KR101732056B1

KR101732056B1 - 중화 항-인플루엔자 ａ 바이러스 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101732056B1
Application number: KR1020117003526A
Authority: KR
Inventors: 안토니오 란차페히아
Original assignee: 인스티튜트 포 리서치 인 바이오메드슨
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2009-07-27
Publication date: 2017-05-02
Anticipated expiration: 2029-07-27
Also published as: BRPI0911699B8; JP2011528901A; US9340603B2; CN102164613A; IL210771A0; EP2313112A2; IL210772A0; MA32577B1; GT201100023A; KR20110049802A; AU2009275226B2; US20100086555A1; CN102216327A; BRPI0911699A2; KR20110047193A; CR20110079A; EP2313433A2; US20100080813A1; HK1161110A1; RU2011105062A

Abstract

본 발명은 헤마글루티닌에 결합하고 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형을 중화시키는 항체 및 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항체 및 항체 단편을 생산하는 불멸화된 B 세포 및 배양된 단일 형질세포를 인코딩하는 핵산, 및 그와 같은 항체 및 항체 단편에 결합하는 에피토프에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 스크리닝 방법, 및 진단, 치료 및 예방에서의 항체, 항체 단편, 및 에피토프의 용도에 관한 것이다.

Description

중화 항-인플루엔자 Ａ 바이러스 항체 및 이의 용도{NEUTRALIZING ANTI-INFLUENZA A VIRUS ANTIBODIES AND USES THEREOF}

본원은 2008년 7월 25일과 2009년 5월 27에 각각 출원된 미국 가출원 제61/083,838호 및 제61/181,582호의 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 전체가 참조로써 본원에 통합되어 있다.

인플루엔자 A 바이러스에 대한 중화 항체 반응은 특정한 바이러스 아형(subtype)에 대해 특이적인 것으로 여겨진다. 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)에 의해 정의된 16종의 인플루엔자 A 아형이 존재한다. 16종의 HA인 H1-H6은 두 가지 그룹으로 분류될 수 있다. 1그룹은 H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, 및 H16 아형으로 이루어지며, 2그룹은 H3, H4, H7, H10, H14 및 H15 아형을 포함한다. 모든 아형이 조류에 존재함에도 불구하고, 주로 H1, H2 및 H3 아형이 인간에게 질병을 일으킨다. H5, H7 및 H9 아형은 인간에게 산발적인 심각한 감염을 일으키고 있으며 새로운 전염병을 발생시킬 수 있다. H1 및 H3 바이러스는 끊임없이 진화하여 항원 소변이(antigenic drift)라 불리는 현상인 새로운 변종을 발생시킨다. 그 결과, 이전의 바이러스에 대한 반응으로 생성된 항체는 소변이된 새로운 바이러스에 대해 예방효과가 좋지 못하거나 없다. 결론은 출현할 것으로 예측되는 H1 및 H3 바이러스에 대해 매해 새로운 백신을 생산해야 하는데, 이 과정은 매우 비용이 많이 들뿐만 아니라 항상 효과적이지만은 않다는 것이다. 동일한 상황이 H5 인플루엔자의 생산에 적용된다. 실제로 베트남 또는 인도네시아 인플루엔자 A 바이러스 분리물에 기초한 현재의 H5 백신이 미래의 유행성 H5 바이러스를 예방할지 여부는 불분명하다.

이러한 이유로 인해, 모든 인플루엔자 A 바이러스 아형뿐만 아니라 이들의 매해의 변종을 중화시킬 수 있는 광범위 중화 항체를 유도하는 백신을 갖는 것이 매우 바람직할 것이다 (Gerhard et al., 2006에 의해 검토됨). 또한, 광범위 중화 이질아형(heterosubtype) 항체가 예방 또는 치료 세팅에 사용될 수 있을 것이다.

인플루엔자 A 바이러스를 인식하는 항체가 규명되어 왔다. M2에 대한 항체 (감염된 세포 상에서는 발현되지만 감염성 바이러스 상에서는 발현되지 않는 불변 (invariant) 소단백질)는 아마도 감염된 세포를 표적으로 하여 NK 세포나 세포독성 T 세포에 의해 파괴함으로써, 생체내에서 약간의 예방 효과를 나타내었다. 하지만, HA가 중화 항체의 1차 표적이다. 이는, 숙주 유래의 효소에 의해 분해되어 이황화 결합으로 여전히 연결된 2개의 폴리펩타이드를 생성하는 대략 500개의 아미노산인 거대한 엑토도메인 (ectodomain)을 포함한다. 보다 큰 N 말단 단편 (HA1, 320-330개의 아미노산)은 수용체 결합 부위 및 바이러스 중화 항체에 의해 인식되는 대부분의 결합부위 (determinant)를 함유하는 막 말단의 구형 도메인 (globular domain)을 형성한다. 보다 작은 C 말단 부분 (HA2, 대략 180개의 아미노산)은 상기 구형 도메인을 세포막 또는 바이러스 막에 고정시키는 줄기유사(stem-like) 구조를 형성한다. 아형 간의 서열 상동성 정도는 HA2 폴리펩타이드 (51%-80% 상동성)에서보다 HA1 폴리펩타이드(34%-59%)에서 더 작다. 최대로 보존된 영역은 절단 부위 주위의 서열, 특히 모든 인플루엔자 A 바이러스 아형 간에 보존되어 있는, 융합 펩타이드로 명명된 HA2 N 말단의 11개 아미노산이다. 이 영역의 일부는 HA 전구체 분자(HAO)에서 표면 루프(loop)로 노출되지만, HAO가 HA1/HA2로 분해되는 경우 접근하기 어렵게 된다. 요약하면, 상이한 HA 아형간의 보존 영역이 HA1-HA2 접합 영역과 HA2 영역에 존재한다. 하지만, 이들 영역은 중화 항체에 대한 접근성이 좋지 않을 수 있다.

인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 아형을 중화시키는 항체를 동정하는데 있어 제한된 성공만이 있었으며, 이들의 중화 범위가 좁고 이들의 잠재력이 낮다. Okuno 등은 인플루엔자 바이러스 A/Okuda/57 (H2N2)로 마우스를 면역화시킨 후, HA2 내에 보존된 입체형태적 에피토프(conformational epitope)에 결합하며 테스트관내 및 생체내 동물 모델에서 1그룹 H2, H1 및 H5 아형 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키는 단일클론 항체 (C179)를 분리하였다 (Okuno et al.,1993; Smirnov et al., 1999; Smirnov et al., 2000).

최근에, Gioia 등은 통상적인 계절성 인플루엔자 백신을 접종한 일부 개인의 혈청에서 H5N1 바이러스 중화 항체의 존재를 기술하였다 (Gioia et al., 2008). 저자는 중화 활성이 뉴라민산분해효소(neuraminidase, N1)에 대한 항체로 인한 것일 수 있음을 제시하고 있다. 하지만, 단일클론 항체가 분리되지 않았고 표적 에피토프가 규명되지 않았다. 상기 혈청 항체가 인플루엔자 A 바이러스의 다른 아형을 중화시키는지 여부가 불분명하다.

수십 년의 연구에도 불구하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 광범위하게 중화시키거나 억제하거나 또는 인플루엔자 A 바이러스에 의해 유발되는 질병을 약화시키는 항체가 시판된 적이 없다. 그러므로, 인플루엔자 A 바이러스의 다수의 아형을 예방하는 새로운 항체를 동정할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명은, 부분적으로는, 계절성 인플루엔자 백신을 접종한 개인으로부터 HA에 결합하고 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 아형의 감염을 중화시키는 자연적으로 발생하는 인간 단일클론 항체뿐만 아니라 본 발명의 항체가 결합하는 신규 에피토프를 분리하는 것에 기초를 두고 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 실시형태에서, 본 발명은 1그룹 및 2그룹 아형으로부터 선택된, 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 아형의 감염을 중화시키는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형의 감염을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1-6 또는 17-22 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 일치도를 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스를 중화시킨다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하고, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스를 중화시킨다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스를 중화시킨다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스를 중화시킨다. 본 발명은 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 FI6 돌연변이체 1 또는 FI6 돌연변이체 2이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형의 감염을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 단편은 불멸화된 B 세포 클론에 의해 발현된다.

다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 세포를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리 또는 정제된 면역성 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 발현시키는 세포, 또는 본 발명의 면역성 폴리펩타이드, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 제1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 제2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하고, 상기 제1 항체는 본 발명의 항체이고, 상기 제2 항체는 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다

(ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서의, (ⅱ) 백신에서의, 또는 (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서의, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 발명의 핵산, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 발현시키는 세포, 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 결합하는 에피토프를 포함하는 분리 또는 정제된 면역성 폴리펩타이드, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도는 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 생각된다. 또한, 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 생각된다.

다른 양상에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 항체, 또는 이의 항원 결합 항체 단편을 필요한 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 감소시키거나 인플루엔자 A 바이러스 감염의 위험을 낮게 하는 방법을 포함한다.

추가 양상에서, 본 발명은 (ⅰ) 치료에, (ⅱ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에, (ⅲ) 백신으로서, 또는 (ⅳ) 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시킬 수 있는 리간드의 스크리닝에 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 부분적으로, 본 발명의 항체가 결합하는 신규 에피토프뿐만 아니라 상이한 아형의 인플루엔자 A 바이러스를 광범위하게 중화시키는 자연적으로 발생하는 인간 항체의, 계절성 인플루엔자 A 백신으로 백신접종된 개체로부터의 발견 및 분리를 기초로 한다. 그와 같은 항체는, 단지 하나 또는 소수의 항체가 인플루엔자 A 바이러스의 상이한 아형을 중화하기 위해 필요한 바와 같이 바람직하다. 또한, 그와 같은 항체에 의해 인식되는 에피토프는 상이한 아형의 계절성 및 후보 대유행 분리물 모두에 대한 광범위한 보호를 유도할 수 있는 백신의 일부일 수 있다.

따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 1그룹 및 2그룹 아형의 적어도 2개의 인플루엔자 A 바이러스를 중화시키는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 또는 2그룹 아형의 감염을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명의 다른 양상에서, 상이한 인플루엔자 A 바이러스 아형의 HA에 대항하여 광범위한 특이성을 갖는 중화 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 항원 결합 단편은 1그룹 및 2그룹으로부터 선택된 2개 이상의 인플루엔자 A 바이러스 아형 중에서 보존되는 HA의 줄기 영역에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체, 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 37, 38, 39 또는 40 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다.

