877-2250的其它核苷酸不变得到的重组载体。
3.目的基因的诱导表达
分别将大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250和BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250，涂板隔夜挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃，220r/min振荡摇床中培养至OD值达到0.6左右加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导12h时收集发酵液，离心收取1mL菌体，加入90μL ddH2O重悬菌体，再加入90μL2×SDS Buffer充分混合均匀，沸水浴10min后用12％SDS-PAGE凝胶进行SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况。重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，经160mA，45min转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭液37℃封闭1h后用1×PBST洗膜3次，加入1：1000稀释的HRP标记的His-tag抗体37℃孵育1h，1×PBST洗膜3次，每次7min后用SuperSignal West Pico Plus(购自Thermo Fisher Scientific公司)通过凝胶成像仪检测。其中2×SDS Buffer的成分为：(将SDS，32g；DTT，6.17g；溴酚蓝，0.4；甘油，160mL；1mol/L pH6.8的Tirs-HCI，100mL；的混合物用ddH2O定容至1L)
结果如图1所示，图1中M表示Marker，1表示大肠杆菌BL21(DE3)的蛋白表达情况，2表示大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250的蛋白表达情况，3表示大肠杆菌/pET28a-StxB-Fha1877-2250的蛋白表达情况。与大肠杆菌BL21(DE3)相比大肠杆菌pET28a-Fha1877-2250和BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250在40、50kDa处有明显表达的蛋白条带(如图1A所示)，与目的蛋白His-FHA1877-2250、His-StxB-Fha1877-2250的预测值41和51kDa基本一致。如图1B所示，通过Western blot进一步验证了我们所需要的目的蛋白表达正确。
4重组蛋白的纯化与复性
分别将大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250和BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250，涂板隔夜挑取单克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃，220r/min振荡摇床中培养至OD值达到0.6左右加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导12h时收集500mL发酵液，离心去掉上清，将菌体沉淀用上样缓冲液A1(溶质为：0.5mol/L NaCl,13.3mLTirs-HCL,0.1mmol/L Imidazole；溶剂为水；pH7.5)重悬，用细胞破碎仪破碎菌体。离心取破碎沉淀用含尿素的缓冲液A2(0.5mol/L NaCl,13.3ml/L Tirs-HCL,0.1mmol/LImidazole，8M Urea；溶剂为水；pH7.5)重悬菌液，待破碎菌体完全溶解后，12000r/min离心10min，取上清液(蛋白样品)进行纯化。
将镍柱(上海博格隆生物技术有限公司)用10倍柱体积的缓冲液A2进行平衡，然后将蛋白样品用4mL/min的流速上样，最后以5倍柱体积的洗脱液(溶质为：0.5mol/L NaCl，13.3mL/L Tirs-HCL，8M Urea，0.5mol/L Imidazole，溶剂为水；pH7.4)洗脱收集目的蛋白。将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[溶剂为1×PBS(pH8.0)，溶质为：4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea]中复性，复性后的蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH8.0)溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，得到蛋白质His-StxB-Fha1877-2250溶液(由BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250制备而来)和蛋白质His-StxB-Fha1877-2250溶液(由BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250制备而来)，并将其冻存至-80℃。
经过镍离子柱亲和层析的方法纯化后，可以得到高纯度的蛋白包涵体。复性后的得到的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250溶液和蛋白质His-StxB-Fha1877-2250溶液经SDS-PAGE验证，BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-FHA1877-2250、BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250相对分子质量与理论大小一致，并且纯度超过98％(如图2所述，图2中M为Marker,1为BL21(DE3)/pET28a-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-FHA1877-2250；2为BL21(DE3)/pET28a-StxB-Fha1877-2250诱导表达的蛋白质His-StxB-Fha1877-2250)。
5动物免疫评价实验
