KR101749316B1

KR101749316B1 - Ｈ１ｎ１―감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체 및 이를 포함하는 바이러스의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101749316B1
Application number: KR1020147019693A
Authority: KR
Inventors: 김호언; 배소현; 이은숙
Original assignee: (주) 에이프로젠
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2017-06-21
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: KR20140116416A; WO2013089496A1

Abstract

본 발명은 H1N1-감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체 및 이를 포함하는 바이러스의 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는 단일클론 항체 및 상기 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

Description

H1N1-감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체 및 이를 포함하는 바이러스의 치료용 조성물{A Highly Potent Broad-Spectrum Neutralizing Monoclonal Antibody Derived From H1N1-Infected Patients and Method Of Treatment of Virus By Using Thereof}

본 발명은 H1N1-감염된 환자들로부터 유도된 매우 잠재력 있는 넓은-스펙트럼 중화 단일클론 항체에 관한 것이다.

본 발명은 상기 단일클론 항체를 포함하는 항바이러스용 치료제 조성물에 대한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 단백질들의 구성에 따라 A, B, C형으로 구분된다.

이중 A형과 B형이 사람에게 감영가능하다. A형은 B형과 C형에 비해 변이속도가 매우 빠르다. A형은 주로 야생물새에서 나타나던 것들로 때때로 가금류(닭 등)나 사람에게까지 퍼지기도 한다. 인플루엔자 바이러스는 엔벨롭(껍데기) 지질층에 헤마글루티닌(H: Haemagglutinin)과 뉴라미니다아제(N; neuraminidase)를 가지고 있다. 여러 가지 변종들이 존재하는데 이러한 변종의 종류에 따라 (H1, H2, H3, ... 그리고 N1, N2, N3, ...) 이름을 짖는다. 그 대표적인 예로는 돼지독감 혹은 신종플루로 알려진 H1N1이 있고, 그 외 H5N1, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7 등이 있다.

H1N1는 스페인 독감이라고 부르는 유행성 돌감을 일으켰고, 1918년에서 1919년에는 5000만명에서 1억명의 사망자를 기록했다. 저병원성의 H1N1은 현재 세계에 널리 분포되어 있으며, 2006년에는 인간에의 감염의 거의 반을 차지하고 있다.

인플루엔자 A 바이러스 서브타입 H5NA(influenza A virus subtype H5N1)은 인플루엔자 A의 아형으로, 고병원성 조류 독감을 일으킨다. 사람을 비롯한 다른 동물들에게도 전염을 일으킬 수 있으며, 현재 백신이 개발되지 않은 상태로, 타미플루와 릴렌자 등의 치료제가 이용되고 있다.

중화항체(neutralizing antibody)는 생물학적 활성을 억제 또는 중화하여 항원 또는 감염개체로부터 세포를 보호하는 항체이다.

감염에 의하거나 환경에 자연스럽게 노출시 사람에 있어서 면역 반응을 나타내지 않는 에피토프를 포함하는 HN 단백질 서열을 사용하여 사람이 아닌 포유동물에서 항체를 생산하여, HN 감염성을 중화시키고, 감염된 CD4 림프구를 쉽게 죽이고, HN의 생활 주기에서 필수적인 단계를 불활성화시키는데 투여될 수 있다.

'중화 부위'라는 용어는 본 발명의 다른 항체와 결합하거나 개별적으로 HN 감염을 중화시킬 수 있는 항체와 반응적인 하나 이상의 에피토프를 정의하는 아미노산 세그먼트를 포함하는 HN, 특히 HN 단백질의 그러한 부분을 말한다. 중화를 조사하기 위한 적합한 분석이 또한 공지되어 있고, T-세포계 내에서 HN 감염의 감소, 합포체 저해 시험 및 비리온-수용체 결합 시험을 측정하는 분석을 포함할 수 있다. '불활성 부위'라는 용어는 항체와 조합하거나 또는 개별적으로 반응시, HN 생활 주기에서 중요한 사건을 기능적으로 불활성화시키는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 HN 단백질의 세그먼트를 말한다. 항체-매개된 HN 감염된 림프구의 파괴율을 조사하는 적합한 분석법이 공지되어 있고, 항체 의존성 세포 매개된 세포독성, 보체 매개된 용해 및 천연 킬러(NK) 분석을 포함할 수 있다. HN 생활 주기의 필수 단계의 항체-매개된 불활성화을 측정하기 위한 적합한 분석은, 역전사효소의 불활성화를 결정하거나 중합효소 및 프로테아제 활성을 측정하거나, 또는 바이러스 RNA를 리보뉴클리아제 분해에 노출하여 핵 캡시드 침투성에서 항체 매개된 보체 의존성 변화를 평가하는 분석을 포함한다. 필요시, 면역형광법, 면역블롯, 효소-결합 면역분석 및 방사성면역분석과 같은 면역화학 분석법에서, 중화 활성은 항체 활성과 비교할 수 있다.

