MD3626731T2

MD3626731T2 - Noi peptide și combinație de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva carcinomului hepatocelular (HCC) și a altor cancere

Info

Publication number: MD3626731T2
Application number: MDE20200300T
Authority: MD
Inventors: Toni Weinschenk; Andrea Mahr; Jens Fritsche; Phillip Muller; Anita Wiebe; Sarah Missel
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2022-01-31
Also published as: JP2020191869A; JP2023100927A; ES2899425T3; US11672848B2; IL281752A; MD3616706T2; PT3626731T; KR20240033128A; US20220118071A1; JP2020191864A; MA48487A; UA124331C2; MA49157A; LT3236985T; ES2763911T5; JP2020191867A; DK3236985T4; FI3236985T4; TWI794679B; MY199068A

Abstract

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În mod special, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la paciente. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare. În special, prezenta invenţie se referă la mai multe secvenţe peptidice noi şi variantele acestora derivate din moleculele HLA de clasă I şi de clasă II ale celulelor tumorale umane care se pot folosi în formule de vaccin pentru inducerea de răspunsuri imunitar antitumorale sau drept ţinte pentru dezvoltarea de compuşi sau celule active din punct de vedere farmaceuticIimunologic.

Description

Fundamentul invenţiei

Carcinomul hepatocelular (HCC) este una dintre cele mai frecvente tumori din lume şi reprezintă aproximativ 6% din toate cazurile noi de cancer diagnosticate în întreaga lume. În 2012, au apărut în lume aproximativ 782.000 de cazuri noi de HCC, ceea ce îl face al cincilea cel mai frecvent cancer la bărbaţi (554.000 de cazuri) şi al nouălea la femei (228.000 de cazuri) (http://globocan.iarc.fr). HCC este cea mai frecventă malignitate hepatică primară, reprezentând peste 80% din toate cazurile de cancer hepatic primar la adulţi.

Distribuţia HCC variază geografic, iar ratele de incidenţă depind de sex. Rata de incidenţă standardizată pe structura de vârstă (ASR) a HCC la bărbaţi este cea mai ridicată în Asia de Est (31,9) şi Asia de Sud-Est (22,2), intermediară în Europa de Sud (9,5) şi America de Nord (9,3) şi cea mai mică în Europa de Nord (4,6 ) şi Asia Sud-Centrală (3,7). Ratele de incidenţă a HCC la femei sunt mai mici decât ASR la bărbaţi. Cea mai mare valoare a ASR la femei apare în Asia de Est (10,2) şi Africa de Vest (8,1), cea mai mică în Europa de Nord (1,9) şi Micronezia (1,6).

Prognosticul general pentru pacienţii cu HCC este slab. Rata de supravieţuire relativă de 5 ani (5Y-RSR) pentru HCC este de aproximativ 15%, în funcţie de stadiul din momentul diagnosticării. Pentru HCC localizat, unde cancerul este încă limitat la ficat, 5Y-RSR este de aproximativ 28%. Pentru HCC regional şi îndepărtat, unde cancerul a crescut în organe apropiate sau îndepărtate, 5Y-RSR este de 7%, respectiv 2%.

În ultimul timp au fost efectuate un număr limitat de studii de imunoterapie pentru HCC. Au fost utilizate citokine pentru activarea subseturilor de celule imune şi/sau creşterea imunogenicităţii tumorii (Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). Alte studii s-au concentrat asupra infuziei de limfocite infiltratoare tumorale sau limfocite din sânge periferic activat (Shi et al., 2004a; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000).

Până în prezent a fost efectuat un număr mic de studii de vaccinare terapeutică. Butterfield et al. au efectuat două studii folosind peptide derivate din alfa-fetoproteină (AFP) ca vaccin sau celule dendritice încărcate cu peptide AFP ex vivo (Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). În două studii diferite, celule dendritice (DC) autologe au fost pulsate ex vivo cu lizat de tumoră autolog sau lizat de linie celulară HepG2 de hepatoblastom (Palmer et al., 2009). Până în prezent, studiile de vaccinare au arătat doar îmbunătăţiri limitate ale rezultatelor clinice.

Williams et al. (2013) descriu faptul că variantele de secvenţe în SLC16A11 sunt un factor de risc pentru diabetul de tip 2, însă nu descriu o peptidă care cuprinde SEQ ID NO. 56 pentru utilizare în terapie, inclusiv tratarea cancerului.

Rezumatul invenţiei

Prezenta invenţie se referă la o peptidă care cuprinde secvenţa de aminoacid din SEQ ID NO. 56, aşa cum este definită în Revendicarea 1 anexată. Alte aspecte ale invenţiei sunt definite în revendicările anexate.

Într-un prim aspect se descrie o peptidă care cuprinde o secvenţă aminoacidică selectată din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă de secvenţă a acestuia care este de cel puţin 80%, de preferinţă de cel puţin 90%, omologă (de preferinţă cel puţin 80% sau cel puţin 90% identică) cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300, în care varianta menţionată se leagă de MHC şi/sau induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida menţionată, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia, în care peptida menţionată nu este polipeptida de bază cu lungime completă.

Este descrisă, de asemenea, o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care este de cel puţin 80%, de preferinţă de cel puţin 88%, omologă (de preferinţă cel puţin 80% sau cel puţin 88% identică) cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300, în care peptida menţionată sau varianta acesteia are o lungime totală între 8 şi 100, de preferinţă între 8 şi 30 şi, cel mai preferat, între 8 şi 14 aminoacizi.

Tabelele următoare prezintă peptida în conformitate cu prezenta descoperire, valorile lor SEQ ID NO. respective şi gena-sursă (subiacentă) prospectivă pentru această peptidă.

Tabelul 1: Peptide HLA-A*02 în conformitate cu prezenta invenţie - S* = fosfoserină

SEQ ID NO. Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale de gene 56 GVLPGLVGV 162515 SLC16A11

În plus, sunt descrise, în general, peptidele în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în tratamentul bolilor proliferative, cum ar fi, de exemplu, cancerul pancreatic, cancerul de colon sau rectal, cancerul renal, cancerul cerebral şi/sau leucemii.

Preferate în mod special sunt peptidele - singure sau în combinaţie - în conformitate cu prezenta descoperire selectate din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300. Mai preferate sunt peptidele - singure sau în combinaţie - selectate din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 124 (vezi Tabelul 1), preferabil pentru legarea A*02, şi din grupul format din of SEQ ID NO. 187 până la SEQ ID NO. 218, de preferinţă pentru legarea A*24 şi utilizarea lor în imunoterapia de HCC, cancerul cerebral, cancerul renal, cancerul pancreatic, cancerul de colon sau rectal ori leucemie, şi, de preferinţă, HCC.

Astfel, un alt aspect al prezentei descrieri se referă la utilizarea peptidelor descrise în prezentul document pentru tratamentul - de preferinţă combinat - al unei boli proliferative selectate din grupul de HCC, cancer cerebral, cancer renal, cancer pancreatic, cancer de colon sau rectal şi leucemie.

Prezenta descoperire se referă, în plus, la peptidele descrise în prezentul document care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau - într-o formă alungită, cum ar fi o variantă de lungime - sau de clasă II.

Prezenta descoperire se referă şi la peptidele descrise în prezentul document în care peptidele respective (fiecare) constau, în esenţă, dintr-o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300.

Prezenta invenţie se referă în continuare la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă este modificată şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta descoperire se referă suplimentar la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta descoperire se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptidele descrise în prezentul document. Prezenta descoperire referă în continuare la acidul nucleic descris în prezentul document, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta descoperire se referă în continuare la un vector de exprimare care este capabil să exprime şi/sau exprimă un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă conform descrierii din prezentul document, un acid nucleic conform descrierii din prezentul document sau un vector de exprimare conform descrierii din prezentul document pentru utilizare în tratamentul bolilor, inclusiv cancer şi boli patologice autoimuneIinflamatoriiIimune.

Prezenta descoperire se mai referă la anticorpi împotriva peptidelor descrise în prezentul document sau complexe ale peptidelor menţionate în conformitate cu descrierea din prezentul document cu MHC şi metode de realizare a acestora.

Prezenta descoperire se referă în continuare la receptori de celule T (TCR), în special TCR solubil (sTCR) şi TCR clonate transformate în celule T autologe sau alogene şi metode de realizare a acestora, precum şi celule NK sau alte celule care poartă respectivul TCR sau care reacţionează încrucişat cu TCR-urile menţionate.

Anticorpii şi TCR sunt exemple de realizare suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidelor în conformitate cu invenţia la îndemână.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o celulă gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document sau un vector de exprimare descris anterior. Prezenta descoperire se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document, care este o celulă prezentatoare de antigen şi, de preferinţă, este o celulă dendritică.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând cultivarea celulei gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document şi izolarea peptidei din celula gazdă menţionată sau din mediul său de cultură.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda descrisă în prezentul document în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau de clasă II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda descrisă în prezentul document în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO. 1 până la SQ ID NO. 300, de preferinţă conţinând SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 124 şi SEQ ID NO. 187 până la SEQ ID NO. 218 sau o variantă de secvenţă aminoacidică.

Prezenta descoperire se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda descrisă în prezentul document, în care celula T menţionată recunoaşte selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând administrarea, la pacient, a unui număr eficace de celule T produse în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, acidul nucleic în conformitate cu prezenta descriere, vectorul de exprimare în conformitate cu prezenta descriere, celula în conformitate cu prezenta descriere, limfocita T activată, receptorul de celule T sau anticorpul sau alte molecule de legare peptidică şi/sau MHC în conformitate cu prezenta descriere ca medicament sau la fabricarea unui medicament. De preferinţă, medicamentul este activ împotriva cancerului.

De preferinţă, respectivul medicament este pentru o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau anticorp solubil.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care numitele celule canceroase sunt HCC, cancer cerebral, cancer renal, cancer pancreatic, cancer de colon sau rectal sau leucemie şi, de preferinţă, celule HCC.

Prezenta descoperire se referă în continuare la proteine marker şi biomarkeri particulari pe baza peptidelor descrise în prezentul document, numite în prezentul document „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticarea şi/sau prognosticul CRC. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi în contextul tratamentului cancerului.

Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2 microglobuline (receptori MHC de clasă I) sau, respectiv, dintr-un lanţ alfa şi un lanţ beta (receptori MHC de clasă II). Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide. Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC în timpul endocitozei şi care sunt procesate ulterior. Complexele de peptide şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de TCR (receptor de celule T) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR adecvat. Este bine cunoscut faptul că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1.

Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigenii asociaţi tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imunitare antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007).

În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006).

Peptidele alungite (mai lungi) din descoperire pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II. Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral.

S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ).

Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

Antigenele care sunt recunoscute de limfocitele T citotoxice specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, reglate în sens crescător în celulele respectivei tumori.

Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale.

Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu incizura de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare.

În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR).

Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii cuprinde următoarele grupuri principale :

a) Antigeni de cancer testicular: primele AAT identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece exprimarea membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, la nivelul ţesuturilor naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, în placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE sau NY-ESO-1. b) Antigeni de diferenţiere: aceste TAA sunt împărţite între tumori si ţesuturi normale din care provin tumorile; majoritatea sunt identificate în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine derivate din melanocite sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic. c) TAA supra-exprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu niveluri reduse de exprimare. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1. d) Antigeni specifici tumorii: aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii). e) TAA-uri care apar prin modificări anormale post-translaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori.

Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii.

f) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical. Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T citotoxice ca antigene specifice tumorale sau asociate tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceşti antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T. În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop. Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-un exemplu foarte preferat este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efector („celule T efectoare»). În cazul TCR şi al anticorpilor conform invenţiei, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. Pentru TCR-urile şi anticorpii descrişi în prezentul document, prezentarea este factorul determinant. Utilizările terapeutică şi diagnostică împotriva cancerelor suplimentare sunt prezentate în următoarea descriere mai detaliată a proteinelor (polipeptidelor) care stau la baza peptidelor în conformitate cu descrierea. O peptidă constând sau constând în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată aici poate avea unul sau doi aminoacizi neancoraţi (vezi mai jos în ceea ce priveşte motivul de ancoră) schimbaţi fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau să fie afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată. Într-un alt exemplu, într-o peptidă care constă în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată în prezentul document, unul sau doi aminoacizi pot fi schimbaţi cu partenerii lor de schimb conservatori (vezi aici mai jos), fără ca această capacitate de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată substanţial sau este afectată negativ în comparaţie cu peptida nemodificată. Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă în conformitate cu prezentul document, în care respectiva peptidă este modificată şi/sau include legături non-peptidice. Prezenta descoperire se referă suplimentar la o peptidă în conformitate cu prezenta descriere, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice, adică se leagă de celulele dendritice. Prezenta descoperire se referă în continuare la un acid nucleic care codifică o peptidă descrisă în prezentul document. Prezenta descoperire referă în continuare la acidul nucleic descris în prezentul document, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora. Prezenta descoperire se referă în continuare la un vector de exprimare care este capabil să exprime, exprimă şi/sau prezintă un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document. Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă în conformitate cu descrierea din prezentul document, un acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document sau un vector de exprimare în conformitate cu descrierea din prezentul document pentru utilizare în medicină. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la anticorpii descrişi mai în detaliu mai jos şi metodele pentru realizarea lor. Preferaţi sunt anticorpii care sunt specifici pentru peptidele prezentei descrieri şi/sau pentru peptidele prezentei descrieri atunci când sunt legate de MHC-ul lor. Anticorpii preferaţi pot fi monoclonali. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la receptori de celule T (TCR), în particular receptori de celule T solubili (sTCR), care vizează peptidele descrise în prezentul document şi/sau complexe peptidă-MHC ale acestora, precum şi metodele pentru realizarea lor. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la anticorpi sau alte molecule de legare care vizează peptidele descrise în prezentul document şi/sau complexe peptidă-MHC ale acestora, precum şi metodele pentru realizarea lor. Prezenta descriere se referă în continuare la o celulă gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document sau un vector de exprimare descris anterior. Prezenta descoperire se referă în continuare la celula-gazdă descrisă în prezentul document care este o celulă prezentatoare de antigen. Prezenta descoperire se referă în continuare la celula-gazdă descrisă în prezentul document în care celula prezentatoare de antigen este o celulă dendritică. Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând cultivarea celulei gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document şi izolarea peptidei din celula-gazdă şi/sau din mediul său de cultură. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o metodă in vitro pentru producerea de celule T activate, metoda cuprinzând contactul in vitro al celulelor T cu molecule II MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T menţionate într-un mod specific antigenului, respectivul antigen fiind cel puţin o peptidă în conformitate cu prezenta invenţie. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o metodă în care antigenul este încărcat pe molecule de II MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen. Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda descrisă în prezentul document în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă de secvenţă aminoacidică a acesteia. Prezenta descoperire se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu descrierea din prezentul document care recunosc selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document. Prezenta descoperire se referă în continuare la o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi în conformitate cu descrierea din prezentul document, metoda cuprinzând administrarea, la pacient, a unui număr eficace de celule T în conformitate cu descrierea din prezentul document. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document, a unui vector de exprimare în conformitate cu descrierea din prezentul document, a unei celule în conformitate cu descrierea din prezentul document sau a unei celule T activate în conformitate cu descrierea din prezentul document ca medicament sau în fabricarea unui medicament. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care respectivul medicament este un vaccin, o celulă, o populaţie de celule, cum ar fi, de exemplu, o linie celulară, sTCR-uri şi anticorpi monoclonali. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care medicamentul este activ împotriva cancerului. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care respectivele celule canceroase sunt celule de HCC. Prezenta descoperire se referă în continuare la proteine marker şi biomarkeri particulari pe baza peptidelor din prezenta invenţie care pot fi utilizate în diagnosticarea şi/sau prognosticul HCC. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi pentru tratarea cancerului. În plus, prezenta descoperire se referă la o metodă de producere a unui vaccin anticancer personalizat pentru un pacient individual folosindu-se o bază de date (descrisă în prezentul document şi ca „depozit») de peptide asociate cu tumori preselectate. Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent, imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de valorificare a ambelor componente, umorală şi celulară, ale sistemului imunitar. Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA). Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, preferabil, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea lungimea de 8 aminoacizi şi până la 10, 11, 12 sau 13 aminoacizi şi, în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor din descoperire), pot avea o lungime de 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 de aminoacizi. Mai mult, termenul „peptidă» va include săruri ale unei serii de resturi aminoacid conectate între ele, de obicei, prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau acetat (trifluoroacetat). Trebuie menţionat că sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta descriere diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele nu sunt săruri in vivo. Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru invenţie atât timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se includ în aceasta. Oligopeptidele au, de obicei, o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi. Termenul „peptidele din prezenta invenţie» va include, de asemenea, peptidele care constau din sau conţin o peptidă definită mai sus în conformitate cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300. Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi -carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru invenţie atâta timp cât sau epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid. O peptidă, oligopeptidă, proteină sau polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (desemnată prin termenul „imunogen» în prezenta invenţie) dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei invenţii, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, o „imunogenă» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei invenţii, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a ridica anticorpi sau TCR-uri specifice împotriva acesteia. Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (catenă alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi. La oameni există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigeni leucocitari umani desemnaţi (HLA)): HLA-A, HLA-B şi HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, şi HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate din aceşti loci.

Tabelul 2: Frecvenţele de exprimare F pentru HLA*A02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori M et al., HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997 Oct 15; 64(7): 1017-27) folosind formula Hardy-Weinberg: F=1-(1-Gf)2. Combinaţiile de A*02 sau A*24 cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (S.J. Chanock, et al. (2004) HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and DRB1 in an African American population from Bethesda, USA Human Immunology, 65: 1223-1235).

Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucaziană (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americană (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americană (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americană (America de Nord) 48,3% DR1 Caucaziană (America de Nord) 19,4% DR2 Caucaziană (America de Nord) 28,2% DR3 Caucaziană (America de Nord) 20,6% DR4 Caucaziană (America de Nord) 30,7% DR5 Caucaziană (America de Nord) 23,3% DR6 Caucaziană (America de Nord) 26,7% DR7 Caucaziană (America de Nord) 24,8% DR8 Caucaziană (America de Nord) 5,7% DR9 Caucaziană (America de Nord) 2,1% DR1 Afro-(nord)-americană 13,20% DR2 Afro-(nord)-americană 29,80% DR3 Afro-(nord)-americană 24,80% DR4 Afro-(nord)-americană 11,10% DR5 Afro-(nord)-americană 31,10% DR6 Afro-(nord)-americană 33,70% DR7 Afro-(nord)-americană 19,20% DR8 Afro-(nord)-americană 12,10% DR9 Afro-(nord)-americană 5,80% DR1 Afro-(nord)-americană 6,80% DR2 Afro-(nord)-americană 33,80% DR3 Afro-(nord)-americană 9,20% DR4 Afro-(nord)-americană 28,60% DR5 Afro-(nord)-americană 30,00% DR6 Afro-(nord)-americană 25,10% DR7 Afro-(nord)-americană 13,40% DR8 Afro-(nord)-americană 12,70% DR9 Afro-(nord)-americană 18,60% DR1 Latino-(nord)-americană 15,30% DR2 Latino-(nord)-americană 21,20% DR3 Latino-(nord)-americană 15,20% DR4 Latino-(nord)-americană 36,80% DR5 Latino-(nord)-americană 20,00% DR6 Latino-(nord)-americană 31,10% DR7 Latino-(nord)-americană 20,20% DR8 Latino-(nord)-americană 18,60% DR9 Latino-(nord)-americană 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Neneţia, Rusia 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Samara, Rusia 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%

Peptidele din descoperire, de preferinţă atunci când sunt incluse într-un vaccin al descoperirii, aşa cum este descris aici, se leagă de A*02 sau A*24. Un vaccin poate include, de asemenea, peptide MHC de clasă II. Prin urmare, vaccinul în conformitate cu descoperirea poate fi utilizat pentru tratarea cancerului la pacienţi care sunt A*02 pozitivi, A*24 pozitivi sau pozitivi pentru A*02 şi A*24 întrucât nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II din cauza pan-legării acestor peptide.

