MX2007009273A

MX2007009273A - Anticuerpos humanos contra la rabia y uso de los mismos.

Info

Publication number: MX2007009273A
Application number: MX2007009273A
Authority: MX
Inventors: Donna Ambrosino; Gregory J Babcock; Robert Mandell; William D Thomas Jr; Susan Schonhoff; Charles Rupprecht
Original assignee: Univ Massachusetts
Priority date: 2005-02-02
Filing date: 2006-02-02
Publication date: 2008-02-19
Also published as: SI1851315T1; US20110008360A1; ZA200707339B; BRPI0606790A2; EP1851315A1; HRP20140271T1; US20150315266A1; CA2596697A1; BRPI0606790C8; ME01785B; CA2596697C; ES2453973T3; US7727532B2; PT1851315E; US20090041777A1; DK1851315T3; BRPI0606790B1; PL1851315T3; EP1851315B1; US20130039926A1

Abstract

En la presente se proveen anticuerpos monoclonales humanos que se unen especificamente al virus de la rabia, porciones de union al antigeno de los mismos y metodos para formar y usar dichos anticuerpos y porciones de un antigeno de los mismos para tratar el virus de la rabia en un sujeto.

Description

ANTICUERPOS HUMANOS CONTRA LA RABIA Y USO DE LOS MISMOS Información Relacionada La solicitud reclama prioridad a la solicitud de patente provisional de E.U.A. Número 607649,512, presentada el 2 de febrero de 2005, todo el contenido de la cual se incorpora aquí por referencia. El contenido de cualquier patente, solicitudes de patentes y referencias citadas incorporadas aquí por referencia.

Antecedentes de la Invención La rabia es una encefalitis ocasionada progresiva aguda ocasionada por la infección con un virus de ARN de la familia Rhabdoviridae (género lyssavirus) . Mientras las fatalidades de rabia humada son raras en naciones en desarrollo (usualmente hay menos de 5 muertos en los Estados Unidos cada año) , se reportan significantes números de muertes en, por ejemplo, la India, en donde 50,000 mueren de la enfermedad y más de 500,000 son tratados. Aún en los Estados Unidos, de 15,000 40,000 personas reciben tratamiento contra la rabia cada año. Normalmente, los perros son los portadores principales de la enfermedad pero frecuentemente también otros mamíferos son portadores frecuentes como mapache, mofeta, murciélago y zorro. La transmisión del virus de un animal portador a un ser humano ocurre usualmente por una mordida o rasguño que penetra la piel. Dado que la rabia en seres humanos es casi siempre fatal, se deberá tratar aún si se sospecha de infección con un régimen de tratamiento posterior a la exposición agresiva. El tratamiento posterior a la infección de la rabia en seres humanos cosiste de cuidado apropiado de la herida, administración local de inmunoglobulina de suero contra la rabia infiltrada en y alrededor de la herida, y la administración de múltiples dosis de vacunas de rabia usualmente durante varios días y semanas (para una revisión de profilaxis contra la rabia, véase, v.gr., Rupprecht y Gibbons y otros, N. Engl. J. Med. 351:25 (2004)). El cuidado apropiado de la herida puede disminuir la cantidad de virus que sobrevive para entrar en el paciente. La infiltración del área con inmunoglobulina de suero contra la rabia puede unirse al virus de la rabia y ayuda a limpiarla disminuyendo así la carga viral (por inmunización pasiva) . La administración de múltiples dosis de vacunas contra la rabia (inmunización activa) , usualmente en la forma de una primera dosis seguido por dosis de refuerzo subsiguientes, permite que el paciente produzca una inmunidad activa vigorosa, incluyendo respuestas humorales y celulares. Las fuentes actuales de inmunoglobulina de suero contra la rabia se obtienen de la sangre de donadores humanos vacunados. Otras fuentes de inmunoglobulina se suero contra la rabia, por ejemplo, quinos o murinos, se consideran inaceptables. Las fuentes actuales de vacunas contra la rabia se producen en líneas celulares y se inactivan y liofilizan químicamente. Mientras que estos agentes, cuando se administran en tiempo, son altamente efectivos, permanecen ciertos obstáculos. Por ejemplo, hay pocos fabricantes de esto agentes contra la rabia y siguen siendo relativamente costosos, especialmente el mundo en desarrollo en donde son más requeridos. Además, la inmunoglobulina de suero contra la rabia humana, debido a que se recolecta del suero de donadores humanos, debe ser altamente purificada para evitar la transmisión de cualquier agente espontáneo. Además, la vacuna contra la rabia requiere cultivo celular de mano de obra intensa y pasos de inactivación y purificación costosos. Consecuentemente, es necesaria la inmunoterapia mejoradas para tratar y prevenir infección por rabia.

Sumario de la Invención La presente invención resuelve los problemas anteriores proporcionando un anticuerpo monoclonal contra la rabia humano completamente recombinante que se una específicamente a una amplia variedad de aislados de virus de la rabia e inhiba la capacidad del virus para infectar células . En una modalidad, se demuestra por la capacidad de los anticuerpos la neutralización (es decir, inhibición o bloqueo) del virus de la rabia in vitro (v.gr. en un análisis de RFFIT) . En otra modalidad, esto se demuestra por la capacidad de los anticuerpos para inhibir la infectividad del virus de la rabia in vivo en un sujeto, tal como un animal o un ser humano. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención puede hacerse eficientemente en cantidades virtualmente no limitadas, en forma altamente purificada. Consecuentemente, los anticuerpos son adecuados para pronóstico, diagnóstico y/o tratamiento de un individuo expuesto o que se sospecha que ha sido expuesto a la rabia. Los anticuerpos de la invención son particularmente ventajosos para la profilaxis posterior a la exposición (PPE) a la rabia dado que eliminan la necesidad de una fuente donadora de inmunoglobulina de suero contra la rabia humano. Los anticuerpos pueden producirse usando una variedad de técnica para crear anticuerpos humanos conocidos en la materia. Por ejemplo, como se ejemplifica en la presente, los anticuerpos pueden generarse en animales transgénicos que expresan segmentos de genes de inmunoglobulina humana, v.gr., ratones transgénicos que comprenden un sitio Ig humano.

Además, los anticuerpos pueden administrarse solos o en combinación, v.gr., con una vacuna del virus contra la rabia u otros anticuerpos, para incrementar los regímenes de supervivencia de los sujetos (v.gr., animales y seres humanos) infectados con el virus de la rabia. Consecuentemente, la invención provee varias variantes que incluyen, por no están limitadas a lo siguiente: -un anticuerpo contra la rabia recombinante completamente humano para pronosticar, diagnosticar, y/o tratar el virus de la rabia o conducir la profilaxis posterior a la exposición (PPE) del virus de la rabia en un sujeto, v.gr., proteger o inhibir la morbidez o mortalidad mediada por el virus de la rabia en un sujeto; - una composición (v.gr., farmacéutica) y/o un equipo que comprende uno o más anticuerpos contra la rabia recombinantes completamente humanos que pueden usarse solos o en combinación con las vacunas comercialmente disponibles para tratar infección de rabia y/o conducir PPE en un sujeto; y - un método mejorado de inmunoterapia pasiva para tratar a un sujeto infectado con el virus de a rabia (v.gr. que necesita profilaxis posterior a la exposición (PPE) del virus de la rabia) que puede usarse solo o en combinación con inmunoterapia activa (vacuna de la rabia) .

En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos o porciones de unión del antígeno de las mismas de la invención se unen específicamente a la glicoproteína G del virus de la rabia. Los anticuerpos particulares o porciones de unión del antígeno de los mismos se unen específicamente a un epítope dentro de la mitad N-terminal de la glicoproteína G del virus de la rabia. Otros anticuerpos particulares o porciones de unión del antígeno del mismo se unen específicamente a un epítope dentro del dominio C-terminal del virus de la rabia. Dichos epítopes pueden residir, por ejemplo, dentro de aminoácidos 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-524 de glicoproteína G del virus de la rabia, o cualquier intervalo, porción o rango de la misma. En una modalidad, los anticuerpos o porciones de unión de antígenos de los mismos se unen específicamente a un epítope dentro de la mitad N-terminal de la glicoproteína G del virus de la rabia, es decir, entre aproximadamente 19-422 residuos de aminoácidos. En otra modalidad, el epítope de la glicoproteína G de la rabia comprnede 336-442 residuos de aminoácidos. En un a modalidad, la glicoproteína G de la rabia comprende 336 residuos de aminoácido así como alteraciones de los mismos, tal como sustituciones o supresiones. En una modalidad relacionada, el epítope de glicoproteína G de la rabia comprende un epítope lineal, epítope conformacional, epítope discontinuo, o combinaciones de dichos epítopes. En otra modalidad relacionada, el epítope de glicoproteína G de la rabia consiste de sitio antigénico I, sitio antigénico II, sitio antigénico III, sitio antigénico menor A o combinaciones de dichos sitios antigénicos, por ejemplo, sitio antigénico III y sitio menor A. En otras modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de porciones de unión del antígeno de los mismos puede caracterizarse como unión especifica al virus de la rabia con una KD de menos de aproximad mantee 10 x 10~6 M. En una modalidad particular, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se une específicamente al virus de la rabia (v.gr., una glicoproteína G del virus de la rabia) con una KD de por lo menos aproximadamente 10 x 10~7 M, por lo menos aproximadamente 10 x 10"8 M, por lo menos aproximadamente 10 x 10~9 M, por lo menos aproximadamente 10 x 10~10 M, por lo menos aproximadamente 10 x 10"11 M, o por lo menos aproximadamente 10 x 10"12 M o una KD aún más favorable. En varias otras modalidades, los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos, incluyen una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 1), 6G11 (SEC ID NO: 15), 5G5, 2B10, o 1E5. En otras modalidades, los anticuerpos o porciones de unión del antígeno de los mismos incluyen una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 2), 6G11 (SEC ID NO: 16), 5G5, 2B10, o 1B5. En aún otras modalidades, los anticuerpos o porciones de unión de antígenos de los mismos incluyen una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 1), 6G11 (SEC ID NO: 15), 5G5, 2B10, o 1E5) , y una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena libera variable del clon 17C7 (SEC ID NO: 2), 6G11 (SEC ID NO: 16), 5G5, 2B10, o 1E5. En ciertas otras modalidades, los anticuerpos o porciones de unión de antígenos de las mismas se unen específicamente a un epítope que se traslapa con un epítope unido por un anticuerpo producido por el clon 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, O 1E5 y/ compite para unión a un virus de la rabia, o porción del mismo con un anticuerpo producido pro el clon 7C7, 6G11, 5G5, 1B10, o 1E5. Las regiones de cadena pesada y ligera variable de los anticuerpos o porciones de unión de antígeno del mismo incluyen normalmente una o más regiones que determinan complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) . Estas incluyen las regiones CDR1, CDR2, y CDR3. En modalidades particulares, la cadena pesada variable CDR son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% o más idénticas a una CDR del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 3, 4, 5), 6G11 (SEC ID NO: 17, 18, 19), 5G5, 2B10, o 1E5 (también mostrado en la Tabla 1) . En otras modalidades particulares, la cadena ligera variable CDR es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% o más idéntica a CDR o una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 6, 7, 8), 6G11 (SEC ID NO: 20, 21, 22), 5G5, 2B10 o 1E5 (también mostrado en la Tabla 2). Consecuentemente, los anticuerpos particulares o fragmentos de la invención comprenden una región de cadena pesada variable que incluye una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99%, o más idéntico a una CDR de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 3, 4, 5<) , 6G11 (SEC ID NO: 17, 18, 19), 5G5, 2B10, o 1E5 y una región de cadena ligera variable que incluye una o más CDR que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticas a una CDR o una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 6, 7, 8), 6G11 (SEC ID NO: 20, 21, 22), 5G5, 2B10 o 1E5. La región de cadena pesada variable de los anticuerpos o porciones de unión de antígeno de los mismos también puede incluir las tres CDR que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99%, o más idénticas a CDR de la región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 3, 4, 5), 6G11 (SEC ID NO: 17, 18, 19), 5G5, 2B10, o 1E5 y/o las tres CDR que son por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idénticas a la CDR de la región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el clon 17C7 (SEC ID NO: 6, 7, 8), 6G11 (SEC ID NO: 20, 21, 22), 5G5, 2B10, o 1E5. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos humanos o porciones de unión de antígeno de los mismos (a) incluyen una región variable de cadena pesada que se codifica por, o se deriva de (es decir, es el producto de un gen VH humano 3-30-3 o VH 3-33; y/o (b) incluye una región de variable de cadena ligera que se codifica por, o se deriva de, un gen VK humano seleccionado del grupo que consiste de V?L6, VKLII, VKL13, VKL15, O V?L19.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención incluyen anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, que incluyen un dominio efector (v.gr., un dominio de Fc) , así como porciones o fragmentos de anticuerpo tales como anticuerpos de cadena ligera y fragmentos de Fab. Los anticuerpos también pueden ligarse a una variedad de agentes terapéuticos (v.gr., agentes antivirales o toxinas) y/o un marcador. En otro aspecto, la invención provee polipéptidos aislaos que incluyen una porción de unión de antígeno de un anticuerpo producido por clon de hibridoma 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, o 1E5 (también denominado en la presente como "17C7", "6G11", "5G5", "2B10", y "1E5"). En otro aspecto, la invención provee ácidos nucleicos aislados incluyendo una secuencia que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo que por lo menos es 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEC ID NO: 13 o 23. La invención también provee ácidos nucleicos aislados que incluyen una secuencia que codifica una región variable de cadena ligera de anticuerpos que es por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más idéntica a SEC ID NO: 14 o 24. La invención también provee vectores de expresión que incluyen cualquiera de los ácidos nucleicos anteriores ya sea solos o en combinación (v.gr., expresados de uno o más vectores) , así como células huésped que comprenden dichos vectores de expresión. Las células huésped adecuadas para expresar anticuerpos de la invención incluyen una variedad de células eucarióticas, v.gr., células de levadura, células de mamíferos, v.gr., células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células de mieloma, o células de plantas. En otro aspecto, la invención provee composiciones y equipos que incluyen uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o porciones de unión de antígenos de los mismos como se describió en la presente que se unen específicamente a virus de la rabia e inhiben la capacidad del virus de infectar células de mamíferos. La composición o equipo además puede incluir uno o más anticuerpos (v.gr., anticuerpos monoclonales o policlonales humanos (o porciones de unión de antígeno de los mismos que se unen específicamente al virus de la rabia. En una modalidad, el anticuerpo policlonal o porción de unión de antígeno del mismo se une específicamente a la glicoproteína G del virus de la rabia. En una modalidad particular, la composición o equipo incluye (a) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a un primer aislado de virus de la rabia; y (B) un anticuerpo monoclonal humano aislado que se unen específicamente a un segundo aislado del virus de la rabia.

La invención también provee métodos para tratar virus de la rabia en un sujeto por administración al sujeto de un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión de antígeno del mismo como se describió en la presente (es decir, que se une específicamente al virus de la rabia) en una cantidad efectiva para inhibir la enfermedad del virus de la rabia, v.gr., síntomas mediados por el virus de la rabia o morbidez. Los anticuerpos monoclonales humanos o porciones de los mismos (y composiciones que comprenden a los anticuerpos o porciones de los mimos) de la invención, se pueden administrar en una variedad de formas adecuadas, v.gr., intravenosamente (IV), subcutáneamente (SC) , y preferiblemente, intramuscularmente (IM) al sujeto. El anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo puede administrase solo o en combinación con otro agente terapéutico, v.gr., un segundo anticuerpo monoclonal humano porción de unión de antígeno del mismo. En un ejemplo, el segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de unión del mismo se une específicamente a un segundo aislado del virus de la rabia que difiere den aislado unido al primer anticuerpo. En otro ejemplo, el anticuerpo se administra junto con otro agente, por ejemplo, un agente antiviral. En otro ejemplo, el anticuerpo se administra junto con una gama-globulina policlonal (v.gr., gama-globulina humana). En otro ejemplo, el anticuerpo se administra antes, después o contemporáneamente con una vacuna del virus de la rabia. En otro aspecto, la invención caracteriza métodos para formar un anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo que se unen específicamente a un virus de la rabia. En una modalidad, el método implica inmunizar un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgene de cadena pesada humana o un transgene de cadena aligera humana con una composición que incluye un virus de la rabia, v.gr., virus vivo o inactivado y aislando un anticuerpo, célula que produce anticuerpo, o ácido nucleico de codificación de anticuerpo del animal. El virus de la rabia puede inactivarse, por ejemplo, por tratamiento químico y/o liofilización. El método además puede incluir evaluar la unión del anticuerpo al virus de la rabia o glicoproteína G del virus de la rabia. La invención también provee métodos para crear los anticuerpos o porciones de unión de anfígeno de los mimos expresando ácidos nucleicos que codifican anticuerpos humanos en una célula huésped (v.gr., ácidos nucleicos que codifican la porción de región de unión de antígeno de un anticuerpo) . En aún otro aspecto, la invención provee un hibridoma o transfectoma incluyendo los ácido nucleicos mencionados antes .

