[go: up one dir, main page]

ME02816B - Koagonisti receptora za glukagon/glp-1 receptora - Google Patents

Koagonisti receptora za glukagon/glp-1 receptora

Info

Publication number
ME02816B
ME02816B MEP-2017-169A MEP2017169A ME02816B ME 02816 B ME02816 B ME 02816B ME P2017169 A MEP2017169 A ME P2017169A ME 02816 B ME02816 B ME 02816B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
amino acid
peptide
glucagon
receptor
acid
Prior art date
Application number
MEP-2017-169A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Richard D Dimarchi
David L Smiley
Original Assignee
Univ Indiana Res & Tech Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Indiana Res & Tech Corp filed Critical Univ Indiana Res & Tech Corp
Publication of ME02816B publication Critical patent/ME02816B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/605—Glucagons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNA VEZA SA SRODNIM PRIJAVAMA
Ova prijava ima prioritet SAD privremene prijave br. 61/500,027, koja je podneta 22.06.2012., i SAD privremene prijave br. 61/547,360, koja je podneta 14.10.2012.
OSNOVA PRONALASKA
Pre-proglukagon je prekursorski polipeptid od 158 aminokiselina koji se obrađuje u različitim tkivima tako da formira određeni broj različitih peptida poreklom od proglukagona, uključujući glukagon, glukagonu-sličan peptid-1 (GLP-1), glukagonu-sličan peptid-2 (GLP-2) i oksintomodulin (OXM), koji su uključeni u široki niz različitih fizoloških funkcija, uključujući homeostazu glukoze, izlučivanje insulina, pražnjenje želudca, i rast creva, kao i regulaciju unosa hrane. Glukagon je peptid od 29 aminokiselina koji odgovara aminokiselinama 33 do 61 pre-proglukagona, dok se GLP-1 proizvodi kao peptid od 37 aminokiselina koji odgovara aminokiselinama 72 do 108 pre-proglukagona. GLP-1(7-36) amid ili GLP-1(7-37) kiselina su biološki potentni oblici GLP-1, koji pokazuju uglavnom ekvivalentnu aktivnost na GLP-1 receptoru.
U toku hipoglikemije, kada nivoi glukoze u krvi padnu ispod normalnih, glukagon šalje signal jetri da razlaže glikogen i oslobađa glukozu, izazivajući porast nivoa glukoze u krvi ka normalnom nivou. Hipoglikemija je uobičajeni sporedni efekat terapije insulinom kod pacijenata sa hiperglikemijom (povišeni nivoi glukoze u krvi) kao posledica dijabetesa. Na taj način, najpoznatija uloga glukagona u regulaciji glukoze je neutralisanje dejstva insulina i održavanje nivoa glukoze u krvi.
GLP-1 ima različite biološke aktivnosti u poređenju sa glukagonom. Njegove aktivnosti obuhvataju stimulaciju sinteze i izlučivanja insulina, inhibiciju izlučivanja glukagona i inhibiciju unosa hrane. Pokazano je da GLP-1 smanjuje hiperglikemiju kod dijabetičara. Eksendin-4, peptid iz otrova guštera koji deli oko 50% aminokiselinske identičnosti sa GLP-1, aktivira GLP-1 receptor i na sličan način je pokazano da smanjuje hiperglikemiju kod dijabetičara.
Takođe postoji dokaz da GLP-1 i eksendin-4 mogu da smanje unos hrane i stimulišu gubitak telesne težine, efekat koji bi bio koristan ne samo za dijabetičare, već takođe za pacijente koji pate od gojaznosti. Pacijenti sa gojaznošću imaju veći rizik od dijabetesa, hipertenzije, hiperlipidemije, kardiovaskularne bolesti i muskuloskeletnih bolesti.
WO 2009/155258 opisuje analoge nativnog glukagona pri čemu analozi imaju pojačanu aktivnost na GLP-1 receptoru u odnosu na aktivnost nativnog glukagona na GLP-1 receptoru. Naročito, referenca navodi da formiranje intramolekulskih mostova, ili supstitucija terminalne karboksilne kiseline sa amidnom grupom, proizvodi peptide koji ispoljavaju koagonističku aktivnost na receptor za glukagon/GLP- 1 receptor. Rastvorljivost i stabilnost ovih visoko potentnih analoga glukagona može biti dalje poboljšana modifikacijom polipeptida putem pegilacije, acilacije, alkilacije, supstitucije karboksi terminalnih aminokiselina, C- terminalnog skraćivanja, ili adicije karboksi terminalnog peptida izabranog iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) i SEQ ID NO: 28 (KRNR).
WO/2010/071807 opisuje prolek analoge nativnog glukagona pri čemu je peptid glukagon modifikovan vezom dipeptida za superfamiliju glukagona preko amidne veze. Veza proleka inhibira tu aktivnost peptida glukagona, i njegovo kasnije uklanjanje ponovo uspostavlja aktivnost. Povoljno, oblik proleka je preveden u aktivni oblik u fiziološkim uslovima preko ne-enzimatske reakcije vođene preko hemijske nestabilnosti.
REZIME PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na peptid prema setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na konjugat kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na dimer ili multimer kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju i njenu upotrebu u lečenju bolesti ili medicinskog stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od: metaboličkog sindroma, dijabetesa, gojaznosti, steatoze jetre i neurodegenerativne bolesti kao što je definisano u setu patentnih zahteva.
Predmetni opisi daju peptide i varijante peptida koji ispoljavaju aktivnost na receptoru za glukagon, aktivnost na GLP-1 receptoru, ili aktivnost na svakom od receptora za glukagon i GLP-1 receptoru. U ilustrativnim primerima izvođenja, sada opisani peptidi i varijante peptida ispoljavaju pojačanu aktivnost na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim glukagonom. U primerima aspekata, peptidi i varijante peptida ispoljavaju najmanje 100-struku selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
Sadašnja otkrića dalje obezbeđuju konjugate koji sadrže bilo koji od peptida i varijanti peptida opisanih ovde konjugovanih sa heterolognim delom. U primerima aspekata, heterologni deo je peptid ili protein i konjugat je fuzioni peptid ili himerni peptid. U primerima aspekata, heterologni deo je polimer, npr., polietilen glikol. Predmetna otkrića dalje obezbeđuju dimere i multimere koji sadrži bilo koji od peptida i varijanti peptida koji su ovde opisani.
Predmetna otkrića dalje obezbeđuju farmaceutske kompozicije bilo kog od peptida i varijanti peptida koji su ovde opisani i farmaceutski prihvatljivi nosač, kao i postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili medicinskog stanja (npr., metaboličkii sindrom, dijabetes, gojaznost, steatoza jetre, neurodegenerativna bolest, hipoglikemija) kod pacijenta. Postupak sadrži primenu na pacijenta trenutno opisanog peptida ili peptidne varijante, izborno formulisanog u farmaceutsku kompoziciju, u količini efikasnoj za lečenje bolesti ili medicinskog stanja.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 predstavlja grafikon kumulativne promene telesne težine (grami) DIO miševa tretiranih kontrolom nosačem ili dozom peptida od SEQ ID NO: 12, 17, 18 ili 19, kao što je detaljno opisano u Primeru 7.
Slika 2 predstavlja grafikon bazalne glukoze (mg/dl) DIO miševa tretiranih kontrolom nosačem ili dozom peptida od SEQ ID NO: 12, 17, 18 ili 19, kao što je detaljno opisano u Primeru 7.
Slika 3A predstavlja grafikon kumulativne promene telesne težine (%) gojaznih rezus majmuna tretiranih kontrolom nosačem, Liraglutidom (Lira), ili dozom peptida od SEQ ID NO: 17 ili 20, kao što je detaljno opisano u Primeru 8.
Slika 3B predstavlja grafikon kumulativnog unosa hrane (izraženog kao procenat unosa hrane na dan 0) gojaznih rezus majmuna tretiranih nosačem kontrolom, Liraglutidom ili dozom peptida od SEQ ID NO: 17 ili 20, kao što je detaljno opisano u Primeru 8.
Slika 4 predstavlja grafikon nivoa glukoze u krvi (mg/dL) dijabetičkih rezus majmuna tretiranih kontrolom nosačem ili dozom peptida od SEQ ID NO: 17, kao što je detaljno opisano u Primeru 9.
DETALJAN OPIS
Predmetni pronalazak se odnosi na peptid prema setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na konjugat kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na dimer ili multimer kao što je definisan u setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju i njenu upotrebu u lečenju bolesti ili medicinskog stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od: metaboličkog sindroma, dijabetesa, gojaznosti, steatoze jetre i neurodegenerativne bolesti kao što su definisani u setu patentnih zahteva.
DEFINICIJE
Termin "oko" kao što je ovde korišćen označava veće ili manje od vrednosti ili opsega navedenih vrednosti za 10 procenata, ali nije bila namera da označava bilo koju vrednost ili opseg vrednosti samo za ovu široku definiciju. Svaka vrednost ili opseg vrednosti kome prethodi termin "oko" je takođe određen tako da obuhvata primer izvođenja navedene apsolutne vrednosti ili opsega vrednosti.
Kao što je ovde korišćen, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" obuhvata bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što je fosfatno-puferisani fiziološki rastvor, voda, emulzije kao što je ulje/voda ili voda/ulje emulzija, i različiti tipovi sredstava za vlaženje. Ovaj termin takođe obuhvata bilo koje od sredstava odobrenih od strane regulatorne agencije SAD Federalne vlade ili navedenih u SAD farmakopeji za upotrebu kod životinja, uključujući ljude.
Kao što je ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava soli jedinjenja koja zadržavaju biološku aktivnost ishodnog jedinjenja, i koja nisu biološki ili na drugi način nepoželjna. Mnoga od jedinjenja koja su ovde navedena su sposobna da formiraju kisele i/ili bazne soli zahvaljujući prisustvu amino i/ili karboksil grupa ili grupa sličnih njima.
Farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli mogu biti pripremljene od neorganskih ili organskih baza. Soli poreklom od neorganskih baza, obuhvataju samo radi primera, soli natrijuma, kalijuma, litijuma, amonijuma, kalcijuma i magnezijuma. Soli poreklom od organskih baza obuhvataju, ali bez ograničenja na, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina.
Kao što je ovde korišćen, termin "lečenje" obuhvata profilaksu specifičnog poremećaja ili stanja, ili ublažavanje simptoma povezanih sa specifičnim poremećajem ili stanjem i/ili sprečavanje ili eliminaciju navedenih simptoma. Na primer, kao što je ovde korišćen termin "lečenje dijabetesa" će označavati generalno promenu nivoa glukoze u krvi u smeru normalnih nivoa i može da obuhvata povećanje ili smanjenje nivoa glukoze u krvi u datoj situaciji.
Kao što je ovde korišćena "efikasna" količina ili "terapeutski efikasna količina" peptida glukagona označava netoksičnu, ali dovoljnu količinu peptida za obezbeđivanje željenog efekta. Na primer jedan željeni efekat bio bi prevencija ili lečenje hiperglikemije, npr., kao što je mereno preko promene u nivou glukoze u krvi bliže ka normalnom, ili indukcija gubitka telesne težine/prevencija dobitka na telesnoj težini, npr., kao što je mereno preko redukcije u telesnoj težini, ili prevencija ili smanjenje povećanja u telesnoj težini, ili normalizacija raspodele telesne masti. Količina koja je "efikasna" variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od starosti i opšteg stanja individue, načina primene, i slično. Na taj način, nije uvek moguće specificirati tačnu "efikasnu količinu." Međutim, odgovarajuća "efikasna" količina u bilo kom pojedinačnom slučaju može biti određena od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike upotrebom rutinskih eksperimenata.
Termin, "parenteralni" označava ne preko probavnog kanala, već preko nekog drugog puta, npr., subkutano, intramuskularno, intraspinalno ili intravenski.
Kao što je ovde korišćen, termin "peptid" obuhvata lanac od 3 ili više aminokiselina i tipično manje od 100 aminokiselina, pri čemu su aminokiseline one koje se javljaju u prirodi ili kodirane ili aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi ili nisu kodirane. Aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi označavaju aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi in vivo, ali koje, ipak, mogu biti ugrađene u peptidne strukture koje su ovde opisane. "Koje nisu kodirane" kao što je ovde korišćeno označava aminokiselinu koja nije L-izomer bilo koje od sledećih 20 aminokiselina: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. "Kodirana" kao što je ovde korišćeno označava aminokiselinu koja je L-izomer bilo koje od 20 aminokiselina: Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr. U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani su oko iste dužine kao SEQ ID NO: 1 (koja je dužine 29 aminokiselina dužine), npr. dužine 25-35 aminokiselina. Primeri dužina obuhvataju dužine 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, ili 50 aminokiselina.
Tipično, polipeptidi i proteini imaju dužinu polimera koja je veća od one kod "peptida."
U prijavi, sva pozivanja na određeni aminokiselinski položaj preko broja (npr., položaj 28) označavaju aminokiselinu na tom položaju u nativnom glukagonu (SEQ ID NO: 1) ili odgovarajući aminokiselinski položaj u bilo kom od njihovih analoga. Na primer, pozivanje ovde na "položaj 28" bi označavalo odgovarajući položaj 27 za analog glukagona u kome je prva aminokiselina od SEQ ID NO: 1 deletirana. Slično, referenca ovde na "položaj 28" bi označavala odgovarajući položaj 29 za analog glukagona u kome je jedna aminokiselina dodata pre N-terminusa SEQ ID NO: 1. Kao što je ovde korišćena "aminokiselinska modifikacija" označava (i) supstituciju ili zamenu aminokiseline od SEQ ID NO: 1 sa različitom aminokiselinom (aminokiselina koja se javlja u prirodi ili koja je kodirana ili koja nije kodirana ili koja se ne javlja u prirodi), (ii) adiciju aminokiseline ((aminokiselina koja se javlja u prirodi ili koja je kodirana ili koja nije kodirana ili koja se ne javlja u prirodi), na SEQ ID NO: 1 ili (iii) deleciju jedne ili više aminokiselina od SEQ ID NO: 1.
"Procenat identičnosti" u vezi sa dve aminokiselinske sekvence označava broj aminokiselina prve sekvence koji se podudara (identičan je sa) aminokiselinama u drugoj referentnoj sekvenci, podeljen sa dužinom referentne sekvence, kada su dve sekvence poravnate da bi se postiglo maksimalno poklapanje (npr. praznine mogu biti uvedene za optimalno poravnanje).
Aminokiselinska "modifikacija" označava inserciju, deleciju ili supstituciju jedne aminokiseline drugom. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija ili zamena je konzervativna aminokiselinska supstitucija, npr., konzervativna supstitucija aminokiseline na jednom ili više položaja 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 ili 29. Kao što je ovde korišćen, termin "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima slične osobine, npr., veličinu, naelektrisanje, hidrofobnost, hidrofilnost, i/ili aromatičnost, i obuhvata izmene sa jednom od sledećih pet grupa:
I. Mali alifatični, nepolarni ili slabo polarni ostaci:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II. Polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi i estri:
Asp, Asn, Glu, Gln, cisteinska kiselina i homocisteinska kiselina;
III. Polarni, pozitivno naelektrisani ostaci:
His, Arg, Lys; ornitin (Orn)
IV. Veliki, alifatični, nepolarni ostaci:
Met, Leu, Ile, Val, Cys, norleucin (Nle), homocistein
V. Veliki, aromatični ostaci:
Phe, Tyr, Trp, acetil fenilalanin
U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska supstitucija nije konzervativna aminokiselinska supstitucija, npr., to je nekonzervativna aminokiselinska supstitucija.
Kao što je ovde korišćen termin "naelektrisana aminokiselina" ili "naelektrisani ostatak" označava aminokiselinu koja sadrži bočni lanac koji je negativno naelektrisan (tj., de-protonovan) ili pozitivno-naelektrisan (tj., protonovan) u vodenom rastvoru na fiziološkoj pH. Na primer negativno naelektrisane aminokiseline obuhvataju asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, cisteinsku kiselinu, homocisteinsku kiselinu i homoglutaminsku kiselinu, dok pozitivno naelektrisane aminokiseline obuhvataju arginin, lizin i histidin. Naelektrisane aminokiseline obuhvataju naelektrisane aminokiseline među 20 kodiranih aminokiselina, kao i atipične ili aminokiseline koje se ne javljaju uprirodi ili koje nisu kodirane.
Kao što je ovde korišćen, termin "kisela aminokiselina" označava aminokiselinu koja sadrži drugi kiseli deo (osim karboksilčne kiseline aminokiseline), uključujući primer, grupu karboksilne kiseline ili sulfonske kiseline.
Kao što je ovde korišćen, termin "acilovana aminokiselina" označava aminokiselinu koja sadrži acil grupu koja je nenativna za aminokiselinu koja se javlja u prirodi, bez obzira na način na koji je proizvedena (npr. acilacija pre ugradnje aminokiseline u peptid, ili acilacija posle ugradnje u peptid).
Kao što je ovde korišćen termin "alkilovana aminokiselina" označava aminokiselinu koja sadrži alkil grupu koja je nenativna za aminokiselinu koja se javlja u prirodi, bez obzira na način na koji je proizvedena. Prema tome, acilovane aminokiseline i alkilovane aminokiseline predmetnog otkrića su aminokiseline koje nisu kodirane.
Kao što je ovde korišćen, termin "selektivnost" molekula za prvi receptor u odnosu na drugi receptor odnosi se na sledeći odnos: EC50 molekula na drugom receptoru podeljena sa EC50 molekula na prvom receptoru. Na primer, molekul koji ima EC50 od 1 nM na prvom receptoru i EC50 od 100 nM na drugom receptoru ima 100-puta veću selektivnost za prvi receptor u odnosu na drugi receptor.
Kao što je ovde korišćen termin "nativni glukagon" označava peptid koji se sastoji od sekvence od SEQ ID NO: 1 i termin "nativni GLP-1" je generički termin koji označava GLP-1(7-36) amid, GLP-1(7-37) kiselinu ili smešu ova dva jedinjenja.
Kao što je ovde korišćena, "potencija glukagona" ili "potencija u poređenju sa nativnim glukagonom" molekula označava obrnuti odnos EC50 molekula na receptoru za glukagon podeljen sa EC50 nativnog glukagona na receptoru za glukagon.
Kao što je ovde korišćen, "potencija GLP-1" ili "potencija u poređenju sa nativnim GLP-1" molekula označava obrnuti odnos EC50 molekula na GLP-1 receptoru podeljen sa EC50 nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru.
PRIMERI IZVOĐENJA
Predmetna otkrića daju peptide i varijante peptida koji ispoljavaju aktivnost na GLP-1 receptoru, na receptoru za glukagon, ili na oba GLP-1 receptoru i receptoru za glukagon. U tom smislu, predmetna otkrića daju peptide agoniste GLP-1 receptora, peptide agoniste receptora za glukagon, i peptide koagoniste GLP-1 receptora/receptora za glukagon. U ilustrativnim primerima izvođenja, trenutno opisani peptidi i varijante peptida ispoljavaju pojačanu aktivnost ili veću potenciju na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim humanim glukagonom (SEQ ID NO: 1). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida predmetnih otkrića ispoljavaju veću potenciju na GLP-1 receptoru u poređenju sa nativnim humanim GLP-1 (SEQ ID NO: 2) ili jednim od njegovih aktivnih oblika (SEQ ID NOs: 5 i 6). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju veću potenciju na receptoru za glukagon u poređenju sa nativnim humanim GLP-1. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju veću potenciju na receptoru za glukagon u poređenju sa nativnim humanim glukagonom.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida opisani ovde ispoljavaju druga poboljšanja u osobinama u odnosu na nativni glukagon ili nativni GLP-1, kao što je veća stabilnost, veća rastvorljivost, produženi polu-život u cirkulaciji, odloženi početak aktivnosti, produženo trajanje aktivnosti, smanjeni pik (npr., relativno smanjena srednja maksimalna koncentracija u plazmi), i poboljšana rezistencija na proteaze, kao što je DPP-IV.
Peptidi i varijante peptida opisani ovde su zasnovani na aminokiselinskoj sekvenci nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1), i ovde su opisani kao "peptidi", "varijante peptida","analozi glukagona", "analozi", ili "peptidi glukagona." Podrazumeva se da termini kao što su "analog" ili "varijanta" ili "modifikacije" obuhvataju peptide ili proteine sintetisane de novo i ne zahtevaju izvođenje bilo kog određenog koraka modifikacije. U nekim aspektima, peptidi i varijante peptida opisani ovde sadrže modifikovanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1 koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 aminokiselinskih modifikacija u odnosu na SEQ ID NO: 1, i u nekim slučajevima, 16 ili više (npr., 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26), aminokiselinskih modifikacija, kao što je dalje ovde opisano. Sledeći opis analoga glukagona i/ili peptida glukagona na taj način se odnosi na bilo koji od trenutno opisanih peptida i varijanti peptida, bez obzira na stepen sličnosti između nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) i peptida ili varijante peptida prema predmetnim otkrićima.
Razmatrano je da bilo koja od peptidnih sekvenci opisanih ovde može biti dalje menjana ugradnjom dodatnih aminokiselinskih modifikacija; na primer, uključivanjem bilo koje od modifikacija koje su ovde opisane, npr., na položajima koji su opisani ovde, ili ugradnjom konzervativnih supstitucija, ili vraćanjem na aminokiselinu nativnog glukagona (videti SEQ ID NO: 1) na tom položaju. U ilustrativnim primerima izvođenja, modifikacije obuhvataju, npr., acilaciju, alkilaciju, pegilaciju, skraćivanje na C-terminusu, supstituciju aminokiseline na jednom ili više položaja 1, 2, 3, 7, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 27, 28 i 29. Na primer, tamo gde bilo koja od peptidnih sekvenci koje su ovde opisane obuhvata Cys za svrhe pegilacije, varijanta peptida može da koristi različitu aminokiselinu za pegilaciju. Kao sledeći primer, varijanta peptida može biti pegilovana na različitom položaju (npr., zamenom postojećeg Cys sa različitom aminokiselinom, inseriranjem nove Cys na predloženom pegilacionom položaju, i pegilacijom novog Cys). Kao sledeći primer, tamo gde bilo koja od peptidnih sekvenci koje su ovde opisane obuhvata Lys za svrhe acilacije, Lys može biti pomeren do različitog položaja i novi položaj acilovan. U bilo kom od primera izvođenja koji su ovde opisani, varijante peptida mogu biti, na primer, 80%, 85%, 90% ili 95% identične sa ishodnim peptidima po dužini ishodnih peptida ili preko aminokiselina 1-29 ishodnog peptida (npr., može da obuhvata 1, 2, 3, 4, ili 5 dodatnih modifikacija u poređenju sa ishodnim peptidom).
Takođe su razmatrani konjugati, fuzioni proteini i multimeri bilo koje od peptidnih sekvenci koje su ovde opisane.
AKTIVNOST PEPTIDA I VARIJANTI PEPTIDA
Agonistička aktivnost na receptoru za glukagon
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida prema predmetnim otkrićima ispoljavaju EC50 na receptoru za glukagon od oko 1000 µm ili manje (npr., oko 750 µM ili manje, oko 500 µM ili manje, oko 250 µM ili manje, oko 100 µM ili manje, oko 75 µM ili manje, oko 50 µM ili manje, oko 25 µM ili manje, oko 10 µM ili manje, oko 5 µM ili manje, ili oko 1 µM ili manje). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 za aktivaciju receptora za glukagon koja je u nanomolarnom opsegu. Na primer, trenutno opisani peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 na receptoru za glukagon koja je oko 1000 nM ili manje (npr., oko 750 nM ili manje, oko 500 nM ili manje, oko 250 nM ili manje, oko 100 nM ili manje, oko 75 nM ili manje, oko 50 nM ili manje, oko 25 nM ili manje, oko 10 nM ili manje, oko 5 nM ili manje, ili oko 1 nM ili manje). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 na reeceptoru za glukagon koja je u pikomolarnom opsegu. Prema tome, u primerima aspekata, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 za aktivaciju receptora za glukagon od oko 1000 pM ili manje (npr., oko 750 pM ili manje, oko 500 pM ili manje, oko 250 pM ili manje, oko 100 pM ili manje, oko 75 pM ili manje, oko 50 pM ili manje, oko 25 pM ili manje, oko 10 pM ili manje, oko 5 pM ili manje, ili oko 1 pM ili manje). Razume se da niža EC50 ukazuje na veću aktivnost ili potenciju na receptoru.
U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji su ovde opisani ispoljavaju EC50 na receptoru za glukagon koja je oko 0.001 pM ili više, oko 0.01 pM ili više, ili oko 0.1 pM ili više. Aktivacija receptora za glukagon (aktivnost receptora za glukagon) može biti merena pomoću in vitro analiza merenjem indukcije cAMP u HEK293 ćelijama koje prekomerno eksprimiraju receptor za glukagon, npr., analizom HEK293 ćelija kotransficiranih sa DNK koja kodira receptor za glukagon i gen za luciferazu vezan za cAMP responsivni element kao što je opisano u Primeru 2.
U ilustrativnim primerima izvođenja, trenutno otkriveni peptidi i varijante peptida ispoljavaju oko 0.001% ili više, oko 0.01% ili više, oko 0.1% ili više, oko 0.5% ili više, oko 1% ili više, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 20% ili više, oko 30% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 75% ili više, oko 100% ili više, oko 125% ili više, oko 150% ili više, oko 175% ili više, oko 200% ili više, oko 250% ili više, oko 300% ili više, oko 350% ili više, oko 400% ili više, oko 450% ili više, ili oko 500% ili više aktivnosti na receptoru za glukagon u odnosu na nativni glukagon (potencija glukagona). U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani ispoljavaju oko 5000% ili manje ili oko 10,000% ili manje aktivnosti na receptoru za glukagon u odnosu na nativni glukagon. Aktivnost analoga glukagona na receptoru u odnosu na nativni ligand receptora je izračunavana kao obrnuti odnos vredosti EC50 za analog glukagona prema nativnom ligandu.
U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju značajnu aktivnost (potencija) na samo receptoru za glukagon i malo do nimalo aktivnosti na GLP-1 receptoru. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida se smatraju "čistim agonistima receptora za glukagon" ili se ne smatraju "koagonistima receptora za glukagon/GLP-1 receptora." U nekim primerima izvođenja ovi peptidi i varijante peptida ispoljavaju bilo koji od nivoa aktivnosti ili potencije na receptoru za glukagon opisan ovde, ali imaju značajno manje aktivnosti (potencije) na GLP-1 receptoru. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona ispoljava EC50 na GLP-1 receptoru koja je 100-struka ili više od EC50 na receptoru za glukagon.
Agonistička aktivnost na GLP-1 receptoru
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 za aktivaciju GLP-1 receptora od oko 1000 µM ili manje (npr., oko 750 µM ili manje, oko 500 µM ili manje, oko 250 µM ili manje, oko 100 µM ili manje, oko 75 µM ili manje, oko 50 µM ili manje, oko 25 µM ili manje, oko 10 µM ili manje, oko 5 µM ili manje, ili oko 1 µM ili manje). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 na GLP-1 receptoru od oko 1000 nM ili manje (npr., oko 750 nM ili manje, oko 500 nM ili manje, oko 250 nM ili manje, oko 100 nM ili manje, oko 75 nM ili manje, oko 50 nM ili manje, oko 25 nM ili manje, oko 10 nM ili manje, oko 5 nM ili manje, ili oko 1 nM ili manje). U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida imaju EC50 na GLP-1 receptoru koja je u pikomolarnom opsegu. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 za aktivaciju GLP-1 receptora od oko 1000 pM ili manje (npr., oko 750 pM ili manje, oko 500 pM ili manje, oko 250 pM ili manje, oko 100 pM ili manje, oko 75 pM ili manje, oko 50 pM ili manje, oko 25 pM ili manje, oko 10 pM ili manje, oko 5 pM ili manje, ili oko 1 pM ili manje). Razume se da niža EC50 ukazuje na veću aktivnost ili potenciju na receptoru.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida opisani ovde ispoljavaju EC50 na GLP-1 receptoru koja je oko 0.001 pM ili više, oko 0.01 pM ili više, ili oko 0.1 pM ili više. Aktivacija GLP-1 receptora (aktivnost GLP-1 receptora) može biti merena pomoću in vitro analiza merenjem indukcije cAMP u HEK293 ćelijama koje prekomerno eksprimiraju GLP-1 receptor, npr., analizom HEK293 ćelija kotransficiranih sa DNK koja kodira GLP-1 receptor i gen luciferaze vezan za cAMP responsivni element kao što je opisano u Primeru 2.
U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida predmetnih otkrića ispoljavaju oko 0.001% ili više, oko 0.01% ili više, oko 0.1% ili više, oko 0.5% ili više, oko 1% ili više, oko 5% ili više, oko 10% ili više, oko 20% ili više, oko 30% ili više, oko 40% ili više, oko 50% ili više, oko 60% ili više, oko 75% ili više, oko 100% ili više, oko 125% ili više, oko 150% ili više, oko 175% ili više, oko 200% ili više, oko 250% ili više, oko 300% ili više, oko 350% ili više, oko 400% ili više, oko 450% ili više, ili oko 500% ili više aktivnosti na GLP-1 receptoru u odnosu na nativni GLP-1 (GLP-1 potencija). U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida opisani ovde ispoljavaju oko 5000% ili manje ili oko 10,000% ili manje aktivnosti na GLP-1 receptoru u odnosu na nativni GLP-1 (potencija GLP-1).
U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju značajnu aktivnost (potenciju) na samo GLP-1 receptoru i malo ili nimalo akitvnosti na receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida se smatraju "čistim agonistima GLP-1 receptora" ili se ne smatraju "koagonistima receptora za glukagon/GLP-1 receptora." U nekim primerima izvođenja ovi peptidi i varijante peptida ispoljavaju bilo koji od nivoa aktivnosti ili potencije na GLP-1 receptoru opisanom ovde, ali imaju značajno manje aktivnosti (potencije) na receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju EC50 na receptoru za glukagon koja je 100-struka ili veća od EC50 na GLP-1 receptoru.
Agonistička aktivnost na GLP-1 receptoru i receptoru za glukagon
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida ispoljavaju aktivnost na oba GLP-1 receptoru i receptoru za glukagon i mogu se smatrati "koagonistima receptora za glukagon/GLP-1 receptora". U ilustrativnim primerima izvođenja, aktivnost (npr., EC50 ili relativna aktivnost ili potencija) peptida i varijanti peptida na receptoru za glukagon je unutar oko 50-struko, oko 40-struko, oko 30-struko, oko 20-struko, oko 10-struko, ili oko 5-struko različita (veća ili manja) od njegove aktivnosti (npr., EC50 ili relativne aktivnosti ili potencije) na GLP-1 receptoru. U primerima aspekata, potencija glukagona peptida ili varijante peptida je unutar oko 25-, oko 20-, oko 15-, oko 10-, ili oko 5-struko različita (veća ili manja) od njegove GLP-1 potencije. U primerima aspekata, potencija glukagona peptida ili varijante peptida je unutar oko 25-, oko 20-, oko 15-, oko 10-, ili oko 5-struko manja od njegove GLP-1 potencije.
U ilustrativnim primerima izvođenja, koagonist je približno ekvipotentan ili relativno potentniji na GLP-1 receptoru od receptora za glukagon. Na primer, odnos relativne aktivnosti ili EC50 ili potencije peptida ili varijante peptida na receptoru za glukagon podeljen sa relativnom aktivnošću ili EC50 ili potencijom peptida ili varijante peptida na GLP-1 receptoru je manji od, ili je oko, X, pri čemu je X izabran od 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 ili 5. U ilustrativnim primerima izvođenja, odnos EC50 ili potencije ili relativne aktivnosti peptida ili varijante peptida na receptoru za glukagon podeljen sa EC50 ili potencijom ili relativnom aktivnošću peptida ili varijante peptida na GLP-1 receptoru je oko 1 imanje od 5 (npr., oko 4, oko 3, oko 2, oko 1). U ilustrativnim primerima izvođenja, odnos EC50 ili potencije ili relativne aktivnosti peptida ili varijante peptida na GLP-1 receptoru podeljen sa EC50 ili potencijom ili relativnom aktivnošću peptida ili varijante peptida na receptoru za glukagon je manji od 5 (npr., oko 4, oko 3, oko 2, oko 1). U ilustrativnim primerima izvođenja, odnos potencije glukagona peptida ili varijante peptida u poređenju sa potencijom GLP-1 peptida ili varijante peptida je manji od, ili je oko, Y, pri čemu je Y izabran od 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, i 5. U ilustrativnim primerima izvođenja, odnos potencije glukagona peptida ili varijante peptida u poređenju sa potencijom GLP-1 peptida ili varijante peptida je manji od 5 (npr., oko 4, oko 3, oko 2, oko 1). U nekim primerima izvođenja, analog glukagona ima EC50 na receptoru za glukagon koja je 2- do 10-puta (npr., 2-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta) veća od EC50 na GLP-1 receptoru.