Combinarea, de exemplu, a peptidelor A*02 şi A*24 într-un singur vaccin are avantajul că un procentaj mai mare din orice populaţie de pacienţi poate fi tratat în comparaţie cu abordarea fiecărei alele MHC de clasă I singulare. În timp ce, în majoritatea populaţiilor, mai puţin de 50% dintre pacienţi pot fi abordaţi de o alelă singulară, vaccinul din descoperire poate trata cel puţin 60% dintre pacienţi din orice populaţie relevantă. În mod specific, următoarele procentaje de pacienţi vor fi pozitive pentru cel puţin una dintre aceste alele în diferite regiuni: SUA 61%, Europa de Vest 62%, China 75%, Coreea de Sud 77%, Japonia 86% (calcule de pe www.allelefrequencies.net).

Aşa cum este utilizată aici, referirea la o secvenţă ADN include atât ADN monocatenar, cât şi dublu-catenar. Astfel, secvenţa specifică, dacă contextul nu indică altminteri, se referă la monocatena ADN a secvenţei respective, la duplexul respectivei secvenţe cu complementul ei (ADN dublu catenar) şi la complementul secvenţei respective. Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de exprimare nativ al genei respective.

Regiunea de codificare poate fi derivată dintr-o genă non-mutantă („normală»), mutantă sau alterată ori poate fi derivată chiar dintr-o secvenţă ADN sau o genă sintetizată în întregime în laborator folosindu-se metode bine cunoscute profesioniştilor din domeniul sintezelor ADN.

Într-o concretizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.

Secvenţa nucleotidică ce codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele care fac subiectul acestei descoperiri sunt asamblate pornind de la fragmente ADNc şi liganzi scurţi oligonucleotidici sau de la serii de oligonucleotide, care asigură o genă sintetică capabilă de a fi exprimată într-o unitate de transcriere recombinantă care conţine elemente regulatoare derivate dintr-un operon microbian sau viral.

Aşa cum se utilizează aici, termenul „o codificare (sau codare) cu nucleotide pentru o peptidă» se referă la o codificare cu o secvenţă de nucleotide pentru peptidă care include coduri de start şi stop artificiale (făcute de om) compatibile pentru sistemul biologic pentru care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR.

Termenul „produs de exprimare» se referă la polipeptida sau proteina care reprezintă produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalenţi de codificare a secvenţei de acid nucleic rezultaţi din degenerarea codului genetic care, astfel, codifică aceiaşi aminoacizi.

Termenul „fragment», atunci când se referă la o secvenţă de codificare, înseamnă o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine, în principal, aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.

Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN, sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei construcţii ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manipularea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.

Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care se poate împerechea cu o monocatenă ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unei catene de dezoxiribonucleotide.

Termenul „promotor» se referă la o regiune ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcrierea.

Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.

Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene, dezvăluite în conformitate cu prezenta descoperire, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, este avută în vedere în mod special o polipeptidă revendicată care are o puritate de, preferabil, 99,999%, sau cel puţin 99,99% sau 99,9%; sau chiar şi 99% ca greutate sau mai mare.

Produsele de exprimare a acizilor nucleici şi polipeptidelor descrise în conformitate cu prezenta descoperire, precum şi vectorii de exprimare care conţin aceşti acizi nucleici şi/sau aceste polipeptide pot fi în „formă îmbogăţită». În accepţiunea documentului, termenul „îmbogăţit» se referă la faptul că materialul respectiv este în concentraţie de cel puţin 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), mai avantajos 0,01% masic, preferabil cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezenta descoperire pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată.

Termenul „fragment activ» se referă la un fragment, de obicei o peptidă, o polipeptidă sau o secvenţă de acid nucleic, care generează un răspuns imunitar (adică, are activitate imunogenă) la administrare, singur sau, opţional, alături de un adjuvant adecvat, unui animal, cum ar fi de exemplu un mamifer, ca de exemplu un iepure sau cobai, dar care include si un om, răspunsul imunitar putând lua forma unui răspuns de stimulare a celulelor T în cadrul animalului primitor, cum ar fi omul. Alternativ, termenul „fragment activ» se poate folosi pentru inducerea unui răspuns celular T in vitro.

În accepţiunea prezentului document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt folosiţi în raport cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de resturi, cum ar fi resturi de aminoacid, care secvenţă formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt folosiţi în raport cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produse obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleazele uzuale.

În accepţiunea prezentei descoperiri, termenul „omologie procentuală», „identitate procentuală» sau „procentaj identic», cu referire la o secvenţă, presupune că o secvenţă este comparată cu o secvenţă patentată sau descrisă după alinierea secvenţei care se compară („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau patentată („secvenţă de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule:

Identitate procentuală = 100 [1 - (C/R)]

unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care

(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi (ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi (iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe şi (iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.

Dacă există un aliniament între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată anterior este aproximativ egală cu, sau mai mare decât o identitate procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are o identitate procentuală minimă specificată cu secvenţa de referinţă, deşi pot exista aliniamente pentru care anterior-menţionata identitate procentuală să fie mai mică decât identitatea procentuală specificată.

Peptidele originale (nemodificate) în conformitate cu descrierea din prezentul document se pot modifica prin substituirea unuia sau a mai multor resturi din diferite poziţii diferite, posibil selectate, din structura catenei peptidice, dacă nu s-a specificat altfel. Preferabil, aceste substituţii sunt localizate la capătul catenei de aminoacizi. Astfel de substituţii pot fi conservatoare, de exemplu, dacă un aminoacid este substituit cu un alt aminoacid cu structură şi caracteristici similare, astfel încât de exemplu un aminoacid hidrofob să fie înlocuit cu un alt aminoacid hidrofob. Mult mai conservatoare ar fi înlocuirea aminoacizilor cu unii de dimensiune şi natură chimică identică sau similară, cum ar fi în cazul în care leucina este înlocuită de izoleucină. În studiile variaţiilor de secvenţe la familii cu proteine omologe natural-survenite, anumite substituţii aminoacidice sunt mai frecvent tolerate decât altele, aceasta corelându-se cu similitudinile de dimensiune, sarcină, polaritate şi hidrofobicitate dintre aminoacidul natural şi cel care îl înlocuieşte, aceasta fiind baza de definire a „substituţiilor conservatoare''.

Substituţiile conservatoare sunt în prezentul document definite ca schimburi în cadrul unuia dintre următoarele cinci grupuri: Grupul 1 - resturi mici, alifatice, nepolare sau uşor polare (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupul 2 - resturi polare, încărcate negativ şi amidele lor (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupul 3 - resturi polare, încărcate pozitiv (His, Arg, Lys); Grupul 4 - resturi mari, alifatice, nepolare (Met, Leu, Ile, Val, Cys); şi Grupul 5 - resturi mari, aromatice (Phe, Tyr, Trp).

Substituţiile mai puţin conservatoare pot implica schimbarea unui aminoacid cu un altul cu caracteristici similare dar oarecum diferit ca dimensiuni, cum ar fi de exemplu substituirea alaninei cu un rest de izoleucină. Substituţiile înalt non-conservatoare pot implica substituirea unui aminoacid acid cu unul care este polar sau chiar bazic. Astfel de substituţii „radicale» nu pot fi apreciate, totuşi, ca potenţial ineficiente deoarece efectele chimice nu sunt complet previzibile; astfel de substituţii radicale pot provoca efecte caracterizate de serendipitate, fiind impredictibile pe baza principiilor chimice elementare.

Desigur, aceste substituţii pot implica structuri diferite de L-aminoacizii uzuali. Astfel, D-aminoacizii se pot substitui cu L-aminoacizii identificaţi uzual în peptidele antigenice ale descoperirii, fiind în continuare incluşi în prezentul document. În plus, aminoacizii care prezintă grupări R non-standard (adică, grupări R diferite de cele identificate in cei 20 aminoacizi uzuali din proteinele naturale) pot fi folosiţi în scopuri de substituţie pentru a produce imunogene şi polipeptide imunogene conform prezentei descoperiri.

Dacă substituţiile din mai mult de o poziţie se descoperă că pot conduce la o peptidă cu activitate antigenică substanţial echivalentă sau mai mare decât cea descrisă mai jos, atunci aceste substituţii se vor testa pentru a identifica dacă substituţiile combinate provoacă efecte cumulative sau sinergice ale antigenicităţii peptidei. În cel mai rău caz, nu se pot substitui simultan mai mult de 4 poziţii din cadrul peptidei.

Peptidele din descoperire pot fi alungite cu până la patru aminoacizi, adică 1, 2, 3 sau 4 aminoacizi pot fi adăugaţi la orice capăt în orice combinaţie între 4:0 şi 0:4.

Combinaţiile alungirilor în conformitate cu descoperirea pot fi ilustrate din Tabelul 3:

C-terminus N-terminus 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4 N-terminus C-terminus 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4

Aminoacizii pentru alungire/extindere pot fi peptidele secvenţei iniţiale a proteinei sau a oricărui alt aminoacid S. Alungirea poate fi utilizată pentru a spori stabilitatea sau solubilitatea peptidelor.

Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă, in vitro sau in vivo. Pentru CTL limitate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citokine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.

De preferat, atunci când celulele T specifice pentru o peptidă descrisă faţă de peptide substitute, concentraţia de peptide la care peptidele substituite ating jumătate din creşterea maximă a lizei comparativ cu fundalul este mai mică de 1mM, preferabil nu depăşeşte 1 μM, şi mai preferabil nu depăşeşte 1 nM, cel mai preferabil nu depăşeşte 100 pM şi în mod ideal nu depăşeşte 10 pM. Este de asemenea de preferat ca peptida substituită să fie recunoscută de celule T provenind de la mai mulţi indivizi, preferabil doi, dar, şi mai preferabil, trei indivizi.

Astfel, epitopii din prezenta descoperire pot fi identici cu cei care apar natural asociaţi tumorii sau specifici tumorii, sau pot include epitopi care diferă prin cel mult patru resturi de peptida de referinţă, atâta timp cât au activitate antigenică substanţial identică.

Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate care prezintă peptide rezultate din scindarea proteolitică a proteinelor care sunt în principal endogene, provenite din citosol sau nucleare, şi DRIP, dar şi a peptidelor mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatură ca „prezentare încrucişată».

Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8-dependente şi CD4-dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenelor asociate tumorii recunoscute de celule T CD8-pozitive (molecule MHC de clasă I) sau de celule T CD4-pozitive (molecule MHC de clasă II) este importantă pentru dezvoltarea unor vaccinuri antitumorale. Face, prin urmare, obiectul prezentei descoperiri furnizarea de compoziţii ale peptidelor care conţin peptide care se leagă de complexe MHC indiferent de clasa acestora.

Considerând efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratarea cancerului este nevoie disperată de metode îmbunătăţite de diagnostic şi prognostic mai bun. Prin urmare este necesară identificarea altor factori care reprezintă biomarkeri pentru cancer în general şi pentru HCC în special. Mai mult, este necesară identificarea unor factori care se pot folosi pentru tratamentul cancerului în general şi pentru HCC în special.

Prezenta descoperire furnizează peptide care sunt utile în tratarea cancerelor/tumorilor, de preferinţă HCC, care supraprezintă sau prezintă exclusiv peptidele din descoperire. Aceste peptide sunt ilustrate prin spectrometrie de masă pentru a fi prezentate în mod natural de către moleculele HLA pe probe primare umane de HCC.

S-a constatat că gena-/proteina-sursă (denumită, de asemenea, „proteină de lungime completă» sau „proteină subiacentă») din care se derivă peptidele este foarte supraexprimată în cancer comparativ cu ţesuturile normale - „ţesuturi normale», în raport cu prezenta descoperire, înseamnă celule hepatice sănătoase sau alte celule tisulare normale care demonstrează un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă (vezi Exemplul 2). Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în raport cu această descoperire, înseamnă o probă de la un pacient care suferă de HCC, însă nu şi pe ţesuturi normale (vezi Exemplul 1).

Peptidele legate de HLA se pot recunoaşte de către sistemul imunitar, în special de limfocite T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA-peptidă recunoscut, de exemplu celulele HCC care prezintă peptidele derivate.

Peptidele din prezenta descoperire s-au dovedit a fi capabile să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau sunt supraprezentate şi astfel pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, în particular sTCR-uri, conform prezentei descoperiri (vezi Exemplul 3). Mai mult, complexul format de peptide cu MHC-ul respectiv poate fi folosit şi pentru producţia de anticorpi specifici şi/sau TCR-uri, în particular sTCR-uri, în conformitate cu descrierea din prezentul document. Metodele respective sunt bine cunoscute de experţii în domeniu şi pot fi găsite şi în literatura de specialitate respectivă. Astfel, peptidele din prezenta descoperire sunt utile pentru generarea unui răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imun la pacient poate fi indus prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursoare adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) la pacient, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea (de exemplu un adjuvant). Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei descoperiri nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.

O „compoziţie farmaceutică» este, preferabil, o compoziţie potrivită pentru administrarea la o fiinţă umană într-un cadru medical. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă conform recomandărilor GMP.

Compoziţiile farmaceutice conţin peptidele fie în forma liberă fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (vezi mai sus). În accepţiunea prezentului document, „sare acceptabilă (din punct de vedere) farmaceutic» se referă la un derivat al peptidei menţionate în care peptida este modificată prin formarea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide sunt preparate din baza liberă (de obicei, în forma neutră, medicamentul are un grup -NH2 neutru) implicând reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru pregătirea sărurilor acide includ atât acizi organici (de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartaric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metansulfonic, acid etansulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi alţii asemenea lor), cât şi acizi anorganici, cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul fosforic şi alţii asemenea lor. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.

Într-o concretizare preferată în mod special, compusul farmaceutic cuprinde peptidele sub forma unor săruri de acid acetic (acetaţi), trifluor-acetaţi sau săruri de acid clorhidric (cloruri).

Se preferă, în special, o compoziţie şi/sau utilizarea acesteia, de exemplu sub formă de vaccin.

Peptida din prezenta descoperire se poate folosi pentru a genera şi a dezvolta anticorpi specifici contra complexelor MHC/peptidă. Acestea se pot folosi pentru tratament, direcţionarea toxinelor sau substanţelor radioactive către ţesutul bolnav. O altă utilizare a acestor anticorpi poate fi ţintirea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Această utilizare poate ajuta la depistarea metastazelor mici sau pentru stabilirea dimensiunii şi localizării exacte a ţesutului bolnav.

Prin urmare, un alt aspect al invenţiei este furnizarea unei metode pentru producerea unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I sau II complexate cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II uman complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I sau II care este complexat cu un antigen restricţionat HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.

Un alt aspect al prezentei invenţii se referă, deci, la o metodă de producere a anticorpului respectiv care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I sau II complexată cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu posibilitate de legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat. Metodele respective pentru producerea unor astfel de anticorpi şi complexe majore de histocompatibilitate de clasă I cu catenă unică, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt descrise în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Preferabil, anticorpul se leagă la complex cu o afinitate de legare mai mică de 20 nanomolari, preferabil sub 10 nanomolari, care este considerată ca fiind „specifică» în contextul prezentei invenţii.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza o metodă pentru producerea unui receptor de celule T solubil (sTCR) care să recunoască un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori de celule T solubili pot fi generaţi din clone de celule T specifice şi afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile determinante de complementaritate. În scopul selectării receptorilor de celule T, poate fi utilizat o afişare de fagi (US 2010/0113300, Liddy et al., 2012). În scopul stabilizării receptorilor celulelor T în timpul afişării fagilor şi în cazul utilizării practice ca medicament, catena alfa şi catena beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfurice non-native, alte legături covalente (receptor de celulă T cu o singură catenă) sau prin domenii de dimerizare (vezi Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (vezi, de exemplu, US 2013/0115191), domenii care recrutează celule efectoare precum domeniul anti-CD3, etc. pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. Mai mult, poate fi exprimată în celule T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode pentru producere sunt prezentate în WO 2013/057586A1.

În plus, peptidele şi/sau TCR-urile ori anticorpii sau alte molecule de legare din prezenta descoperire pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer de la un patolog pe baza unei probe biopsiate.

Pentru a selecta peptide supraprezentate, se calculează un profil de prezentare arătând prezentarea mediană a probei, precum şi variaţia replicării. Profilul juxtapune probe ale entităţii tumorale de interes pentru o linie de bază a probelor de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de supraprezentare, calculându-se valoarea p a unui model liniar cu efecte combinate (Pinheiro et al., 2007), care se ajustează pentru testarea multiplă prin rata de descoperire falsă (Benjamini şi Hochberg).

Pentru identificarea şi cuantificarea relativă a liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, moleculele HLA din probele de ţesut îngheţat prin şoc au fost purificate şi peptidele asociate cu HLA au fost izolate. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente online de nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) prin cromatografie de lichid-spectrometrie de masă (LC-MS). Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a TUMAP naturale înregistrate din probe de HCC (N = 16 probe A*02-pozitive, inclusiv 13 probe A*02:01-pozitive, N = 15 probe A*24-pozitive) cu modele de fragmentare ale peptidelor de referinţă sintetice corespunzătoare ale secvenţelor identice. Deoarece peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA ale tumorilor primare, aceste rezultate furnizează dovezi directe pentru procesarea şi prezentarea naturale ale peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar obţinut de la pacienţi cu HCC.

Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (vezi, de exemplu, US 2013-0096016) permite identificarea şi selectarea candidaţilor relevanţi pentru vaccinare cu peptide supraprezentate pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide HLA-restricţionate pe ţesuturile canceroase comparativ cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără etichete utilizându-se datele LC-MS obţinute, procesate de un pipeline patentat de analiză a datelor, combinându-se algoritmi pentru identificarea secvenţelor, gruparea spectrală, numărarea ionilor, alinierea timpului de retenţie, deconvoluţia de stare a încărcării şi normalizarea.

Au fost stabilite nivelurile de prezentare, inclusiv estimările de eroare pentru fiecare peptidă şi probă. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesuturi tumorale şi peptide supraprezentate în tumoră faţă de ţesuturi şi organe necanceroase.

Complexele HLA-peptidă din probe de ţesut de HCC au fost purificate şi peptidele HLA-asociate au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate peptidele TUMAP conţinute în prezenta aplicaţie au fost identificate cu această abordare pe probe de HCC primar, confirmându-se prezentarea acestora pe HCC primar.

Peptidele TUMAP identificate pe mai multe tumori de HCC şi ţesuturi normale au fost cuantificate utilizându-se numărarea de ioni la datelor LC-MS fără etichete. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide se corelează cu abundenţa sa în probă. Toate semnalele cantitative ale unei peptide în diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, mediate per probă şi fuzionate într-o diagramă de bare, denumită profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în baza de date cu proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia de stare de încărcare (decompresie) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.