La invención también provee un método para formar un hibridoma que expresa un anticuerpo que se une específicamente al virus de la rabia inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que incluye un transgene de cadena pesada humano y un transgene de cadena ligera humano, con una composición que incluye el virus de la rabia o glicoproteína G del virus de la rabia; aislando esplenocitos del animal; generando hibridomas de los esplenocitos; y seleccionando un hibridoma que produce un anticuerpo que se unen específicamente el virus de la rabia o proteína del virus de la rabia del mismo. El tratamiento de seres humanos con anticuerpos monoclonales humanos ofrece varias ventajas. Por ejemplo, los anticuerpos probablemente son menos inmunogénicos en seres humanos que los anticuerpos no humanos. La terapia también es rápida debido a que la inactivación del virus de la rabia no ocurre en cuanto el anticuerpo alcanza los sitios de infección y neutraliza directamente el virus de la rabia que causa la enfermedad. Los anticuerpos humanos también localizan los sitios apropiados en seres humanos más eficientemente que los anticuerpos no humanos. Además, el tratamiento es específico para el virus de la rabia, y es recombinante y altamente purificados y, a diferencia de las terapias tradicionales, evita el potencial de ser contaminado con agentes ventajosos.

Otros aspectos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve Descripción de los dibujos La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano contra la rabia (es decir, clon 17C7) recombinante. Estas secuencias corresponden a SEC ID NO: 1 y 2, respectivamente. Las regiones que determinan complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) para cada cadena se indican, correspondiendo a SEC ID NO: 3, 4, y 5 (de la cadena pesada) y 6, 7, y 8 (de la cadena ligera). La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano contra la rabia (es decir, clon 6G11) recombinante. Estas secuencias corresponden a SEC ID NO: 15 y 16, respectivamente. Las regiones que determinan complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) para cada cadena se indican, correspondiendo a SEC ID NO: 17, 18 y 19 (de la cadena pesada) y 20, 21 y 22 (de la cadena ligera) . La Figura 3 es una representación esquemática de la glicoproteína recombinante G del virus de la rabia indicando fragmentos que se analizaron para estudios de mapeo de epítope. El anticuerpo Humano 17C7 se determinó para unirse al epítope dentro de los residuos de aminoácidos 19-422 como se determinó por inmunoprecipitación e inmunotransferencia. La Figura 4 muestra la forma en que HuMa 17C7 neutraliza el virus de la rabia como se determina por RFFT cuando se diluye en serie de 1:5 a 1:390625 comparado con suero humano (HRIG) . La Figura 5 muestra glicoproteínas ERA-N y ERA-CO que se expresaron en células de 293T y se expresaron fácilmente cuando se optimizó el codón (A) que es capaz de unirse por 17C7 (B-D) cuando se expresa sobre la superficie de células. La Figura 6 muestra que HuMab 17C7 reconoce el ectodomino G de la rabia (A) y bajo condiciones no reductoras (B) así como al proteína G de la cepa ERA (C) . La Figura 7 muestra que HuMab 17C7 reconocen las glicoproteínas ERA de las mutantes N336K y N336D (A) por ELISA y por inmunotransferencia (B) . La figura 8 muestra que HuMab 17C7 neutraliza infección de pseudovirus de ERA de las células (A-B) y las consecuencias de varias mutaciones a la proteína G de ERA C-D) con respecto a la unión 17C7 del mismo. La Figura 9 muestra las consecuencias de varias mutaciones a la proteína G de ERA (A-B) con respecto a la unión de 17C7 a la misma.

Descripción Detallada de la Invención Con el fin de proveer un entendimiento claro de la especificación y reivindicaciones, se proveen en seguida las siguientes definiciones. Definiciones Como se usa en la presente, el término "virus de rabia" se refiere al virion o porción del mismo, por ejemplo la porción de proteína, tal como glicoproteína G del virus de la rabia que se codifica por el ARN del virus de la rabia. El término "anticuerpo del virus contra la rabia" es un anticuerpo que interactúa con (v.gr., se une a) un virus de la rabia o una proteína, carbohidrato, lípido y otro componente producido por, o asociado con el virus de la rabia. Un "anticuerpo de glicoproteína G del virus de la rabia" es un anticuerpo que se une a una glicoproteína G del virus de la rabia o un fragmento de mismo. Un virus contra la rabia o anticuerpo de glicoproteína G puede unirse a un epítope, v.gr., un epítope conformacional o lineal, o una porción o fragmento del virus o componente del mismo. El término "anticuerpo humano" es un anticuerpo que tiene regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos descritos en la presente pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (v.gr., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatorio a o específica para sitios in vitro o por mutación somática in vivo) . Un anticuerpo del virus contra la rabia, o porción de unión de antígenos de la misma, se puede administrar sola o en combinación con un segundo agente. El sujeto puede ser un paciente infectado o que se sospecha que está infectado con virus de la rabia o que tiene un síntoma de enfermedad mediada por el virus de la rabia (v.gr., una neuropatología, encefalomielitis o titulación del suero de inmunoglobulina contra la rabia) . El tratamiento puede usarse para curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, aminorar, paliar, mejorar o afectar la infección y la enfermedad asociada con la infección, los síntomas de la enfermedad, o una predisposición hacia la enfermedad. Para el manejo clínico de infección del virus de la rabia, "tratamiento" frecuentemente se entiende que significa la profilaxis o prevención de una infección productiva antes del inicio de la enfermedad. Una cantidad del anticuerpo del virus contra la rabia efectivo para trata r una infección del virus de la rabia, o una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad del anticuerpo que es efectivo, en administración de una sola dosis o múltiples dosis a un sujeto, para inhibir la infección por virus de la rabia, enfermedad, o secuelas de la misma, en un sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede variar de acuerdo con los factores tales como el estado de enfermedad, sitio de herida, cepa o aislado del virus de la rabia, vector animal de virus de la rabia, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual se sopesa cualquier anticuerpo o porción de anticuerpo por los efectos terapéuticamente benéficos. La capacidad de un anticuerpo para inhibir un parámetro que puede medirse puede evaluarse en un sistema de modelo animal que precie la eficacia en seres humanos. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo el virus contra la rabia para proteger a los hámsters de confrontación letal con el virus de la rabia puede predecir la eficacia en seres humanos como se describió en los Ejemplos. Alternativamente, esta propiedad de un anticuerpo o composición de anticuerpos puede evaluarse examinando al capacidad del compuesto para modular las interacciones del virus/célula de la rabia, v.gr., unión, infección, virulencia, y similares, por el análisis in vitro conocido por los expertos. Loa análisis in vitro incluyen los análisis de unión tales como ELISA, y análisis de neutralización . Una cantidad de anticuerpo del virus o contra la rabia efectivo para prevenir un trastorno o una "cantidad profilácticamente efectiva" del anticuerpo es una cantidad que es efectiva, por la administración de una sola dosis o múltiples dosis al sujeto, para evitar o retardar la presentación de inicio o recurrencia de virus de la rabia, o inhibiendo un síntoma del mismo. Sin embargo, si se desean intervalos más largos de protección, se pueden administrar dosis incrementada o dosis más frecuentes. Los términos "antagoniza", "induce", "inhibe", "potencia", "eleva", "incrementa", "disminuye", o similares, v.gr., que denota diferencias cuantitativas entre dos etapas, se refiere a una diferencia, v.gr., una diferencia estadísticamente o clínicamente significativa, entre las dos etapas . El término "unión específica" o "se une específicamente a" se refiere a la capacidad de un anticuerpo a unirse a un virus de la rabia o porción del mismo, con una afinidad de por lo menos 1 x 10"6 M, y/o se unen a un virus de la rabia, o porción del mismo, con una afinidad que es por lo menos dos veces mayor que su afinidad para un antígeno no específico. Un "anticuerpo" es una proteína que incluye por lo menos uno o dos, regiones variables de cadena pesada (H) (abreviada en la presente como VH) , y por lo menos una o dos regiones variables de cadena ligera (L) (abreviada en la presente como VL) . Las regiones de VH y VL además pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, llamado "regiones que determinan complementariedad" (CDR) intercalados con regiones que se conservan más, llamados "regiones de estructura" (FR, por sus siglas en inglés) . El grado de la región de estructura y CDR se ha definido precisamente (véase, Kabat, E.A., y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de E.U.A. de Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242, 1991, y Chothia, C. y otros, J. Mol. Bio. 196:901-917, 1987, que se incorpora aquí por referencia) . Preferiblemente cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos de terminaciones amino a terminaciones carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones de VH o VL del anticuerpo además pueden incluir todo o parte de una región constante de cadena pesada o ligera. En una modalidad, el anticuerpo es un tetrámero de dos cepas de inmunoglobulina pesadas y dos cepas de inmunoglobulina ligera, en donde las cepas de inmunoglobulina pesada y ligera están interconectadas por, v.gr., enlaces disulfuro. La región constante de cadena pesada incluyen tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. La región variable de las cepas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median normalmente la unión del anticuerpo a tejidos huésped o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (v.gr., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye inmunoglobulinas intactas de los tipos de TgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de los mismos), en donde las cepas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. El término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consiste de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa (IgAl y IgA2) , gama (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta (IgD) , epsilon (IgE), mu (IgM), así como los genes de región variable de inmunoglobulina de miríada. Las "cepas ligeras" de inmunoglobulina de longitud completa (alrededor de 25 KD y 214 aminoácidos) se codifican por un gen de región variable en la terminación NH2 (alrededor de 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en la terminación COOH. Las "cepas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KD y 446 aminoácidos) , se codifican similarmente por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados antes, v.gr., gama (que codifican aproximadamente 330 aminoácidos) . El término "inmunoglobulina" incluye una inmunoglobulina que tiene CDRs de una fuente humana o no humana, v.gr., una estructura de murinos modificada para disminuir antigenicidad en seres humanos una estructura sintética, v.gr., una secuencia consensual. Una región de inmunoglobulina madura /anticuerpo normalmente se evita de una secuencia líder. Además las inmunoglobulinas/anticuerpos se pueden distinguir por sus regiones constantes en la clase (v.gr. IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM) y la subclase o isotipo (v.gr, IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4). El término "porción de unión de antígenos" de un anticuerpo o simplemente "porción de anticuerpos", o "porción"), como se usa en la presente, se refiere a una porción de un anticuerpo que se une específicamente a un virus de la rabia o componente del mismo (v.gr., glicoproteína G) , v.gr., una molécula en la cual una o más cepas de inmunoglobulina no es de longitud completa, pero que se une específicamente a un virus de la rabia o componente del mismo. Ejemplos de porciones de unión abarcadas entro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluir (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que cosiste de los dominios de VL, VH, CL y CH1; (ii) fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento de Fd que consiste del domino de VH y CHl; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios Fl y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward y otros, Nature 341:544-546, 1989), que consiste de un domino de VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR) que tiene suficiente estructura para unirse específicamente, v.gr., a una porción de unión de antígeno de una región variable. Una porción de unión de antígeno de una región variable de cadena ligera y una porción de unión de antígeno de una región variable de cadena pesada, v.gr., los dos dominios del fragmento de Fv, VL y VH, pueden unirse usando métodos recombinantes, por un ligador sintético que les permite que se formen como una sola cadena de proteínas en la cual los pares de regiones de VL y VH formen moléculas monovalentes (conocidas como Fv de una sola cadena (scFv) ; véase v.gr., Bird y otros (1988) Science 242:243-426; y Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla también se abarcan dentro del termino "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. Estas porciones de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la materia, y las porciones se tamizan para utilidad en la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que exhibe una sola especificidad de unión y afinidad para un blanco particular, v.gr., epítope. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" que se usa en la presente se refiere a una preparación de anticuerpos o porciones de los mismos con una sola composición molecular. El término anticuerpo "recombinante", como se usa en la presente, se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean, o asilan por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un veto de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios, recombinantes, los anticuerpos aislados de un animal (v.gr., un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos o anticuerpos preparados, expresados, creados, o aislados por cualesquiera otros medios que implican la división de las secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos de CDR humanizados, injertados, quiméricos, generados in vitro (v.gr., por despliegue de datos) , y opcionalmente pueden incluir regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. El término "sustancialmente idéntica" (o "sustancialmente homologa") se refiere a un primer aminoácido o secuencia de nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (v.gr., con una cadena lateral similares, v.gr., sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de manera que las primera y segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos tiene actividades similares. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene por lo menos 50% de la afinidad del primer anticuerpo. Los cálculos de "homología" entre dos secuencias se llevan a cabo de la siguiente manera. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (v.gr., se pueden introducir espacios en una o ambas de las primera y segunda secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos para la alineación óptima y las secuencias no homologas pueden omitirse para fine de comparación) . La longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación por lo menos es del 50% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes o posiciones de nucleótidos se compran. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótidos que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición (como se usa en la presente, "identidad" aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico) . La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de espacios y la longitud de cada espacio, que necesita ser introducido para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de homología porcentual entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. La homología porcentual entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 970, que se ha incorporado en el programa de GAP en el paquete de software de GCG, usando una matriz de clasificación de Blossum 62 con una penalidad de espacios de 12, una penalidad de extensión de espacios de 4, y una penalidad de espacios de cambio de estructura de 5. Cornos se usa en la presente, el término se "hibridiza bajo condiciones de baja restricción, restricción media, restricción alta, o restricción muy alta" describe condiciones para hibridización lavado. La guía para llevar a cabo reacciones de hibridización se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6., 1989, que se incorpora aquí por referencia. Los métodos acuosos y no acuosos se describieron en la referencia y se pueden usar. Las condiciones de hibridización específicas denominadas en la presente como sigue: 1) condiciones de hibridización de baja restricción: 6X cloruro de sodio (citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por dos lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS por lo menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede incrementarse a 55°C para condiciones de baja restricción) ; 2) condiciones de hibridización de restricción media: 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 60°C; 3) condiciones de hibridización de alta restricción: 6X XXC a aproximadamente 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 65°C; y 4) condiciones de hibridización de alta restricción: 0.5 M fosfato de sodio, 7% SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1% SDS a 65°C. Se entiende que los anticuerpos y porciones de unión de antígeno de las mismas descritas en la presente pueden tener sustituciones de aminoácidos conservadoras o no esenciales adicionales, que no tienen el efecto sustancial en las funciones de polipéptidos. Ya sea que se tolere o no una sustitución particular, es decir, que no afecte adversamente las propiedades biológicas deseadas, tales como actividad de unión, se puede determinar como se describió en Bowie y otros, Science, 247: 1306-1310, 1990. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la cual se reemplaza un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cepas laterales similares. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cepas laterales similares se han definido en la materia. Estas familias incluyen aminoácidos con cepas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina), cepas laterales acidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico), cepas laterales polares no cargadas (v.gr., asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cepas laterales no polares (v.gr., glicina, alanina valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cepas laterales beta-ramificadas (v.gr., treonina, valina, isoleucina) y cepas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Un residuo de aminoácidos "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo silvestre de un polipéptido, tal como un agente de unión, v.gr., un anticuerpo, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un resido de aminoácidos da como resultado un cambio. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos adecuados y materiales se describen más adelante. En caso de conflicto, controlará la presente especificación, incluyendo definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes.

Revisión General El virus de la rabia es un virus de ARN que ocasiona encefalitis fatal en seres humanos. En la presente se proveen métodos y composiciones para el tratamiento y prevención de animales infectadas con el virus de la rabia, en particular, sujetos humanos, más particularmente, seres humanos que necesitan de tratamiento contra la rabia después de la exposición o profilaxis posterior a la exposición (PPE) . Las composiciones incluyen anticuerpos que reconocen proteínas y otros componentes moleculares (v.gr., lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos) de virus de la rabia, incluyendo anticuerpos que reconocen la glicoproteína G del virus de la rabia, o porción de la misma. En particular, se proveen anticuerpos monoclonales humanos completamente recombinantes. En ciertas modalidades, estos anticuerpos monoclonales humanos son producidos en ratones que expresan segmentos de genes de inmunoglobulina humana, (descritos mas adelante) . También se proveen combinaciones de anticuerpos de virus contra la rabia. Los nuevos métodos incluyen administrar anticuerpos (y porciones de unión de antígenos de los mismos) que se unen al virus de la rabia en un sujeto para inhibir enfermedad mediada por virus de rabias en el sujeto. Por ejemplo, los anticuerpos de virus contra la rabia monoclonales humanos puede neutralizar virus de la rabia e inhibir infección por rabia en la etapa final y encefalitis. En otros ejemplos, las combinaciones de anticuerpos de virus contra la rabia (v.gr., anticuerpos monoclonales de glicoproteína G del virus contra la rabia) se pueden administrar para inhibir enfermedad mediada por el virus de la rabia. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden administrarse localmente (infiltrarse) en el sitio de la herida de infección por rabia y, opcionalmente, seguido por la administración de una vacuna contra a rabia.