[0050] U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid je primarno agonist glukagona i relativno je potentniji na receptoru za glukagon nego na GLP-1 receptoru (npr. peptid je 5 puta ili više potentniji na receptoru za glukagon u poređenju sa GLP-1 receptorom). Na primer, odnos relativne aktivnosti ili potencije ili EC50 peptida ili varijante peptida na GLP-1 receptoru podeljen sa relativnom aktivnošću ili potencijom ii EC50 peptida ili varijante peptida na receptoru za glukagon je manji od, ili je oko, V, pri čemu je V izabran od 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 ili 5. U nekim primerima izvođenja, odnos potencije GLP-1 peptida ili varijante peptida u poređenju sa potencijom glukagona peptida ili varijante peptida je manji od, ili je oko, W, pri čemu je W izabran od 100, 75, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, i 5. U nekim primerima izvođenja, peptid ili varijanta peptida ispoljava najmanje 0.1% (npr., oko 0.5% ili više, oko 1% ili više, oko 5% ili više, oko 10% ili više, ili više) aktivnosti nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru (potencija GLP-1) i ispoljava najmanje 0.1% (npr., oko 0.5% ili više, oko 1% ili više, oko 5% ili više, oko 10% ili više, ili više) aktivnosti nativnog glukagona na receptoru za glukagon (potencija glukagona).
Aktivnost na GIP receptoru
Pored toga što su aktivni na receptoru za glukagon i/ili GLP-1 receptoru, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani, u nekim aspektima, ispoljavaju nisku agonističku aktivnost na GIP receptoru. U takvim aspektima, poželjno takvi peptidi i varijante peptida su najmanje 100-puta selektivnije za GLP-1 receptor u odnosu na GIP receptor.
U drugim aspektima, međutim, peptid ili varijanta peptida ispoljavaju značajnu aktivnost na GIP receptoru, npr. EC50 analoga na GIP receptoru je manje od oko 50-struko različita od njegove EC50 na GLP-1 receptoru, izborno, pri čemu je potencija GIP analoga unutar oko 50-puta veća od potencije GLP-1 analoga. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi ispoljavaju EC50 za aktivnost aktivacije GIP receptora od oko 1 µM ili manje, ili 100 nM ili manje, ili oko 75, 50, 25, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 nM ili manje. Podrazumeva se da niža EC50 ukazuje na veću aktivnost ili potenciju na receptoru. U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani ispoljavaju EC50 na GIP receptoru koja je oko 0.001 nM, 0.01 nM, ili 0.1 nM. U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani ispoljavaju EC50 na GIP receptoru koja nije veća od oko 100 nM. Aktivacija receptora može biti merena pomoću in vitro analiza merenjem indukcije cAMP u HEK293 ćelijama koje prekomerno eksprimiraju receptor, npr. analizom HEK293 ćelija kotransficiranih sa DNK koja kodira receptor i gen za luciferazu vezan za cAMP responsivni element kao što je opisano u Primeru 2.
U nekim primerima izvođenja, trenutno opisani peptidi i varijante peptida ispoljavaju najmanje oko 0.1%, 1%, 10%, 50%, 100%, 150%, ili 200% ili veću aktivnost na GIP receptoru u odnosu na nativni GIP (potencija GIP). U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani ispoljavaju ne više od 1000%, 10,000%, 100,000%, ili 1,000,000% aktivnost na GIP receptoru u odnosu na nativni GIP. Aktivnost peptida glukagona (potencija) na receptoru u odnosu na nativni ligand receptora izračunava se kao obrnuti odnos EC50 vrednosti za peptid naspram nativnog liganda.
Na taj način, jedan aspekt predmetnih otkrića daje peptide i varijante peptida koji ispoljavaju aktivnost na oba, receptoru za glukagon i GIP receptoru ("koagonsiti glukagona/GIP"). U nekim primerima izvođenja, EC50 peptida na GIP receptoru je manje od oko 50-puta, 40-puta, 30-puta ili 20-puta različita (veća ili manja) od njegove EC50 na receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, potencija GIP peptida je manje od oko 500-, 450-, 400-, 350-, 300-, 250-, 200-, 150-, 100-, 75-, 50-, 25-, 20-, 15-, 10-, ili 5-puta različita (veća ili manja) od njegove potencije glukagona. U nekim primerima izvođenja, aktivnost GLP-1 je značajno smanjena ili uništena, npr., pomoću aminokiselinske modifikacije na položaju 7, delecije aminokiseline(a) C-terminalno u odnosu na aminokiselinu na položaju 27 ili 28, ili njihove kombinacije.
U alternativnim aspektima predmetnih otkrića, peptidi i varijante peptida prema predmetnim otkrićima ispoljavaju aktivnost na GLP-1 i GIP receptorima, ali ne ispoljavaju značajnu aktivnost na receptoru za glukagon ("koagonisti GIP/GLP-1"), npr., zahvaljujući aminokiselinskoj modifikaciji Gln na položaju 3. Na primer, supstitucija na ovom položaju sa kiselom, baznom ili hidrofobnom aminokiselinom (glutaminska kiselina, ornitin, norleucin) smanjuje aktivnost glukagona. U drugim aspektima, peptidi i varijante peptida ispoljavaju aktivnost na svakom od receptora za glukagon, GIP i GLP-1 receptora ("tri-agonisti glukagona/GIP/GLP-1"). Na primer, u svakom od ovih poslednjih aspekata, EC50 peptida na GIP receptoru je manje od oko 50-puta, 40-puta, 30-puta ili 20-puta različita (veća ili manja) od njegove EC50 na GLP-1 receptoru. U nekim primerima izvođenja, potencija GIP peptida je manje od oko 25-, 20-, 15-, 10-, ili 5-puta različita (veća ili manja) od njegove potencije GLP-1. U nekim primerima izvođenja ovi peptidi imaju oko 10% ili manje od aktivnosti nativnog glukagona na receptoru za glukagon, npr. oko 1-10%, ili oko 0.1-10%, ili više od oko 0.1%, ali manje od oko 10%.
Aktivnost konjugata
U nekim primerima izvođenja, peptidi i varijante peptida koji su ovde opisani ispoljavaju aktivnost ili potenciju na receptoru za glukagon i/ili aktivnost na GLP-1 receptoru i/ili aktivnost na GIP receptoru, kao što je opisano u prethodnom tekstu i, kada je peptid ili varijanta peptida deo konjugata (npr., konjugovan za heterologni deo, npr., hidrofilni deo, npr., polietilen glikol), peptid ili varijanta peptida ispoljava aktivnost koja je niža (tj. niža potencija ili veća EC50) nego kada peptid ili varijanta peptida nije deo konjugata. U nekim aspektima, peptid ili varijanta peptida kada nije deo konjugata ispoljava potenciju na receptoru za glukagon i/ili GLP-1 receptoru koja je oko 10-puta ili više veća od potencije peptida ili varijante peptida kada je deo konjugata. U nekim aspektima, peptid ili varijanta peptida kada je nekonjugovan ispoljava potenciju na receptoru za glukagon i/ili GLP-1 receptoru koja je oko 10-puta, oko 15-puta, oko 20-puta, oko 25-puta, oko 30-puta, oko 35-puta, oko 40-puta, oko 45-puta, oko 50-puta, oko 100-puta, ili čak više puta veća od potencije peptida ili varijante peptida kada je konjugovan.
STRUKTURA ANALOGA GLUKAGONA
Acilacija
U skladu sa nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu (npr., nekodiranu acilovanu aminokielinu (npr., aminokiselinu koja sadrži acil grupu koja nije nativna za aminokiselinu koja se javlja u prirodi)). Acilovana aminokiselina u nekim primerima izvođenja izaziva da analog glukagona ima jedan ili više od (i) produženi polu-život u cirkulaciji, (ii) odloženi početak delovanja, (iii) produženo trajanje aktivnosti, (iv) poboljšanu otpornost na proteaze, kao što je DPP-IV, i (v) povećanu potenciju na jednom ili oba, GLP-1 receptoru i receptoru za glukagon. Kao što je ovde pokazano, acilovani analozi glukagona ne ispoljavaju smanjenu aktivnost na receptoru za glukagon i GLP-1 receptoru u poređenju sa odgovarajućim neacilovanim analogom glukagona. Pre, u nekim slučajevima, acilovani analozi glukagona ispoljavaju povećanu aktivnost na GLP-1 receptorima i receptorima za glukagon. Prema tome, potencija acilovanih analoga glukagona je slična neacilovanim verzijama analoga glukagona, ako nije pojačana.
U skladu sa jedinim primerom izvođenja, analog glukagona sadrži acil grupu koja je vezana za analog glukagona preko estarske, tioestarske ili amidne veze za svrhe produžavanja polu-života u cirkulaciji i/ili odlaganja početka i/ili produženja trajanja aktivnosti i/ili poboljšanja otpornosti na protezae kao što je DPP-IV.
Acilacija može biti izvedena na bilo kom položaju unutar analoga glukagona, uključujući bilo koji od položaja 1-29, položaj C-terminalno u odnosu na 29. aminokiselinu (npr., aminokiselina na položaju 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, itd., na položaju unutar C-terminalnog produžetka ili na C-terminusu), pod uslovom da je zadržana aktivnost glukagona i/ili GLP-1, ako ne pojačana. Neograničavajući primeri obuhvataju položaje 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 ili 29. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 9, 10, 12, 16 i 20. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 10, 12 i 16. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 9, 10, 12, 16 i 20. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja 10 i 12. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu na položaju 12. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži C-terminalni produžetak i acilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od 9, 10, 12, 16, 20 i 37-43 (npr., 40). U specifičnim primerima izvođenja, acilacija se javlja na položaju 10 analoga glukagona i analog glukagona nema intramolekulski most, npr., kovalentni intramolekulski most (npr., laktamski most). Takvi acilovani analozi glukagona koji nemaju intramolekulski most pokazuju povećanu aktivnost na GLP-1 receptorima i receptorima za glukagon u poređenju sa odgovarajućim neacilovanim analozima koji nemaju kovalentni intramolekulski most i u poređenju sa odgovarajućim analozima koji nemaju intramolekulski most acilovan na položaju osim položaja 10. Kao što je ovde prikazano, acilacija na položaju 10 može čak da transformiše analog glukagona koji ima malo aktivnosti na receptoru za glukagon u analog glukagona koji ima aktivnost na oba, receptorima za glukagon i GLP-1 receptorima. Prema tome, položaj na kome se javlja acilacija može da promeni ukupni profil aktivnosti analoga glukagona.
Analog glukagona u nekim primerima izvođenja je acilovan na istom aminokiselinskom položaju gde je hidrofilni deo vezan, ili na različitom aminokiselinskom položaju. Neograničavajući primeri obuhvataju acilaciju na položaju 10 i pegilaciju na jednom ili više položaja u C-terminalnom delu analoga glukagona, npr., položaju 24, 28 ili 29, unutar C-terminalnog produžetka, ili na C-terminusu (npr., preko dodavanja C-terminalnog Cys).
Acil grupa može biti kovalentno vezana direktno za aminokiselinu analoga glukagona, ili indirektno za aminokiselinu analoga glukagona preko spejsera, pri čemu je spejser postavljen između aminokiseline analoga glukagona i acil grupe.
U specifičnim aspektima, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži acil grupu putem direktne acilacije amina, hidroksila ili tiola u bočnom lancu aminokiseline analoga glukagona. U nekim primerima izvođenja, acilacija je na položaju 10, 20, 24 ili 29 analoga glukagona. U tom smislu, acilovani analog glukagona može da sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, sa najmanje jednom od aminokiselina na položajima 10, 20, 24 i 29 analoga modifikovanog do bilo koje aminokiseline koja sadrži amin, hidroksil ili tiol u bočnom lancu. U nekim specifičnim primerima izvođenja, direktna acilacija analoga glukagona javlja se preko amina, hidroksila ili tiola bočnog lanca aminokiseline na položaju 10.
U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amino grupu u bočnom lancu je aminokiselina formule I:
gde je n = 1 do 4
[Formula I]
U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule I, je aminokiselina u kojoj n je 4 (Lys) ili n je 3 (Orn).
U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil u bočnom lancu je aminokiselina formule II:
gde je n = 1 do 4
[Formula II]
U nekim ilustrativni primerima izvođenja, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj je n jedanko 1 (Ser).
U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži tiol u bočnom lancu je aminokiselina formule III:
wherein n = 1 do 4
[Formula III]
U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je aminokiselina u kojoj je n jednako 1 (Cys).
U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu je disupstituisana aminokiselina koja sadrži istu strukturu formule I, formule II, ili formule III, osim što je vodonik vezan za alfa ugljenik aminokiseline formule I, formule II ili formule III zamenjen drugim bočnim lancem.
U nekim primerima izvođenja, acilovani glukagon sadrži spejser između analoga i acil grupe. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je kovalentno vezan za spejser, koji je kovalentno vezan za acil grupu.
U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu. Aminokiselina za koju je vezan spejser može biti bilo koja aminokiselina (npr., jednostruko ili dvostruko α-supstituisana aminokiselina) koja sadrži deo koji omogućava vezivanje za spejser. Na primer, aminokiselina koja sadrži NH2, -OH, ili –COOH u bočnom lancu (npr., Lys, Orn, Ser, Asp ili Glu) je pogodna. U tom smislu, acilovani analog glukagona može da sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, sa najmanje jednom od aminokiselina na položajima 10, 20, 24 i 29 modifikovanom u bilo koju aminokiselinu koja sadrži amino grupu, hidroksil ili karboksilat u bočnom lancu.
U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu, ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu.
Kada se acilacija javlja preko amino grupe spejsera, acilacija može da se javi preko alfa amino grupe aminokiseline ili amino grupe bočnog lanca. U slučaju gde je alfa amino grupa acilovana, aminokiselina spejsera može biti bilo koja aminokiselina. Na primer, aminokiselina spejsera može biti hidrofobna aminokiselina, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-amino heksanska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminooktanska kiselina. Alternativno, aminokiselina spejsera može biti kiseli ostatak, npr., Asp, Glu, homoglutaminska kiselina, homocisteinska kiselina, cisteinska kiselina, gama-glutaminska kiselina.
U slučaju u kome amino grupa bočnog lanca aminokiseline spejsera je acilovana, aminokiselina spejsera je aminokiselina koja sadrži amino grupu u bočnom lamcu, npr., aminokiselina formule I (npr., Lys ili Orn). U ovom slučaju, moguće je da oba, alfa-amino grupa i amino grupa bočnog lanca aminokiseline spejsera budu acilovane, tako da je analog glukagona diacilovan. Primeri izvođenja opisa obuhvataju takve diacilovane molekule.
Kada se acilacija javi preko hidroksil grupe spejsera, aminokiselina ili jedna od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule II. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Ser.
Kada se acilacija javi preko tiol grupe spejsera, aminokiselina ili jedna od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule III. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Cys.
U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofilni bifunkcionalni spejser. U određenim primerima izvođenja, hidrofilni bifunckionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amino, hidroksil, tioli karboksilnu grupu ili bilo koje njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, hidrofilni funkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. U specifičnom primeru izvođenja, spejser sadrži amino poli(alkiloksi)karboksilat. U tom smislu, spejser može da sadrži, na primer, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, gde je m ceo broj od 1 do 6 i n je ceo broj od 2 do 12, kao što je, npr., 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina, koja je komercijalno dostupna iz Peptides International, Inc. (Louisville, KY).
U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofobni bifunkcionalni spejser. Hidrofobni bifunkcionalni spejseri su poznati u stanju tehnike. Videti, npr., Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996). U određenim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amino, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koje njihove kombinacije. U određenim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. Pogodni hidrofobni bifunkcionalni spejseri koji sadrže karboksilat i hidroksil grupu ili tiol grupu su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, 8-hidroksioktansku kiselinu i 8-merkaptooktansku kiselinu.
U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser nije dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati, metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilatnih grupa. U nekim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser je dikarboksilna kiselina koja sadrži negranati, metilen od 1-7 atoma ugljenika između karboksilatnih grupa.
Spejser (npr., aminokiselina, dipeptid, tripeptid, hidrofilni bifunkcionalni spejser, ili hidrofobni bifunkcionalni spejser) u specifičnim primerima izvođenja je 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma, (npr., 6, 7, 8, 9 ili 10 atoma) u dužinu. U specifičnijim primerima izvođenja, spejser je dužine oko 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) i acil grupa je C12 do C18 masna acil grupa, npr., C 14 masna acil grupa, C16 masna acil grupa, tako da je ukupna dužina spejsera i acil grupe jednaka 14 do 28 atoma, npr., oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28 atoma. U nekim primerima izvođenja, dužina spejsera i acil grupe je 17 do 28 (npr., 19 do 26, 19 do 21) atoma.
U skladu sa određenim gore navedenim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser može biti sintetička ili prirodna aminokiselina (uključujući, ali bez ograničenja na, bilo koju od onih koje su ovde opisane) koja sadrži aminokiselinsku osnovu koja je 3 do 10 atoma u dužinu (npr., 6-amino heksanska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminooktanska kiselina). Alternativno, spejser može biti dipeptid ili tripeptid spejser koji ima peptidnu osnovu koja je dužine 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma). Svaka aminokiselina dipeptidnog ili tripeptidnog spejsera može biti ista ili različita od druge aminokiseline (drugih aminokiselina) dipeptida ili tripeptida i može biti nezavisno izabrana iz grupe koja se sastoji od: aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili koje su kodirane i/ili nekodiranih aminokiselina ili aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi, uključujući, na primer, bilo koju od D ili L izomera aminokiselina koje se javljaju u prirodi (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr), ili bilo koji od D ili L izomera aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi ili nekodiranih aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od: β-alanina (β-Ala), N-α-metil-alanina (Me-Ala), aminobuterne kiseline (Abu), γ-aminobuterne kiseline (γ-Abu), aminoheksanske kiseline (ε-Ahx), aminoizobuterne kiseline (Aib), aminometilpirol karboksilne kiseline, aminopiperidinkarboksilne kiseline, aminoserina (Ams), aminotetrahidropiran-4-karboksilne kiseline, arginin N-metoksi-N-metil amida, β-asparaginske kiseline (β-Asp), azetidin karboksilne kiseline, 3-(2-benzotiazolil)alanina, α-terc-butilglicina, 2-amino-5-ureido-n-valerijanske kiseline (citrulina, Cit), β-cikloheksilalanina (Cha), acetamidometil-cisteina, diaminobuterne kiseline (Dab), diaminopropionske kiseline (Dpr), dihidroksifenilalanina (DOPA), dimetiltiazolidina (DMTA), γ-glutaminske kiseline (γ-Glu), homoserina (Hse), hidroksiprolina (Hyp), izoleucin N-metoksi-N-metil amida, metil-izoleucina (MeIle), izonipekotinske kiseline (Isn), metil-leucina (MeLeu), metil-lizina, dimetil-lizina, trimetil-lizina, metanoprolina, metionin-sulfoksida (Met(O)), metionin-sulfona (Met(O2)), norleucina (Nle), metil-norleucina (Me-Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), para-aminobenzojeve kiseline (PABA), penicilamina (Pen), metilfenilalanina (MePhe), 4-hlorofenilalanina (Phe(4-Cl)), 4-fluorofenilalanina (Phe(4-F)), 4-nitrofenilalanina (Phe(4-NO2)), 4-cijanofenilalanina ((Phe(4-CN)), fenilglicina (Phg), piperidinilalanina, piperidinilglicina, 3,4-dehidroprolina, pirolidinilalanina, sarkozina (Sar), selenocisteina (Sec), O-Benzil-fosfoserina, 4-amino-3-hidroksi-6-metilheptanske kiseline (Sta), 4-amino-5-cikloheksil-3-hidroksipentanske kiseline (ACHPA), 4-amino-3-hidroksi-5-fenilpentanske kiseline (AHPPA), 1,2,3,4,-tetrahidroizohinolin-3-karboksilne kiseline (Tic), tetrahidropiranglicina, tienilalanina (Thi), O-benzil-fosfotirozina, O-fosfotirozina, metoksitirozina, etoksitirozina, O-(bis-dimetilamino-fosfono)-tirozina, tirozin sulfat tetrabutilamina, metil-valina (MeVal) i alkilovane 3-merkaptopropionske kiseline.
U nekim primerima izvođenja, spejser sadrži ukupno negativno naelektrisanje, npr., sadrži jednu ili dve negativno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, dipeptid nije bilo koji od dipeptida opšte strukture A-B, gde je A izabran iz grupe koja se sastoji od Gly, Gln, Ala, Arg, Asp, Asn, Ile, Leu, Val, Phe i Pro, gde je B izabran izgrupe koja se sastoji od Lys, His, Trp. U nekim primerima izvođenja, dipeptidni spejser je izabran iz grupe koja se sastoji od: Ala-Ala, β-Ala- β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-aminobuterne kiseline - γ-aminobuterne kiseline, Glu-Glu i γ-Glu- γ-Glu.
U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži acil grupu acilacijom amino grupe, hidroksila ili tiola spejsera, pri čemu je spejser vezan za bočni lanac aminokiseline na položaju 10, 20, 24 ili 29, ili na C-terminalnoj aminokiselini analoga glukagona.
U specifičnijim primerima izvođenja, acil grupa je vezana za aminokiselinu na položaju 10 analoga glukagona i dužina spejsera i acil grupe je 14 do 28 atoma. Aminokiselina na položaju 10, u nekim aspektima, je aminokiselina formule I, npr., Lys, ili disupstituisana aminokiselina vezana za formulu I. U specifičnijim primerima izvođenja, analog glukagona nema intramolekulski most, npr., kovalentni intramolekulski most. Analog glukagona, na primer, može biti analog glukagona koji sadrži jedan ili više alfa, alfa-disupstituisanih aminokiselina, npr., AIB, za stabilizaciju alfa spirale analoga.
Pogodni postupci acilacije peptida preko amina, hidroksila i tiola su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Primer 19 (za postupke za acilaciju preko amina), Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982); i Previero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972) (za postupke za acilaciju preko hidroksila); i San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005) (za postupke za acilaciju preko tiola); Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989).
Acil grupa acilovane aminokiseline može biti bilo koje veličine, npr., ugljenični lanac bilo koje dužine, i može biti linearni ili granati. U nekim specifičnim primerima izvođenja, acil grupa je C4 do C30 masna kiselina. Na primer, acil grupa može biti bilo koja od C4 masne kiseline, C6 masne kiseline, C8 masne kiseline, C10 masne kiseline, C12 masne kiseline, C14 masne kiseline, C16 masne kiseline, C18 masne kiseline, C20 masne kiseline, C22 masne kiseline, C24 masne kiseline, C26 masne kiseline, C28 masne kiseline ili C30 masne kiseline. U nekim primerima izvođenja, acil grupa je C8 do C20 masna kiselina, npr., C14 masna kiselina ili C16 masna kiselina.
U alternativnom primeru izvođenja, acil grupa je žučna kiselina. Žučna kiselina može biti bilo koja pogodna žučna kiselina, uključujući, ali bez ograničenja na, holnu kiselinu, henodeoksiholnu kiselinu, deoksiholnu kiselinu, litoholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, glikoholnu kiselinu i holesterol kiselinu.
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži acilovanu aminokiselinu acilacijom dugolančanog alkana pomoću analoga glukagona. U specifičnim aspektima, dugolančani alkan sadrži amino, hidroksi ili tiol grupu (npr., oktadecilamin, tetradekanol i heksadekantiol) koja reaguje sa karboksil grupom, ili njenim aktiviranim oblikom, analoga glukagona. Karboksil grupa, ili njen aktivirani oblik, analoga glukagona može biti deo bočnog lanca aminokiseline (npr., glutaminske kiseline, asparaginske kiseline) analoga glukagona ili može biti deo osnove analoga.
U određenim primerima izvođenja, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži acil grupu putem acilacije dugolančanog alkana preko spejsera koji je vezan za analog glukagona. U specifičnim aspektima, dugolančani alkan sadrži amino, hidroksil ili tiol grupu koja reaguje sa karboksil grupom, ili njenim aktivirani oblikom, spejsera. Pogodni spejseri koji sadrže karboksil grupu, ili njen aktivirani oblik, su ovde opisani i obuhvataju, na primer, bifunkcionalne spejsere, npr., aminokiseline, dipeptide, tripeptide, hidrofilne bifunkcionalne spejsere i hidrofobne bifunkcionalne spejsere.
Kao što je ovde korišćen, termin "aktivirani oblik karboksil grupe" označava karboksil grupu sa opštom formulom R(C=O)X, gde je X odlazeća grupa i R je analog glukagona ili spejser. Na primer, aktivirani oblici karboksil grupa mogu da obuhvataju, ali bez ograničenja na, acil hloride, anhidride i estre. U nekim primerima izvođenja, aktivirana karboksil grupa je estar sa N-hidroksisukcinimid estarskom (NHS) odlazećom grupom.
U vezi sa ovim aspektima, u kome je dugolančani alkan acilovan pomoću analoga glukagona ili spejsera, dugolančani alkan može biti bilo koje veličine i može da sadrži ugljenični lanac bilo koje dužine. Dugolančani alkan može biti linearni ili granati. U određenim aspektima, dugolančani alkan je C4 do C30 alkan. Na primer, dugolančani alkan može biti bilo koji od C4 alkana, C6 alkana, C8 alkana, C10 alkana, C12 alkana, C14 alkana, C16 alkana, C18 alkana, C20 alkana, C22 alkana, C24 alkana, C26 alkana, C28 alkana ili C30 alkana. U nekim primerima izvođenja, dugolančani alkan sadrži C8 do C20 alkan, npr., C14 alkan, C16 alkan, ili C18 alkan.
Takođe, u nekim primerima izvođenja, amino, hidroksil ili tiol grupa analoga glukagona je acilovana sa holesterol kiselinom. U specifičnom primeru izvođenja, analog glukagona je vezan za holesterol kiselinu preko alkilovanog des-amino Cys spejsera, tj., alkilovanog 3-merkaptopropionska kiselina spejsera. Alkilovani des-amino Cys spejser može biti, na primer, des-amino-Cys spejser koji sadrži dodekaetilen glikol deo. U jednom primeru izvođenja, analog glukagona sadrži strukturu:
Acilovani analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti dalje modifikovani tako da sadrže hidrofilnu grupu. U nekim specifičnim primerima izvođenja hidrofilni deo može da sadrži polietilen glikol (PEG) lanac. Ugradnja hidrofilnog dela može biti postiguta preko bilo kojih pogodnih načina, kao što je bilo koji od postupaka koji su ovde opisani. U tom smislu, acilovani analog glukagona može da sadrži SEQ ID NO: 1, uključujući bilo koju od modifikacija opisanih ovde, u kojima najmanje jedna od aminokiselina na položaju 10, 20, 24, i 29 analoga sadrži acil grupu i najmanje jedna od aminokiselina na položaju 16, 17, 21, 24 ili 29, položaju sa C-terminalnim produžetkom, ili C-terminalna aminokiselina su modifikovane u Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za hidrofilnu grupu (npr., PEG). U nekim primerima izvođenja, acil grupa je vezana za položaj 10, izborno preko spejsera koji sadrži Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i hidrofilni deo je ugrađen na Cys ostatku na položaju 24.
Alternativno, acilovani analog glukagona može da sadrži spejser, pri čemu je spejser i acilovan i modifikovan tako da sadrži hidrofilni deo. Neograničavajući primeri pogodnih spejsera obuhvataju jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Cys, Lys, Orn, homo-Cys i Ac-Phe.
Alkilacija
U skladu sa nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu (npr., nekodiranu alkilovanu aminokiselinu (npr., aminokiselinu koja sadrži alkil grupu koja je nenativna za aminokiselinu koja se javlja u prirodi)). Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, veruje se da alkilacija analoga glukagona postiže slične, ako ne iste, efekte kao acilacija analoga glukagona, npr., produženi polu-život u cirkulaciji, odloženi početak aktivnosti, produženo trajanje aktivnosti, poboljšana otpornost na proteaze, kao što je DPP-IV, povećana potencija na GLP-1 receptorima i receptorima za glukagon.
Alkilacija se može izvesti na bilo kojim položajima unutar analoga glukagona, uključujući bilo koji od položaja opisanih ovde kao mesto za acilaciju, uključujući, ali bez ograničenja na, bilo koji od aminokiselinskih položaja 1-29, aminokiselinog položaja C-terminalno prema 29. ostatku, npr., 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, itd., na položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili na C-terminusu, uz uslov da je zadržana aktivnost glukagona ili aktivnost GLP-1. Neograničavajući primeri obuhvataju položaje 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 ili 29. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 9, 10, 12, 16 i 20. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 10, 12 i 16. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od: 9, 10, 12, 16, i 20. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja 10 i 12. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži alkilovanu aminonokiselinu na položaju 12. U ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži C-terminalni produžetak i alkilovanu aminokiselinu na jednom ili više položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od 9, 10, 12, 16, 20 i 37-43 (npr., 40). Alkil grupa može biti kovalentno vezana direktno za aminokiselinu analoga glukagona, ili indirektno za aminokiselinu analoga glukagona preko spejsera, pri čemu je spejser postavljen između aminokiseline analoga glukagona i alkil grupe. Analog glukagona može biti alkilovan na istom aminokiselinskom položaju gde je vezan hidrofilni deo, ili na različitom aminoiselinskom položaju. Neograničavajući primeri obuhvataju alkilaciju na položaju 10 i pegilaciju na jednom ili više položaja u C-terminalnom delu analoga glukagona, npr., položaju 24, 28 ili 29, unutar C-terminalnog produžetka, ili na C-terminusu (npr., preko dodavanja C-terminalnog Cys).
U specifičnim aspektima, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži alkil grupu preko direktne alkilacije amina, hidroksila ili tiola bočnog lanca aminokiseline analoga glukagona. U nekim primerima izvođenja, alkilacija je na položaju 10, 20, 24 ili 29 analoga glukagona. U tom smislu, alkilovani analog glukagona može da sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO : 2, ili njenu modifikovanu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, sa najmanje jednom od aminokiselina na položajima 10, 20, 24 i 29 modifikovanom u bilo koju aminokiselinu koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu. U nekim specifičnim primerima izvođenja, direktna alkilacija analoga glukagona se javlja preko amino grupe, hidroksila ili tiola bočnog lanca aminokiseline na položaju 10.
U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amino grupu u bočnom lancu je aminokiselina formule I. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule I, je aminokiselina u kojoj je n jednako 4 (Lys) ili n je 3 (Orn).
U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži hidroksil u bočnom lancu je aminokiselina formule II. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule II je aminokiselina u kojoj je n jednako 1 (Ser).
U sledećim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži tiol u bočnom lancu je aminokiselina formule III. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina formule III je aminokiselina u kojoj je n jednako 1 (Cys).
U drugim primerima izvođenja, aminokiselina koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu je disupstituisana aminokiselina koja sadrži istu strukturu formule I, formule II, ili formule III, osim što je vodonik vezan za alfa ugljenik aminokiseline formule I, formule II, ili formule III zamenjen drugim bočnim lancem.
U nekim primerima izvođenja, alkilovani analog glukagona sadrži spejser između analoga i alkil grupe. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je kovalentno vezan za spejser, koji je kovalentno vezan za alkil grupu. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži alkil grupu putem alkilacije amino grupe, hidroksila ili tiola spejsera, pri čemu je spejser vezan za bočni lanac aminokiseline na položaju 10, 20, 24 ili 29 analoga glukagona. Aminokiselina za koju je vezan spejser može biti bilo koja aminokiselina koja sadrži deo koji omogućava vezu za spejser. Na primer, aminokiselina koja sadrži NH2, -OH ili –COOH u bočnom lancu (npr., Lys, Orn, Ser, Asp ili Glu) je pogodna. U tom smislu, alkilovani analog glukagona može da sadrži modifikovanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1, koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, sa najmanje jednom od aminokiselina na položajima 10, 20, 24 i 29 modifikovanom do bilo koju aminokiseline koja sadrži amono grupu, hidroksil ili karboksilat u bočnom lancu.
U nekim primerima izvođenja, spejser je aminokiselina koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu ili dipeptid ili tripeptid koji sadrži aminokiselinu koja sadrži amino grupu, hidroksil ili tiol u bočnom lancu.
Kada se alkilacija javi preko amino grupe spejsera, alkilacija može da se javi preko alfa amina aminokiseline ili amina bočnog lanca. U slučaju u kome je alfa amin alkilovan, aminokiselina spejsera može biti bilo koja aminokiselina. Na primer, aminokiselina spejsera može biti hidrofobna aminokiselina, npr., Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Met, Phe, Tyr, 6-amino heksanska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminooktanska kiselina. Alternativno, aminokiselina spejsera može biti kiseli ostatak, npr., Asp i Glu, uz uslov da se alkilacija javlja na alfa amino grupi kiselog ostatka. U slučaju u kome je amino grupa bočnog lanca aminokiseline spejsera alkilovana, aminokiselina spejsera je aminokiselina koja sadrži amino grupu bočnog lanca, npr., aminokiselina formule I (npr., Lys or Orn). U ovom slučaju, moguće je da obe, alfa amino grupa i amino grupa bočnog lanca aminokiseline spejsera budu alkilovane, tako da je analog glukagona dialkilovan. Primeri izvođenja opisa obuhvataju takve dialkilovane molekule.
[0105] Kada se alkilacija javi preko hidroksil grupe spejsera, aminokiselina ili jedna od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule II. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Ser.
[0106] Kada se alkilacija javi preko tiol grupe spejsera, aminokiselina ili jedna od aminokiselina dipeptida ili tripeptida može biti aminokiselina formule III. U specifičnom ilustrativnom primeru izvođenja, aminokiselina je Cys.
U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofilni bifunkcionalni spejser. U određenim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amino grupu, hidroksil, tiol, i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofilni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. U specifičnom primeru izvođenja, spjeser sadrži amino poli(alkiloksi)karboksilat. U tom smislu, spejser može da sadrži, na primer, NH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOH, gde je m ceo broj od 1 do 6 i n je ceo broj od 2 do 12, kao što je, npr., 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina, koja je komercijalno dostupna iz Peptides International, Inc. (Louisville, KY).