Prezenta descoperire se referă la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 90% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida menţionată, în care peptida menţionată nu este polipeptida de bază cu lungime completă.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 90% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300, în care peptida menţionată sau varianta acesteia are o lungime totală între 8 şi 100, de preferinţă între 8 şi 30 şi, cel mai preferat, între 8 şi 14 aminoacizi.

Prezenta descoperire se referă şi la peptidele în conformitate cu descrierea din prezentul document şi care au capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau de clasă II.

Prezenta descoperire se referă şi la peptidele descrise în prezentul document în care peptidele respective constau sau constau în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi în conformitate cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300.

Prezenta invenţie se referă în continuare la peptidele descrise în prezentul document, în care peptida este modificată (chimic) modificată şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta descoperire se mai referă la peptidele în conformitate cu descrierea din prezentul document în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, care cuprinde în special aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau în care peptida este fuzionată cu (sau în) un anticorp, cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta descriere se referă în plus la un acid nucleic care codifică peptidele în conformitate cu descrierea din prezentul document, cu condiţia ca peptida să nu fie proteina umană completă (întreagă).

Prezenta descoperire referă în continuare la acidul nucleic descris în prezentul document, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta descoperire se referă în continuare la un vector de exprimare care este capabil să exprime un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la o peptidă conform descrierii din prezentul document, un acid nucleic conform descrierii din prezentul document sau un vector de exprimare conform descrierii din prezentul document pentru utilizare în medicină, în special în tratamentul HCC.

Prezenta descriere se referă în continuare la o celulă gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document sau un vector de exprimare în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Prezenta descoperire se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu descrierea din prezentul document, care este o celulă prezentatoare de antigen şi, de preferinţă, este o celulă dendritică.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda în conformitate cu descrierea din prezentul document în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta descoperire se referă în continuare la metoda descrisă în prezentul document în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau varianta menţionată de secvenţă de aminoacizi.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu descrierea din prezentul document, a unui vector de exprimare în conformitate cu descrierea din prezentul document, a unei celule în conformitate cu descrierea din prezentul document sau a unei limfocite T citotoxice activată în conformitate cu descrierea din prezentul document ca medicament sau în fabricarea unui medicament. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care medicamentul este un vaccin. Prezenta descoperire se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu descrierea din prezentul document în care celulele canceroase menţionate sunt celule HCC sau alte celule tumorale solide sau hematologice, cum ar fi cele de cancer pancreatic, cancer cerebral, cancer renal, cancer de colon sau rectal ori leucemie.

Prezenta descoperire se referă în continuare la proteine marker şi biomarkeri particulari pe baza peptidelor descrise în prezentul document, numite în prezentul document „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticarea şi/sau prognosticul CRC. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi pentru tratarea cancerului.

Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat aici într-un sens larg şi include anticorpi atât policlonali, cât şi monoclonali. În plus faţă de moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul „anticorpi» sunt incluse, de asemenea, fragmente (de exemplu, fragmente de CDR, Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acelor molecule de imunoglobulină şi versiunile umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atât timp cât acestea manifestă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică a unei polipeptide marker HCC, livrarea unei toxine într-o celulă de HCC care exprimă o genă marker de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide marker de HCC) în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Ori de câte ori este posibil, anticorpii descoperirii pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii din descoperire pot fi generaţi, de asemenea, folosindu-se metode bine cunoscute. Specialiştii în domeniu vor înţelege că pot fi utilizaţi fie polipeptide markeri de HCC de lungime completă, fie fragmente ale acestora pentru generarea anticorpilor în conformitate cu descoperirea. O polipeptidă de utilizat pentru generarea unui anticorp din descoperire poate fi purificată parţial sau complet dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă utilizându-se tehnici cu ADN recombinant.

De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă în conformitate cu descrierea din prezentul document, cum ar fi o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300, o polipeptidă ori o variantă sau un fragment al acesteia, poate fi exprimat în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau celule eucariote (de exemplu, celule de drojdii, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorpi monoclonali sau policlonali care leagă în mod specific polipeptida marker de HCC utilizată pentru a genera anticorpul, în conformitate cu descrierea din prezentul document.

Un specialist în domeniu va realiza că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea obţinerii unui anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare utilizării sale preconizate (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care anticorpii urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.), pentru îndrumări suplimentare privind generarea şi testarea anticorpilor (vezi, de exemplu, Harlow şi Lane, 2013). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi în teste ELISA, imunoamprente (Western blots), colorare imunohistochimică a cancerelor fixate cu formalină sau secţiuni de ţesut îngheţat. După caracterizarea iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării diagnostice terapeutice sau in vivo sunt testaţi conform metodelor cunoscute de testare clinică.

Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali cuprinzând populaţia sunt identici, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali descrişi în mod specific includ anticorpi „himerici», în care o porţiune din catena grea şi/sau uşoară este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul catenei (catenelor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât aceştia prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567).

Anticorpii monoclonali ai invenţiei pot fi generaţi folosindu-se metode de hibridom. Într-o metodă de hibridom, un şoarece sau alt animal-gazdă adecvat este, de obicei, imunizat cu un agent de imunizare pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific la agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.

Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai invenţiei poate fi izolat uşor şi secvenţializat utilizându-se proceduri convenţionale (de exemplu, prin utilizarea probelor oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la genele codificatoare ale catenelor grele şi uşoare ale anticorpilor murinici).

Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în particular fragmente Fab, poate fi realizată folosindu-se tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată folosindu-se papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaină a anticorpilor produce, de obicei, două fragmente identice de legare la antigen, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul pepsinei generează un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.

Fragmentele de anticorpi, fie că sunt ataşate la alte secvenţe sau nu, pot include de asemenea inserţii, deleţii, substituţii sau alte modificări selectate ale unor regiuni particulare sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau degradată în mod semnificativ faţă de anticorpul nemodificat sau fragmentul de anticorp. Aceste modificări pot furniza unele proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legare la disulfuri, creşterea biolongevităţii, modificarea caracteristicilor secretoare etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legării la domeniul de legare, etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza specifică situsului acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.

Anticorpii conform invenţiei pot cuprinde suplimentar anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, catene de imunoglobulină sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab 'sau alte subsecvente de legare la antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulină non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care resturile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a recipientului sunt înlocuite cu resturi dintr-o CDR a unei specii non-umane (anticorp donor), de exemplu de şoarece, şobolan sau iepure cu specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, resturile de cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu resturi non-umane corespunzătoare. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, resturi care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele de CDR sau de cadru importate. În general, anticorpul umanizat va cuprinde, practic, toate cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile în care toate sau, practic, toate regiunile CDR corespund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau, practic, toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe de consens a imunoglobulinelor umane. Anticorpul umanizat optim va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.

Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacid introduse în el dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacid non-umane sunt adesea denumite reziduuri de „import», care sunt, de obicei, luate dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată, practic, prin substituirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de la rozătoare pentru secvenţele corespunzătoare unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care, practic, mai puţin de un domeniu variabil uman intact a fost substituit cu secvenţa corespunzătoare de la o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele resturi CDR şi, posibil, unele resturi FR sunt substituite cu resturi din situsuri analoage în anticorpi de la rozătoare.

Pot fi folosite animale transgenice (de exemplu, şoareci), care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă. De exemplu, a fost descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de legare a catenei grele de anticorp la şoareci mutanţi himeric şi de filiaţie germinală conduce la inhibarea completă a producţiei de anticorpi endogeni. Transferul seriei de gene de imunoglobulină cu filiaţie germinală umană în astfel de şoareci mutanţi cu filiaţie germinală va conduce la producerea de anticorpi umani după provocarea de către un antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare a fagilor.

Anticorpii din invenţie sunt, preferabil, administraţi unui subiect într-un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În mod obişnuit, o cantitate adecvată dintr-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este utilizată în formulă pentru a face formularea izotonică. Exemplele de agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţia salină, soluţia Ringer şi soluţia de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 până la aproximativ 7,5. Agenţii purtători suplimentari includ preparate cu eliberare prelungită, de exemplu matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matricele fiind sub formă de articole formate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Va fi evident pentru persoanele de specialitate din domeniu că anumiţi agenţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie de, de exemplu, calea de administrare şi concentraţia anticorpului care este administrat.

Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzia, care asigură eliberarea sa în sânge într-o formă eficace. De asemenea, anticorpii pot fi administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale pentru a exercita efecte terapeutice locale, precum şi sistemice. Este preferabilă injectarea locală sau intravenoasă.

Dozele şi schemele eficace pentru administrarea anticorpilor pot fi determinate empiric şi realizarea unor astfel de determinări se află în domeniul de specialitate. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorpi care trebuie administrată va varia în funcţie de, de exemplu, subiectul care va primi anticorpul, calea de administrare, de tipul particular de anticorp utilizat şi alte medicamente administrate. O doză zilnică tipică de anticorp utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. După administrarea unui anticorp, preferabil pentru tratarea HCC, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. De exemplu, mărimea, numărul şi/sau distribuţia cancerului la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate utilizându-se tehnici standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat terapeutic care opreşte creşterea tumorii, are ca rezultat contracţia tumorală şi/sau împiedică dezvoltarea de tumori noi în comparaţie cu evoluţia bolii care ar avea loc în absenţa administrării anticorpului este un anticorp eficace pentru tratamentul cancerului.

Deoarece peptidele menţionate în tabelele de mai sus ale descrierii şi, prin urmare, polipeptidele subiacente sunt foarte bine exprimate în HCC şi sunt exprimate la niveluri mai degrabă până la extrem de scăzute în celulele normale, inhibarea unei proteine selectate din grupul format din produsele proteice ale următoarelor gene: Preferred for the inhibition and for antibodies and/or TCRs are GLUL, GPAM, PLIN2, SLC16A1, SLC9A3R1, PCBD1, SEC16A, AKR1C4, ABCB11, HAL, CYP2E1, C4A, C4B, ALDH1L1, CRP, ACSL4, EEF2, HLTF, FBXO22, GALK1, TMC01, TMEM33, ZNF318, IPO9, AMACR, C1QTNF3, CYP4F8, CYP4F3, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F2, MOCOS, A1CF, COL18A1, HPR, LBP, C19orf80, CFHR5, ITIH4, TMEM110, LARP4, LMF2, SLC10A5, and SLC16A11; still preferred for the inhibition and for antibodies and/or TCRs are ANKFYI, C12orf44, C16orf58, CPSF1, DCAF8, PEX19, DDX11, DDX12P, DECR2, NME4, DENND5B, DYM, EDC4, ERI3, FAM20A, FNDC3A,GPR107, GYG2, HEATR2, IFT81, KCTD3,SHKBP1, KIAA1324L, KLHL24, MARCH6, MBTPS2, MIR1279, CPSF6, NOC4L, NXF1, PANK2, PCNXL3, PIPSL, PSMD4, PSMD14, SLC35B1, TCP11L2, THNSL2, THOC2, T0MM5, TRAPPC6B, TRIM54, TRIM55, TRIM63, UGGT2, URB1, VPS54, WIZ, ZNF451, RFTN2, SCFD1, SERINC5, CCT7P2, CMAS, ANKS1A, C17orf70, CCT7, CDK5RAP2, CLPTM1, şi cele mai preferate pentru inhibare şi pentru anticorpi şi/sau TCR-uri sunt APOB, FASN şi/sau COPA; iar expresia sau activitatea acestor markeri poate fi integrată de preferinţă într-o strategie terapeutică, de exemplu pentru tratarea sau prevenirea HCC.

Principiul de terapie anti-sens este bazat pe ipoteza că supresia, specifică secvenţei, a exprimării genice (prin transcripţie sau translaţie) se poate obţine prin hibridizare intracelulară între ADN sau ARNm genomic şi specii complementare anti-sens. Formarea unui asemenea duplex de acid nucleic hibrid interferează cu transcripţia ADN-ului genomic care codifică antigenul ţintă tumoral sau cu procesarea/transportul/translaţia şi/sau stabilitatea ARNm-ului pentru antigenul-ţintă tumoral.

Acizii nucleici anti-sens se pot administra printr-o varietate de metode. De exemplu, oligonucleotidele anti-sens sau ARN-ul anti-sens se pot administra direct (de exemplu, prin injectare intravenoasă) unui subiect într-o formă care permite captarea în celulele tumorale. Alternativ, vectorii virali sau plasmidici care codifică ARN-ul anti-sens (sau fragmente de ARN) se pot introduce în celule in vivo. Efectele anti-sens se pot induce prin secvenţe de sens; totuşi, extensia modificărilor fenotipice este foarte variabilă. Modificările fenotipice induse de tratamentul anti-sens eficace sunt evaluate conform modificărilor apărute, de exemplu, în valorile ARNm-ului ţintă, valorile proteinelor-ţintă şi/sau nivelul de activitate al proteinelor-ţintă.

Într-un exemplu specific, inhibarea funcţiei de ţintă/marker HCC prin terapie genică anti-sens se poate obţine prin administrarea directă de ARN marker tumoral anti-sens unui subiect. Markerul tumoral ARN anti-sens se poate produce şi izola prin orice tehnică standard, dar este cel mai convenabil produs prin transcripţie in vitro folosindu-se marker ADNc tumoral anti-sens sub controlul unui promotor de mare eficacitate (de exemplu, promotorul T7). Administrarea unui marker tumoral ARN anti-sens unor celule se poate face prin oricare dintre metodele pentru administrarea directă de acid nucleic descrisă mai jos.

O strategie alternativă pentru inhibarea funcţiei unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus şi, cel mai preferabil, din APOB, FASN şi/sau COPA, implică utilizarea unui acid nucleic (de exemplu, siARN sau un acid nucleic care codifică un anticorp antiproteic sau o porţiune a acestuia, care poate fi transferat în celulele canceroase sau în alte celule, ceea ce duce la exprimarea şi secreţia intracelulară a anticorpului), o proteină sau o moleculă mică ori orice alt compus care vizează exprimarea, translaţia şi/sau funcţia biologică a acestei proteine.

În metodele descrise mai sus, care includ administrarea şi absorbţia ADN-ului exogen în celulele unui subiect (adică, transducţia sau transfecţia genică), acizii nucleici din prezenta descoperire pot fi sub formă de ADN gol sau acizii nucleici pot fi într-un vector pentru eliberarea acizilor nucleici în celule pentru inhibarea exprimării proteinei marker pentru HCC. Vectorul poate fi un preparat disponibil comercial, de exemplu un vector de adenovirus (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada). Livrarea acidului nucleic sau a vectorului în celule poate fi realizată printr-o varietate de mecanisme. Ca un exemplu, livrarea poate fi realizată printr-un lipozom utilizându-se preparate lipozomale disponibile în comerţ, de exemplu Lipofectin, Lipofectamine (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), Superfect (Qiagen, Inc. Hilden, Germania) şi Transfectam Biotec, Inc., Madison, Wis., SUA), precum şi alte lipozomi dezvoltaţi conform procedurilor standard din domeniu. În plus, acidul nucleic sau vectorul din această descoperire poate fi livrat in vivo prin electroporare, pentru care este disponibilă tehnologia de la Genetronics, Inc. (San Diego, SUA), precum şi prin intermediul unui aparat Sonoporation (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Arizona, SUA).

De exemplu, livrarea vectorului se poate face printr-un sistem viral, cum ar fi un sistem de vector retroviral care poate ambala un genom retroviral recombinant. Retrovirusul recombinant se poate apoi folosi pentru a infecta şi, prin urmare, pentru a livra în celulele infectate acid nucleic anti-sens care inhibă exprimarea unei proteine selectate dintr-un grup constând din proteinele menţionate mai sus. Metoda exactă de introducere a acidului nucleic alterat în celulele de mamifere nu este, desigur, limitată la folosirea de vectori retrovirali. Pentru această procedură sunt disponibile şi alte tehnici disponibile pe scară largă, inclusiv folosirea de vectori adenovirali, vectori asociaţi adeno-virusurilor (AAV), vectori lentivirali, vectori retrovirali pseudotipaţi. De asemenea, se pot utiliza tehnici de transducţie fizică, cum ar fi livrarea de lipozomi şi alte mecanisme de endocitoză mediată de receptor sau de alt tip. Această invenţie se poate folosi în asociere cu oricare dintre aceste metode de transfer genic, precum şi cu alte metode folosite frecvent.

Anticorpii pot fi utilizaţi, de asemenea, pentru teste diagnostice in vivo. În general, anticorpii sunt etichetaţi printr-o radionucleotidă (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32 P sau 35S), astfel încât tumora să poată fi localizată folosind imunoscintiografie. Într-una dintre realizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă la domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea de afinitate (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.

Anticorpii pentru utilizare diagnostică pot fi etichetaţi cu sonde adecvate pentru detectarea prin diferite metode imagistice. Metodele pentru detectarea sondelor includ, dar nu se limitează la, fluorescenţă, lumină, microscopie confocală şi electronică; imagistică prin rezonanţă magnetică şi spectroscopie; fluoroscopie, tomografie computerizată şi tomografie cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi cu emisie de pozitron. În plus, probele pot fi bi- sau multifuncţionale şi pot fi detectate folosind una sau mai multe dintre metodele prezentate aici. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea probelor la anticorpi implică ataşarea covalentă a probei, încorporarea probei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea probei, printre alte acţiuni bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, proba de ţesut bolnav poate fi proaspătă sau congelată ori poate fi încorporată în parafină şi fixată cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau încorporată care conţine proba intră în contact cu un anticorp etichetat principal şi cu un anticorp secundar, anticorp folosit pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.

După cum s-a menţionat mai sus, prezenta descoperire furnizează, astfel, o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care este 90% omologă SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acesteia care va induce reactivitate încrucişată a celulelor T cu peptida menţionată. Peptidele din descoperire au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau de versiuni alungite ale peptidelor menţionate la clasa II.

În prezenta descoperire, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (consultaţi secţiunea „Identitate procentuală» de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. Anterior menţionata „omologie» se stabileşte prin compararea a două secvenţe aliniate in condiţii optime cu secvenţele care vor trebui comparate. O astfel de omologie a secvenţei se poate calcula prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programe de analiză a secvenţei disponibile în mod obişnuit, mai specific Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente de analiză sunt furnizate de baze de date publice.

Specialiştii în domeniu vor putea analiza dacă celulele T induse de o variantă a peptidei specifice vor putea reacţiona încrucişat cu peptida în sine (Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006 ; Appay et al., 2006).

Prin „variantă» a secvenţei date de aminoacizi, inventatorii se referă la faptul că lanţurile secundare provenite, de exemplu, de la unul sau două resturi aminoacid sunt modificate (de exemplu prin substituirea lor cu lanţul secundar al altui rest aminoacid natural sau cu un alt lanţ secundar) astfel încât peptida să fie în continuare capabilă să se lege de molecula HLA în principal în acelaşi mod ca şi peptida care conţine secvenţa dată de aminoacid constând din SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300. De exemplu, o peptidă se poate modifica astfel încât aceasta să menţină, dacă nu să amelioreze posibilitatea de a interacţiona cu şi de a se lega de un situs de legare al unei molecule MHC adecvate, cum ar fi HLA-A*02 sau -DR, şi astfel să menţină cel puţin, dacă nu să îmbunătăţească abilitatea de a se lega la TCR pentru celule T activate.