Generación de Anticuerpos Inmunógenos En general, los animales se inmunizaron con virus y/o anfígenos expresados por el virus de la rabia para producir anticuerpos. Para producir anticuerpos del virus contra la rabia, los animales se inmunizan normalmente con virus de la rabia inactivado. El virus de la rabia puede inactivarse, v.gr., por tratamiento químico y/o liofilización y varias vacunas del virus de la rabia están comercialmente disponibles . Los anticuerpos de virus contra la rabia que se unen y neutralizan el virus de la rabia pueden interactuar con epítopes específicos del virus de la rabia, por ejemplo, glicoproteína G del virus de la rabia. Por ejemplo, una glicoproteína G del virus contra la rabia puede unirse a un epítope dentro de una región N-terminal de la glicoproteína G del virus de la rabia. O una región C-terminal o una región interna de la proteína o fragmento de la misma (ver Ejemplo 4 y Fig. 5) o una combinación de los mismos. En un ejemplo, un anticuerpo que se une y neutraliza el virus de la rabia se une a un epítope, por ejemplo, un epítope lineal, dentro de los aminoácidos 19-422 de la glicoproteína G del virus de la rabia. En otro ejemplo, se identifica un anticuerpo que se une a un epítope lineal y/o epítope conformacional dentro de los aminoácidos 19-422 de la glicoproteína G del virus de la rabia. Como se trató en la presente, dichos epítopes también se pueden usar para identificar otro anticuerpos que se unen a la rabia. Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos en Ratones HuMAb Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en una forma que no es posible con anticuerpos policlonales. Los antisueros policlonales varían de animal a animal, mientras que las preparaciones monoclonales exhiben una especificidad antigénica uniforme. Los sistemas de animales de murinos son útiles para generar anticuerpos monoclonales, y protocolos de inmunización, técnicas para aislar y fusionar esplenocitos, y métodos y reactivos para producir hibridomas son bien conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencionales, v.gr., la técnica de hibridización de células somáticas normales, de Kohler y Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Véase generalmente, Harlow, E. y Lañe, D. Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Aunque se conocen estas técnicas normales, es conveniente usar anticuerpos humanizados o humanos en lugar de anticuerpos de murinos para tratar sujetos humanos, debido a que los humanos montan una respuesta autoinmune a anticuerpos de ratones y otras especies. La respuesta inmune a anticuerpos de murinos se llama un anticuerpo anti-ratón humanos o respuesta de HAMA (Schroff, R. y otros, Cáncer Res., 45, 879-885, 1985) y es una condición que ocasiona enfermedad del suero en seres humanos y da como resultado la rápida eliminación de los anticuerpos de murinos de una circulación individual. Se ha mostrado que la respuesta inmune en humanos es contra las regiones variables y constantes de inmunoglobulinas de murinos. Los anticuerpos monoclonales humanos son más seguros para la administración a seres humanos que los anticuerpos derivados de otros animales y anticuerpos policlonales humanos. Un tipo útil de animal en el cual generan anticuerpos monoclonales humanos es un ratón transgénico que expresa genes de inmunoglobulina humana en lugar de sus propios genes de inmunoglobulina de ratones. Dichos ratones transgénicos, v.gr., ratones "HuMAb™", contienen mini sitios de genes de inmunoglobulina humana que codifica cadena pesada (µ y ?) y ligera K humana no rearregladas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los sitios de cepas µ y K endógenas (véase v.gr., Lonberg, N. y otros, Nature 368 (6474): 856-859, 1994, y Patente de E.U.A. 5,770,429). Consecuentemente, los ratones exhiben expresión reducida de ratones IgM o K, y en respuesta la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos se someten a intercambio de clases y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG? de alta afinidad (Lonberg, N. y otros, supra; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; Lonberg, N. y Huszar, D., Intern, Rev. Immunol. 13: 65-93, 1995, y Harding F. y Lonberg, N, Ann. N.Y. Acad. Sci., 764: 536-546, 1995).

La preparación de dichos ratones transgénicos se describió en mayor detalle en Taylor, L. y otros, Nucleic Acids Reserarch, 20: 6287-6295, 1992; Chen, J. y otros, International Immunology 5: 647-656, 1993; Tuaillon y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA 90:37203724, 1993; Choi y otros, Nature Genetics, 4:117-123, 1993; Chen, J. y otros, EMBO J. ,12: 821-830, 1993; Tuaillon y otros, J. Immunol., 152:2912-2920, 1994; Taylor, L. y otros, International I munology, 6: 579-591, 1994; y Fishwild, D. y otros, Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996. Ver además, Patente de E.U.A. 5,545,806; Patente de E.U.A. 5,569,825, Patente de E.U.A. 5,625,126, Patente de E.U.A. 5,633,425, Patente de E.U.A. 5,661,016, Patente de E.U.A. 5,770,429, Patente de E.U.A. 5,789,650, Patente de E.U.A. 5,814,318, Patente de E.U.A. 5,874,299 y Patente de E.U.A. 5,877,397, todas de Lonberg and Kay, y Publicaciones de PCT Nos. WO 01114424, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, y WO 92/03918. Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos a un antígeno, los ratones HMAb pueden inmunizarse con un inmunógeno, como se describió por lNber, N. y otros, Nature, 368(6474): 856-859, 19943; Fishwild, D. y otros, Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996 y WO 98/ 24884. Preferiblemente, los ratones tienen de 6-16 semanas de edad desde la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada de virus de la rabia inactivados pueden usarse para inmunizar intraperitonealmente ratones HuMAb. Para generar anticuerpos contra proteínas, lípidos y/o moléculas de carbohidratos del virus de la rabia, se pueden inmunizar ratones con virus de la rabia inactivados y/o liofilizados muertos o no viables. En otra modalidad, una glicoproteína del virus G de la rabia, o uno o más fragmentos de la misma, se pueden usar como un inmunógeno. Los ratones transgénicos HuMab responden mejor cuando se inmunizan inicialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante de Freund completo, seguido por inmunizaciones de IP cada semana (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. La respuesta inmune puede monitorearse sobre el curso del protocolo de inmunización obteniéndose muestras de plasma por sangrados retro-orbitales. El plasma puede tamizarse, por ejemplo, por ELISA o por citometría, y los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana del virus contra la rabia se pueden usar para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con antígeno 3 día antes de sacrificarse y la remoción del bazo. Se espera que se puedan requerir realizar múltiples fusiones para cada antígeno. Varios ratones normalmente se inmunizan para cada antígeno. Los esplenocitos de ratones pueden aislarse y fusionarse con PEG a una línea celular de mieloma de ratón con base en protocolos normales, los hibridomas resultantes luego se tamizan para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Por ejemplo, las suspensiones celulares únicas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan una sexta parte el número de células de mieloma de ratón no secretor P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Las células se siembran en placas a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo conteniendo 20% de Suero de Clon fetal, 19% de medio condicionado "653", 5% (IGEN) de origen, 4 mM de L-glutamina, 1 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 5 mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetano. 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y lxHAT (Sigma; se agregó HAT 24 horas después de la fusión) . Después de dos semanas, se sembraron en cultivos las células en el medio en el cual se reemplazó HAT con HT. Los sobrenadantes de pozos individuales se tamizaron por ELISA para IgM monoclonal de virus contra la rabia humano y anticuerpos IgG. Los hibridomas secretores de anticuerpos se volvieron a sembrar en placas, se tamizaron de nuevo y si aún son positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales de virus contra la rabia, se pueden subclonar en por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables luego se cultivan in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización . En una modalidad, el animal transgénico usado para generar anticuerpos humanos al virus de la rabia contiene por lo menos uno, normalmente de 2-10, y algunas veces 25-50 o más copias del transgene descrito en el Ejemplo 12 o WO 98/24884 (v.gr., pHCl o pHC2) criado como un animal que contiene una sola copia de un transgene de cadena ligera descrito en los Ejemplos 5, 6, 8, ó 14 de WO 98/24884, y la descendencia desarrollada con el animal suprimido de JH descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884, el contenido de las cuales se incorpora expresamente por referencia. Los animales se desarrollan para ser homocigotos para cada uno de estros tres rasgos. Dichos animales tienen el siguiente genotipo; una sola copia (por grupo de haploide de cromosomas) de un mini-sitio no rearreglado de cadena pesada humana (descrito en el ejemplo 12 de WO 98/24884), una sola copia (por conjunto de haploide de cromosomas) de una construcción de cadena ligera K humana rearreglada (descrita en el Ejemplo 14 de WO 98/24884), y una supresión en cada sitio de cadena pesada de ratón endógena que remueve todos los segmentos funcionales de JH (descritos en el Ejemplo 10 de WO 98/24884). Dichos animales se desarrollan con ratones que son homocigotos para la supresión de los segmentos de JH (Ejemplos 10 de WO 98/24884) para producir descendencias que son homocigotas para la supresión de JH y hemicigotas para las construcciones de cadena pesada y ligera humana. Los animales resultantes se inyectan con antígenos y se usan para producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos. Las células B aisladas de dicho animal son monoespecificas con respecto a las cepas pesada y ligera humanas debido a que contiene únicamente una sola copia de cada gen. Además, serán mono-específicas con respecto a cepas humanas o de ratones debido a que ambas copias de genes de cadena pesada de ranotes endógenas son no funcionales en virtud de la expansión de supresión de la región de JH introducida como se describió en los Ejemplo 9 y 12 de WO 98/24884. Además, una fracción sustancial de las células B serán no específicas con respecto a las cepas ligeras humanas o de ratón, debido a que la expresión de una sola copia del gene de cadena ligera kappa humana rearreglada de los genes de cadena kappa y lambda de ratón endógeno en una fracción importante de las células B. En una modalidad, el ratón transgénico exhibirá producción de inmunoglobulina con un repertorio importante, finalmente sustancialmente similar al de un ratón nativo. Por lo tanto, por ejemplo, en modalidades en donde los genes de Ig endógenos se han inactivado, los niveles de inmunoglobulina total variarán de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml de suero, v.gr., 0.5 a 5 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml. Cuando un transgene capaz de efectuar un intercambio con IgG de IgM se ha introducido en el ratón transgénico, la relación de ratón adulto de suero IgG a IgM preferiblemente es de aproximadamente 10:1. La relación de IgG a IgM será bastante inferior en el ratón inmaduro. En general, mayor a aproximadamente 10%, v.gr., aproximadamente 40 a 80% del bazo y células de nodo linfático B expresará proteína IgG exclusivamente humana. El repertorio en el ratón transgénico idealmente será aproximado al mostrado en un ratón no transgénico, usualmente será tan alto como por lo menos aproximadamente 10%, preferiblemente tan alto como 25 a 50% o más. Generalmente, por lo menos aproximadamente mil diferentes inmunoglobulinas (idealmente IgG) , preferiblemente 104 a 106 o más, serán producidos, dependiendo principalmente del número de diferentes regiones de V, J, y D, introducido en el genoma de ratones. Normalmente, las inmunoglobulinas exhibirán una afinidad para antígenos preseleccionados de por lo menos aproximadamente 10"6M 10"7M, 10"8M, 10"9M, 1010M, 10"nM, 10"12M, 10"13M, 10"14M, o mayor, v.gr., hasta 10"15M o más. Los ratones HuMAb pueden producir células B que sufren de recombinación de intercambio intratransgénico vía intercambio de clases (intercambio cis) y expresan inmuoglobulinas reactivas con el virus de la rabia. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencia humana, en donde los polipéptidos de cadena pesada y ligera se codifican por secuencias de transgenes humanos, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y uniones recombinatorias de la región V, así como secuencias codificadas por la línea germinal. Estas inmunoglobulinas de secuencias humanas pueden denominarse como sustancialmente idénticas a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen de VL o VH humano y un segmento de JL humano o JL, aunque pueden estar presentes otras secuencias que no sean de línea germinal como resultado de mutación somática y uniones de recombinación de V-J y V-D-J diferencial. Con respecto a dichos anticuerpos de secuencia humana, las regiones variables de cada cepa normalmente son codificadas por lo menos 80 por ciento por segmentos de genes de la línea germinal humana V, J y en el caso de cepas pesadas, D. Frecuentemente, por lo menos 85 por ciento de las regiones variables se codifican por secuencias de la línea germinal presente en el transgene. Con frecuencia, de 90 a 95 por ciento o más de las secuencias de la región variable se codifican por las secuencias de la línea germinal humana en el transgene. Sin embargo, dado que no se introducen secuencias que no son líneas germinales se introdujeron por la mutación somática y las uniones de VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia humana frecuentemente tendrán algunas secuencias de región variable (y secuencias de región menos frecuentemente constantes) que no se codifican por segmentos de genes V, D, o J humanos como se encuentran en el transgene humano en la línea germinal de los ratones. Normalmente, dichas secuencias no germinales (o posiciones de nucleótidos individuales) se agruparon en o cerca de las CDR, 0 en regiones en donde se sabe que se agrupan las mutaciones somáticas . Los anticuerpos de secuencias humanas, que se unen al virus de la rabia, pueden resultar de intercambios de isotipos, tales como anticuerpos humanos que comprenden una cadena gama de secuencia humana (tales como gama 1, gama 2, o gama 3) y se produce una cadena ligera de secuencia humana (tal como K) . Dichos anticuerpos de secuencias humanas intercambiadas por isotipos con frecuencia contienen una o más mutaciones somáticas, normalmente en la región variable y con frecuencia dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) como resultado de maduración de afinidad y selección de células B por antígeno, particularmente confrontación de antígeno subsiguiente a secundario (o subsiguiente) . Estos anticuerpos de secuencias humanas de alta afinidad tienen afinidades de unión de por lo menos aproximadamente 1 x 10~9 M, normalmente por lo menos 5 x 10~9 M, frecuentemente más de 1 x 10"10M, y algunas veces 5xl0"10M a lxlO"nM o mayor.

Los anticuerpos de virus contra la rabia también pueden originarse en otros mamíferos, incluyendo ratones no transgénicos, seres humanos, conejos y cabras. Anticuerpos de Virus Contra la Rabia Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a virus de la rabia incluyen anticuerpos producidos por los clones 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y 1E5 descritas en la presente (denominados como, respectivamente, clones de anticuerpos 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y 1E5) . Los anticuerpos con las regiones de cadena pesada variable y cadena ligera variable que por lo neos son 80% idénticas a las regiones de cadena pesada y ligera variable de 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, o 1E5 también se puede unir a virus de la rabia. En modalidades relacionadas, los anticuerpos de virus contra la rabia incluyen, por ejemplo, regiones determinantes de complementariedad (CDR) que por lo menos son 80% idénticas para la CDR de las cepas pesadas variables y/o cepas ligeras variables de 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, o 1E5. Las CDR de las regiones de cadena pesada variable de estos clones de anticuerpos se muestran en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de Aminoácidos de CDR de Cadena Pesada Variable Las CDR de las regiones de cadena ligera variable estos clones se muestran en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2. Secuencias de Aminoácidos de CDR de Cadena Ligera Variable CDR son las porciones de inmunoglobulinas que determinan especificidad para un antígeno particular. En ciertas modalidades, CDR que corresponden a las CDR en las Tablas 1 y 2 que tienen variaciones de secuencias (v.gr., sustituciones conservadoras) pueden unirse al virus de la rabia. Por ejemplo, las CDR, en la cuales se sustituyen o suprimen, 1, 2, 3, 4, ó 5 residuos o menos de 20% de residuos totales en la CDR, pueden estar presentes en un anticuerpos (o porción de unión de antígeno del mismo) que se une al virus de la rabia. Similarmente, los anticuerpos de virus contra la rabia pueden tener CDR que contienen una secuencia consensual, como motivos de secuencia conservados entre múltiples anticuerpos pueden ser importantes para actividad de unión. Por ejemplo, la invención provee el uso de una o más regiones de CDR o derivados de CDR descritas. Dichas CDR de derivados se derivan de una CDR o porción de la misma y, opcionalmente, se alteran en una o más posiciones de aminoácidos. Las alteraciones incluyen una o más adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos como se describe en la presente. Las posiciones de residuos ilustrativas para alteración incluyen aquellas posiciones de aminoácidos identificadas como sujetas a más varianza que otras posiciones de aminoácidos, por ejemplo, posiciones sujetas a mutaciones somáticas como se conoce en la materia. Alternativamente, dichas posiciones pueden identificarse comparando dos o más secuencias conocidas por tener la actividad de unión deseada e identificando residuos de CDR que varían y residuos de CDR que son constantes. Por ejemplo, una comparación de las regiones variables de las cepas pesada ligera de 17C7 y 6G11 se presentan más adelante (Tablas 3-4) y se muestran las secuencias derivadas o consensúales CDR que pueden determinarse de las mismas (Tablas 5-6) .