U nekim primerima izvođenja, spejser je hidrofobni bifunkcionalni spejser. U određenim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži dve ili više reaktivnih grupa, npr., amino grupu, hidroksil, tiol i karboksil grupu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži hidroksil grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži amino grupu i karboksilat. U drugim primerima izvođenja, hidrofobni bifunkcionalni spejser sadrži tiol grupu i karboksilat. Pogodni hidrofobni bifunkcionalni spejseri koji sadrže karboksilat i hidroksil grupu ili tiol grupu su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, 8-hidroksioktansku kiselinu i 8-merkaptooktansku kiselinu.
Spejser (npr., aminokiselina, dipeptid, tripeptid, hidrofilni bifunkcionalni spejser ili hidrofobni bifunkcionalni spejser) u specifičnim primerima izvođenja je dužine 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma, (npr., 6, 7, 8, 9 ili 10 atoma)). U specifičnijim primerima izvođenja, spjeser je dužine oko 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma) i alkil je C12 do C18 alkil grupa, npr., C 14 alkil grupa, C16 alkil grupa, tako da je ukupna dužina spejsera i alkil grupe 14 do 28 atoma, npr., oko 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28 atoma. U nekim primerima izvođenja, dužina spejsera i alkila je 17 do 28 (npr., 19 do 26, 19 do 21) atoma.
U skladu sa određenim gore navedenim primerima izvođenja, bifunkcionalni spejser može biti sintetička aminokiselina koja se ne javlja u prirodi ili nekodirana aminokiselina koja sadrži aminokiselinsku osnovu koja je dužine 3 do 10 atoma (npr., 6-amino heksanska kiselina, 5-aminovalerijanska kiselina, 7-aminoheptanska kiselina i 8-aminooktanska kiselina). Alternativno, spejser može biti dipeptidni ili tripeptidni spejser koji ima peptidnu osnovu koja je dužine 3 do 10 atoma (npr., 6 do 10 atoma). Dipeptidni ili tripeptidni spejser može biti sastavljen od aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili kodiranih aminokiselina i/ili nekodiranih aminokiselina ili kiselina koje se ne javljaju u prirodi, uključujući, na primer, bilo koju od aminokiselina koje su ovde navdene. U nekim primerima izvođenja, spejser sadrži ukupno negativno naelektrisanje, npr., sadrži jednu ili dve negativno naelektrisane aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, dipeptidni spejser je izabran iz grupe koja se sastoji od: Ala-Ala, β-Ala- β-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-aminobuterna kiselina- γ-aminobuterne kiseline i γ-Glu- γ-Glu.
Pogodni postupci peptidne alkilacije preko amina, hidroksila i tiola su poznati u stanju tehnike. Na primer, Williamson-ova sinteza etra miže biti korišćena za formiranje etarske veze između hidroksil grupe analoga glukagona i alkil grupe. Takođe, reakcija nukleofilne supstitucije peptida sa alkil halogenidom miže da rezultira u bilo kojoj od etarske, tioetarske ili amino veze.
Alkil grupa alkilovanog naloga glukagona može biti bilo koje veličine, npr., ugljenični lanac bilo koje dužine, i može biti linearna ili granata. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C4 do C30 alkil. Na primer, alkil grupa može biti bilo koji od sledećih: C4 alkil, C6 alkil, C8 alkil, C10 alkil, C12 alkil, C14 alkil, C16 alkil, C18 alkil, C20 alkil, C22 alkil, C24 alkil, C26 alkil, C28 alkil ili C30 alkil. U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je C8 do C20 alkil, npr., C14 alkil ili C16 alkil.
U nekim specifičnim primerima izvođenja, alkil grupa sadrži steroidni deo žučne kiseline, npr., holna kiselina, henodeoksiholna kiselina, deoksiholna kiselina, litoholna kiselina, tauroholna kiselina, glikoholna kiselina i holesterol kiselina.
U nekim primerima izvođenja opisa, analog glukagona sadrži alkilovanu aminokiselinu putem reakcije nukleofilnog, dugolančanog alkana sa analogom glukagona, pri čemu analog glukagona sadrži odlazeću grupu pogodnu za nukleofilnu supstituciju. U specifičnim aspektima, nukleofilna grupa dugolančanog alkana sadrži amino, hidroksil ili tiol grupu (npr., oktadecilamin, tetradekanol i heksadekantiol). Odlazeća grupa analoga glukagona može biti deo bočnog lanca aminokiseline ili može biti deo peptidne osnove. Pogodne odlazeće grupe obuhvataju, na primer, N-hidroksisukcinimid, halogene i sulfonatne estre.
U određenim primerima izvođenja, analog glukagona je modifikovan tako da sadrži alkil grupu putem reakcije nukleofilnog, dugolančanog alkana sa spejserom koji je vezan za analog glukagona, pri čemu spejser sadrži odlazeću grupu. U specifičnim aspektima, dugolančani alkan sadrži amino, hidroksil ili tiol grupu. U određenim primerima izvođenja, spejser koji sadrži odlazeću grupu može biti bilo koji spejser razmatran ovde, npr., aminokiseline, dipeptidi, tripeptidi, hidrofilni bifunkcionalni spejseri i hidrofobni bifunkcionalni spejseri koji dalje sadrže pogodnu odlazeću grupu.
U vezi sa ovim aspektima opisa, u kome je dugolančani alkan alkilovan analogom glukagona ili spejserom, dugolančani alkan može biti bilo koje veličine i može da sadrži ugljenični lanac bilo koje dužine. Dugolančani alkan može biti linearan ili granat. U određenim aspektima, dugolančani alkan je C4 do C30 alkan. Na primer, duglančani alkan može biti bilo koji od sledećih: C4 alkan, C6 alkan, C8 alkan, C10 alkan, C12 alkan, C 14 alkan, C16 alkan, C18 alkan, C20 alkan, C22 alkan, C24 alkan, C26 alkan, C28 alkan ili C30 alkan. U nekim primerima izvođenja, dugolančani alkan sadrži C8 do C20 alkan, npr., C14 alkan, C16 alkan ili C18 alkan.
Takođe, u nekim primerima izvođenja, alkilacija može da se javi između analoga glukagona i holesterol dela. Na primer, hidroksil grupa holesterola može da premesti odlazeću grupu na dugolančanom alkanu tako da se formira proizvod holesterol-analog glukagona.
Alkilovani analog glukagona koji je ovde opisan može biti dalje modifikovan tako da sadrži hidrofilni deo. U nekim specifičnim primerima izvođenja hidrofilni deo može da sadrži polietilen glikol (PEG) lanac. Ugradnja hidrofilnog dela može biti postignuta preko bilo kojih pogodnih sredstava, kao što su bilo koji od postupaka koji su ovde opisani. U tom smislu, alkilovani analog glukagona može da sadrži modifikovanu SEQ ID NO: 1 koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, u kojoj najmanje jedna od aminokiselina na položaju 10, 20, 24 i 29 sadrži alkil grupu i najmanje jedna od aminokiselina na položaju 16, 17, 21, 24 i 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka ili C-terminalna aminokiselina su modifikovane u Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za hidrofilni deo (npr., PEG). U nekim primerima izvođenja, alkil grupa je vezana za položaj 10, izborno preko spejsera koji sadrži Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i hidrofilni deo je ugrađen na Cys ostatku na položaju 24.
Alternativno, alkilovani analog glukagona može da sadrži spejser, pri čemu je spejser alkilovan i modifikovan tako da sadrži hidrofilni deo. Neograničavajući primeri pogodnih spejsera obuhvataju spejser koji sadrži jednu ili više aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od Cys, Lys, Orn, homo-Cys i Ac-Phe.
Stabilizacija alfa spirale i aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu
Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, analozi glukagona koji su ovde opisani sadrže spiralnu strukturu, npr., alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiseline koje stabilizuju alfa spiralnu strukturu. Prema tome, u nekim aspektima, analog glukagona sadrži jednu ili više aminokiselina koje stimulišu alfa spiralu. Kao što je ovde korišćen, termin "aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu" označava aminokiselinu koja obezbeđuje povećanu stabilnost alfa spirali analoga glukagona čiji je deo. Aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu su poznate u stanju tehnike. Videti, na primer, Lyu et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 88: 5317-5320 (1991); Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, Garland Publishing, New York, NY, 1991; Fasman, Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Confirmation, ed. Fasman, Plenum, NY, 1989). Pogodne aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu za ovde navedene svrhe obuhvataju, ali bez ograničenja na: alanin, norvalin, norleucin, alfa aminobuternu kiselinu, alfa-aminoizobuternu kiselinu, leucin, izoleucin, valin i slično. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je bilo koja aminokiselna koja je deo alfa spirale koja se nalazi u proteiniu koji se nalazi u prirodi, npr., Leu, Phe, Ala, Met, Gly, Ile, Ser, Asn, Glu, Asp, Lys, Arg.
U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu obezbeđuje veću stabilnost alfa spirali u poređenju sa glicinom ili alaninom. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina.
Alfa spirala: Položaj aminokiselina koje stimulišu alfa spiralu
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je slična nativnom glukagonu (SEQ ID NO: 1) i analog glukagona sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je locirana na bilo kom od položaja 12 do 29 (prema numeraciji nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1). U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 1 i sadrži najmanje jednu aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu, npr., na jednom ili više od položaja 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu na jednom, dva, tri ili svim od položaja 16, 17, 20 i 21.
Alfa spirala: alfa, alfa di-supstituisane aminokiseline
U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je alfa, alfa di-supstituisana aminokiselina. U specifičnim primerima izvođenja, alfa, alfa di-supstituisana aminokiselina sadrži R1 i R2, od kojih je svaki vezan za alfa ugljenik, pri čemu je svaki od R1 i R2 nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od C1-C4 alkila, izborno supstituisan sa hidroksil, amido, tiol, halo, ili R1 i R2 zajedno sa alfa ugljenikom za koji su vezani formiraju prsten (npr., C3-C8 prsten). U nekim primerima izvođenja, svaki od R1 i R2 je izabran iz grupe koja se sastoji od: metila, etila, propila i n-butila, ili R1 i R2 zajedno formiraju ciklooktan ili cikloheptan (npr., 1-aminociklooktan-1-karboksilna kiselina). U nekim primerima izvođenja, R1 i R2 su isti. U nekim primerima izvođenja, R1 je različit od R2. U određenim aspektima, svaki od R1 i R2 je C1-C4 alkil. U nekim aspektima, svaki od R1 i R2 je C1 ili C2 alkil. U nekim primerima izvođenja, svaki od R1 i R2 je metil, tako da je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina jednaka alfa-aminoizobuternoj kiselini (AIB).
U nekim aspektima, analozi glukagona koji su ovde opisani sadrže jednu ili više alfa, alfa di-supstituisanih aminokiselina i analozi glukagona specifično nemaju kovalentni intramolekulski most (npr., laktam), s obzirom na to da je alfa, alfa disupstituisana aminokiselina sposobna za stabilizaciju alfa spirale u odsustvu kovalentnog mosta. U nekim aspektima, analog glukagona sadrži jednu ili više alfa, alfa di-supstituisanih aminokiselina na C-terminusu (oko položaja 12-29). U nekim primerima izvođenja, jedan, dva, tri, četiri ili više od položaja 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 28 ili 29 analoga glukagona je supstituisan sa α, α-disupstituisanom aminokiselinom, npr., amino izo-buternom kiselinom (AIB), aminokiselinom disupstituisanom sa istom ili različitom grupom izabranom od metila, etila, propila, i n-butila, ili sa ciklooktanom ili cikloheptanom (npr., 1-aminociklooktan-1-karboksilna kiselina). Na primer, supstitucija na položaju 16 sa AIB pojačava aktinost GLP-1, u odsustvu intramolekulskog mosta, npr., ne-kovalentnog intramolekulskog mosta (npr., mosta soli) ili kovalentnog intramolekulskog mosta (npr., laktam). U nekim primerima izvođenja, jedan, dva, tri ili više od položaja 16, 20, 21 ili 24 su susptituisani sa AIB. U specifičnim primerima izvođenja, jedna ili obe od aminokiselina koje odgovaraju položajima 2, 16, nativnog humanog glukagona (SEQ ID NO: 1) su supstituisane sa alfa, alfa disupstituisanom aminokiselinom kao što je AIB.
U skladu sa nekim primerima izvođenja, analog glukagona koji nema intramolekulski most sadrži jednu ili više supstitucija unutar aminokiselinskih položaja 12-29 sa α, α-disupstituisanom aminokiselinom i acil ili alkil grupom kovalentno vezanom za bočni lanac aminokiseline na položaju 10 analoga glukagona. U specifičnim primerima izvođenja, acil ili alkil grupa se ne javlja u prirodi na aminokiselini. U određenim aspektima, acil ili alkil grupa je nenativna za aminokiselinu na položaju 10. Takvi acilovani ili alkilovani glukagon peptidi koji nemaju intramolekulski most ispoljavaju pojačanu aktivnost na GLP-1 receptorima i receptorima za glukagon u poređenju sa neacilovanim odgovarajućim peptidima. Dalje pojačanje u aktivnosti na GLP-1 receotrima i receptorima za glukagon može biti postignuto acilovanim glukagon peptidima koji nemaju intramolekulski most putem ugradnje spejsera između acil ili alkil grupe i bočnog lanca aminokiseline na položaju 10 analoga. Acilacija i alkilacija, sa ili bez ugradnje spejsera, su dalje ovde opisane.
Alfa spirala: Intramolekulski mostovi
U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je aminokiselina koja je vezana za drugu aminokiselinu analoga glukagona preko intramolekulskog mosta. U takvim primerima izvođenja, svaka od ove dve aminokiseline vezana preko intramolekulskog mosta smatra se aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži jedan ili dva intramolekulska mosta. U nekim specifičnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži jedan intramolekulski most u kombinaciji sa najmanje jednom drugom aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu, npr., alfa, alfa disupstituisanom aminokiselinom.
U nekim primerima izvođenja, intramolekulski most je most koji povezuje dva dela analoga glukagona preko nekovalentnih veza, uključujući, na primer, van der Waals-ove interakcije, vodonične veze, jonske veze, hidrofobne interakcije, dipol-dipol intrerakcije, i slično. U tom smislu, analog glukagona u određenim aspektima sadrži nekovalentni intramolekulski most. U nekim primerima izvođenja, nekovalentni intramolekulski most je most soli.
U nekim primerima izvođenja, intramolekulski most je most koji povezuje dva dela analoga preko kovalentnih veza. U tom smislu, analog glukagona u određenim aspektima sadrži kovalentni intramolekulski most.
U nekim primerima izvođenja, intramolekulski most (npr., nekovalentni intramolekulski most, kovalentni intramolekulski most) je formiran između dve aminokiseline koje su udaljene za 3 aminokiseline, npr., aminokiseline na položajima i i i+4, pri čemu je i bilo koji ceo broj između 12 i 25 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 i 25). Naročito, bočni lanci aminokiselinskih parova 12 i 16, 16 i 20, 20 i 24 ili 24 i 28 (aminokiselinski parovi u kojima je i = 12, 16, 20 ili 24) su vezani međusobno i na taj način stabilizuju alfa spiralu glukagona. Alternativno, i može biti 17. U nekim specifičnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži intramolekulski most između aminokiselina 17 i 21. U nekim specifičnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži intramolekulski most između aminokiselina na položajima 16 i 20 ili 12 i 16 i drugi intramolekulski most između aminokiselina na položajima 17 i 21. Ovde su razmatrani analozi glukagona koji sadrže jedan ili više intramolekulskih mostova. U specifičnim primerima izvođenja, gde su aminokiseline na položajima i i i+4 spojene intramolekulskim mostom, veličina linkera je oko 8 atoma, ili oko 7-9 atoma.
U drugim primerima izvođenja, intramolekulski most je formiran između dve aminokiseline koje su udaljene za dve aminokiseline, npr., aminokiseline na položajima j i j+3, gde je j bilo koji ceo broj između 12 i 26 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 i 26). U nekim specifičnim primerima izvođenja, j je 17. U specifičnim primerima izvođenja, gde su aminokiseline na položajima j i j+3 spojene intramolekulskim mostom, veličina linkera je oko 6 atoma, ili oko 5 do 7 atoma.
U drugim primerima izvođenja, intramolekulski most je formiran između dve aminoiseline koje su udaljene za 6 aminokiselina, npr., aminokiseline na položajima k i k+7, gde je k bilo koji ceo broj između 12 i 22 (npr., 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 i 22). U nekim specifičnim primerima izvođenja, k je 12, 13 ili 17. U ilustrativnim primerima izvođenja, k je 17.
Alfa spirala: aminokiseline uključene u intramolekulske mostove
Primeri aminokiselinskih parova koji su sposobni da se vezuju (kovalentno ili nekovalentno) tako da formiraju vezujući most od šest atoma obuhvataju Orn i Asp, Glu i aminokiselinu formule I, gde je n jednako 2, i homoglutaminsku kiselinu i aminokiselinu formule I, gde je n jednako 1, pri čemu, formula I je:
gde je n = 1 do 4
[Formula I]
Primeri aminokiselinskih parova koji su sposobni da se vezuju tako da formiraju vezujući most od sedam atoma obuhvataju Orn-Glu (laktamski prsten); Lys-Asp (laktam); ili Homoser-Homoglu (lakton). Primeri aminokiselinskih parova koji mogu da formiraju linker od osam atoma obuhvataju Lys-Glu (laktam); Homolys-Asp (laktam); Orn-Homoglu (laktam); 4-aminoPhe-Asp (laktam); ili Tyr-Asp (lakton). Primeri aminokiselinskih parova koji mogu da formiraju linker od devet atoma obuhvataju Homolys-Glu (laktam); Lys-Homoglu (laktam); 4-aminoPhe-Glu (laktam); ili Tyr-Glu (lakton). Bilo koji od bočnih lanaca na ovim aminokiselinama može dodatno biti supstituisan sa dodatnim hemijskim grupama, sve dok trodimenzionalna struktura alfa spirale nije narušena. Stručnjak iz date oblasti tehnike može predvideti alternativne parove ili alternativne aminokiselinske analoge, uključujući hemijski modifikovane derivate, koji bi stvorili stabilizujuću strukturu slične veličine i željenog efekta. Na primer, homocistein- homocistein disulfidni most je 6 atoma u dužinu i može biti dalje modifikovan tako da se obezbedi željeni efekat.
Čak bez kovalentne veze, aminokiselinski parovi opisani u prethodnom tekstu (ili slični parovi koje stručnjak iz date oblasti tehnike može da predvidi) mogu takođe da obezbede dodatnu stabilnost alfa spirali preko nekovalentnih veza, na primer, preko formiranja mostova soli ili vodoničnih veza. Prema tome, mostovi soli mogu biti formirani između: Orn i Glu; Lys i Asp; Homo-serina i Homo-glutamata; Lys i Glu; Asp i Arg; Homo-Lys i Asp; Orn i Homo-Glutamata; 4-aminoPhe i Asp; Tyr i Asp; Homo-Lys i Glu; Lys i Homo-Glu; 4-aminoPhe i Glu; ili Tyr i Glu. U nekim primerima izvođenja, analog sadrži most soli između bilo kog od parova aminokiselina: Orn i Glu; Lys i Asp; Lys i Glu; Asp i Arg; Homo-Lys i Asp; Orn i Homo-Glutamata; Homo-Lys i Glu; i Lys i Homo-Glu. Mostovi soli mogu biti formirani između drugih parova suprotno naelektrisanih bočnih lanaca. Videti, npr., Kallenbach et al., Role of the Peptide Bond in Protein Structure and Folding, in The Amide Linkage: Structural Significance in Chemistry, Biochemistry, and Materials Science, John Wiley & Sons, Inc. (2000).
U nekim primerima izvođenja, nekovalentni intramolekulski most je hidrofobni most. U skladu sa jednim primerom izvođenja, alfa spirala analoga je stabilizovana preko ugradnje hidrofobnih aminokiselina na položajima j i j+3 ili i i i+4. Na primer, i može biti Tyr i i+4 može biti Val ili Leu; i miže biti Phe i i+4 može biti Met; ili i može biti Phe i i+4 može biti Ile. Podrazumeva se da, za svrhe koje su ovde navedene, gore navedeni aminokiselinski parovi mogu biti obrnuti, tako da nazačena aminokiselina na položaju i mogla bi biti alternativno locirana na i+4, dok i+4 aminokiselina može biti locirana na položaju i. Takođe podrazumeva se da pogodni aminokiselinski parovi mogu biti formirani za j i j+3.
Alfa spirala: kovalentni intramolekulski most
U nekim primerima izvođenja, kovalentni intramolekulski most je laktam prsten ili laktam most. Veličina laktam prstena može da varira u zavisnosti od dužine aminokiselinskih bočnih lanaca, i u jednom primeru izvođenja laktam je formiran vezivanjem bočnih lanaca ornitina za bočni lanac asparaginske kiseline. Laktam mostovi i postupci za pripremu istih su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Houston, Jr., et al., J Peptide Sci 1: 274-282 (2004), i Primer 1 ovde. U nekim prmerima izvođenja, analog sadrži modifikovanu sekvencu od SEQ ID NO: 1 i laktam most između i i i+4, pri čemu je i kao što je ovde definisan u prethodnom tekstu. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži dva laktam mosta: jedan između aminokiselina na položajima 16 i 20 i drugi između aminokiselina na položajima 17 i 21. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži jedan laktam most i jedan most soli. Dodatni ilustrativni primeri izvođenja, su opisani ovde u delu pod naslovom "PRIMERI." Dodatni ilustrativni primeri izvođenja obuhvataju sledeće parove, izborno sa laktam mostom: Glu na položaju 12 sa Lys na položaju 16; nativni Lys na položaju 12 sa Glu na položaju 16; Glu na položaju 16 sa Lys na položaju 20; Lys na položaju 16 sa Glu na položaju 20; Glu na položaju 20 sa Lys na položaju 24; Lys na položaju 20 sa Glu na položaju 24; Glu na položaju 24 sa Lys na položaju 28; Lys na položaju 24 sa Glu na položaju 28.
U nekim primerima izvođenja, kovalentni intramolekulski most je lakton. Pogodni postupci za pripremu lakton mosta su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Sheehan et al., J Am Chem Soc 95: 875-879 (1973).
U nekim aspektima, olefin metateza je korišćena za unakrsno vezivanje jednog ili dva navoja alfa spirale analoga upotrebom sistema za unakrsno vezivanje koji je ceo od ugljovodonika. Analog glukagona u ovom slučaju sadrži α-metilovane aminokiseline koje nose olefinske bočne lance različite dužine i konfigurisane sa R ili S stereohemijom na j i j+3 ili i i i+4 položajima. U nekim primerima izvođenja, olefinski bočni lanac sadrži (CH2)n, gde je n bilo koji ceo broj između 1 do 6. U nekim primerima izvođenja, n je 3 za dužinu unakrsnog vezivanja od 8 atoma. U nekim primerima izvođenja, n je 2 za dužinu unakrsnog vezivanja od 6 atoma. Primer analoga glukagona koji sadrži olefinsku unakrsnu vezu je ovde opisan kao SEQ ID NO: 17. Pogodni postupci za formiranje takvih intramolekulskih mostova su opisani u stanju tehnike. Videti, na primer, Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000) i Walensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004). U alternativnim primerima izvođenja, analog sadrži O-alil Ser ostatke locirane na susednim navojima spirale, koji su premošćeni zajedno preko rutenijum-katalizovane metateze zatvaranja prstena. Takvi postupci unakrsnog vezivanja su opisani u, na primer, Blackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281-3284 (1998).
U specifičnim aspektima, upotreba neprirodne tio-dialanin aminokiseline, lantionina, koja je široko prihvaćena kao peptidomimetik cistina, korišćena je za unakrsno vezivanje jednog navoka alfa spirale. Pogodni postupci ciklizacije na bazi lantionina su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., J. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996); i Osapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993).
U nekim primerima izvođenja, α, ω-diaminoalkan lanci, npr., 1,4-diaminopropan i 1,5-diaminopentan) između dva Glu ostatka na položajima i i i+7 korišćeni su za stabilizaciju alfa spirale analoga. Takvi lanci dovode do formiranja mosta dužine 9-atoma ili više, u zavisnosti od dužine diaminoalkan lanca. Pogodni postupci za proizvodnju peptida unakrsno vezanih sa takvim lancima su opisani u stanju tehnike. Videti, na primer, Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997).
U drugim primerima izvođenja, disulfidni most je korišćen za unakrsno vezivanje jednog ili dva navoja alfa spirale analoga. Alternativno, modifikovani disulfidni most u kome su jedan ili oba atoma sumpora zamenjeni metilen grupom rezultirajući u izosternoj makrociklizaciji je korišćen za stabilizaciju alfa spirale analoga. Pogodni postupci modifikacije peptida sa disulfidnim mostovima ili ciklizacije na bazi sumpora opisani su u, na primer, Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991) i Rudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964).
U drugim primerima izvođenja, alfa spirala analoga je stabilizovana preko vezivanja atoma metala preko dva His ostatka ili His i Cys para koji se nalazi na j i j+3, ili i i i+4. Atom metala može biti, na primer, Ru(III), Cu(II), Zn(II) ili Cd(II). Takvi postupci stabiluzacije alfa spirale na bazi vezivanja metala su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990); i Ghadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997).
Alfa spirala analoga može alternativno biti stabilizovana preko drugih načina peptidne ciklizacije, pri čemu su ti načini prikazani u Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003). Alfa spirala može biti stabilizovana preko formiranja amidnog mosta, tioetarskog mosta, tioestarskog mosta, urea mosta, karbamatnog mosta, sulfonamidnog mosta i slično. Na primer, tioestarski most može biti formiran između C-terminusa i bočnog lanca Cys ostatka. Alternativno, tioestar može biti formiran preko bočnih lanaca aminokiselina koje imaju tiol (Cys) i karboksilnu kiselinu (npr., Asp, Glu). U sledećem postupku, unakrsno-vezujuće sredstvo, kao što je dikarboksilna ksielina, npr., suberinska kiselina (oktandionska ksielina), itd. može da uvede vezu između dve funkcionalne grupe aminokiselinskog bočnog lanca, kao što je slobodna amino, hidroksil, tiol grupa, i njihove kombinacije.
Peptidi otporni na DPP-IV
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 1 ili 2, ili na oba položaja 1 i 2, aminokiselinu koja postiže otpornost analoga glukagona na cepanje dipeptidil peptidazom IV (DPP IV). U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 1 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: D-histidina, dezaminohistidina, hidroksil-histidina, acetil-histidina, homo-histidina, N-metil histidina, alfa-metil histidina, imidazol sirćetne kiseline, ili alfa, alfa-dimetil imidiazol sirćetne kiseline (DMIA). U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 2 aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: D-serina, D-alanina, valina, glicina, N-metil serina, N-metil alanina ili alfa, aminoizobuterne kiseline. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži na položaju 2 aminokiselinu koja postiže otpornost analoga glukagona na DPP IV i aminokiselina koja postiže otpornost analoga glukagona na DPP IV nije D-serin.
U nekim aspektima, analog glukagona koji sadrži aminokiselinu koja postiže otpornost analoga glukagona na DPP IV dalje sadrži aminokiselinsku modifikaciju koja stabilizuje alfa spiralu koja se nalazi u C-terminalnom delu glukagona, npr., preko kovalentne veze između aminokiselina na položajima "i" i "i+4", npr., 12 i 16, 16 i 20, ili 20 i 24. U nekim primerima izvođenja, ova kovalentna veza je laktam most između glutaminske kiseline na položaju 16 i lizina na položaju 20. U nekim primerima izvođenja, ova kovalentna veza je intramolekulski most osim laktam mosta. Na primer, pogodni postupci kovalentnog vezivanja obuhvataju bilo koji od jednog ili više olefin metateza, ciklizacije na bazi lantionina, formiranja disulfidnog mosta ili modifikovanog mosta koji sadrži sumpor, upotrebe α, ω-diaminoalkan lanaca, formiranja metal-atom mostova, i drugih načina ciklizacije peptida.
Modifikacija položaja 1
U nekim specifičnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži (a) aminokiselinsku supstituciju His na položaju 1 sa velikom, aromatičnom aminokiselinom i (b) intramolekulski most koji stabilizuje tu alfa spiralu u C-terminalnom delu molekula (npr., oko položaja 12-29). U specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 1 je zamenjena sa Tyr, Phe, Trp, amino-Phe, nitro-Phe, hloro-Phe, sulfo-Phe, 4-piridil-Ala, metil-Tyr ili 3-amino Tyr. Intramolekulski most, u nekim primerima izvođenja, je bilo koji od onih koji su ovde opisani. U nekim aspektima, intramolekulski most je između bočnih lanaca dve aminokiseline koje su odvojene sa tri aminokiseline između, tj., između bočnih lanaca aminokiselina i i i+4. U nekim primerima izvođenja, intramolekulski most je laktam most. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži veliku, aromatičnu aminokiselinu na položaju 1 i laktam most između aminokiselina na položajima 16 i 20 analoga. Takav analog glukagona u nekim aspektima dalje sadrži jednu ili više (npr., dve, tri, četiri, pet ili više) drugih modifikacija koje su ovde opisane. Na primer, analog glukagona može da sadrži amid umesto C-terminalnog karboksilata. Takođe, u nekim primerima izvođenja, takvi analozi glukagona dalje sadrže jednu ili više od velikih alifatičnih aminoiselina na položaju 17, aminokiselinu koja sadrži imidazol na položaju 18, i pozitivno naelektrisanu aminokiselinu na položaju 19. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji sadrže modifikaciju na položaju 1 i intramolekulski most dalje sadrže aminokiselinsku sekvencu Ile-His-Gln na položajima 17-19. Takve modifikacije mogu biti napravljene bez uništavanja aktivnosti analoga glukagona na GLP-1 receptoru i receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona dodatno sadrži acilovani ili alkilovani aminokiselinski ostatak.
Modifikacija položaja 3
U nekim primerima izvođenja, treća aminokiselina od SEQ ID NO: 1 (Gln3) je supstituisana sa kiselim, baznim ili hidrofobnim aminokiselinskim ostatkom i takva modifikacija izaziva smanjenje aktivnosti receptora za glukagon. U nekim primerima izvođenja, kisela, bazna ili hidrofobna aminokiselina je glutaminska kiselina, ornitin, norleucin. U nekim aspektima, modifikacija sa jednim od ovih ostataka dovela je do toga da analog glukagona ispoljava značajno smanjenu ili uništenu aktivnost na receptoru za glukagon. Analozi glukagona koji su supstituisani sa, na primer, glutaminskom kiselinom, ornitinom ili norleucinom u nekim aspektima imaju oko 10% ili manje od aktivnosti nativnog glukagona na receptoru za glukagon, npr., oko 1-10%, ili oko 0.1-10%, ili više od oko 0.1%, ali manje od oko 10%, dok ispoljava najmanje 20% od aktivnosti GLP-1 na GLP-1 receptoru. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona ispoljavaju oko 0.5%, oko 1% ili oko 7% od aktivnosti nativnog glukagona, dok ispoljavaju najmanje 20% od aktivnosti GLP-1 na GLP-1 receptoru.
U nekim primerima izvođenja, glutamin na položaju 3 od SEQ ID NO: 1 analoga glukagona je supstituisan sa analogom glutamina bez značajnog gubitka aktivnosti na receptoru za glukagon, i u nekim slučajevima, sa pojačanjem aktivnosti na receptoru za glukagon. U nekim primerima izvođenja, analog glutamina je aminokiselina koja se javlja u prirodi ili koja se ne javlja u prirodi ili nekodirana aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I, II ili III:
Struktura I
Struktura II
Struktura III
gde R1 je C0-3 alkil ili C0-3 heteroalkil; R2 je NHR4 ili C1-3 alkil; R3 je C1-3 alkil; R4 je H ili C1-3 alkil; X je NH, O, ili S; i Y je NHR4, SR3 ili OR3. U nekim primerima izvođenja, X je NH ili Y je NHR4. U nekim primerima izvođenja, R1 je C0-2 alkil ili C1 heteroalkil. U nekim primerima izvođenja, R2 je NHR4 ili C1 alkil. U nekim primerima izvođenja, R4 je H ili C1 alkil. U ilustrativnim primerima izvođenja, obezbeđena je aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture I gde, R1 je CH2-S, X je NH, i R2 je CH3 (acetamidometil-cistein, C(Acm)); R1 je CH2, X je NH, i R2 je CH3 (acetildiaminobuterna kiselina, Dab(Ac)); R1 je C0 alkil, X je NH, R2 je NHR4, i R4 je H (karbamoildiaminopropanska kiselina, Dap(urea)); ili R1 je CH2-CH2, X je NH, i R2 je CH3 (acetilornitin, Orn(Ac)). U ilustrativnim primerima izvođenja, obezbeđena je aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture II gde, R1 je CH2, Y je NHR4, i R4 je CH3 (metilglutamin, Q(Me)); U ilustrativnim primerima izvođenja, obezbeđena je aminokiselina koja sadrži bočni lanac strukture III gde, R1 je CH2 i R4 je H (metionin-sulfoksid, M(O)); U specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 3 je supstituisana sa Dab(Ac). Na primer, agonisti glukagona mogu da sadrže modifikovanu aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 601 SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605 i SEQ ID NO: 606 sa spiska sekvenci međunarodne patentne prijave br. PCT/UTS2009/047438, koja je podneta 16.06.2009., pri čemu su ove aminokiselinske sekvence modifikovane kao što je dalje opisano ovde, npr., modifikovane tako da sadrže najmanje tri aminokiseline koje stimulišu alfa spiralu, modifikovane tako da sadrže (i) acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu na položaju 10, (ii) aminokiselinu koja stimuliše alfa spiralu na položaju 16, (iii) alifatičnu aminokiselinu na položaju 17 i/ili 18, i (iv) najmanje jednu naelektrisanu aminokiselinu lociranu C-terminalno prema položaju 27, i, izborno, dodatne modifikacije; modifikovane tako da sadrže najmanje tri aminokiseline od aminokisleina 18-24 eksendina-4 (SEQ ID NO: 8) na odgovarajućim položajima analoga glukagona.