인간 모노클로날 항체, 본 발명의 항체를 분비하는 불멸화된 B 세포 클론 또는 형질감염된 숙주세포, 및 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산은 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 단편", "단편", 및 "항체 단편"은 항체의 항원 결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 어떤 단편을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 비제한적으로 단쇄 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 scFv를 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 항체 및 이의 항원 결합 단편 둘 모두를 포함한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "광범위한 특이성"은 인플루엔자 A 바이러스의 하나 이상의 1그룹 아형 및 하나 이상의 2그룹 아형에 결합하고/하거나 그 아형들을 중화시킬 수 있는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 의미하는 것으로 사용된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체를 중화시키는"이란 숙주에서 감염을 개시 및/또는 영속시키기 위해 병원체의 능력을 중화, 즉 방지, 억제, 감소, 방해 및/또는 저해할 수 있는 것이다. 용어 "중화 항체" 및 "...를 중화시키는 항체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 항체는 활성 백신접종과 관련하여 적당한 제형시 예방제 또는 치료제로서, 본 명세서에 기재된 진단 도구 또는 생산 도구로서, 단독으로 또는 병용하여 사용된 수 있다.

본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 1그룹 (H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, 및 H16 및 이들의 돌연변이체)로부터의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 및 2그룹 (H3, H4, H7, H10, H14 및 H15 및 이들의 돌연변이체) 아형으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스를 중화시킨다. 하나의 구체예에서, 예시적인 1그룹 아형 H1, H2, H5, H6, 및 H9를 포함하고, 예시적인 2그룹 아형은 H3 및 H7을 포함한다.

본 발명의 항체 및 항체 단편은 다양한 조합의 인플루엔자 A 바이러스 아형을 중화시킬 수 있다. 하나의 구체예에서, 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1 및 H3 아형, 또는 H2 및 H3 아형, 또는 H3 및 H5 아형, 또는 H3 및 H9 아형, 또는 H1 및 H7 아형, 또는 H2 및 H7 아형, 또는 H5 및 H7 아형, 또는 H7 및 H9 아형을 중화시킬 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2 및 H3 아형, 또는 H1, H3 및 H5 아형, 또는 H1, H3 및 H9 아형, 또는 H2, H3 및 H5 아형, 또는 H2, H3 및 H9 아형, 또는 H3, H5 및 H9 아형, 또는 H1, H2 및 H7 아형, 또는 H1, H5 및 H7 아형, 또는 H1, H7 및 H9 아형, 또는 H2, H5 및 H7 아형, 또는 H2, H7 및 H9 아형, 또는 H5, H7 및 H9 아형, 또는 H1, H3 및 H7 아형, 또는 H2, H3 및 H7 아형, 또는 H3, H5 및 H7 아형, 또는 H3, H7 및 H9 아형을 중화시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2, H3 및 H7 아형, 또는 H1, H3, H5 및 H7 아형, 또는 H1, H3, H7 및 H9 아형, 또는 H2, H3, H5 및 H7 아형, 또는 H2, H3, H7 및 H9 아형, 또는 H3, H5, H7 및 H9 아형 또는 H1, H2, H3 및 H5 아형, 또는 H1, H2, H3 및 H9 아형, 또는 H1, H3, H5 및 H9 아형, 또는 H2, H3, H5 및 H9 아형, 또는 H1, H2, H5 및 H7 아형, 또는 H1, H2, H7 및 H9 아형, 또는 H1, H5, H7 및 H9 아형, 또는 H2, H5, H7 및 H9 아형을 중화시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 인플루엔자 A 바이러스 H1, H2, H3, H5 및 H7 아형, 또는 H1, H2, H3, H7 및 H9 아형, 또는 H1, H3, H5, H7 및 H9 아형, 또는 H2, H3, H5, H7 및 H9 아형, 또는 H1, H2, H3, H5 및 H9 아형, 또는 H1, H2, H5, H7 및 H9 아형, 또는 H1, H2, H3, H5, H7 및 H9 아형을 중화시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스 H6 아형을 중화시키는 것에 추가하여 하나 이상의 상기 조합을 중화시킨다.

본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 높은 중화 효능을 갖는다. 인플루엔자 A 바이러스의 50% 중화에 필요한 본 발명의 항체의 농도는 예를 들어 약 50 μg/ml 이하일 수 있다. 하나의 구체예에서, 인플루엔자 A 바이러스의 50% 중화에 필요한 본 발명의 항체의 농도는 약 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 17.5, 15, 12.5, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 또는 약 1 μg/ml 이하이다. 다른 구체예에서, 인플루엔자 A 바이러스의 50% 중화에 필요한 본 발명의 항체의 농도는 약 0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.075, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.008, 0.006, 0.004, 0.003, 0.002 또는 약 0.001 μg/ml 이하이다. 이는, 단지 저농도의 항체가 인플루엔자 A 바이러스의 50% 중화에 필요하다는 것을 의미한다. 특이성 및 효능은 당업자에게 공지된 바와 같이 표준 중화 분석을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명의 항체

본 발명은 특히 HA에 대한 광범위한 특이성을 가지며 1그룹으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 아형 및 2그룹으로부터의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 아형을 중화시키는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 1그룹 및 2그룹으로부터 선택된 2개 이상의 인플루엔자 A 바이러스 아형 중에서 보존되는 HA의 영역에서 에피토프에 결합한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 1그룹 및 2그룹 인플루엔자 A 바이러스 아형의 HA의 줄기 영역에서 보존 에피토프에 특이적으로 결합하고, 바이러스성 복제 또는 스프레딩(spreading)를 저해하는 항체, 예를 들어, 분리된 항체 또는 정제된 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 1그룹 및 2그룹 아형의 HA의 줄기 영역에서 보존 에피토프에 특이적으로 결합하고, 세포에의 바이러스 침입을 억제하는 항체, 예를 들어, 분리된 항체 또는 정제된 항체를 제공한다. 이론에 구속되지 않으면서, 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인플루엔자 A 바이러스의 줄기 영역에서 보존된 에피토프에 결합하고, 융합 단계를 방해하여 세포에의 바이러스 침입을 억제한다. 단백질의 에피토프, 즉 항원결정부위는 항체의 결합 부위(즉 파라토프)에 의해 특이적으로 인식되는 분자의 부분들에 상응한다. 따라서, 에피토프는 작동 인식에 대한 상보적 파라토프를 필요로 하는 관계적 실체이다. 단백질의 상이한 돌연변이체 중에서 보존되는 에피토프는, 동일한 파라토프가 분자의 동일 부분을 접촉시켜 이들 상이한 돌연변이체를 특이적으로 인식할 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 항체는 모노클로날, 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 단편, 특히 항체의 항원 결합 활성을 유지하는 단편을 제공한다. 특허청구범위를 포함하는 명세서가 일부 위치에서 명백하게 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 항체의 돌연변이체(들) 및/또는 유도체(들)를 언급할 수 있을 지라도, 용어 "항체" 또는 "본 발명의 항체"는 모든 카테고리의 항체, 즉, 항원 결합 단편(들), 항체 단편(들), 항체의 돌연변이체(들) 및 유도체(들)을 포함하는 것으로 이해된다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 1그룹 및 2그룹의 2개 이상의 인플루엔자 A 바이러스 아형의 조합을 중화시킨다. 예시적인 인플루엔자 A 바이러스 아형은 비제한적으로 H5N1 (A/Vietnam/1203/04), H1N1 (A/New Caledonia/20/99), H1N1 (A/Salomon Island/3/2006), H3N2 (A/Wyoming/3/03) 및 H9N2 (A/chicken/Hong Kong/G9/97)을 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 초과의 1그룹 및 2그룹 인플루엔자 A 바이러스 아형의 조합을 중화시키고/거나 그 조합에 대해 특이적이다.

예시적인 구체예에서, 본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 아형 H1 및 H3 (예, H1N1 및 H3N2); 또는 H1, H3, H5, 및 H9 (예, H1N1, H3N2, H5N1 및 H9N2)에 대해 특이적인 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 H1, H3, H5, H7 및 H9 (예, H1N1, H3N2, H5N1, H7N1, H7N7, H9N2)에 대해 특이적이다. 인플루엔자 A 바이러스의 아형의 다른 예시적인 조합은 본 출원의 초기에 제공된다.

본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 경쇄 가변 영역 (V_L)의 아미노산 서열의 SEQ ID NO 및 항체를 인코딩하는 핵산 서열의 SEQ ID NO는 표 1에 열거되어 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO: 13, 33, 29 또는 35 중 어느 하나에서 인용된 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO: 14 또는 30에서 인용된 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 15, 34, 31 또는 36 중 어느 하나에서 인용된 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 16 또는 32에서 인용된 서열과 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩될 수 있다.

항체 중쇄의 CDR는 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로 각각 부른다. 마찬가지로, 항체 경쇄의 CDR은 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로 각각 부른다. CDR 아미노산의 위치는 하기와 같은 IMGT 넘버링 시스템에 따라 정의된다: CDR1 - IMGT 위치 27 내지 38, CDR2 - IMGT 위치 56 내지 65 및 CDR3 - IMGT 위치 105 내지 117.

표 2는 본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 각각의 6개의 CDR의 아미노산 서열에 대한 SEQ ID NO를 제공한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 SEQ ID NO: 1-6 또는 17-22 중 어느 하나에 대해 적어도 95% 서열 일치도를 갖는 서열을 갖는 적어도 하나의 CDR을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 FI6 돌연변이체 1, FI6 돌연변이체 2, FI28 돌연변이체 1 또는 FI28 돌연변이체 2로부터 하나 이상 (즉, 하나, 2개 또는 3개 모두)의 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체를 제공한다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체 또는 항체 단편은 (ⅰ) CDRH1에 대한 SEQ ID NO: 1, CDRH2에 대한 SEQ ID NO: 2 및 CDRH3에 대한 SEQ ID NO: 3, 또는 (ⅱ) CDRH1에 대한 SEQ ID NO: 17, CDRH2에 대한 SEQ ID NO: 18 및 CDRH3에 대한 SEQ ID NO: 19를 포함하는 중쇄를 포함한다.

FI6 돌연변이체 1, FI6 돌연변이체 2, FI28 돌연변이체 1 또는 FI28 돌연변이체 2로부터 하나 이상 (즉, 하나, 2개 또는 3개 모두)의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 또한 제공된다. 예시적인 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; SEQ ID NO: 5 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 6 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 명세서에 제공된 항체는 (ⅰ) CDRL1에 대한 SEQ ID NO: 4, CDRL2에 대한 SEQ ID NO: 5 및 CDRL3에 대한 SEQ ID NO: 6, 또는 (ⅱ) CDRL1에 대한 SEQ ID NO: 20, CDRL2에 대한 SEQ ID NO: 21 및 CDRL3에 대한 SEQ ID NO: 22를 포함하는 경쇄를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 열거된 항체 FI6 돌연변이체 1의 CDR 모두를 포함하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 열거된 항체 FI6 돌연변이체 2의 CDR 모두를 포함하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 열거된 항체 FI28 돌연변이체 1의 CDR 모두를 포함하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시킨다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 2에 열거된 항체 FI28 돌연변이체 2의 CDR 모두를 포함하고, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시킨다.