Tabla 3. Comparación de Regiones Variables de Cadena Pesada Comparación de: 17c7H -126 aa 6G11H -125 aa Usando archivo de matriz: Blosum50, penalidades de espacio: -14/-4 87.2% identidad en traslapamiento de 125 aa; clasificación 731 10 20 30 40 50 60 QVQ VES GGG WQ PGRS RLS CAASG FT FSTYAMH VRQAPGKGLE VAWSYDGRTKDY QVOLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMH VRQAPGKG EWAVII.YDGSNKYH 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 ADSVKGRFTISRD-1SKNT YLQMNSLRTEDTAVYFCARERFSGAYFDYWGQGTLVTVSS? ADSVKGRFTISRD-IS NTI-YLQMNSLR?EDTAVYYCARIAPAGSAFDY GQGTLVTVSSA 70 80 90 100 110 120 _ STKGP SEC ID NO _ STKGP SEC ID NO Tabla 4. Comparación de Regiones Variables de Cadena Ligera Comparación de: 17c7H -107 aa 6G11H -106 aa Usando archivo de matriz: Blosum50, penalidades de espacio: - 14/-4 71.4% identidad en traslapamiento de 106 aa; clasificación 527 10 20 30 40 50 60 IVLTQSPAT S SPGERAT SCRASQSVSSYIAWYQQKPGQAPRL IYDAS-mATGIPAR IQLTQSPSSLSAS GDRV ITCRASQGISSVLAWYQQKSGKAPKF I DASS ESGVPSR 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYSCQQRNNWPPTFGGGTKVBIK SEC ID NO: FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPPTFGQGTKLEIK SEC ID NO: Los derivados de CDR ilustrativos o secuencias consensúales se presentan en seguida: Tabla 5. Derivados de CDR de Cadena Pesada Tabla 6. Derivados de CDR de Cadena Ligera También se entiende que uno o más de las CDR descritas en la presente (incluyendo secuencias derivada o consensúales de CDR) pueden usarse para identificar CDR presentes en la naturaleza que también son adecuados para unirse a epítope de virus de la rabia. Las CDR también se pueden combinar o clonar cruzadamente entre las regiones variables, por ejemplo, CDR de cadena ligera, pueden introducirse en regiones variables de cadena pesada y CDR de cadena pesada pueden introducirse en regiones variables da cadena ligera y tamizarse para asegurar que se retiene la unión específica. Los anticuerpos de virus contra la rabia humanas pueden incluir regiones variables que son producto de, o derivados de, genes de inmunoglobulina humana específica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluir una región de cadena pesada variable que es el producto de, o derivados de, un gen VH humano 3-30-3 o VH3-33 (véase, v.gr., Acc. No.: AJ555951, Gl No.: 29826865; Ac. No.: AJ556080, Gl No.: 29837087; Ac. No. : AJ556038, Gl No. : 29837012, y otros segmentos de genes redispuestos VH3-33 humanos provistos en GenBank®) . Los anticuerpos también, o alternativamente, incluyen una región de variable de cadena ligera que es el producto de, o derivo de un gen V?L6, VKLII, VKL13, VKL15, O VKL19 (véase, v.gr., GenBank® Ac. No.: AJ556049, Gl No.: 2987033 para una secuencia parcial de un segmento de gen V?L19 humado rearreglado) . Como se conoce en la materia, y se describe en esta sección, anterior, las regiones de inmunoglobulina variable de anticuerpos recombinados se derivan por un proceso de recombinación in vivo en el cual se introduce la variabilidad a segmentos genómicos que codifican las regiones. Consecuentemente, las regiones variables derivadas de un gen VH o VL humano pueden incluir nucleótidos que son diferentes a aquellos en el gen encontrado en tejidos no linfoides. Estas diferencias de nucleótidos normalmente se concentran en las CDR. Además, lo anticuerpos anteriores exhiben actividad de unión a un virus de la rabia y, en particular a uno o más epítopes de glicoproteínas G de la rabia. Dichos anticuerpos además exhiben actividad de neutralización del virus de la rabia y eficacia protectora in vivo contra secuelas de la rabia como se describió más adelante y en los ejemplos. 2. Producción y Modificación de Anticuerpos Muchas formas diferentes de anticuerpos de virus contra la rabia pueden ser útiles en la inhibición de enfermedad mediada por virus de la rabia. Los anticuerpos pueden ser de varios isotipos, incluyendo: IgG (v.gr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD, o IgE. Preferiblemente, el anticuerpo es un isotipo de IgG, v.gr., IgGl. Las moléculas de anticuerpos pueden ser de longitud completa (v.gr., un anticuerpo IgGl, IgG2, IgG3, o IgG4) o puede incluir solo un fragmento de unión de antígeno (v.gr., un Fab, F(ab')2, Fv o un solo fragmento de Fb de una sola cepa). Estos incluyen anticuerpos (v.gr., anticuerpos monoclonales humanos), anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados, así como porciones de unión de antígenos de lo anterior. Los anticuerpos del virus contra la rabia o porciones de los mismos útiles en la presente invención también pueden ser anticuerpos recombinantes producidos por células huésped transformadas con ADN que codifica cepas ligera pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo deseado. Los anticuerpos recombinantes pueden producirse por técnicas de ingeniería genética conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden producirse clonando una secuencia de nucleótidos, v.gr, un ADNc o ADN genómico, que codifica las cepas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica los polipéptidos se inserta luego en un vector de expresión de manera que ambos genes de ligan operativamente a sus propias secuencias de control de expresión transcripcional y traslacional. Las secuencias de vector de expresión y control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. Normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Se pueden usar las células huésped procarióticas o eucarióticas. La expresión en células huésped eucarióticas se prefiere dado que dichas células tienen más probabilidad que las células procarióticas de asemejarse y secretar un anticuerpo duplicado apropiadamente e inmunológicamente activo. Sin embargo, cualquier anticuerpo producido que es inactivo debido a la duplicación inapropiada puede renaturalizarse de acuerdo con los métodos bien conocidos (Kim y Baldwin, An, Rev. Bioche., 51:459-89, 1982). Es posible que las células huésped produzcan porciones de anticuerpos intactos, tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada, que también son homólogos de anticuerpos de acuerdo con al presente invención. Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden producir en un transfectoma de células huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección como es bien conocido en la materia (Morrison, S., Science, 229:1202, 1985). Por ejemplo, en una modalidad, los genes de interés, v.gr., genes de anticuerpos humanos, pueden ligarse en un vector de expresión tal como plásmido de expresión eucariótica tal como se usa en un sistema de expresión de genes de GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841, o en otros sistemas de expresión bien conocidos en la materia. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados pueden introducirse en las células huésped eucarióticas tales como células de CHO, o células de NSO o alternativamente otras células eucarióticos como células derivadas de planta, hongos, o células de levaduras. El método usado para introducir estos genes puede ser cualquier método descrito en la materia tal como electroporación, lipofectina, lipofectamina, transfección (v.gr., medida por cloruro de calcio) o transfección balística, en la cual se bombardean células con micropartículas portando el ADN de interés (Rodin, y otros, Immunol. Lett., 74(3): 197-200, 2000). Después de introducir estos genes de anticuerpos en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que pueden amplificarse para su nivel de expresión y aumentarse para producir anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden ser aislados y purificados de estos sobrenadantes de cultivos y/o células usando técnicas normales . Se entenderá que las variaciones de los procedimientos anteriores son útiles en la presente invención. Por ejemplo, puede ser conveniente transformar una célula huésped con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo. La tecnología de ADN recombinante puede usarse también para remover algo o todo el ADN que codifica ya sea una o ambas de las cepas ligera y pesada que no es necesario unirse, v.gr., la región constante puede modificarse, por ejemplo, para suprimir aminoácidos específicos. Las moléculas expresadas para dichas moléculas de ADN truncadas son útiles en los métodos descritos en la presente. Además, pueden producirse los anticuerpos bifuncionales, en los cuales una cadena pesada y una cadena ligera se une a un virus de la rabia, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno diferente al del virus de la rabia, u otro epítope del virus de la rabia. También, dentro del alcance de la invención hay anticuerpos en los cuales se han sustituido, suprimido o agregado aminoácidos específicos. En particular, los anticuerpos preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de la estructura, de manera que mejora la unión al antígeno. Por ejemplo, un número pequeño seleccionado de los residuos de estructura aceptores de la cadena de inmunoglobulina pueden reemplazarse por los aminoácidos donadores correspondientes. Los lugares preferidos de las sustituciones incluyen residuos de aminoácidos adyacentes a la CDR, o que son capase de interactuar con una CDR (véase, v.gr., Patente de E.U.A. 5,585,089 (v.gr., columnas 12-16), el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia. La estructura del acepto puede ser una secuencia de estructura de anticuerpo humano maduro o una secuencia consensual. Según se desea, la región de Fc de los anticuerpos de la invención pueden alterarse para modular las funciones efectoras tales como, por ejemplo unión de complemento y/o unión de receptor de Fc. Los criterios y subgrupos de alteraciones de estructura y/o regiones constantes adecuadas para alteración (por ejemplo, por sustitución, supresión, o inserción) se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 6.548,640; 5,859,205; 6,632,927; 6,407,213; 6,054,297; 6,639,055; 6,737,056; y 6,673,580. Una "secuencia consensual" es una secuencia formada de los aminoácidos más frecuentemente presentes (o nucleótidos) en una familia de secuencias relacionadas (Véase, v.gr., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschft, Weinheim, Alemania 1987) . En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consensual se ocupa por el aminoácido que esta presente con mayor frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos están presentes con la misma frecuencia, cualquiera puede ser incluido en la secuencia consensual. Una "estructura consensual" de una inmunoglobulina se refiere a una región de estructura en la secuencia de inmunoglobulina consensual. Un anticuerpo de virus contra la rabia, o porción de unión de antígeno del mismo, puede derivarse o ligarse a otra molécula funcional (v.gr., otro péptido o proteína). Por ejemplo, un anticuerpo puede ligarse funcionalmente (por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo, un agente detectable un gente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediar la asociación con otra molécula (tal como región de núcleo de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina) . Un tipo de anticuerpo derivado (o fragmento del mismo) se produce por entrelazamiento de dos o más de dichas proteínas (del mismo tipo o diferentes tipo) . Los entrelazantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos distintos separados por un separador apropiado (v.gr., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homofuncionales (v.gr., suberato disuccinimidilo) . Tales enlazantes están disponibles de Pierce Chemical Company; Fockford, IL.

Los agentes detectables útiles con los cuales se puede derivar (o marcar) un anticuerpo (o fragmento del mismo) incluyen compuestos fluorescentes, varias enzimas, grupos prostéticos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radioactivos. Los agentes detectables fluorescentes ilustrativo incluyen fluroesceina, isotiocianto de fluoresceína, rodamina, y ficoeritrina. Una proteína o anticuerpo también puede derivatizarse con enzimas detectables tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, acetilcolinesterasa, oxidas de glucosa y similares. Cuando se derivatiza una proteína con una enzima detectable, se detecta agregando reactivos adiciones que usa la enzima para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando está presente la peroxidasa de rábano del agente detectable, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción de color, que es detectable. Una proteína también puede derivatizarse con un grupo prostético (v.gr., estreptavidina/biotina y avidina/biotina) . Por ejemplo, un anticuerpo puede derivatizarse con biotina, y detectarse a través de medición indirecta de unión de avidina o estreptavidina. Se pueden usar proteínas y anticuerpos marcados, por ejemplo, diagnósticamente y/o experimentalmente en un número de contextos, incluyendo (i) aislar un antígeno predeterminado por técnicas normales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación; y (ii) detectar un antígeno predeterminado (v.gr., un virus de la rabia, o proteína del virus de la rabia, carbohidrato, o lípido, o combinación de los mismos, v.gr., en un lisato celular o una muestra del paciente) con el fin de monitorear niveles de virus y/o proteína en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínico, v.gr., para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Cualquiera de las técnicas de derivatización/marcado de proteína anteriores se puede emplear sobre un blanco viral, por ejemplo, una proteína de la rabia, tal como glicoproteína G o fragmentos de la misma. 3. Métodos de Tamizado Los anticuerpos del virus contra la rabia pueden caracterizarse por la unión al virus de la rabia por una variedad de técnicas conocidas. Los anticuerpos normalmente se caracterizan primero por ELISA. En resumen, las placas de microtitulación pueden ser revestidas con el antígeno blanco en PBS, por ejemplo, el virus de la rabia o glicoproteína G o porción de la misma y luego bloquearse con proteínas irrelevantes tales como albúmina de suero de bovinos (BSA) diluida en PBS. Las diluciones de placas de ratones inmunizados con el antígeno blanco, por ejemplo, una vacuna de la rabia, se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween 20 y luego se incuban con un reactivo policlonal específico para Fc de IgG anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, se desarrollaron placas con sustrato de ABTS, y se analizaron a OD de 405. Preferiblemente, los ratones que desarrollaron las titulaciones superiores serán usados por fusiones. Un análisis de ELISA como se describió antes, puede usarse para tamizar anticuerpos y, sí, los hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con virus de la rabia. Los hibridomas que producen anticuerpos que se unen, preferiblemente con alta afinidad, al virus de la rabia, que pueden subclonarse y caracterizarse adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células madre (por ELISA) pueden elegirse para formar una biblioteca de células, y para purificación de anticuerpos . Para purificar los anticuerpos del virus contra la rabia, los hibridomas seccionados pueden desarrollarse en botellas de rodillos, matraces giratorios de dos litros u otros sistemas de cultivos. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) para purificar la proteína. Después del intercambio con solución reguladora a PBS, la concentración se puede determinar por métodos espectrométricos . Para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se unen a los epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Oxford, 111) . Se puede detectar la unión de Mab biotinilada con una sonda marcada por estreptavidina.