Aceste celule T pot apoi reacţiona încrucişat cu celulele şi pot distruge celulele care exprimă o polipeptidă care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei înrudite definite în descrierea descoperirii. După cum poate fi derivat din literatura ştiinţifică (Godkin et al., 1997) şi bazele de date (Rammensee et al., 1999), anumite poziţii ale peptidelor care leagă HLA sunt de obicei reziduuri ancoră care constituie o secvenţă centrală care corespunde tiparului de cuplare al incizurii de cuplare a receptorului HLA, care este definit de proprietăţile polare, electrofizice, hidrofobe şi spaţiale ale lanţului polipeptidei care constituie incizura de cuplare. Astfel, un expert în domeniu ar putea modifica secvenţele de aminoacizi stabilite în SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300, prin menţinerea resturilor-ancoră, şi vor putea stabili dacă aceste variante îşi menţin abilitatea de a se lega de moleculele MHC de clasă I sau II. Variantele prezentei descoperiri îşi păstrează abilitatea de a lega TCR pentru celule T activate, care pot reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă polipeptida care conţine secvenţa naturală de aminoacid a peptidei înrudite definite în descrierea invenţiei.

Reziduurile aminoacidice care nu contribuie substanţial la interacţiunea cu receptorul celulelor T pot fi modificate prin substituirea cu alţi aminoacizi a căror încorporare nu modifică substanţial reactivitatea celulelor T şi care nu elimină cuplarea cu MHC relevant. Astfel, cu excepţia condiţiei explicate, peptida care face obiectul descoperirii poate fi orice peptidă (termen în care includem şi oligopeptide sau polipeptide) care include secvenţele de aminoacizi sau o porţiune sau variantă a acestora.

Aceste resturi de aminoacid care nu contribuie substanţial la interacţiunea cu TCR-ul pot fi modificate prin substituirea cu alţi aminoacizi a căror încorporare nu modifică substanţial reactivitatea celulelor T şi care nu elimină cuplarea cu MHC relevant. Astfel, cu excepţia condiţiei explicate, peptida care face obiectul invenţiei poate fi orice peptidă (termen în care includem şi oligopeptide, şi polipeptide) care include secvenţele de aminoacizi sau o porţiune sau variantă a acestora.

Pot fi adecvate, de asemenea, peptide mai lungi. Este, de asemenea, posibil ca epitopii MHC de clasă I, deşi de obicei cu lungimea de 8-11 aminoacizi, să fie generaţi prin procesarea peptidelor provenite din peptide sau proteine mai lungi care includ epitopul efectiv. Este preferabil ca resturile care flanchează epitopul efectiv să fie resturi care să nu influenţeze substanţial clivajul proteolitic necesar pentru expunerea epitopului efectiv în timpul procesării.

În consecinţă, prezenta descoperire furnizează peptide şi variante de epitopi MHC de clasă I, în care peptida sau varianta are o lungime totală cuprinsă între 8 şi 100, preferabil între 8 şi 30, şi, cel mai preferabil, între 8 şi 14, şi anume 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoacizi; în cazul peptidelor de legare de clasă II alungite, lungimea poate fi, de asemenea, de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 sau 22 de aminoacizi.

Desigur, peptida sau varianta în conformitate cu prezenta descoperire va avea capacitatea să se lege de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I or II.

Legarea unei peptide sau a unei variante la un complex MHC poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

Într-o realizare preferată în mod special a descoperirii, peptida constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300.

„Constând în esenţă din» înseamnă că o peptidă în conformitate cu prezenta descoperire, pe lângă secvenţa în conformitate cu oricare dintre SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă a acestora, conţine segmente de aminoacid N-terminale sau C-terminale care nu fac în mod necesar parte din peptida care funcţionează ca epitop pentru molecule MHC.

Totuşi, aceste resturi pot fi importante pentru a furniza o introducere adecvată a peptidei care face obiectul prezentei descoperiri în interiorul celulei. Într-o concretizare a prezentei descoperiri, peptida face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine, de exemplu, cei 80 aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (p33, următoarea „Ii») derivaţi din NCBI, număr de identificare GenBank X00497. În alte fuziuni, peptidele din prezenta descoperire pot fi fuzionate la un anticorp aşa cum este descris în prezentul document, sau o parte funcţională a acestuia, în special într-o secvenţă a unui anticorp, astfel încât să fie direcţionate în mod specific de respectivul anticorp, sau, de exemplu, către sau într-un anticorp care este specific pentru celulele dendritice descrise în prezentul document.

În plus, peptida sau varianta pot fi ulterior modificate pentru a îmbunătăţi stabilitatea şi/sau legarea de molecule MHC pentru a exercita un răspuns imun mai puternic. Metodele pentru această optimizare a secvenţei de peptidă este cunoscută în domeniu şi poate include, de exemplu, introducerea unor legături peptidice inversate sau a unor legături non-peptidice.

Într-o legătură peptidică inversată, reziduurile aminoacidice nu sunt unite prin legături peptidice (-CO-NH-), ci legătura peptidică este inversată. Astfel de retro-inverso peptido-mimetice se pot obţine folosind metodele cunoscute în literatura de specialitate, cum ar fi de exemplu cele descrise în Meziere et al. (1997). Această abordare implică sinteza de pseudopeptide care conţin modificări care implică scheletul şi nu orientarea lanţurilor secundare. Meziere et al (1997) demonstrează că aceste pseudopeptide sunt utile pentru legarea MHC şi răspunsurile celulelor T helper. Peptidele retro-inversate, care conţin legături NH-CO şi nu legături peptidice CO-NH, sunt mult mai rezistente la proteoliză.

O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, şi -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.

Peptidele care conţin secvenţele descrise mai sus pot fi sintetizate cu ajutorul unor grupări chimice suplimentare prezente la capetele amino- sau carboxi-terminale, pentru a îmbunătăţi stabilitatea, biodisponibilitatea şi/sau afinitatea peptidelor. De exemplu, grupările hidrofobe, cum ar fi carbo-benzoxil, dansil sau T-butil-oxi-carbonil pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal. Similar, o grupare acetil sau o grupare 9-fluorenil-metoxi-carbonil se poate plasa la capătul amino-terminal al peptidei. În plus, grupările hidrofobe, cum ar T-butil-oxi-carbonil, sau o grupare amido- pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal.

Mai mult, peptidele din descoperire pot fi sintetizate în funcţie de configuraţia lor sterică. De exemplu, se poate utiliza izomerul D al unuia sau mai multor resturi de aminoacid peptidic în locul izomerului L uzual. Ba chiar mai mult, cel puţin unul dintre resturile de aminoacid al peptidei din descoperire poate fi substituit cu unul dintre resturile de aminoacid cunoscute, care nu apar în mod natural. Alterări de tipul acestora pot ajuta la creşterea stabilităţii, biodisponibilităţii şi/sau legării peptidelor care fac obiectul descoperirii.

Similar, o peptidă sau o variantă a descoperirii se poate modifica din punct de vedere chimic prin reacţii cu diverşi aminoacizi înainte sau după sinteza peptidei. Exemplele acestor modificări sunt bine cunoscute în domeniu şi sunt rezumate, de exemplu, în R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005. Modificarea chimică a aminoacizilor include, fără a se limita la, modificarea prin acilare, amidinare, piridoxilarea lizinei, alkilare reductivă, trinitrobenzilarea grupurilor amino cu acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfonic (TNBS), modificarea amidică a grupărilor carboxil şi sulfhidril prin oxidarea cu acid performic a cisteinei la acid cisteic, formarea de derivaţi de mercur, formarea de disulfide mixte cu alţi compuşi tiolici, reacţia cu maleimidă, carboximetilarea cu acid iodoacetic sau iodoacetamidă şi carbamoilare cu cianat la pH alcalin, deşi fără a se limita la acestea. În aceste privinţe, doritorii sunt trimişi la Capitolul 15 al protocolului prezent din Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) pentru metodologia extinsă legată de modificarea chimică a proteinelor.

Pe scurt, modificarea de exemplu a resturilor arginil sunt de obicei bazate pe reacţia dintre compuşii dicarbonil vecini cum ar fi fenilglioxal, 2, 3-butandionă, şi 1,2-ciclohexan-dionă pentru formarea unui aduct. Un alt exemplu este reacţia dintre metilglioxal şi resturile de arginină. Cisteina se poate modifica fără modificarea concomitentă a altor situri nucleofile cum ar fi lizina şi histidina. Ca rezultat, pentru modificarea cisteinei sunt disponibili un număr mare de reactivi. Paginile unor companii cum ar fi Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pot furniza informaţii despre anumiţi reactivi.

Reducerea selectivă a punţilor disulfidice din proteine este şi ea frecventă. Punţile disulfidice se pot forma şi oxida prin tratamentul termic al produselor biofarmaceutice. Reactivul K de la Woodward se poate folosi pentru modificarea resturilor de acid glutamic. N-(3-(dimetil-amino)propil)-N'-etilcarbodiimida se poate folosi pentru a forma legături intra-moleculare între un rest de lizină şi un rest de acid glutamic. De exemplu, dietilpirocarbonatul este un reactiv pentru modificarea resturilor de histidil din proteine. Histidina se poate modifica la rândul sau folosind 4-hidroxi-2-nonenal. Reacţia resturilor de lisină şi a altor grupări α-amino este utilă, de exemplu, pentru legarea peptidelor de suprafeţe sau de legături încrucişate proteine-peptide. Lisina este locul de ataşare a poli(etilen)glicolului şi locul principal de modificare în cazul glicozilării proteinelor. Resturile de metionină din proteine se pot modifica de exemplu folosind iodoacetamidă, brometilamină şi cloramină T.

Tetranitrometanul şi N-acetil-imidazolul se pot folosi pentru modificarea resturilor tirozil. Legarea încrucişată prin formarea de ditirosină poate fi realizată cu ioni de cupru sau apă oxigenată.

Studii recente privind modificarea triptofanului au utilizat N-bromosuccinimidă, bromură 2-hidroxi-5-nitrobenzil sau 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-scatol).

Modificarea cu succes a proteinelor şi peptidelor terapeutice cu PEG este adesea asociată cu o extindere a timpului de înjumătăţire circulatorie în timpul legării încrucişate a proteinelor cu glutaraldehidă, diacrilat de polietilen-glicol, iar formaldehida este utilizată pentru pregătirea hidrogelurilor. Modificarea chimică a alergenilor pentru imunoterapie este obţinută adesea prin carbamilare cu cianat de potasiu.

O peptidă sau o variantă, în care peptida este modificată sau include legături non-peptidice reprezintă un exemplu preferat al descoperirii. În general, peptidele şi variantele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile de acid amino) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lukas et al. (Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. May 1981; 78(5): 2791-2795) şi referinţele citate. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacizi sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosindu-se proceduri de testare care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic sau izotină. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (vezi, de exemplu, Bruckdorfer et al., 2004 şi referinţele citate în acest document).

Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).

Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.

Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.

Un alt aspect al descoperirii furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă sau o variantă de peptidă din invenţie. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora, în helix simplu şi/sau dublu sau în forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotidele cu bază de fosforotioat şi poate conţine sau nu introni, cu condiţia să codifice pentru peptidă. Desigur, numai peptidele care conţin resturi de aminoacid existente în mod natural şi unite prin legături peptidice care apar în mod natural sunt codificabile de o polinucleotidă. Un alt aspect al descoperirii constă în furnizarea unui vector de expresie capabil să exprime o polipeptidă conform descoperirii.

Au fost dezvoltate mai multe metode de legare a polinucleotidelor, în special a ADN-ului, de vectori, de exemplu, prin terminale coezive complementare. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul ADN sunt apoi unite prin punţi de hidrogen între cozile complementare homopolimer pentru a forma molecule ADN recombinate.

Agenţii de legătură sintetici care conţin unul sau mai multe situri limitative oferă o modalitate alternativă de alăturare a segmentelor ADN la vectori. Agenţii de legare care conţin o varietate de situri de endonucleaze de restricţie sunt disponibili comercial de la mai multe surse, dintre care amintim pe International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SUA.

O metodă preferabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida din descoperire utilizează reacţia de polimerază în lanţ descrisă de Saiki RK et al. (Saiki et al., 1988). Această metodă poate fi utilizată pentru introducerea ADN-ului într-un vector potrivit, de exemplu prin implementarea în locaţii cu restricţii adecvate sau poate fi utilizată pentru modificarea ADN-ului în alte moduri, după cum este cunoscut în literatura de specialitate. În cazul utilizării unor vectori virali, sunt preferaţi vectorii virus variolic sau adenovirus.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) poate fi apoi exprimat într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta din descoperire. Prin urmare, ADN-ul care codifică peptida sau varianta din descoperire poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificate corespunzător instrucţiunilor prezente, în vederea construirii unui vector de expresie, care este apoi utilizat pentru transformarea unei celule-gazdă corespunzătoare pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din descoperire. Astfel de tehnici includ cele descrise, de exemplu, în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică polipeptida care formează compusul din descoperire poate fi cuplat cu o mare varietate de alte secvenţe ADN pentru introducerea într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi dacă se doreşte integrarea sau întreţinerea episomală.

În general, ADN-ul este introdus într-un vector de exprimare, cum ar fi o plasmidă, cu orientarea corectă şi intervalul potrivit de citire pentru exprimare. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi corelat cu secvenţele de nucleotide de transcripţie şi translaţie corespunzătoare, recunoscute de gazda dorită, cu toate că astfel de controale sunt disponibile în general în vectorul de exprimare. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnicile standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selectare implică înglobarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe ADN cu toate elementele de control necesare, care să codifice o trăsătură selectabilă din celula transformată, cum ar fi de exemplu rezistenţa la antibiotic.

Alternativ, gena unei asemenea trăsături selectabile poate fi pe un alt vector, care este folosit pentru a cotransforma celula-gazdă dorită.

Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din descoperire sunt apoi cultivate un timp suficient şi în condiţii corespunzătoare, cunoscute celor iniţiaţi, în conformitate cu îndrumările din acest document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.

Sunt cunoscute numeroase sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), levuri (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule provenite de la insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.

Prezenta descoperire este legată şi de o serie de celule-gazdă transformate cu un vector polinucleotidic, creat în cadrul prezentei invenţii. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Este posibil ca celulele bacteriene să fie celule-gazdă procariote preferate în anumite circumstanţe şi, de regulă, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile E. coli DH5, disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1, disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (No ATCC 31343). Printre celulele-gazdă eucariote se numără celulele de drojdie, insecte şi mamifere, de preferinţă celule de vertebrate precum cele de la şoarece, şobolan, maimuţă sau linii de celule fibroblastice sau de colon umane. Celulele-gazdă provenite din drojdii includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt disponibile în general de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, SUA. Celulele-gazdă preferate provenite de la mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc, disponibile de la ATCC ca CCL61, celulele embrionare de cobai NIH elveţian, NIH/3T3 disponibile de la ATCC ca CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichii de maimuţă disponibile de la ATCC ca CRL 1650 şi celulele 293 care sunt celule embrionare renale umane. Celulele preferate provenite de la insecte sunt celulele Sf9 care pot fi transfectate cu vectori de exprimare a baculovirusului. O prezentare generală a opţiunilor de celule-gazdă adecvate poate fi găsită, de exemplu, în manualul scris de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Partea I, ediţia a doua, ISBN 978-1-58829-262-9 şi în alte lucrări cunoscute în domeniu.

Transformarea celulelor-gazdă adecvate cu un produs ADN obţinut pe baza acestui patent este realizată folosind metode bine cunoscute care depind de obicei de tipul de vector folosit. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, vezi, de exemplu, Cohen et al. (1972) şi Sambrook et al. (1989). Transformarea celulelor de levuri este descrisă în Sherman et al. (1986). Metoda lui Beggs (1978) este, de asemenea, utilă. Referitor la celulele de la vertebrate, reactivii utili în transferul unor astfel de celule, de exemplu, formule pe bază de fosfat de calciu şi DEAE-dextran sau lipozom, sunt disponibili de la Stratagene Cloning Systems sau de la Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, SUA. Electro-permeabilizarea este de asemenea utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este o metodă bine cunoscută pentru transformarea celulelor provenite din drojdii, bacterii, insecte şi a celulelor vertebrate.

Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie ADN din prezenta invenţie, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum este PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.

Se va aprecia că anumite celule-gazdă din cadrul descoperirii sunt utile în pregătirea peptidei din descoperire, de exemplu celule de bacterii, de levuri şi de insecte. Totuşi, şi alte celule-gazdă pot fi utile pentru anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi şi ele utile pentru exprimarea peptidelor din descoperire, astfel încât să fie încărcate în moleculele MHC adecvate. Prin urmare, această invenţie prezintă o celulă-gazdă, compusă dintr-un acid nucleic, sau un vector de exprimare, conform invenţiei.

Într-o integrare optimă, celula-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în particular o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. Celulele APC încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă, care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP), sunt în prezent în curs de investigare de către U.S. Food and Drug Administration (FDA) la data de 29 aprilie 2010 pentru tratamentul cancerului de prostată asimptomatic sau minim simptomatic (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Un alt aspect al descoperirii se referă la o metodă de producere a unei peptide sau a variantei sale, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

În altă integrare a peptidei, acidul nucleic sau vectorul de expresie inventat este utilizat în medicină. De exemplu, peptida sau varianta acesteia poate fi pregătită pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de administrare injectabilă pentru peptidă sunt s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de administrare injectabilă pentru ADN sunt i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Pot fi date doze de peptidă şi ADN cuprinse, de exemplu, între 50 µg şi 1,5 mg, preferabil între 125 µg şi 500 µg, şi vor depinde de peptida sau ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studii anterioare (Walter et al., 2012).

Un alt aspect al acestei invenţii include o metodă in vitro de producere a celulelor T activate, metoda constând în contactarea celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T într-un mod specific antigenului, antigenul fiind o peptidă conform invenţiei. Este de preferat să se utilizeze o cantitate suficientă de antigen împreună cu celula prezentatoare a antigenului.

Este de preferat o celulă de mamifer, care are un nivel redus sau inexistent de funcţionare ca transportator de peptidă TAP. Printre celulele adecvate, care nu sunt transportatoare de peptidă TAP se numără celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.

Linia de celule umane T2 deficiente în încărcarea peptidei este disponibilă de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, având Nr. de catalog CRL 1992; linia de celule Drosophila, linia Schneider 2 este disponibilă de la ATCC cu NR. de catalog CRL 19863; linia de celule RMA-S de şoarece este descrisă în Karre et al. (Ljunggren şi Karre, 1985).

De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă în mod substanţial nicio moleculă MHC de clasă I. Este, de asemenea, de preferat ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal de costimulare pentru celule T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroase molecule de MHC de clasă I şi ale moleculelor de costimulator sunt disponibile public în bazele de date GenBank şi EMBL.

În cazul unui epitop MHC de clasă I utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.

Dacă o celulă care prezintă antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitrop, este de preferat ca celula să conţină un vector capabil să exprime peptida care conţine SEQ. ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 sau o variantă de secvenţă aminoacidică a acesteia.

