MD3319985T2

MD3319985T2 - Noi peptide și combinații de peptide pentru utilizare în imunoterapie împotriva cancerului esofagian și a altor cancere

Info

Publication number: MD3319985T2
Application number: MDE20180500T
Authority: MD
Inventors: Andrea Mahr; Toni Weinschenk; Colette Song; Oliver Schoor; Jens Fritsche; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2021-01-31
Also published as: EP3736283A1; US11939366B2; HUE052628T2; PE20231014A1; TWI776332B; AU2022205209A1; CO2017012886A2; KR20180026758A; JP6944382B2; MX2021013003A; RS61203B1; PL3319985T3; MY188354A; US12297254B2; US11932678B2; ES2841507T3; US20220098276A1; US20210277086A1; US20220098275A1; IL313594A

Abstract

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În particular, prezenta invenţie se referă la imunoterapia cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la un epitop peptidic al celulelor T citotoxice asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept componente farmaceutice active ale formulelor de vaccin care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili ai celulelor T şi ale altor molecule de legare.

Description

Prezenta invenţie se referă la o peptidă derivată din molecule HLA de clasă I ale celulelor tumorale umane care se pot folosi în formule de vaccin pentru inducerea de răspunsuri imunitar antitumorale sau drept ţintă pentru dezvoltarea de compuşi sau celule active din punct de vedere farmaceuticIimunologic.

FUNDAMENTELE INVENŢIEI

Cancerul esofagian este al optulea cel mai frecvent cancer la nivel mondial, cu o prevalenţă de cinci ani de 464.063 de pacienţi în 2012. Ratele mortalităţii sunt foarte similare cu ratele de incidenţă (400.169 faţă de 455.784 în 2012), subliniind fatalitatea ridicată a cancerului esofagian (World Cancer Report, 2014; Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

Carcinomul cu celule scuamoase şi adenocarcinomul reprezintă cele mai comune două subtipuri de cancer esofagian. Ambele subtipuri sunt mai frecvente la bărbaţi decât la femei, însă prezintă distribuţii geografice distincte. Carcinomul cu celule scuamoase este mai răspândit în regiunile cu resurse reduse, având rate de incidenţă deosebit de ridicate în Republica Islamică Iran, unele părţi din China şi Zimbabwe. Adenocarcinomul este cel mai frecvent tip de cancer esofagian în rândul caucazienilor şi populaţiilor cu un statut socio-economic ridicat, Regatul Unit, Australia, Olanda şi SUA fiind în fruntea clasamentului. Cei mai puternici factori de risc pentru dezvoltarea carcinomului celular scuamos esofagian includ consumul de alcool şi tutun, în timp ce adenocarcinomul esofagian este asociat în principal cu obezitatea şi boala de reflux gastro-esofagian. Rata de incidenţă a adenocarcinomului esofagian este în continuă creştere în ţările cu venituri mari, fapt care ar putea fi atribuit ratelor crescânde de obezitate şi de boală de reflux gastro-esofagian, precum şi modificărilor în clasificarea tumorilor la joncţiunea gastro-esofagiană. Carcinomul neuroendocrin, carcinomul chistic adenoid, carcinomul adenoscuamous, carcinomul muco-epidermoid, carcinomul mixt adeno-neuroendocrin, diferite sarcoame şi melanomul reprezintă subtipuri mai rare de cancer esofagian (World Cancer Report, 2014).

Strategia de tratament de primă intenţie pentru cancerul esofagian depinde de stadiul şi localizarea tumorii, de tipul histologic şi de starea medicală a pacientului. Doar chirurgia nu este suficientă, cu excepţia unui subgrup mic de pacienţi cu carcinom cu celule scuamoase. În general, chirurgia trebuie combinată cu chimioterapia preoperatorie şi, eventual, postoperatorie sau cu chimioradioterapia preoperatorie, în timp ce s-a demonstrat că numai radioterapia preoperatorie sau postoperatorie nu conferă beneficii de supravieţuire. Regimurile chimioterapeutice includ oxaliplatină plus fluorouracil, carboplatină plus paclitaxel, cisplatină plus fluorouracil, FOLFOX şi cisplatină plus irinotecan. Pacienţii cu tumori HER2-pozitive trebuie trataţi conform recomandărilor pentru cancerul gastric utilizându-se o combinaţie de cisplatină, fluorouracil şi trastuzumab, deoarece datele randomizate pentru terapiile ţintite în cancerul esofagian sunt foarte limitate (Stahl et al., 2013; Leitlinie Magenkarzinom, 2012).

În general, majoritatea tipurilor de cancer esofagian sunt uşor de gestionat, dacă pacienţii prezintă tumori în stadiu incipient, în timp ce succesul terapeutic este foarte limitat în stadii mai avansate. Astfel, dezvoltarea de noi protocoale de screening ar putea fi foarte eficace în reducerea ratelor de mortalitate legate de cancerul esofagian (World Cancer Report, 2014).