Los anticuerpos del virus contra la rabia pueden probarse más para reactividad con el virus de la rabia o proteína del virus de la rabia por inmunoprecipitación o inmunotransferencia . Los anticuerpos particulares de la invención se caracterizan por la unión a uno o más epítopes de una glicoproteína G de la rabia. Por ejemplo, el epítope de glicoproteína G de la rabia puede ser un epítope lineal, epítope conformacional, epítope discontinuo, o combinaciones de dichos epítopes. En una modalidad, el epítope de glicoproteína G de la rabia consiste de sitio I antigénico, sitio II antigénicos, sitio III, antigénicos, sitio menor A antigénico, o combinaciones de dichos sitios antigénicos, por ejemplo, sitio III antigénico y sitio A menor. En otra modalidad, el epítope de la glicoproteína G de la rabia comprende residuos de aminoácidos 336-442. En una modalidad particular, la glicoproteína G de la rabia comprnede el residuo 336 de aminoácidos, y, opcionalmente alteraciones de los mismos tales como sustituciones o supresiones (v.gr., véase Tabla 9). Otro análisis para medir actividad de los anticuerpos el virus contra la rabia incluyen análisis de neutralización. Los análisis de neutralización in vitro pueden medir la capacidad de un anticuerpo para inhibir un efecto citopático, infectividad, o presencia de un virus o en células en cultivo (véase el Ejemplo 3, siguiente) . La neutralización in vivo o análisis de supervivencia se puede usar para medir neutralización del virus de la rabia como una función de morbidez y/o mortalidad reducida en un modelo animal apropiado (ver Ejemplo 5, siguiente) . 4. Composiciones y Equipos Farmacéuticos En otro aspecto, la presente invención provee composiciones, v.gr., composiciones farmacéuticamente aceptables, que incluyen una molécula de anticuerpo descrita en la presente o porción de unión del antígeno de la misma, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. "Vehículos farmacéuticamente aceptables" incluyen cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, agentes de retardo isotónico y de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los vehículos pueden ser adecuados para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, rectal espinal o epidérmica (v.gr., por inyección o infusión) . Las composiciones de esta invención pueden tener una variedad de formas. Estas incluye, por ejemplo, formas de dosis líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (v.gr., soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, liposimas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones útiles tienen la forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo útil para la administración es parenteral (v.gr., intravenosa, subcutánea, intraperitonal, intramuscular) . Por ejemplo, el anticuerpo o porción de unión de anticuerpo o antígeno del mismo puede administrarse por infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión de antígeno del mismo se administra por inyección subcutánea o intramuscular. La composición de la invención puede coadministrarse con a) uno o más anticuerpos, v.gr., anticuerpos contra la rabia, b) proteína de la rabia, v.gr., una vacuna para rabia, c) toxinas, d) otros agentes terapéuticos (v.gr., antivirales), y/o e) etiquetas. Las frases "administración parenteral" y "administrada parenteralmente" como se usan en la presente, significan modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intracraneal, intraperitonal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidal, intraespinal, epidural, e intraesternal e infusión. Las composiciones terapéuticas normalmente deberán ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de anticuerpos. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes ennumerados antes, como se requiere, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehiculo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los ennumerados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles los métodos útiles para la preparación son secados a vacío y secados por congelación que de un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada, estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede obtenerse incluyendo en la composición un agente que retardada la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos y porciones de anticuerpos descritos en la presente se pueden administrar por una variedad de métodos conocidos en la materia y para muchas aplicaciones terapéuticas. Como será apreciado por los expertos, la ruta y/modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo del mismo, puede administrarse, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo asimilable comestible. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también puede introducirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o suave, comprimirse en tabletas, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención por administración distinta a la parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivo médicos conocidos en la materia. Los regímenes de dosis se ajustan para proveer la respuesta deseada óptima (v.gr., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un solo bolo puede administrarse, varias dosis divididas pueden administrarse con el tiempo, o la dosis puede reducirse proporcionalmente o incrementarse como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria, como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dictan por, y dependen directamente de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que será logrado, y (b) las limitaciones inherente en la materia de la formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Una escala ilustrativa, no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de unión de antígeno de la invención es de 0.1-60 mg/kg, v.gr., 0.5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg, o 0.75-10 mg/kg. En una modalidad, la cantidad de anticuerpo del virus contra la rabia (o porción de unión de antígeno del mismo) administrado, es de aproximadamente 0.25 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, o en un intervalo o escala del mismo. Además se puede entender que para algún sujeto particular, los regímenes de dosis específicos deberán ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosis exhibidas en la presente son ilustrativas únicamente y no se pretende que limitan el alcance o práctica de la composición reclamada. También dentro del alcance de la invención hay equipos que incluyen un anticuerpo del virus contra la rabia, o porción de unión de antígeno del mismo. Los equipos pueden incluir uno o más elementos, incluyendo; instrucciones de uso; otros reactivos, v.gr., una etiqueta, un agente terapéutico, o un agente útil para quelatación, o de alguna manera acoplamiento, un anticuerpo a una etiqueta o agente terapéutico, u otros materiales para preparar el anticuerpo para administración; vehículos farmacéuticamente aceptables, y dispositivo u otros materiales para la administración a un sujeto. Varias combinaciones de anticuerpos pueden empacarse juntas. Por ejemplo, un equipo puede incluir anticuerpos que se unen a virus de la rabia (v.gr., anticuerpo que incluyen las regiones de cadena pesada y/o ligera variable de 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, 1E5, o una combinación de las mismas. Los anticuerpos pueden mezclarse juntos, o empacarse por separado dentro del equipo. Las instrucciones de uso pueden incluir instrucciones para aplicación terapéutica incluyendo dosis sugeridas y/o modos de administración, v.gr., en un paciente con un síntoma o indicación de exposición de virus de la rabia o que se sospecha exposición al virus de la rabia. Otras instrucciones pueden incluir instrucciones en el acoplamiento del anticuerpo a un quelante, una etiqueta o agente terapéutico, o para purificación de un anticuerpo conjugado, v.gr, de componentes de conjugación sin reaccionar. El equipo puede incluir una etiqueta detectable, un agente terapéutico, y/o un reactivo útil para quelar o de alguna manera acoplar una etiqueta o agente terapéutico al anticuerpo. Los agentes de acoplamiento incluyen agentes tales como N-hidroxisuccinimida (NHS) . En dichos casos, el equipo puede incluir uno o más de un recipiente de reacción para llevar a cabo la reacción o un dispositivo de separación, v.gr., una columna cromatográfica, para usarse en la separación del producto terminado de los materiales de partida o intermediarios de reacción. El equipo además puede contener por lo menos un reactivo adicional, tal como un agente de diagnóstico o terapéutico, v.gr, un agente de diagnóstico o terapéutico como se describió en la presente, y/o uno o más anticuerpos del virus contra la rabia adicionales (o porciones de los mimos), formulaciones como apropiados en una o más preparaciones farmacéuticas separadas. Otros equipos pueden incluir ácidos nucleicos optimizados que codifican anticuerpos de virus contra la rabia, para usarse como inmunoterapia pasiva, y/o proteínas del virus de la rabia, o fragmentos de las mismas para usarse como, v.gr., vacunas (inmunoterapia activa) e instrucciones para la expresión de los ácido nucleicos. 5. Métodos y Composiciones Terapéuticas Los anticuerpos y fragmentos de unión de anticuerpos de la presente invención tienen utilidades terapéuticas, profilácticas y diagnósticos in vi tro e in vivo. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden administrarse a células en cultivo, v.gr., in vi tro o ex vivo o in vivo, a un animal, preferiblemente un sujeto humano, para tratar, inhibir, prevenir, retardar y/o diagnosticar virus de la rabia y enfermedad asociada con la rabia. Como se usa en la presente, el término "sujeto" se pretende que incluya animales humanos y no humanos. El término "animales son humanos" incluye todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, perros, gatos, cerdos, vacas, y caballos. Las proteínas y anticuerpos pueden ser usados en células en cultivo, v.gr., in vivo o ex vivo . Por ejemplo, las células se pueden cultivar in vivo en medio de cultivo y el paso de contacto puede efectuarse agregando el anticuerpo del virus contra la rabia o fragmento del mismo, al medio de cultivo. Los métodos pueden llevarse a cabo en viriones o células presentes en un sujeto, como parte de un protocolo in vivo (v.gr., terapéutico o profiláctico). Para modalidades, in vivo, el paso de contacto se efectúa en un sujeto e incluye administrar un anticuerpo del virus contra la rabia o porción del mismo al sujeto bajo condiciones efectivas para permitir la unión del anticuerpo, o porción, a un virus de la rabia o cualquier porción del mismo presente en el sujeto, v.gr., en o alrededor de una herida o en o cerca de las células de origen neuronal. Los métodos para administrar moléculas de anticuerpos como se describió en la presente. Las dosis adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Las moléculas de anticuerpos pueden usarse como agentes competitivos para unión de ligandos para inhibir o reducir una interacción indeseable, v.gr., para inhibir la unión y/o infección de virus de rabia de células, v.gr., células neuronales. Los anticuerpos de virus contra la rabia (o porciones de unión de antígeno de las mismas) pueden administrarse en combinación con otros anticuerpos de virus contra la rabia (v.gr., otros anticuerpos monoclonales, gama-globulina policlonal, v.gr., suero humano que comprende inmunoglobulinas contra la rabia) . Combinaciones de anticuerpos que se pueden usar incluyen un anticuerpo de virus contra la rabia o porción de unión a antígeno de los miso y/o una proteína G del virus contra la rabia o porción de unión de antígeno del mismo. E-l virus contra la rabia o anticuerpo de proteína G puede ser clon de anticuerpo 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y/o 1E5 que incluye las regiones variables de dicho anticuerpo o anticuerpos, o un anticuerpo con regiones variables por lo menos 90% idénticas a las regiones variables del anterior, v.gr., 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y/o 1E5. Las combinaciones de anticuerpos de virus contra la rabia (v.gr., 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y/o 1E5) pueden proveer inhibición potente de rabia, especialmente, v.gr, aislados de rabia particulares (véase Tablas 11-13) . Los aislados de virus de rabia característicos para los cuales son adecuados los anticuerpos de la invención para tratar, detectar, diagnosticar y similares, incluyen por ejemplo, aislado de CVS-11, aislado ERA, aislado de virus Pasteur, aislado de zorro gris (Texas), aislado de zorro gris (Arizona), aislado de zorro ártico (Arkansas) , asilado de mofeta (Central Norte), aislado de mofeta (Central Sur) , aislado de mapache, aislado de coyote (Texas) , aislado de perro (Texas) , aislado de murciélago { Lasiurus borealis; Tennessee) , aislado de murciélago { Eptesicus fuscus - Myotis sp.; Colorado), aislado de murciélago {Myotis spp; Washington) , aislado de murciélago { Lasiurus borealis; Arizona) , aislado de murciélago { Pipstrell us subflavus; Alabama) , aislado de murciélago { Tadarida brasiliensis; Alabama), aislado de murciélago ( Lasionycetris noctivagans : Washington) ; aislado de murciélago {Eptesicus fuscus; Pensilvania) , aislado de mangosta (New York/ Puerto Rico) , aislado de perro (Argentina), aislado de perro (Sonora), aislado de perro (Gabon) , aislado de perro (Thai), y combinaciones de los mismos. Se entiende que cualquiera de los genes de la invención, por ejemplo, anticuerpos del virus contra la rabia, o fragmentos del mismo, se puede combinar, por ejemplo, en diferentes relaciones o cantidades, para efecto terapéutico mejorado. Además, los agentes de la invención pueden formularse como una mezcla, o ligarse química o genéticamente usando técnicas reconocidas en la materia dando así como resultado anticuerpos covalentemente ligados (o fragmentos de anticuerpos covalentemente ligados) , que tiene propiedades de unión contra la rabia, por ejemplo, propiedades de unión a múltiples epítopes, a, por ejemplo, glicoproteína G del virus de la rabia. La formulación combinada puede guiase por una determinación de uno o más parámetros tales como afinidad, avidez, o eficacia biológica del agente solo o en combinación con otro agente. Los agentes de la invención o también pueden administrarse en combinación con otros agentes que mejoran el acceso, vida media o estabilidad del agente terapéutico para dirigir, despejar y/o secuestrar virus de la rabia o un antígeno del mismo. Dichas terapias de combinación preferiblemente son aditivas y aún sinergísticas en su actividad terapéutica, v.gr, en la inhibición, prevención, infección y/o tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con el virus de la rabia. La administración a dichas terapias de combinación puede disminuir la dosis del agente terapéutico (v.gr., anticuerpo o mezcla de fragmento de anticuerpos, o anticuerpo o fragmento de anticuerpos biespecífico entrelazado o genéticamente fusionado) que se requiere para lograr el efecto deseado.

Las composiciones inmnogénicas que contienen una cantidad inmunogénicamente efectiva de un componente del virus de la rabia, por ejemplo, glicoproteína G del virus de la rabia, o fragmentos de la misma, también se proveen por la presente invención y se pueden usar para generar anticuerpos del virus contra la rabia. Los epítopes inmnogénicos en una secuencia de proteína del virus de rabia puede identificarse como se describe en la presente (véase, v.gr., Ejemplo 4) o de acuerdo con los métodos conocidos en la materia, y proteínas o fragmentos que contiene los epítopes pueden suministrarse por varios medios, en una composición de vacuna. Las composiciones adecuadas pueden incluir, por ejemplo, lipopétidos (v.gr., Vitiello y otros, J. Clin. Invest. 95:341 (1995)), composiciones de péptido encapsuladas en microesferas poli (DL-lactido-coglicolido) ("PLG") (véase, v.gr., Eldirdge y otros, Molec. Immunol. 28: 287-94 (1991); Alonso y otros, Vaccine 12:299-306 (1994); Jones y otros, Vaccine 13:675-81 (1995)), composiciones de péptidos contenidas en complejos de estimulación inmune (ISCOMS) (véase, v.gr., Takahashi y otros, Nature 344: 873-75 (1990); Hu y otros, Clin. Exp. Immunol. 113:235-43 (1998)), y sistema de péptidos de antígenos múltiples (MAP (véase, v.gr., Tam, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 95: 5409-13 (1998); Tam, J. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 85: 5409-13 (1988); Tam. J. Immunol . Methods 196:17-32 (1996)).

Los vehículos útiles que se pueden usar con composiciones inmunogénicas de la invención son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, tiroglobulina, albúminas tales como albúminas de suero humanas, toxoide de tétanos, ácidos poliamino tales como poli L-lisina, poli ácido L-glutámico, influenza, proteína de núcleo de virus de hepatitis B, y similares. Las composiciones pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o solución salina normalmente solución salina con fosfato regulado. Las composiciones pueden contener un diluyente fisiológicamente tolerable (es decir, aceptable) tal como agua, o solución salina normalmente solución salina de fosfato. Las composiciones y vacunas también incluyen normalmente un adyuvante. Los adyuvantes tales como adyuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alúmina son ejemplos de materiales bien conocidos en la materia. Adicionalmente, las respuestas de CTL pueden iniciarse conjugando antígenos dirigidos, por ejemplo una proteína del virus de la rabia (o fragmentos, derivados inactivos o análogos de los mismos) a lípidos, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS) . Los anticuerpos contra la rabia pueden administrarse en combinación con otros agentes, tales como composiciones para tratar enfermedad mediada por el virus de la rabia. Por ejemplo, los terapéuticos que se pueden administrar en combinación con anticuerpos cota la rabia incluye agentes antivirales, inmunoglobulina de suero, y/o vacunas para tratar, prevenir, o inhibir rabia, (por ejemplo, vacunas tales como RabAvert™ (Chiron) , Vacuna Rabies adsorbida (Bioport) , y Imovax™ Rabies (Aventis) y/o inmunoglobulinas, tal como BayRab™ (Bayer) y I ogam™ Rabies-HT (Aventis) . El anticuerpo puede administrarse antes, después, o contemporáneamente con vacuna del virus de la rabia. 6. Otros Métodos Un anticuerpo contra la rabia (v.gr., anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar virus de la rabia por técnicas normales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo contra la rabia se puede usar para detectar el virus (v.gr., en una muestra de suero), v.gr., para tamizar muestras para la presencia/exposición de virus de rabia. Los anticuerpos contra la rabia pueden usarse diagnósticamente para monitorear niveles del virus en el tejido como parte de un procedimiento de pruebas clínicas, v.gr., para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Además, los epítopes del virus de la rabia, por ejemplo, epítopes de glicoproteína G (lineal, conformacional o combinaciones de los mismas) se pueden usar como inmunógenos o como blanco para identificar las moléculas de unión contra la rabia neutralizantes, incluyendo, por ejemplo, suero humano, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos.

Ejemplificación A través de los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos a menos que se establezca de otra manera . Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otra manera, técnica convencionales de química, biología molecular, terminología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, v.gr., tecnología de anticuerpos), y técnicas normales en la preparación de polipéptidos. Véase v.gr., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Labora tory Press (1989) ; An tibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology) , 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). Ver también, por ejemplo, Smith et al., A rapid fl uorescent focus inhibi tion test (RFFIT) for determining rabies virus- neutralizing an tibody, págs. 181189 y Chapter 15 en Labora tory Techniques in Rabies, 4a. ed., editado por Meslin et al., Geneva: World Health Organization (1996)). Inmunización de Ratones y Aislamiento de Hibridomas Los ratones HuMab (Medarex) son ratones transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana y genes de cadena pesada de ratones inactivada y genes de cadena ligera kappa. Los ratones HuMab se inyectaron normalmente con una ~1/10 de una dosis de humano de una vacuna de rabia comercialmente disponible usando adyuvante de Freund completo en la primera semana, y adyuvante FIBI en semanas subsiguientes por un total de 6-8 semanas. Una ELISA de glicoproteína de cubierta de rabia se usó para medir respuestas del suero y se sacrificaron animales cuando se consideraron máximas las respuestas del suero. Los hibridomas se generaron por fusión de esplenocitos y células socias (células de mieloma de ratón P3X63Ag8.653) y los sobrenadantes resultantes se tamizaron para reactividad en una ELISA de glicoproteína de rabia. Los anticuerpos positivos se purificaron de cultivos de hibridomas por cromatografía de proteína A Sepharose (Amersham) . RFFIT El análisis de RFFIT se llevó a cabo como se describió en la técnica. Las cepas de virus de la rabia, aislados de virus de calle, y células de neuroblastoma de ratón (MNA) usados fueron todos del Centre from Disease Control and Prevention, Atlanta, EUA. Células y Cultivo Celular Se desarrollaron células HEK-293T/17, obtenidas de ATCC, en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) suplementado con suero de bovino fetal al 10% y 100 IU de penicilina-estreptomicina (medio completo) a 37° con 5% C02. Las células se recolectaron en solución salina regulada de fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) conteniendo 5 mm de EDTA. Clonación de Glicoproteínas de la Rabia La secuencia de aminoácidos de la proteína G de la rabia (cepa ERA, GenBank: AF406693) se usó para diseñar una versión optimizada de codones del gen de glicoproteína de la rabia que extiende la glicoproteína de longitud completa del aminoácido 1-524. El gen sintético se clonó en pcDNA3. lMyc/His (Invitrogen) en la estructura con las etiquetas de c-Myc y 6-histidina (His) . Estas etiquetas inmunes permitieron la fácil purificación y detección. Se construyeron las versiones truncadas de los genes marcados que codifican la glicoproteína, las cuales contuvieron todo el ecto-dominio (20-439 a. a.). Se realizaron truncaciones por amplificación de RCP de los fragmentos deseados de los clones de glicoproteína de longitud completa seguido por la digestión y ligadura de restricción en pcDNA3. lmyc/His (Invitrogen) y se verificaron por análisis de secuencia de ADN. Para el aislamiento de genes nativos que codifican varias cepas de glicoproteína G de la rabia, se infectaron células de MNA con CVS—11, Skink-CA, Lasirui us borealis, Lasirius cinereus, y virus de la rabia ERA (Center for Disease Control and Prevention, EUS) . Se extrajo ARN de células infectadas o de viriones usando directivo Trizol. Se llevó a cabo RTPCR en 2 pasos. Primero, se sintetizó ADNc usando el Equipo Ambion Retroscript, y los genes que codifican glicoproteína de la rabia se amplificaron usando Turbo Pfu (Stratagene) e iniciadores específicos para el virus de la rabia. Los genes que codifican la glicoproteína de la rabia se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pCDNA3. lMycHis (Invitrogen) en los sitios HinglII/Xba I en la estructura con etiquetas del epítope c-Myc e His. Los genes recombinantes que codifica la glicoproteína de la rabia mutada en los residuos clasificados cono sitio antigénico I, II, III y sitio menor a se sintetizaron usando mutagénesis dirigida al sitio. Los iniciadores traslapantes conteniendo las mutaciones del punto deseado usaron para amplificar los genes de glicoproteína mutantes de longitud completa y el vector pcDNA3. lMyc/His de la glicoproteína ERA optimizada por el codón clonado previamente. El ADN amplificado por RCP se digirió con Dpnl para remover el patrón de partida no amplificado tipo silvestre, transformado en bacteria, y tamizado para la mutación pretendida por secuenciación. La secuencia de codificación completa de cada mutante se confirmó, y las construcciones resultantes se clonaren en los vectores de expresión de pcDNA3. lMyc/His . Expresión de Glicoproteína Recombinante Todas las construcciones se transfectaron en células HEK-293T/17 usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) como se describió por el fabricante. Se desarrollaron células para confluencia del 85% en placas de cultivo de tejido de 150 mm en 15 ml de DMEM-10% suero de becerro fetal (FCS, por sus siglas en ingles) . Las cantidades de 30 u de ADN mezcla do con 75 ul de Lipofecamina se agregaron a las células, y se incubaron placas durante la noche a 37 °C. Se removió el medio y se almacenó a 24, 48 y 72 horas después de la transfección para proteínas solubles secretadas o descartadas para proteína se unión de membranas. Purificación de Proteínas Recombinante, Inmunoprecipitación y Análisis Western Las glicoproteínas de la rabia ERA20-439 y CVS-1120-439, conteniendo ambas etiquetas de epítopes Myc e His, se purificaron de sobrenadante de cultivo celular por incubación con perlas de ácido de níquel-nitriloacético (Ni-NTA) (Invitrogen), seguido por filtración por columna y elusión de proteína usando imidazol 250 mM. Para inmunoprecipitación de glicoproteínas de unión de membrana de longitud completa, las células transfectadas desprendieron de la placa con PBS/EDTA 5mM y se solubilizaron en PBS, 1% CHAPS, inhibidor de proteínas completa IX. Los lisados celulares se aclararon por centrifugación y se incubaron con HuMab 17C7, o un HuMab de control sin rabia, y Proteína A Sepharose. Las proteínas inmunoprecipitadas se volvieron a disolver por SDS-PAGE para análisis subsiguiente. Para análisis de inmunotransferencia, se hirvieron las proteínas en solución reguladora de la muestra Laemmli 2X (+/-BME) durante 5 minutos y se volvieron a disolver usando 10 ó 12 % de geles Novex (Invitrogen) . Los geles se transfirieron a Immobilon P (Millipore) como se describió por el fabricante, y se llevó a cabo el análisis de inmunotransferencia. La proteínas se detectaron usando anticuerpo anti-Myc de ratón 9E10 (0.2 ug/ml) (BD Pharmingen) , o HuMab 17C7 (2 ug/ml) seguido por IgG antiratón o anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano (1:5000 Jackson Immunoresearch) . Las membranas se incubaron con reactivo de quimioluminiscencia mejorado (Amersham) durante 1 minuto y se expusieron a película X-Omat-AR durante varios períodos.