본 발명의 예시적인 항체는 비제한적으로 FI6 돌연변이체 1, FI6 돌연변이체 2, FI28 돌연변이체 1 또는 FI28 돌연변이체 2를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명의 항체는 또한 본 발명의 항체로부터의 하나 이상의 CDR 및 동일한 에피토프에 대한 다른 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 하이브리드 항체 분자를 포함한다. 하나의 구체예에서, 그와 같은 하이브리드 항체는 본 발명의 항체로부터의 3개의 CDR 및 동일한 에피토프에 대한 다른 항체로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 예시적인 하이브리드 항체는 i) 본 발명의 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR 및 동일한 에피토프에 대한 다른 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR, 또는 ⅱ) 본 발명의 항체로부터의 3개의 중쇄 CDR 및 동일한 에피토프에 대한 다른 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.

돌연변이형 항체는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 출원에서 인용된 서열의 돌연변이체는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 그와 같은 돌연변이체는 면역 반응 동안에 생체 내에서 또는 불멸화된 B 세포 클론의 배양시 실험실 내에서 체세포 돌연변이에 의해 산출된 자연적인 돌연변이체를 포함한다. 대안으로, 돌연변이체는 상기에서 언급한 바와 같이 유전 코드의 퇴보로 인해 생길 수 있고, 또는 전사 또는 번역에서의 오차로 인해 생성될 수 있다.

개선된 친화도 및/또는 효능을 갖는 항체 서열의 추가 돌연변이체는 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 얻을 수 있고, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 아미노산 치환은 추가 개선된 친화도를 갖는 항체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 항체의 생성을 위한 발현 시스템에서 번역의 효율을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 어떤 핵산 서열에 대한 유도된 질화 방법의 적용에 의해 항체 특이성 또는 중화 활성을 위해 최적화된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

구체예에서, 돌연변이형 항체 서열은 70% 또는 그 초과 (즉, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과) 아미노산 서열 일치도를 본 출원에서 인용된 서열와 함께 할 수 있다. 일부 구체예에서, 그와 같은 서열 일치도는 참조 서열 (즉, 본 출원에서 인용된 서열)의 전체 길이에 관해서 계산된다. 일부 추가 구체예에서, 본 명세서에 언급된 % 일치도는 NCBI (the National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 열거된 디폴트 파라미터 [Blosum 62 매트릭스; 갭 오픈 벌점(gap open penalty)=11 및 갭(gap) 확장 벌점=1]를 사용하는 BLAST 버젼 2.1.3를 사용하여 특정된다.

다른 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄 및 CDR의 일부 또는 전부를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 항체의 경쇄 및 중쇄 및 CDR의 일부 또는 전부를 인코딩하는 핵산 서열이 본 명세서에 제공된다. 표 1은 본 발명의 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 SEQ ID NO를 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 핵산 서열은 SEQ ID NO: 15 (이는 FI6 돌연변이체 1 중쇄 가변 영역을 인코딩함), SEQ ID NO:　34 (이는 FI6 돌연변이체 2 중쇄 가변 영역을 인코딩함), SEQ ID NO: 16 (이는 FI6 돌연변이체 1 및 FI6 돌연변이체 2 경쇄 가변 영역을 인코딩함), SEQ ID NO: 31 (이는 FI28 돌연변이체 1 중쇄 가변 영역을 인코딩함); SEQ ID NO: 36 (이는 FI28 돌연변이체 2 중쇄 가변 영역을 인코딩함) 및 SEQ ID NO: 32 (이는 FI28 돌연변이체 1 및 돌연변이체 2 경쇄 가변 영역을 인코딩함)을 포함한다.

표 3은 본 발명의 예시적인 항체의 CDR을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 SEQ ID NO를 제공한다. 유전 코드의 여분에 기인하여, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 이들 서열의 돌연변이체가 존재할 것이다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 핵산에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 일치도를 갖는 핵산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열은 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 인코딩하는 핵산의 서열을 갖는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 서열은 SEQ ID NO: 7-12, 15, 16, 34, 23-28, 31, 32 또는 36의 핵산 서열과 적어도 75% 동일한 서열을 포함한다.

벡터, 예를 들어 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 그와 같은 벡터로 형질전환된 세포는 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 그와 같은 세포의 예는 비제한적으로 진핵 세포, 예를 들어 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포를 포함한다. 하나의 구체예에서, 세포는 포유류, 예를 들어 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 FI6 돌연변이체 1, FI6 돌연변이체 2, FI28 돌연변이체 1 및 FI28 돌연변이체 2로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체를 비제한적으로 포함하는 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 에피도프에 결합하는 모노클로날 항체에 관한 것이다.

모노클로날 및 재조합 항체는 이들 항체를 지도하는 개별적인 폴리펩타이드 또는 다른 항원의 확인 및 정제에 특히 유용하다. 본 발명의 항체는, 면역분석, 방사선면역분석 (RIA) 또는 효소결합 면역흡수 분석법 (ELISA)에서 시약으로 이용될 수 있다는 점에서 추가적인 유용성을 갖는다. 이들 적용에서, 항체는 방사선동위원소, 형광 분자 또는 효소와 같은 분석적으로 검출가능한 시약으로 표지될 수 있다. 항체는 또한 항원의 분자 확인 및 특성화 (에피토프 맵핑)을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 치료 부위로의 전달을 위한 약물에 커플링될 수 있거나 관심 세포, 예컨대 인플루엔자 A 바이러스로 감염된 세포를 포함하는 부위의 이미징을 용이하게 하기 위해 검출가능 표지에 커플링될 수 있다. 항체를 약물 및 검출가능 표지에 커플링하기 위한 방법은 검출가능 표지를 이미징화하기 위한 방법인 바와 같이 본 기술분야에 공지되어 있다. 표지된 항체는 다양한 표지를 이용하여 다양한 분석에서 이용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 관심 에피토프 (인플루엔자 A 바이러스 에피토프) 사이의 항원-항체 복합체의 형성의 검출은 검출가능 기질을 항체에 부착시킴으로써 용이하게 될 수 있다. 적당한 검출 수단은 표지, 예컨대 방사선핵종, 효소, 조효소, 형광물질, 켐일루미네서(chemiluminescer), 색원체, 효소 기질 또는 공동인자, 효소 억제제, 보결분자(prosthetic) 그룹 복합체, 유리 라디칼, 입자, 염료 등의 사용을 포함한다. 적당한 효소의 예는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린스테라아제를 포함하고; 적당한 보결분자(prosthetic) 그룹 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적당한 형광 물질의 예는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀이고; 생물발광 물질의 예는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 적당한 방사선활성 물질의 예는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, 또는 ³H을 포함한다. 그와 같은 표지된 시약은 다양한 공지 분석, 예컨대 방사선면역분석, 효소 면역분석, 예를 들어, ELISA, 형광 면역분석 등에 사용될 수 있다 (참고, 예를 들어 US 3,766,162; US 3,791,932; US 3,817,837; 및 US 4,233,402).

본 발명에 따른 항체는 치료성분, 예컨대 세포독소, 치료제, 또는 방사선활성 금속 이온 또는 방사선동위원소에 콘쥬게이트될 수 있다. 방사선동위원소의 예는 비제한적으로 I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, Bi-213, Pd-109, Tc-99, In-111 등을 포함한다. 그와 같은 항체 콘쥬게이트는 주어진 생물학적 반응을 변경시키기 위해 사용될 수 있고; 약물성분은 고전적인 화학 치료제로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 약물성분은 원하는 생물학적 활성을 가지고 있는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 그와 같은 단백질은 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아 독소를 포함할 수 있다.

그와 같은 치료성분을 항체에 콘쥬게이트하기 위한 기술은 공지되어 있다. 참조, 예를 들어, Arnon et al. (1985) "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, ed. Reisfeld et al . (Alan R. Liss, Inc.), pp. 243-256; ed. Hellstrom et al. (1987) "Antibodies for Drug Delⅳery," in Controlled Drug Delⅳery, ed. Robinson et al. (2d ed; Marcel Dekker, Inc.), pp. 623-653; Thorpe (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, ed. Pinchera et al. pp. 475-506 (Editrice Kurtis, Milano, Italy, 1985); "Analysis, Results, and Future Prospectⅳe of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, ed. Baldwin et al . (Academic Press, New York, 1985), pp. 303-316; and Thorpe et al . (1982) Immunol . Rev . 62:119-158.

대안으로, 항체, 또는 이의 항체 단편은 제2 항체, 또는 이의 항체 단편에 콘쥬게이트되어, US 4,676,980에 기재되어 있는 바와 같이 항체 헤테로콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 또한, 링커는 표지 및 본 발명의 항체 사이에 사용될 수 있다 (예, US 4,831,175). 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사선활성요오드, 인듐, 이트륨, 또는 본 기술분야에 공지된 기타 방사선활성 입자로 직접 표지될 수 있다 (예, US 5,595,721). 치료제는 치료제와, 동시에 또는 순차적으로 투여된 콘쥬게이트 또는 비(non)콘쥬게이트된 항체의 병용으로 이루어질 수 있다 (예, WO00/52031; WO00/52473).