将30只健康、5-6周龄、体重18g的雌性BALB/c小鼠随机分成三组，每组10只：FHA1877-2250组、StxB-Fha1877-2250组、PBS免疫对照组(Control)。所有小鼠均以皮下免疫的方式免疫3次，每次间隔两周。每次免疫如下：FHA1877-2250组每只小鼠免疫100μL免疫原，该100μL免疫原由90μL His-FHA1877-2250蛋白溶液(溶质为His-Fha1877-2250，溶剂为1×PBS(pH8.0))和10μL氢氧化铝佐剂组成，使His-FHA1877-2250的免疫剂量为2.5μg/只；StxB-FHA1877-2250组每只小鼠免疫100μL免疫原，该100μL免疫原由90μL His-StxB-FHA1877-2250蛋白溶液(溶质为His-StxB-Fha1877-2250，溶剂为1×PBS(pH8.0))和10μL氢氧化铝佐剂组成，使His-StxB-FHA1877-2250的免疫剂量为2.5μg/只；PBS免疫对照组每只小鼠免疫100μL免疫原，该100μL免疫原由90μL 1×PBS(pH8.0)和10μL氢氧化铝佐剂组成。
第三次免疫后第10天经尾静脉采血，4℃隔夜后6000r/min离心分离血清采用间接ELISA法测定小鼠血清抗体水平。第三次免疫第14天对三组小鼠腹腔每只接种2倍半数致死剂量的(1.21×108CFU)ptx P1菌液，感染后观察10天，统计小鼠死亡情况。18h后，小鼠出现活动减少、精神萎靡等症状，24h后，对照组与实验组小鼠开始死亡，攻毒72h后，对照组全部死亡，而FHA1877-2250免疫组小鼠在4天内有6只死亡，StxB-Fha1877-2250免疫组小鼠有4只死亡，其余小鼠在经历萎靡不振后慢慢恢复健康。记过如图5所示，从图5中可以看出，融合蛋白StxB-Fha1877-2250具有较好的潜在保护效果，有效保护率为60％。
带有GST标签的FHA1877-2250蛋白的制备：化学合成如序列1391-1509位所示的FHA1877-2250基因片段，以FHA基因片段为模板，以GXTfha-up(GGAATTCGACGAGCACCGTCACCTGCTG，下划线部分为EcoR I位点)和GXTfha-dn(GACGTCGACACCATCCGCCAGGCT，下划线部分为Sal I位点)为引物，进行PCR扩增，将得到的扩增产物片段与pGEX-4T-1质粒通过EcoR I和Sal I双酶切连接构建重组质粒pGEX-4T-1-FHA，测序正确后，将重组质粒pGEX-4T-1-FHA导入DL21中诱导表达，经纯化复性后得到带有GST标签的FHA1877-2250蛋白。
采用间接ELISA法测定小鼠血清抗体水平方法如下：以带有GST标签的FHA1877-2250蛋白作为包被抗原，100μL/孔包被酶标板，其中含GST-Fha1877-2250蛋白10μg，4℃包被过夜。次日用PBST洗3次，加入5％脱脂牛奶37℃封闭1h，用PBST洗三次，然后加入1:50倍比稀释的小鼠血清(即小鼠血清的初始稀释比例为1:50，之后按照倍比稀释的原则依次稀释为前面的1/2)，100μL/孔，37℃孵育1h，用PBST洗3次后加入1：20000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，37℃孵育1h，用PBST洗3次加入TMB(Soluble TMB Kit(20x)购自康为世纪生物公司)溶液避光显色15分钟，最后加入终止液(55.5mL浓硫酸加入444.5蒸馏水，待冷却后使用)5分钟后，用酶标仪读取450nm吸光值。以对照组小鼠血清平均OD值的2.1倍为阳性判定标准。
小鼠分别经His-StxB-Fha1877-2250、His-FHA1877-2250重组蛋白三次免疫后，取末次免疫后第10天的小鼠血清检测抗体滴度。结果由图3所示，由图3可知，无论是StxB-Fha1877-2250组或FHA1877-2250组均能产生抗FHA的特异性抗体，其抗体效价与阴性对照相比差异显著，并且StxB-Fha1877-2250蛋白产生的抗体效价最高可达1：3200(如图3所示)相比于FHA1877-2250蛋白免疫的小鼠能够产生更高水平特异性抗体。ELISA检测证明了重组蛋白StxB-Fha1877-2250免疫小鼠后能够有效刺激机体产生特异性B细胞免疫应答。
6血清体外杀菌实验
将百日咳ptx P1菌株培养至OD600为2.0时，用生理盐水稀释至菌浓度为100-200CFU/10μL的稀释液。取10μL稀释的菌液与倍比稀释的10μL步骤5的第三次免疫后第10天小鼠血清(预先58℃水浴30分钟，以灭活其中的补体成分)混合，37℃孵育1小时后加入20μL补体充分混匀，37℃孵育1小时后全部涂LB平板，37℃温箱培养5日计算平板菌落总数，计算杀菌率。
通过体外杀菌实验检测StxB-Fha1877-2250组血清杀菌活性。结果如图4所示，初始浓度的血清几乎可以达到80％的杀菌效果，但是当血清稀释到80倍后效果就明显地下降。但总体上而言，StxB-Fha1877-2250组的血清杀菌效率要比FHA1877-2250组略好。
上述实验中，均应用SAS 9.2软件进行统计学分析，采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，以P＜0.05为差异有统计学意义。
通过疫苗接种获得的免疫不是终生的，其保护效果在4至10年的时间内趋于减弱，使得现如今百日咳的发病率重新升高。因此，开发新一代疫苗需要进一步研究百日咳博德特氏菌的发病机制和疫苗的免疫效果。亚单位疫苗免疫原性低是普遍的问题，进入机体后无法产生充分刺激，对免疫系统激活能力差，可采用多种疫苗提送系统(如胞外囊泡、自组装蛋白纳米颗粒、病毒样颗粒等)，促进抗原更高效地被抗原提呈细胞识别与递送，激发T细胞依赖的免疫应答，相关研究也在进行当中。
作为百日咳的主要外膜蛋白，FHA不仅丰度较高，同时也是现如今百日咳无细胞疫苗(acelluar pertussis vaccine,apv)的主要组成成分。本实验将StxB片段构建到FHA1877-2250N-端进行融合表达，纯化出的StxB-Fha1877-2250蛋白选择用Bp146菌株对其免疫原性进行评价。本研究结果显示，FHA1877-2250组小鼠的保护率达到40％，也就是说，单一的FHA1877-2250抗原能够刺激机体产生一定的免疫保护，与Asgarian-Omran等人报道一致。在此基础上，融合了StxB的StxB-Fha1877-2250组的保护率又有所提高。虽然在之后的体外杀菌实验中实验组并没有太明显的差异，但通过间接ELISA检测的StxB-Fha1877-2250抗体效价最高可达到1∶3200，验证了StxB与FHA1877-2250的融合有助于提高单抗原的免疫原性和免疫保护性。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种百日咳丝状血凝素融合蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcaa aaaaacatta 120
ttaatagctg catcgctttc atttttttca gcaagtgcgc tggcgacgcc tgattgtgta 180