Se pot folosi o serie de alte metode pentru generarea celulelor T in vitro. De exemplu, în generarea CTL pot fi folosite limfocite cu infiltrare tumorală autologe. Piebanski et al. (1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în pregătirea celulelor T. Mai mult, este posibilă producerea de celule T autolog prin pulsarea de celule dendritice cu peptidă sau polipeptidă sau prin infectare cu un virus recombinant. De asemenea, pot fi folosite celule B pentru producerea de celule T autologe. În plus, celule macrofage pulsate cu peptidă sau polipeptidă sau infectate cu virus recombinant pot fi utilizate pentru prepararea de celule T autologe. S. Walter et al., (2003) descriu pregătirea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC-uri), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta descoperire, aAPC-urile au fost generate prin cuplarea unor complexe de peptide MHC preformate pe suprafaţa unor particule de polistiren (microgranule) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe celulele aAPC, fapt ce permite amplificarea selectivă a răspunsurilor de aviditate ridicată sau scăzută a celulei T specifice antigenului cu eficienţă crescută, din probele de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, aAPC-urile trebuie să poarte alte proteine cu activitate de costimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. Mai mult, astfel de sisteme bazate pe aAPC-uri necesită adesea adăugarea unor factori solubili adecvaţi, de exemplu citokine precum interleukina-12.

Pentru pregătirea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă detaliat în WO 97/26328. De exemplu, pe lângă celulele de Drosophila şi celulele T2, se pot utiliza şi alte celule pentru prezentarea antigenilor, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu baculovirus, bacterii, levuri, celule-ţintă infectate cu vaccin. În plus, pot fi folosiţi viruşi vegetali (vezi, de exemplu, Porta et al. (1994), care descrie dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata, ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine.)

Celulele T activate, care sunt orientate spre peptidele din invenţie, sunt utile în terapie. Astfel, un aspect suplimentar al invenţiei constă în descrierea celulelor T activate care se pot obţine prin metodele anterior menţionate în această invenţie.

Celulele T activate, care sunt produse de metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă ce conţine o secvenţă de aminoacizi cu SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300.

Este de preferat ca celula T să recunoască celula interacţionând prin TCR cu complexul HLA/peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, atunci când pacientului îi este administrat un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi preluate de la pacient şi activate conform descrierii de mai sus (adică sunt celule T autologe). Alternativ, celulele T nu sunt preluate de la pacient, ci de la alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul are o stare generală de sănătate bună, de preferat un sistem imunitar puternic şi, mai bine, nu suferă de nicio boală care să poată fi testată sau detectată.

In vivo, celulele ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei invenţii pot fi celule tumorale (care, uneori, exprimă MHC de clasă II) şi/sau celulele stromale care înconjură tumoarea (celule tumorale) (care, uneori, pot şi ele exprima MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).

Celulele T din prezenta invenţie pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. Astfel, descoperire furnizează, de asemenea, o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din descoperire, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului aşa cum s-a arătat mai sus.

Prin „exprimată aberant'', inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supra-exprimată în comparaţie cu nivelurile normale de exprimare sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care este derivă tumoarea, însă în tumoare este exprimată. Prin „supraexprimată'' inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât în ţesutul normal; de preferat de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât nivelul prezent în ţesutul normal.

Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, precum cele descrise mai sus.

Protocoale pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattinoni et al. (2006) şi Morgan, et al. (2006).

Toate moleculele din această invenţie, adică peptida, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula T activată, receptorul celulei T sau acidul nucleic care îl codifică sunt utile pentru tratamentul unor afecţiuni caracterizate de celule care evită un răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta invenţie poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă(e) moleculă(e) din invenţie sau cu o moleculă/molecule cunoscută(e).

De preferat, medicamentul din această invenţie trebuie să fie sub formă de vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau administrat pe cale sistemică, i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. sau aplicat ex vivo celulelor preluate de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt apoi administrate pacientului sau utilizate in vitro pentru selectarea unei subpopulaţii de celule imune derivate de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. Dacă acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citochine imunostimulatoare, cum este interleukina 2. Peptida poate fi substanţial pură sau combinată cu un adjuvant stimulator imun (vezi mai jos) ori poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145). Peptida poate fi, de asemenea, ţintită, o proteină de fuziune sau o moleculă hibridă. Se anticipează că peptidele a căror secvenţă este furnizată în prezenta invenţie vor stimula celule T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa celulelor T helper CD4. În consecinţă, pentru epitopii MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul sau secţiunile de fuziune ale unei molecule hibride furnizează în mod adecvat epitopi care stimulează celule T CD4-pozitive. Epitopii care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine-cunoscuţi în domeniu şi includ pe cei identificaţi în prezenta invenţie.

Într-unul din aspecte, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă care are secvenţa de aminoacizi de la SEQ ID NO. 1 la SQ ID NO. 300 prezentată şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.

Într-un alt aspect, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată în SEQ ID NO. 1 până la SEQ ID NO. 300 şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.

Polinucleotida poate fi substanţă pură sau poate fi conţinut de un vector sau sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie dintre acestea. Metodele pentru conceperea şi introducerea unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de Pascolo et al. (2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imunitar nu este pe deplin înţeles. Printre vectorii şi sistemele de livrare adecvate se numără ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, adenovirusuri asociate sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Printre sistemele de livrare nevirale se numără lipide cationice şi polimeri cationici, bine cunoscuţi în domeniul livrării ADN-ului. Se poate folosi administrarea fizică, cum ar fi cea pe calea unui „pistol genic». Peptida sau peptidele codificată(e) de acidul nucleic poate (pot) fi o proteină de fuziune, de exemplu cu un epitop care stimulează celulele T pentru celula CDR opusă respectivă, după cum s-a observat mai sus.

Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon alfa, oligonucleotide şi derivaţi de CpG, poli(L:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări sub formă de particule cu PLG sau virozomi.

Într-o formulare preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon alfa.

În concretizarea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod şi resiquimod. În formularea preferată a compusului farmaceutic conform invenţiei, adjuvantul este ciclofosfamidă, imiquimod sau resiquimod. Adjuvanţii şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) şi anti-CD40 mAB sau combinaţii ale acestora.

Această compoziţie este folosită pentru administrare parenterală, cum ar fi subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. Pentru aceasta, peptidele şi opţional alte molecule sunt dizolvate sau in suspensie într-un mediu de transport (transportor) farmacologic acceptabil, preferabil apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi explozivi, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe care stimulează imunitatea, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate fi preluată, de exemplu, din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Compoziţia poate fi folosită pentru prevenirea, profilaxia şi/sau tratamentul bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formule pot fi găsite, de exemplu, în EP2113253.

Prezenta invenţie furnizează un medicament util în tratarea cancerului, în special HCC şi alte afecţiuni maligne.

Prezenta invenţie mai include un kit care cuprinde:

(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descrierii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată; (b) opţional, un al doilea recipient care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi (c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate. Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (vii) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat. Trusele din prezentul brevet vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată. Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu). La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare. Trusele din prezentul brevet pot prezenta un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus. Preferabil, trusele din invenţie includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct. Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor care fac obiectul invenţiei şi care intră în componenţa trusei. Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat. Deoarece peptidele din invenţie sunt izolate din HCC, medicamentul din invenţie este folosit de preferinţă pentru tratarea HCC. Este important de înţeles că răspunsul imunitar declanşat de vaccin în conformitate cu invenţia atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. Mai mult, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care vizează doar una sau câteva ţinte, ceea ce poate determina adaptarea uşoară a tumorii la atac (evadare a tumorii). Mai mult, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorii asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin unele dintre ţinte. Compoziţia a fost special concepută astfel încât fiecare tumoare HLA-A*02-pozitivă şi/sau HLA-A*24-pozitivă este de aşteptat să exprime mai multe dintre antigene şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Pentru fiecare dintre subseturile peptidice specifice celor două alele HLA de clasă I (A*02 şi A*24), acest lucru este asigurat în mod independent pe baza analizelor experimentale subiacente.Astfel, vaccinul poate fi „de uz general» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselectare a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi restricţionată la tiparea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerului pentru exprimarea antigenului, dar este totuşi asigurat că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

În figuri,

Figura 1 prezintă supraprezentarea diferitelor peptide din ţesuturi normale (gri închis) şi HCC (gri deschis). Figura 1A) APOB, Peptidă: ALVDTLKFV (A*02) (SEQ ID NO. 7), ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 colonuri, 4 esofage, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 16 rinichi, 4 probe de leucocite, 45 plămâni, 1 ganglion, 1 ovar, 7 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 1 membrană seroasă, 3 piei, 4 spline, 7 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene şi 20 ficaţi; Figura 1B) ALDH1L1, Peptidă: KLQAGTVFV (A*02) (SEQ ID NO. 2), ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 colonuri, 4 esofage, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 16 rinichi, 4 probe de leucocite, 45 plămâni, 1 ganglion, 1 ovar, 7 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 1 membrană seroasă, 3 piei, 4 spline, 7 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri, 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene şi 20 ficaţi; Figura 1C) C8B, Peptidă: AYLLQPSQF (A*24) (SEQ ID NO. 200), ţesuturi de la stânga la dreapta: inclusiv 2 glande suprarenale, 1 arteră, 4 creiere, 1 sân, 5 colonuri, 1 inimă, 13 rinichi, 9 plămâni, 3 pancreasuri, 2 recturi, 3 piei, 1 splină, 12 stomacuri, 1 timus, 2 utere şi 9 ficaţi; Figura 1D) RAD23B, Peptidă: KIDEKNFVV (SEQ ID NO. 63) 1 membrană seroasă, 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 coloane, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 12 rinichi, 4 leucocite, 19 ficaţi, 43 plămâni, 1 ganglion limfatic, 1 ovar, 6 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 3 piei, 4 spline, 5 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene, 4 esofage; Figura 1E) RAD23B, Peptidă: KIDEKNFVV (SEQ ID NO. 63). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 63) 5 linii celulare, 1 ţesut normal (1 glandă suprarenală), 16 ţesuturi canceroase (2 cancere cerebrale, 4 cancere hepatice, 5 cancere pulmonare, 1 cancer rectal, 1 cancer de vezică urinară, 3 cancere uterine) (de la stânga la dreapta); Figura 1F) RFNG RLPPDTLLQQV (SEQ ID NO. 92). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 1 membrană seroasă, 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 coloane, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 12 rinichi, 4 leucocite, 19 ficaţi, 43 plămâni, 1 ganglion limfatic, 1 ovar, 6 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 3 piei, 4 spline, 5 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene, 4 esofage; Figura 1G) RFNG, Peptidă: RLPPDTLLQQV (SEQ ID NO. 92). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 2 linii celulare, 2 ţesuturi normale (2 glande suprarenale), 17 ţesuturi canceroase (1 cancer cerebral, 1 cancer mamar, 1 cancer esofagian, 5 cancere hepatice, 4 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian, 1 cancer de prostată, 2 cancere ale vezicii urinare, 1 cancer uterin (de la stânga la dreapta); Figura 1H) FLVCR1, Peptidă: SVWFGPKEV (SEQ ID NO. 104) 1 membrană seroasă, 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 coloane, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 12 rinichi, 4 leucocite, 19 ficaţi, 43 plămâni, 1 ganglion limfatic, 1 ovar, 6 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 3 piei, 4 spline, 5 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene, 4 esofage; Figura 1I) FLVCR1, Peptidă: SVWFGPKEV (SEQ ID NO. 104). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 9 linii celulare, 1 ţesut normal (1 intestin subţire), 16 ţesuturi canceroase (1 cancer cerebral, 1 cancer mamar, 5 cancere hepatice, 5 cancere pulmonare, 1 cancer de piele, 1 cancer de stomac, 1 cancer de vezică urinară, 1 cancer uterin) (de la stânga la dreapta); Figura 1J) IKBKAP, Peptidă: LLFPHPVNQV (SEQ ID NO. 156) 1 membrană seroasă, 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduvi osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 coloane, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 12 rinichi, 4 leucocite, 19 ficaţi, 43 plămâni, 1 ganglion limfatic, 1 ovar, 6 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 3 piei, 4 spline, 5 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene, 4 esofage; Figura 1K) IKBKAP, Peptidă: LLFPHPVNQV (SEQ ID NO. 156). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 7 linii celulare, 2 culturi primare, 1 ţesut normal (1 colon), 34 ţesuturi canceroase (1 cancer de măduvă osoasă, 1 cancer mamar, 1 cancer de colon, 2 cancere esofagiene, 2 cancere de leucemie leucocitară, 4 cancere hepatice, 11 cancere pulmonare, 3 cancere de ganglioni limfatici, 5 cancere ovariene, 4 cancere ale vezicii urinare) (de la stânga la dreapta); Figura 1L) NKD1, Peptidă: FLDTPIAKV (SEQ ID NO. 47), 1 membrană seroasă, 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 2 artere, 2 măduve osoase, 7 creiere, 3 sâni, 13 colonuri, 2 vezici biliare, 3 tracturi GI, 3 inimi, 12 rinichi, 4 leucocite, 19 ficaţi, 43 plămâni, 1 ganglion limfatic, 1 ovar, 6 pancreasuri, 1 nerv periferic, 1 glandă hipofizară, 3 pleure, 1 prostată, 6 recturi, 3 muşchi scheletici, 3 piei, 4 spline, 5 stomacuri, 1 testicul, 2 timusuri 3 glande tiroide, 2 utere, 2 vene, 4 esofage; Figura 1M) NKD1, Peptidă: FLDTPIAKV (SEQ ID NO. 47). Sunt arătate doar probe pe care a fost prezentată peptida: 1 altă boală, 2 ţesuturi normale (1 plămân, 1 splină), 35 ţesuturi canceroase (5 cancere cerebrale, 6 cancere de colon, 1 cancer esofagian, 6 cancere hepatice, 9 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian, 1 cancer de prostată, 4 cancer rectale, 2 cancere stomacale) (de la stânga la dreapta).

Figura 2 arată exemple de profiluri de exprimare (exprimare relativă comparativ cu rinichi normal) ale genelor-sursă din prezenta invenţie care sunt foarte supraexprimate sau exprimate exclusiv în HCC într-un panel de ţesuturi normale (gri închis) şi 12 probe de HCC (gri). Figura 2A) APOB, ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas, 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter, 1 venă; Figura 2B) AMACR, ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas, 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter, 1 venă; Figura 2C) ALDH1L1, ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas, 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter, 1 venă; Figura 2D) FGG, ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas, 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter, 1 venă; Figura 2E) C8B, ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas , 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter, 1 venă; şi Figura 2F) HSD17B6, ţesuturi de la stânga la dreapta: inclusiv 1 glandă suprarenală, 1 arteră, 1 măduvă osoasă, 1 creier (întreg), 1 sân, 1 colon, 1 esofag, 1 inimă, 3 rinichi, 1 probă de leucocite, 1 ficat, 1 plămân, 1 nodul limfatic, 1 ovar, 1 pancreas, 1 placentă, 1 prostată, 1 glandă salivară, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 testicul, 1 timus, 1 glandă tiroidiană , 1 vezică urinară, 1 col uterin, 1 uter şi 1 venă.

Figura 3 prezintă exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerică specifică peptidelor. Pentru explicaţii suplimentare, consultaţi Exemplul 4.

Figura 4 arată exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerică specifică peptidelor. Pentru explicaţii suplimentare, consultaţi Exemplul 4.

EXEMPLE

EXEMPLUL 1: Identificarea şi cuantificarea peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară

Probe de ţesut

Ţesuturile tumorale de la pacienţi au fost obţinute de la Universitätsklinik für Allgemeine, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Tübingen, Germania; Istituto Nazionale Tumori „Pascale». Molecular Biology and Viral Oncology Unit, Via Mariano, Naples, Italia; BioOptions Inc., Brea, CA, SUA; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SUA; Asterand Europe, Royston Herts, Regatul Unit. Consimţămintele informate scrise ale pacienţilor au fost obţinute înainte de intervenţiile chirurgicale. Ţesuturile au fost congelate rapid imediat după intervenţia chirurgicală şi stocate până la izolarea TUMAP la -70°C sau temperaturi mai joase.

Izolarea peptidelor HLA din probe de ţesut

Seturile de peptide HLA din probe de ţesut congelate rapid au fost obţinute prin precipitare imună din ţesuturi solide conform unui protocol uşor modificat (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) folosindu-se anticorpul HLA-A*02-specific BB7.2, anticorpul HLA-A, -B, -C-specific W6/32, sefaroză CNBr-activată, tratament cu acid şi ultrafiltrare.

Analize prin spectrometrie de masă

Seturile de peptide HLA obţinute au fost separate în funcţie de hidrofobie prin cromatografie în fază inversă (sistem nanoAcquity UPLC, Waters), iar peptidele eluate au fost analizate în spectrometre de masă hibride LTQ-velos şi cu fuziune (ThermoElectron) echipate cu o sursă ESI. Seturile de peptide au fost încărcate direct în coloana de analiză microcapilară cu siliciu infuzat (75 µm i.d. x 250 mm) prevăzută cu material în fază inversă C18, de 1,7 µm (Waters) cu aplicarea unui debit de 400 nl pe minut. Apoi, peptidele au fost separate cu ajutorul unui gradient binar de 180 minute în două trepte, de la 10% la 33% B la un debit de 300 nl pe minut. Gradientul a fost compus din solvent A (0,1% acid formic în apă) şi solvent B (0,1% acid formic în acetonitril). Un capilar din sticlă aurită (PicoTip, New Objective) a fost utilizat pentru introducerea în sursa nanoESI. Spectrometrele de masă LTQ-Orbitrap au fost operate în modul dependent de date folosindu-se o strategie TOP5. Pe scurt, un ciclu de scanare a fost iniţiat cu o scanare completă de mare precizie masică în orbitrap (R = 30.000), urmată de scanări MS/MS tot în orbitrap (R = 7500) pe cele mai abundenţi 5 ioni precursori cu excluderea dinamică a ionilor selectaţi anterior. Spectrul de masă tandem a fost interpretat de SEQUEST şi alte controale manuale. Secvenţa peptidică identificată a fost asigurată pin compararea modelului de fragmentare a peptidei naturale generat cu modelul de fragmentare a peptidei sintetice de referinţă, cu secvenţă identică.

Cuantificarea LC-MS relativă fără etichete a fost efectuată prin numărarea ionilor, adică prin extracţie şi analiză a caracteristicilor LC-MS (Mueller et al. 2007a). Metoda presupune că zona de semnal LC-MS a peptidei se corelează cu abundenţa sa în probă. Caracteristicile extrase au fost prelucrate APOI prin deconvoluţia de stare a încărcării şi alinierea timpului de retenţie (Mueller et al., 2007b; Sturm et al., 2008). În final, toate caracteristicile LC-MS au fost referenţiate încrucişat cu rezultatele identificării secvenţei pentru a combina datele cantitative ale diferitelor probe şi ţesuturi cu profilurile de prezentare ale peptidelor. Datele cantitative au fost normalizate pe două niveluri în funcţie de tendinţa centrală pentru a ţine cont de variaţiile în cadrul replicilor tehnice şi biologice. Astfel, fiecare peptidă identificată poate fi asociată cu date cantitative care permit cuantificarea relativă între probe şi ţesuturi. În plus, toate datele cantitative obţinute pentru candidaţii peptidici au fost inspectate manual pentru a se asigura consecvenţa datelor şi a se verifica acurateţea analizei automate. Pentru fiecare peptidă a fost calculat un profil de prezentare care arată prezentarea medie a probei, precum şi variaţiile replicilor. Profilurile juxtapun probe de HCC cu o referinţă de probe de ţesut normal.