본 발명의 항체는 또한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체, 또는 이의 기능적 항체 단편은 예를 들어 순환 반감기를 증가시키기 위해 폴리머에 대한 공유 콘쥬게이션에 의해 화학적으로 변성될 수 있다. 폴리머, 및 이들을 펩타이드에 부착시키는 방법의 예는 하기에 나타나 있다: US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 및 US 4,609,546. 일부 구체예에서, 폴리머는 폴리옥시에틸렌화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로부터 선택될 수 있다. PEG는 실온에서 물에서 가용성이고, 하기 일반식으로 표시된다: R(O--CH₂ --CH₂)_n O--R (여기서, R은 수소, 또는 보호 그룹, 예컨대 알킬 또는 알칸올 그룹일 수 있다). 하나의 구체예에서, 상기 보호 그룹은 1 내지 8개의 탄소를 가질 수 있다. 추가 구체예에서, 상기 보호 그룹은 메틸이다. 부호 n은 양의 정수이다. 하나의 구체예에서, n은 1 내지 1,000이다. 다른 구체예에서, n은 2 내지 500이다. 하나의 구체예에서, PEG는 1,000 내지 40,000의 평균 분자량을 갖는다. 추가 구체예에서, PEG는 2,000 내지 20,000의 분자량을 갖는다. 추가 구체예에서, PEG는 3,000 내지 12,000의 분자량을 갖는다. 하나의 구체예에서, PEG는 적어도 하나의 히드록시 그룹을 갖는다. 다른 구체예에서, PEG는 말단 히드록시 그룹을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 억제제 상에서 유리 아미노 그룹과 반응하도록 활성화되는 말단 히드록시 그룹이다. 그러나, 반응성 그룹의 유형 및 양은 본 발명의 공유 콘쥬게이트된 PEG/항체을 성취하기 위해 변할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

수용성 폴리옥시에틸렌화 폴리올은 또한 본 발명에 유용하다. 이들은 폴리옥시에틸렌화 소르비톨, 폴리옥시에틸렌화 글루코스, 폴리옥시에틸렌화 글리세롤 (POG) 등을 포함한다. 하나의 구체예에서, POG가 사용된다. 이론에 구속되지 않고, 폴리옥시에틸렌화 글리세롤의 글리세롤 주쇄는, 예를 들어 모노-, 디-, 트리글라세라이드에서 동물 및 인간에서 자연적으로 생기는 동일한 주쇄이기 때문에, 이 분지화는 신체에서 외부 제제로서 반드시 보일 필요는 없다. 일부 구체예에서, POG는 PEG로서 동일한 범위에서 분자량을 갖는다. 순환 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 다른 약물 전달 시스템은 리포좀이다. 리포좀 전달 시스템의 제조 방법은 Gabizon et al. (1982), Cafiso (1981) 및 Szoka (1980)에서 논의된다. 기타 약물 전달 시스템은 본 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: Poznansky et al. (1980) 및 Poznansky (1984).

본 발명의 항체는 정제된 형태로 제공될 수 있다. 전형적으로, 항체는 기타 폴리펩타이드가 실질적으로 없는 조성물에 존재할 것이고, 예를 들어, 여기서, 조성물의 90% (중량)% 미만, 일반적으로 60% 미만, 더욱 일반적으로 50% 미만이 기타 폴리펩타이드로 구성된다.

본 발명의 항체는 비(non)인간 (또는 이종의) 숙주, 예를 들어 마우스에서 면역성일 수 있다. 특히, 항체는 인간 숙주에서가 아니라 비(non) 인간 숙주에서 면역성인 이디오토프(idiotope)를 가질 수 있다. 인간 사용을 위한 본 발명의 항체은숙주, 예컨대 마우스, 염소, 토끼, 랫트, 비(non) 영장류 등으로부터 쉽게 분리될 수 없는 것들을 포함하고, 인간화에 의해 또는 제노마우스(xeno-mouse)로부터 일반적으로 얻을 수 없다.

본 발명의 항체는 어떤 아이소타입 (예, IgA, IgG, IgM, 즉 α, γ 또는 μ 중쇄)일 수 있지만, 일반적으로 IgG일 것이다. IgG 아이소타입 내에, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 κ 또는 λ 경쇄를 가질 수 있다.

항체의 생성

본 발명에 따른 항체는 본 기술분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 만드는 일반적인 방법은 공지되어 있다 (Kohler, G. 및 Milstein, C,. 1975; Kozbar et al. 1983). 하나의 구체예에서, WO2004/076677에 기재된 대안적인 EBV 불멸화 방법이 사용된다.

WO2004/076677에 기재된 방법을 사용하여, 본 발명의 항체를 생산하는 B 세포는 폴리클로날 B 세포 활성화제의 존재에서 EBV로 형질전환될 수 있다. EBV에 의한 형질전환은 표준 기술이고, 폴리클로날 B 세포 활성화제를 포함하도록 쉽게 맞출 수 있다.

세포 성장 및 분화의 추가 자극제는 효율을 추가로 향상시키도록 형질전환 단계 동안에 임으로 첨가될 수 있다. 이들 자극제는 사이토카인, 예컨대 IL 2 및 IL-15일 수 있다. 하나의 양상에서, IL-2이 불멸화의 효율을 추가로 향상시키기 위해 불멸화 단계 동안에 첨가되지만, 그의 사용이 필수는 아니다. 그 다음, 이들 방법을 사용하여 생산된 불멸화된 B 세포는 본 기술분야에 공지된 방법 및 그 세포로부터 분리된 항체를 사용하여 배양될 수 있다.

UK 특허출원 0819376.5에 기재된 방법을 사용하여, 단일 형질세포는 마이크로웰 배양 접시에서 배양될 수 있다. 항체는 단일 형질세포 배양으로부터 분리될 수 있다. 또한, 단일 형질세포 배양으로부터, RNA는 추출될 수 있고, 단일 세포 PCR은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 항체의 VH 및 VL 영역은 RT-PCR에 의해 증폭되고, 서열화되며, 그 다음 HEK293T 세포 또는 기타 숙주세포로 형질감염된 발현 벡터로 클로닝된다. 발현 벡터에서의 핵산의 클로닝, 숙주세포의 형질감염(transfection), 형질감염된 숙주세포의 배양 및 생산된 항체의 분리는 본 기술분야의 숙련자에 공지된 어떤 방법을 사용하여 행할 수 있다.

항체는, 필요에 따라, 여과, 원심분리 및 다양한 크로마토그래피 방법, 예컨대 HPLC 또는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 제약 등급의 항체를 생산하기 위한 기술을 포함하는, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체의 정제 기술은 본 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 항체의 단편은 효소, 예컨대 펩신 또는 파파인(papain)에 의한 소화를 포함하는 방법, 및/또는 화학 환원에 의한 디설파이드 결합의 절단에 의해 항체로부터 얻을 수 있다. 대안으로, 항체의 단편은 중쇄 또는 경쇄의 서열 일부의 클로닝 및 발현에 의해 얻을 수 있다. 항체 "단편"은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 유도된 단쇄 Fv 단편 (scFv)을 포함하고, 예를 들어 본 발명은 본 발명의 항체로부터 CDR을 포함하는 scFv를 포함한다. 중쇄 또는 경쇄 모노머 및 다이머, 단일 도메인 중쇄 항체, 단일 도메인 경쇄 항체, 및 단쇄 항체, 예를 들어 단쇄 Fv가 또한 포함되며, 여기서, 상기 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 펩타이드 링커에 의해 연결된다.

본 발명의 항체 단편은 1가 또는 다가 상호작용을 부여할 수 있고, 상기에 기재된 바와 같은 다양한 구조로 함유될 수 있다. 예를 들어, scFv 분자는 3가 "트리아바디(triabody)" 또는 4가 "테트라바디(tetrabody)"를 만들도록 합성될 수 있다. scFv 분자는 2가 미니바디가 생기는 Fc 영역의 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 서열은 다중특이성 분자의 성분일 수 있고, 여기서, 본 발명의 서열은 본 발명의 에피토프, 및 기타 표적에 결합하는 분자의 기타 영역을 표적으로 한다. 예시적인 분자는 비제한적으로 이중특이성 Fab2, 3중특이성 Fab3, 이중특이성 scFv, 및 다이아바디를 포함한다 (Holliger 및 Hudson, 2005, Nature Biotechnology 9: 1126-1136).

분자생물학의 표준 기술은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 인코딩하는 DNA 서열을 준비하도록 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위 겨냥된 돌연변이생성 및 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 기술은 필요에 따라 사용될 수 있다.

어떤 적당한 숙주세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자 또는 이의 단편을 인코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. 박테리아, 예를 들어 대장균, 및 기타 미생물 시스템은 항체 단편, 예컨대 Fab 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편 및 단쇄 항체 단편, 예를 들어, 단쇄 Fvs의 발현을 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 진핵, 예를 들어 포유류, 숙주세포 발현 시스템은 완전한 항체 분자를 포함하는 더 큰 항체 분자의 생산을 위해 사용될 수 있다. 적당한 포유류 숙주세포는 비제한적으로 CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 분자의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 이끄는데 적당한 조건 하에서 본 발명의 핵산을 인코딩하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계 및 항체 분자를 분리하는 단계를 포함한다.

항체 분자는 단지 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이 경우에, 단지 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드 코딩 서열은 숙주세포를 트랩스펙션하도록 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 모두를 포함하는 생성물을 생산하기 위해, 세포주는 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 대안으로, 단일 벡터가 사용될 수 있고, 이 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함한다.

대안으로, 본 발명에 따른 항체는 i) 숙주세포에서 본 발명에 따른 핵산 서열을 발현시키는 단계 ⅱ) 발현된 항체 생성물을 분리하는 단계에 의해 생산될 수 있다. 추가로, 이 방법은 ⅲ) 항체를 정제하는 단계를 포함할 수 있다.

형질전환된 B 세포, 배양된 단일 형질세포 및 형질감염 된 HEK293T 세포의 스크리닝

형질전환된 B 세포 및 배양된 단일 형질세포는 원하는 특이성 또는 기능의 항체를 생산하는 것을 위해 스크리닝될 수 있다.

스크리닝 단계는 원하는 특이성 또는 기능을 확인하기 위한 어떤 면역분석, 예를 들어, ELISA, 조직 또는 세포 (형질감염된 세포 포함)의 염색(staining), 중화 분석 또는 수많은 기타 본 기술분야에 공지된 방법 중의 하나에 의해 수행될 수 있다. 분석은 하나 이상의 항원의 단일 인식의 기초에 대해 선택될 수 있고, 또는 예를 들어 항원 결합 항체보다는 항체를 중화시키는 것을 선택하기 위해, 표적 세포, 예컨대 신호전달 케스케이드(cascade), 형태, 성장 속도, 기타 세포에 영향을 미치는 능력, 기타 세포 또는 기타 시약 또는 조건의 변화에 의한 영향에 대한 반응, 분화 상황의 특징을 변화시킬 수 있는 항체를 선택하기 위해 원하는 기능의 추가적인 기초에 대해 선택될 수 있다.

그 다음, 개별적인 형질전환된 B 세포 클론은 포지티브 형질전환된 B 세포 배양으로부터 생산될 수 있다. 포지티브 세포의 혼합물로부터 개별적인 클론을 분리하기 위한 클로닝 단계는 한계 희석, 현미 조작, 세포 분류에 의한 단일 세포 침착 또는 본 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

배양된 단일 형질세포로부터의 핵산은 본 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 HEK293T 세포 또는 기타 숙주세포에서 분리, 클로닝 및 발현될 수 있다.