actggaaagg tggagtatac aaaatataat gatgacgata cctttacagt taaagtgggt 240
gataaagaat tatttaccaa cagatggaat cttcagtctc ttcttctcag tgcgcaaatt 300
acggggatga ctgtaaccat taaaactaat gcctgtcata atggaggggg attcagcgaa 360
gttatttttc gtctgcaggg cggatccggc gacgagcacc gtcacctgct gaacgaaggc 420
gtgatccagg cgggtggcca tggtcacatt ggtggcgacg tggataaccg tagcgtggtt 480
cgtaccgtta gcgcgatgga gtacttcaag accccgctgc cggttagcct gaccgcgctg 540
gataaccgtg cgggtctgag cccggcgacc tggaactttc agagcaccta cgaactgctg 600
gactatctgc tggatcaaaa ccgttacgag tatatctggg gcctgtaccc gacctatacc 660
gaatggagcg tgaacaccct gaaaaacctg gacctgggtt atcaagcgaa gccggcgccg 720
accgctccgc cgatgccgaa agcgccggag ctggatctgc gtggtcacac cctggagagc 780
gcggaaggcc gtaagatttt cggtgaatac aagaaactgc agggcgagta tgaaaaggcg 840
aaaatggcgg tgcaagcggt tgaggcgtac ggtgaagcga cccgtcgtgt gcacgaccag 900
ctgggtcaac gttatggcaa agcgctgggt ggcatggacg cggagaccaa ggaagtggat 960
ggcatcattc aagagtttgc ggcggacctg cgtaccgttt acgcgaaaca ggcggatcaa 1020
gcgaccatcg acgcggaaac cgataaagtt gcgcagcgtt ataagagcca aatcgatgcg 1080
gtgcgtctgc aggcgattca accgggtcgt gttaccctgg cgaaggcgct gagcgcggcg 1140
ctgggtgcgg actggcgtgc gctgggtcac agccagctga tgcaacgttg gaaggatttc 1200
aaagcgggca agcgtggcgc ggagattgcg ttttacccga aagaacagac cgttctggcg 1260
gcgggtgcgg gtctgaccct gagcaacggt gcgatccaca acggcgagaa cgcggcgcaa 1320
aaccgtggtc gtccggaagg cctgaaaatt ggtgcgcaca gcgcgaccag cgtgagcggc 1380
agctttgatg cgctgcgtga tgttggtctg gagaagcgtc tggacatcga cgatgcgctg 1440
gcggcggtgc tggttaaccc gcacatcttt acccgtattg gtgcggcgca gaccagcctg 1500
gcggatggtc tcgagcacca ccaccaccac cactga 1536
<210> 2
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Lys Lys Thr Leu Leu Ile Ala Ala Ser Leu Ser Phe
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Thr Pro Asp Cys Val Thr Gly Lys Val
50 55 60
Glu Tyr Thr Lys Tyr Asn Asp Asp Asp Thr Phe Thr Val Lys Val Gly
65 70 75 80
Asp Lys Glu Leu Phe Thr Asn Arg Trp Asn Leu Gln Ser Leu Leu Leu
85 90 95
Ser Ala Gln Ile Thr Gly Met Thr Val Thr Ile Lys Thr Asn Ala Cys
100 105 110
His Asn Gly Gly Gly Phe Ser Glu Val Ile Phe Arg Leu Gln Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Asp Glu His Arg His Leu Leu Asn Glu Gly Val Ile Gln Ala
130 135 140
Gly Gly His Gly His Ile Gly Gly Asp Val Asp Asn Arg Ser Val Val
145 150 155 160
Arg Thr Val Ser Ala Met Glu Tyr Phe Lys Thr Pro Leu Pro Val Ser
165 170 175
Leu Thr Ala Leu Asp Asn Arg Ala Gly Leu Ser Pro Ala Thr Trp Asn
180 185 190
Phe Gln Ser Thr Tyr Glu Leu Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Gln Asn Arg
195 200 205
Tyr Glu Tyr Ile Trp Gly Leu Tyr Pro Thr Tyr Thr Glu Trp Ser Val
210 215 220
Asn Thr Leu Lys Asn Leu Asp Leu Gly Tyr Gln Ala Lys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ala Pro Pro Met Pro Lys Ala Pro Glu Leu Asp Leu Arg Gly His
245 250 255
Thr Leu Glu Ser Ala Glu Gly Arg Lys Ile Phe Gly Glu Tyr Lys Lys
260 265 270
Leu Gln Gly Glu Tyr Glu Lys Ala Lys Met Ala Val Gln Ala Val Glu