Profilurile de prezentare ale peptidelor exemplificate supraprezentate sunt prezentate în Figura 1. Scorurile de prezentare pentru exemple de peptide sunt prezentate în Tabelul 4.

Tabelul 4: Scoruri de prezentare. Tabelul prezintă peptide care sunt extrem de supraprezentate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraprezentate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraprezentate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+). S* = fosfoserină

SEQ ID NO. Secvenţă Prezentare a peptidei 56 GVLPGLVGV +

EXEMPLUL 2

Profilarea exprimării genelor care codifică peptidele din descoperire

Supraprezentarea sau prezentarea specifică a unei peptide pe celule tumorale în comparaţie cu celule normale este suficientă pentru utilitatea sa în imunoterapie, iar unele peptide sunt specifice tumorii în pofida proteinei-sursă care apare şi în ţesuturile normale. Totuşi, profilarea exprimării ARNm adaugă un nivel suplimentar de siguranţă în selectarea ţintelor peptidice pentru imunoterapii. În special pentru opţiunile terapeutice cu riscuri mari de siguranţă, cum ar fi TCR-urile maturizate în funcţie de afinitate, peptida-ţintă ideală va fi derivată dintr-o proteină care este unică pentru tumoare şi care nu se găseşte pe ţesuturi normale.

Surse de ARN şi pregătirea acestora

Eşantioanele de ţesut prelevate chirurgical au fost furnizate aşa cum este indicat mai sus (vezi Exemplul 1) după obţinerea consimţământului informat scris de la fiecare pacient. Probele de ţesut tumoral au fost îngheţate instantaneu imediat după intervenţia chirurgicală şi au fost ulterior omogenizate cu mojar şi pistil sub azot lichid. ARN-ul total a fost preparat din aceste probe, utilizându-se reactiv TRI (Ambion, Darmstadt, Germania), urmat de o curăţare cu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Germania); ambele metode au fost executate conform protocolului producătorului.

ARN-ul total din ţesuturi umane sănătoase a fost obţinut comercial (Ambion, Huntingdon, Regatul Unit; Clontech, Heidelberg, Germania; Stratagene, Amsterdam, Ţările de Jos; BioChain, Hayward, CA, SUA). ARN-ul de la mai mulţi indivizi (între 2 şi 123 indivizi) a fost combinat astfel încât ARN-ul fiecărui individ să fie ponderat în mod egal.

Calitatea şi cantitatea tuturor probelor de ARN au fost evaluate printr-un bioanalizor Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Germania) cu trusă RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimente în micromatrice

Analiza expresiei genomului tuturor probelor de ARN din ţesut tumoral şi normal a fost efectuată cu micromatrice de oligonucleotide Affymetrix Human Genome (HG) U133A sau HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA). Toate etapele au fost urmate în conformitate cu manualul Affymetrix. Pe scurt, ADNc cu dublu-helix a fost sintetizat din 5-8 µg ARN total, folosindu-se SuperScript RTII (Invitrogen) şi primerul oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Germania) conform descoperirii din manual. Transcrierea in vitro a fost efectuată cu o trusă BioArray High Yield RNA Transcript Labelling (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SUA) pentru matricele U133A sau cu o trusă GeneChip IVT Labelling (Affymetrix) pentru matricele U133 Plus 2.0, urmată de fragmentarea ARNc, hibridizare şi colorare cu streptavidină-ficoeritrină şi anticorp anti-streptavidină biotinilat (Molecular Probes, Leiden, Ţările de Jos). Imaginile au fost scanate cu Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) sau cu Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), iar datele au fost analizate cu software-ul GCOS (Affymetrix), folosindu-se setările implicite pentru toţi parametrii. Pentru normalizare au fost folosite 100 gene auxiliare furnizate de Affymetrix. Valorile exprimărilor relative au fost calculate pe baza rapoartelor jurnalelor de semnal furnizate de software, iar proba de rinichi normal a fost stabilită arbitrar la 1,0. Exemplele de profiluri de exprimare ale genelor-sursă din prezenta descoperire care sunt puternic supraexprimate sau exprimate exclusiv în HCC sunt prezentate în Figura 2. Scorurile de exprimare pentru alte exemple de gene sunt prezentate în Tabelul 5.

Tabelul 5: Scoruri de exprimare. Tabelul prezintă peptide din gene necorelate cu invenţia care sunt extrem de supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+).

SEQ ID NO. Secvenţă Exprimare genă 1 VMAPFTMTI +++ 2 KLQAGTVFV ++ 3 ILDDNMQKL + 4 KLQDFSDQL +++ 5 ALVEQGFTV +++ 7 ALVDTLKFV +++ 10 SLLEEFDFHV + 13 GLIDTETAMKAV +++ 19 FLEETKATV +++ 20 KLSNVLQQV +++ 21 QLIEVSSPITL +++ 25 SLDGKAALTEL +++ 27 TLPDFRLPEI +++ 28 TLQDHLNSL +++ 29 YIQDEINTI +++ 31 YQMDIQQEL +++ 38 ALADVVHEA + 39 ALDPKANFST + 41 ALLELDEPLVL +++ 42 ALLGGNVRMML + 44 ALQDAIRQL + 45 ALQDQLVLV ++ 46 AMAEMKVVL ++ 48 FLLEQPEIQV + 49 FLYPEKDEPT +++ 50 FTIPKLYQL +++ 52 GLFNAELLEA +++ 53 GLIHLEGDTV +++ 55 GLYGRTIEL +++ 60 ILSPLSVAL + 61 KIADFELPTI +++ 62 KIAGTNAEV + 66 KLHEEIDRV +++ 67 KLKETIQKL +++ 68 KLLAATVLLL +++ 73 KLTLVIISV +++ 74 KLYDLELIV +++ 76 LLADIGGDPFAA + 81 NLASFIEQVAV + 82 NVFDGLVRV +++ 83 QLHDFVMSL +++ 84 QLTPVLVSV ++ 85 RILPKVLEV ++ 87 RLFEENDVNL +++ 90 RLLDVLAPLV + 93 RLYTMDGITV +++ 94 RMSDVVKGV + 95 SICNGVPMV ++ 97 SLLPQLIEV +++ 100 SLVGDIGNVNM +++ 103 SMGDHLWVA + 105 SVYDGKLLI + 106 TLAAIIHGA ++ 107 TLGQFYQEV +++ 109 TLYALSHAV +++ 110 TVGGSEILFEV +++ 113 VLMDKLVEL +++ 114 VLSQVYSKV +++ 116 WVIPAISAV ++ 117 YAFPKSITV + 119 YLDKNLTVSV ++ 120 YLGEEYVKA +++ 124 LLIDVVTYL +++ 126 TLLDSPIKV +++ 129 SQADVIPAV ++ 130 ALDAGAVYTL ++ 132 ALHEEVVGV ++ 141 AMGEKSFSV + 142 AVIGGLIYV +++ 145 FLIAEYFEHV ++ 146 FLWTEQAHTV ++ 148 GLFAPLVFL + 149 GLLSGLDIMEV +++ 154 KLTDHLKYV +++ 157 QLLPNLRAV + 158 RIISGLVKV ++ 160 RLLAKIICL +++ 163 RLTESVLYL ++ 165 RVIEHVEQV ++ 168 SLAVLVPIV +++ 172 SLLNFLQHL + 173 SLTSEIHFL + 175 TLFEHLPHI ++ 177 VLDEPYEKV ++ 182 YLLHFPMAL +++ 183 YLYNNEEQVGL +++ 187 SYPTFFPRF + 188 RYSAGWDAKF +++ 192 SYITKPEKW + 193 IYPGAFVDL + 200 AYLLQPSQF +++ 204 KYRLTYAYF +++ 206 KWPETPLLL + 215 IYTGNISSF +++ 217 DYIPYVFKL +++ 218 VYQGAIRQI +++ 228 YLITSVELL + 233 ALLGKLDAI + 249 LLLGERVAL + 255 SLFGQDVKAV + 259 TLITDGMRSV + 263 VLYPSLKEI + 273 AILETAPKEV + 275 ALIEGAGILL + 286 KVLDKVFRA + 296 SLLSGRISTL + 298 TMAKESSIIGV + 301 VLADFGARV ++ 302 KIQEILTQV + 315 KVLDGSPIEV ++ 318 KLNEINEKI +++ 320 GLADNTVIAKV + 324 RLFETKITQV ++ 327 GLNEEIARV + 336 YLPTFFLTV + 341 YLAIGIHEL ++ 345 SYNPLWLRI (A*24) ++

EXEMPLUL 3: Schimb UV-ligand/Legare a peptidei la HLA-A*02 şi HLA-A*24

Peptidele candidate pentru terapii bazate pe celule T în conformitate cu prezenta descoperire au fost testate în continuare în privinţa capacităţii lor de legare la MHC (afinitate). Complexele peptidă-MHC individuale au fost produse prin schimb UV-ligand, unde o peptidă sensibilă la UV este scindată la iradiere UV şi schimbată cu peptida de interes, aşa cum a fost analizată. Doar candidaţii peptidici care se pot lega şi stabiliza în mod eficient moleculele de MHC receptive la peptide împiedică disocierea complexelor MHC. Pentru a determina randamentul reacţiei de schimb, a fost efectuat un ELISA bazat pe detectarea lanţului uşor (β2m) al complexelor MHC stabilizate. Testul a fost efectuat aşa cum este descris cu caracter general în Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006).

Plăci de 96 de godeuri MAXISorp (NUNC) au fost acoperite peste noapte cu 2 µg/ml streptavidină în PBS la temperatura camerei, au fost spălate de 4 ori şi au fost blocate pentru 1 oră la 37°C în 2% BSA care conţinea tamponul de blocare. Monomerii HLA-A*0201/MLA-001 reasamblaţi au servit ca standarde, acoperind domeniul 15-500 ng/ml. Monomerii peptidă-MHC ai reacţiei de schimb UV au fost diluaţi de 100 de ori în tampon de blocare. Probele au fost incubate timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate de patru ori, au fost incubate cu 2 µg/ml de anti-β2m HRP conjugat timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate din nou şi au fost detectat cu soluţia TMB stopată cu NH2SO4. Absorbţia a fost măsurată la 450 nm. Peptidele candidate care prezintă un randament de schimb mare (preferabil mai mare de 50%, cele mai preferabil mai mare de 75%) sunt, în general, preferate pentru o generare şi producţie de anticorpi sau fragmente ale acestora şi/sau receptori de celule T sau fragmente ale acestora, deoarece arată suficientă aviditate la molecule de MHC şi împiedică disocierea complexelor MHC.

Tabelul 6: Scoruri de legare MHC clasă I

Legarea peptidelor restricţionate HLA de clasă I la HLA-A*02 sau HLA-A*24 în funcţie de secvenţa peptidică a fost clasificată prin randamentul schimbului peptidic: ≥10% = +; ≥20% = ++; ≥50 = +++; ≥ 75% = ++++. S* = fosfoserină.

SEQ ID Secvenţă Schimb de peptide 56 GVLPGLVGV "+++"

EXEMPLUL 4

Imunogenitatea in vitro pentru peptide prezentate MHC de clasă I

Pentru a obţine informaţii cu privire la imunogenitatea TUMAP-urilor din prezenta invenţie, inventatorii au efectuat investigaţii utilizând un test in vitro de amorsare a celulelor T pe baza stimulărilor repetate de celule T CD8+ cu celule care prezintă un antigen artificial (aAPC-uri) încărcate cu complexe de peptide/MHC şi anticorp anti-CD28. Astfel inventatorii au putut arăta imunogenitatea pentru 22 TUMAP-uri restricţionate de HLA-A*0201 în conformitate cu descoperirea până în prezent, demonstrând că aceste peptide sunt epitopi ai celulelor T împotriva cărora există celule T precursoare CD8+ la oameni.

Stimularea in vitro a celulelor T CD8+

Pentru a efectua stimulări in vitro de către celule prezentatoare de antigen artificiale încărcate cu complex peptidă-MHC (pMHC) şi anticorp anti-CD28, inventatorii au izolat mai întâi celule T CD8+ din produse de leucafereză HLA-A*02 proaspete prin selectare pozitivă utilizând microgranule CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germania) de la donatori sănătoşi, obţinute de la University Clinics Mannheim, Germania, după consimţământ informat.

PBMC-urile şi limfocitele CD8+ izolate au fost incubate până la utilizare în mediu de celule T (TCM) constând din RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) suplimentat cu ser AB uman inactivat la căldură 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, 100 U/ml penicilină/100 µg/ml streptomicină (Cambrex, Köln, Germania), 1 mM piruvat de sodiu (CC Pro, Oberdorla, Germania), 20 µg/ml gentamicină (Cambrex). În această etapă s-au adăugat, de asemenea, la TCM 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germania) şi 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germania).

Generarea granulelor acoperite cu pMHC/anti-CD28, stimularea celulelor T şi citirea au fost realizate într-un sistem in vitro înalt definit utilizându-se 4 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de stimulare şi 8 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de citire.

Anticorpul purificat costimulator 9.3 anti-uman IG2a CD28 de şoarece (Jung et al., 1987) a fost biotinilat chimic folosindu-se sulfo-N-hidroxisuccinimicobiotină în condiţiile recomandate de producător (Perbio, Bonn, Germania). Granulele utilizate au fost de particule de polistiren de 5,6 µm acoperite cu streptavidină (Bangs Laboratories, Illinois, SUA).

pMHC-urile utilizate pentru stimulări de control pozitive şi negative au fost A*0201/MLA-001 (peptidă ELAGIGILTV din Melan-A/MART-1 modificat) şi A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI din DDX5).

800.000 de granuleI 200 µl au fost acoperite în plăci cu 96 de godeuri în prezenţa a 4x12,5 ng de biotină-pMHC diferite, au fost spălate şi apoi s-au adăugat 600 ng de biotină anti-CD28 într-un volum de 200 µl. Stimulările au fost iniţiate în plăci de 96 de godeuri prin coincubare cu 1x106 celule T CD8+ cu 2x105 perle tapetate spălate în 200 µl TCM suplimentat cu 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) pentru 3 zile la 37°C. Jumătate din mediu a fost apoi schimbat cu TCM proaspete suplimentate cu 80 U/ml IL-2, iar incubarea a fost continuată timp de 4 zile la 37°C. Acest ciclu de stimulare sa efectuat în total de trei ori. Pentru citirea multimerului pMHC utilizându-se 8 molecule pMHC diferite per condiţie, a fost utilizată o abordare de codificare combinatorică bidimensională, aşa cum a fost descris anterior (Andersen et al., 2012), cu modificări minore care cuprind cuplarea la 5 fluorocromi diferiţi. În final, s-au efectuat analize multimerice prin colorarea celulelor cu colorant aproape IR viu/mort (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), clonă de anticorp CD1-FITC SK1 (BD, Heidelberg, Germania) şi multimeri fluorescenţi pMHC. Pentru analiză a fost utilizat un citometru BD LSRII SORP echipat cu lasere şi filtre adecvate. Celulele specifice peptidei au fost calculate ca procentaje din totalul celulelor CD8+. Evaluarea analizei multimerice a fost efectuată utilizându-se software-ul FlowJo (Tree Star, Oregon, SUA). Amorsarea in vitro a limfocitelor multimer+ CD8+ specifice a fost detectată prin comparaţie cu stimulări de control negative. Imunogenitatea pentru un antigen dat a fost detectată dacă cel puţin un godeu evaluabil stimulat in vitro al unui donor sănătos a fost găsit conţinând o anumită linie de celule T CD8+ după stimulare in vitro (adică acest godeu conţine cel puţin 1% de multimer+ specific între celulele T CD8+ şi procentajul celulelor tetramer+ este de cel puţin 10 ori mediana stimulărilor negative).

Imunogenicitatea in vitro pentru peptidele HCC

Pentru peptidele HLA de clasă I testate, imunogenitatea in vitro se poate demonstra prin generarea de linii de celule T specifice peptidelor. Exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea cu multimer TUMAP-specific pentru trei peptide din invenţie sunt prezentate în Figura 3 şi Figura 4 împreună cu controalele negative corespondente.

Exemple de rezultate ale răspunsurilor celulelor T CD8 + specifice peptidelor in vitro ale unui donator de HLA-A*02+ sănătos (Figura 3)

Celulele T CD8+ au fost amorsate folosindu-se APC-uri artificiale acoperite cu mAb anti-CD28 şi HLA-A*02 în complex cu peptida IMA-APOB-002 (SEQ ID NO. 7) (A, panoul din dreapta) sau, respectiv, IMA-APOB-003 (B, panoul din dreapta, SEQ ID NO. 2). După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide s-a efectuat prin colorare multimerică 2D cu A*02/APOB0-002 (A) sau A*02APOB-003 (B) sau A*02/ALDH1 L1-001. Panourile din stânga (A, B, C) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*02/peptidice irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate prin gating pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals pozitive detectate cu multimeri specifici pentru diferite peptide. Sunt indicate frecvenţele celulelor multimer+ specifice între limfocitele CD8+.

Exemple de rezultate ale răspunsurilor celulelor T CD8 + specifice peptidelor in vitro ale unui donator de HLA-A*24+ sănătos (Figura 4)

Celulele T CD8+ au fost amorsate folosindu-se APC-uri artificiale acoperite cu mAb anti-CD28 şi HLA-A*24 în complex cu peptida IMA-KLHL24-001 (SEQ ID NO 190) (panoul din dreapta) sau, respectiv, IMA-APOB-006 (B, panoul din dreapta, SEQ ID NO 218). După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide s-a efectuat prin colorare multimerică 2D cu A*24/ KLHL24-001 (A) sau A*24/ APOB-006 (B). Panourile din stânga (A şi B) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*24/peptidici irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate prin gating pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals pozitive detectate cu multimeri specifici pentru diferite peptide. Sunt indicate frecvenţele celulelor multimer+ specifice între limfocitele CD8+.

Exemplul 5: Sinteze de peptide

Toate peptidele au fost sintetizate utilizându-se sinteza standard şi bine stabilită de peptide în fază solidă utilizându-se strategia Fmoc. Identitatea şi puritatea fiecărei peptide individuale au fost determinate prin spectrometrie de masă şi RP-HPLC analitic. Peptidele au fost obţinute sub formă de liofilizaţi de culoare albă până la albă (sare de trifluoroacetat) cu purităţi >50%. Toate TUMAP-urile se administrează preferabil ca săruri de trifluoroacetat sau de acetat, fiind posibile şi alte săruri.