본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 형질감염된 HEK293T 세포는, 예를 들어 모노클로날 항체의 공급원으로서, 관심 모노클로날 항체를 인코딩하는 핵산 (DNA 또는 mRNA)의 공급원으로서, 연구를 위해 다양한 방식으로 사용될 수 있다.

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2개의 상이한 1그룹 아형 및 적어도 2개의 상이한 2그룹 아형을 중화시키는 항체를 생산하는 불멸화된 B 기억 세포 또는 형질감염된 숙주세포를 포함하는 조성물을 제공한다.

에피토프

상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 항체는 결합되는 에피토프를 맵핑하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명자들은, 인플루엔자 A 바이러스 감염을 중화시키는 항체가 HA 상에서 발견된 에피토프를 향한 것이라는 것을 발견했다. 하나의 구체예에서, 항체는 하나 이상의 1그룹 및 2그룹 인플루엔자 A 바이러스의 아형 중에서 보존된 HA의 줄기 영역에서 하나 이상의 에피토프에 대한 것이다. 본 발명의 항체가 결합되는 에피토프는 선형적 (연속) 또는 형태적 (불연속)일 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체 및 항체 단편은, 상기에서 논의된 바와 같이 SEQ ID NO: 37, 38, 39 또는 40을 포함하는 폴리펩타이드의 영역을 결합한다.

본 발명의 항체에 의해 인식된 에피토프는 수많은 용도를 가질 수 있다. 정제 및 합성 형태의 에피토프 및 이의 미모토프(mimotope)는 면역 반응 (즉, 백신으로서, 또는 기타 용도의 항체의 생성을 위한)을 상승시키기 우해 또는 에피토프 또는 이의 미모토프(mimotope)와 면역반응을 하는 항체의 혈청을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구체예에서, 그와 같은 에피토프 또는 미모토프, 또는 그와 같은 에피토프 또는 미모토프를 포함하는 항원은 면역 반응을 상승시키기 위해 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 항체 단편은 또한 백신의 질을 모니터하는 방법에 사용될 수 있다. 특히 항체는, 백신 중의 항원이 정확한 형태로 정확한 면역성 에피토프를 함유하는 지를 검사하기 위해 사용될 수 있다.

에피토프는 또한 상기 에피토프에 결합하는 리간드를 스크리닝하는데 유용할 수 있다. 그와 같은 리간드는 비제한적으로 낙타, 상어 및 기타 종을 포함하는 항체, 항체의 단편, 펩타이드, 파지(phage) 디스플레이 기술 생성물, 압타머(aptamer), 아드넥틴(adnectin) 또는 기타 바이러스성 또는 세포성 단백질의 단편을 포함하고, 에피토프를 차단할 수 있어서, 감염을 방지할 수 있다. 그와 같은 리간드는 본 발명의 범위 내에 포함된다.

재조합 발현

본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포는 또한 이후의 재조합 발현을 위하여 항체 유전자의 클로닝을 위한 핵산 공급원으로 사용될 수 있다. 재조합 공급원으로부터의 발현이, 예컨대 안정성, 재현성, 배양 편의 등의 이유로 인해 B 세포나 하이브리도마로부터의 발현보다 약제학적 목적을 위해 더 일반적이다.

따라서, 본 발명은 (ⅰ) 목적하는 항체를 인코딩하는 B 세포 클론 또는 배양된 단일 혈장 세포로부터 하나 이상의 핵산 (예컨대, 중쇄 및/또는 경쇄 mRNA)을 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 핵산을 발현 벡터로 삽입하는 단계; 및 (ⅲ) 목적하는 항체를 숙주세포에서 발현시키기 위해, 상기 벡터를 숙주세포 내로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

유사하게, 본 발명은 (ⅰ) 목적하는 항체를 인코딩하는 B 세포 클론 또는 배양된 단일 혈장 세포로부터 핵산의 서열을 결정하는 단계; 및 (ⅱ) 목적하는 항체를 숙주세포에서 발현시키기 위해, 단계 (ⅰ)로부터 얻은 정보를 이용하여 숙주세포 내로 삽입하기 위한 핵산을 제조하는 단계를 포함하는, 재조합 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 핵산은, 제한효소 부위를 도입하거나, 코돈 빈도를 변화시키고/시키거나 전사 및/또는 번역 조절 서열을 최적화하기 위해, 단계 (ⅰ) 및(ⅱ) 중간에 조작될 수 있으나, 조작되지 않아도 된다.

본 발명은 또한 숙주세포를 목적하는 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산으로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 형질감염된 숙주세포를 제조하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 핵산은 본 발명의 불멸화된 B 세포 클론 또는 배양된 단일 혈장 세포로부터 유래된 핵산이다. 따라서, 일차적으로 핵산을 제조한 다음, 이를 이용하여 숙주세포를 형질감염시키는 과정은 상이한 장소 (예컨대, 상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 상이한 시점에 수행될 수 있다.

본 발명의 이러한 재조합 세포들은 이후 발현 및 배양 목적을 위해 사용될 수 있다. 이들은 대규모의 의약품 생산을 위한 항체의 발현에 특히 유용하다. 이들은 또한 약제학적 조성물의 활성 성분으로 사용될 수 있다. 임의의 적절한 배양 기법, 예를 들어 정치 배양, 롤러 용기 (roller bottle) 배양, 복수액 (ascites fluid), 실관형 (hollow-fiber type) 생물반응기 카트리지, 모듈 미니발효기 (modular minifermenter), 교반 탱크, 미세담체 (microcarrier) 배양, 세라믹 코어 관류 (ceramic core perfusion) 등이 또한 사용될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

B 세포 또는 혈장 세포로부터 면역글로불린 유전자를 수득하고 서열을 결정하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다 (예컨대, Kuby Immunology, 4th edition, 2000의 제4장 참조).

형질감염된 숙주세포는 효모 및 동물 세포, 특히 포유동물 세포 (예컨대, CHO 세포, NS0 세포, PER.C6 (Jones et al 2003) 또는 HKB-11 (Cho et al. 2001; Cho et al. 2003) 세포와 같은 인간 세포, 골수종 세포 (US 5,807,715; US 6,300,104 등)) 뿐만 아니라 식물 세포를 포함하는 진핵 세포일 수 있다. 바람직한 발현 숙주는 본 발명의 항체를, 특히 인간에서 그 자체로 면역원성이 아닌 탄수화물 구조로 글리코실화할 수 있다. 하나의 구체예에서, 형질감염된 숙주세포는 혈청이 없는 배지에서 성장할 수 있다. 추가의 구체예에서, 형질감염된 숙주세포는 동물 유래 산물이 존재하지 않는 배양액 중에 성장할 수 있다. 형질감염된 숙주세포는 또한 배양되어 세포주를 생성할 수도 있다.

본 발명은 (ⅰ) 본 발명에 따라 불멸화된 B 세포 클론을 수득하거나 혈장 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 B 세포 클론 또는 배양된 단일 혈장 세포로부터 목적하는 항체를 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 목적하는 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (예컨대, 중쇄 및 경쇄 유전자)를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (ⅰ) 본 발명에 따라 불멸화된 B 세포 클론을 제조하거나 단일 혈장 세포를 배양하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 목적하는 항체를 인코딩하는 핵산의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 목적하는 항체를 인코딩하는 핵산 서열을 수득하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 형질전환된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 수득한 핵산을 수득하는 단계를 포함하는, 목적하는 항체를 인코딩하는 핵산 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 따라서, 일차적으로 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포를 수득한 다음, 상기 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 핵산을 얻는 과정은 상이한 장소 (예컨대, 상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 상이한 시점에 수행될 수 있다.

본 발명은 (ⅰ) 목적하는 항체를 발현하는 선발된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포로부터 하나 이상의 핵산 (예컨대, 중쇄 및 경쇄 유전자)을 수득하고/하거나 서열을 결정하는 단계; (ⅱ) 상기 핵산을 삽입하거나 핵산 서열을 이용하여 발현 벡터를 제조하는 단계; (ⅲ) 목적하는 항체를 발현할 수 있는 숙주세포를 형질감염시키는 단계; (ⅳ) 상기 형질감염된 숙주세포를 목적하는 항체가 발현되는 조건하에서 배양하거나 하위배양하는 단계; 및 임의로, (v) 목적하는 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체 (예컨대, 약제학적 용도용)를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 목적하는 항체가 발현되는 조건하에서 형질감염된 숙주세포 집단을 배양하거나 하위배양하는 단계; 및 임의로, 목적하는 항체를 정제하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 형질감염된 숙주세포 집단은 (ⅰ) 상기에서 기술한 바와 같이 제조된 B 세포 클론 또는 배양된 혈장 세포에 의해 생산된, 선별된 목적하는 항체를 인코딩하는 핵산을 제공하는 것, (ⅱ) 상기 핵산을 발현 벡터 내로 삽입하는 것, (ⅲ) 상기 벡터를 목적하는 항체를 발현할 수 있는 숙주세포로 형질감염시키는 것, 및 (ⅳ) 상기 삽입된 핵산을 포함하는 형질감염된 숙주세포를 배양하거나 하위배양하여 목적하는 항체를 생산하는 것에 의해 제조되어 왔다. 따라서, 일차적으로 재조합 숙주세포를 제조한 다음 이를 배양하여 항체를 발현하는 과정은 상이한 장소 (예컨대, 상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 상이한 시점에 수행될 수 있다.

약제학적 조성물

본 발명은 항체 및/또는 본 발명의 항체 단편 및/또는 그와 같은 항체를 인코딩하는 핵산 및/또는 본 발명의 항체에 의해 인식된 에피토프를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 또한 투여를 허용하는 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자체가 조성물을 수용하는 개체에 해로운 항체의 생성을 유도하지 않아야 하고, 유독성이어서는 안 된다. 적당한 담체는 큰, 느리게 물질대사된 거대분자, 예컨대 단백질, 폴리펩타이드, 리포좀, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 무기산 염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트일 수 있다.

치료용 조성물 중 약제학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조물, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질은 그와 같은 조성물에 존재할 수 있다. 그와 같은 담체는, 약제학적 조성물이 대상체에 의한 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 서스펜션으로 제형되도록 할 수 있다.

본 발명의 범위 내에, 투여 비경구 투여에 적합한 형태, 예를 들어 주사 또는 주입, 예를 들어 볼러스(bolus) 주사 또는 연속 주입을 포함할 수 있다. 생성물이 주사 또는 주입용인 경우, 오일성 또는 수성 비이클(vehicle) 중 서스펜션, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 제형 제제, 예컨대 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안으로, 항체 분자는 적절한 살균액과 함께 사용하기 전에, 재구성을 위해 건조 형태일 수 있다.