275 280 285
Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Arg Arg Val His Asp Gln Leu Gly Gln Arg
290 295 300
Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Gly Met Asp Ala Glu Thr Lys Glu Val Asp
305 310 315 320
Gly Ile Ile Gln Glu Phe Ala Ala Asp Leu Arg Thr Val Tyr Ala Lys
325 330 335
Gln Ala Asp Gln Ala Thr Ile Asp Ala Glu Thr Asp Lys Val Ala Gln
340 345 350
Arg Tyr Lys Ser Gln Ile Asp Ala Val Arg Leu Gln Ala Ile Gln Pro
355 360 365
Gly Arg Val Thr Leu Ala Lys Ala Leu Ser Ala Ala Leu Gly Ala Asp
370 375 380
Trp Arg Ala Leu Gly His Ser Gln Leu Met Gln Arg Trp Lys Asp Phe
385 390 395 400
Lys Ala Gly Lys Arg Gly Ala Glu Ile Ala Phe Tyr Pro Lys Glu Gln
405 410 415
Thr Val Leu Ala Ala Gly Ala Gly Leu Thr Leu Ser Asn Gly Ala Ile
420 425 430
His Asn Gly Glu Asn Ala Ala Gln Asn Arg Gly Arg Pro Glu Gly Leu
435 440 445
Lys Ile Gly Ala His Ser Ala Thr Ser Val Ser Gly Ser Phe Asp Ala
450 455 460
Leu Arg Asp Val Gly Leu Glu Lys Arg Leu Asp Ile Asp Asp Ala Leu
465 470 475 480
Ala Ala Val Leu Val Asn Pro His Ile Phe Thr Arg Ile Gly Ala Ala
485 490 495
Gln Thr Ser Leu Ala Asp Gly Leu Glu His His His His His His
500 505 510

Claims (10)

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为a）或b）或c）：
a）氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
b）氨基酸序列是SEQ ID No.2第37-503位的蛋白质；
c）在a）或b）所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）至B12）中的任一种：
B1）编码所述蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；
B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；
B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；
B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；
B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；
B9）含有B1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10）含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11）含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12）含有B4）所述重组载体的转基因动物细胞系。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下1）或2） 所示的基因：
1）编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
2）编码序列是SEQ ID No.1的第109-1509位所示的DNA分子。
4.制备权利要求1中所述蛋白质的方法，包括使权利要求1所述的蛋白质的编码基因在生物中进行表达得到所述蛋白质的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述使蛋白质的编码基因在生物中进行表达包括将所述蛋白质的编码基因导入受体微生物，得到表达所述蛋白质的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到所述蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述重组微生物为将 pET28a-StxB-Fha1877-2250导入大肠杆菌BL21（DE3）得到的表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质的重组微生物，所述 pET28a-StxB-Fha1877-2250为将载体pET28a（+）的EcoR I和XhoI位点之间的序列替换为SEQ ID No.1第109-1509位所示的DNA片段得到的重组载体。
7.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述表达为诱导表达。
8.一种预防动物百日咳的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的生物材料。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于：所述预防动物百日咳的疫苗的活性成分为所述蛋白质或所述生物材料。
10.下述任一种应用：
Y1)权利要求1中所述蛋白质在制备百日咳疫苗中的应用；
Y2)权利要求2或3所述生物材料在制备百日咳疫苗中的应用；
Y3)权利要求4-7中任一所述的方法在制备百日咳疫苗中的应用；
Y4）权利要求1中所述蛋白质在制备百日咳诊断抗原中的应用；
Y5）权利要求1中所述蛋白质在制备单克隆抗体中的应用。
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