Tinción de Superficie Celular Las células transfectadas con construcciones que codifican proteína G de rabia de longitud completa se recolectaron 48 horas después de la transfección y se incubaron con concentración viral de HuMabs . La unión de HuMabs se detectó por IgG anti-humano marcado con ficoeritrina (Jackson) y citometría de flujo se llevó a cabo usando FACScan con software CellWest (Becton Dickinson) . ELISA Un ELISA de captura se llevó a cabo en todos los hibridomas para identificar los IgG humanos de formación. Las placas ELISA se revistieron con 3 µg/ml de anticuerpos de cadena ligera Kappa anti-humana (Southern Biotech) . Las placas se lavaron con solución reguladora de lavado (PBS, 0.05% Tween), bloqueadas con la solución reguladora bloqueadora (PBS, 1% BSA, 0.05% Tween), se lavó y luego las muestras se agregaron a la placa (diluido 1:2 -1:400 en solución reguladora de bloqueo) . La unión se detectó con anticuerpo secundario de IgG anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch) , y las placas se lavaron y desarrollaron con sal de disodio fosfato, Nitrofenil a 1 mg/ml en dietanolamina ÍM durante 20 minutos. Las palcas se leyeron a 405 nm. Se usó una ELISA de glicoproteína de captura para probar la interacción de HuMab 17C7 con CVS-1120-439 y ERA20-439 optimizada con codón. Las placas se revistieron con 7.5 ug/ml de anticuerpo antí-c-Myc de ratón 9E10 (BD Pharmigen) o anticuerpo anti-c-Myc de pollo (Molecular Probes) . Se incubaron las palcas con glicoproteínas purificadas o lisatos de células solubilizadas con detergentes y luego se incubaron con anticuerpos primarios (HuMab 17C7 y glicoproteína anticonejo de ratón R0012 (US Biological)) a 5 ug/ml. La unión se detectó con fosfatasa alcalina conjugada con secundaria antihumana de cabra (Jackson ImmunoResearch) , y luego se desarrolló como se describió antes. Producción de Virus Resistentes a 17C7 HuMab Las células de neuroblastoma de ratones se sembraron en placas a 1.5 x 105 células / ml pozo en el Dia 1. En el día 2, se incubó virus de rabia 1 x 101 a 108FFU/ml de CVS-11 con IU/ml de HuMb 17C7 (133 ug/ml) a 37°C durante 1 hora. La mezcla de virus/anticuerpo se agregó a las células y se incubó durante 3.13 horas a 37 °C. La mezcla de virus/anticuerpo se removió de las células y las células se lavaron una vez con el medio, seguido por la adición de medio fresco conteniendo IU/ml de HuMab 17C7 durante 60 horas adicionales. En el día 5 el medio que contiene virus resistente 17C7 HuMab potencial, se removió del portaobjetos, se marcó y se almacenó a 4°C. Los portaobjetos se tiñeron luego para presencia de células infectada con la rabia por incubación con dilución 1:40 de IgG anti-Rabia Centicor FITC (Fujirebio Diagnostics) durante 30 minutos a 36C/0.5% C02.

Los portaobjetos se lavaron y examinaron bajo un microscopio fluorescente (filtro FITC) a aumento de 200 x. Los virus tomados de pozos que contienen puntos fluorescentes 1-5 se amplificaron en células MNA durante 3 días en presencia de HuMab 17C7. El virus amplificado se probaron por la capacidad de células de MNA infectadas de manera equivalente en presencia y ausencia de HuMab 17C7. Se infectaron placas de 6 pozos de células MNA con virus residente a 17C7 HuMab. El ARN se extrajo de las células infectadas por virus, se transcribieron inversamente y la secuencia de codificación de glicoproteína se amplificó por RCP con indicadores específicos para glicoproteína CVS-11. Las mutaciones en genes que codifican para glicoproteína se analizaron por secuenciación de toda la secuencia de codificación. Pseudovirus de Rabia Una replicación de lecturas de la estructura de la base de Env- Vpr-VIH conteniendo gen de luciferasa de luciérnaga insertado en el gen nef, pNL4-3.Luc.R-E-, se co-transfectó con plásmidos de codificación de glicoproteína de la rabia en células 293T. El reactivo pNL4-3.Luc.R-E- se obtuvo a través del Programa NIH AIDS Research and Reference Reagent, División de AIDS, NIAID, un NIH. Las partículas pseudovirales se recolectaron 48-72 horas después de la transfección, se concentraron 30 veces usando un concentrador Centricon (Millipore) se congelaron a -80°C. Los conteos de luciferasa por segundo de las preparaciones de pseudo virus se determinaron por dilución en serie del virus seguido por infección y detección (véase más adelante) . Para análisis de neutralización aproximadamente 50,000 conteos por segundo de pseudovirus se incubaron con sin anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla de anticuerpo/virus se aplicó luego a células HOS (ATCC# CRL-1543) , en presencia de 2 ug/ml de polipreno y se inoculó por centrifugación durante 2 horas a 800G y 4°C, seguido por incubación a 37°C/5% C02. La actividad de luciferasa se analizó luego 72 horas después de la invención usando el reactivo Bright-Glo (Promega), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

EJEMPLOS La invención se describe además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones. Ejemplo 1. Generación de Anticuerpos Monoclonales de Virus Contra la Rabia Los ratones transgénicos que comprenden genes de inmunoglobulina humana generados como se describió antes en la sección titulada "Generation of Human Monoclonal Antibodies in HuMa Mice" y suministrados por Medarex, Milpitas, CA, se inmunizaron con 6 dosis de una vacuna comercial contra la rabia. La vacuna se administró en combinación con adyuvante completo de Freund y luego se reforzó con vacuna de rabia adicional y adyuvante incompleto de Freund. La vacuna de la rabia consiste de virus de rabia completos que se han inactivado y liofilizado. Las células B esplénicas se aislaron del animal inmunizado y se fusionaron a células de mieloma de (P3X) . Los hibridomas clónales se generaron y tamizaron por ELISA. Los hibridomas resultantes se cultivaron y el análisis inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) para detección de cadenas de anticuerpo de kappa/gamma humana se usó para detectar anticuerpos de IgG humanos candidatos para análisis adicionales. Los clones designados 54.17C7; 108.6F11; 35.5F5.1E12.149; 35.2B10.1G11.3FG; y 35.1E1G1.4CB denominado en la presente como, respectivamente, clones 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y 1E5 se determinaron además para unir específicamente la glicoproteína G del virus de la rabia por un análisis ELISA específico para antígeno. Además, estos cinco clones de hibridoma se seleccionaron y determinaron para neutralizar infección de rabia de células neuronales de ratón en un análisis RFFIT contra un número de diferentes aislados de rabia (véase Ejemplo 39) . Consecuentemente, los ADNc de clones ilustrativos se amplificaron por RCP-TA de ARNm, se clonaron, y secuenciaron. Una secuencia consensual de región B de cadena pesada se encontró para cada clon (Tabla 7) . Los cinco clones usaron una región de VH derivada de uno de los dos genes de la región V de la línea germinal, pero utilizaron diferentes secuencias J. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de clones ilustrativos 17C7 y 6G11 se mostraron en las Figs. 1-2 (SEC ID NO: 1, 2, 15, y 16). Las regiones que determinan complementariedad (es decir, CDR1, CDR2, y CDR3) se indican para las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo (SEC ID NO: 3-8, 17-22) . ADN que codifica la porción de unión de antígeno de cada clon se clonó en un vector que será expresado como un anticuerpo humano para administración a humanos. Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para las cepas ligera y pesada de clones de anticuerpo 17C7 y 6G11 se proveen en la lista de secuencias (respectivamente, SEC ID NO: 9-12 y SEC ID NO. 23-26) .

Tabla 7. Clones de Anticuerpos y Composición de Genes (nomenclatura de *IMGT usada para la tabla anterior) Ejemplo 2. Actividad de Unión de Anticuerpos de Virus Contra la Rabia La unión de cada anticuerpo para el virus de la rabia, en particular, la glicoproteína G del virus de la rabia se determinó por ELISA usando técnicas normales. La afinidad de los anticuerpos del virus contra la rabia para glicoproteína G del virus de la rabia también se puede medir con el instrumento Biacore®, que detecta interacciones de unión biomolecular con tecnología de resonancia del plasmogeno superficial. Cada anticuerpo se agrega a microcircuitos sensores revestidos con proteína A, y la glicoproteína del virus de la rabia G se permite fluir sobre el microcircuito para medir la unión. Se pueden determinar las constantes de unión que varían de una KD de 1 x 10"6M, KD de 1 x 10"7M, KD de 1 x 10"8M, KD de 1 x 10~9M, KD de 1 x 10"10M, KD de 1 x 10?-HiM*, KD de 1 x 10" -12,M, y superiores (o internas o escalas de los mismos) . Los anticuerpos contra la rabia con constantes de unión favorables indican que los anticuerpos tienen afinidades adecuadas para usarse en terapia humana. El anticuerpo 17C7, cundo se prueba en la región de ectodominio de una glicoproteína G de rabia (codón optimizado) , se determinó por análisis de Biacore por tener una afinidad de unión de por lo menos 1.36E-8M. Ejemplo 3. Neutralización del Virus de la Rabia por Anticuerpos de Virus Contra la Rabia Los anticuerpos expresados por hibridomas 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y 1E5 se probaron para actividad de neutralización del virus de la rabia in vito en una serie de experimentos (véase Tablas 8-11) , siguientes) . Específicamente, la actividad de neutralización de rabia se determinó usando la Prueba de Inhibición Fluorescente (RFFIT) , que detecta la infección del virus de la rabia de células de neuroblastoma de ratones usando anticuerpos marcados por fluorescencia. El análisis de RFIT es un análisis estandarizados que se usa por médicos y expertos en salud pública para determinar la potencia de una preparación de anticuerpo dada para neutralizar virus de la rabia (es decir, inhibe su capacidad de infectar células) . El análisis normalmente se lleva a cabo usando un virus fijo (CVS11) pero también se puede realizar usando aislados de animales infectados. El análisis se realiza por la adición de una cantidad normal de virus con y sin diluciones de anticuerpos a monocapas de células de neuroblastoma de ratón. Las monocapas se incuban luego se detectan los focos de las células de neuroblastoma infectadas usando un anticuerpo monoclonal de nucleoproteína contra la rabia marcadas por fluorescencia. Los fosos se visualizan y cuentan usando microscopía fluorescente. Los resultados subsiguientes se reportaron como la concentración del anticuerpo (dilución) en donde el número de campos de microscopio sin focos fluorescentes es 50%. Todos los análisis incluyen una preparación de globulina inmune de rabia normal (SRIG) por comparación. Los anticuerpos monoclonales humanos contra la rabia 17C7, 6G11, 5G5, 2B10, y 1E5 se probaron contra un panel del virus de la rabia aisla la significancia de salud pública de varios animales vertebrados de Norte América. La tabla 8 muestra los resultados de análisis de neutralización in vitro de anticuerpos seleccionados, comparado con terapias actuales (es decir suero contra la rabia humano; "SRIG"), contra panel de aislados de virus de rabia. Los números indican la dilución duplicada por la cual un anticuerpo puede diluirse y aún exhibe una actividad de neutralización del 50%, es decir, la capacidad de bloquear infección de virus de la rabia de células de neuroblastoma de murinos in vi tro . Los resultados para 17C7 a una concentración superior contra aislados seleccionados y se muestran en el panel inferior.

Tabla 8. Resultados de Neutralización de Cepa Inicialmente, cada uno de HuMAbs se tamizó para la capacidad de neutralizar la cepa de virus de la rabia CVS-11. HuMabs neutralizante se probaron luego más extensamente contra un amplio panel de aislados de significancia de salud pública de América del Norte y América del Sur, Europa, África y Asia. Sorprendentemente, HuMab 17C7 neutralizaron la mayoría de aislados del virus de la rabia en contraste con HuMabs 2B10 y 5G5 (Tabla 8) . La titulación de neutralización del pinto final de 50% se determinó para uno de los virus de la rabia de calle, aislados de una mofeta de California EUA (Mofeta-CA) . La titulación calculada para HuMab 17C7 (concentración probada fue de 0.03 mg/ml) contra Mofeta de California fue de 1:12,898, que demuestra potencialmente 17C7 HuMab neutraliza este virus de calle. Para entender mejor la forma en que la potencia de un solo anticuerpo monoclonal humano compara el hRIG policlonal, HuMab 17C7 y hRIG se probaron en concentraciones del anticuerpo en un análisis de RFFIT usando el virus de la rabia CBS-11. La titulación del punto final del 50% para hRIG fue 1:224, mientras fue de 1:7029 para HuMab 17C7 (Figura 4). Por lo tanto, HuMab 17C7 inhibió la infección por CVS-11 más potencialmente que hRIG a concentraciones de anticuerpos equivalentes. Estos experimentos iniciales revelaron que HuMab 17C7 fue capaz de neutralizar muchos aislados de virus de rabia, y que el grado de neutralización varió de la neutralización potente del aislado de Mofeta de CA a una dosis de anticuerpo baja (0.03 ug/ml; 1:12,898) comparado con la neutralización menos potente de CVS-11 a una dosis de anticuerpo superior (2 mg/ml; 1:7029). Se realizaron repeticiones de prueba usando 17C7 purificado a concentraciones variables contra aislados de la rabia que no muestran inicialmente la neutralización en pruebas de RFFIT en sobrenadantes de hibridoma { Lasiurus borealis, TN y Lasiurus cinerus , AZ) y demostró que fuera capaz de neutralizar ambos virus en el análisis de repetición. Estos datos implican que HMab 17C7 interactúa con un epítope de neutralización del gen de glicoproteína de la rabia de L . borealis-TN y L . cinereus-AZ (Tabla 9) .

Tabla 9 Neutralización de Punto Final al 50% (Titulación Reciproca) de HuMabs 2B10, 17/ y 565 en Virus de Rabias Contra RFFIT Aislados de Murciélagos de Norte América (Las±rius borealis y cinere s) Aislado de la Rabia hRIG 17C7 2B10 5G5 ( 2IU/ral ) ( 2mg/ml ) ( 1.5mg/ml ) ( lmg/ml) Murciélago, Lasi urus borealis, TN 42 320 7 <5 Murciélago, Lasiurus borealis, AZ 25 270 85 <5 El clon de HuMab 17C7 se probó también para su capacidad de neutralizar lyssaviruses que no son de rabia .