일단 제형되면, 본 발명의 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 하나의 구체예에서, 조성물은 인간 대상체에 투여를 위해 적응된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 경피, 경피, 국소, 피하, 비강, 장(enteral), 설하, 질내 또는 직장 경로를 비제한적으로 포함하는 임의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(Hypospray)는 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 주사가능물질, 예를 들어 액체 용액 또는 서스펜션으로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비이클 내의 용액, 또는 서스펜션에 적합한 고형 형태가 또한 제조될 수 있다.

조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 이루어질 것이고, 또는 조직의 세포 사이의 공간으로 전달될 것이다. 조성물은 또한 병변(lesion)에 투여될 수 있다. 투약 치료는 단일 투약 스케줄 또는 다중 투약 스케줄일 수 있다. 공지된 항체 기잔 제약은 투여의 빈도, 예를 들어 제약이 매일, 매주, 매월 등으로 투여되어야 하는지에 관한 안내를 제공한다. 빈도 및 투약은 증상의 심각도에 좌우될 수 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태로 조제될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 서스펜션과 같은 주사가능물질로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비이클 내의 용액, 또는 서스펜션에 적합한 고형 형태가 또한 제조될 수 있다 (예, 동결건조된 조성물, 예를 들어 Synagis^TM 및 Herceptin^TM, 보존제를 함유하는 살균수에 의한 재구성을 목적으로). 조성물은 국소 투여를 위해, 예를 들어 연고, 크림 또는 파우더로서 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여, 예를 들어 정제 또는 캡슐, 스프레이, 또는 시럽 (임의의 풍미)으로서 제조될 수 있다. 조성물은 미세 파우더 또는 스프레이를 사용하여 예를 들어 흡입기로서 폐 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 페서리(pessary)로서 제조될 수 있다. 조성물은 코, 귀, 또는 점적약과 같은 눈 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 대상체에 투여 직전에 조합된 조성물이 재구성되도록 고안된 키트 형태일 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 항체는 살균수 또는 살균 완충액을 갖는 키트 형태로 제공될 수 있다.

조성물 내의 활성 성분은 항체 분자, 항체 단편 또는 이의 돌연변이체 및 유도체일 수 있다는 것을 인정할 것이다. 그와 같은 자격으로, 위장관에서 분해가 쉬울 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되어야 한다면, 조성물은, 분해로부터 항체를 보호하지만, 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출하는 제제를 함유할 필요가 있다.

약제학적으로 허용가능한 담체의 철저한 논의는 하기로부터 이용가능하다: Gennaro (2000) Remington : The Science 및 Practice of Pharmacy , 20th edition, ISBN: 0683306472.

본 발명의 약제학적 조성물은 일반적으로 5.5 내지 8.5의 pH를 갖는다. 일부 구체예에서, 이는 6 내지 8이고, 추가 구체예에서는 약 7이다. pH는 완충액의 사용에 의해 유지될 수 있다. 조성물은, 살균이고/이거나 발열물질이 없을 수 있다. 조성물은 인간에 대해 등장(isotonic)일 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 밀봉 용기로 공급된다.

약제학적 조성물은 하나 이상의 본 발명의 항체 및/또는 본 발명의 항체를 결합하는 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드의 유효량, 즉 목적 질환 또는 상태를 치료, 경감, 또는 예방하거나 검출가능 치료 효과를 나타내는데 충분한 양을 포함할 것이다. 치료 효과는 또한 신체 증상의 감소를 포함한다. 어떤 특정 대상체에 대한 정확한 유효량은 크기 및 건강, 상태의 본질 및 정도, 및 투여를 위해 선택된 치료제 또는 이의 조합에 좌우될 것이다. 주어진 상황에 대한 유효량은 일상적인 실험에 의해 결정되고 임상의 판단의 범위 내에 있다. 본 발명을 위해, 유효 투여량은 일반적으로 투여되는 개체에서 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 본 발명의 조성물일 것이다. 공지된 항체 기반 제약은 이러한 점에서 안내를 제공한다. 예를 들어, Herceptin^TM는 초기 부하 용량 4 mg/kg 체중 및 매주 유지 용량 2 mg/kg 체중과 함께 21　mg/ml 용액의 정맥내 주입에 의해 투여되고; Rituxan^TM는 375 mg/m²로 매주 투여된다.

구체예에서, 조성물은 부가 또는 상승적인 치료 효과를 제공하도록 하나 초과 (예, 2, 3 등)의 본 발명의 항체를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 조성물은 인플루엔자 A 바이러스에 대항하는 하나 이상 (예, 2, 3 등)의 본 발명의 항체 및 하나 이상 (예, 2, 3 등)의 추가 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 항체는 HA 에피토프에 결합할 수 있지만, 다른 항체는 HA 상의 상이한 에피토프, 또는 뉴라민산분해효소 및/또는 매트릭스 단백질 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 또한, 인플루엔자 A 백신, 또는 인플루엔자 A 바이러스 이외의 특이성의 항체와 함께하는 본 발명의 항체의 투여는 본 발명의 범위 내이다. 본 발명의 항체는 인플루엔자 백신으로부터, 또는 인플루엔자 A 바이러스 이외의 특이성의 항체로부터 병용으로/동시에 또는 별도로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 2개 이상의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 제1 항체는 본 발명의 항체이고 HA 에피토프에 대해 특이적이고, 상기 제2 항체는 뉴라민산분해효소 에피토프, 제2 HA 에피토프 및/또는 매트릭스 에피토프에 대해 특이적이다. 예를 들어, 본 발명은 2개 이상의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 제1 항체는 인플루엔자 A 바이러스 HA의 줄기에서 에피토프에 대해 특이적이고, 상기 제2 항체는 뉴라민산분해효소 에피토프, 제2 HA 에피토프 (예를 들어, HA의 구형 헤드부(head)에서 에피토프, HA의 줄기에서 제2 에피토프), 및/또는 매트릭스 에피토프에 대해 특이적이다. 인플루엔자 A 바이러스 HA 의 줄기에서 제2 에피토프 또는 구형 헤드부에서 하나 초과의 인플루엔자 A 바이러스 아형 중에서 보존될 수 있지만 그럴 필요는 없다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 2개 이상의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 제1 항체는 뉴라민산분해효소 에피토프에 대해 특이적이고, 상기 제2 항체는 제2 뉴라민산분해효소 에피토프, HA 에피토프 및/또는 매트릭스 에피토프에 대해 특이적이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 2개 이상의 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 제1 항체는 매트릭스 에피토프에 대해 특이적이고, 상기 제2 항체는 제2 매트릭스 에피토프, HA 상의 에피토프 및/또는 뉴라민산분해효소에 대해 특이적이다.

인플루엔자 A 바이러스 표적 단백질에 대해 특이적인 본 발명의 예시적인 항체는 비제한적으로 FI6 돌연변이체 1, FI6 돌연변이체 2, FI28 돌연변이체 1 또는 FI28 돌연변이체 2를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 항체 FI6 돌연변이체 1 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 FI6 돌연변이체 2 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 FI28 돌연변이체 1 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 FI28 돌연변이체 2 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 항체는 기타 치료제, 예를 들어 화학치료 화합물, 방사선치료 등과 함께 (병용으로 또는 별개로) 투여될 수 있다. 하나의 구체예에서, 치료 화합물은 항-바이러스 화합물, 예컨대 Tamiflu^TM를 포함한다. 그와 같은 병용 치료는, 단독으로 투여될 때의 개별적인 치료제에 대해 치료 효능의 부가 또는 상승적인 개선을 제공한다. 용어 "상승작용"은, 활성제 각각의 개별적인 효과의 합보다 더 큰 2개 이상의 활성제의 병용 효과를 묘사하기 위해 사용된다. 따라서, 2개 이상의 제제의 병용 효과가 활성 또는 공정의 "상승적인 억제"로 귀결되는 경우에, 활성 도는 공정의 억제는 활성제 각각의 억제 효과의 합보다 더 큰 것으로 의도된다. 용어 "상승적인 치료 효과"란 2개 이상의 치료제의 병용으로 관찰된 치료 효과를 의미하고, 여기서, 치료 효과 (수많은 파라미터 중 어떤 것으로 측정)는 개별적인 치료제 각각으로 관찰된 개별적인 치료 효과의 합보다 더 크다.

항체는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료에 대한 반응을 이전에는 보여주기 않은, 즉 항-인플루엔자 치료에 대해 굴절력이 있는 것으로 보여진 대상체에 투여될 수 있다. 그와 같은 치료는 항-바이러스제에 의한 이전의 치료를 포함할 수 있다. 이는 예를 들어 인플루엔자 A 바이러스의 항-바이러스 저항성 긴장에 의한 감염에 기인할 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항체를 포함할 수 있고, 여기서, 항체는 조성물 중 총 단백질의 적어도 50 중량% (예, 60 중량%, 70 중량%, 75 중량%, 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 99% 또는 그 초과로 된다. 그와 같은 조성물에서, 항체는 정제된 형태이다.

본 발명은 (ⅰ) 본 발명의 항체를 제조하는 단계; 및 (ⅱ) 정제된 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 제약의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 제약의 제조 방법을 제공하고, 여기서, 상기 항체는 본 발명의 형질전환된 B 세포 또는 배양된 형질세포로부터 얻은 모노클로날 항체이다. 따라서 먼저 모노클로날 항체를 얻고, 그 다음, 제약을 제조하는 절차는 상이한 곳 (예, 상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에서 수행될 수 있다.

치료 목적을 위한 항체 또는 B 세포의 전달의 대안으로서, B 세포 또는 배양된 형질세포로부터 유도된 관심 모노클로날 항체 (또는 이의 활성 단편)을 인코딩하는 핵산(전형적으로 DNA)을 대상체에 전달할 수 있고, 이로써, 핵산은 원하는 치료 효과를 제공하도록 원위치 대상체에서 발현될 수 있다. 적당한 유전차 치료 및 핵산 전달 벡터는 본 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 면역성 조성물일 수 있고, 일부 구체예에서, 본 발명의 항체에 의해 인식된 에피토프를 포함하는 항원을 포함하는 백신 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 예방적 (즉, 감염 예방) 또는 치료적 (즉, 감염 치료)일 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 37, 38, 39 또는 40의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 백신을 제공한다.

조성물은, 툭히 다중 투약 형식으로 포장된다면, 항미생물을 포함할 수 있다. 세정제, 예를 들어 Tween (폴리소르베이트), 예컨대 Tween 80를 포함할 수 있다. 세정제는 일반적으로 낮은 수준, 예를 들어 <0.01%으로 존재할 수 있다. 조성물은 또한 강장(tonicity)을 제공하기 위해 나트륨 염 (예, 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 10±2 mg/ml NaCl의 농도가 전형적이다.