본 발명자들은 H1N1-감염된 환자에서 분리된 단일 클론 항체가 매우 높고, 넓은 중화 능력을 가지고 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 넓은 범위에 걸쳐서 중화작용을 나타내는 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 넓은 범위에 걸쳐서 중화작용을 나타내는 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 목적으로 한다.

상기한 목적을 위하여 본 발명의 제 1 의 형태는 헤비체인 가변부에 서열번호 1 를 포함하는 항체이다.

항체의 구조기본 구조는 Y자형의 단백질이며, Y자의 위쪽 두 가지에 항원과 결합할 수 있는 특이적 구조를 가지고 있다. 이러한 특이적 구조는 면역 세포에서 일어나는 DNA 수준에서의 유전자 재배열에 의해 상상할 수 없을 정도로 많은 가짓수를 가질 수 있으므로, 다양한 항원에 대응할 수 있다. 항체의 기본 단위는 각각 라이트 체인 2개와 헤비체인 2개가 이황화 결합을 하여 이루어진 Y자 모양을 한 단량체 분자이며 단량체가 1- 5개까지 모여 하나의 항체를 구성한다. 헤비체인은 5가지(γ, δ, α, μ, ε) 종류가 있으며 헤비체인이 항체의 종류를 결정짓는다. α와 γ는 450개, μ 와 ε는 550개의 아미노산으로 구성되어 있다. 헤비체인에는 두 영역 즉 가변 영역 및 불변영역이 있다. 가변 영역은 항체가 만들어지는 B세포(형질 세포)에 따라 달라지며 같은 세포에서 만들어지는 항체의 가변영역은 모두 동일하다. 그 1차 구조는 동일 개체에서도 무수히 달라 항체분자의 항원 결합부위를 형성하고 있다 불변 영역은 항체의 종류가 같을 때만 동일하다. γ, α, δ 는 3개의 불변 영역이 있고 구부러지는 영역을 가지고 있지만 μ, ε는 4개의 불변 영역을 가지고 있다. 모든 헤비체인의 가변 영역은 한 군데만 있으며 110개 정도의 아미노산으로 구성되어 있다. 가변 영역은 아미노산으로 서로 연결된다. 라이트 체인은 λ, κ 2가지 종류가 있으며 대략 211-217개의 아미노산으로 구성되어 있다. 라이트체인은 불변 영역과 가변 영역이 연속적으로 이루어져 있다.

Y모양의 항체 단량체는 2개의 헤비체인과 2개의 라이트 체인이 모여 이루어져 있으며 6-8개의 불변 영역과 4개의 가변 영역을 가진다. 항체의 갈라진 부분(Y의 가지부분)을 Fab조각(Fab(fragment antigen binding) fragments)이라고 하는데 불변 영역과 가변 영역 각각 1개씩을 가지며 N-말단이 항원에 결합한다. 2개의 가변 영역이 특정한 항원에 결합하는 부위이다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 요지를 이용하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 일부 결실, 부가 또는 치환하여도 본 발명의 요지를 달성할 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있다. 따라서 본 발명의 권리범위는 상기 서열번호 1의 아미노산이 본 발명의 목적을 달성하는 범위내에서 일부 치환, 부가 또는 결실된 아미노산 서열도 포함한다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 항체의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명의 제 2 의 형태는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화 하는 헥산 서열이다. 유전코드의 퇴화 때문에 매우 다양한 형태의 헥산서열이라도 서열번호 1의 아미노산 서열을 동일하게 암호화 할 수 있다. 본 발명의 권리범위는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 모든 헥산서열을 포함한다.