Los lyssaviruses no son un problema de salud pública mundial importante, pero han ocasionado enfermedad fatal en un número pequeño de casos en seres humanos. Estar presentaciones, así como la prevalesencia de algunos lyssaviruses en portadores de la vida silvestre, ha conducido a un reciente interés en cuanto as si los biológicos de la rabia protegen contra lisavirus que no son de rabia. HuMab 17C7 pudo neutralizar potencialmente los lyssavirus de murciélagos Australianos cuando se probaron en un análisis de RFFIT modificado. La titulación calculada para HuMabl7C7 (concentración probada fue de 2 mg/ml) contra lyssavirus de murciélago Australiana fue mayor a 1:1400 que demuestra que HuMab 17C7 neutraliza el lyssavirus de murciélago australiano (Tabla 10) . Tabla 10 Neutralización de Punto Final al 50% (Titulación Reciproca) de HuMab 17C7 en RFFIT contra Lyssavirus Lyssavirus hRIG HuMab 17C7 (2IU/ml) (2mg/ml) Rabia (CBVS-11) 270 >1400 Lagos <5 <5 Mo ola <5 <5 Duvenhage 13 <5 Murciélago europeo Lyssavirus 1 42 <5 Murciélago europeo Lyssavirus 2 40 <5 Murciélago australiano Lyssavirus 5 544 >1400 Estos datos muestran que los anticuerpos monoclonales contra la rabia fueron capaces de neutralizar los aislados del virus de la rabia de una variedad de animales vertebrados de Norte América de significancia de salud pública en el análisis de FRRIT. Ejemplo 4. Mapeo de Epítope de Anticuerpos de Glicoproteína G de Virus Contra la Rabia El epítope de la glicoproteína G del virus de la rabia unido por cada anticuerpo monoclonal se determinó por análisis de inmunotransferencia e inmunoprecipitación (véase Fig. 3) . Un gen de glicoproteína G del virus de la rabia optimizado por codón humano sintético de longitud completa del aislado del virus de la rabia ERA se construyó usando reacción en cadena de polimerasa (RCP) e ingeniería genética. El gen y derivados de supresión se clonaron en pCDNA3.1A (Invitrogen) para expresión en célula 293T humanas. Se llevaron a cabo experimentos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación usando técnicas normales. Los resultados usando glicoprotéina G del virus de la rabia expresados recombinantemente mostraron que el anticuerpo monoclonal 17C7 mapeado a un epítope dentro de la terminal de NH3 19-422 AA del ectodomino en la glicoproteína G de rabia. Los clones monoclonales humanos 5G5, 2B10, 1E5, no reaccionan en inmunotransferencia con fragmentos de glicoproteína G soluble.

Para probar además la interacción de HuMab 17C7 con glicoproteínas de la rabia in vi tro, las glicoproteínas del virus de la rabia de una variedad de cepas y aislados del virus de la rabia se clonaron y expresaron. La glicoproteína CVS-11 tipo silvestre se clonó y expresó inicialmente del vector de expresión de mamíferos pcDNA3.1 Myc/His (Invitrogen) y a niveles inferiores en células humanas transfectadas. Para superar este bajo nivel de expresión, una versión optimizada por codones del gen que codifica glicoproteína de la rabia ERA (ea-co) se trató usando técnicas reconocidas en la materia. También se clonaron otras proteínas G (ERA (era-n) , n aislado de mofeta de California, EUA (mofeta-ca) , y los aislados de murciélagos 1 borealis-tn y 1. cinereus-az) . La optimización de codones del gen de codificación de glicoproteína ERA condujo a un incremento marcado en el nivel de expresión comparado con la glicoproteína ERA de tipo silvestre (Figura 5), y sirvió como un reactivo útil para muchos experimentos subsiguientes. HuMab 17C7 se determinó para inmunoprecipitar las glicoproteínas de células solubilizadas transfectadas con aislados era -co (no mostradas) , era -n , mofeta -ca , 1 . borealis-tn y 1 , cinereus-az (Figura 5B) . Usando citometría de flujo además se mostró que HuMab 17C7 también se unió dependiendo de la dosis a las células que expresan la glicoproteína ERA-CO, ERA-N, L. borealis-TN y L. cinereus-AZ en su superficie celular (Figura 5C y D) . Estos datos muestran que HuMab 17C7 se une específicamente a glicoproteínas del virus de conejos de múltiples cepas y aislados . Para caracterizar mejor el epítope que reconoce HuMab 17C7, 17C7 se probó y determinó para reconocer una versión soluble de la glicoproteína de la rabia (aminoácido 20-439) no tuvo los dominios citoplásmicos o transmembranas de la glicoproteína HuMAb 27C7 se determinó también que reconoció una forma soluble secretada de glicoproteína ERA (ERA-CO20-439) y los aminoácidos de expansión de glicoproteína CVS-11 (CVS-1120-439) 20-439 en ELISA (Figura 6A) . Sorprendentemente, HuMab 17C7 reconoció ERA-CO20-439 y ERACO desnaturalizado en un gel de SDS-PAGE después de la incubación en agentes reductores que contiene solución reguladora de muestra. Sin embargo, la fuerza de la señal fue aumentada en gran parte cuando las muestras se prepararon sin la adición de los argentes reductores (Figura 6B) . Este reconocimiento en SDS-PAGE no se observó para glicoproteína CVS-1120-439 sin agentes reductores (Figura 6C) . Estos datos indican que HuMab 17C7 reconoce un epítope discontinuo en la glicoproteína de la rabia ERA. HuMab 17C7 reconoce un sitio menor y un sitio antigénico III de la glicoproteína del virus de la rabia.

Para entender menor cuáles regiones en la glicoproteína de la rabia se reconocen por HuMab 17C7, se trataron los virus de la rabia capaces de desarrollarse en la presencia de HuMab 17C7. Con el fin de crear virus resistentes de HuMab 17C7 se adaptó por cultivo celular en la cepa CVS-11 y el aislado de mofeta de CA. Se aislaron los virus resistentes de 17C7 HuMab de las materias primas del virus de CVS-11. El análisis de las secuencias de codificación de glicoproteínas de estos virus derivados de CCS-11 revelaron las mutaciones de 3 puntos en los 8 virus analizados (CBS 1 a 8). Interesantemente, se identificaron cambios en Asparagina 336 en dos casos de aminoácidos. Un virus contuvo un cambio de Asn a Lys, y múltiples virus contuvieron un cambio de Asn a Asp. Dos de los virus contuvieron un cambio de Asn a Asp en 336, así como un cambio de Gln a Lys a 426. La asparagina 336 está dentro de una región previamente identificada como parte del sitio antigénico II (Tabla 11) . Con el fin de dirigirse a si la Asparagina 336 fue un residuo crítico para unión de HuMab 17C7, un residuo de Asparagina de 336 en la construcción de Era-co se mutó a aquellas observadas en los virus resistentes derivados de CVS-11. La glicoproteína de ERA se describió en las Figuras 5 y 6, se reconoció robustamente por HuMab 17C7; y el virus de ERA, que es altamente similar en la secuencia de glicoproteína a mofeta-CA también es potencialmente neutralizada por HuMab 17C7 comparado con CVS-11. Por lo tanto, se establece que los experimentos el residuo Asp336 se mostró importante para la neutralización de HuMab 17C7 del virus de CVS-11 y también importante para mantener al epítope de HuMab 17C7 dentro de la glicoproteína ERA. Las glicoproteínas mutadas ERA-CO N336K y ERA-CO N336D se expresaron y analizaron para el reconocimiento por HuMab 17C7. Las glicoproteínas mutantes se reconocieron por HuMab 17C7 en una ELISA, sin embargo la unión de HuMab 17C7 a la glicoproteína de ERA-CO N336K se redujo en gran parte comparado con el tipo silvestre (Figura 7A) . Los niveles del tipo silvestre y glicoproteína mutante capturada en el análisis de ELISA fueron similares a los mostrados por unión comparable de un anticuerpo monoclonal de glicoproteína contra la rabia de ratón (Figura 7A) . Las glicoproteínas mutantes fueron todas de los pesos moleculares apropiados como se muestra por inmunoprecipitación usando la etiqueta His, seguido por análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo de marca de Myc (Figura 7B) . HuMab 17C7 inmunoprecipitó las glicoproteínas ERA-CO y ERA-CO N336D más fácilmente que la glicoproteína de ERA-CO N336K (Figura 7B) , que concuerda con la unión disminuida de ERA-CO N336K observada en ELISA. En contraste con ERA-CO tipo silvestre, las proteínas mutantes no se reconocieron en análisis Western bajo condiciones sin reducción (Figura 7B) . También se crearon ERA-CO N336D Q42K y ERA Q426K, y los resultados de ELISA e inmunotransferencia fueron similares a aquellos para ERA-CO N336D, y ERA-CO Q426K respectivamente, revelando que la mutación de Q426K no afectó a la unión de HuMab 17C7. Con el fin de dirigir a si el reconocimiento por HuMab 17C7 se correlaciona con la actividad de neutralización, se creó un pseudovirus HIV-1 pseudotipificado de glicoproteína de rabia (10, 20), usando la glicoproteína ERA-CO. Se observó que estas células humanas infectadas por partículas de pseudovirus (Figura 8A) , y que HuMab 17C7 inhibieron potencialmente la infección por pseudovirus de ERA-CO tipo silvestre, mostrando inhibición importante por debajo de 100 pM (Figura 8B) . Se probaron HuMabs que no son de rabia no relacionados a 1000 nM y no neutralizaron los pseudovirus de rabia. Interesentemente, HuMab 17C7 también inhibió la infección de los pseudovirus ERA-CO N336K y ERA-CO N336D (Figura 8C) , concordante con la observación de que HuMab 17C7 reconoce ERA-CO N336K y neutralización de glicoproteínas ERA-CO N336D. Similar a HuMab 17C7, hRIG también inhibió todos los pseudovirus de la rabia en una forma dependiente de dosis (Figura 8D) . Estos datos demuestran que las mutaciones que vuelven inmune al virus CBS-11 a la neutralización de 17C7 HuMab disminuye, pero no anula, el reconocimiento de HuMab 17C7 de la glicoproteína de ERA y neutralización de pseudovirus de ERA. Con el fin de probar si otros sitios antigénicos bien caracterizados se reconocieron por HuMab 17C7, se creó un panel de glicoproteínas mutantes conteniendo ca bos de aminoácidos reportados previamente para virus resistentes a MAb alterados en residuos que afectan sitios antigénicos I, II, III y sitio menor a (Tabla 11) . HuMab 17C7 se inmunoprecipitó fácilmente todas las glicoproteínas mutantes de lisatos celulares con excepción de la glicoproteína R333I, K342T, G343E, en una porción de sitio antigénico III (a. a. 333) y mutante de sitio menor a (a. a. 342 y 343). Además se caracterizó que la determinante importante para unión de HuMab 17C7 creando un sitio de mutante III R333I separado y mutante de sitio a menor K342T, G343E. La mutante III del sitio R3331 se reconoció por HuMab 17C7 en ELISA e inmunotransferencia, mientras las mutantes K343T, G343E menor a y R333I, K342T, G343E de sitio III/menor a fueron menos bien reconocidas 19 (Figura 7A y B) . Las mutantes K343T, G343E y R333I, K342T, G343E fueron reconocidas por un anticuerpo monoclonal de rabia comercial (Figura 9A) , y se expresaron a niveles comparables. Por lo tanto, se determinó que la falta de unión de HuMab 17C7 a las mutantes de sitio a menor se debió a las mutaciones en aminoácidos 342 y 343 de la glicoproteína, demostrando que estos aminoácidos son importantes para el reconocimiento de HuMab 17C7 de la glicoproteina de la rabia (Tabla 12). Además, se compararon las secuencias de glicoproteínas de los aislados del virus de la rabia y lyssavirus que no son de rabia en los aminoácidos 336, 342 y 343. Los residuos importantes para HuMab 17C7 se conservaron entre cepas divergentes de virus de la rabia y lyssavirus de murciélago Australianos por algún otro lyssavirus (Tabla 13) . Las secuencias de glicoproteínas de virus de la rabia 154 se compararon de aislados de seres humanos, murciélagos y carnívoros de otros en el mundo, incluyendo Norte y Sud-América, China y la India. La comparación de secuencias reveló que la Asparagina 336 se conservó por un 93%, la lisina se conservó un 98% y la Glicina 343 se consideró un 99%. Estos datos indican que los residuos importantes para reconocimiento de HuMab 17C7 de glicoprotéina del virus de la rabia se conservaron ampliamente.

Tabla 11. Virus Resistentes HuMab 17C7 Virus No. de Cambio de Cambio de Codón Proximidad a sitio Aminoác-.do aminoácido antigénico CVS1 336 Asn a Lys AAT a AAG III CVS3-6 336 Asn a Asp AAT a GAT III CVS7-8 336 Asn a Asp AAT a GAT III CVS8-8 426 Glu a Asp CAG a AAG N/A Tabla 12 HuMab 17C7 Reconoce Glicoproteinas Mutdas por Siti I y Sitio II Mutaciones en glicoproteína Unión de HuMab Sitios recombinante 17C7 R333I + III K342T, G343E - Menor a R333I, K342T, G343E - Menor a y III K226E, L231P + I G34E + II G40V, S42P, M44I + II K198E + II Tabla 13 Ainoáciso 330-345 de Virus de la Rabia y otros Lyssaviruses Virus ID de Banco de Aminoácidos 330-345 Genes CVS-11 AF085333 KSVRTWNEIIPSKGCL ERA-CO AF406693 KSVRT NEILPSKGCL Skunk-CA N/A KSVRTWNEILPSKGCL L . borealis-TN N/A KSVKTWNEVIPSKGCL L . cinereus -AZ N/A KSVKT NEVIPSKGCL ERA na tive N/A KSVRT NEIIPSKGCL ABLV AF406693 KSVRT NEIIPSKGCL EBLV-1 AF298143 KSVREWTEVIPSKGCL EBLV-2 AF298145 KSIRE TDVIPSKGCL Lagos AF429312 LKVDNWSEILPSKGCL Mokola MVU17064 KRVQRWADILPSRGCJ.

HuMab 17C7 reconoce un epítope discontinuo debido a su capacidad para unirse con mayor reactividad con proteína no reducida. La interacción de HuMab 17C7 con la glicoproteína de la rabia también es única debido a que puede inmunoprecipitar las glicoproteínas unidas a membranas de una variedad de aislados de la rabia, y de neutralizar todos estos aislados, pero son o pueden interactuar con un subgrupo de glicoproteínas solubles secretadas en ELISA e inmunotransferencias. El reconocimiento de proteína no reducida por HuMab 17C7 indica que el sitio antigénico II, el sitio menor a, o una determinante conformacional desconocida de la glicoproteína de la rabia es importante para el reconocimiento por HuMab 17C7. El análisis de glicoproteínas mutantes reveló que 2 cambios de aminoácidos en el sitio menor a disminuye dramáticamente el reconocimiento de HuMab 17C7 de la glicoproteína de la rabia y/o da como resultado una modificación de la estructura terciaria de glicoproteína para unión HuMab 17C7. Estos datos muestran que los virus resistentes de 17C7 HuMab indican que Asparagina 336 es importante para neutralización de 17C7 HuMab. El cambio de aminoácido en el residuo 336 altera el ,sitio de unión de HuMab 17C7 en la glicoproteína de la rabia y/o da como resultado una modificación de la estructura de glicoproteína de la rabia crítica para unión de HuMab 17C7. El análisis de glicoproteínas mutantes criadas con mutagénesis dirigida al sitio también reveló que HuMab 17C7 reconoce un sitio menor a y parte del sitio antigénico III. Tomados juntos, estos resultados indican que HuMab 17C7 reconoce un epítope que se conserva ampliamente. La reactividad cruzada amplia de HuMab 17C7 indica que puede usarse en lugar de RIG para profilaxis por exposición posterior. Ejemplo 5. Protección de Hámsters de Virus de la Rabia Letales Confrontados por Administración de Anticuerpos del Virus Contra la Rabia Los anticuerpos se probaron para la capacidad de proteger hámsters de la confrontación con una dosis letal de virus de la rabia (véase Tablas 14-15) . El anticuerpo monoclonal humano 27C7 también se probó en un modelo de hámster de profilaxis posterior a la exposición (PEP) para determinar su potencial como una profilaxis para infección por virus de la rabia en seres humanos. Los hámster se confrontaron en el músculo de gastrocnemius de la extremidad trasera con una dosis fatal de virus de la rabia. El virus de confrontación originalmente se aisló de un coyote de Texas. En este modelo, los animales no tratados mueren por infección del virus de la rabia en menos de dos semanas. En resumen, se confrontaron los animales en el músculo gastrotecnemius con 50 µl de virus de la rabia y dados los anticuerpos del virus contra la rabia en el mismo sitio 24 horas después. Se trataron los animales (n=9) con una sola dosis de 19 mg/kg de inmunoglobulina derivada del suero de la rabia humano comercialmente disponible (HRIG, Imogam, Aventis) o anticuerpo monoclonal humano 17C7 en varias dosis (5, 0.5 o 0.25 mg/kg). Todos los animales en un grupo confrontado no tratado murieron de rabia dentro de 2 semanas de confrontación. La supervivencia porcentual en 63 días después el la confrontación mostró mejor protección por el anticuerpo monoclonal en una dosis de 0.25 mg/kg que la inmunoglobulina humana comercialmente disponible (Tabla 14). Un experimento similar se llevó a cabo en donde los animales se trataron con exposición posterior a anticuerpos a la rabia y, además, se trataron con vacunas contra la rabia. Se administró la vacuna humana comercial en el músculo gastrocnemius opuesto del sitio de confrontación en un volumen de inyección de 50 µl 1, 3, 7, 14, y 28 días después de la confrontación con la rabia. Los anticuerpos se administraron como se describió previamente. De nuevo, la supervivencia porcentual a 53 días después de la confrontación mostró mejor protección por el anticuerpo monoclonal a una dosis de 0.125 mg/kg que la inmunoglobulina humana comercialmente disponible (Tabla 15) . El anticuerpo se administró solo y con vacuna y los resultados mostrados en las Tablas 14-15 demuestran que los hámster confrontados con una dosis letal de virus de la rabia pueden protegerse con anticuerpos de la invención dados después de la exposición al virus ya sea solos (véase Tabla 14) o junto con la administración de vacuna de la rabia (Tabla 15) . Para demostrar que 17C7 no interfiere con la respuesta de las vacunas, se dieron los hámster 17C7 y vacunas contra la rabia. Como se muestra en la Tabla 16, los animales respondieron a la vacuna aún cuando se dio 17C7, demostrando así que el anticuerpo 17C7 no interfiere con la respuesta de la vacuna.