또한, 조성물은, 동결건조될 수 있거나, 동결건조된 물질로부터 재구성된 물질을 포함할하면, 예를 들어 약 15-30 mg/ml (예, 25 mg/ml)로 당 알콜 (예, 만니톨) 또는 이당류 (예, 수크로오스 또는 트레할로오스)를 포함할 수 있다. 동결건조를 위한 조성물의 pH는 동결건조 전에 약 6.1로 조정될 수 있다.

본 발명의 조성물 또한 하나 이상의 면역조절제를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 하나 이상의 면역조절제는 보조약(adjuvant)을 포함한다.

본 발명의 에피포트 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 감염에 효과적으로 초점을 맞추기 위해 인간 면역 반응뿐만 아니라 세포 매개된 면역 반응 모두를 유도할 수 있다. 이 면역 반응은 인플루엔자 A 바이러스에 노출시 빨리 반응할 수 있는 항체 및 세포 매개된 면역을 장기간 지속하는 (예, 중화시키는) 것을 유도할 수 있다.

의학적 치료 및 용도

본 발명의 항체 및 항체 단편 또는 이의 유도체 및 돌연변이체는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료, 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단을 위해 사용될 수 있다.

진단 방법은 항체 또는 항체 단편을 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 그와 같은 샘플은, 예를 들어 콧구멍, 부비강(sinus cavity), 침샘, 폐, 간, 췌장, 신장, 귀, 눈, 태반, 소화관, 심장, 난소, 뇌하수체, 부신, 갑상선, 뇌 또는 피부로부터 취한 조직 샘플일 수 있다. 진단 방법은 또한 항원/항체 복합체의 검출을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 치료에 사용하기 위한 (ⅰ) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 돌연변이체 및 유도체, (ⅱ) 본 발명에 따른 불멸화된 B 세포 클론, (ⅲ) 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 에피토프 또는 (ⅳ) 본 발명의 항체를 결합하는 에피토프를 결합할 수 있는 리간드, 바람직하게는 항체를 제공한다.

본 발명은 또한 대상체에, 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 돌연변이체 및 유도체, 또는 본 발명의 항체를 결합하는 에피토프를 결합할 수 있는 리간드, 바람직하게는 항체를 투여하는 것을 포함하는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 상기 방법으로 대상체의 인플루엔자 A 바이러스 감염이 감소하게 된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 대상체의 인플루엔자 A 바이러스 감염을 예방하고, 그 위험을 감소시키고 또는 그 감염을 지연시킨다.

본 발명은 또한 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 의약의 제조에서의, (ⅰ) 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 또는 이의 돌연변이체 및 유도체, (ⅱ) 본 발명에 따른 불멸화된 B 세포 클론, (ⅲ) 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 에피토프, 또는 (ⅳ) 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 에피토프에 결합하는 리간드, 바람직하게는 항체의 용도를 제공한다.

본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 제공한다. 또한, 대상체의 치료 및/또는 대상체의 진단용 의약의 제조에서의, 그와 같은 항체가 결합되는 에피토프를 포함하는 본 발명의 항체 및/또는 단백질의 용도를 제공한다. 또한, 대상체에 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간일 수 있다. 치료의 효능을 검사하는 하나의 방법은 본 발명의 조성물의 투여 후에 질환 증상을 모니터하는 것을 수반한다. 치료는 단일 투약 스케줄 또는 다중 투약 스케줄일 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명에 따른 항체, 항체 단편, 불멸화된 B 세포 클론, 에피토프 또는 조성물은 그와 같은 치료가 필요한 대상체에 투여된다. 그와 같은 대상체는 예를 들어, 면역타협된(immunocompromised) 대상체를 포함하는, 특히 인플루엔자 A 바이러스 감염의 위험이 있거나 쉬운 대상체를 비제한적으로 포함한다. 항체 또는 본 발명의 항체 단편은 또한 수동적인 면역 또는 활성 백신접종에 사용될 수 있다.

본 발명에 기재된 항체 및 이의 단편은 또한 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단용 키트에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 결합할 수 있는 에피토프는 보호 항-인플루엔자 A 바이러스 항체의 존재를 탐지하여 백신접종 절차의 효능을 모니터하기 위한 키트에 사용될 수 있다. 본 발명에 기재된 바와 같은 항체, 항체 단편, 또는 이의 돌연변이체 및 유도체는 또한 원하는 면역원성을 갖는 백신 제품을 모니터하기 위한 키트에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 모노클로날 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는 제약의 제조 방법을 제공하고, 여기서, 상기 모노클로날 항체는 본 발명의 형질감염된 숙주세포로부터 얻은 모노클로날 항체이다. 따라서, 먼저 모노클로날 항체를 얻고 (예, 이를 발현시킴 및/또는 그것을 정제함), 그 다음 그 항체를 약제학적 담체(들)과 혼합시키는 절차는 상이한 곳 (예, 상이한 국가)에서 상이한 사람들에 의해 매우 상이한 시간에서 수행될 수 있다.

본 발명의 형질전환된 B 세포나 배양된 혈장 세포로 시작하여, 다양한 배양, 하위 배양 (sub-culturing), 클로닝, 하위 클로닝 (sub-cloning), 서열분석, 핵산 준비 등의 단계들은 형질전환된 B 세포나 배양된 혈장 세포에 의해 발현된 항체를 지속시키기 위해 각 단계에서 임의의 최적화 과정과 함께 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 항체를 인코딩하는 핵산에 적용되는 최적화 기법 (예컨대, 친화력 성숙 (affinity maturation) 또는 최적화)을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 단계 중에 사용 및 제조된 모든 세포, 핵산, 벡터, 서열, 항체 등을 포함한다.

이들 방법 모두에서, 발현 숙주에 사용되는 핵산은 특정 핵산 서열을 삽입하거나, 결실시키거나 수정하도록 조작될 수 있다. 그러한 조작으로 인한 변화로는 제한효소 부위를 도입하거나, 코돈빈도 (codon usage)를 수정하거나, 전사 및/또는 번역 조절 서열을 최적화하는 등의 변화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 핵산을 바꾸어 인코딩된 아미노산을 변경시킬 수도 있다. 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내로 하나 이상의 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 등) 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 도입하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 점 돌연변이 (point mutation)는 작용 기능 (effector function), 항원 결합 친화력, 번역후 변형, 면역원성 등을 변형시키거나, 공유 그룹 (예컨대, 라벨)의 부착을 위해 아미노산을 도입하거나, 태그 (tag)(예컨대, 정제 목적을 위함)를 도입할 수 있다. 돌연변이는 특정 부위에 도입되거나 무작위로 도입된 다음, 선별 (예컨대, 분자 진화 (molecular evolution))될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 CDR 영역, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나를 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 무작위로 또는 지정되어 돌연변이되어 상기 인코딩된 아미노산에 상이한 특성을 도입할 수 있다. 그러한 변화는 초기 변화가 유지되고 다른 뉴클레오타이드 위치에 새로운 변화가 도입되는 반복적인 과정의 결과일 수 있다. 더욱이, 독립된 단계에서 달성된 변화들이 결합될 수 있다. 인코딩된 아미노산에 도입된 상이한 특성으로는 친화력 증가를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

개괄

용어 "포함하는"은 "함유하는" 뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함하며, 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X만으로 이루어질 수 있거나 부가적인 것, 예컨대 X + Y를 포함할 수 있다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지는 않으며, 예컨대 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.

수치 χ와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어 χ±10%를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "질환"은, 용어 "장애" 및 "상태"(의학적 상태로서)와 일반적으로 같은 의미인 것으로 의도되며 상호교환적으로 사용되는데, 이들 모두 정상적인 기능을 손상시키는, 인간이나 동물의 신체 또는 그 일부 중 하나의 비정상적인 상태를 반영하고, 구별되는 징후 및 증상에 의해 통상적으로 나타나며, 인간이나 동물의 수명 또는 삶의 질을 감소시킨다는 점에서 그러하다.

본원에 사용된 바와 같이, 대상 또는 환자의 "치료"에 대한 언급에는 예방 및 치료요법을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "대상" 또는 "환자"는 상호교환적으로 사용되며 인간을 포함한 모든 포유동물을 의미한다. 대상의 예로는 인간, 소, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지 및 토끼를 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 환자는 인간이다.

실시예

본 발명의 예시적 구체예가 하기의 실시예에 제공된다. 하기 실시예는 단지 예시로써 통상의 기술을 가진 자가 본 발명을 사용하는 것을 돕기 위해 제공되는 것이다. 실시예는 어떤 식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 혈장 세포로부터 인플루엔자 A 바이러스 광범위 중화 항체의 생성 및 규명

계절성 인플루엔자 백신 (H1 및 H3 HA 함유)에 대한 반응으로 이질이형 항체를 생성할 수 있는 개인을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 증강 (boost) 7일 후 회수한 순환하는 혈장 세포를 대상으로, 백신이나 관련없는 H5 HA (A/VN/1203/04)에 결합된 항체를 분비하는 이들의 능력으로 ELISPOT에 의해 스크리닝하였다. 놀랍게도, 테스트한 5명의 공여자 중 4명에게서, H5 특이적 혈장 세포가 검출되지 않았음에도 불구하고, 한 명의 공여자에게서, IgG 분비 혈장세포 중 14%가 H5에 대한 항체를 생성한 반면, 57%는 상기 백신에 대한 항체를 생성하였다. 자성 마이크로-비드를 이용하여 백신접종한지 7일째에 회수한 말초혈액단핵세포 (PMBC)로부터 CD138⁺ 혈장 세포를 분리한 후, FACSAria 기계를 이용하여 세포를 분류 (sorting)하였다. 제한된 수의 혈장 세포를 마이크로웰 배양 플레이트에 분주하였다. 배양 상등액을, 항원으로서 재조합 H5 또는 H9 HA 및 관련없는 항원 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid)를 이용하여 3개의 병렬 ELISA에서 테스트하였다. 스크리닝된 4,928개의 배양 상등액 중에서, 12개는 H5에 결합하지만 H9 HA에는 결합하지 않았고, 25개는 H9에 결합하지만 H5 HA에는 결합하지 않았으며, 54개는 H5 및 H9 모두에 결합하였다. 가장 높은 OD 신호를 갖는 일부 54개의 배양물에 대해 RT-PCR을 수행하고, 두 쌍의 VH 및 VL 유전자를 회수하였다.