Imunoterapia ar putea fi o abordare inovatoare promiţătoare pentru tratamentul cancerului esofagian avansat. Câteva gene asociate cancerului şi antigeni de cancer testicular s-au dovedit a fi supraexprimate în cancerul esofagian, inclusiv diferite gene MAGE, NY-ESO-1 şi EpCAM (Kimura et al., 2007; Liang et al., 2005b; Inoue et al., 1995; Bujas et al., 2011; Tanaka et al., 1997; Quillien et al., 1997). Aceste gene reprezintă ţinte foarte interesante pentru imunoterapie şi cele mai multe dintre ele sunt cercetate pentru tratarea altor malignităţi (ClinicalTrials.gov, 2015). Mai mult, a fost descrisă reglarea în sens crescător a PD-L1 şi PD-L2 în cancerul esofagian, care s-a corelat cu un prognostic mai slab. Astfel, pacienţii cu cancer esofagian cu tumori cu PD-L1-pozitive ar putea beneficia de imunoterapie anti-PD-L1 (Ohigashi et al., 2005).

Datele clinice privind abordările imunoterapeutice în cancerul esofagian sunt încă relativ rare în prezent, deoarece a fost finalizat doar un număr foarte limitat de studii clinice în fază timpurie (Toomey et al., 2013). Într-un studiu de fază I cu rezultate moderate a fost administrat un vaccin format din trei peptide derivate din trei antigeni diferiţi de cancer testicular (proteinkinaza TTK, antigenul limfocitului complex 6 locus K şi proteina 3 de legare a ARNm-ului factorului de creştere similar insulinei (IGF)-II) la pacienţi cu cancer esofagian avansat (Kono et al., 2009). Injectarea intratumorală de celule T activate după o provocare in vitro cu celule maligne autologe şi interleukină 2 a generat răspunsuri complete sau parţiale ale tumorii la patru din unsprezece pacienţi într-un studiu de fază l/ll (Toh et al., 2000; Toh et al., 2002). În prezent sunt efectuate alte studii clinice pentru a se evalua impactul diferitelor imunoterapii asupra cancerului esofagian, inclusiv terapie celulară adoptivă (NCT01691625, NCT01691664, NCT01795976, NCT02096614, NCT02457650), strategii de vaccinare (NCT01143545, NCT01522820) şi terapie anti-PD-L1 (NCT02340975) (ClinicalTrials.gov, 2015).

Având în vedere efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratarea cancerului, este necesară identificarea factorilor care pot fi utilizaţi în tratamentul cancerului în general şi al cancerului esofagian în special.. De asemenea, este necesară identificarea factorilor care reprezintă biomarkeri pentru cancer în general şi pentru cancerul esofagian în special, conducând la îmbunătăţirea diagnosticării cancerului, a evaluării prognosticului şi a prezicerii succesului tratamentului.

Imunoterapia cancerului reprezintă o opţiune de ţintire specifică a celulelor canceroase concomitent cu minimizarea efectelor secundare. Imunoterapia cancerului foloseşte existenţa antigenilor asociaţi tumorii.

Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii (TAA) cuprinde următoarele grupuri principale:

a) Antigeni pentru cancer testicular: Primele TAA identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece expresia membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, în ţesuturile naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, din placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1. b) Antigeni de diferenţiere: Aceste TAA sunt comune tumorilor şi ţesutului normal din care provin tumorile. Majoritatea antigenilor de diferenţiere cunoscuţi sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine corelate cu linia melanocitară sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic. c) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu nivele reduse de expresie. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1. d) Antigeni specifici tumorii: Aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii). e) TAA care apar prin modificări anormale post-translaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii. f) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical. Imunoterapia bazată pe celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumori, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, suprareglate în celulele respectivei tumori. Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2-microglobuline, molecule MHC de clasă II ale unui lanţ alfa şi ale unui lanţ beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide. Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatura de specialitate ca „prezentare încrucişată» (Brossart şi Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri, de exemplu în timpul endocitozei, şi care sunt procesate ulterior. Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1. Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigenii asociaţi tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imunitare antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007). În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006). Peptidele alungite (mai lungi) din invenţie pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II. Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral. S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ) (Beatty şi Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014). Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1). Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale. Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu incizura de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare. În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR). Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici tumorii sau asociaţi tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceşti antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T. În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop. Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-o concretizare foarte preferată a invenţiei este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efector („celule T efectoare»).

În cazul ţintirii peptidei-MHC de către TCR-uri specifice (de exemplu, TCR solubile) şi anticorpi în conformitate cu invenţia, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. În aceste cazuri, prezentarea este factorul determinant.