Modifikacija položaja 7
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu SEQ ID NO: 1 sa aminokiselinskom modifikacijom na položaju 7. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 7 od SEQ ID NO: 1 (Thr) je supstituisana sa velikom, alifatičnom aminokiselinom, npr., Ile, Leu, Ala, i slično. Smatra se da takve modifikacije drastično smanjuju aktivnost analoga glukagona na GLP-1 receptoru.
Modifikacija položaja 15
U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona sadrže modifikovanu SEQ ID NO: 1 sa aminokiselinskom modifikacijom na položaju 15 koja poboljšava stabilnost. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 15 od SEQ ID NO: 1 je deletirana ili supstituisana sa glutaminskom kiselinom, homoglutaminskom kiselinom, cisteinskom kiselinom ili homocisteinskom kiselinom. Takve modifikacije smanjuju razgradnju ili cepanje analoga tokom vremena, naročito u kiselim ili alkalnim puferima, npr., puferima na pH unutar opsega od 5.5 do 8. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji sadrže ovu modifikaciju zadržavaju najmanje 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% od originalnog analoga posle 24 časa na 25°C.
Modifikacija položaja 16
U skladu sa jednim primerom izvođenja, obezbeđeni su analozi glukagona koji imaju pojačanu potenciju i izborno poboljšanu rastvorljivost i stabilnost. U jednom primeru izvođenja, pojačana potencija glukagona i GLP-1 obezbeđena je preko aminokiselinske modifikacije na položaju 16 nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1). Pomoću neograničavajućeg primera, takva pojačana potencija može biti obezbeđena supstitucijom serina koji se javlja u prirodi na položaju 16 sa glutaminskom kiselinom ili sa drugom negativno naelektrisanom aminokiselinom koja ima bočni lanac sa dužinom od 4 atoma, ili alternativno sa bilo kojom od glutamina, homoglutaminske kieline ili homocisteinske kiseline, ili naelektrisane aminokiseline koja ima bočni lanac koji sadrži najmanje jedan heteroatom, (npr., N, O, S, P) i sa dužinom bočnog lanca od oko 4 (ili 3-5) atoma. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu SEQ ID NO: 1 koja sadrži supstituciju Ser na položaju 16 sa aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina, homoglutaminske kiseline, homocisteinske kiseline, treonina ili glicina. U nekim aspektima, serinski ostatak na položaju 16 je supstituisan sa aminokiselinom izabranom iz grupe koja se sastoji od glutaminske kiseline, glutamina, homoglutaminske kiseline i homociteinske kiseline. U nekim specifičnim aspektima, serinski ostatak na položaju 16 je supstituisan sa glutaminskom kiselinom ili njenom konzervativnom supstitucijom (npr. eksendin-4 aminokiselinom).
U alternativnim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu sekvencu od SEQ ID NO: 1 modifikovanu supstitucijom Ser na položaju 16 sa Thr ili AIB ili drugom aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu kao što je opisana u prethodnom tekstu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekulski most sa aminokiselinom na j+3 ili i+4.
Modifikacija na položajima 17-18
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu SEQ ID NO: 1 u kojoj je dvobazno Arg-Arg mesto na položajima 17 i 18 eliminisano. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, veruje se da eliminacija dvobaznog mesta u nekim primerima izvođenja poboljšava in vivo efikasnost analoga glukagona. U nekim aspektima, analog glukagona je modifikovan u tom smislu supstitucijom jedne ili više aminokiselina na položajima 17 i 18 od SEQ ID NO: 1 sa aminokiselinom koja nije bazna, npr., sa alifatičnom aminokiselinom. U nekim primerima izvođenja, jedna od aminokiselina na položaju 17 ili 18 je deletirana ili aminokiselina je inserirana između položaja 17 i 18. U nekim primerima izvođenja, Arg na položaju 17 je supstituisan sa drugom aminokiselinom kao što je ovde opisana, npr., Gln, aminokiselinom koja sadrži hidrofilni deo, aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekulski most sa aminokiselinom na j+3 ili i+4. U nekim primerima izvođenja, Arg na položaju 18 je supstituisan sa drugom aminokiselinom kao što je ovde opisana. U primerima aspekata, aminokiselina na položaju 18 je alfa, alfa, disupstituisana aminokiselina, npr., AIB. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 18 je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala. U nekim spesifičnim aspektima, aminokiselina na položaju 18 je mala alifatična aminokiselina, npr., Ala, i Arg na položaju 17 ostaje nemodifikovan.
Modifikacija položaja 20
Pojačana aktivnost na GLP-1 receptoru je takođe obezbeđena aminokiselinskom modifikacijom na položaju 20. U nekim primerima izvođenja, glutamin na položaju 20 je zamenjen sa aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu, npr. AIB, kao što je opisana u prethodnom tekstu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekulski most sa aminokiselinom na j-3 ili i-4. U nekim specifičnim primerima izvođenja aminokiselina je hidrofilna aminokiselina koja ima bočni lanac koji je naelektrisan ili ima sposobnost da se vezuje vodoničnim vezama, i dužine je najmanje oko 5 (ili oko 4-6) atoma, na primer, lizin, citrulin, arginin ili ornitin, i izborno formira most soli sa drugom aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu na položaju 16, npr. negativno naelektrisanom aminokiselinom. Takve modifikacije u nekim posebnim aspektima smanjuju razgradnju koja se javlja preko deamidacije Gln i u nekim primerima izvođenja, povećavaju aktivnost analoga glukagona na GLP-1 receptoru. U nekim aspektima, aminokiselina na položaju 20 je Glu ili Lys ili AIB.
Modifikacija na položajima 21, 23, 24 i 28
U nekim primerima izvođenja, položaj 21 i/ili položaj 24 je modifikovan supstitucijom sa aminokiselinom koja stimuliše alfa spiralu. U nekim primerima izvođenja, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu formira nekovalentni intramolekulski most sa ainokiselinom na j-3 ili i-4. U nekim aspektima, aminokiselina koja stimuliše alfa spiralu je AIB.
U ilustrativnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 23 je Ile.
U primerima aspekata, aminokiselina na položaju 28 je alfa, alfa, disupstituisana aminokiselina, npr., AIB.
Naelektrisani C-terminus
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je modifikovan aminokiselinskim supstitucijama i/ili adicijama koje uvode naelektrisanu aminokiselinu u C-terminalni deo analoga. U nekim primerima izvođenja, takve modifikacije pojačavaju stabilnost i rastvorljivost. Kao što je ovde korišćen termin "naelektrisana aminokiselina" ili "naelektrisani ostatak" označava aminokiselinu koja sadrži bočni lanac koji je negativno naelektrisan (tj., de-protonovan) ili pozitivno naelektrisan (tj., protonovan) u vodenom rastvoru na fiziološkoj pH. U nekim aspektima, ove aminokiselinske supstitucije i/ili adicije koje uvode naelektrisane aminokiselinske modifikacije su na položaju C-terminalno prema položaju 27 od SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, jedna, dve ili tri (i u nekim slučajevima, više od tri) naelektrisane aminokiseline su uvedene unutar C-terminalnog dela (npr., položaj(i) C-terminalno prema položaju 27). U skladu sa nekim primerima izvođenja, nativna aminokiselina (aminokiseline) na položajima 28 i/ili 29 su supstituisane sa naelektrisanim aminokiselinama, i/ili u sledećem primeru izvođenja jedna do tri naelektrisane aminokiseline su takođe dodate C-terminusu analoga. U ilustrativnim primerima izvođenja, jedna, dve ili sve od naelektrisanih aminokiselina su negativno naelektrisane. Negativno naelektrisana aminokiselina u nekim primerima izvođenja je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, cisteinska kiselina, homocisteinska kiselina ili homoglutaminska kiselina. U nekim aspektima, ove modifikacije povećavaju rastvorljivost, npr., obezbeđuju najmanje 2-puta, 5-puta, 10-puta, 15-puta, 25-puta, 30-puta ili više veću rastvorljivost u odnosu na nativni glukagon na datoj pH između oko 5.5 i 8, npr., pH 7, kada je merena posle 24 časa na 25°C.
C-terminalno skraćenje
U skladu sa nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji su ovde opisani su modifikovani skraćenjem C-terminusa pomoću jednog ili dva aminokiselinska ostatka. Takvi modifikovani peptidi glukagona, kao što su ovde prikazani, zadržavaju sličnu aktivnost i potenciju na receptoru za glukagon i GLP-1 receptoru. U tom smislu, peptidi glukagona mogu da sadrže aminokiseline 1-27 ili 1-28 nativnog analoga glukagona (SEQ ID NO: 1), izborno sa bilo kojom od dodatnih modifikacija koje su ovde opisane.
C-terminus sa negativnim naelektrisanjem
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona sadrži modifikovanu SEQ ID NO: 1 u kojoj je karboksilna kiselina C-terminalne aminokiseline zamenjena grupom sa neutralnim naelektrisanjem, kao što je amid ili estar. Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, takve modifikacije u određenim aspektima povećavaju aktivnost analoga glukagona na GLP-1 receptoru. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, analog glukagona je amidovan peptid, tako da C-terminalni ostatak sadrži amid umesto alfa karboksilata aminokiseline. Kao što je ovde korišćena opšta referenca na peptid ili analog je određena tako da obuhvata peptide koji imaju modifikovani amino terminus, karboksi terminus, ili oba amino i karboksi terminuse. Na primer, aminokiselinski lanac koji sadrži amidnu grupu umesto terminalne karboksilne kiseline je određen tako da bude obuhvaćen bilo kojom aminokiselinskom sekvencom koja određuje standardne aminokiseline.
Druge modifikacije
U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona dodatno ili alternativno sadrže sledeće aminokiselinske modifikacije:
(i) supstitucija Ser na položaju 2 sa Ala;
(ii) supstitucija Tyr na položaju 10 sa Val ili Phe, ili Trp;
(iii) supstitucija Lys na položaju 12 sa Arg;
(iv) supstitucija Arg na položaju 17 sa Gln ili malom alifatičnom aminokiselinom, npr., Ala, ili velikom alifatičnom aminokiselinom, npr., Ile;
(v) supstitucija Arg na položaju 18 sa malom alifatičnom aminokiselinom, npr., Ala; ili aminokiselinom koja sadrži imidazol, npr., His;
(vi) supstitucija Ala na položaju 19 sa pozitivno naelektrisanom aminokiselinom, npr., Gln;
(vii) supstitucija Val na položaju 23 sa Ile, i
(viii) supstitucija Thr na položaju 29 sa Gly ili Gln.
U nekim primerima izvođenja, stabilnost analoga glukagona je povećana pomoću modifikacije metionina na položaju 27, na primer, supstitucijom sa leucinom ili norleucinom. Takve modifikacije mogu da smanje oksidativno razlaganje. Stabilnost takođe može biti povećana pomoću modifikacije Gln na položaju 20 ili 24 ili 28, npr., supstitucijom sa Ala, Ser, Thr ili AIB. Takve modifikacije mogu da smanje razlaganje koje se javlja preko deamidacije Gln. Stabilnost može biti povećana modifikacijom Asp na položaju 21, npr., supstitucijom sa drugim kiselim ostatkom, npr., Glu. Takve modifikacije mogu da smanje razlaganje koje se javlja preko dehidratacije Asp tako da se formira ciklični sukcinimidni intermedijer nakon čega sledi izomerizacija u izo-aspartat.
U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona koji su ovde opisani su glikozilovani, amidovani, karboksilovani, fosforilovani, esterifikovani, N-acilovani, ciklizovani preko, npr., disulfidnog mosta, ili prevedene u so (npr., kisela adiciona so, bazna adiciona so), i/ili izborno dimerizovani, multimerizovani ili polimerizovani ili konjugovani.
Bilo koja od modifikacija koje su ovde opisane, uključujući, na primer, modifikacije koje povećavaju ili smanjuju aktivnost na receptoru za glukagon i koja povećava aktivnost na GLP-1 receptoru, može biti primenjena pojedinačno ili u kombinaciji. Kombinacije modifikacija koje povećavaju aktivnost na GLP-1 receptoru mogu da obezbede veći aktivnost GLP-1 od bilo kojih drugih takvih modifikacija uzetih pojedinačno.
ILUSTRATIVNI PRIMERI IZVOĐENJA
Predmetni opisi obezbeđuju peptide koji sadrže strukturu sličnu onoj od nativnog humanog glukagona i ispoljavaju pojačanu agonističku aktivnost na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim humanim glukagonom. Glukagon normalno ima oko 1% aktivnosti nativnog-GLP-1 na GLP-1 receptoru, dok GLP-1 normalno ima manje od oko 0.01% od aktivnosti nativnog glukagona na receptoru za glukagon. Prema tome, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost veću od 1% aktivnosti nativnog-GLP-1 na GLP-1 receptoru. U ilustrativnim primerima izvođenja, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju veću od ili oko 5%, veću od ili oko 10%, veću od ili oko 15%, veću od ili oko 20%, veću od ili oko 25%, veću od ili oko 30%, veću od ili oko 35%, veću od ili oko 40%, veću od ili oko 45%, veću od ili oko 50%, veću od ili oko 55%, veću od ili oko 60%, veću od ili oko 65%, veću od ili oko 70%, veću od ili oko 75%, veću od ili oko 80%, veću od ili oko 85%, veću od ili oko 90%, ili veću od ili oko 95% od aktivnosti nativnog-GLP-1 na GLP-1 receptoru. U primerima aspekata, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju aktivnost na GLP-1 receptoru koja je veća od one od nativnog GLP-1. Prema tome, u primerima aspekata, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju veću od ili oko 100% od aktivnosti nativnog-GLP-1 na GLP-1 receptoru. U primerima aspekata, peptidi predmetnih otkrića ispoljavaju veću od ili oko 150%, veću od ili oko 200%, veću od ili oko 250%, veću od ili oko 300%, veću od ili oko 350%, veću od ili oko 400%, veću od ili about 450%, veću od ili oko 500%, veću od ili oko 550%, veću od ili oko 600%, veću od ili oko 650%, veću od ili oko 700%, veću od ili oko 750%, veću od ili oko 800%, veću od ili oko 850%, veću od ili oko 900%, veću od ili oko 950%, ili veću od ili oko 1000% od aktivnosti nativnog GLP-1 na GLP-1 receptoru.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 12.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 13.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 14.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 15.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 16 i ispoljava najmanje 100-puta veću selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
U ilustrativnim primerima izvođenja, peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 17.
Predmetni opisi dalje obezbeđuju varijante peptida koje sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je visoko slična sa aminokiselinskom sekvencom od jednog od trenutno opisanih peptida. U ilustrativnim primerima izvođenja, varijanta peptida predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90% ili 95% identična sa aminokiselinama 1-29 od aminokiselinske sekvence peptida bilo koje od SEQ ID NOs: 12-17, pri čemu varijanta peptida zadržava aktivnost ishodnog peptida na GLP-1 receptoru, receptoru za glukagon i GIP receptoru (npr., ispoljava najmanje 100-puta veću selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora), i izborno potenciju GLP-1 od najmanje 1%; ili pri čemu EC50 peptida na GIP receptoru je manje od 100-puta različita od njegove EC50 na GLP-1 receptoru). U ilustrativnim primerima izvođenja, varijanta peptida prema predmetnim opisima ispoljava najmanje 100-puta veću selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
U ilustrativnim primerima izvođenja, varijanta peptida prema predmetnim otkrićima sadrži aminokiselinsku sekvencu na bazi aminokiselinske sekvence peptida predmetnih otkrića, ali se razlikuje na jednom ili više aminokiselinskih položaja, uključujući, ali bez ograničenja na položaj 1, položaj 2, položaj 3, položaj 7, položaj 10, položaj 12, položaj 15, položaj 16, položaj 17, položaj 18, položaj 20, položaj 21, položaj 23, položaj 24, položaj 27, položaj 28, položaj 29. U primerima aspekata, varijanta peptida može da sadrži konzervativnu supstituciju u odnosu na ishodni peptid, može da sadrži bilo koju od aminokiselinskih modifikacija koje su ovde opisane, ili može da sadrži aminokiselinsku modifikaciju koja vraća do aminokiseline prisutne na tom položaju u sekvenci nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1). U primerima aspekata, varijanta peptida predmetnih otkrića sadrži aminokiselinsku sekvencu na bazi aminokiseline peptida predmetnih otkrića, ali se razlikuje na jedan ili više od sledećih načina:
a) varijanta peptida sadrži acilovanu aminokiselinu ili alkilovanu aminokiselinu;
b) acilovana aminokiselina ili alkilovana aminokiselina je zamenjena odgovarajućom aminokiselinom nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1) na tom položaju ili konzervativnom supstitucijom nativne aminokiseline, i izborno nova acilovana ili alkilovana aminokiselina je uvedena na različitom položaju;
c) varijanta peptida sadrži aminokiselinu kovalentno vezanu za hidrofilni deo;
d) aminokiselina kovalentno vezana za hidrofilni deo je zamenjena odgovarajućom aminokiselinom nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1) na tom položaju, i izborno nova aminokiselina kovalentno vezana za hidrofilni deo je uvedena na različitom položaju;
e) C-terminalna aminokiselina varijante peptida sadrži C-terminalni amid umesto C-terminalnog alfa karboksilata;
f) aminokiselina na bilo kom od položaja 1 do 29 je zamenjena odgovarajućom aminokiselinom nativnog glukagona (SEQ ID NO: 1) na tom položaju;
g) ili bilo koja njihova kombinacija.
U vezi sa bilo kojim od gore navedenih varijanti peptida, u ilustrativnim primerima izvođenja, varijanta peptida sadrži hidrofilni deo kovalentno vezan za aminokiselinu na položaju 16, 17, 21, 24, 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili na C-terminusu. U primerima aspekata, varijanta peptida sadrži Cys, Lys, Orn, homocistein, i Ac-Phe kovalentno vezan za hidrofilni deo, izborno, pri čemu je Cys, Lys, Orn, homocistein, ili Ac-Phe lociran na položaju 16, 17, 21, 24, 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili na C-terminusu varijante peptida. U primerima aspekata, hidrofilni deo je polietilen glikol.
U primerima aspekata, varijanta peptida sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu, izborno, na položaju 10. U primerima aspekata, varijanta peptida sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu koja sadrži C8 do C20 alkil lanac, C12 do C18 alkil lanac ili C14 ili C16 alkil lanac. U primerima aspekata, varijanta peptida sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu koja je acilovana ili alkilovana aminokiselina formule I, formule II ili formule III, izborno, pri čemu je aminokiselina formule I jednaka Lys.
U primerima aspekata, varijanta peptida predmetnih otkrića sadrži acilovanu ili alkilovanu aminokiselinu, gde je acil ili alkil grupa kovalentno vezana za aminokiselinu preko spejsera, izborno, pri čemu je spejser aminokiselina ili dipeptid. U ilustrativnim primerima izvođenja, spejser sadrži jedan ili dva kisela ostatka.
U bilo kom od gore navedenih ilustrativnih primera izvođenja, peptid ili varijanta peptida bilo kog od predmetnih otkrića ispoljava (EC50 na receptoru za glukagon)/(EC50 na GLP-1 receptoru) od oko 20 ili manje (npr., 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.10, 0. 05, 0.025, 0.01, 0.001).
U bilo kom od gore navedenih ilustrativnih primera izvođenja, peptid ili varijanta peptida bilo kog od predmetnih otkrića ispoljava (EC50 na receptoru za glukagon)/(EC50 na GLP-1 receptoru) od više od 20 (npr., 21, 25, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 750, 1000, ili više).
U bilo kom od prethodno navedenih ilustrativnih primera izvođenja, peptid ili varijanta peptida bilo kog od predmetnih otkrića ispoljava EC50 na GLP-1 receptoru koja je dva- do deset-puta (npr., 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-puta) veća od EC50 na receptoru za glukagon.
ISKLJUČENJA
U ilustrativnim primerima izvođenja, bilo koji od gore navedenih peptida je isključen iz analoga glukagona opisanih ovde, iako bilo koji od sledećih peptida koji sadrže jednu ili više dodatnih modifikacija kao što su ovde opisane ispoljavaju željenu GLP-1 ili ko-agonističku aktivnost, farmaceutske kompozicije, kompleti i postupci za lečenje upotrebom takvih jedinjenja mogu biti uključeni u otkriće: Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Arg12] supstitucijom i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Arg12,Lys20] supstitucijama i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Arg12,Lys24] supstitucijama i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Arg12,Lys29] supstitucijama i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Glu9] supstitucijom; Peptid od SEQ ID NO: 1 kome nedostaje His1, sa [Glu9, Glu16, Lys29] supstitucijama i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Glu9, Glu16, Lys29] supstitucijama i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Lys13, Glu17] supstitucijama vezanim preko laktam mosta i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 sa [Lys17, Glu21] supstitucijama vezanim preko laktam mosta i sa C-terminalnim amidom; Peptid od SEQ ID NO: 1 kome nedostaje His1, sa [Glu20, Lys24] supstitucijama vezanim preko laktam mosta. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona nije nijedan od peptida opisanih u bilo kojoj od međunarodne patentne prijave br. PCT/LTS2009/034448, koja je podneta 19.02.2009., i objavljena 26.08.2010., kao WO 2010/096052; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2009/068678, podnete 18.12.2009., i objavljene 26.08.2010., kao WO 2010/096142; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2009/047438, koja je podneta 15.06.2009., io objavljena 23.12.2009. kao WO 2009/155258; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2008/053857, podnete 13.02.2008., i objavljene 21.08.2008., kao WO 2008/101017; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2010/059724, podnete 9.12.2010.; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2009/047447, podnete 16.06.2009., i objavljene 28.01.2010., kao WO2010/011439; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2010/38825, podnete 16.06.2010., i objavljene 23.12.2010., kao WO2010/148089; međunarodne patentne prijave br. PCT/US2011/022608, podnete 26.01.2011.; i SAD privremene prijave br. 61/426,285, podnete 22.12.2010. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona ne obuhvata celu ili deo sekvence KRNRNNIA povezane sa C-terminusom posle položaja 29, npr. KRNR.
POSTUPCI ZA PRIPREMU PEPTIDA
Analozi glukagona otkrića mogu biti dobijeni pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike. Pogodni postupci de novo sinteze peptida su opisani u, na primer, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; i SAD patentu br. 5,449,752.
Takođe, u slučajevima u kojima analozi otkrića ne sadrže nijednu nekodiranu ili neprirodnu aminokiselinu, analog glukagona može biti rekombinantno proizveden upotrebom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu analoga upotrebom standardnih rekombinantnih postupaka. Videti, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994.
U nekim primerima izvođenja, izolovani su analozi glukagona otkirića. U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona otkića su prečišćeni. Poznato je da je "čistoća" relativan termin, i ne bi ga trebalo neophodno tumačiti kao apsolutnu čistoću ili apsolutno obogaćenje ili apsolutnu selekciju. U nekim aspektima, čistoća je najmanje ili oko 50%, je najmanje ili oko 60%, najmanje ili oko 70%, najmanje ili oko 80%, ili najmanje ili oko 90% (npr., najmanje ili oko 91%, najmanje ili oko 92%, najmanje ili oko 93%, najmanje ili oko 94%, najmanje ili oko 95%, najmanje ili oko 96%, najmanje ili oko 97%, najmanje ili oko 98%, najmanje ili oko 99% ili približno 100%.
U nekim primerima izvođenja, peptidi opisani ovde su komercijalno sintetisani od strane kompanija, kao što je Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) i Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). Sa tim u vezi , peptidi mogu biti sintetički, rekombinantni, izolovani i/ili prečišćeni.
KONJUGATI
Otkriće dalje daje konjugate koji sadrže jedan ili više analoga glukagona koji su ovde opisani konjugovane za heterologni deo, pri čemu konjugat ispoljava pojačanu aktivnost na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim glukagonom, i ispoljava najmanje 100-puta veću selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora. Kao što je ovde korišćen, termin "heterologni deo" je sinonim sa terminom "konjugat deo" i označava bilo koji molekul (hemijski ili biohemijski, koji se javlja u prirodi ili nekodiran) koji je različit od analoga glukagona koji su ovde opisani. Primeri konjugata delova koji mogu biti vezani za bilo koji od analoga koji su ovde opisani obuhvataju, ali bez ograničenja na heterologni peptid ili polipeptid (uključujući na primer, protein plazme), ciljno sredstvo, imunoglobulin ili njegov deo (npr., varijabilni region, CDR ili Fc region), dijagostički obeleživač kao što je radioaktivni izotop, fluorofora ili enzimatski obeleživač, polimer uključujući polimere rastvorljive u vodi, ili druga terapeutska ili dijagnostička sredstva. U nekim primerima izvođenja obezbeđen je konjugat koji sadrži analog predmetnog otkrića i protein plazme, pri čemu je protein plazme izabran iz grupe koja se sastoji od albumina, transferina, fibrinogena i globulina. U nekim primerima izvođenja deo proteina plazme od konjugata je albumin ili transferin. Konjugat u nekim primerima izvođenja sadrži jedan ili više analoga glukagona koji su ovde opisani i jedan ili više od: peptida (koji se razlikuje od aktivnih analoga glukagona receptora za glukagon i/ili GLP-1 receptora koji su ovde opisani), polipeptida, molekula nukleinske kiseline, antitela ili njegovog fragmenta, polimera, kvantne tačke, malog molekula, toksina, dijagnostičkog sredstva, ugljenog hidrata, aminokiseline.
U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je peptid koji je različit od aktivnih analoga receptora za glukagon i/ili GLP-1 receptora koji su ovde opisani i konjugat je fuzioni peptid ili himerni peptid. U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je peptidno produžetak od 1-21 aminokiselina. U specifičnim primerima izvođenja, produžetak je vezan za C-terminus analoga glukagona, npr., za aminokiselinu na položaju 29.
U nekim specifičnim aspektima, produžetak je jedna aminokiselina ili dipeptid. U specifičnim primerima izvođenja, produžetak sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: naelektrisane aminokiseline (npr., negativno naelektrisane aminokiseline (npr., Glu), pozitivno naelektrisane aminokiseline), aminokiseline koja sadrži hidrofilni deo. U nekim aspektima, produžetak je Gly, Glu, Cys, Gly-Gly, Gly-Glu.
U nekim primerima izvođenja, produžetak sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 9 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 10 (GGPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 8 (KRNRNNIA) ili SEQ ID NO: 11 (KRNR). U specifičnim aspektima, aminokiselinska sekvenca je vezana preko C-terminalne aminokiseline analoga glukagona, npr., aminokiseline na položaju 29. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca od SEQ ID NOs: 13-16 je vezana za aminokiselinu 29 analoga glukagona preko peptidne veze. U nekim specifičnim primerima izvođenja, aminokiselina na položaju 29 analoga glukagona je Gly i Gly je fuzionisan sa jednom od aminokiselinskih sekvenci od SEQ ID NOs: 8-11.
U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je polimer. U nekim primerima izvođenja, polimer je izabran iz grupe koja se sastoji od: poliamida, polikarbonata, polialkilena i njihovih derivata uključujući, polialkilen glikole, polialkilen okside, polialkilen tereftalate, polimere akrilnih i metakrilnih estara, uključujući poli(metilmetakrilat), poli(etil metakrilat), poli(butilmetakrilat), poli(izobutil metakrilat), poli(heksilmetakrilat), poli(izodecil metakrilat), poli(lauril metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), i poli(oktadecil akrilat), polivinil polimeri uključujući polivinil alkohole, polivinil etre, polivinil estre, polivinil halogenide, poli(vinil acetat), i polivinilpirolidon, poliglikolide, polisiloksane, poliuretane i njihove kopolimere, celuloze uključujući alkil celulozu, hidroksialkil celuloze, celulozne etre, celulozne estre, nitro celuloze, metil celulozu, etil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksi-propil metil celulozu, hidroksibutil metil celulozu, celuloza acetat, celuloza propionat, celuloza acetat butirat, celuloza acetat ftalat, karboksiletil celulozu, celuloza triacetat i celuloza sulfat natrijum so, polipropilen, polietilene uključujući poli(etilen glikol), poli(etilen oksid), i poli(etilen tereftalat), i polistiren.
U nekim aspektima, polimer je biorazgradivi polimer, uključujući sintetički biorazgradivi polimer (npr., polimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline, polianhidridi, poli(orto)estre, poliuretane, poli(buterna kiselina), poli(valerijanska kiselina) i poli(laktid-kokaprolakton)), i prirodni biorazgradivi polimer (npr., alginat i drugi polisaharidi uključujući dekstran i celulozu, kolagen, njihove hemijske derivate (supstitucije, adicije hemijskih grupa, na primer, alkil, alkilen, hidroksilacije, oksidacije i druge modifikacije rutinski napravljene od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike), albumin i druge hidrofilne proteine (npr., zein i druge poliamine i hidrofobne proteine)), kao i bilo koji kopolimer ili njegovu smešu. Uopšteno, ovi materijali se razlažu putem enzimatske hidrolize ili preko izlaganja vodi in vivo, putem površinske ili obilne erozije.
U nekim aspektima, polimer je bioadhezivni polimer, kao što je bioerodiblni hidrogen opisan od strane H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587, polihijaluronske kiseline, kazein, želatin, glutin, polianhidridi, poliakrilna kiselina, alginat, hitosan, poli(metil metakrilati), poli(etil metakrilati), poli(butilmetakrilat), poli(izobutil metakrilat), poli(heksilmetakrilat), poli(izodecil metakrilat), poli(lauril metakrilat), poli(fenil metakrilat), poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), poli(izobutil akrilat), i poli(oktadecil akrilat).
U nekim primerima izvođenja, polimer je polimer rastvorljiv u vodi ili hidrofilni polimer. Hidrofilni polimeri su dalje ovde opisani pod "Hidrofilni delovi." Pogodni polimeri rastvorljivi u vodi su poznati u stanju tehnike i obuhvataju, na primer, polivinilpirolidon, hidroksipropil celulozu (HPC; Klucel), hidroksipropil metilcelulozu (HPMC; Methocel), nitrocelulozu, hidroksipropil etilcelulozu, hidroksipropil butilcelulozu, hidroksipropil pentilcelulozu, metil celulozu, etilcelulozu (Ethocel), hidroksietil celulozu, različite alkil celuloze i hidroksialkil celuloze, različite celulozne etre, celuloza acetat, karboksimetil celulozu, natrijum karboksimetil celulozu, kalcijum karboksimetil celulozu, kopolimere vinil acetata/krotonske kiseline, poli-hidroksialkil metakrilat, hidroksimetil metakrilat, kopolimere metakrilne kiseline, polimetakrilnu kiselinu, polimetilmetakrilat, kopolimere anhidrida maleinske kiseline/metil vinil etra, polivinil alkohol, natrijum i kalcijum poliakrilnu kiselinu, poliakrilnu kiselinu, kisele karboksi polimere, karboksipolimetilen, karboksivinil polimere, polioksietilen polioksipropilen kopolimer, polimetilviniletar ko-anhidrid maleinske kiseline, karboksimetilamid, kalcijum metakrilat divinilbenzen ko-polimer, polioksietilenglikoli, polietilen oksid, i njihove derivate, soli i kombinacije.
U specifičnim primerima izvođenja, polimer je polialkilen glikol, uključujući, na primer, polietilen glikol (PEG).
U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je ugljeni hidrat. U nekim primerima izvođenja, ugljeni hidrat je monosaharid (npr., glukoza, galaktoza, fruktoza), disaharid (npr., saharoza, laktoza, maltoza), oligosaharid (npr., rafinoza, stahioza), polisaharid (skrob, amilaza, amilopektin, celuloza, hitin, kaloza, laminarin, ksilan, manan, fukoidan, galaktomanan.
U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je lipid. Lipid, u nekim primerima izvođenja, je masna kiselina, ejkozanoid, prostaglandin, leukotrien, tromboksan, N-acil etanolamin), glicerolipid (npr., mono-, di-, tri-supstituisani gliceroli), glicerofosfolipid (npr., fosfatidilholin, fosfatidilinozitol, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin), sfingolipid (npr., sfingozin, ceramid), sterol lipid (npr., steroid, holesterol), prenol lipid, saharolipid, ili poliketid, ulje, vosak, holesterol, sterol, vitamin rastvorljiv u masti, monoglicerid, diglicerid, triglicerid, fosfolipid.
U nekim primerima izvođenja, heterologni deo je vezan preko nekovalentne ili kovalentne veze za analog predmetnog otkrića. U određenim aspektima, heterologni deo je vezan za analog predmetnog otkrića preko linkera. Veza može biti postignuta preko kovalentnih hemijskih veza, fizičkih sila kao što su elektrostatička, vodonična, jonska, van der Waals-ove, ili hidrofobne ili hidrofilne interakcije. Mogu biti korišćeni različiti sistemi nekovalentnog spajanja, uključujući biotin-avidin, ligand/receptor, enzim/supstrat, nukleinska kiselina/vezujući protein nukleinske kiselne, lipid/vezujući protein lipida, partneri ćelijskih adhezionih molekula; ili bilo koji vezujući partneri ili njihovi fragmenti koji imaju afinitet jedan za drugog.