Tabla 14 Protección posterior a la exposición de rabia con un anticuerpo monoclonal humano3 Muestra IU/kg mg/kg Supervivencia A globulina inmune de rabia humana 15 8.0 5/9 B It 11 6 4.0 4/9 C II TI 1 0.4 0/9 D ?? p 0. 05 0.0 0/9 E hu MoAb 17C7 26 1.7 9/9 F ti II 7 0.9 9/9 G It II 1 0.1 6/9 H II fl 0.05 0.0 1/9 I Controles - - 0/9 a A las 24 horas después de la inoculación de un aislado del virus de la rabia de coyote de Texas (#323) , la profilaxis se inició en otros grupos de tratamiento de 9 animales cada uno con anticuerpo monoclonal humano 17C7 (26 IU/kg; 7 IU/kg, 1 IU/kg, o 0.05 IU/kg) o globulina inmune de la rabia humana comercial (15 IU/kg, 1 IU/kg, o 0.05 IU/kg) , administrada al sitio de inoculación del virus. El grupo de control no tratado consistió de 9 animales.

Tabla 15 Profilaxis posterior a la exposición de la rabia incluyendo vacuna. Comparación de un anticuerpo monoclonal humano a globulina inmune de rabia humana3 Muestra IU/kg mg/kg Supervivencia A globulina inmune de rabia humana 20 21 17/18 B anticuerpo monoclona humano 20 1 17/18 c 10 0.5 16/18 D 2 0.1 16/18 E controles - - 0/18 A 24 horas después de la inoculación del virus de la rabia (50 ul de 1:1000 (106-8 MICLD50/ml) de homogenado de glándula salivaría de un coyote infectado naturalmente (aislado de virus de la rabia de coyote de Texas #323) ) , se inició la profilaxis en cuatro grupos de tratamiento (A-D) de 18 hásmters cada uno con anticuerpo monoclonal humano 17C7 (20 IU/kg; 10 IU/kg o 2 IU/kg) o globulina inmune de la rabia humana comercial (20 IU/kg) , administrada en el sitio de inoculación del virus. Un volumen de 50 ul de vacuna de la rabia comercial se administró en el músculo gastrocnemius izquierdo. Las dosis adicionales de la vacuna se administraron en los días 3, 7, 14 y 28. El grupo de control no tratado consistió de 18 animales.

Tabla 16 Titulaciones Medias Geométricas de Anticuerpos Neutralizantes del Virus de la Rabia Siguiendo Combinaciones de Vacunas y Anticuerpos de la Rabia Día Grupos 3 7 14 28 42 Ig + vacuna de rabia humana 15 26 1,315 28 42 +/- Dev. St. 9-26 13-50 1241-1393 10,013 5,878 B hu MoAb+vacuna 12 22 339 3730-26873 4293- 8049 +/- Dev. St. 8-17 1 111--4455 129-8889 4,442 6,704 C hu MoAb + vacuna 10 17 6257- 404 2754-7158 7189 +/- Dev. St. 9-11 9-31 181-900 9,304 5,812 a Tres grupos de tratamiento (A-C) de animales recibieron anticuerpo monoclonal humano 17C7 (25 IU/kg (grupo B) o 15 IU/kg (grupo C) ) o globulina inmune de rabia humana comercial (25 IU/kg) administrada intramuscularmente en el músculo gastrocnemius izquierdo. Un volumen de 50 ul de vacuna de la rabia comercial se administró en el músculo gastrocnemius derecho. Las dosis adiciones de vacunas se administraron en los días 3, 7, 14, y 28. En los días 3, 7, 14, 28, y 42, seis animales por grupo se sedaron se recopiló sangre y se eutanizaron los animales. Tomados juntos, estos datos indican que 17C7 HuMab provee consistentemente protección in vivo contra la rabia y se puede usar en lugar de RIG para profilaxis después de la exposición.

Ejemplo 6. Producción de Anticuerpos de Virus Contra la Rabia para Administración en Seres Humanos Los anticuerpos humanos de la presente invención se pueden clonar y expresar recombinantemente para facilitar o incrementar su producción usando técnicas conocidas. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican 1 cadena pesada variables y cepas de ligeras de un clon de anticuerpos de la invención se puede clonar en un vector pIE-UgammalF usando metodología de ADN recombinante estándar. El vector se amplifica en E. coli, se purifica y se transfecta en células de CHO. Las células retransfectadas se siembran en placas a 4xl05 células por pozo en una placa de 96 pozos y se selecciona para transfección de vector con G418. Los clones resistentes seleccionados por resistencia G418, se analizan luego junto con otros transfectomas para la producción de IgG. La expresión de un anticuerpo puede amplificarse por crecimiento en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato. Un cultivo capaz de crecer en metotrexato 175 nM se elige para clonar células sencillas para desarrollo posterior. Sembrando el cultivo en placas de 96 pozos a baja densidad permitió la generación de cultivos originan desde de una sola célula o clones. Los cultivos se recuperaron para la producción de IgG humano, y la célula que produce el nivel más alto de IgG normalmente se selecciona para uso adicional. El clon amplificado por metotrexato se expandió para producir una biblioteca de células incluyendo frascos de reacción congelados múltiples de cédulas. Alternativamente, se pueden usar vectores de glutamina sintetasa (GS) con selección celular lograda usando, v.gr., metionina sulfosimina (véase, v.gr. Patentes de E.U.A. Nos. 5,827,739; 5,122,464; 5,879,936; y 5,891,603). Para preparar anticuerpos de células transfectadas, las células de un clon aislado en los pasos previos se cultivaron y expandieron como inoculo para un birreactor. El birreactor normalmente contiene un volumen de 500 litros de medio de cultivo. Las células se cultivaron en el birreactor hasta que cae la viabilidad de las células, lo cual indica que se ha producido una concentración máxima de anticuerpos en el cultivo. Las células se removieron por filtración. El ilustrado se aplicó a una columna de proteína A. Los anticuerpos se unen a la columna y se eluyen con un lavado con pH bajo. En seguida, los anticuerpos se aplican a una columna de Q-Sepharose para remover los contaminantes residuales tales como proteínas de célula CHO, ADN, y otros contaminantes (v.gr., contaminantes viales, si están presentes) . los anticuerpos se eluyeron de la columna de Q-Sepharoe, se nanofiltraron, se concentraron y se lavaron en una solución reguladora de pH tal como PBS. La preparación luego se tomó por alícuota asépticamente en frasco de reacción para administración.

Otras Modalidades Los expertos en la materia reconocerán o podrán asegurar el uso de no más de la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención descrita en la presente. Dichos equivalentes se pretende que sean abarcados por las siguientes reivindicaciones .

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a dos o más epítopes no traslapantes dentro del sitio antigénico I, sitio antigénico II, sitio antigénico

III, o sitio antigénico menor A de una proteína G del virus de la rabia, en donde el anticuerpo inhibe la capacidad del virus de la rabia para infectar células. 2. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo neutraliza el virus de la rabia en una Prueba de Inhibición del Foco Fluorescente

Rápido (RFFTT, por sus siglas en ingles) 3.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe el virus de la rabia in vivo en un sujeto. 4.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, protege de o inhibe la patología neuronal mediada por el virus de la rabia en un sujeto; protege de o inhibe la encefalomielitis mediada por el virus de la rabia en un sujeto; o protege o inhibe parálisis mediada por virus de la rabia en un sujeto. 5.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el virus de la rabia es un aislado seleccionado del grupo que consiste de aislado de aislado de CVS-11, aislado ERA, aislado de virus Pasteur, aislado de zorro gris (Texas) , aislado de zorro gris

(Arizona), aislado de zorro ártico (Arkansas) , asilado de mofeta (Central Norte) , aislado de mofeta (Central Sur) , aislado de mapache, aislado de coyote (Texas) , aislado de perro (Texas) , ^aislado de murciélago {Lasiurus borealis;

Tennessee) , aislado de murciélago {Eptesicus fuscus - Myotis sp.; Colorado), aislado de murciélago {Myotis spp;

Washington) , aislado de murciélago { Lasiurus borealis; Arizona), aislado de murciélago { Pipstrellus subflavus;

Alabama), aislado de murciélago { Tadarida brasiliensis;

Alabama) , aislado de murciélago { Lasionycetris noctivagans :

Washington) ; aislado de murciélago { Eptesicus fuscus;

Pensilvania) , aislado de mangosta (New York/ Puerto Rico) , aislado de perro (Argentina) , aislado de perro (Sonora) , aislado de perro (Gabon) , aislado de perro (Thai) , y combinaciones de los mismos. 6.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el epítope está entre los aminoácidos 19-524-19-439, 19-422, o 336-342 de la proteína G del virus de la rabia. 7.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el epítope se selecciona del grupo que consiste de epítope lineal, epítope conformacional, epítope discontinuo y sus combinaciones. 8.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a la proteína G, o fragmento de la misma, de un virus de la rabia con una KD de por lo menos aproximadamente 1 x 10"7M, 1 x 10"8M, 1 x 10"9M, 1 x 10"10M, 1 x 10_11M, 1 x 10"12M, o mejor. 9.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable de SEC ID NO: 1 (17C7) o SEC ID NO: 15 (6G11). 10.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable de SEC ID NO: 2 (17C7) o SEC ID NO: 16 (6G11).

11.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable de SEC ID NO: 1 (17C7) o SEC ID NO: 15 (6G11).

12.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable de SEC ID NO: 2 (17C7) o SEC ID NO: 16 (6G11).

13.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de región de cadena pesada variable de SEC ID NO: 2 (17C7) o SEC ID NO: 16 (6G11).

14.- Un anticuerpo humano aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a los epítopes reconocidos por un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera como se muestra en SEC ID NO: 2(17C7) o SEC ID NO: 16 (6G11) y una secuencia de aminoácidos de región variable como se muestra en SEC ID NO: 1 (17C7) o SEC ID NO: 15 (6G11), respectivamente .

15.- Un anticuerpo humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un epítope en la glicoproteína G del virus de la rabia que se traslapa con un epítope único por inmunoglobulina de suero humano o anticuerpo monoclonal de murino MAb 1112-1 (A.T.C.C. Acceso No. : HB 10751) .

16.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo compite para unirse a la proteína G del virus de la rabia con inmunoglobulina de suero humano o anticuerpo monoclonal de murinos MAb 1112-1 (A.T.C.C. Acceso No.: HB 10751).

17.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) que por lo menos son 80% idénticas a una o más de SEC ID NO: 3-5 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 17-19 (6G11) .

18.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena ligera variable del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) que por lo menos son 80% idénticas a una o más de SEC ID NO: 6-8 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 20-22 (6G11) .

19.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena pesada variable del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) que por lo menos son 95% idénticas a una o más de SEC ID NO: 3-5 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 17-19 (6G11) .

20.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena ligera variable del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) que por lo menos son 95% idénticas a una o más de SEC ID NO: 6-8 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 20-22 (6G11) .

21.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena pesada variable comprende tres CDR que por lo menos son 80% idénticas a una o más de SEC ID NO: 3-5 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 17-19 (6G11).

22.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde una región de cadena ligera variable comprende tres CDR que por lo menos son 80% idénticas a una o más de SEC ID NO: 6-8 (17C7) o a una o más de SEC ID NO: 20-22 (6G11). 22a.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo se une a dos o más epítopes no traslapantes dentro del sitio III antigénico y menor A.

23.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que se codifica por un gen humano VH 3-30 o gen VH 3-33; y (b) comprende una región variable de cadena ligera que se codifica por un gen VK humano seleccionado de V?L6, VKLII, V?L13, VKL15 O V?L19.

24.- El anticuerpo de la reivindicación 23, en donde la región variable de cadena pesada se codifica o deriva del gen VH 3-33 y la región variable de cadena ligera o codificada o derivada de V?L13.

25.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo inhibe la unión del virus de la rabia a células de mamíferos.

26.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo inhibe la unión de la proteína G del virus de la rabia a células de mamíferos.

27.- El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

28.- Un polipéptido aislado que comprende la porción de unión de antígeno de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

29.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicción 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio efector.

30.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicción 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio Fc.

31.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicción 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo de una sola cadena.

32.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicción 1, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende un fragmento de Fab.

33.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende además una marca o toxina.

34.- Una composición que comprende el anticuerpo o porción de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

35.- Una composición que comprende dos o más anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los anticuerpos se unen a diferentes epítopes de glicoproteína G de la rabia.

36.- Un ácido nucleico aislado que codifica una región variable de un anticuerpo humano que se une al virus de la rabia que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 25, o SEC ID NO: 27.

37.- Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 36.

38.- Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 36.

39.- Una vacuna de la rabia que comprende una glicoproteína G de la rabia aislada o fragmento de la misma.

40.- Un equipo que comprende uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados, o porción de unión de antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, e instrucciones para usarse en el tratamiento de enfermedad mediada por el virus de la rabia.

41.- Un método para tratar infección por rabia en un sujeto, comprendiendo: administrar al sujeto un anticuerpo monoclonal humano aislado o porción de unión a antígeno del mismo, o una composición de cualquiera de las reivindicciones precedentes en una cantidad efectiva para tratar al sujeto.

42.- El método de la reivindicación 41, en donde el sujeto es humano.

43.- El método de la reivindicación 41, en donde el anticuerpo porción de unión a antígeno del mismo se administra intravenosamente, intramuscularmente o subcutáneamente al sujeto.

44.- El método de la reivindicación 41, en donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se administra en combinación con un segundo agente terapéutico.

45.- El método de la reivindicación 44, en donde el segundo agente es un segundo anticuerpo humano o porción de unión de antígeno del mismo.

46.- El método de la reivindicación 44, en dónde el segundo gente es un agente antiviral.

47.- El método de la reivindicación 44, en donde el segundo agente es una vacuna del virus de la rabia.

48.- El método de la reivindicación 47, en donde la vacuna del virus de la rabia es una proteína G del virus de la rabia o fragmento de la misma.

49.- Un método para identificar un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a dos o más epítopes no traslapantes de una proteína G del virus de la rabia, el método comprendiendo el contacto del anticuerpo con un epítope dentro de un sitio antigénico seleccionado del grupo que consiste del sitio I antigénico, sitio II antigénico, sitio III antigénico, sitio menor A antigénico, combinaciones de los mismos, e identificar un anticuerpo con dicha actividad de unión.

50.- El método de la reivindicación 49, en donde el anticuerpo es un suero de anticuerpo humano, anticuerpo policlonal, o anticuerpo monoclonal.

51.- El método de la reivindicación 49, en donde el anticuerpo se une específicamente a un epítope lineal, epítope conformacional, o combinación del mismo.

52.- El método de la reivindicación 49, en donde el anticuerpo se identifica como reactivo cruzado con más de una cepa del virus de la rabia.

53.- Un anticuerpo o fragmento del mismo, identificado de acuerdo con el método de la reivindicación 52.

54.- Una composición que comprende uno o más péptidos que comprenden colectivamente dos o más epítopes no traslapantes dentro del sitio antigénico I, sitio antigénico II, sitio antigénico III, o antigénico menor A, de la proteína G del virus de la rabia, en donde la composición es capaz de inducir la neutralización de anticuerpos cuando se introducen en un mamífero.

55.- La composición de la reivindicación 54, en donde el mamífero es un ser humano, primate, o ratón.

56.- La composición de la reivindicación 54, en donde el ratón es un ratón transgénco que comprende una secuencia de inmunoglobulina humana.