본 발명의 제 3 의 형태는 서열번호 1을 암호화하는 헥산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.

본 발명에서 사용되는 벡터라는 용어는 또다른 핵산을 그것에 결합시켜 이송시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현벡터란 용어는 상기 벡터에 의해 운반되는 각 재조합형 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 합성시킬 수 있는 플라스미드, 코스미드 또는 파아지를 포함한다. 바람직한 벡터는 그것이 결합된 핵산을 자기 복제 및 발현시킬 수 있는 벡터이다.

본 발명의 제 4 의 형태는 서열번호 1을 암호화하는 헥산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포이다. 본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.

본 발명의 제 5 의 형태는 헤비체인 가변부에 서열번호 2 를 포함하는 항체이다.

본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 요지를 이용하여 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 일부 결실, 부가 또는 치환하여도 본 발명의 요지를 달성할 수 있다는 것을 용이하게 알 수 있다. 따라서 본 발명의 권리범위는 상기 서열번호 2의 아미노산이 본 발명의 목적을 달성하는 범위내에서 일부 치환, 부가 또는 결실된 아미노산 서열도 포함한다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 항체의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다.

본 발명의 제 6 의 형태는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화 하는 헥산 서열이다. 유전코드의 퇴화 때문에 매우 다양한 형태의 헥산서열이라도 서열번호 2의 아미노산 서열을 동일하게 암호화 할 수 있다. 본 발명의 권리범위는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 모든 헥산서열을 포함한다.

본 발명의 제 7 의 형태는 서열번호 2을 암호화하는 헥산 서열을 포함하는 재조합 벡터이다.

본 발명의 제 8 의 형태는 서열번호 2을 암호화하는 헥산 서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포이다. 본 발명에서 사용되는 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA 또는 RNA가 세포에 흡수되어 세포의 유전형이 변화되는 것을 말한다. 적합한 형질전환세포로는 원핵생물, 곰팡이, 식물, 동물세포 등이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 대장균을 이용한다.

본 발명의 제 9 의 형태는 헤비체인 가변부에 서열번호 1 를 포함하고, 라이트체인 가변부에 서열번호 2를 포함하는 항체이다.

본 발명의 제 10 의 형태는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2, 및 서열번호 1 및 2 모두를 포함하는 항체를 포함하는 바이러스 중화용 약학적 조성물이다. 상기 바이러스는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 바람직하게는, 상기 바이러스는 H1, H2, H5, H9의 헤마글루티닌을 가지는 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 상기 바이러스는 H1N1 인플루엔자 바이러스 또는 H5N1 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여하고자 하는 경로에 적합하게 고체, 액체 또는 에어로졸의 형태로 제형화할 수 있다. 고체 조성물의 예는 정제, 크림 및 주입식 투여량 유닛(implantable dosage units)을 포함한다. 정제는 경구 투여할 수 있다. 치료용 크림은 국소적으로 사용될 수 있다. 주입식 투여량 유닛(Implantable dosage units)은 예를 들어 특정 부위에 국부적으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 피하로 본 발명의 약학적 조성물이 조직적으로 배출되도록 이식할 수 있다. 액체 조성물의 예는 피하주사, 정맥주사, 동맥 내, 국부적이고 안구 내 투여를 위한 제형을 포함한다. 에어로졸 조성물의 예는 폐를 통한 투여를 위해 흡입식 제형을 포함한다.