Analog glukagona u nekim primerima izvođenja je vezan za konjugovane delove preko direktne kovalentne veze reakcijom ciljanih aminokiselinskih ostataka analoga sa organskim derivatizujućim sredstvom koje je sposobno da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima ovih ciljanih aminokiselina. Reaktivne grupe na analogu ili konjugatnom delu obuhvataju, npr., aldehid, amino, estar, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupu. Derivatizujuća sredstva obuhvataju, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija preko cisteinskih ostataka), N-hidroksisukcinimid (preko lizinskih ostataka), glutaraldehid, anhidrid ćilibarne kiseline ili druga sredstva poznata u stanju tehnike. Alternativno, konjugatni delovi mogu biti vezani za analog indirektno preko intermedijernih nosača, kao što su polisaharidni ili polipeptidni nosači. Primeri polisaharidnih nosača obuhvataju aminodekstran. Primeri pogodnih polipeptidnih nosača obuhvataju polilizin, poliglutaminsku kiselinu, poliasparaginsku kiselinu, njihovi ko-polimeri i mešani polimeri ovih aminokiselina i drugih, npr., serina, za obezbeđivanje poželjnih osobina rastvorljivosti za rezultujući dodati nosač.
Cisteinil ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina, hloroacetamid da bi se dobili karboksimetil ili karboksiamidometil derivati. Cisteinil ostaci su takođe derivatizovani reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, alfa-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.
Histidil ostaci su derivatizovani reakcijom sa dietilpirokarbonatom na pH 5.5-7.0 zbog toga što je ovo sredstvo relativno specifično za histidil bočni lanac. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija je poželjno izvedena u 0.1 M natrijum kakodilatu na pH 6.0.
Lizinil i amino-terminalni ostaci su reagovali sa anhidridom ćilibarne ili anhidridima drugih karboksilnih kiselina. Derivatizacija sa ovim sredstvima ima efekat reverzije naelektrisanja lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrži alfa-amino obuhvataju imidoestre kao što su metil pikolinimidat, piridoksal fosfat, piridoksal, hloroborohidrid, trinitrobenzensulfonska kiselina, O-metilizourea, 2,4-pentandion i reakcija sa glioksilatom katalizovana transaminazom.
Arginil ostaci su modifikovani pomoću reakcije sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagenasa, među njima fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion, i ninhidrin. Derivatizacija argininskih ostataka zahteva da reakcija bude izvedena u alkalinnim uslovima zbog visoke pKa guanidin funkcionalne grupe. Pored toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i arginin epsilon-amino grupom.
Specifična modifikacija tirozil ostataka može biti napravljena, sa posebnim interesom u uvođenju spektralnih obeleživača u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće, N-acetilimidizol i tetranitrometan su korišćeni za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata, respektivno.
Karboksil bočne grupe (aspratil ili glutamil) su selektivno modifikovane reakcijom sa karbodiimidima (R-N=C=NR’), gde su R i R’ različite alkil grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil)karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)karbodiimid. Pored toga, aspartil i glutamil ostaci su prevedeni u asparaginil i glutaminil ostatke reakcijom sa amonijum jonima.
Druge modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksil grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), deamidaciju asparagina ili glutamina, acetilaciju N-terminalnog amina i/ili amidaciju ili esterifikaciju C-terminalne grupe karboksilne kiseline.
Sledeći tip kovalentne modifikacije obuhvata hemijsko ili enzimatsko kuplovanje glikozida za analog. Šećer(i) mogu biti vezani za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksil grupe, (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksil grupe kao što su one od serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatične ostatke kao što su oni od tirozina ili triptofana, ili (f) amidnu grupu glutamina. Ovi postupci su opisani u WO87/05330 objvaljenom 11.09.1987., i u Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za heterologni deo preko kovalentne veze između bočnog lanca aminokiseline analoga glukagona i heterolognog dela. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za heterologni deo preko bočnog lanca aminokiseline na položaju 16, 17, 21, 24 ili 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalne aminokiseline ili kombinacije ovih položaja. U nekim aspektima, aminokiselina kovalentno vezana za heterologni deo (npr., aminokiselina koja sadrži heterologni deo) je Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za heterologni deo.
U nekim primerima izvođenja, konjugat sadrži linker koji spaja analog glukagona za heterologni deo. U nekim aspektima, linker sadrži lanac od atoma od 1 do oko 60, ili 1 do 30 atoma ili duže, 2 do 5 atoma, 2 do 10 atoma, 5 do 10 atoma, ili 10 do 20 atoma dužine. U nekim primerima izvođenja, atomi lanca su svi atomi ugljenika. U nekim primerima izvođenja, atomi lanca u osnovi linkera su izabrani iz grupe koja se sastoji od C, O, N i S. Atomi lanca i linkeri mogu biti izabrani prema njihovoj očekivanoj rastvorljivosti (hidrofilnosti) tako da se obezbedi rastvorljiviji konjugat. U nekim primerima izvođenja, linker obezbeđuje funkcionalnu grupu koja je podvrgnuta cepanju enzimom ili drugim katalizatorom ili hidrolitičkim uslovima koji se nalaze u ciljnom tkivu ili organu ili ćeliji. U nekim primerima izvođenja, dužina linkera je dovoljno duga da smanji potencijal za prostornu prepreku. Ako je linker kovalentno vezan ili peptidil veza i konjugat je polipeptid, ceo konjugat može biti fuzioni protein. Takvi peptidil linkeri mogu biti bilo koje dužine. Primeri linkera su od oko 1 do 50 aminokiselina u dužinu, 5 do 50, 3 do 5, 5 do 10, 5 do 15, ili 10 do 30 aminokiselina u dužinu. Takvi fuzioni proteini mogu alternativno biti proizvedeni pomoću postupaka rekombinantnog genetičkog inženjeringa poznatih stručnjaku iz date oblasti tehnike.
Konjugati: Fc fuzije
Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, u nekim primerima izvođenja, analozi su konjugovani, npr., fuzionisani za imunoglobulin ili njegov deo (npr., varijabilni region, CDR, ili Fc region). Poznati tipovi imunoglobulina (Ig) obuhvataju IgG, IgA, IgE, IgD ili IgM. Fc region je C-terminalni region teškog lanca Ig, koji je odgovoran za vezivanje za Fc receptore koji izvršavaju aktivnosti kao to je reciklaža (koja rezultira u produženom polu-životu), ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
Na primer, prema nekim definicijama humani Fc region teškog lanca IgG se proteže od Cys226 do C-terminusa teškog lanca. "Zglobni region" generalno se proteže od Glu216 do Pro230 humanog IgG1 (zglobni regioni drugih IgG izotipova mogu biti poravnati sa IgG1 sekvencom poravnanjem cisteina uključenih u vezivanje cisteina). Fc region od IgG obuhvata dva konstanta domena, CH2 i CH3. CH2 domen humanog Fc regiona IgG obično se proteže od aminokiselina 231 do aminokiseline 341. CH3 domen gumanog Fc regiona IgG obično se proteže od aminokiselina 342 do 447. Pozivanje na aminokiselinsku numeraciju imunoglobulina ili fragmenata ili regiona imunoglobulina, su svi bazirani na Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md. U srodnim primerima izvođenja, Fc region može da sadrži jedan ili više nativnih ili modifikovanih konstatnih regiona iz teškog lanca imunoglobulina, osim CH1, na primer, CH2 i CH3 regione od IgG i IgA, ili CH3 i CH4 regione od IgE.
Pogodni konjugovani delovi obuhvataju delove imunoglobulinske sekvence koji obuhvataju FcRn vezujuće mesto. FcRn, spašavajući receptor, je odgovoran za reciklažu imunoglobulina i njihovo vraćanje u cirkulaciju krvi. Region Fc dela od IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisan je na osnovu rendgenske kristalografije (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Glavna površina kontakta Fc sa FcRn je blizu spoja CH2 i CH3 domena. Fc-FcRn kontakti su svi unutar jednog teškog lanca Ig. Glavna mesta kontakta obuhvataju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena.
Neki konjugatni delovi mogu ili ne moraju da obuhvataju FcγR vezujuće mesto(a). FcγR su odgovorni za ADCC i CDC. Primeri položaja unutar Fc regiona koji prave direktni kontakt sa FcγR su aminokiseline 234-239 (donji zglobni region), aminokiseline 265-269 (B/C petlja), aminokiseline 297-299 (C’/E petlja), i aminokiseline 327-332 (F/G) petlja (Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000). Donji zglobni region od IgE takođe je uključen u vezivanje FcRI (Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997). Ostaci uključeni u vezivanje IgA receptora opisani su u Lewis et al., (J Immunol. 175:6694-701, 2005). Aminokiselinski ostaci uključeni u vezivanje IgE receptora opisani su u Sayers et al. (J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004).
Aminokiselinske modifikacije mogu biti napravljene u Fc regionu imunoglobulina. Takve varijante Fc regiona sadrže najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u CH3 domenu Fc regiona (ostaci 342-447) i/ili najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju u CH2 domenu Fc regiona (ostaci 231-341). Mutacije za koje se veruje da daju povećani afinitet za FcRn obuhvataju T256A, T307A, E380A i N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). Druge mutacije mogu da smanje vezivanje Fc regiona za FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB i/ili FcγRIIIA bez značajnog smanjenja afiniteta za FcRn. Na primer, supstitucija Asn na položaju 297 Fc regiona sa Ala ili drugom aminokiselinom uklanja visoko konzervativno N-glikozilaciono mesto i može da rezultira u smanjenoj imunogenosti sa istovremenim produženim polu-životom Fc regiona, kao i smanjenim vezivanjem za FcγRs (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Napravljene su aminokiselinske modifikacije na položajima 233-236 od IgG1 koje smannuju vezivanje za FcγRs (Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613). Neke ilustrativne aminokiselinske supstitucije su opisane u SAD patentima 7,355,008 i 7,381,408.
Konjugati: hidrofilni delovi
Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti dalje modifikovani tako da poboljšaju njegovu rastvorljivost i stabilnost u vodenim rastvorima na fiziološkoj pH, uz zadržavanje visoke biološke aktivnosti u odnosu na nativni glukagon. Hidrofilni delovi kao što su PEG grupe mogu biti vezani za analoge pod bilo kojim pogodnim uslovima korišćenim za reakciju proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Bilo koji načini poznati u stanju tehnike mogu biti korišćeni, uključujući preko acilacije, reduktivne alkilacije, Michael-ove adicije, tiol alkilacije ili drugih postupaka hemoselektivne konjugacije/ligacije preko reaktivne grupe na PEG delu (npr., aldehidna, amino, estarska, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa) za reaktivnu grupu na ciljnom jedinjenju (npr., aldehidna, amino, estarska, tiol, α-haloacetil, maleimido ili hidrazino grupa). Aktivirajuće grupe koje mogu biti korišćene za vezivanje polimera rastvorljivog u vodi za jedan ili više proteina obuhvataju bez ograničenja sulfon, maleimid, sulfhidril, tiol, triflat, trezilat, azidirin, oksiran, 5-piridil i alfa-helogenizovanu acil grupu (npr., alfa jodo sirćetna kiselina, alfa-bromosirćetna kiselina, alfa-hlorosirćetna kiselina). Ako je vezan za analog putem reduktivne alkilacije, izabrani polimer bi trebalo da ima jedan reaktivni aldehid tako da je stepen polimerizacija kontrolisan. Videti, na primer, Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002); i Zalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995).
U specifičnim aspektima, aminokiselinski ostatak analoga koji ima tiol je modifikovan sa hidrofilnim delom kao što je PEG. U nekim primerima izvođenja, tiol je modifikovan sa maleimidom-aktiviranim PEG u Michael-ovoj reakciji adicije da bi se dobio PEGilovani analog koji sadrži tioetarsku vezu prikazanu u daljem tekstu:
U nekim primerima izvođenja, tiol je modifikovan sa haloacetilom-aktiviranim PEG u reakciji nukleofilne supstitucije da bi se dobio PEGilovani analog koji sadrži tioetarsku vezu prikazanu u daljem tekstu:
Pogodni hidrofilni delovi obuhvataju polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol, polioksietilovane poliole (npr., POG), polioksietilovani sorbitol, polioksietilovanu glukozu, polioksietilovani glicerol (POG), polioksialkilene, polietilen glikol propionaldehid, kopolimere etilen glikola/propilen glikola, monometoksi-polietilen glikol, mono-(C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol, karboksimetilcelulozu, poliacetale, polivinil alkohol (PVA), polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilena/anhidrida maleinske kiseline, poli (beta-aminkiseline) (homopolimeri ili slučajni kopolimeri), poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, propropilen glikol homopolimeri (PPG) i drugi polialkilen oksidi, kopolimeri polipropilen oksida/etilen kopolimeri, kiseline debelog creva ili drugi polisaharidni polimeri, Ficoll ili dekstran ili njihove smeše. Dekstrani su polisaharidni polimeri glukoznih podjedinica, pretežno vezani preko α1-6 veza. Dekstran je dostupan u mnogim opsezima molekulskih težina, npr., oko 1 kD to oko 100 kD, ili od oko 5, 10, 15 ili 20 kD do oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ili 90 kD. Razmatrani su linearni ili granati polimeri polimeri. Rezultirajući preparati konjugata mogu biti uglavnom monodisperzni ili polidisperzni, i mogu imati oko 0.5, 0.7, 1, 1.2, 1.5 ili 2 polimerna dela po analogu.
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za hidrofilni deo preko kovalentne veze između bočnog lanca aminokiseline analoga glukagona i hidrofilnog dela. U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je konjugovan za hidrofilni deo preko bočnog lanca aminokiseline na položaju 16, 17, 21, 24 ili 29, položaju unutar C-terminalnog produžetka, ili C-terminalne aminoiseline, ili kombinacije ovih položaja. U nekim aspektima, aminokiselina kovalentno vezana za hidrofilni deo (npr., aminokiselina koja sadrži hidrofilni deo) je Cys, Lys, Orn, homo-Cys ili Ac-Phe, i bočni lanac aminokiseline je kovalentno vezan za hidrofilni deo (npr., PEG).
Konjugati: rPEG
U nekim primerima izvođenja, konjugat predmetnog otkrića sadrži analog koji ima aktivnost agonista glukagona i/ili GLP-1 fuzionisan za pomoćni analog koji je sposoban da formira produženu konformaciju sličnu hemijskom PEG (npr., rekombinantni PEG (rPEG) molekul), kao što su oni opisani u objavi međunarodne patentne prijave br. WO2009/023270 i objavi SAD patentne prijave br. US20080286808. rPEG molekul u nekim aspektima je polipeptid koji sadrži jedan ili više od glicina, serina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline, alanina ili prolina. U nekim aspektima, rPEG je homopolimer, npr., poli-glicin, poli-serin, poli-glutaminska kiselina, poli-asparaginska kiselina, polialanin, ili poli-prolin. U drugim primerima izvođenja, rPEG sadrži ponovljena dva tipa aminokiselina, npr., poli(Gly-Ser), poli(Gly-Glu), poli(Gly-Ala), poli(Gly-Asp), poli(Gly-Pro), poli(Ser-Glu), itd. U nekim aspektima, rPEG sadrži tri različita tipa aminokiselina, npr., poli(Gly-Ser-Glu). U specifičnim aspektima, rPEG povećava polu-život analoga agonista glukagona i/ili GLP-1. U nekim aspektima, rPEG sadrži ukupno pozitivno ili ukupno negativno naelektrisanje. rPEG u nekim aspektima nema sekundarnu strukturu. U nekim primerima izvođenja, rPEG je veći od ili jednak 10 aminokiselina u dužinu i u nekim primerima izvođenja je oko 40 do oko 50 aminokiselina u dužinu. Pomoćni peptid u nekim aspektima je fuzionisan za N- ili C-terminus analoga predmetnog otikrića preko peptidne veze ili mesta cepanja proteinazom, ili je inseriran u petlje analoga predmetnog otkrića. rPEG u nekim aspektima sadrži afinitetni obeleživač ili je vezan za PEG koji je veći od 5 kDa. U nekim primerima izvođenja, rPEG daje analog prema predmetnom otkriću sa povećanim hidrodinamičkim radijusom, polu-životom u serumu, otpornošću na proteazu ili rastvorljivošću i u nekim aspektima daje analog sa smanjenom imunogenošću.
Konjugati: multimeri
Otkriće dalje daje multimere ili dimere analoga koji su ovde opisani, uključujući homo- ili heteromultimere ili homo- ili hetero- dimere. Dva ili više od analoga mogu biti vezani zajedno upotrebom standardnih vezujućih sredstava i postupaka poznatih stručnjaku iz date oblasti tehnike. Na primer, dimeri mogu biti formirani između dva peptida preko upotrebe bifunkcionalnih tiol unakrsnih linkera i bi-funkcionalnih amino unakrsnih linkera, naročito za analoge koji su supstituisani sa ostacima cisteina, lizina, ornitina, homocisteina ili acetil fenilalanina. Dimer može biti homodimer ili alternativno može biti heterodimer. U određenim primerima izvođenja, linker koji vezuje dva (ili više) analoga je PEG, npr., 5 kDa PEG, 20 kDa PEG. U nekim primerima izvođenja, linker je disulfidna veza. Na primer, svaki monomer dimera može da sadrži Cys ostatak (npr., terminalni ili interno pozicionirani Cys) i atom sumpora svakog Cys ostatka učestvuje u formiranju disulfidne veze. U nekim aspektima, monomeri su vezani preko terminalnih aminokiselina (npr., N-terminalnih ili C-terminalnih), preko internih aminokiselina, ili preko terminalne aminokiseline najmanje jednog monomera i interne aminokiseline najmanje jednog drugog monomera. U specifičnim aspektima, monomeri nisu vezani preko N-terminalne aminoiseline. U nekim aspektima, monomeri multimera su vezani zajedno u "rep-ka-repu" orijentaciji u kojoj su C-terminalne aminokiseline svakog monomera vezane zajedno.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE, UPOTREBE I KOMPLETI
Soli
U nekim primerima izvođenja, analog glukagona je u obliku soli, npr., farmaceutski prihvatljive soli. Kao što je ovde korišćen termin "farmaceutski prihvatljiva so" označava soli jedinjenja koje zadržavaju biološku aktivnost ishodnog jedinjenja, i koja nisu biološki ili na drugi način nepoželjna. Takve soli mogu biti pripremljene in situ u toku krajnje izolacije i prečišćavanja analoga, ili posebno pripremljene reakcijom funkcionalne grupe slobodne baze sa pogodnom kiselinom. Mnoga od jedinjenja koja su ovde opisana su sposobna da formiraju kisele i/ili bazne soli pomoću prisustva amino i/ili karboksil grupa ili grupa koje su njima slične.
Farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli mogu biti pripremljene od neorganskih ili organskih kiselina. Reprezentativne kisele adicione soli obuhvataju, ali bez ograničenja na acetat, adipat, alginat, citrat, aspartat, benzoat, benzensulfonat, bisulfat, natrijum bisulfat, butirat, kamforat, kamfor sulfonat, diglukonat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanoat, fumarat, hidrohlorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat (izotionat), laktat, maleat, metan sulfonat, nikotinat, 2-naftalen sulfonat, oksalat, palmitoat, pektinat, persulfat, 3-fenilpropionat, pikrat, pivalat, propionat, sukcinat, sulfat, tartrat, tiocijanat, fosfat, glutamat, bikarbonat, p-toluensulfonat i undekanoat. Soli poreklom od neorganskih kiselina obuhvataju hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu, azotnu kiselinu, fosofornu kiselinu i slično. Soli poreklom od organskih kiselina obuhvataju sirćetnu kiselinu, trifluorosirćetnu kiselinu, propionsku kiselinu, glikolnu kiselinu, piruvinsku kiselinu, oksalnu kiselinu, jabučnu kiselinu, malonsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu, maleinsku kiselinu, fumarnu kiselinu, vinsku kiselinu, limunsku kiselinu, benzojevu kiselinu, cimetnu kiselinu, bademovu, metansulfonsku kiselinu, etansulfonsku kiselinu, p-toluen-sulfonsku kiselinu, salicilnu kiselinu i slično. Primeri kiselina koje mogu biti korišćene tako da formiraju farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli obuhvataju, na primer, neorgansku kiselinu, npr., hlorovodoničnu kiselinu, bromovodoničnu kiselinu, sumpornu kiselinu i fosfornu kiselinu, i organsku kiselinu, npr., oksalnu kiselinu, maleinsku kiselinu, ćilibarnu kiselinu i limunsku kiselinu.
Bazne adicione soli takođe mogu biti pripremljene in situ u toku krajnje izolacije i prečišćavanja izvora salicilne kiseline, ili reakcijom dela koji sadrži karboksilnu kiselinu sa pogodnom bazom kao što je hidroksid, karbonat ili bikarbonat farmaceutski prihvatljivog katjona metala ili sa amonijakom ili organskim primarnim, sekundarnim ili tercijarnim aminom. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju, ali bez ograničenja na, katjone na bazi alkalnih metala ili zemnoalkalnih metala kao što su litijum, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum i aluminijum soli, i slično, i netoksične kvaternarne amonijum i amino katjone uključujući amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamonijum, dimetilamonijum, trimetilamonijum, trietilamonijum, dietilamonijum i etilamonijum, pored ostalih. Drugi reprezentativni organski amini korisni za formiranje baznih adicionih soli obuhvataju, na primer, etilendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperidin, piperazin i slično. Soli poreklom od organskih baza obuhvataju, ali bez ograničenja na, soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina.
Pored toga, bazne grupe koje sadrže azot mogu biti kvaternizovane sa analogom predmetnog otkrića kao niži alkil halogenidi kao što su metil, etil, propil i butil hloridi, bromidi i jodidi; dugolančani halogenidi kao što su decil, lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi; arilalkil halogenidi kao što su benzil i fenetil bromidi i drugi. Na taj način su dobijeni proizvodi koji su rastvorljivi ili disperzibilni u vodi ili ulju.
Formulacije
U skladu sa nekim primerima izvođenja, obezbeđena je farmaceutska kompozicija pri čemu kompozicija sadrži analog glukagona predmetnog otkrića ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija može da sadrži bilo koji farmaceutski prihvatljiv sastojak, uključujući, na primer, acidifikujuća sredstva, aditive, adsorbente, propelante aerosola, sredstva za istiskivanje vazduha, alkalizujuća sredstva, sredstva protiv lepljenja, antikoagulante, antimikrobne konzervanse, antioksidante, antiseptike, baze, vezujuća sredstva, puferujuća sredstva, helatirajuća sredstva, sredstva za oblaganje, sredstva za bojanje, desikante, deterdžente, razblaživače, sredstva za dezinfekciju, sredstva za raspadanje, dispergujuća sredstva, sredstva za povećanje rastvaranja, boje, omekšivače, emulgujuća sredstva, stabilizatore emulzije, punioce, sredstva za formiranje filma, pojačivače arome, arome, pojačivače protoka, gelirajuća sredstva, granulaciona sredstva, humektante, lubrikante, mukoadhezive, baze masti, masti, uljane nosače, organske baze, baze za pastile, pigmente, plastifikatore, polirajuća sredstva, konzervanse, sekvestirajuća sredstva, sredstva za prodiranje kroz kožu, solubilizujuća sredstva, rastvarače, stabilizujuća sredstva, baze za supozitorije, površinski aktivna sredstva, surfaktante, suspendujuća sredstva, zaslađivače, terapeutska sredstva, sredstva za zgušnjavanje, sredstva za regulaciju izotoničnosti, sredstva za regulaciju toksičnosti, sredstva za povećanje viskoznosti, sredstva za apsorpciju vode, korastvarači koji se mešaju sa vodom, omekšivači vode ili sredstva za vlaženje.
U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koju ili kombinaciju sledećih komponenti: akacija, acesulfam kalijum, acetiltributil citrat, acetiltrietil citrat, agar, albumin, alkohol, dehidratisani alkohol, denaturisani alkohol, razblaženi alkohol, aleuritinska kiselina, alginska kiselina, alifatični poliestri, alumina, aluminijum hidroksid, aluminijum stearat, amilopektin, α-amiloza, askrobinska kiselina, askorbil palmitat, aspartam, bakteriostatička voda za injekciju, bentonit, bentonit magma, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzoeva kiselina, benzil alkohol, benzil benzoat, bronopol, butilovan hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, butilparaben, butilparaben natrijum, kalcijum alginat, kalcijum askorbat, kalcijum karbonat, kalcijum ciklamat, dvobazni anhidrovani kalcijum fosfat, dvobazni dehidrat kalcijum fosfat, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum propionat, kalcijum silikat, kalcijum sorbat, kalcijum stearat, kalcijum sulfat, kalcijum sulfat hemihidrat, ulje od uljane repice, karbomer, ugljen dioksid, karboksimetil celuloza kalcijum, karboksimetil celuloza natrijum, β-karoten, karaginan, ricinusovo ulje, hidrogenisano ricinusovo ulje, katjonski emulgujući vosak, celuloza acetat, celuloza acetat ftalat, etil celuloza, mikrokristalna celuloza, celuloza u prahu, silicifikovana mikrokristalna celuloza, natrijum karboksimetil celuloza, cetostearil alkohol, cetrimid, cetil alkohol, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, holesterol, hlorheksidin acetat, hlorheksidin glukonat, hlorheksidin hidrohlorid, hlorodifluoroetan (HCFC), hlorodifluorometan, hlorofluorokarboni (CFC) hlorofenoksietanol, hloroksilenol, čvrste supstance kukuruznog sirupa, anhidrovana limunska kiselina, monohidrat limunske kiseline, kakao puter, sredstva za bojenje, kukuruzno ulje, ulje od semena pamuka, krezol, m-krezol, o-krezol, p-krezol, kroskarmeloza natrijum, krospovidon, ciklaminska kiselina, ciklodekstrini, dekstrati, dekstrin, dekstroza, anhidrovana dekstroza, diazolidinil urea, dibutil ftalat, dibutil sebacat, dietanolamin, dietil ftalat, difluoroetan (HFC), dimetil-β-ciklodekstrin, jedinjenja tipa ciklodekstrina kao što je Captisol®, dimetil etar, dimetil ftalat, dikalijum edentat, dinatrijum edentat, dinatrijum hidrogen fosfat, dokusat kalcijum, dokusat kalijum, dokusat natrijum, dodecil galat, dodeciltrimetilamonijum bromid, edentat kalcijum dinatrijum, etilendiamintetrasirćetna kiselina, eglumin, etil alkohol, etilceluloza, etil galat, etil laurat, etil maltol, etil oleat, etilparaben, etilparaben kalijum, etilparaben natrijum, etil vanilin, fruktoza, tečna fruktoza, mlevena fruktoza, fruktoza bez pirogena, fruktoza u prahu, fumarna kiselina, želatin, glukoza, tečna glukoza, gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, glicerin, gliceril behenat, glicerl monooleat, gliceril monostearat, samo-emulgujući gliceril monostearat, gliceril palmitostearat, glicin, glikoli, glikofurol, guar guma, heptafluoropropan (HFC), heksadeciltrimetilamonijum bromid, visoko fruktozni sirup, humani serum albumin, ugljovodonici (HC), razblažena hlovorodonična kiselina, hidrogenisano biljno ulje, tip II, hidroksietil celuloza, 2-hidroksietil-β-ciklodekstrin, hidroksipropil celuloza, nisko-supstituisana hidroksipropil celuloza, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza ftalat, imidurea, indigo karmin, jonski izmenjivači, gvožđe oksidi, izopropil alkohol, izopropil miristat, izopropil palmitat, izotičan fiziološki rastvor, kaolin, mlečna kiselina, laktitol, laktoza, lanolin, lanolin alkoholi, anhidrovani lanolin, lecitin, magnezijum aluminijum silikat, magnezijum karbonat, normalni magnezijum karbonat, anhidrovani magnezijum karbonat, magnezijum karbonat hidroksid, magnezijum hidroksid, magnezijum lauril sulfat, magnezijum oksid, magnezijum silikat, magnezijum stearat, magnezijum trisilikat, anhidrovani magnezijum trisilikat, jabučna kiselina, slad, maltitol, rastvor maltitola, maltodekstrin, maltol, maltoza, manitol, trigliceridi srednje dužine lanca, meglumin, mentol, metilceluloza, metil metakrilat, metil oleat, metilparaben, metilparaben kalijum, metilparaben natrijum, mikrokristalna celuloza i karboksimetilceluloza natrijum, mineralno ulje, svetlo mineralno ulje, mineralno ulje i lanolin alkoholi, ulje, maslinovo ulje, monoetanolamin, montmorilonit, oktil galat, oleinska kiselina, palmitinska kiselina, parafin, ulje od kikirikija, vazelin, vazelin i lanolin alkoholi, farmaceutska glazura, fenol, tečni fenol, fenoksietanol, fenoksipropanol, feniletil alkohol, fenilmerkuri acetat, fenilmerkuri borat, fenilmerkuri nitrat, polakrilin, polakrilin kalijum, poloksamer, polidekstroza, polietilen glikol, polietilen oksid, poliakrilati, polietilen-polioksipropilen-blok polimeri, polimetakrilati, polioksietilen alkil etri, polioksietilen derivati ricinusovog ulja, polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina, polioksietilen stearati, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, kalijum alginat, kalijum benzoat, kalijum bikarbonat, kalijum bisulfit, kalijum hlorid, kalijum citrat, kalijum citrat anhidrovani, kalijum hidrogen fosfat, kalijum metabisulfit, monobazni kalijum fosfat, kalijum propionat, kalijum sorbat, povidon, propanol, propionska kiselina, propilen karbonat, propilen glikol, propilen glikol alginat, propil galat, propilparaben, propilparaben kalijum, propilparaben natrijum, protamin sulfat, ulje od uljane repice, Ringerov rastvor, saharin, saharin amonijum, saharin kalcijum, saharin natrijum, ulje od suncokreta, saponit, proteini seruma, susamovo ulje, koloidni silicijum dioksid, koloidni silicijum dioksid, natrijum alginat, natrijum askrobat, natrijum benzoat, natrijum bikarbonat, natrijum bisulfit, natrijum hlorid, anhidrovani natrijum citrat, natrijum citrat dehidrat, natrijum hlorid, natrijum ciklamat, natrijum edentat, natrijum dodecil sulfat, natrijum lauril sulfat, natrijum metabisulfit, natrijum fosfat, dvobazni, natrijum fosfat, monobazni, natrijum fosfat, trobazni, anhidrovani natrijum propionat, natrijum propionat, natrijum sorbat, natrijum skrob glikolat, natrijum stearil fumarat, natrijum sulfit, sorbinska kiselina, sorbitan estri (sorbitan masni estri), sorbitol, rastvor sorbitola 70%, sojino ulje, spermaceti vosak, skrob, kukuruzni skrob, krompirov skrob, preželatinizirani skrob, sterilizujući kukuruzni skrob, stearinska kiselina, prečišćena stearinska kiselina, stearil alkohol, saharoza, šećeri, kompresibilni šećer, poslastičarski šećer, šećerne sfere, invertni šećer, Sugartab, Sunset Yellow FCF, sintetički parafin, talk, vinska kiselina, tartrazin, tetrafluoroetan (HFC), teobroma ulje, timerosal, titanijum dioksid, alfa tokoferol, tojoferil acetat, alfa tokoferil kisselina sukcinat, beta-tokoferol, delta-tokoferol, gama-tokoferol, tragant, triacetin, tributil citrat, trietanolamin, trietil citrat, trimetil-β-ciklodekstrin, trimetiltetradecilamonijum bromid, tris pufer, trinatrijum edentat, vanilin, tip I hidrogenisano biljno ukje, voda, meka voda, tvrda voda, voda bez ugljen dioksida, voda bez pirogena, voda za injekciju, sterilna voda za inhalaciju, sterilna voda za injekciju, sterilna voda za irigaciju, voskovi, anjonski emulgujući vosak, karnauba vosak, katjonski emulgujući vosak, cetil estar vosak, mikrokristalni vosak, nejonski emulgujući vosak, vosak za supozitorije, beli vosak, žuti vosak, beli vazelin, lanolin, ksantan guma, ksilitol, zein, cink propionat, soli cinka, cink stearat, ili bilo koji ekscipijens iz Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000). Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980), opisuje različite komponente korišćene u formulaciji farmaceutski prihvatljivih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ukoliko je bilo koje konvencionalno sredstvo nekompatibilno sa farmaceutskim kompozicijama, razmatrana je njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama. Dopunski aktivni sastojci takođe mogu biti ugrađeni u kompozicije.
U nekim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kojoj koncentraciji, kao što je, na primer, najmanje A, gde je A jednako 0.0001 % tež./zapr., 0.001 % tež./zapr., 0.01 % tež./zapr., 0.1 % tež./zapr., 1% tež./zapr., 2% tež./zapr., 5% tež./zapr., 10% tež./zapr., 20% tež./zapr., 30% tež./zapr., 40% tež./zapr., 50% tež./zapr., 60% tež./zapr., 70% tež./zapr., 80% tež./zapr. ili 90% tež./zapr. U nekim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kojoj koncentraciji, kao što je, na primer, najviše B, pri čemu je B jednako 90% tež./zapr., 80% tež./zapr., 70% tež./zapr., 60% tež./zapr., 50% tež./zapr., 40% tež./zapr., 30% tež./zapr., 20% tež./zapr., 10% tež./zapr., 5% tež./zapr., 2% tež./zapr., 1% tež./zapr., 0.1 % tež./zapr., 0.001 % tež./zapr. ili 0.0001 %. U drugim primerima izvođenja, gore navedene komponenta(e) mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji u bilo kom opsegu koncentracija, kao što je, na primer od oko A do oko B. U nekim primerima izvođenja, A je 0.0001% i B je 90%.
Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane tako da se postigne fiziološki kompatibilna pH. U nekim primerima izvođenja, pH farmaceutske kompozicije može biti najmanje 5, najmanje 5.5, najmanje 6, najmanje 6.5, najmanje 7, najmanje 7.5, najmanje 8, najmanje 8.5, najmanje 9, najmanje 9.5, najmanje 10 ili najmanje 10.5 do i uključujući pH 11, u zavisnosti od formulacije i puta primene. U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije mogu da sadrže puferujuća sredstva da bi se postigla fiziološki kompatibilna pH. Puferujuća sredstva mogu da obuhvataju bilo koja jedinjenja sposobna da puferuju na željenoj pH kao što su, na primer, foafatni puferi (npr., PBS), trietanolamin, Tris, bicin, TAPS, tricin, HEPES, TES, MOPS, PIPES, kakodilat, MES i drugi. U određenim primerima izvođenja, jačina pufera je najmanje 0.5 mM, najmanje 1 mM, najmanje 5 mM, najmanje 10 mM, najmanje 20 mM, najmanje 30 mM, najmanje 40 mM, najmanje 50 mM, najmanje 60 mM, najmanje 70 mM, najmanje 80 mM, najmanje 90 mM, najmanje 100 mM, najmanje 120 mM, najmanje 150 mM ili najmanje 200 mM. U nekim primerima izvođenja, jačina pufera nije više od 300 mM (npr., najviše 200 mM, najviše 100 mM, najviše 90 mM, najviše 80 mM, najviše 70 mM, najviše 60 mM, najviše 50 mM, najviše 40 mM, najviše 30 mM, najviše 20 mM, najviše 10 mM, najviše 5 mM, najviše 1 mM).
Putevi primene
Sledeća diskusija o putevima primene je data samo za ilustraciju ilustrativnih primera izvođenja i ne bi je trebalo tumačiti kao ograničavajuću za obim ni na koji način.
Formulacije pogodne za oralnu primenu mogu da se sastoje od (a) tečnih rastvora, kao što je efikasna količina analoga predmetnog otkrića rastvorena u razblaživačima, kao što su voda, fiziološki rastvor ili sok od narandže; (b) kapsula, skrobnih kapsula, tableta, lozengi, i pastila, od kojih svaka sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka, kao čvrste supstance ili granule; (c) prahove; (d) suspenzije u odgovarajućoj tečnosti; i (e) pogodne emulzije. Tečne formulacije mogu da obuhvataju razblaživače, kao što su voda i alkoholi, na primer, etanol, benzil alkohol i polietilen alkoholi, bilo sa ili bez dodavanja farmaceutski prihvatljivog surfaktanta. Oblici kapsule mogu biti uobičejnog tipa sa tvrdom- ili mekom-želatinskom ljuskom koji mogu da sadrže, na primer, surfaktante, lubrikante i inertne punioce, kao što su laktoza, saharoza, kalcijum fosfat, i kukuruzni skrob. Oblici tablete mogu da obuhvataju jedan ili više od laktoze, saharoze, manitola, kukuruzni skrob, skrob od krompira, alginiska kiselina, mikrokristalna celuloza, akacija, želatin, guar guma, koloidni silicijum dioksid, kroskarmeloza natrijum, talk, magnezijum stearat, kalcijum stearat, cink stearat, stearinska kiselina i drugi ekscipijensi, boje, razblaživači, puferujuća sredstva, sredstva za raspadanje, sredstva za vlaženje, konzervansi, arome, i drugi farmakološki kompatibilni ekscipijensi. Oblici lozengi mogu da sadrže analog predmetnog otkrića u aromu, obično saharoze i akacije ili traganta, kao i pastile koje sadrže analog predmetnog otkrića u inertnoj bazi, kao što je želatin i glicerin, ili saharoza i akacija, emulzije, gelovi i slično koje sadrže pored takvih ekscipijenasa kao što su poznati u stanju tehnike.
Analozi otkrića, pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim pogodnim komponentama, mogu biti primenjeni preko plućne primene i mogu biti napravljeni u formulacijama aerosola za primenu preko inhalacije. Ove formulacije aerosola mogu biti postavljene u prihvatljive propelante pod pritiskom, kao što su dihlorodifluorometan, propan, azot, i slično. One takođe mogu biti formulisane kao lekovi za preparate koji nisu pod pritiskom, kao što je u nebulizatoru ili atomizatoru. Takve formulacije spreja takođe mogu biti korišćene za prskanje mukoze. U nekim primerima izvođenja, analog je formulisan u mešavini praha ili u mikročestice ili nanočestice. Pogodne plućne formulacije su poznate u stanju tehnike. Videti, npr., Qian et al., Int J Pharm 366: 218-220 (2009); Adjei and Garren, Pharmaceutical Research, 7(6): 565-569 (1990); Kawashima et al., J Controlled Release 62(1-2): 279-287 (1999); Liu et al., Pharm Res 10(2): 228-232 (1993); objave međunarodnih patentnih prijava br. WO 2007/133747 i WO 2007/141411.
Formulacije pogodne za parenteralnu primenu obuhvataju vodene i nevodene, izotonične sterilne rastvore za injekciju, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate, i supstance koje se rastvaraju koje omogućavaju da formulacija bude izotonična sa krvlju namenjenog primaoca, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da obuhvataju suspendujuća sredstva, solubilizatore, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse. Termin, "parenteralni" označava ne preko probavnog kanala, već preko nekog drugog puta kao što je subkutani, intramuskularni, intraspinalni ili intravenski. Analog predmetnog otkrića može biti primenjen sa fiziološki prihvatljivim razblaživačem u farmaceutskom nosaču, kao što je sterilnna tečnost ili smeša tečnosti, uključujući vodu, fiziološki rastvor, vodeni rastvor dekstroze i rastvore srodnih šećera, alkohol, kao što je etanol ili heksadecil alkohol, glikol, kao što je propilen glikol ili polietlen glikol, dimetilsulfoksid, glicerol, ketali kao što je 2,2- dimetil-153-dioksolan-4-metanol, etri, poli(etilenglikol) 400, ulja, masne kiseline, estri ili gliceridi masnih kiselina ili acetilovani gliceridi masnih kiselina sa ili bez dodavanja farmaceutski prihvatljivog surfaktanta, kao što je sapun ili deterdžent, suspendujuće sredstvo, kao što je pektin, karbomeri, metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza ili karboksimetilceluloza, ili emulgujuća sredstva i drugi farmaceutski adjuvanti.
Ulja, koja mogu biti korišćena u parenteralnim formulacijama obuhvataju petrolej, životinjska, biljna ili sintetička ulja. Specifični primeri ulja obuhvataju ulje od kikirikija, soje, susama, pamuka, kukuruza, maslinovo, vazelin i mineralno ulje. Pogodne masne kiseline za upotrebu u parenteralnim formulacijama obuhvataju oleinsku kiselinu, stearinsku kiselinu, i izostearinsku kiselinu. Etil oleat i izopropil miristat su primeri pogodnih estara masnih kiselina.
Pogodni sapuni za upotrebu u parenteralnim formulacijama obuhvataju soli masne kiseline i alkalnog metala, amonijuma i trietanolamina, i pogodni deterdženti obuhvataju (a) katjonske deterdžente kao što su, na primer, dimetil dialkil amonijum halogenidi, i alkil piridinijum halogenidi, (b) anjonske deterdžente kao što su, na primer, alkil, aril i olefin sulfonati, alkil, olefin, etar i monoglicerid sulfati i sulfosukcinati, (c) nejonske deterdžente kao što su, na primer, masni amin oksidi, alkanolamini masnih kiselina i polioksietilenpolipropilen kopolimeri, (d) amfoterni deterdženti kao što su, na primer, alkil-β-aminopropionati i 2-alkil -imidazolin kvaternarne amoniojum soli i (e) njihove smeše.
Parenteralne formulacije mogu biti predstavljene u zaptivenim kontejenerima za jediničnu dozu ili višestruke doze, kao što su ampule i vijalice, i mogu biti čuvane u stanju osušenom zamrzavanjem (liofilizovanom) koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog ekscipijensa, na primer, vode, za injekcije, neposredno pre upotrebe. Rastvori i suspenzije za ex tempore injekciju mogu biti pripremljeni od sterilnih prahova, granula i tableta vrste poznate u stanju tehnike.
Injektabilne formulacije su u skladu da otkrićem. Uslovi za efikasne farmaceutske nosače za injektabilne kompozicije su dobro poznate stručnjacima iz date oblasti tehnike (videti, npr., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), i ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).
Pored toga, analog predmetnih otkrića može biti napravljen u supozitorije za rektalnu primenu putem mešanja sa različitim bazama, kao što su emulgujuće baze ili baze rastvorljive u vodi. Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu biti predstavljene kao materični ulošci, tamponi, kreme, gelovi, paste, pene ili formule spreja koji sadrže, pored aktivnog sastojka, takve nosače kao što su poznati u stanju tehnike kao odgovarajući.
Stručnjaku iz date oblasti tehnike biće jasno da, pored gore opisanih farmaceutskih kompozicija, analog otkrića može biti formulisan kao inkluzioni kompleksi, kao što su inkluzioni kompleksi ciklodekstrina, ili lipozomi.
Doza
Veruje se da su analozi otkrića korisni u postupcima za lečenje bolesti ili medicinskog stanja u kome agonizam receptora za glukagon, agonizam GLP-1 receptora ili koagonizam receptora za glukagon receptor/GLP-1 receptora ima ulogu. Za svrhe otkrića, primenjena količina ili doza analoga predmetnog otkrića trebalo bi da je dovoljna da postigne, npr., terapeutski ili profilaktički odgovor, kod subjekta ili životinje u razumnom vremenskom okviru. Na primer, doza analoga predmetnog otkrića trebalo bi da je dovoljna da se stimuliše izlučivanje cAMP iz ćelija kao što su ovde opisane ili dovoljne da se povećaju nivoi glukoze u krvi, nivoi masti, nivoi unosa hrane ili telesna težina sisara, u periodu od oko oko 1 do 4 minuta, 1 do 4 časa ili 1 do 4 nedelje ili duže, npr., 5 do 20 ili više nedelja, od vremena primene. U određenim primerima izvođenja, vremenski period bi čak mogao biti duži. Doza će biti određena preko efikasnosti određenog analoga predmetnog otkrića i stanja životinje (npr., čoveka), kao i telesne težine životinje (npr., čoveka) koja se tretira.
Mnoge analize za određivanje primenjene doze su poznate u stanju tehnike. Za svrhe koje su ovde navedene, mogla bi se koristiti analiza, koja sadrži poređenje veličine do koje su nivoi glukoze u krvi sniženi posle primene date doze analoga predmetnog otkrića na sisara među grupom životinja od kojih je svakoj data različita doza analoga, za određivanje početne doze koja će biti primenjena na sisara. Veličina do koje su nivoi glukoze u krvi sniženi posle primene određene doze može biti analizirana pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući, na primer, postupke koji su opisani ovde kao Primer 4.
Doza analoga predmetnog otkrića takođe će biti određena preko postojanja, prirode i veličine bilo kojih štetnih sporednih efekata koji bi mogli da prate primenu određenog analoga predmetnog otkrića. Tipično, nadležni lekar će odlučiti o dozi analoga predmetnog otkrića sa kojom bi trebalo lečiti svakog pojedinačnog pacijenta, uzimajući u obzir različite faktore, kao što su starost, telesna težina, opšte zdravstveno stanje, ishrana, pol, analog predmetnog otkrića koji će se primeniti, put primene i težina stanja koje se leči. Na primer i bez namere da se otkriće ograniči, doza analoga predmetnog otkrića može biti oko 0.0001 do oko 1 g/kg telesne težine subjekta koji se leči/dan, od oko 0.0001 do oko 0.001 g/kg telesne težine/dan, ili oko 0.01 mg do oko 1 g/kg telesne težine/dan.
U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži bilo koji od analoga koji su ovde otkriveni na nivou čistoće pogodnim za primenu na pacijenta. U nekim primerima izvođenja, analog ima nivo čistoće od najmanje oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98% ili oko 99%, i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, nosač ili ekscipijens. Farmaceutska kompozicija u nekim aspektima sadrži analog predmetnog otkrića u koncentraciji od najmanje A, pri čemu je A od oko 0.001 mg/ml, oko 0.01 mg/ml, 0 oko 1 mg/ml, oko 0.5 mg/ml, oko 1 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko 17 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 23 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 25 mg/ml ili više. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži analog u koncentraciji od najviše B, pri čemu je B oko 30 mg/ml, oko 25 mg/ml, oko 24 mg/ml, oko 23, mg/ml, oko 22 mg/ml, oko 21 mg/ml, oko 20 mg/ml, oko 19 mg/ml, oko 18 mg/ml, oko 17 mg/ml, oko 16 mg/ml, oko 15 mg/ml, oko 14 mg/ml, oko 13 mg/ml, oko 12 mg/ml, oko 11 mg/ml, oko 10 mg/ml, oko 9 mg/ml, oko 8 mg/ml, oko 7 mg/ml, oko 6 mg/ml, oko 5 mg/ml, oko 4 mg/ml, oko 3 mg/ml, oko 2 mg/ml, oko 1 mg/ml ili oko 0.1 mg/ml. U nekim primerima izvođenja, kompozicije mogu da sadrže analog u opsegu koncentracija od A do B mg/ml, na primer, oko 0.001 do oko 30.0 mg/ml.
Ciljni oblici
Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da analozi otkrića mogu biti modifikovani na bilo koji od određenog broja načina, tako da je terapeutska ili profilaktička efikasnost analoga predmetnih otkrića povećana preko modifikacija. Na primer, analog predmetnog otkrića može biti konjugovan bilo direktno ili indirektno preko linkera za ciljni deo. Praksa konjugovanja jedinjenja, npr., analoga glukagona koji su ovde opisani, za ciljne delove je poznata u stanju tehnike. Videti, na primer, Wadhwa et al., J Drug Targeting, 3, 111-127 (1995) i SAD patent br. 5,087,616. Termin "ciljni deo" kao što je ovde korišćen, označava bilo koji molekul ili sredstvo sposobno da specifično prepozna i veže se za receptor na ćelijskoj površini, tako da ciljni deo usmerava primenu analoga predmetnih otkrića na populaciju ćelija na čijoj površini je eksprimiran receptor (receptor za glukagon, GLP-1 receptor). Ciljni deovi obuhvataju, ali bez ograničenja na, antitela ili njihove fragmente, peptide, hormone, faktore rasta, citokine i bilo koje druge prirodne ili neprirodne ligande, koji se vezuju za receptore na ćelijskoj površini (npr., receptor za epitelijalni faktor rasta (EGFR), T-ćelijski receptor (TCR), B-ćelijski receptor (BCR), CD28, receptor za faktor rasta poreklom od trombocita (PDGF), nikotinski acetilholinski receptor (nAChR), itd.). Kao što je ovde korišćen "linker" je veza, molekul ili grupa molekula koji vezuje dva posebna entiteta međusobno. Linkeri mogu da obezbede otpimalnu udaljenost dva entiteta ili mogu dalje da obezbede slabu vezu koja omogućava da dva entiteta budu odvojena. Slabe veze obuhvataju grupe koje se mogu cepati usled svetlosti, delove koji su osetljivi na kiselinu, delove koji su osetljivi na baze i grupe koje se cepaju enzimima. Termin "linker" u nekim primerima izvođenja označava bilo koje sredstvo ili molekul koji premošćuje analog predmetnih otkrića za ciljni deo. Stručnjak iz date oblasti tehnike zna da su mesta na analogu predmetnih otkrića, koja nisu neophodna za funkciju analoga predmetnih otkrića, idealna mesta za vezivanje linkera i/ili ciljnog dela, uz uslov da linker i/ili ciljni deo, pošto se vežu za analog predmetnih otkrića, ne utiču na funkciju analoga predmetnih otkrića, tj., sposobnost da stimulišu izlučivanje cAMP iz ćelija, za lečenje dijabetesa ili gojaznosti.
Formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem
Alternativno, analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti modifikovani u depo oblik, tako da je način na koji se analog predmetnih otkrića oslobađa u telo na koje se primenjuje kontrolisan u odnosu na vreme i lokaciju unutar tela (videti, na primer, SAD patent br. 4,450,150). Depo oblici analoga predmetnih otkrića mogu biti, na primer, implantabilna kompozicija koja sadrži analog predmetnih otkrića i porozni i neporozni materijal, kao što je polimer, pri čemu je analog predmetnih otkrića inkapsuliran od strane ili raširen kroz razloženi porozni i/ili neporozni materijal. Depo je zatim implantiran u željenu lokaciju unutar tela i analog predmetnih otkrića je oslobođen iz implanta unapred određenom stopom.
Farmaceutska kompozicija u određenim aspektima je modifikovana tako da ima bilo koji tip profila in vivo oslobađanja. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija je formulacija sa neposrednim oslobađanjem, kontrolisanim oslobađanjem, produženim oslobađanjem, produženim oslobađanjem, odloženim oslobađanjem ili bi-faznim oslobađanjem. Postupci za formiranje peptida za kontrolisano oslobađanje su poznati u stanju tehnike. Videti, na primer, Qian et al., J Pharm 374: 46-52 (2009) i objave međunarodnih patentnih prijava br. WO 2008/130158, WO2004/033036; WO2000/032218; i WO 1999/040942.
Predstavljene kompozicije mogu dalje da sadrže, na primer, micele ili lipozome, ili neki drugi inkapsulirani oblik, ili mogu biti primenjene u obliku za produženo oslobađanje tako da se obezbedi efekat produženog čuvanja i/ili primene. Opisane farmaceutske formulacije mogu biti primenjene prema bilo kom režimu uključujući, na primer, jednom dnevno (1 na dan, 2 puta na dan, 3 puta na dan, 4 puta na dan, 5 puta na dan, 6 puta na dan), svaka dva dana, svaka tri dana, svaka četiri dana, svakih pet dana, svakih šest dana, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, svake tri nedelje, jednom mesečno ili dva puta mesečno.
Kombinacije
Analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti primenjeni pojedinačno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima koja imaju za cilj lečenje ili prevenciju bilo koje od bolesti ili medicinskih stanja koji su ovde opisani. Na primer, analozi glukagona koji su ovde opisani mogu biti koprimenjivani sa (istovremeno ili uzastopno) anti-dijabetičkim sredstvom ili sredstvom protiv gojaznosti. Anti-dijabetička sredstva poznata u tehnici ili koja se ispituju obuhvataju insulin, leptin, Peptid YY (PYY), peptid pankreasa (PP), faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21), agoniste Y2Y4 receptora, sulfoniluree, kao što je tolbutamid (Orinase), acetoheksamid (Dymelor), tolazamid (Tolinase), hlorpropamid (Diabinese), glipizid (Glucotrol), gliburid (Diabeta, Micronase, Glynase), glimepirid (Amaryl) ili gliklazid (Diamicron); meglitinide, kao što je repaglinid (Prandin) ili nateglinid (Starlix); biguanide kao što je metformin (Glucophage) ili fenformin; tiazolidindione kao što je rosiglitazon (Avandia), pioglitazon (Actos) ili troglitazon (Rezulin), ili drugi inhibitori PPARγ; inhibitore alfa glukozidaze koji inhibiraju razlaganje ugljenih hidrata, kao što je miglitol (Glyset), akarboza (Precose/Glucobay); eksenatid (Byetta) ili pramlintid; inhibitore dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4) kao što je vildagliptin ili sitagliptin; inhibitore SGLT (natrijum-zavisnog transportera glukoze 1); aktivatore glukokinaze (GKA); antagoniste receptora za glukagon (GRA); ili inhibitore FBPaze (fruktoza 1,6-bisfosfataze).
Sredstva protiv gojaznosti poznata u stanju tehnike ili koja se ispituju obuhvataju supresante apetita, uključujući stimulante tipa fenetilamina, fentermin (izborno sa fenfluraminom ili deksfenfluraminom), dietilpropion (Tenuate®), fendimetrazin (Prelu-2®, Bontril®), benzfetamin (Didrex®), sibutramin (Meridia®, Reductil®); rimonabant (Acomplia®), druge antagoniste kanabinoidnog receptora; oksintomodulin; fluoksetin hidrohlorid (prozak); Qnexa (topiramat i fentermin), Ekskalija (bupropion i zonisamid) i kontrave (bupropion i naltrekson); ili inhibitore lipaze, slične XENICAL (Orlistat) ili Cetilistat (takođe poznat kao ATL-962) ili GT 389-255.
Peptidi koji su ovde opisani u nekim primerima izvođenja se koprimenjuju sa sredstvom za lečenje bolesti nealkoholne masne jetre ili NASH. Sredstva korišćena za lečenje bolesti nealkoholne masne jetre obuhvataju ursodeoksiholnu kiselinu (takođe poznata kao, aktigal, URSO i ursodiol), metformin (Glucophage), rosiglitazon (Avandia), klofibrat, gemfibrozil, polimiksin B, i betain.
Peptidi koji su ovde opisani u nekim primerima izvođenja su koprimenjivani sa sredstvom za lečenje neurodegenerativne bolesti, npr., Parkinsonove bolesti. Sredstva protiv Parkinsonove bolesti su dalje poznata u stanju tehnike i obuhvataju, ali bez ograničenja na, levodopa, karbidopa, antiholinergike, bromokriptin, pramipeksol i ropinirol, amantadin i rasagilin.
U pogledu gore navedenog, otkriće dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije i komplete koji dodatno sadrže jedno od ovih drugih terapeutskih sredstava. Dodatno terapeutsko sredstvo može biti primenjivano istovremeno ili uzastopno sa analogom predmetnog otkrića. U nekim aspektima, analog je primenjen pre dodatnog terapeutskog sredstva, dok u drugim aspektima, analog je primenjen posle dodatnog terapeutskog sredstva.
Upotrebe
Ovde je razmatrano da su analozi glukagona koji su ovde opisani i srodne farmaceutske kompozicije korisni za lečenje bolesti ili medicinskog stanja, kod koga npr., nedostatak aktivnosti na receptoru za glukagon, GLP-1 receptoru ili na oba receptora, je faktor u početku i/ili tokom napredovanja bolesti ili medicinskog stanja. Prema tome, otkriće obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju bolesti ili medicinskog stanja kod pacijenta, pri čemu, bolest ili medicinsko stanje je bolest ili medicinsko stanje kod koga je nedostatak aktivacije GLP-1 receptora i/ili aktivacije receptora za glukagon povezan sa početkom i/ili napredovanjem bolesti ili medicinskog stanja. Postupak sadrži obezbeđivanje pacijentu analoga u skladu sa bilo kojim od onih koji su ovde opisani u količini koja je efikasna za lečenje ili prevenciju bolesti ili medicinskog stanja.
U nekim primerima izvođenja, bolest ili medicinsko stanje je metabolički sindrom. Metabolički sindrom, takođe poznat kao metabolički sindrom X, sindrom insulinske rezistencije ili Reaven-ov sindrom, je poremećaj koji pogađa preko 50 miliona Amerikanaca. Metabolički sindrom je tipično okarakterisan grupisanjem najmanje tri ili više od sledećih faktora rizika: (1) abdominalna gojaznost (prekomerno masno tkivo u i oko abdomena), (2) aterogena dislipidemija (poremećaji masti u krvi uključujući visoke trigliceride, nizak HDL holesterol i visok LDL holesterol koji pojačava akumulaciju plaka u zidovima arterija), (3) povišeni krvni pritisak, (4) insulinska rezistencija ili intolerancije glukoze, (5) protrombotičko stanje (npr., visok fibrinogen ili plazminogen aktivator inhibitor-1 u krvi), i (6) pro-inflamatorno stanje (npr., povišeni C-reaktivni protein u krvi). Drugi faktori rizika mogu da obuhvataju starenje, hormonalnu neravnotežu i genetičku predispoziciju.
Metabolički sindrom je povezan sa povećanim rizikom od koronarne bolesti srca i drugim poremećajima povezanim sa akumulacijom vaskularnih plakiova, kao što je šlog i periferna vaskularna bolest, označena kao aterosklerotična kardiovaskularna bolest (ASCVD). Pacijenti sa metaboličkim sindromom mogu da napreduju od stanja insulinske rezistencije u njegovim ranijim stadijumima do potpuno razvijenog dijabetesa tipa II sa dalje rastućim rizikom od ASCVD. Bez namere da se vežemo za bilo koju određenu teoriju, veza između insulinske rezistencije, metaboličkog sindroma i vaskularne bolesti može da uključuje jedan ili više istovremenih patogenih mehanizama uključujući oštećenu insulinom-stimulisanu vazodilataciju, smanjenje u dostupnosti NO kao posledica pojačanog oksidativnog stresa povezano sa insulinskom rezistencijom i abnormaliteti u hormonima poreklom od adipocita kao što je adiponektin (Lteif and Mather, Can. J. Cardiol. 20 (suppl. B):66B-76B (2004)).
Prema 2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel (ATP III), bilo koje tri od sledećih osobina kod iste individue ispunjavaju kriterijume za metabolički sindrom: (a) abdominalna gojaznost (obim struka preko 102 cm kod muškaraca i preko 88 cm kod žena); (b) trigliceridi u serumu (150 mg/dl ili iznad); (c) HDL holesterol (40 mg/dl ili niže kod muškaraca i 50 mg/dl ili niže kod žena); (d) krvni pritisak (130/85 ili više); i (e) glukoza prilikom gladovanja (110 mg/dl ili više). Prema Svetskoj zdravstvenoj organiziji (WHO), individua koja ima visoke nivoe insulina (povišena glukoza prilikom gladovanja ili samo povišena posle obroka) sa najmanje dva od sledećih kriterijuma ispunjavaju kriterijume za metabolički sindrom: (a) abdominalna gojaznost (odnos struka prema kukovima veći od 0.9, indeks telesne mase od najmanje 30 kg/m2, ili mera struka preko 37 inča); (b) panel holesterola koji pokazuje nivo triglicerida od najmanje 150 mg/dl ili HDL holesterol niži od 35 mg/dl; (c) krvni pritisak od 140/90 ili više, ili na tretmanu za visok krvni pritisak). (Mathur, Ruchi, "Metabolic Syndrome," ed. Shiel, Jr., William C., MedicineNet. com, May 11, 2009).
Za svrhe ovde navedene, ako individua ispunjava bilo koji ili oba kriterijuma navedena u 2001 National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel ili WHO, ta individua se smatra pogođenom metabočkim sindromom.
Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, peptidi koji su ovde opisani su korisni za lečenje metaboličkog sindroma. Prema tome, otkriće daje postupak za prevenciju ili lečenje metaboličkog sindroma, ili smanjenje jednog, dva, tri ili više njegovih faktora rizika, kod subjekta, koji sadrži obezbeđivanje subjektu analoga koji je ovde opisan u količini koja je efikasna za sprečavanje ili lečenje metabočkog sindroma, ili njegovog faktora rizika.
U nekim primerima izvođenja, postupak leči hiperglikemijsko medicinsko stanje. U određenim aspektima, hiperglikemijsko medicinsko stanje je dijabetes, dijabetes melitus tipa I, dijabetes melitus tipa II, ili gestacioni dijabetes, bilo insulin-zavisni ili ne-insulin-zavisni. U nekim aspektima, postupak leči hiperglikemijsko medicinsko stanje redukcijom jedne ili više komplikacija dijabetesa uključujući nefropatiju, retinopatiju i vaskularnu bolest.
U nekim aspektima, bolest ili medicinsko stanje je gojaznost. U nekim aspektima, gojaznost je gojaznost indukovana lekom. U nekim aspektima, postupak leči gojaznost prevencijom ili smanjenjem dobitka na telesnoj težini ili povećanjem gubitka na telesnoj težinu kod pacijenta. U nekim aspektima, postupak leči gojaznost smanjenjem apetita, smanjenjem unosa hrane, snižavanjem nivoa masti u pacijentu ili smanjenjem stope kretanja hrane u gastrointestinalnom sistemu.
Kako je gojaznost povezana sa početkom ili napredovanjem drugih bolesti, postupci za lečenje gojaznosti su dalje korisni u postupcima za smanjenje komplikacija povezanih sa gojaznošću uključujući vaskularnu bolest (koronarna arterijska bolest, šlog, periferna vaskularna bolest, ishemija reperfuzija, itd.), hipertenzija, početak dijabetesa tipa II, hiperlipidemija i muskuloskeletne bolesti. Otkriće prema tome obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju ovih komplikacija povezanih sa gojaznošću.
U nekim primerima izvođenja, bolest ili medicinsko stanje je bolest nealkoholne masne jetre (NAFLD). NAFLD označava široki spektar bolesti jetre u opsegu od masne jetre (steatoza), do nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), do ciroze (ireverzibilno, uznapredovalo oštećenje jetre). Svi stadijumi NAFLD imaju zajedničku akumulaciju masti (infiltracija masti) u ćelijama jetre (hepatocitama). Masna jetra abnormalna akumulacija određenog tipa masti, triglicerida, u ćelijama jetre bez inflamacije ili oštećenja. Kod NASH, akumulacija masti je povezana sa različitim stepenima inflamacije (hepatitisa) i oštećenja (fibroza) jetre. Inflamatorne ćelije mogu da unište ćelije jetre (hepatocelularna nekroza). U terminima "steatohepatitis" i "steatonekroza", steato označava infiltraciju masti, hepatitis označava inflamaciju u jetri, i nekroza označava uništene ćelije jetre. NASH može konačno da dovede do oštećenja jetre (fibroza) i zatim ireverzibilnog, uznapredovalog oštećenja (ciroze). Ciroza koja je izazvana sa NASH je poslednji i najteži stadijum u spektru NAFLD. (Mendler, Michel, "Fatty Liver: Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH)," ed. Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005).
Alkoholna bolest jetre ili alkoholom-indukovana bolest jetre, obuhvata tri patološki posebne bolesti jetre povezane sa ili izazvane prekomernom upotrebom alkohola: masna jetra (steatoza), hronični ili akutni hepatatis, i ciroza. Alkoholni hepatitis može biti u opsegu od blagog hepatitisa, sa abnormalnim laboratorijskim testovima koji su samo indikacija bolesti, do teške disfunkcije jetre sa komplikacijama kao što je žutica (žuta koža izazvana zadržavanjem bilirubina), hepatična encefalopatija (neurološka disfunckija izazvana insuficijencijom jetre), asciti (akumulacija tečnosti u abdomenu), varikozne vene u jednjaku koje krvare (varikozne vene u jednjaku), abnormalno zgrušavanje krvi i koma. Histološki, alkoholni hepatitis ima karakterističan izgled sa degeneracijom hepatocita u obliku balona, inflamacija sa neutrofilima i nekada Mallory tela (abnormalne agregacije ćelijskih intermedijernih filamentnih proteina). Ciroza je karakteristična anatomski po široko raširenim čvorićima u jetri kombinovanih sa fibrozom. (Worman, Howard J., "Alcoholic Liver Disease", Columbia University Medical Center website).
Bez vezivanja za bilo koju određenu teoriju, analozi koji su ovde opisani su korisni za lečenje alkoholne bolesti jetre, NAFLD, ili bilo kog njenog stadijuma, uključujući, na primer, steatozu, steatohepatitis, hepatitis, hepatičku inflamaciju, NASH, cirozu ili njihove komplikacije. Prema tome, otkriće daje postupak za prevenciju ili lečenje bolesti alkoholne jetre, NAFLD, ili bilo kog njenog stadijuma, kod subjekta koji sadrži obezbeđivanje subjektu analoga koji je ovde opisan u količini efikasnoj za sprečavanje ili lečenje alkoholne bolesti jetre, NAFLD, ili njenog stadijuma. Takvi postupci za lečenje obuhvataju smanjenje jednog, dva, tri ili više od sledećih: sadržaj masti u jetri, incidenca ili napredovanje ciroze, incidenca ili hepatoćelijski karcinom, znaci inflamacije, npr., abnormalni nivoi hepatičkog enzima (npr., aspartat aminotransferaza AST i/ili alanin aminotransferaza ALT ili LDH), povišeni feritin u serumu, povećani bilirubin u serumu i/ili znaci fibroze, npr., povećani nivoi TGF-beta. U poželjnim primerima izvođenja, peptidi su korišćeni za lečenje pacijenata koji su napredovali preko masne jetre (steatoza) i ispoljavaju znake inflamacije ili hepatitisa. Takvi postupci mogu da rezultiraju, na primer, u smanjenju nivoa AST i/ili ALT.