Listă de referinţă

Adler, A. S. et al., Genes Dev. 28 (2014)

Ahn, Y. H. et al., J Proteomics. 106 (2014)

Akiyama, H. et al., Oncol Rep. 21 (2009)

Alam, S. M. et al., Endocr.Relat Cancer 16 (2009)

Aleman, G. et al., Am J Physiol Endocrinol.Metab 289 (2005)

Alexanian, A. et al., Cancer Genomics Proteomics. 9 (2012)

Altenhofer, S. et al., J Biol.Chem. 285 (2010)

Alvarez, C. et al., J Biol.Chem. 276 (2001)

Ammerpohl, O. et al., Int.J Cancer 130 (2012)

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012)

Arai, E. et al., Carcinogenesis 33 (2012)

Araki, T. et al., J Biol.Chem. 286 (2011)

Arlt, A. et al., Oncogene 28 (2009)

Arndt, S. et al., Oncol Rep. 18 (2007)

Arner, E. S. et al., Eur.J Biochem. 267 (2000)

Atienza, J. M. et al., Mol Cancer Ther 4 (2005)

Avery-Kiejda, K. A. et al., BMC.Cancer 14 (2014)

Bachmann, S. B. et al., Mol Cancer 13 (2014)

Balogh, K. et al., Oncogene 31 (2012)

Bani, M. R. et al., Mol Cancer Ther 3 (2004)

Bansal, N. et al., PLoS.One. 6 (2011)

Barbarulo, A. et al., Oncogene 32 (2013)

Bell, J. C. et al., Drug Metab Dispos. 40 (2012)

Ben-Izhak, O. et al., Histopathology 41 (2002)

Bergada, L. et al., Lab Invest 94 (2014)

Bergeron, M. J. et al., Mol Aspects Med. 34 (2013)

Bhattacharya, C. et al., Mol Cancer 11 (2012)

Bhogaraju, S. et al., Science 341 (2013)

Bidkhori, G. et al., PLoS.One. 8 (2013)

Bieche, I. et al., Breast Cancer Res 6 (2004)

Biswas, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1832 (2013)

Blanke, K. L. et al., Cancer Causes Control 25 (2014)

Bodine, S. C. et al., Science 294 (2001)

Boehringer, J. et al., Biochem.J 448 (2012)

Bojjireddy, N. et al., J Cell Sci. (2014)

Booth, D. G. et al., EMBO J 30 (2011)

Bouquet, C. et al., Mol Ther 14 (2006)

Boylan, K. L. et al., Proteome.Sci. 8 (2010)

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brockmoller, S. F. et al., J Proteome.Res 11 (2012)

Buch, S. C. et al., Mol Carcinog. 51 Suppl 1 (2012)

Bull, C. et al., Cancer Res 74 (2014)

Burrell, R. A. et al., Nature 494 (2013)

Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006)

Butterfield, L. H. et al., Clin.Cancer Res. 9 (2003)

Byrne, A. et al., Exp.Cell Res 316 (2010)

Cadenas, C. et al., Cell Cycle 13 (2014)

Cadoret, A. et al., Oncogene 21 (2002)

Cao, H. et al., Biochemistry 41 (2002)

Cao, Y. et al., Cancer Research 61 (2001)

Cao-Ehlker, X. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)

Carroll, M. et al., J Interferon Cytokine Res 33 (2013)

Carrouel, F. et al., J Dent.Res 87 (2008)

Castro, M. et al., J Transl.Med. 8 (2010)

Chae, Y. S. et al., Med.Oncol 28 (2011)

Chang, L. O. et al., Cancer Res 33 (1973)

Chang, Y. S. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 59 (2007)

Chapiro, J. et al., Radiol.Med. 119 (2014)

Charbonneau, B. et al., Am J Hematol. 87 (2012)

Chatterjee, M. et al., Haematologica 98 (2013)

Chen, J. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 420 (2012a)

Chen, M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 108 (2011a)

Chen, R. et al., World J Gastroenterol. 17 (2011b)

Chen, X. et al., J Dig.Dis. 12 (2011c)

Chen, X. Q. et al., Med.Oncol 29 (2012b)

Cheng, L. et al., Genomics 102 (2013)

Choi, Y. W. et al., Int.J Gynecol.Cancer 17 (2007)

Christa, L. et al., Gastroenterology 106 (1994)

Clark, A. G. et al., Cytoskeleton (Hoboken.) 69 (2012)

Claro da, Silva T. et al., Mol.Aspects Med. 34 (2013)

Cohen, L. et al., Nature 395 (1998)

Collins, C. L. et al., Surgery 122 (1997)

Com, E. et al., J Proteomics. 75 (2012)

Copps, K. D. et al., Diabetologia 55 (2012)

Cornen, S. et al., PLoS.ONE. 9 (2014)

Cornez, I. et al., Biochem.Pharmacol. 75 (2008)

Cowling, V. H., Oncogene 29 (2010)

Cui, T. et al., Int.J Oncol 39 (2011)

da Silva, M. G. et al., Exp.Clin Cardiol. 17 (2012)

Dadkhah, E. et al., Arch.Iran Med. 16 (2013)

Darmanis, S. et al., PLoS.One. 8 (2013)

Darvekar, S. et al., Biochem.J 442 (2012)

Darvekar, S. R. et al., PLoS.One. 9 (2014)

Datta, K. et al., J Biol.Chem. 284 (2009)

David, S. et al., Front Biosci.(Elite.Ed) 5 (2013)

de Almagro, M. C. et al., Biochem.Pharmacol. 81 (2011)

de Groot, J. F. et al., Cancer Res 65 (2005)

Deb, S. et al., Br.J Cancer 110 (2014)

Debauve, G. et al., Cell Mol Life Sci. 65 (2008)

Decker, T. et al., J Clin Invest 109 (2002)

Decock, A. et al., Genome Biol. 13 (2012)

Del Campo, E. M. et al., Mol Phylogenet.Evol. 66 (2013)

Delaval, B. et al., J Cell Biol. 188 (2010)

Deng, X. D. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014)

Di, Gregorio E. et al., J Med.Genet. 50 (2013)

Diggle, C. P. et al., PLoS.Genet. 10 (2014)

Dimitrov, A. et al., Hum.Mol Genet. 18 (2009)

Dmitriev, O. Y., Biochem.Cell Biol. 89 (2011)

Doherty, J. A. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 20 (2011)

Dong, Z. et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 59 (2006)

Dou, R. et al., Cancer Lett. 336 (2013)

Drazkowska, K. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013)

Edavana, V. K. et al., Drug Metab Dispos. 41 (2013)

Edwards, P. A. et al., Breast Cancer Res 14 (2012)

Elvenes, J. et al., PLoS.One. 6 (2011)

Emaduddin, M. et al., Cell Commun.Signal. 6 (2008)

Enguita-German, M. et al., World J Hepatol. 6 (2014)

Epelbaum, R. et al., Pathol.Oncol Res 4 (1998)

Fan, T. W. et al., Mol Cancer 8 (2009)

Fang, Z. Q. et al., Genet.Mol Res 12 (2013)

Fassas, A. B. et al., Leuk.Lymphoma 45 (2004)

Feferman, L. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis. 16 (2013)

Fei, F. et al., J Cancer Res Clin Oncol (2014a)

Fei, F. et al., Ann Surg.Oncol 21 (2014b)

Feigelson, H. S. et al., Breast Cancer Res 10 (2008)

Feng, L. et al., Cell Biochem.Funct. 29 (2011)

Feng, M. et al., J Clin Invest 124 (2014a)

Feng, S. et al., Int.J Biol.Sci. 9 (2013)

Feng, Y. et al., J Biol.Chem. 289 (2014b)

Feng, Y. et al., Free Radic.Res 46 (2012)

Fernandes, C. F. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 361 (2007)

Ferre, S. et al., J Am Soc Nephrol. 25 (2014)

Ferrer-Ferrer, M. et al., Arch.Med.Res 44 (2013)

Filmus, J. et al., FEBS J 280 (2013)

Fiorito, V. et al., Biochim.Biophys.Acta 1839 (2014)

Fojo, A. T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84 (1987)

Fonseca, A. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012)

Fossdal, G. et al., ScientificWorldJournal. 2012 (2012)

Fournier, T. et al., Biochim.Biophys.Acta 1482 (2000)

Fu, W. et al., J Cell Sci. 123 (2010)

Fujitomo, T. et al., Cancer Res 72 (2012)

Furukawa, T. et al., Sci.Rep. 1 (2011)

Furutani, M. et al., Hepatology 24 (1996)

Gadd, S. et al., Lab Invest 90 (2010)

Gailani, D., Trends Cardiovasc.Med. 10 (2000)

Galamb, O. et al., Helicobacter. 13 (2008)

Galazis, N. et al., Gynecol.Endocrinol. 29 (2013)

Gandhi, A. V. et al., Ann Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013)

Gao, L. et al., Mol Oncol 6 (2012)

Garcia-Baquero, R. et al., Tumour.Biol. 35 (2014)

Gardner-Stephen, D. A. et al., Drug Metab Dispos. 35 (2007)

Garg, M. et al., Cancer 116 (2010a)

Garg, M. et al., Eur.J Cancer 46 (2010b)

Gburcik, V. et al., Mol Cell Biol. 25 (2005)

Gergely, F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97 (2000)

Gervasini, G. et al., Cancer 107 (2006)

Getty, A. L. et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011)

Gilabert, M. et al., J Cell Physiol 228 (2013)

Gilkes, D. M. et al., Mol Cancer Res 11 (2013)

Giovannetti, E. et al., J Natl.Cancer Inst. 106 (2014)

Gokmen-Polar, Y. et al., Mod.Pathol. (2014)

Goldstein, I. et al., Carcinogenesis 34 (2013)

Gong, Y. et al., Genet.Mol Res 12 (2013)

Goode, E. L. et al., Clin Cancer Res 16 (2010)

Gordon, E. M. et al., Am.J Pediatr.Hematol.Oncol 15 (1993)

Gotzmann, J. et al., Crit Rev.Eukaryot.Gene Expr. 9 (1999)

Gray, L. R. et al., Cell Mol Life Sci. 71 (2014)

Gregory, P. A. et al., J Biol.Chem. 278 (2003)

Greif, P. A. et al., Leukemia 25 (2011)

Gu, W. et al., PLoS.One. 7 (2012)

Guo, L. et al., Cancer Sci. 103 (2012)

Halon, A. et al., Arch.Gynecol.Obstet. 287 (2013)

Hamamoto, R. et al., Cancer Sci. 97 (2006)

Hamilton, S. R. et al., Glycobiology 15 (2005)

Hamm, A. et al., BMC.Cancer 8 (2008)

Hanioka, N. et al., Basic Clin Pharmacol.Toxicol. 110 (2012)

Harris, M. et al., Pharmacogenet.Genomics 24 (2014)

Hatakeyama, H. et al., Proteomics. 6 (2006)

Havens, M. A. et al., PLoS.Genet. 10 (2014)

He, P. et al., Hum.Pathol. 35 (2004)

He, X. et al., Neoplasma 61 (2014a)

He, Y. et al., Mol Carcinog. (2014b)

Hellwinkel, O. J. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis. 14 (2011)

Hemmingsson, O. et al., Oncol Rep. 22 (2009)

Hidalgo-Curtis, C. et al., Br.J Haematol. 148 (2010)

Hider, J. L. et al., BMC.Evol.Biol. 13 (2013)

Hinsch, N. et al., BMC.Cancer 9 (2009)

Hirota, Y. et al., Nucleic Acids Res 28 (2000)

Hlavata, I. et al., Mutagenesis 27 (2012)

Hoelz, D. J. et al., Proteomics. 6 (2006)

Holden, H. M. et al., Cell Mol Life Sci. 61 (2004)

Honda, K. et al., PLoS.One. 7 (2012)

Hong, Y. et al., J Biol.Chem. 274 (1999)

Hood, F. E. et al., Bioarchitecture. 1 (2011)

Hood, F. E. et al., J Cell Biol. 202 (2013)

Hopfer, O. et al., Br.J Cancer 93 (2005)

Horani, A. et al., Am J Hum.Genet. 91 (2012)

Hou, M. et al., Int.J Mol Med. 33 (2014)

Hu, D. G. et al., Drug Metab Rev. 46 (2014)

Hua, D. et al., Int.J Mol Med. 30 (2012a)

Hua, T. et al., J Biol.Chem. 287 (2012b)

Huang, O. et al., Jpn.J Clin Oncol 43 (2013)

Huang, S. et al., Oncogene 21 (2002)

Huang, Y. et al., Oncotarget. 5 (2014)

Hughes, H. et al., J Cell Sci. 123 (2010)

Hunecke, D. et al., J Pathol. 228 (2012)

Huopaniemi, L. et al., Glycobiology 14 (2004)

Hyung, S. W. et al., Mol Cell Proteomics. 10 (2011)

Iannitti, T. et al., Mar.Drugs 8 (2010)

Ichida, K. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 282 (2001)

Ignatova, I. D. et al., Am J Physiol Endocrinol.Metab 296 (2009)

Ikeda, R. et al., Int.J Oncol 38 (2011)

Inuzuka, M. et al., J Biol.Chem. 280 (2005)

Ishiguro, H. et al., Oncogene 21 (2002)

Ishizaki, F. et al., Sci.Rep. 3 (2013)

Ivashchenko, A. T. et al., Biomed.Res Int. 2013 (2013)

Jacquemier, J. et al., Cancer Res 65 (2005)

Jacques, C. et al., Br.J Cancer 101 (2009)

Jaffe, E. K. et al., Arch.Biochem.Biophys. 530 (2013)

Jakobsson, A. et al., Prog.Lipid Res 45 (2006)

Jamroziak, K. et al., Eur.J Haematol. 72 (2004)

Jeung, H. C. et al., Oncologist. 12 (2007)

Jia, Y. et al., Br.J Cancer 110 (2014)

Jiang, J. G. et al., Cancer Res 65 (2005)

Jiang, X. et al., Histol.Histopathol. 25 (2010)

Jiang, X. et al., Mol Carcinog. (2014)

Jin, Z. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014)

Jockusch, H. et al., Proteomics. 14 (2014)

Johnson, M. A. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 1012 (2004)

Jose-Eneriz, E. S. et al., Br.J Haematol. 142 (2008)

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987)

Jung, H. J. et al., J Mol Med.(Berl) 91 (2013)

Kaira, K. et al., Hepatobiliary.Pancreat.Dis.Int. 13 (2014)

Kalsotra, A. et al., Toxicol.Appl.Pharmacol. 199 (2004)

Kalthoff, S. et al., J Biol.Chem. 285 (2010)

Kamiyama, S. et al., Glycobiology 21 (2011)

Kamiyama, S. et al., J Biol.Chem. 281 (2006)

Kandil, D. H. et al., Adv.Anat.Pathol. 16 (2009)

Kandimalla, R. et al., Nat Rev.Urol. 10 (2013)

Karvonen, U. et al., J Mol Biol. 382 (2008)

Kelleher, D. J. et al., Glycobiology 16 (2006)

Khan, A. P. et al., Neoplasia. 15 (2013)

Kim, Y. et al., Hum.Pathol. 46 (2015)

Kim, Y. W. et al., PLoS.One. 7 (2012)

Klein, C. J. et al., Neurology 82 (2014)

Kobayashi, T. et al., Biochem.J 400 (2006)

Kollmann, K. et al., Cancer Cell 24 (2013)

Komatsu, M. et al., Pharmacol.Res 66 (2012)

Kong, S. Y. et al., Cancer Sci. 99 (2008)

Kovacevic, Z. et al., Biochim.Biophys.Acta 1783 (2008)

Kracmarova, A. et al., Leuk.Lymphoma 49 (2008)

Kraemer, N. et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011)

Kress, T. R. et al., Mol Cell 41 (2011)

Krohn, A. et al., J Pathol. 231 (2013)

Krupenko, S. A. et al., Cell Growth Differ. 13 (2002)

Kubota, H. et al., Cell Stress.Chaperones. 15 (2010)

Kummel, D. et al., EMBO Rep. 6 (2005)

Kunutsor, S. K. et al., Int.J Cancer (2014)

Kuriyama, H. et al., Gene 253 (2000)

Laezza, F. et al., Mol Cell Neurosci. 34 (2007)

Lahiri, S. et al., PLoS.Biol. 12 (2014)

Lando, M. et al., J Pathol. 230 (2013)

Lapucci, A. et al., FASEB J 24 (2010)

Lascorz, J. et al., BMC.Med.Genet. 13 (2012)

Lauffart, B. et al., BMC.Womens Health 5 (2005)

Laverdiere, I. et al., Endocr.Relat Cancer (2014)

Leasure, C. D. et al., Plant Physiol 150 (2009)

Lee, C. H. et al., Hum.Reprod. 24 (2009)

Lee, K. W. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)

Lee, S. J. et al., Toxicol.Lett. (2014)

Lee, W. C. et al., J Immunother. 28 (2005)

Lee, Y. C. et al., Int.J Cancer 122 (2008)

Lekva, T. et al., PLoS.One. 8 (2013)

LeRoy, P. J. et al., Cancer Res 67 (2007)

Leung, T. et al., Breast Cancer Res 15 (2013)

Levenson, V. V. et al., Somat.Cell Mol Genet. 25 (1999)

Levi, S. et al., Front Pharmacol. 5 (2014)

Li, D. et al., Protein Cell 5 (2014a)

Li, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 455 (2014)

Li, X. et al., Med.Oncol 31 (2014b)

Li, Y. et al., Mol Cell Biol. 29 (2009)

Li, Y. H. et al., World J Gastroenterol. 18 (2012)

Liang, J. et al., PLoS.One. 3 (2008)

Lillig, C. H. et al., Antioxid.Redox.Signal. 9 (2007)

Lin, C. H. et al., J Cell Biol. 189 (2010)

Lin, M. C. et al., Oral Oncol 50 (2014)

Lin, S. H. et al., Oncogene 23 (2004)

Lin, Z. et al., Cell Rep. 5 (2013)

Linderoth, J. et al., Br.J Haematol. 141 (2008)

Line, A. et al., Cancer Immunol Immunother. 51 (2002)

Ling, C. et al., EMBO J 26 (2007)

Linge, A. et al., J Proteome.Res 13 (2014)

Lioutas, A. et al., EMBO Rep. 14 (2013)

Liu, C. et al., Nat Med. 20 (2014)

Liu, C. et al., J Natl.Cancer Inst. 105 (2013a)

Liu, H. et al., Carcinogenesis 34 (2013b)

Liu, T. W. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 106 (2009a)

Liu, W. et al., J Biol.Chem. 279 (2004)

Liu, Y. et al., Curr.Drug Targets. 13 (2012)

Liu, Y. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 18 (2009b)

Liu, Y. et al., Oncol Rep. 18 (2007)

Ljungberg, B., Curr.Opin.Urol. 17 (2007)

Llovet, J. M. et al., N.Engl.J Med. 359 (2008)

Lo Re, A. E. et al., J Biol.Chem. 287 (2012)

Lo, W. Y. et al., J Proteome.Res 6 (2007)

Lombardo, Y. et al., Breast Cancer Res 16 (2014)

Lourenco, G. J. et al., Breast Cancer Res Treat. 100 (2006)

Lovelace, L. L. et al., J Biol.Chem. 286 (2011)

Lung, H. L. et al., Int J Cancer 127 (2010)

Lutcke, H., Eur.J Biochem. 228 (1995)

Ma, X. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003)

Mackiewicz, A. et al., Glycoconj.J 12 (1995)

Mahajan, K. et al., Cancer Lett. 338 (2013)

Mamtani, M. et al., BMC.Res Notes 5 (2012)

Mariani, L. et al., Clin Cancer Res 7 (2001)

Marina, M. et al., Front Biosci.(Landmark.Ed) 19 (2014)

Markiewski, M. M. et al., Nat Immunol 9 (2008)

Martin, T. A. et al., Eur.J Cancer 40 (2004)

Martinez, H. D. et al., Genes Cancer 2 (2011)

Mathison, J. et al., Pathobiology 59 (1991)

Matsubara, J. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 20 (2011)

Matusiak, D. et al., J Histochem.Cytochem. 55 (2007)

McGuire, T. A., Md Med.J 40 (1991)

Medjkane, S. et al., Cell Cycle 11 (2012)