상기 조성물은 스탠다드 루트(Standard routes)로 투여할 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 국소적, 경구적, 직장, 질 내, 비강 또는 비경구적인 경로로 투여할 수 있다(예를 들어, 정맥, 피하, 근육 내). 이에 더하여, 상기 조성물은 생분해 폴리머, 예를 들어 타겟 사이트에 이식되는 폴리머와 같은 지속적인 배출 매트릭스를 포함할 수 있다. 또한 생분해될 수 있는 폴리머 및 다른 폴리머를 조직적인 전달(systemic delivery)이 가능하도록 이식할 수 있다. 투여방법은 단일의 복용량 투여, 미리 정해진 시간 간격으로 반복적인 복용량 투여 및 미리 정해진 시간 간격으로 지속적인 투여를 하는 방법을 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같이, 지속적인 배출 매트릭스는 물질로 만들어진 매트릭스, 주로 효소적 또는 산염기 가수분해 또는 용해에 의해 분해가능한 폴리머이다. 인체에 삽입되면, 매트릭스는 효소 및 체액에 의해 활성화된다. 바람직하게는 지속적인 배출 매트릭스는 리포솜(liposomes), 폴리락타이드산(polylactide acid), 폴리글리코라이드(글리콜산의 폴리머, polymer of glycolic acid), 폴리락타이드 코-글리코라이드 (젖산과 글리콜산의 코폴리머들, copolymers of lactic acid and glycolic acid), 폴리앤하이드라이드(polyanhydrides), 폴리오르토에스터(poly(ortho)esters), 폴리펩타이드(polypeptides), 하이얼루로닉 산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 콘드리친 황산염(chondroitin sulfate), 카르복시산(carboxylic acids), 지방산(fatty acids), 인지질(phospholipids), 폴리사카라이드(polysaccharides), 핵산(nucleic acids), 폴리아미노산(polyamino acids), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine), 이소류신(isoleucine)과 같은 아미노산들, 폴리뉴클레오타이드(polynucleotides), 포리비닐프로필렌(polyvinyl propylene), 폴리비닐피로딘(polyvinylpyrrolidone) 및 실리콘(silicone)과 같은 생체 적합성이 있는 물질을 선택할 수 있다. 바람직한 생분해 매트릭스는 폴리락타이드, 폴리글리코라이드 또는 폴리락타이드 코-글리코라이드(co-polymers of lactic acid and glycolic acid) 중 어느 하나이다.

상기 조성물의 정량은 치료 상황, 특별한 조성물 사용 및 체중 및 환자의 상태와 같은 기타 임상적인 요소, 투여 형태에 의해 좌우된다. 상기 조성물은 질병의 치료 과정 및 다른 조성물과 함께 결합하여 투여할 수 있다.

투여 경로의 예로는 정맥내, 혈액내, 피하, 흡입, 국부, 점막 및 직장 같은 비경구 투여 또는 경구 투여가 있다. 혈액 또는 피하 투여와 같은 경구 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 주사용 용매, 염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그 밖의 합성 용매와 같은 무균 희석제, 벤진 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 증장성 조절제가 포함될 수 있다. 좌제의 제조에 적합한 담체는 천연 및 경화 오일, 왁스, 지방, 반-액체 폴리올 등이다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알로 밀봉될 수 있다. 주사용으로 적합한 질환 치료제는 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 주사액 또는 분산액의 즉석 제제용 무균 분말을 포함한다. 정맥 내 투여용으로 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, CremophorELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에 있어서, 질환 치료제는 살균되어야하고, 용이하게 주사될 수 있는 정도의 유체여야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 있어서 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌글리콜및 액체 폴리레틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분사 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 부산액의 경우에 요구되는 입도를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항세균제 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가 알코올, 염화나트륨과 같은 등장제가 질환 치료제 중에 포함되는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 흡수연장은 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 질환 치료제에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

무균 주사액은 적합한 용매 중에서 상기 기재된 하나 또는 조합된 성분에 필요 활성 성분을 혼입하고, 필요에 따라 여과 살균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유할 수 있는 무균 비히클을 혼입하여 제조할 수 있다. 무균 주사액을 제조하기 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이들 방법에 의해 활성성분과 이전에 살균된 여과 용액으로부터 바람직한 성분의 분말을 얻을 수 있다. 주사 액제의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일 등이 있다.

경구용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료적 투여를 위해, 활성성분은 부형제에 혼입되어 정제, 트로우키(troches), 또는 젤라틴 형태의 캡슐로 사용된다. 또한 경구용은 구강 세척액으로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 대한 적합한 담체의 예로는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형 및 액체 폴리올등이 있다. 액제 및 시럽의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 폴리올, 사카로즈, 전화당, 글루코스 등이 있다.