Pokazano je da GLP-1 i eksendin-4 imaju izvestan neuroprotektivni efekat. Otkriće takođe daje upotrebe analoge glukagona koji su ovde opisani u lečenju neurodegenerativnih bolesti, uključujući, ali bez ograničenja na Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, multiplu sklerozu, amiotrofnu lateralnu sklerozu, druge poremećaje povezane sa demijelizacijom, senilnu demenciju, subkortikalnu demenciju, arteriosklerotičku demenciju, demenciju povezanu sa SIDA-om ili druge demencije, kancer centralnog nervnog sistema, traumatsku povredu mozga, povredu kičmene moždine, šlog ili cerebralnu ishemiju, cerebralni vaskulitis, epilepsiju, Huntington-ova bolest, Tourette-ov sindrom, Guillain Barre sindrom, Wilson-onova bolest, Pick-ovu bolest, neuroinflamatorne poremećaje, encefalitis, encefalomijelitis ili meningitis virusnog, gljivičnog ili bakterijskog porekla, ili druge infekcije centralnog nervnog sistema, prionske bolesti, cerebelarne ataksije, cerebelarnu degeneraciju, sindrome spinocerebelarne degeneracije, Friedreichs ataksiju, ataksiju telangiektaziju, kičmenu dismiotrofiju, progresivnu supranuklearnu paralizu, distoniju, spastičnost mišića, tremor, retinitis pigmentosa, striatonigralnu degeneraciju, mitohondrijalne encefalomiopatije, neuronalnu ceroidnu lipofuscinozu, hepatičke encefalopatije, renalne encefalopatije, metaboličke encefalopatije, toksinima indukovane encefalopatije i zračenjem-indukovano oštećenje mozga.
U nekim primerima izvođenja, bolest ili medicinsko stanje je hipoglikemija. U nekim primerima izvođenja, pacijent je dijabetički pacijent i hipoglikemija je indukovana primenom insulina. U specifičnim aspektima, postupak sadrži obezbeđivanje analoga predmetnog otkrića u kombinaciji sa insulinom tako da analog puferuje hipoglikemijske efekte bolus primene insulina.
U nekim primerima izvođenja, analozi glukagona su korišćeni zajedno sa parenteralnom primenom hranljivih sastojaka na nedijabetičke pacijente u bolničkom okruženju, npr., na pacijente koji primaju parenteralnu ishranu ili totalnu parenteralnu ishranu. Neograničavajući primeri obuhvataju pacijente koji su imali operaciju, pacijente u komi, pacijente sa bolešću digestivnog trakta ili nefunkcionalnim gastrointestinalnim traktom (npr. kao posledica hirurškog odstranjivanja, blokade ili oštećenog apsorptivnog kapaciteta, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, opstrukcije gastrointestinalnog trakta, fistule gastrointestinalnog trakta, akutnog pankreatitisa, ishemičnog creva, velike gastrointestinalne operacije, određenih kongenitalnih anomalija gastrointestinalnog trakta, produženu dijareju ili sindrom skraćenog creva kao posledica operacije, pacijenata u šoku i pacijenata koji prolaze kroz proces lečenja često primaju parenteralnu primenu ugljenih hidrata zajedno sa različitim kombinacijama lipida, elektrolita, minerala, vitamina i aminokiselina. Analozi glukagona i parenteralna hranljiva kompozicija može biti primenjena u isto vreme, u različita vremena, jedan pre ili posle drugog, uz uslov da analog glukagona ispoljava željeni biološki efekat u vreme kada se parenteralna hranljiva kompozicija digestira. Na primer, parenteralna ishrana može biti primenjivana, 1, 2 ili 3 puta na dan, dok je analog glukagona primenjivan jednom svakog drugog dana, tri puta nedeljno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno, jednom svake 2 nedelje, jednom svake 3 nedelje ili jednom mesečno.
Kao što su ovde korišćeni, termini "lečenje," i "prevencija" kao i reči koje od njih potiču, ne ukazuju neophodno na 100% ili potpuno lečenje ili prevenciju. Radije, postoje različiti stepeni tretmana ili prevencije koje stručnjak iz date oblasti tehnike prepoznaje kao da ima potencijalnu korist ili terapeutski efekat. U tom smislu, inventivni postupci mogu da obezbede bilo koju količinu bilo kog nivoa lečenja ili prevencije bolesti ili medicinskog stanja kod sisara. Pored toga, lečenje ili prevencija obezbeđena postupkom može da obuhvata lečenje ili prevenciju jednog ili više stanja ili simptoma bolesti ili medicinskog stanja. Na primer, u vezi sa postupcima za lečenje gojaznosti, postupak u nekim primerima izvođenja, postiže smanjenje u unosu hrane ili nivoa masti kod pacijenta. Takođe, za svrhe koje su ovde navedene, "prevencija" može da obuhvata odlaganje početka bolesti ili simptoma ili njegovog stanja.
U vezi sa gore navedenim postupcima za lečenje, pacijent je bilo koji domaćin. U nekim primerima izvođenja, domaćin je sisar. Kao što je ovde korišćen, termin "sisar" označava bilo koju životinju kičmenjaka klase sisara, uključujući, ali bez ograničenja na, bilo koji od taksona kljunara, torbara i placentalnih taksona. U nekim primerima izvođenja, sisar je jedan od sisara reda Rodentia, kao što su miševi i hrčci, i sisari reda Lagomorpha, kao što su zečevi. U određenim primerima izvođenja, sisari su iz reda Carnivora, uključujući Felines (mačke) i Canines (pse). U određenim primerima izvođenja, sisari su iz reda Artiodactyla, uključujući Bovines (krave) i svinje ili iz reda Perssodactyla, uključujući Equines (konje). U nekim slučajevima, sisari su iz reda Primata, Ceboida ili Simoida (majmuna) ili iz reda Antropoida (ljudi i majmuni). U posebnim primerima izvođenja, sisar je čovek.
Kompleti
Analozi glukagona predmetnog otkrića mogu biti obezbeđeni u skladu sa jednim primerom izvođenja kao deo kompleta. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, obezbeđen je komplet za primenu analoga glukagona, npr., agonistički peptid glukagona, na pacijenta kod koga postoji potreba za tim, pri čemu komplet sadrži analog glukagona kao što je ovde opisan.
U jednom primeru izvođenja komplet je obezbeđen sa uređajem za primenu kompozicije glukagona na pacijenta, npr., špricom, olovka špric, jet injector ili drugim injektorom bez igle. Komplet može alternativno ili dodatno da sadrži jedan ili više spremnika, npr., vijalica, epruveta, bočica, prethodno napunjenih špriceva sa jednom ili više komora, kertridža, infuzionih pumpi (spoljašnjih ili implantirajućih), mlaznih injektora, prethodno napunjenih špric olovaka i slično, izborno koji sadrže analog glukagona u liofilizovanom obliku ili u vodenom rastvoru. Kompleti u nekim primerima izvođenja sadrže uputstva za upotrebu. U skladu sa jednim primerom izvođenja uređaj kompleta je uređaj za primenu aerosola, pri čemu je kompozicija prethodno spakovana unutar uređaja za aerosol. U sledećem primeru izvođenja komplet sadrži špric i iglu, i u jednom primeru izvođenja sterilna kompozicija šprica je prethodno pakovana unutar šprica.
Sledeći primeri su dati samo za ilustraciju predmetnog pronalaska, a ne za ograničavanje njegovog obima ni na koji način.
PRIMERI
PRIMER 1
Sinteza peptidnih fragmenata glukagona
Materijali:
Svi peptidi koji su opisani ovde u PRIMERIMA su amidovani osim ukoliko nije naznačeno drugačije.
MBHA smola (4-metilbenzhidrilamin polistiren smola je korišćena u toku sinteze peptida. MBHA smola, 100-180 mreža, 1% DVB unakrsno-vezani polistiren; punjenje od 0.7-1.0 mmol/g), Boc-zaštićene i Fmoc zaštićene aminokiseline su kupljene iz Midwest Biotech. Čvrsto fazna sinteza peptida upotrebom Boc-zaštićenih aminokiselina je izvedena na Applied Biosystem 430A Peptide Synthesizer. Sinteza Fmoc zaštićene aminokiseline je izvedena upotrebom Applied Biosystems Model 433 Peptide Synthesizer.
Sinteza peptida (Boc aminokiseline/HF cepanje):
Sinteza ovih analoga je izvedena na Applied Biosystem Model 430A Peptide Synthesizer. Sintetički peptidi su konstruisani sekvencijalnim dodavanjem aminokiselina u kertridž koji sadrži 2 mmol Boc zaštićene aminokiseline. Specifično, sinteza je izvedena upotrebom Boc DEPBT-aktiviranih pojedinačnih kuplovanja. Na kraju koraka kuplovanja, peptidil-smola je tretirana sa TFA da bi se uklonila N-terminalna Boc zaštićena grupa. Ispirana je više puta sa DMF i ovaj ponavljajujući ciklus je ponavljan željeni broj koraka kuplovanja. Posle sklapanja, zaštita bočnog lanca, Fmoc, je uklonjena sa 20% piperidinskim tretmanom i acilacija je izvedena upotrebom DIC. Peptidil-smola na kraju cele sinteze je sušena upotrebom DCM, i peptid je odcepljen sa smole sa anhidrovanim HF.
Za laktamizaciju, ortogonalne zaštitne grupe su izabrane za Glu i Lys (npr., Glu(Fm), Lys(Fmoc)). Posle uklanjanja zaštitnih grupa i pre HF cepanja, ciklizacija je izvedena kao što je prethodno opisano (videti, npr., objavu međunarodne patentne prijave br. WO2008/101017).
HF tretman peptidil-smole
Peptidil-smola je tretirana sa anhidrovanim HF, i ovo je tipično proizvelo približno 350 mg (~50% prinos) sirovog deprotektovanog peptida. Specifično, peptidil-smola (30mg do 200mg) je postavljena u reakcionu posudu sa vodonik fluoridom (HF) za cepanje. 500 µL p-krezola je dodato u posudu kao akceptor jona karbonijuma. Posuda je vezana za HF sistem i potopljena u smeši metanola/suvog leda. Posuda je ispražnjena sa vakuumskom pumpom i 10 ml HF je destilovano u reakcionu posudu. Ova reakciona smeša peptidil-smole i HF je mešan jedan čas na 0°C, nakon čega je uspostavljen vakuum i HF je brzo ispražnjen (10-15 min). Posuda je pažljivo uklonjena i napunjena sa približno 35 ml etra da bi se istaložio peptid i ekstrahovao p-krezol i mali molekuli organske zaštine grupe koje su rezultat HF tretmana. Ova smeša je filtrirana upotrebom teflonskog filtera i ponovljena dva puta da bi se uklonio višak krezola. Ovaj filtrat je odbačen. Istaloženi peptid se rastvara u približno 20 ml od 10% sirćetne kiseline (vodeni rastvor). Ovaj filtrat, koji je sadržao željeni peptid, je sakupljen i liofilizovan.
Analitička HPLC analiza sirovog solubilizovanog peptida je izvedena pod sledećim uslovima [4.6X 30 mm Xterra C8, 1.50 mL/min, 220 nm, A pufer 0.1% TFA/10% ACN, B pufer 0.1% TFA/100% ACN, gradijent 5-95% B tokom 15 minuta]. Ekstrakt je razblažen dva puta sa vodom i sipan na 2.2 X 25 cm Vydac C4 preparativnu reverzno-faznu kolonu i eluiran upotrebom gradijenta acetonitrila na Waters HPLC sistemu (A pufer od 0.1 % TFA/10% ACN, B pufer od 0.1 % TFA/10% CAN i gradijent od 0-100% B tokom 120 minuta na protoku od 15.00 ml/min. HPLC analiza prečišćenog peptida pokazala je veću od 95% čistoću i elektrosprej jonizacija-masena spektralna analiza je korišćena da bi se potvrdio identitet peptida.
Acilacija peptida
Acilovani peptidi su pripremljeni na sledeći način. Peptidi su sintetisani na čvrstoj podlozi smole upotrebom CS Bio 4886 Peptide Synthesizer ili Applied Biosystems 430A Peptide Synthesizer. In situ neutralizacija je korišćena kao što je opisano od strane Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992). Za acilovane peptide, ciljni aminokiselinski ostatak koji će se acilovati (npr., položaj deset, u odnosu na aminokiselinski položaj od SEQ ID NO: 3) je supstituisan sa N ε -FMOC lizinskim ostatkom. Tretman kompletnog N-terminalno BOC zaštićenog peptida sa 20% piperidinom u DMF u trajanju od 30 minuta uklonio je FMOC/formil grupe. Kuplovanje sa slobodnim ε-amino Lys ostatkom je postignuto spajanjem desetostrukog molarnog viška FMOC-zaštićene spejser aminokiseline (pr. FMOC-Glu-OtBu) ili acil lanca (pr. CH3(CH2)14-COOH) i PyBOP ili DEPBT kuplujućeg reagensa u DMF/DIEA. Kasnije uklanjanje FMOC grupe spejser aminokiseline je praćeno ponavljanjem kuplovanja sa acil lancem. Finalni tretman sa 100% TFA rezultovao je u uklanjanju bilo kojih zaštitnih grupa bočnog lanca i N-terminalne BOC grupe. Peptidne smole su bile neutralizovana sa 5% DIEA/DMF, sušene i zatim odcepljene iz podloge upotrebom HF/p-krezola, 95:5, na 0°C za jedan čas. Posle etarske ekstrakcije, 5% HOAc rastvor je korišćen za solvatiranje sirovog peptida. Zatim je potvrđeno da uzorak rastvora sadrži peptid ispravne molekulske težine pomoću ESI-MS. Ispravni peptidi su prečišćeni pomoću RP-HPLC upotrebom linearnog gradijenta od 10% CH3CN/0.1% TFA do 0.1% TFA u 100% CH3CN. Vydac C18 22 mm x 250 mm proteinska kolona je korišćena za prečišćavanje. Acilovani peptidni analozi generalno su završili eluiranje sa odnosom pufera od 20:80. Porcije su sakupljene i proverene u odnosu na čistoću na analitičkoj RP-HPLC. Čiste frakcije su liofilizovane proizvodeći bele, čvrste peptide.
Ako je peptid sadržao laktamski most i ciljne ostatke koji će biti acilovani, acilacija je izvedena kao što je opisano u prethodnom tekstu posle dodavanja te aminokiseline peptidnoj osnovi.
PEGilacija peptida
Za PEGilaciju peptida, 40 kDa metoksi poli(etilen glikol) idoacetamid (NOF) je reagovao sa molarnim ekvivalentom peptida u 7M Urea, 50mM Tris-HCl puferu upotrebom minimalne količine rastvarača koja je potrebna da se rastvore oba, peptid i PEG u bistar rastvor (generalno manje od 2 mL za reakciju upotrebom 2-3 mg peptida). Snažno mešanje na sobnoj temperaturi trajalo je 4-6 časova i reakcija je analizirana pomoću analitičke RP-HPLC. PEGilovani proizvodi su se javili posebno od početnog materijala sa smanjenim retecionim vremenima. Prečišćavanje je izvedeno na Vydac C4 koloni sa uslovima sličnim onima korišćenim za početno prečišćavanje peptida. Eluiranje se javilo oko odnosa pufera od 50:50. Frakcije čistog PEGilovanog peptida su nađene i liofilizovane. Prinosi su bili iznad 50%, i varirali su po reakciji.
Analiza upotrebom masene spektrometrije
Maseni spektri su dobijeni upotrebom Sciex API-111 elektrosprej quadrapole masenog spektrometra sa standardnim ESI jonskim izvorom. Uslovi jonizacije koji su korišćeni kao što sledi: ESI u pozitivnom-jonskom režimu; jonska sprej voltaža, 3.9 kV; potencijal otvora, 60 V. Korišćeni nebulizujući i gas za formiranje zavese bio je azot na stopi protoka od .9 L/min. Maseni spektri su beleženi od 600-1800 Thompsons na 0.5 Th po koraku i za 2 msec vreme zadržavanja. Uzorak (oko 1mg/mL) je rastvoren u 50% vodenom rastvoru acetonitrila sa 1% sirćetnom kiselinom i uveden pomoću spoljašnje špric pumpe pri stopi od 5 µL/min.
Kada su peptidi analizirani u PBS rastvoru pomoću ESI MS, oni su prvo desaltirani upotrebom ZipTip čvrstofaznog ekstrakcionog vrha koji sadrži 0.6 µL C4 smole, prema uputstvima obezbeđenim od strane proizvođača (Millipore Corporation, Billerica, MA, videti vebsajt Millipore na world wide web na millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737).
Analiza tečne hromatografije visokog učinka (HPLC):
Preliminarne analize su izvedene sa ovim sirovim peptidima da bi se dobila aproksimacija njihovih relativnih stopa konverzije u fosfatnom puferu (PBS) (pH, 7.2) upotrebom tečne hromatografije visokog učinka (HPLC) i MALDI analize. Uzorci sirovog peptida su rastvoreni u PBS puferu u koncentraciji od 1 mg/ml. 1 ml dobijenog rastvora je čuvan u 1.5 ml HPLC vijalici koja je zatim hermetički zatvorena inkubirana na 37°C. Alikvote od 100 µl su uzimane u različitim vremenskim intervalima, hlađene do sobne temperature i analizirane pomoću HPLC.
HPLC analize su izvedene upotrebom Beckman System Gold Chromatography sistema upotrebom UV detektora na 214 nm. HPLC analize su izvedene na 150 mm x 4.6 mm C18 Vydac koloni. Stopa protoka je bila 1 ml/min. Rastvarač A je sadržao 0.1 % TFA u destilovanoj vodi i rastvarač B je sadržao 0.1 % TFA u 90% CH3CN. Korišćen je linearni gradijent (40% do 70%B za 15 minuta). Podaci su sakupljeni i analizirani upotrebom Peak Simple Chromatography softvera.
Početne stope hidrolize su korišćene za merenje stope konstantne disocijacije odgovarajućih prolekova. Koncentracije proleka i leka su procenjivane iz njihovih površina ispod pika respektivno. Prvi red stopa konstantni disocijacije prolekova su određene formiranjem grafikona logaritma koncentracije proleka u različitim vremenskim intervalima. Nagib ovog grafikona daje stopu konstante ’k’. Polu-životi razlaganja različith prolekova su zatim izračunavani upotrebom formule t1/2 = .693/k.
PRIMER 2
Sinteza peptida od Seq ID No. 17
Peptid seq ID no. 17 je sintetisan pomoću čvrste faze upotrebom Fmoc/t-Bu hemijskog postupka. Za pripremu peptida, 0.5 g 2-hlorotritil-smole (100-200 mreža, 1.18 mmol/g) (GL Biochem) su prvo derivatizovani inkubacijom sa 0.8 ekvivalenata (ekv.). Fmoc-Gln(Trt)-OH, 4 ekv. U odnosu na aminokiselinu diizopropiletilamin (DIPEA) u suvom DCM (dihlorometanu) u trajanju od 2 časa. Sklapanje peptidne sekvence je zatim izvedeno na peptidnom multisintisajzeru APEX396 (Advanced Biotech). Sve aminokiseline su rastvorene u koncentraciji od 0.5M u DMF (N,N-dimetil formamidu). Reakcije acilacije su izvođene u trajanju od 60 min sa 6-strukim viškom aktivirane aminokiseline preko amino grupa bez smole. Dvostruke acilacije su izvedene za Aib2, Aib16, Asp15, His1. Aminokiseline su aktivirane sa ekvimolarnim količinama HATU (2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronijum heksafluorofosfata), 0.5 M rastvorom u DMF, i 2-strukim molarnim viškom DIEA (N,N-diizopropiletilamina), 2 M rastvorom u NMP (1-metil-2-pirolidinonu).
Zaštitne grupe bočnih lanaca bile su: terc-butil za Asp i Glu, Ser, Thr i Tyr; tritil za Asn, Gln i His; terc-butoksi-karbonil za Lys, Trp; i, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil za Arg; Boc-His(Trt)-OH je korišćen u sintezi.
Lizin na položaju 10, koji će biti derivatizovan na bočnom lancu, ugrađen je kao Lys(Alloc). Na kraju sklapanja Alloc zaštitna grupa je uklonjena i sinteza je završena kondenzacijom dva ostatka γ-karboksiglutaminske kiseline (4 ekv.) i palmitinske kiseline (4 ekv.) upotrebom HBTU (4 ekv.; (O-benzotriazol-1-il-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat), i DIPEA (8 ekv.) kao aktivatori.
Na kraju sinteze, suve peptidne-smole su pojedinačno tretirane sa 25 mL smeše za cepanje, 88% trifluorosirćetne kiseline (TFA), 5% fenola , 2% triizopropilsilana i 5% vode u trajanju od 2 časa na sobnoj temperaturi. Smola je filtrirana i zapremina rastvora je smanjena i zatim dodata u hladan metil-t-butil etar da bi se peptid istaložio. Posle centrifugiranja, peptidni talozi su isprani sa svežim, hladnim metil-t-butil etrom da bi se uklonili organski skavendžeri. Postupak je ponovljen dva puta. Krajnji talozi su sušeni, resuspendovani u H2O, 20% acetonitrilu i liofilizovani.
Sirovi peptidi su prečišćeni pomoću reverzno-fazne HPLC upotrebom preparativne Waters XBridge C18 (50 x 150 mm, 5 µm) i upotrebom kao eluenata (A) 0.1% TFA u vodi i (B) 0.1 % TFA u acetonitrilu. Analitička UPLC je izvedena na Waters Chromatograph, sa BEH130, C18 Acquity , 1.7 µm koloni, 2.1 x 100 mm, (Waters), na 45°C, upotrebom H2O, 0.1% TFA (A) i CH3CN, 0.1% TFA (B) kao rastvarača. Prečišćeni peptid je okarakterisan pomoću elektrosprej masene spektrometrije na Waters SQ Detector.
PRIMER 3
Sposobnost svakog peptida da indukuje cAMP je merena u reporter analizi na bazi luciferaze svica. Proizvodnja cAMP koja je indukovana direktno je proporcionalna vezivanju fragmenta glukagona za receptor za glukagon ili GLP-1 receptor. HEK293 ćelije ko-transficirane sa receptorom za glukagon ili GLP-1 receptorom, respektivno, i gen za luciferazu vezan za cAMP responsivni element su korišćeni za biološku analizu.
Ćelije su lišene seruma kultivisanjem 16 časova u Dulbecco-modifikovanom minimalnom esencijalnom medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) dopunjenom sa 0.25% goveđim serumom rasta (HyClone, Logan, UT) i zatim inkubirane sa serijskim razblaženjima fragmenata glukagona u trajanju od 5 časova na 37°C, 5% CO2 u 96 komornim "Biocoat" pločama obloženim sa poli-D-lizinom (BD Biosciences, San Jose, CA). Na kraju inkubacije, 100 µL LucLite luminescentnog supstratnog reagensa (Perkin Elmer, Wellesley, MA) dodato je u svaku komoricu. Ploča je kratko mućkana, inkubirana 10 min u mraku i svetlosti i proizvodnja je merena na MicroBeta-1450 tečnom scintilacionom brojaču (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Efikasne 50% koncentracije (EC50) su izračunavane upotrebom Origin softvera (OriginLab, Northampton, MA).
PRIMER 4
In vitro agonističke potencije peptida od SEQ ID NO. 17 su određene upotrebom ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO-K1) koje stabilno eksprimiraju humani GLP-1R, GCGR ili GIPR. Izogeni pulovi stabilne ćelijske linije GLP-1R i GCGR su generisani pomoću Invitrogen™ upotrebom njihove Jump-In™ ciljne integracione tehnologije, dok su stabilne CHO/GIPR linije generisane preko tehnika klasičnog kloniranja i transfekcije (slučajna integracija) sa ograničenim razblaženjem za izbor klonova. Peptidi su testirani in vitro za njihove relativne sposobnosti da stimulišu proizvodnju cAMP u različitim ćelijskim linijama upotrebom DiscoveRx Hithunter™ cAMP XS+ kompleta za analizu (cat# 90-0075L) prema uputstvima iz kompleta. Peptidne 50% efikasne koncentracije (EC50s) su izračunavane pomoću ne-linearne regresione analize fitovanja 4-parametarske krive, GraphPad Prism 4 softvera (GraphPad Software, San Diego, CA) formiranjem grafikona vrednosti luminescencije prema dozama peptida.
PRIMER 5
Peptidi koji imaju aminokiselinske sekvence kao što su opisane u spisku sekvenci su napravljeni kao što je uglavnom opisano u Primeru 1 ili 2 i zatim testirano za in vitro agonističku aktivnost na svakom od receptora za glukagon i GLP-1 receptora kao što je uglavnom opisano u Primeru 3 ili 4. U nekim slučajevima, in vitro agonistička aktivnost na GIP receptoru je takođe testirana. Rezultati su prikazani u daljem tekstu u tabeli 1.
TABELA 1
SEQ ID NO:
Sekvenca
EC50 (nM) na receptoru za glukagon
EC50 (nM) na GLP-1 receptoru
EC50 (nM) na GIP receptoru
12
0.010
0.003
12.763
13
2.806
0.567
139.639
14
0.003
0.003
976
15
0.006
0.005
1.901
16
0.015
0.019
1.038
17
0.11
0.075
> 2000
EC50 vrednosti za peptide od SEQ ID Nos. 12 - 16 su dobijene upotrebom postupka iz Primera 3. EC50 vrednost za peptid od SEQ ID NO 17 je dobijena upotrebom postupka iz Primera 4.
Kao što je pokazano u Tabeli 1, mnogi od peptida ispoljavaju EC50 na GLP-1 receptoru u nanomolarnom ili pikomolarnom opsegu.
PRIMER 6
Miševi kod kojih je gojaznost indukovana ishranom (DIO) su podeljeni u grupe od osam miševa po grupi i određena je početna srednja vrednost telesne težine svake grupe. Svakoj grupi miševa je subkutano injektirana jednom dnevno doza peptida ili kontrole nosača u trajanju od jedne nedelje. Peptidi koji su testirani u ovoj studiji bili su peptidi od SEQ ID NOs: 12-16. Primenjene doze su varirale između 1 i 10 nmol/kg za svaki od testiranih peptida. Telesna težina, sastav tela, unos hrane i nivoi glukoze u krvi su određivani periodično tokom test perioda.
Da bi se bolje odredio efekat ovih peptida na nivoe glukoze u krvi, izveden je drugi eksperiment sa db/db miševima. U ovom eksperimentu, db/db miševi su podeljeni u grupe od osam miševa po grupi i određena je početna srednja vrednost telesne težine svake grupe. Svakoj grupi miševa je subkutano injektirana jedna doza peptida jednog od SEQ ID NOs: 12-16, pri čemu je doza unutar opsega od 3 i 30 nmol/kg. Telesna težina, sastav tela, unos hrane i nivoi glukoze u krvi su određivani periodično tokom test perioda.
PRIMER 7
In vivo efekti određenih peptida kao što su ovde opisani su potvrđeni kod miševa kod kojih je gojaznost indukovana ishranom (DIO) koji su održavani na ishrani sa visokim sadržajem masti u trajanju od 16 nedelja i imali su početnu telesnu težinu od ∼ 47 g. Na miševe je primenjivana kontrola nosača ili doza peptida jednom dnevno u trajanju od devet dana. Peptidi testirani u ovoj studiji uključili su peptid od SEQ ID NO: 12, peptid od SEQ ID NO: 17, peptid od SEQ ID NO: 18, i peptid od SEQ ID NO: 19. Doze svakog peptida su varirale – svaki od peptida od SEQ ID NO: 12, 17 i 19 je primenjivan u dozi od 3 nmol/kg ili 9 nmol/kg, dok je peptid od SEQ ID NO: 18 primenjivan u dozi od 1 nmol/kg, 3 nmol/kg ili 9 nmol/kg. Kumulativna promena telesne težine (u gramima) je merena svakog dana studije i rezultati su prikazani na Slici 1. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM.
Svaki od peptida testiranih u ovoj studiji pokazao je efekat snižavanja telesne težine. Svaka grupa miševa na koje je primanjivan peptid u dozi od 3 nmol/kg ili 9 nmol/kg pokazala je smanjenu telesnu težinu (u poređenju sa miševima tretiranim nosačem) već od dana 1 studije. Na dan 9 studije, miševi na koje je primenjivano 3 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 12 pokazali su približno 5.3% smanjenje telesne težine, dok su miševi na koje je primenjivana doza od 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 12 pokazali približno 29.8% gubitka u telesnoj težini. Na dan 9 studije, miševi na koje je primenjivano 3 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 17 pokazali su približno 9.6% smanjenje telene težine, dok su miševi na koje je primenjeno 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 17 pokazali približno 35.5% gubitak u telesnoj težini. Na dan 9 studije, miševi na koje je primenjivano 3 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 18 pokazali su približno 12.3% smanjenje telesne težine, dok su miševi na koje je primenjeno 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 18 pokazali približno 26.8% gubitak u telesnoj težini. Na dan 9 ove studije, miševi na koje je primenjivano 3 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 19 pokazali su približno 8.1 % smanjenje telesne težine, dok su miševi na koje je primenjivano 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 19 pokazali približno 31.5% smanjenje u telesnoj težini.
Pored kumulativne promene u telesnoj težini, mereni su bazalni nivoi glukoze DIO miševa. Kao što je pokazano na Slici 2, miševi na koje je primenjivana doza od 3 nmol/kg ili 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 18 pokazali su značajno smanjenje u bazalnoj glukozi do dana 4 (-29% naspram nosača; P < 0.05). Miševi koji su primali 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 19 pokazali su približno 40% smanjenje u nivoima glukoze na dan 4 (u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nosač; P < 0.05), približno 39% smanjenje u nivoima glukoze na dan 7 (u poređenju sa kontrolim miševima koji su primali nosač; P < 0.05), i približno 26% smanjenje u nivoima glukoze na dan 9 (u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nosač; P < 0.05).
Miševi koji su primali 9 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 17 pokazali su približno 48% smanjenje u nivoima glukoze na dane 4 i 7 (u poređenju sa kontrolinm miševima koji su primali nosač; P < 0.05), približno 45% smanjenje u nivoima glukoze na dan 9 (u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nosač; P < 0.05). Miševi koji su primali 3 nmol/kg peptida od SEQ ID NO: 17 pokazali su približno 28% smanjenje u nivoima glukoze na dan 7 (u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nosač; P < 0.05) i približno 19% smanjenje u nivoima glukoze na dan 9 (u poređenju sa kontrolnim miševima koji su primali nosač; P < 0.05).
PRIMER 8
In vivo efekti peptida kao što su ovde opisani su potvrđeni kod gojaznih rezus majmuna primenom jednom dnevno u trajanju od 21 dana kontrole nosača, komercijalno dostupnog proizvoda (Liraglutid), peptida od SEQ ID NO: 20, ili peptida od SEQ ID NO: 17. Liraglutid je primenjivan u dozi od 20 µg/kg s.c., dok je svaki od peptida od SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 20 primenjivan u dozi od 3 µg/kg s.c. Svi peptidi su imali sličnu farmakokinetiku (do/2~10 h) i slično vezivanje proteina plazme kod rezus majmuna (> 98%). Mereni su telesna težina i unos hrane.
Kao što je prikazano na slici 3A, na gojazne majmune na koje je primenjivan peptid od SEQ ID NO: 17 pokazali su bolji gubitak telesne težine (-1.2 kg naspram polazne vrednosti i nosača, P < 0.05), u poređenju sa Liraglutidom i peptidom od SEQ ID NO: 20.
Značajno smanjenje u unosu hrane (izraženo kao % promene naspram polazne vrednosti na Slici 3B), je zabeleženo posle tretmana sa liraglutidom (-13.1 ± 1.9%) ili sa peptidom od SEQ ID NO: 17 (-25.7% ± 3.2%, P < 0.05 naspram Liraglutida). Posle jedne nedelje ispiranja, životinje tretirane peptidom od SEQ ID NO: 17 su povratile veći deo telesne težine koji je izgubljen u toku hroničnog tretmana (dan 28). Na slikama 3A i 3B, podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM. *P < 0.05 naspram nosača, ^P < 0.05 peptid od SEQ ID NO: 17 naspram Liraglutida. ;PRIMER 9 ;In vivo efekti peptida prema pronalasku su testirani kod dijabetičkih rezus majmuna (n=7) koji su bili starosti 16-26 godina i imali su prosečnu telesnu težinu od ~22 kg. Na dijabetičke rezus majmune (n=7) koji su bili starosti 16-26 godina sa srednjom telesnom težinom od ~22 kg primenjivana je kontrola nosač, Liraglutid u dozi od 10 µg/kg s.c. ili peptid od SEQ ID NO: 17 u dozi od 1 µg/kg s.c. u trajanju od 10 dana. ;Telesna težina je merena u toku studije i nađeno je da nije zabeležen efekat na telesnu težinu kod ovih životinja u toku perioda tretmana. ;Na kraju svakog tretmana, merena je glukoza pri gladovanju (FBG), a zatim je prvo sledio test tolerancije obroka (MTT) za procenu tolerancije glukoze. Kao što je prikazano na Slici 4, dijabetički majmuni tretirani peptidom od SEQ ID NO: 17 pokazali su značajno smanjen FBG (120 ± 20 naspram 158 ± 15 mg/mL, peptid od SEQ ID NO: 17 naspram nosača (-25%), P<0.05; Slika 4). Takođe, majmuni tretirani peptidom od SEQ ID NO: 17 pokazali su poboljšanu toleranciju glukoze u toku MTT u poređenju sa kontrolnim majmunima koji su primali nosač (Slika 4). Podaci su izraženi na Slici 4 kao srednja vrednost ± SEM. *P < 0.05 naspram nosača.
Upotreba termina "a" i "an" i "the" i slične reference u kontekstu opisivanja pronalaska (naročito u kontekstu sledećih patentnih zahteva) trebalo bi tumačiti tako da pokrivaju jedninu i množinu, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ovde ili kontekst jasno nalaže suprotno. Termini "sadrži," "ima," "uključujući," i "koji sadrži" treba tumačiti kao otvorene termine (tj., označavaju "uključujući, ali bez ograničenja na,") osim ukoliko nije drugačije naznačeno.