상기 VH 및 VL 유전자를 발현 벡터로 클로닝하고 HEK293T 세포를 형질감염시켜 재조합 항체를 생산하였다. 상기 두 가지 단일클론 항체인 FI6 및 FI28은 대부분 V, D 및 J 유전자 단편 (IGHV3-30^*01, IGHD3-9^*01, IGHJ4^*02 및 IGKV4-1^*01)은 동일하였지만, N 영역, IGKJ 빈도 및 체세포 돌연변이 패턴이 달랐으므로, 클론적으로 연관이 없었다.

재조합 항체의 특이성을 상이한 아형에 속하는 HA의 패널을 이용하여 ELISA에 의해 조사하였다. 주목할만하게도, FI6은 1그룹 (H1, H5 및 H9) 및 2그룹 (H3 및 H7)을 포함하는 테스트된 모든 인플루엔자 A HA 아형에 결합한 반면, 인플루엔자 B 바이러스의 HA에는 결합하지 않았다. 대조적으로, FI28은 단지 3개의 1그룹 HA (H1, H5 및 H9)에만 결합하였다.

상기 두 가지 항체의 VH 및 VL 서열의 상동성을 고려하여, FI6, FI28 및 H 사슬의 동일한 V, D 및 J 요소를 사용하는 hCMV 특이적 항체인 7I13의 H 및 L 사슬을 이용하여 셔플링 실험(shuffling experiment)을 수행하였다. H7에 대한 결합은 FI6 H 및 L 사슬의 접합(paring)를 요구한 반면, H5에 대한 결합은 FI6 및 FI28 L 사슬이 뒤섞이는 경우 유지되었다. 또한, H5 결합은 또한 FI6의 H 사슬이 관련없는 7I13 L 사슬에 접합되는 경우에도 관찰되었다. 대조적으로, H5 결합은 상동인 7I13 H 사슬이 FI6 L 사슬과 접합되는 경우에는 관찰되지 않았다. 어떤 특정 이론에 구속됨이 없이, 이들 결과는 H5 결합은 주로 H 사슬로부터 비롯되는 반면, H7 결합은 FI6의 H 및 L 사슬 간의 정확한 접합을 필요로 한다는 것을 제시한다.

이후, FI6 및 FI28을 대상으로, 슈도타입화된 (pseudotyped) 바이러스 (표 5) 뿐만 아니라 감염성 바이러스 (표 6)를 이용하여 1그룹 및 2그룹 인플루엔자 A 아형을 중화시키는 이들의 능력을 테스트하였다. 주목할만하게도, FI6은 테스트한 모든 슈도바이러스 (pseudovirus), 예를 들어 항원성 분지군(dⅳergent clade) 인 0, 1, 2.1, 2.2 및 2.3에 속하는 6가지의 H5 분리물 및 2가지의 H7 조류 분리물을 중화시켰다. 또한 FI6은 테스트한 모든 감염성 바이러스, 예를 들어 수십년을 거쳐온 2가지의 H3N2 바이러스 및 4가지의 H1N1 바이러스와 최근의 H1N1 전염병 분리물 A/CA/04/09까지 중화시켰다 (표 6). FI28은 모든 H5 슈도바이러스를 중화시켰지만 H7 슈도바이러스뿐만 아니라 테스트한 모든 감염성 바이러스를 중화시키지는 못했다. 슈도바이러스에 대한 중화 역가는 감염성 바이러스에 대한 역가보다 높았다.

실시예 2: FI6 및 FI28 항원 결합 부위

항체 FI6 및 FI28이 결합하는 항원 부위를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 우선 HA 줄기 영역의 보존된 영역에 대해 지도가 작성된 마우스 단일클론 항체인 C179의 결합을 억제하는 이들의 능력을 테스트하였다 (Y. Okuno, et al., J Virol 67, 2552 (1993)). FI6 및 FI28 모두 재조합 H5 VN/1203/04 HA에 대한 C179의 결합을 완전히 억제하였는데, 이는 이들이 중복되는 에피토프를 인식한다는 것을 보여준다. 대조적으로, FI6 및 FI28은 HA의 구형 머리부분에 있는 상이한 에피토프를 인식하는 H5N1 면역 공여자로부터 분리된 H5 특이적 항체의 패널과 경쟁하지 않았다 (C. P. Simmons et al ., PLoS Med 4, e178 (2007); S. Khurana et al ., PLoS Med 6, e1000049 (2009)). 도피변이(escape mutant)의 선발에 의해 FI6 에피토프의 지도를 작성하고자 하는 시도는 실패하였는데, 이는 FI6의 에피토크가 바이러스 적응도(fitness)를 해결하지 않고는 손쉽게 변이될 수 없다는 것을 제시한다.

다음으로 본 발명자들은 HA A/VN/1194/04의 선형 및 고리형 펩타이드의 라이브러리를 이용한 펩타이드 기반의 지도작성 (mapping) 뿐만 아니라 Pepscan Presto BV 시스템을 이용한 헬릭스-스캔 (helix-scan)을 수행하였다 (Lelystad, The Netherlands). 이 분석은, HA2 융합 펩타이드 FGAIAG (H3 번호에 따라 아미노산 3-8; 서열번호: 37), HA2 헬릭스 A 펩타이드 DGVTNKVNS (아미노산 46-54; 서열번호: 38), HA2 헬릭스 B 펩타이드 MENERTLDFHDSNVK (아미노산 102-116; 서열번호: 39) 및 HA1 C 말단 펩타이드 LVLATGLRNSP (아미노산 315-325; 서열번호: 40)를 포함하는 FI6의 결합 영역을 확인시켜 주었다. FI28의 결합 영역은 FI6과 상이하였는데, 이 항체가 HA1 C 말단 펩타이드 및 HA2 헬릭스 B 펩타이드와 반응하지 않았기 때문이다.

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<210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcgaaagact cccaactgcg atcactcctc tattttgaat ggttatccca gggatatttt 60 gacccc 66 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cagagtgtca ccttcaacta taagaactac 30 <210> 11 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tgggcatct 9 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cagcaacatt ataggactcc tccgacg 27 <210> 13 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Ser Thr Leu His 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser 100 105 110 Gln Gly Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Thr 115 120 125 Ser <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Phe Asn 20 25 30 Tyr Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Val Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 85 90 95 Arg Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 388 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacgttcagt acctatgcca tgcactgggt ccgtcaggct 120 ccaggcaggg ggctggagtg ggtggcagtt atctcatacg atggaaatta taaatactat 180 gcagactctg tgaagggccg attctccatc tccagagaca attccaacag cacgctgcat 240 ctagaaatga acaccctgag aactgaggac acggctttat attactgtgc gaaagactcc 300 caactgcgat cactcctcta ttttgaatgg ttatcccagg gatattttga cccctggggc 360 cagggaaccc ttgtcaccgt cacctcag 388 <210> 16 <211> 334 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gacatccaga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtat ctctgggcgc gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtcacc ttcaactata agaactactt agcttggtac 120 cagcagaaac caggacagcc tcctaaagtg ctcatttact gggcatctgc ccgggaatca 180 ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 agcctgcagg ctgaagatgt ggctgtttat tactgtcagc aacattatag gactcctccg 300 acgttcggcc aagggaccaa ggtggagatc aaac 334 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 19 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Lys Glu Arg Pro Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asn Asp Tyr 20 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Trp Ala Ser 1 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser 1 5 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggattcacct tcagtaacta tggc 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atatcatatg atggatctaa taag 24 <210> 25 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gcgaaagaga gaccccttcg cctattacga tattttgact ggttatcggg gggggcgaat 60 gactac 66 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 cagagtgttt tatacagctc caacaataag aactac 36 <210> 27 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tgggcatct 9 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cagcagtatt atagaagtcc gtcc 24 <210> 29 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Pro Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser 100 105 110 Gly Gly Ala Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asp Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Asn Leu Gln Val Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Arg Ser Pro Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 388 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gcggtccagc ctggggagtc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtc atatcatatg atggatctaa taagtactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gaaagagaga 300 ccccttcgcc tattacgata ttttgactgg ttatcggggg gggcgaatga ctactggggc 360 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 388 <210> 32 <211> 337 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagttgctca ttgactgggc atctacccgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcaatc tgcaggttga agatgtggcc gtttattact gtcagcagta ttatagaagt 300 ccgtcctttg gccaggggac caagctggag atcaaac 337 <210> 33 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Tyr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Asn Asn Thr Leu His 65 70 75 80 Leu Glu Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ser Gln Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Trp Leu Ser 100 105 110 Gln Gly Tyr Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Thr 115 120 125 Ser <210> 34 <211> 388 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt cacgttcagt acctatgcca tgcactgggt ccgtcaggct 120 ccaggcaggg ggctggagtg ggtggcagtt atctcatacg atggaaatta taaatactat 180 gcagactctg tgaagggccg attctccatc tccagagaca attccaacaa cacgctgcat 240 ctagaaatga acaccctgag aactgaggac acggctttat attactgtgc gaaagactcc 300 caactgcgat cactcctcta ttttgaatgg ttatcccagg gatattttga cccctggggc 360 cagggaaccc tggtcaccgt cacctcag 388 <210> 35 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Arg Pro Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ser 100 105 110 Gly Gly Ala Asn Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser <210> 36 <211> 388 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gcggtccagc ctggggagtc cctgaaactc 60 ccctgtgcag cctctggatt caccttcagt aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg gactggagtg ggtggcagtc atatcatatg atggatctaa taagtactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctctgt tttactgtgc gaaagagaga 300 ccccttcgcc tattacgata ttttgactgg ttatcggggg gggcgaatga ctactggggc 360 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 388 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Phe Gly Ala Ile Ala Gly 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 1 5 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro 1 5 10

Claims

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하기를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(ⅰ) SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; SEQ ID NO: 2 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; 또는
(ⅱ) SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 SEQ ID NO: 6 의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
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SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 33 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형을 중화시키는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
삭제
제 5 항 또는 제 8 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 7-12, 15, 16 또는 34 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하고, 상기 항체는 인플루엔자 A 바이러스의 1그룹 아형 및 2그룹 아형을 중화시키는, 핵산 분자.
제 5 항 또는 제 8 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 세포.
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제 5 항 또는 제 8 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 약제학적 조성물.
제 5 항 또는 제 8 항에 있어서, (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
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제 10 항의 핵산 분자, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 약제학적 조성물.
제 11 항의 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 포함하는 (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서, (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, (ⅰ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 치료용 의약의 제조에서 사용하기 위한, (ⅱ) 백신에서 사용하기 위한, (ⅲ) 인플루엔자 A 바이러스 감염의 진단에서 사용하기 위한, 또는 (ⅳ) 백신의 항원이 정확한 형태로 특이적 에피토프를 함유하는지를 조사하여 항-인플루엔자 A 바이러스 백신의 질을 모니터하기 위한, 세포.
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