약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 첨가제가 질환 치료제의 일부로 포함될 수 있다. 약학 제제는 또한 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 코팅제 또는 산화 방지제를 함유할 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로우키 등은 하기의 성분의 어느 하나 또는 유사한 특성의 혼합물을 함유할 수 있다: 미정질 셀루로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, Primogel TM 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 Sterotes TM와 같은 윤활제; 콜로이드 상태의 이산화규소와 같은 길던트(gildant); 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향과 같은 향미제. 경구 또는 비경구용 질환 치료제는 용량의 투여 밑 균일성을 용이하게 하기 위하여 용량 단위형으로 제형하는 것이 유리하다. 상기 miRNA들은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 약제로서 제형화시킬 수 있다. 락토오즈, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 그의 염을 예를들어, 정제 및 경질 젤라틴 캡슐에 대한 담체로 사용할 수 있다.

바이러스 치료 또는 예방을 위한 투여량은 광범위하게 변화시킬 수 있으며, 물론, 각각의 특별한 경우에 개별적인 필요 조건에 따라 조절할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명에 따른 항체는 H1, H2, H5 및 H9의 헤마글루티닌을 포함하는 인플루엔자 바이러스 모두에 넓은 스펙트럼으로 중화시킬 수 있다.

(ii) 본 발명에 따른 항체는 항원에 대한 결합 친화력이 우수하다.

도 1은 본 발명에 따른 항체 4D9의 헤비체인과 라이트 체인에서의 가변 도메인들의 아미노산 서열을 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 항체 4D9와 F10과의 ELISA를 통한 항원 결합 친화력을 비교한 도표를 보여준다. 여기에서 본 발명에 따른 항체 4D9는 F10 보다 더 높은 친화력으로 H1, H2, H5 그리고 H9에 결합한다는 것을 보여준다(nAb 농도. ~ 100ng/ml)
도 3은 유세포 분석기를 통해서 본발명에 따른 항체 4D9의 항원 결합 스펙트럼를 보여준다. 항체 F10과 유사하게 본발명에 따른 항체 4D9 d H3과 H7을 제외하고 H1, H2, H5 그리고 H9가 결합하는 것을 보여준다. (레미케이드: 음성 대조군)
도 4은 항체 F10과 본 발명에 따른 항체 4D9 사이 경쟁적 ELISA를 보여준다. 이것은 두 개의 항체가 동일한 항원 결정 부위를 공유한다는 것을 나타낸다.
도 5은 본 발명에 따른 항체 4D9가 H5-매개 세포 융합을 억제한다는 것을 보여준다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 본 발명의 실질적이고 바람직한 실시예를 하기에 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니므로 본 발명의 기술분야에서 발명의 목적과 범위 내에서 개량 또는 변형이 가능할 것이다.