Navođenje opsega vrednosti ovde je samo određeno da služi kao skraćeni postupak pozivanja pojedinačno na svaku posebnu vrednost koja spada unutar opsega i svaku krajnju tačku, osim ukoliko nije drugačije ovde naznačeno, i svaka posebna vrednost i krajnja tačka su obuhvaćene u specifikaciji kao da su pojedinačno ovde navedene.
Svi postupci koji su ovde opisani mogu biti izvedeni po bilo kom pogodnom redosledu osim ukoliko nije ovde drugačije naznačeno ili ukoliko kontekst jasno nalaže suprotno. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primer izraza (npr., "kao što je") koji su ovde dati, je određena samo za bolje razumevanje pronalaska i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska osim ukoliko nije drugačije navedeno u patentnim zahtevima. Nijedan izraz u specifikaciji ne bi trebalo tumačiti kao da označava bilo koji element za koji se ne traži zaštita kao esencijalan za izvođenje pronalaska.
Poželjni primeri izvođenja ovog pronalaska su ovde opisani, uključujući najbolji način poznat pronalazačima za izvođenje pronalaska. Varijacije ovih poželjnih primera izvođenja mogu biti očigledne stručnjacima iz date oblasti tehnike posle čitanja gore navedenog opisa. Pronalazači očekuju da stručnjaci iz date oblasti tehnike koriste takve varijacije kako je odgovarajuće, i pronalazači su odredili da se pronalazak izvodi na drugi način nego što je ovde specifično određeno. Prema tome, ovaj pronalazak obuhvata sve modifikacije i ekvivalente predmeta navedenog u patentnim zahtevima koji su ovde priloženi kao što dozvoljava važeći zakon. Pored toga, bilo koja kombinacija gore opisanih elemenata u svim mogućim njihovim varijacijama je obuhvaćena u pronalasku osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
SPISAK SEKVENCI
<110> DiMarchi, Richard
<120> Koagonisti receptora za glukagon/GLP-1 receptora
<130> 31135/46342 PCT
<150> US-61/500,027
<151> 2011-06-22
<150> US-61/547,360
<151> 2011-10-14
<160> 22
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> Nativni humani glukagon
<400> 1
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> GLP-1
<400> 2
<210> 3
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> GLP-2
<400> 3
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> Oksintomodulin
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> GLP1 (7-36 amid)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 5
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> GLP-1 (7-37 kiselina)
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> Heloderma suspectum
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> Eksendin-4
<400> 7
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<400> 8
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<400> 10
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<400> 11
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Xaa je gama-Glu
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 12
<210> 13
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (24) .. (24)
<223> Kovalentno vezana za PEG
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> Xaa je gama-Glu
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 13
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Ser
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu spejsera
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> Xaa je gama-Glu
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 14
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27) .. (27)
<223> Xaa je metionin sulfoksid
<400> 15
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovan sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<400> 16
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Xaa je gama-Glu
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (31)..(31)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 17
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (29) .. (29)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 18
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> D-Ser
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu spejsera
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (29) .. (29)
<223> C-terminalna amidacija
<400> 19
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> D-Glu
<400> 20
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<223> Liraglutid
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (20)..(20)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu spejsera
<400> 21
<210> 22
<211> 32
<212> PRT
<213> Veštačka sekvenca
<220>
<223> Sintetički peptid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> RAZNOVRS_KARAKTERISTIKA
<222> (10)..(10)
<223> Acilovana sa C16 masnom acil grupom preko gama-Glu-gama-Glu spejsera
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Xaa je AIB
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28) .. (28)
<223> Xaa je Orn
<400> 22

Claims (11)

1. Peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence od:SEQ ID NO: 17.
2. Peptid prema patentnom zahtevu 1; ili njegova faremaceutski prihvatljiva so.
3. Konjugat koji sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1 ili 2 konjugovan sa heterolognim delom, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, pri čemu konjugat ispoljava pojačanu aktivnost na GLP-1 receptoru, u poređenju sa nativnim glukagonom, i ispoljava najmanje 100-puta veću selektivnost za humani GLP-1 receptor naspram GIP receptora.
4. Konjugat prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što heterologni deo sadrži jedan ili više od: peptida, polipeptida, molekula nukleinske kiseline, antitela ili njegovog fragmenta, polimera, kvantne tačke, malog molekula, toksina, dijagnostičkog sredstva, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
5. Konjugat prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što, heterologni deo je peptid i konjugat je fuzioni peptid ili himerni peptid, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
6. Konjugat prema patentnom zahtevu 5, koji sadrži produžetak od 1-21 aminokiselina C-terminalno prema aminokiselini na položaju 31 peptida prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
7. Konjugat prema patentnom zahtevu 6, naznačen time što je produžetak izabran iz grupe koja se sastoji od: Gly, Glu, Cys, Gly-Gly, Gly-Glu, GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 9) ili GGPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 10), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
8. Dimer ili multimer koji sadrži peptid prema patetnom zahtevu 1 ili 2, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.
9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži peptid prema patentnom zahtevu 1 ili 2, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so; konjugat prema patentnom zahtevu 3 do 7, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; dimer ili multimer prema patentnom zahtevu 8, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so; ili njihova kombinacija, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
10. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 9, koja dalje sadrži antidijabetičko sredstvo ili sredstvo protiv gojaznosti.
11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 9 ili 10 za upotrebu u lečenju bolesti ili medicinskog stanja izabranog iz grupe koja se sastoji od: metaboličkog sindroma, dijabetesa, gojaznosti, steatoze jetre i neurodegenerativne bolesti.
MEP-2017-169A 2011-06-22 2012-06-12 Koagonisti receptora za glukagon/glp-1 receptora ME02816B (me)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161500027P 2011-06-22 2011-06-22
US201161547360P 2011-10-14 2011-10-14
EP12802005.4A EP2723367B1 (en) 2011-06-22 2012-06-12 Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
PCT/US2012/042084 WO2012177443A2 (en) 2011-06-22 2012-06-12 Glucagon/glp-1 receptor co-agonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02816B true ME02816B (me) 2018-01-20

Family

ID=47362408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2017-169A ME02816B (me) 2011-06-22 2012-06-12 Koagonisti receptora za glukagon/glp-1 receptora

Country Status (34)

Country Link
US (5) US20140221283A1 (me)
EP (1) EP2723367B1 (me)
JP (1) JP6179864B2 (me)
KR (1) KR101972617B1 (me)
CN (1) CN103857408B (me)
AR (1) AR086998A1 (me)
AU (1) AU2012273364B2 (me)
CA (1) CA2839686C (me)
CL (1) CL2013003688A1 (me)
CO (1) CO6821895A2 (me)
CY (1) CY1119577T1 (me)
DK (1) DK2723367T3 (me)
DO (1) DOP2013000310A (me)
EA (1) EA031230B1 (me)
EC (1) ECSP13013097A (me)
ES (1) ES2636445T3 (me)
GE (1) GEP20176629B (me)
GT (1) GT201300319A (me)
HR (1) HRP20170890T1 (me)
HU (1) HUE035776T2 (me)
IL (1) IL230061B (me)
LT (1) LT2723367T (me)
ME (1) ME02816B (me)
MX (1) MX347703B (me)
NI (1) NI201300143A (me)
PE (1) PE20140724A1 (me)
PH (1) PH12013502671A1 (me)
PL (1) PL2723367T3 (me)
PT (1) PT2723367T (me)
RS (1) RS56173B1 (me)
SI (1) SI2723367T1 (me)
TW (1) TWI554518B (me)
WO (1) WO2012177443A2 (me)
ZA (1) ZA201309626B (me)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8546327B2 (en) 2008-06-17 2013-10-01 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
KR20120087875A (ko) 2009-06-16 2012-08-07 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 Ｇｉｐ 수용체-활성 글루카곤 화합물
KR101972617B1 (ko) 2011-06-22 2019-04-25 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루카곤/glp-1 수용체 공동-항진제들
JP6352806B2 (ja) 2011-09-23 2018-07-04 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規のグルカゴン類似体
PE20150863A1 (es) * 2012-06-21 2015-06-11 Univ Indiana Res & Tech Corp Analogos de glucagon que exhiben actividad de receptor de gip
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
PL2934568T3 (pl) 2012-12-21 2018-03-30 Sanofi Agonista podwójny GLP1/GIP lub potrójny GLP1/GIP/glukagon
CA2909581A1 (en) 2013-04-18 2014-10-23 Novo Nordisk A/S Stable, protracted glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
EP3080149A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
TW201609795A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 作為雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑的艾塞那肽－４（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）胜肽類似物
TW201609799A (zh) 2013-12-13 2016-03-16 賽諾菲公司 雙重ｇｌｐ－１／ｇｉｐ受體促效劑
EP3080152A1 (en) 2013-12-13 2016-10-19 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
US10570184B2 (en) 2014-06-04 2020-02-25 Novo Nordisk A/S GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
CR20170164A (es) 2014-10-24 2017-08-29 Merck Sharp & Dohme Coagonistas de los receptores de glucagón y de glp-1
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
WO2016198624A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Sanofi Exendin-4 derivatives as trigonal glp-1/glucagon/gip receptor agonists
WO2016198628A1 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Sanofi Non-acylated exendin-4 derivatives as dual glp-1/glucagon receptor agonists
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
WO2017062334A1 (en) * 2015-10-05 2017-04-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibody peptide conjugates that have agonist activity at both the glucagon and glucagon-like peptide 1 receptors
TWI622596B (zh) 2015-10-26 2018-05-01 美國禮來大藥廠 升糖素受體促效劑
US10793615B2 (en) 2015-10-27 2020-10-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Long-acting co-agonists of the glucagon and GLP-1 receptors
EP3394091A4 (en) 2015-12-09 2019-12-18 Merck Sharp & Dohme Corp. CO-AGONISTS OF GLUCAGON AND GLP-1 RECEPTORS
DK3393496T5 (da) 2015-12-23 2024-09-16 Univ Johns Hopkins Long-acting glp-1r agonist as a therapy of neurological and neurodegenerative conditions
CN113456820B (zh) 2015-12-29 2023-09-08 派格生物医药(苏州)股份有限公司 包含glp-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途
US11058775B2 (en) * 2016-04-26 2021-07-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin dimer-incretin conjugates
WO2017192820A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Glp-1 receptor ligand moiety conjugated oligonucleotides and uses thereof
EP3645558A2 (en) * 2017-06-29 2020-05-06 UREKA Sarl Pro-drug peptide with improved pharmaceutical properties
MA50474A (fr) 2017-09-25 2020-09-02 Merck Sharp & Dohme Co-agonistes à action prolongée des récepteurs du glucagon et du glp-1
AU2018364621A1 (en) * 2017-11-08 2020-06-18 Astrazeneca Ab GLP-1 receptor ligand moiety conjugated oligonucleotides and uses thereof
CN115304666A (zh) * 2017-11-24 2022-11-08 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的胰高血糖素类似物
TWI705820B (zh) 2018-06-22 2020-10-01 美商美國禮來大藥廠 Gip/glp1促效劑組合物
US20200262887A1 (en) 2018-11-30 2020-08-20 Opko Ireland Global Holdings, Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations
WO2020148317A1 (en) 2019-01-18 2020-07-23 Ureka Sarl Peptide-oligourea hybrid compounds
US11471512B2 (en) 2019-03-01 2022-10-18 Merck Sharp & Dohme Llc Pharmaceutical compositions of a peptide
US12252582B2 (en) 2019-08-29 2025-03-18 University Of Delaware Biofunctional thiophene monomers and polymers thereof for electronic biomedical devices
EP3842061A1 (en) * 2019-12-23 2021-06-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Stapled triazole co-agonists of the glucagon and glp-1 receptors
EP3842449A1 (en) 2019-12-23 2021-06-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Stapled olefin co-agonists of the glucagon and glp-1 receptors
EP3842060A1 (en) * 2019-12-23 2021-06-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Stapled lactam co-agonists of the glucagon and glp-1 receptors
CN115322794A (zh) * 2020-01-11 2022-11-11 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
CN114349828B (zh) * 2020-11-27 2023-12-08 江苏师范大学 Glp-1/胰高血糖素受体双重激动剂及其应用
US20240050531A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-15 The Chinese University Of Hong Kong A method for reversing aging brain functional decline
CN120379686A (zh) * 2022-10-19 2025-07-25 伊莱利利公司 含防腐剂的gip/glp激动剂组合物
WO2024252366A1 (en) * 2023-06-09 2024-12-12 Sun Pharmaceutical Industries Limited Glp-1/gip dual, glp-1/gcg dual and glp-1/gip/gcg triple receptor agonists
US12303604B1 (en) 2024-10-16 2025-05-20 Currax Pharmaceuticals Llc Pharmaceutical formulations comprising naltrexone and/or bupropion

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4450150A (en) 1973-05-17 1984-05-22 Arthur D. Little, Inc. Biodegradable, implantable drug delivery depots, and method for preparing and using the same
US4275152A (en) 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
PT83613B (en) 1985-10-28 1988-11-21 Lilly Co Eli Process for the selective chemical removal of a protein amino-terminal residue
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
IN165717B (me) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
ATE123780T1 (de) 1989-02-17 1995-06-15 Chiron Mimotopes Pty Ltd Verfahren zur verwendung und herstellung von peptiden.
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
ATE164852T1 (de) 1990-01-24 1998-04-15 Douglas I Buckley Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung
CA2024855C (en) 1990-09-07 1997-12-09 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd./ Boehringer Ingelheim (Canada) Ltee Process and intermediates for producing glucagon
JPH04145099A (ja) 1990-10-05 1992-05-19 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd Ｇｉｐ様活性を有するポリペプチド誘導体及びその用途
US5510459A (en) 1991-01-17 1996-04-23 Zymogenetics, Inc. Glucagon antagonists
JP3266311B2 (ja) 1991-05-02 2002-03-18 生化学工業株式会社 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5480867A (en) 1993-12-29 1996-01-02 The Rockefeller University Glucagon analogs with serine replacements
US5512549A (en) 1994-10-18 1996-04-30 Eli Lilly And Company Glucagon-like insulinotropic peptide analogs, compositions, and methods of use
US5869602A (en) 1995-03-17 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
DE19530865A1 (de) 1995-08-22 1997-02-27 Michael Dr Med Nauck Wirkstoff sowie Mittel zur parenteralen Ernährung
AU2263197A (en) 1996-02-06 1997-08-28 Eli Lilly And Company Diabetes therapy
TR199802789T2 (xx) 1996-06-05 1999-03-22 Boehringer Mannheim Gmbh Eksendin analoglar� bunlar�n �retimi i�in y�ntemler ve bunlar� i�eren farmas�tik m�stahzarlar.
WO1998011126A1 (en) 1996-09-09 1998-03-19 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptide prodrugs containing an alpha-hydroxyacid linker
UA65549C2 (uk) 1996-11-05 2004-04-15 Елі Ліллі Енд Компані Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція
WO1998024464A1 (en) 1996-12-03 1998-06-11 Trustees Of Boston University Specific antagonists for glucose-dependent insulinotropic polypeptide (gip)
US6303144B1 (en) 1998-02-10 2001-10-16 Welfide Corporation Preparations with controlled release
AU757658B2 (en) 1998-03-09 2003-02-27 Zealand Pharma A/S Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis
DE19828113A1 (de) 1998-06-24 2000-01-05 Probiodrug Ges Fuer Arzneim Prodrugs von Inhibitoren der Dipeptidyl Peptidase IV
US20030236190A1 (en) 1998-09-02 2003-12-25 Renuka Pillutla Isulin and IGF-1 receptor agonists and antagonists
DE69926007T2 (de) 1998-10-07 2005-12-29 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Glukose-abhängiges, insulinotropisches peptid für die verwendung als osteotropes hormon
GB2344287A (en) 1998-12-03 2000-06-07 Ferring Bv Controlled release pharmaceutical formulation
SG125915A1 (en) 1998-12-07 2006-10-30 Sod Conseils Rech Applic Analogues of glp-1
JP2002534512A (ja) * 1999-01-15 2002-10-15 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 非ペプチドｇｌｐ−１アゴニスト
AU3441400A (en) 1999-03-29 2000-10-16 Uutech Limited Peptide
GB0404124D0 (en) 2004-02-25 2004-03-31 Univ Ulster Antagonists of GIP
CA2363712C (en) 1999-05-17 2011-05-10 Conjuchem Inc. Long lasting insulinotropic peptides
EP1356295A2 (en) 2000-04-27 2003-10-29 Bionebraska, Inc. Gastric inhibitory polypeptide diagnostic test for detecting susceptibility to type-2 diabetes, impaired glucose tolerance, or impaired fasting glucos
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
EP1290019A2 (en) 2000-06-14 2003-03-12 Cytovax Biotechnologies Inc. Use of coiled-coil structural scaffold to generate structure-specific peptides
HU229208B1 (en) 2000-06-16 2013-09-30 Lilly Co Eli Glucagon-like peptide-1 analogs
SE525948C2 (sv) 2000-06-28 2005-05-31 Modig Technical Consulting Ab Fleroperationsmaskin
EP1305338A2 (en) 2000-08-02 2003-05-02 Theratechnologies Inc. Modified peptides with increased potency
US20020045572A1 (en) 2000-08-15 2002-04-18 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of type 2 diabetes in humans
US6262062B1 (en) 2000-08-15 2001-07-17 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of coronary heart disease risk factors in humans
US6846831B2 (en) 2000-08-15 2005-01-25 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of lipodystrophy
US6528520B2 (en) 2000-08-15 2003-03-04 Cpd, Llc Method of treating the syndrome of coronary heart disease risk factors in humans
EP1324779B1 (en) 2000-09-29 2011-07-20 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US7199217B2 (en) 2000-12-13 2007-04-03 Eli Lilly And Company Amidated glucagon-like peptide-1
DE60228972D1 (de) 2001-07-31 2008-10-30 Us Gov Health & Human Serv Glp 1 exendin 4 peptidanaloga und deren verwendungen
WO2003014318A2 (en) 2001-08-08 2003-02-20 Genzyme Corporation Methods for treating diabetes and other blood sugar disorders
JP2005508895A (ja) 2001-08-28 2005-04-07 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ｇｌｐ−１および基礎インスリンの予備混合物
GB0121709D0 (en) 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
AR036711A1 (es) 2001-10-05 2004-09-29 Bayer Corp Peptidos que actuan como agonistas del receptor del glp-1 y como antagonistas del receptor del glucagon y sus metodos de uso farmacologico
US7041646B2 (en) 2001-10-05 2006-05-09 Bayer Pharmaceuticals Corporation Methods of treating type 2 diabetes with peptides acting as both GLP-1 receptor agonists and glucagon receptor antagonists
PL377687A1 (pl) 2001-10-18 2006-02-06 Bristol-Myers Squibb Company Środki naśladujące ludzki peptyd glukagonopodobny typu 1 i ich zastosowanie w leczeniu cukrzycy i stanów związanych z cukrzycą
MXPA04003569A (es) 2001-10-19 2004-07-23 Lilly Co Eli Mezclas bifasicas de glp-1 e insulina.
JP2005518408A (ja) 2001-12-29 2005-06-23 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 異常脂肪血症を治療するための、ｇｌｐ−１化合物と他の薬物との組み合わせ使用
JP4282485B2 (ja) 2002-01-08 2009-06-24 イーライ リリー アンド カンパニー 伸長グルカゴン様ペプチド−１アナログ
US20030232761A1 (en) 2002-03-28 2003-12-18 Hinke Simon A. Novel analogues of glucose-dependent insulinotropic polypeptide
WO2003103572A2 (en) 2002-06-04 2003-12-18 Eli Lilly And Company Modified glucagon-like peptide-1 analogs
AU2003237933A1 (en) 2002-06-11 2003-12-22 Cellartis Ab Use of compounds having gip activity for the treatment of disorders associated with abnormal loss of cells and/or for the treatment of obesity
AU2003248676A1 (en) 2002-06-15 2003-12-31 Enteromed, Inc. Treatment of non-alcoholic fatty liver disease
JP2006501820A (ja) 2002-09-06 2006-01-19 バイエル・フアーマシユーチカルズ・コーポレーシヨン 修飾ｇｌｐ−１受容体アゴニストおよびそれらの薬理学的使用法
WO2004033036A2 (en) 2002-10-04 2004-04-22 Microchips, Inc. Medical device for controlled drug delivery and cardiac monitoring and/or stimulation
US7192922B2 (en) 2002-11-19 2007-03-20 Allegheny-Singer Research Institute Method of treating left ventricular dysfunction
EP1587540B1 (en) 2003-01-09 2021-09-15 MacroGenics, Inc. IDENTIFICATION AND ENGINEERING OF ANTIBODIES WITH VARIANT Fc REGIONS AND METHODS OF USING SAME
US20050059605A1 (en) 2003-01-31 2005-03-17 Krishna Peri Chemically modified metabolites of regulatory peptides and methods of producing and using same
EP1626981A4 (en) 2003-03-04 2006-11-22 Biorexis Pharmaceutical Corp PROTEINS PROTECTED AGAINST DIPEPTIDYLPEPTIDASE
PL1605897T3 (pl) 2003-03-19 2012-12-31 Lilly Co Eli Związki będące połączeniem GLP-1 z poli(glikolem etylenowym)
PT1620118E (pt) 2003-04-08 2014-10-16 Yeda Res & Dev Fármacos peguilados de modo reversível
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CN102174102A (zh) 2003-05-15 2011-09-07 塔夫茨大学信托人 肽和多肽药物的稳定类似物
EP1633390B1 (en) 2003-06-03 2012-01-18 Novo Nordisk A/S Stabilized pharmaceutical glp-1 peptide compositions
PL1633391T3 (pl) 2003-06-03 2012-03-30 Novo Nordisk As Stabilizowane farmaceutycznie kompozycje peptydowe
BRPI0411132B8 (pt) 2003-06-12 2021-05-25 Lilly Co Eli protéina de fusão heteróloga e seus usos
WO2004111078A2 (en) 2003-06-18 2004-12-23 Theratechnologies Inc. Compounds that modulate the glucagon response and uses thereof
KR101241862B1 (ko) 2003-09-19 2013-03-13 노보 노르디스크 에이/에스 신규 ｇｌｐ-1 유도체
US7364875B2 (en) 2003-10-30 2008-04-29 Cresent Innovations, Inc. Method for producing medical and commercial grade poly-gamma-glutamic acid of high molecular weight
MXPA06006745A (es) 2003-12-18 2006-08-18 Novo Nordisk As Compuestos glp-1 novedosos.
US20060286129A1 (en) 2003-12-19 2006-12-21 Emisphere Technologies, Inc. Oral GLP-1 formulations
US20080318837A1 (en) 2003-12-26 2008-12-25 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Pharmaceutical Formation For Increased Epithelial Permeability of Glucose-Regulating Peptide
US7442682B2 (en) 2004-10-19 2008-10-28 Nitto Denko Corporation Transepithelial delivery of peptides with incretin hormone activities
SG159551A1 (en) 2005-02-11 2010-03-30 Amylin Pharmaceuticals Inc Gip analog and hybrid polypeptides with selectable properties
US8263545B2 (en) 2005-02-11 2012-09-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties
WO2006097536A2 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Dimeric peptide agonists of the glp-1 receptor
WO2006121904A1 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Bayer Pharmaceuticals Corporation Glucose-dependent insulinotropic polypeptide (gip) receptor agonists and their pharmacological methods of use
EP1881850B1 (en) 2005-05-13 2010-09-29 Eli Lilly And Company Glp-1 pegylated compounds
CA2612063A1 (en) 2005-06-13 2006-12-21 Imperial Innovations Limited Oxyntomodulin analogues and their effects on feeding behaviour
CA2617649A1 (en) 2005-08-11 2007-02-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Hybrid polypeptides with selectable properties
EP1943274A2 (en) 2005-09-08 2008-07-16 Uutech Limited Treatment of diabetes related obesity
WO2007028632A2 (en) 2005-09-08 2007-03-15 Uutech Limited Analogs of gastric inhibitory polypeptide as a treatment for age related decreased pancreatic beta cell function
US7846445B2 (en) 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP1959986B1 (en) 2005-11-07 2014-07-23 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting physiological solubility and stability
US7928058B2 (en) 2006-02-22 2011-04-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Pharmaceutical composition comprising oxyntomodulin derivatives and a method for reducing body weight using the composition
EP2241327A1 (en) 2006-03-15 2010-10-20 Novo Nordisk A/S Mixtures of Amylin and Insulin
US20090186817A1 (en) 2006-03-21 2009-07-23 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Peptide-peptidase inhibitor conjugates and methods of using same
JP2009534423A (ja) 2006-04-20 2009-09-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｇｌｐ−１化合物
CN102569845B (zh) 2006-05-01 2015-03-11 本田技研工业株式会社 燃料电池
EP2020989A2 (en) 2006-05-15 2009-02-11 Wisconsin Allumni Research Foundation Pulmonary delivery of 1,25-dihydroxyvitamin d3 and co-administration of parathyroid hormone or calcitonin
FR2902092B1 (fr) 2006-06-07 2008-09-05 Sapelem Soc Par Actions Simpli Appareil de manutention de charge
WO2008022015A2 (en) 2006-08-11 2008-02-21 Trustees Of Tufts College Retro-inverso incretin analogues, and methods of use thereof
AU2007284365A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Amylin Pharmaceuticals, Inc. DPP-IV resistant GIP hybrid polypeptides with selectable properties
WO2008023050A1 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Novo Nordisk A/S Acylated exendin-4 compounds
EP2069396B1 (en) 2006-09-08 2015-10-21 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses
US8617531B2 (en) 2006-12-14 2013-12-31 Bolder Biotechnology, Inc. Methods of making proteins and peptides containing a single free cysteine
RU2477286C2 (ru) 2007-01-05 2013-03-10 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн АНАЛОГИ ГЛЮКАГОНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПОВЫШЕННОЙ РАСТВОРИМОСТЬЮ В БУФЕРАХ С ФИЗИОЛОГИЧЕСКИМ ЗНАЧЕНИЕМ pH
KR20090119876A (ko) * 2007-02-15 2009-11-20 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루카곤/ｇｌｐ-1 수용체 공동-항진물질
JP5302952B2 (ja) 2007-04-19 2013-10-02 ドン・ア・ファーム・カンパニー・リミテッド 糖調節ペプチドの制御放出に適した生分解性マイクロスフェア組成物及びその製造方法
US7994122B2 (en) 2007-06-15 2011-08-09 Zealand Pharma A/S Glucagon analogues
JP2010536341A (ja) 2007-08-15 2010-12-02 アムニクス， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法
ES2672770T3 (es) 2007-09-05 2018-06-18 Novo Nordisk A/S Derivados del péptido-1 similar al glucagón y su uso farmacéutico
US20100292133A1 (en) 2007-09-05 2010-11-18 Novo Nordisk A/S Truncated glp-1 derivaties and their therapeutical use
EP2650006A1 (en) 2007-09-07 2013-10-16 Ipsen Pharma S.A.S. Analogues of exendin-4 and exendin-3
US20100222251A1 (en) 2007-09-11 2010-09-02 Novo Nordisk A/S Mixture comprising an amylin peptide and a protracted insulin
EP2036923A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Improved derivates of amylin
EP2036539A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Stable formulations of amylin and its analogues
CA2702289A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
JP5669582B2 (ja) 2007-10-30 2015-02-12 インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーションＩｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ グルカゴンアンタゴニスト
CN101918027A (zh) 2007-11-02 2010-12-15 森托科尔奥索生物科技公司 半合成GLP-1肽-Fc融合构造、方法及其用途
EP2249853A4 (en) 2008-01-30 2012-12-26 Univ Indiana Res & Tech Corp ESTER BASED PEPTIDE PRODRUGS
EP2596805B1 (en) 2008-02-01 2021-10-27 Ascendis Pharma A/S Prodrug comprising a drug-linker conjugate
AU2009260301B2 (en) 2008-06-17 2015-09-03 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological pH buffers
US8546327B2 (en) * 2008-06-17 2013-10-01 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
CN102105159B (zh) 2008-06-17 2015-07-08 印第安纳大学研究及科技有限公司 基于gip的混合激动剂用于治疗代谢紊乱和肥胖症
PE20120331A1 (es) 2008-12-19 2012-04-14 Univ Indiana Res & Tech Corp Agentes medicinales unidos a dipeptido
CA2744558A1 (en) 2008-12-19 2010-07-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
PE20120332A1 (es) 2008-12-19 2012-04-14 Univ Indiana Res & Tech Corp Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida
EP2376099A4 (en) 2008-12-19 2012-04-25 Univ Indiana Res & Tech Corp INSULIN AGAIN YL-BASED GROWTH FACTORS WITH HIGH ACTIVITY AT THE INSULIN RECEPTOR
WO2010096052A1 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
KR20120087875A (ko) * 2009-06-16 2012-08-07 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 Ｇｉｐ 수용체-활성 글루카곤 화합물
US8703701B2 (en) 2009-12-18 2014-04-22 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
MX2012008603A (es) 2010-01-27 2013-01-25 Univ Indiana Res & Tech Corp Conjugados de antagonista de glucagon-agonista de gip y composiciones para el tratamiento de desordenes metabolicos y obesidad.
AR080592A1 (es) 2010-03-26 2012-04-18 Lilly Co Eli Peptido con actividad para el gip-r y glp-1-r, formulacion famaceutica que lo comprende, su uso para preparar un medicamento util para el tratamiento de diabetes mellitus y para inducir la perdida de peso
EP2568993A4 (en) 2010-05-13 2014-02-19 Univ Indiana Res & Tech Corp GLUCAGON SUPERFAMILY PEPTIDES WITH G-PROTEIN-COUPLED RECEPTOR ACTIVITY
US9127088B2 (en) 2010-05-13 2015-09-08 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
MX2012014576A (es) 2010-06-24 2013-02-21 Univ Indiana Res & Tech Corp Profarmacos de peptido de la superfamilia de glucagon basado en amida.
CA2796879A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Dipeptide linked medicinal agents
WO2011163473A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon analogs exhibiting enhanced solubility and stability in physiological ph buffers
JP6086067B2 (ja) 2010-12-22 2017-03-01 インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション Ｇｉｐレセプター活性を示すグルカゴンアナローグ
JP2012194860A (ja) 2011-03-17 2012-10-11 Murata Mach Ltd 走行車
US8729017B2 (en) 2011-06-22 2014-05-20 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
KR101972617B1 (ko) 2011-06-22 2019-04-25 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 글루카곤/glp-1 수용체 공동-항진제들
ES2672880T3 (es) 2011-11-17 2018-06-18 Indiana University Research And Technology Corporation Péptidos de la superfamilia de glucagón que muestran actividad de receptor de glucocorticoides
KR20150023013A (ko) 2012-06-21 2015-03-04 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 유사체
WO2013192131A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Indiana University Research And Technology Corporation Incretin receptor ligand polypeptide fc-region fusion polypeptides and conjugates with altered fc-effector function

Also Published As

Publication number Publication date
PL2723367T3 (pl) 2017-10-31
CO6821895A2 (es) 2013-12-31
CY1119577T1 (el) 2018-03-07
US20120329708A1 (en) 2012-12-27
US20190127433A1 (en) 2019-05-02
EA031230B1 (ru) 2018-12-28
ZA201309626B (en) 2017-09-27
RS56173B1 (sr) 2017-11-30
KR20140043792A (ko) 2014-04-10
AU2012273364A1 (en) 2014-01-16
EP2723367A4 (en) 2015-05-06
AR086998A1 (es) 2014-02-05
US20170349642A1 (en) 2017-12-07
CA2839686C (en) 2019-12-24
KR101972617B1 (ko) 2019-04-25
ES2636445T3 (es) 2017-10-05
WO2012177443A3 (en) 2013-04-25
CA2839686A1 (en) 2012-12-27
TW201300408A (zh) 2013-01-01
CN103857408A (zh) 2014-06-11
IL230061B (en) 2020-01-30
US20150376256A1 (en) 2015-12-31
JP6179864B2 (ja) 2017-08-16
US9758562B2 (en) 2017-09-12
NI201300143A (es) 2014-06-06
MX2013015176A (es) 2014-03-21
WO2012177443A2 (en) 2012-12-27
DOP2013000310A (es) 2014-07-15
TWI554518B (zh) 2016-10-21
PH12013502671A1 (en) 2022-04-08
US9156902B2 (en) 2015-10-13
EP2723367A2 (en) 2014-04-30
US20140221283A1 (en) 2014-08-07
HUE035776T2 (en) 2018-05-28
NZ619447A (en) 2016-04-29
CL2013003688A1 (es) 2014-07-25
GT201300319A (es) 2014-11-26
US10730923B2 (en) 2020-08-04
DK2723367T3 (en) 2017-07-17
ECSP13013097A (es) 2014-01-31
CN103857408B (zh) 2017-04-12
EA201490070A1 (ru) 2014-05-30
EP2723367B1 (en) 2017-05-03
LT2723367T (lt) 2017-08-25
JP2014525901A (ja) 2014-10-02
SI2723367T1 (sl) 2017-08-31
MX347703B (es) 2017-05-09
PE20140724A1 (es) 2014-07-10
HRP20170890T1 (hr) 2017-09-08
PT2723367T (pt) 2017-08-11
AU2012273364B2 (en) 2017-06-08
US10174093B2 (en) 2019-01-08
GEP20176629B (en) 2017-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10730923B2 (en) Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
US9309301B2 (en) Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
US8703701B2 (en) Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
EP2864350B1 (en) Analogs of glucagon exhibiting gip receptor activity
KR20150023013A (ko) 수용체 활성을 나타내는 글루카곤 유사체
HK1191568B (en) Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
HK1191568A (en) Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
NZ619447B2 (en) Glucagon/glp-1 receptor co-agonists