Meijers, J. C. et al., Br.J Haematol. 108 (2000)

Mercer, C. A. et al., Autophagy. 5 (2009)

Mercurio, F. A. et al., Biochemistry 51 (2012)

Midorikawa, Y. et al., Jpn.J Cancer Res. 93 (2002)

Miled, C. et al., Cancer Res 65 (2005)

Milkereit, P. et al., J Biol.Chem. 278 (2003)

Miller, J. C. et al., Mol Carcinog. 48 (2009)

Mohelnikova-Duchonova, B. et al., Pancreas 42 (2013)

Monaco, M. E. et al., Transl.Oncol 3 (2010)

Morandi, F. et al., PLoS.One. 7 (2012)

Morrissey, J. J. et al., Urology 83 (2014)

Mu, J. et al., J Biol.Chem. 272 (1997)

Murray, D. W. et al., Br.J Cancer 110 (2014)

Murray, J. I. et al., Mol Biol.Cell 15 (2004)

Murrin, L. C. et al., J Neuroimmune.Pharmacol. 2 (2007)

Murthy, K. G. et al., Genes Dev. 9 (1995)

Mydlikova, Z. et al., Neoplasma 57 (2010)

Narita, T. et al., Mol Cell Biol. 23 (2003)

Narjoz, C. et al., PLoS.One. 9 (2014)

Nelson, E. R. et al., Science 342 (2013)

Ngeow, J. et al., Cancer Discov. 4 (2014)

Nibbe, R. K. et al., Mol.Cell Proteomics. 8 (2009)

Nielsen, M. J. et al., Blood 108 (2006)

Noda, T. et al., Hepatology 55 (2012)

Noh, C. K. et al., Clin Biochem. 47 (2014)

Ntikoudi, E. et al., Cancer Treat.Rev. 40 (2014)

Nwosu, V. et al., Hum.Mol Genet. 10 (2001)

Obholz, K. L. et al., Dev.Biol. 298 (2006)

Oeffner, F. et al., Am J Hum.Genet. 84 (2009)

Ofman, R. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 281 (2001)

Ohshima, K. et al., Mol Biol.Evol. 27 (2010)

Oiso, S. et al., Oncol Rep. 31 (2014)

Oji, Y. et al., Int.J Oncol 44 (2014)

Osada, H. et al., Int.J Cancer 112 (2004)

Otero-Rey, E. M. et al., Oral Oncol 44 (2008)

Palmer, D. H. et al., Hepatology 49 (2009)

Panico, F. et al., Adv.Cancer Res 105 (2009)

Park, B. L. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 363 (2007)

Patel, M. R. et al., Laryngoscope 121 (2011)

Patel, S. A. et al., Br.J Cancer (2014)

Pattani, K. M. et al., PLoS.ONE. 7 (2012)

Pavelec, D. M. et al., Genetics 183 (2009)

Pawlowska, M. et al., Drug Metab Dispos. 41 (2013)

Pehlivan, D. et al., Eur.J Hum.Genet. 22 (2014)

Pei, Z. et al., PLoS.One. 8 (2013)

Pellanda, H. et al., Int.J Biochem.Cell Biol. 44 (2012)

Peng, R. et al., J Cell Biol. 157 (2002)

Perera, S. et al., J Muscle Res Cell Motil. 33 (2012)

Persaud-Sawin, D. A. et al., Hum.Mol Genet. 11 (2002)

Peters, D. G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 14 (2005)

Pizon, V. et al., J Cell Sci. 115 (2002)

Placke, T. et al., Blood 124 (2014)

Plebani, R. et al., Neoplasia. 14 (2012)

Poh, W. et al., Mol Cancer 11 (2012)

Porkka, K. P. et al., Genes Chromosomes.Cancer 39 (2004)

Pylypenko, O. et al., Mol Cell 11 (2003)

Qi, L. et al., Cancer Res 74 (2014)

Qin, Y. et al., Pigment Cell Melanoma Res 26 (2013)

Quayle, S. N. et al., Neuro Oncol 14 (2012)

Quek, H. H. et al., DNA Cell Biol. 16 (1997)

Quidville, V. et al., Cancer Res 73 (2013)

Rajadhyaksha, A. M. et al., Am.J Hum.Genet. 87 (2010)

Rajasekaran, A. K. et al., Nucleic Acids Res 23 (1995)

Rajendran, M. et al., Cancer Metastasis Rev. 29 (2010)

Rakheja, D. et al., Mol Genet.Metab 93 (2008)

Ramana, C. V. et al., EMBO J 19 (2000)

Rashad, N. M. et al., Cytokine 68 (2014)

Rath, N. et al., EMBO Rep. 13 (2012)

Recupero, D. et al., Rom.J Morphol.Embryol. 51 (2010)

Reinisch, W. et al., J Immunother. 25 (2002)

Rekdal, C. et al., J Biol.Chem. 275 (2000)

Ren, Y. G. et al., Mol Biol.Cell 15 (2004)

Rennoll, S. A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 443 (2014)

Rifas, L. et al., Arthritis Rheum. 60 (2009)

Riihila, P. M. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014)

Rodriguez, F. J. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 67 (2008)

Rogov, V. et al., Mol Cell 53 (2014)

Romanuik, T. L. et al., BMC.Genomics 10 (2009)

Roodman, G. D., Ann N.Y.Acad.Sci. 1192 (2010)

Rosado, I. V. et al., RNA. 10 (2004)

Rose, A. E. et al., Cancer Res 71 (2011)

Ross, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 136 (2012)

Rossi, M. R. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 161 (2005)

Rotondo, R. et al., Int.J Cancer 125 (2009)

Rucksaken, R. et al., Cancer Biomark. 12 (2012)

Ruiz, F. X. et al., Biochem.J 440 (2011)

Ruiz, F. X. et al., Front Pharmacol. 3 (2012)

Rutkowski, M. J. et al., Mol Cancer Res 8 (2010)

Rylova, S. N. et al., Cancer Res 62 (2002)

Sahm, F. et al., Cancer Res 73 (2013)

Sahu, A. et al., Immunol Res 17 (1998)

Saito, T. et al., J Biol.Chem. 278 (2003)

Salahshor, S. et al., J Clin Pathol. 58 (2005)

Sang, W. et al., Zhonghua Bing.Li Xue.Za Zhi. 42 (2013)

Sangro, B. et al., J Clin Oncol 22 (2004)

Sanz, L. et al., Mol Cell Biol. 15 (1995)

Saponaro, C. et al., Cancer Biomark. 14 (2014)

Sarajlic, A. et al., Breast Cancer Res Treat. 143 (2014)

Sasahira, T. et al., Eur.J Cancer 50 (2014)

Schneider, E. et al., Clin Chim.Acta 374 (2006)

Schofield, A. V. et al., Crit Rev.Biochem.Mol Biol. 48 (2013)

Schulz, E. G. et al., Immunity. 30 (2009)

Seifert, M. et al., J Pathol. 205 (2005)

Senchenko, V. et al., Oncogene 22 (2003)

Shaughnessy, J. D., Jr. et al., Blood 118 (2011)

Shen, F. et al., J Cell Biochem. 112 (2011)

Shi, M. et al., World J Gastroenterol. 10 (2004a)

Shi, Y. et al., Exp.Cell Res 296 (2004b)

Shi, Z. Z. et al., Clin Transl.Oncol 16 (2014)

Shinji, S. et al., Oncol Rep. 15 (2006)

Shodeinde, A. et al., J Mol Biochem. 2 (2013)

Shubbar, E. et al., BMC.Cancer 13 (2013)

Shurbaji, M. S. et al., Am J Clin Pathol. 96 (1991)

Sillars-Hardebol, A. H. et al., Gut 61 (2012)

Singh, S. et al., Tumour.Biol. (2014)

Smith, P. et al., Clin Cancer Res 13 (2007)

Song, C. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)

Srivenugopal, K. S. et al., Cancer Lett. 117 (1997)

Staal-van den Brekel AJ et al., Br.J Cancer 76 (1997)

Steen, H. C. et al., J Interferon Cytokine Res. 32 (2012)

Stefanska, B. et al., Clin Cancer Res 20 (2014)

Strassburg, C. P. et al., J Biol.Chem. 273 (1998)

Strassburg, C. P. et al., Mol Pharmacol. 52 (1997)

Sudo, H. et al., Genomics 95 (2010)

Sugihara, T. et al., J Biol.Chem. 276 (2001)

Sun, C. et al., Pathol.Res Pract. 210 (2014)

Sun, X. et al., J Pathol. 226 (2012)

Sun, X. et al., Protein Cell 4 (2013)

Sun, X. J. et al., Zhonghua Yi.Xue.Yi.Chuan Xue.Za Zhi. 22 (2005)

Supernat, A. et al., Oncol Lett. 4 (2012)

Surmacz, E., J Mammary.Gland.Biol.Neoplasia. 18 (2013)

Suzuki, K. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 368 (2008)

Swallow, C. J. et al., Oncogene 24 (2005)

Tabuchi, K. et al., J Neurosci. 22 (2002)

Taguchi, O. et al., Clin Chim.Acta 244 (1996)

Takayama, T. et al., Cancer 68 (1991)

Takayama, T. et al., Lancet 356 (2000)

Takeda, Y. et al., Glycobiology 24 (2014)

Takemasa, I. et al., Int.J Oncol 40 (2012)

Takeuchi, A. et al., Mol Cell Endocrinol. 384 (2014)

Tan, L. Z. et al., Am J Pathol. 183 (2013)

Tan, M. K. et al., Mol Cell Biol. 31 (2011)

Tanahashi, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 243 (1998)

Tanaka, M. et al., Mol Med.Rep. 7 (2013)

Tang, L. et al., Arch.Med.Res 43 (2012)

Tang, X. H. et al., Annu.Rev.Pathol. 6 (2011)

Tao, J. et al., Sci.Transl.Med. 3 (2011)

Tao, R. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 341 (2006)

Tao, T. et al., Cell Res 23 (2013)

Tarao, K. et al., Cancer 86 (1999)

Tarao, K. et al., Cancer 79 (1997)

Tasker, P. N. et al., Osteoporos.Int. 17 (2006)

Telikicherla, D. et al., Clin Proteomics. 9 (2012)

Tian, T. et al., Eur.J Cancer 48 (2012)

Tian, Y. et al., BMC.Cancer 14 (2014)

Tomiyama, K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 107 (2010)

Tomoda, T. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 27 (2012)

Tong, J. et al., PLoS.One. 8 (2013)

Tortorella, S. et al., J Membr.Biol. 247 (2014)

Tran, E. et al., Science 344 (2014)

Trougakos, I. P., Gerontology 59 (2013)

Tsai, H. Y. et al., Oncogene 32 (2013)

Uddin, S. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 4 (2011)

Uehara, Y. et al., Cancer Res 43 (1983)

Urig, S. et al., Semin.Cancer Biol. 16 (2006)

Vainio, P. et al., Am.J Pathol. 178 (2011)

van der Spek, P. J. et al., Genomics 31 (1996)

van Zuylen, W. J. et al., PLoS.Pathog. 8 (2012)

van, den Broek, I et al., Proteomics.Clin Appl. 4 (2010)

van, Duin M. et al., Haematologica 96 (2011)

Vejda, S. et al., Mol Cell Proteomics. 1 (2002)

Vincent, F. et al., Cancer Res 69 (2009)

Wang, B. S. et al., Cell Stress.Chaperones. 18 (2013a)

Wang, D. et al., J Biol.Chem. 277 (2002)

Wang, J. et al., Eur.J Cancer Prev. 22 (2013b)

Wang, J. et al., J Clin Invest 112 (2003)

Wang, J. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 6 (2013c)

Wang, J. C. et al., Oncology 81 (2011)

Wang, M. et al., Chin J Physiol 55 (2012)

Wang, S. K. et al., PLoS.Genet. 9 (2013d)

Wang, S. S. et al., PLoS.One. 5 (2010)

Wang, X. et al., Urol.Int. 92 (2014)

Wang, Y. et al., J Biol.Chem. 274 (1999)

Wang, Y. et al., Med.Oncol 32 (2015)

Wazir, U. et al., Cell Mol Biol.Lett. 18 (2013)

Wazir, U. et al., Anticancer Res 32 (2012)

Weiss, J. et al., Int.J Antimicrob.Agents 41 (2013)

Welsh, M. M. et al., Carcinogenesis 29 (2008)

Wieser, R., Leuk.Lymphoma 43 (2002)

Wilhelm, S. M. et al., Cancer Res. 64 (2004)

Williams, A. L. et al., Nature 506 (2014)

Witte, I. et al., Cell Death.Dis. 2 (2011)

Wong, K. K. et al., Leukemia 28 (2014)

Wong, N. et al., J Hepatol. 38 (2003)

Wu, L. et al., Ann Hematol. 91 (2012)

Wu, N. et al., Int.J Mol Sci. 14 (2013a)

Wu, W. et al., Sci.China Life Sci. 56 (2013b)

Wu, X. et al., Am.J Clin Exp.Urol. 2 (2014)

Wu, Y. M. et al., Cancer Res 71 (2011)

Xiao, J. et al., J Biol.Chem. 276 (2001)

Xie, F. W. et al., Neoplasma 61 (2014)

Xu, H. et al., Cell Rep. 9 (2014)

Xu, X. et al., Proteomics. 10 (2010)

Yan, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001)

Yang, C. et al., Virchows Arch. 463 (2013)

Yang, C. Y. et al., J Immunol 192 (2014a)

Yang, H. et al., Oncol Rep. 24 (2010)

Yang, H. W. et al., Oncogene 0 (2014b)

Yang, R. et al., Mol Cell Biol. 31 (2011a)

Yang, Z. J. et al., Mol Cancer Ther 10 (2011b)

Yau, C. et al., Breast Cancer Res 12 (2010)

Ye, X. H. et al., Mol Genet.Genomics (2014)

Yoon, J. K. et al., J Transl.Med. 12 (2014)

Yoshimura, S. et al., J Cell Biol. 191 (2010)

Yoshizuka, N. et al., Mol Cancer Res 10 (2012)

Yosten, G. L. et al., Am J Physiol Regul.Integr.Comp Physiol 303 (2012)

Yu, J. H. et al., RNA. 11 (2005)

Yu, K. et al., PLoS.Genet. 4 (2008)

Yue, C. et al., Int.J Cancer 136 (2015)

Zamanian-Daryoush, M. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)

Zarling, A. L. et al., Cancer Res 74 (2014)

Zekri, A. R. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 13 (2012)

Zelcer, N. et al., Mol Cell Biol. 34 (2014)

Zhang, D. et al., Pak.J Med.Sci. 29 (2013a)

Zhang, H. et al., Oncotarget. 4 (2013b)

Zhang, H. T. et al., Biochim.Biophys.Acta 1839 (2014a)

Zhang, J. et al., Drug Metab Dispos. 34 (2006)

Zhang, S. et al., BMC.Cancer 11 (2011)

Zhang, X. et al., PLoS.One. 7 (2012)

Zhang, X. D. et al., Int.J Clin Exp.Med. 7 (2014b)

Zhao, Y. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013)

Zhou, B. et al., Cancer Biol.Ther 13 (2012)

Zhou, D. et al., PLoS.One. 8 (2013a)

Zhou, J. et al., Oncol Rep. 30 (2013b)

Zhou, J. et al., Lung Cancer 14 (1996)

Zhu, H. et al., Cell Stress.Chaperones. (2014a)

Zhu, W. L. et al., Anticancer Res 29 (2009)

Zhu, X. et al., Biomed.Pharmacother. 68 (2014b)

Zhuang, Z. et al., J Neurosurg. 115 (2011)

Zietek, Z. et al., Pol.Tyg.Lek. 51 (1996)

Zou, W. et al., Cancer Sci. 101 (2010)

Zu, X. et al., Molecules. 18 (2013)

Zu, X. Y. et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov. 7 (2012)

Zynda, E. R. et al., Cell Cycle 13 (2014)

Claims

1. O peptidă care cuprinde secvenţa de aminoacizi SEQ ID NO. 56 şi o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia, în care respectiva peptidă are o lungime totală de 10-30 de aminoacizi şi în care respectiva peptidă are capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate umană (MHC) de clasă I şi este capabilă, atunci când este legată la MHC, să fie recunoscută de celule T CD8.

2. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1, în care respectiva peptidă are o lungime totală de până la 16 aminoacizi şi în care de preferinţă peptida constă din secvenţa de aminoacizi conform SEQ ID No. 56.

3. Peptida în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2, unde respectiva peptidă include legături nepeptidice şi/sau respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (Ii).

4. Un anticorp, solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 până la 3, de preferinţă peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 până la 3 care este legată de o moleculă MHC.

5. Un receptor de celule T (TCR), solubil sau legat de membrană, care este reactiv cu un ligand HLA, în care respectivul ligand are cel puţin 88% identitate cu şi, de preferinţă, constă din secvenţa de aminoacizi cu SEQ ID NO 56, în care, opţional, respectivul TCR este furnizat ca moleculă solubilă şi, tot opţional, are o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu sau o toxină care stimulează imunitatea.

6. Un acid nucleic care codifică o peptidă în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul conform Revendicării 4, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5 sau un vector de exprimare care exprimă respectivul acid nucleic.

7. O celulă-gazdă care cuprinde peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3 sau acidul nucleic ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, în care respectiva celulă-gazdă este preferabil o celulă prezentatoare de antigen, cum ar fi o celulă dendritică sau o celulă T ori o celulă NK.

8. O metodă pentru producerea peptidei în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4 sau TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5, metoda care cuprinde cultivarea unei celule-gazdă în conformitate cu Revendicarea 7, care prezintă peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3 sau exprimă acidul nucleic ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 şi izolarea peptidei, respectivului anticorp sau TCR-ului de celula-gazdă şi/sau mediul său de cultură.

9. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând contactarea in vitro a celulelor T cu molecule de MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau o construcţie artificială care imită o celulă prezentatoare de antigen pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa numitele celule T într-o manieră specifică antigenului, în care respectivul antigen este o peptidă în conformitate cu Revendicarea 1 sau Revendicarea 2.

10. O celulă T activată produs prin metoda în conformitate cu Revendicarea 9 care recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi dată în Revendicarea 1 sau 2.

11. O compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula-gazdă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, excipienţi şi/sau stabilizatori acceptabili farmaceutic.

12. Peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula-gazdă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 11 pentru utilizare în medicină.

13. Peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula-gazdă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea Revendicării 11 pentru utilizare în tratarea cancerului.

14. Peptida în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1-3, anticorpul în conformitate cu Revendicarea 4, TCR-ul în conformitate cu Revendicarea 5, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula-gazdă cuprinzând vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 7, celula T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau compoziţia farmaceutică în conformitate cu Revendicarea 11 pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 13, în care cancerul menţionat este selectat din grupul de HCC, cancer cerebral, cancer renal, cancer pancreatic, cancer de colon sau rectal ori leucemie şi alte tumori care prezintă o supraexprimare a SLC16A11.

15. O trusă care conţine:

(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform Revendicării 11, în soluţie sau în formă liofilizată;

(b) opţional, un al doilea recipient conţinând un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată;

(c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate şi, opţional, conţinând suplimentar una sau mai multe dintre următoarele: (iii) o soluţie-tampon, (iv) un diluant, (v) un filtru, (vi) un ac sau (vii) o seringă.