< 실시예 1> 항체 4 D9 의 헤비체인과 라이트 체인에서의 가변 도메인

도 1은 본 발명에 따른 항체 4D9의 헤비체인과 라이트 체인에서의 가변 도메인들의 아미노산 서열을 보여준다. 항체 4D9은 회복기에 있는 H1N1 influenza 환자의 혈액으로부터 제조한 immune library로부터 확보하였다. 이를 위해 library를 display하는 phage를 제조하기 위하여 library cell stock 1 ml을 500 ml 2xYT+2% glucose, 100 ug/ml ampicillin, 5mM MgCl₂ 배지에 접종하여 37℃, 200 rpm에서 OD600=0.5까지 키웠다. bacteria : helper phage = 1 : 20이 되도록 helper phage를 접종하여 37 ℃에서 30분간 standing한 후 200rpm, 30분간 shaking하였다. 배양액을 6000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 얻은 cell pellets을 2L 2xYT+70 ug/ml kanamycin, 100 ug/ml ampicillin, 5mM MgCl₂ 배지에 재부유하여 220 rpm, 30℃ 에서 overnight 배양하였다. 다음날 배양액을 3000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 상등액만을 취하여 PEG 8000 4%, NaCl 3%를 첨가한 후 완전히 녹였다. 이것을 ice에서 1시간 이상 방치한 후 8000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 상등액을 제거했다. pellets을 10분간 말린 후 1x PBS에 resuspension하였다. 1.5 ml tube에 옮긴 후 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상등액만을 취하여 500 ul씩 분주하여 -70 ℃에 보관하였다. phage의 titration을 위하여 ER2738 cell을 OD 0.5~0.7로 키운다. phage 용액을 1/100로 serial dilution 하여 100 ul의 ER2738 cell에 10 ul 씩 넣는다. 이것을 37 ℃에서 15분간 배양한 후 2xYT+ampicillin plate에 깔아준 후 37℃ 에서 overnight 배양한다. 이 과정을 아래의 panning과정과 짝을 이루어 반복하였는데, 각 panning이 끝난 후 나오는 cell stock을 이용하여 antibody를 display하는 phage를 준비하였다. ER2738 cell을 25 ml 2xYT 배지에 접종하여 220 rpm, 37℃에서 OD가 약 0.5가 될 때까지 키운다. Panning을 수행하기 전날 immunosorb tube 2개는 5 ug/ml antigen(정제한 H5N1-HA VN04)으로, immunosorb tube 1개는 5 ug/ml BSA로 코팅하였다(4 , overnight). 코팅 용액을 버린 후 PBS에 희석한 4% skim milk로 37 , 2시간 blocking하였다. antigen으로 코팅한 tube 중 한 tube의 blocking 용액을 버린 후 PBS에 희석한 4% skim milk 1 ml 과 library phage 용액 1 ml을 섞어 넣어 준 후 37℃ 에서 30분간 pre-incubation 하였다. antigen과 BSA가 코팅된 tube의 코팅 용액을 버리고 pre-incubation 한 샘플을 각각 1 ml씩 넣고 상온에서 2시간 incubation하였다. 2 ml 1xPBST로 2분간 5회 wash 한 후 마지막에 1xPBS로 2회 washing 하였다. 1 ml의 elution buffer(0.1M HCl-glycine, pH2.2)를 첨가하여 상온에서 10분간 반응하고 500 ul의 neutralizing buffer(2M Tris)를 첨가하여 5분간 반응하였다. 위에서 키운 ER2738 cell 10 ml에 1.5 ml의 pgage 용액을 첨가하여 37℃ 에서 30분간 배양하였다. titration을 위해 200 ul를 남겨둔 후 나머지는 3000 rpm에서 8분간 원심 분리하였다. pellet을 2xYT+glucose 배지에 resuspension하고 SOBAG plate에 깔아준 후 37 ℃에서 overnight 배양하였다. 다음 날 SOBAG plate에서 자란 colony를 2xYT+ampicillin +glucose 배지를 이용하여 회수하고 15% glycerol stock을 만들어 500 ul씩 분주하여 -70℃ 에 보관하였다. titration을 위해 남겨둔 200 ul의 배양액 중 50 ul를 취해서 2xYT에 ampicillin (100 /ml)을 첨가한 plate에서 24시간 배양하였다. 또 배양액 중 10 ul를 취해서 1/100 희석하고 그 중 100 ul를 취해 2xYT에 ampicillin (100 /ml)을 첨가한 plate에서 24시간 배양하였다. 이것을 37℃ 에서 overnight 배양하였다. 이 과정을 반복하여 3차 까지 진행하였는데 각 차시마다 wash 조건을 강화하여 수행하였다. Deep plate에 2xYT +ampicillin +glucose 배지를 200 ul/well로 넣고 여기에 plate당 96개 colony를 접종 후 37℃, 600 rpm에서 6시간 배양하였다. 이때 수증기에 의한 교차오염을 방지하기 위하여 뚜껑에 핸드 타올을 멸균하여 올려놓았다. 배양이 끝나면 배양액 중 20 ul를 2xYT +ampicillin 배지 180 ul/well가 들어있는 새로운 deep plate에 접종하여 37℃, 600 rpm에서 1시간 동안 배양하였다. 접종하고 남은 plate는 15% glycerol을 첨가하여 -70 ℃에 보관하고 master plate로 사용하였다. 3 ul/well의 helper phage를 첨가하고 37℃ 에서 30분간 정치한 후 600 rpm에서 30분간 배양하였다. 배양이 끝나면 2 ul/well의 kanamycin을 첨가한 후 30℃ 에서 overnight 배양하였다. 다음 날 plate를 2000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 150 ul씩 취하여 먼저 4% skim milk 150 ul가 담겨있는 plate에 넣어 섞은 후 상온에서 30분간 반응하여 ELISA에 사용하였다. 하루 전에 ELISA plate에 antigen(정제한 H5N1-HA VN04)과 BSA를 200 ng/well로 코팅하였다(4 , overnight). 다음 날 코팅용액을 버린 후 PBS에 희석한 4% skim milk로 37℃ 에서 2시간동안 반응하였다. TBST로 3회 세척한 후 위에서 준비한 phage+skim milk 용액을 100 ul/well로 넣은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다. 다시 TBST로 3회 세척한 후 anti-M13-HRP를 TBST에 1:1000으로 희석하여 100 ul/well로 넣은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다. TBST로 3회 세척한 후 OPD로 develop하고 1M H₂SO₄ 50 ul로 반응을 중지시켰다.ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 값이 가장 높은 4D9 clone의 DNA sequencing 통하여 항체의 가변서열을 확보하였다.

< 실시예 2> 항체 4 D9 와 F10과의 ELISA 를 통한 항원 결합 친화력을 비교

도 2는 본 발명에 따른 항체 4D9와 F10과의 ELISA를 통한 항원 결합 친화력을 비교한 도표를 보여준다. 여기에서 본 발명에 따른 항체 4D9는 F10 보다 더 높은 친화력으로 H1, H2, H5 그리고 H9에 결합한다는 것을 보여준다(nAb 농도. ~ 100ng/ml). 본 실험을 위해 ELISA plate에 HA를 100 ng/ml의 농도로 코팅하였다(4 , overnight). 다음날 0.05% TBST로 3회 세척한 후 PBS에 희석한 20 % BSA를 200 ul/well로 처리하여 상온에서 1시간 반응하였다. TBST로 3회 세척한 후 100 ng/ml농도의 정제한 4D9과 F10을 100 ul/well 처리하고 상온에서 1시간 반응하였다. 다시 TBST로 3회 세척한 후 detection antibody인 goat anti-human IgG Fc-HRP를 TBST에 1:1000으로 희석하여 100 ul/well로 처리하고 상온에서 1시간 반응하였다. TBST로 3회 세척한 후 TMB로 develop하고 1M H₂SO₄ 50 ul로 반응을 중지시켰다. ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. F10과 비교하여 4D9이 HA1, HA2 그리고 HA5 에서 더 높은 binding affinity를 보였다.

< 실시예 3> 본발명에 따른 항체 4 D9 의 항원 결합 스펙트럼

도 3은 유세포 분석기를 통해서 본발명에 따른 항체 4D9의 항원 결합 스펙트럼를 보여준다. 항체 F10과 유사하게 본발명에 따른 항체 4D9 d H3과 H7을 제외하고 H1, H2, H5 그리고 H9가 결합하는 것을 보여준다. (레미케이드: 음성 대조군)

본 실험을 위해 4D9이 cell에 bound되어 있는 HA에는 어떻게 binding하는지 알아보기 위해 pJK2b-HA를 293T cell에 transfection 하였다. 먼저 293T cell을 6 well plate에 접종하고 2일간 10% FBS가 포함된 DMEM을 이용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. cell이 plate의 80%이상 차면 pJK2b-HA 4과 Lipofectamin 2000(invitrogen사, cat#11668) 10를 각각 Opti-MEM I (invitrogen 사, cat#31985) 250에 희석하고 거품이 생기지 않도록 발현벡터와 Lipofectamine 2000을 섞어 혼합물을 상온에서 15분간 정치하였다. 5시간동안 배양한 후 DMEM + 10% FBS 배지로 교체하여 3일간 배양하였다. 배양 후 cell을 0.25% trypsin (invitrogen사, Cat#15050,)을 이용하여 떼어내고 세포수를 측정하여 5 x 10⁶ cells 가 되도록 PBS에 현탁하였다. 200ul의 cell 현탁액을 각각의 tube로 옮기고 4D9과 F10을 10 ug/ml 농도로 처리하였다. rotator를 이용하여 섞어주면서 상온에서 1시간 반응하였다. 3000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 PBS에 1:500으로 희석한 fluorochrome-labled goat anti-human IgM 용액에 현탁하였다. 음성대조군으로 Remicade도 함께 실험하였다. rotator를 이용하여 섞어주면서 상온에서 1시간 반응한 후 3000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 PBS에 현탁하고 GuavaPC96을 이용하여 분석하였다. FACS 분석 결과 ELISA를 통한 binding affinity test와 유사한 결과를 얻었다.

< 실시예 4> 항체 F10과 본 발명에 따른 항체 4 D9 사이 경쟁적 ELISA

도 4은 항체 F10과 본 발명에 따른 항체 4D9 사이 경쟁적 ELISA를 보여준다. 본 실험에서는 4D9와 F10이 서로 같은 epitope에 binding하는지 확인하기 위하여 compitition ELISA를 수행하였다. 우선 pKB-FabD-4D9, pKB-FabD-F10 plasmid를 가진 ER2738에 M13 helper phage를 감염하여 4D9과 F10을 display 하는 phage를 만들었다. ELISA plate에 HA1과 HA5를 200 ng/well로 코팅하여 4 , overnight 반응하였다. 다음 날 코팅용액을 버린 후 PBS에 희석한 4% skim milk로 37℃ 에서 2시간동안 blocking하였다. TBST로 3회 세척한 후 미리 준비한 phage 용액에 정제한 4D9과 F10을 5 ug/ml 농도로 혼합하였다. 용액을 100 ul/well로 넣은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다. 다시 TBST로 3회 세척한 후 anti-M13-HRP를 TBST에 1:1000으로 희석하여 100 ul/well로 넣은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다. TBST로 3회 세척한 후 TMB로 develop하고 1M H₂SO₄ 50 ul로 반응을 중지시켰다. LEISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과는 두 개의 항체 4D9과 F10이 동일한 항원 결정 부위를 공유한다는 것을 나타낸다.

< 실시예 5> 항체 4 D9 가 H5 -매개 세포 융합을 억제

도 5은 본 발명에 따른 항체 4D9가 H5-매개 세포 융합을 억제한다는 것을 보여준다. 여기서는 4D9이 HA에 의한 cell fusion을 얼마나 inhibition 하는지 알아보기 위해 cell fusion inhibition assay를 수행하였다. 먼저 HeLa cell을 6 well plate에 well 당 3x10⁵으로접종하고 2일간 10% FBS가 포함된 DMEM을 이용하여 37℃ , 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. cell이 plate의 95%이상 차면 cell을 PBS를 이용하여 2회 wash하고 pJK2b-HA5와 Lipofectamin 2000(invitrogen 사, cat#11668) 10를 각각 Opti-MEM I (invitrogen 사, cat#31985) 250에 희석하고 거품이 생기지 않도록 발현벡터와 Lipofectamine 2000을 섞어 혼합물을 상온에서 15분간 정치하였다. 5시간동안 배양한 후 DMEM + 10% FBS 배지로 교체하여 2일간 배양하였다. 배양 후 4D9이 함유된 serum-free DMEM 배지로 교체하여 1시간 반응하였다. PBS로 세척한 후 0.1M citric acid가 함유된 pH4.8의 산성배지를 15분간 처리하였고 다시 PBS로 세척한 후 DMEM+10%FBS 배지로 교체하여 3시간 배양하였다. 배양 후 현미경으로 fusion 양상을 관찰하였다. HeLa cell에 HA5 transfection 후 산성배지를 처리하니 plate 전체에서 cell fusion이 관찰되었으며 4D9을 처리한 경우에서는 50-60%의 inhibition을 보였다.

<110> Aprogen Inc. <120> A highly potent broad-spectrum neutralizing monoclonal antibody derived from H1N1-infected patents and the composition for treatment of virus disease comprising thereof <130> PP120005 <150> US 61/576149 <151> 2011-12-15 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> human <400> 1 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Ala Ser Ile Asn Thr Asp 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Thr Gly Ile Ser Arg Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> human <400> 2 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims

헤비체인 가변부에 서열번호 1 및 라이트체인 가변부에 서열번호 2를 포함하는 항체.
제 1 항의 항체를 암호화 하는 유전자.
제 2 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 3 항에 따른 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주세포.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 따른 항체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 중화용 약학적 조성물.
삭제
제 10 항에 있어서, 상기 바이러스는 H1, H2, H5, H9의 헤마글루티닌을 가지는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 바이러스 중화용 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 바이러스는 H1N1 인플루엔자 바이러스 인 것을 특징으로 하는 바이러스 중화용 약학적 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 바이러스는 H5N1 인플루엔자 바이러스 인 것을 특징으로 하는 바이러스 중화용 약학적 조성물.