Rizzolo et al. (în: Conventional and microwave-assisted SPPS approach: a comparative synthesis of PTHrP(1-34)NH2D3 J Pept Sci. 2011 Oct; 17(10):708-14) se referă la o metodă de sinteză pentru polipeptide şi compară SPPS-ul MW-asistat Fmoc/tBu al fragmentului N-terminal 1-34 al peptidei legate de hormonul paratiroid (PTHrP) cu SPPS-ul său convenţional efectuat la RT. În timpul alungirii treptate a peptidei legate la răşină, monitorizarea a fost efectuată prin miniclivaje MW-asistate şi analizarea acestora prin UPLC-ESI-MS. Identificarea unor secvenţe de deleţie a fost utilă pentru recunoaşterea cuplajelor critice şi, ca atare, a ajutat la ghidarea introducerii iradierilor MW în aceste etape. Sunt descrise doar fragmentele peptidice în timpul sintezei. Nu se indică nimic în ceea ce priveşte utilizarea peptidei, aşa cum se revendică în medicină.

US 2005/033023 descrie o peptidă 10mer FLHHLIAEIH (PTR-2, SEQ ID NO: 3) care se suprapune cu SEQ ID NO: 9 din prezenta aplicaţie, HLIAEIHTA. În US 2005/033023, moleculele PTH-rP au fost analizate cu algoritmul „Parker» (BlMAS) pentru a indica peptide care au motive de legare HLA-A(*)02.01 teoretice ridicate. PTR-2 s-a dovedit că are cea mai mare afinitate de legare HLA-A(*)02.01; cu toate acestea, motivul peptidei actuale nu a fost identificat în US 2005/033023.

REZUMATUL INVENŢIEI

Într-un prim aspect, prezenta invenţie se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 9 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia pentru utilizare în medicină.

Tabelele următoare prezintă peptida pentru utilizare din invenţie, SEQ ID NO respective şi genele-sursă (subiacente) prospective pentru aceste peptide. SEQ ID NO: 82 este în conformitate cu invenţia. Toate peptidele din Tabelul 1 şi Tabelul 2 se leagă la HLA-A*02. Peptidele din Tabelul 2 au fost descrise anterior în liste mari ca rezultate ale screeningurilor cu debit mare cu rate de eroare mari sau calculate folosindu-se algoritmi, dar nu au fost deloc asociate anterior cu cancerul. Peptidele din Tabelul 3 sunt peptide suplimentare care pot fi utile în combinaţie cu celelalte peptide pentru utilizare din prezenta invenţie. Peptidele din Tabelul 4 sunt, de asemenea, utile în diagnosticul şi/sau tratamentul diferitelor alte malignităţi care implică o supraexprimare sau o supraprezentare a polipeptidei respective.

Tabelul 1: Peptide în conformitate cu descrierea, SEQ ID NO:9 sunt destinate utilizării conform invenţii

SEQ ID NO Secvenţă Cod(uri) genă Simbol(uri) oficial(e) de gene 1 STYGGGLSV 3861, 3868 KRT14, KRT16 2 SLYNLGGSKRISI 3852 KRT5 3 TASAITPSV 3852 KRT5 4 ALFGTILEL 2769 GNA15 5 NLMASQPQL 5317 PKP1 6 LLSGDLIFL 2709 GJB5 7 SIFEGLLSGV 2709 GJB5 8 ALLDGGSEAYWRV 84985 FAM83A 9 HLIAEIHTA 5744 PTHLH 10 SLDENSDQQV 6273 S100A2 11 ALWLPTDSATV 3914 LAMB3 12 GLASRILDA 3914 LAMB3 13 SLSPVILGV 26525 IL36RN 14 RLPNAGTQV 3655 ITGA6 15 LLANGVYAA 55107 ANO1 16 VLAEGGEGV 10630 PDPN 17 MISRTPEV 2155, 28396, 3500, 3501, 3502, 3503, 3507 F7, IGHV4-31, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHM 18 FLLDQVQLGL 83882 TSPAN10 19 GLAPFLLNAV 101060689, 154761, 285966 FAM115C 20 IIEVDPDTKEML 100505503, 402057, 442216, 6218 RPS17L, RPS17P16, RPS17P5, RPS17 21 IVREFLTAL 27297 CRCP 22 KLNDTYVNV 23306 TMEM194A 23 KLSDSATYL Няма асîцииран ген 24 LLFAGTMTV 29785 CYP2S1 25 LLPPPPPPA 9509 ADAMTS2 26 MLAEKLLQA 2195 FAT1 27 NLREGDQLL 113146 AHNAK2 28 SLDGFTIQV 4939 OAS2 29 SLDGTELQL 284114 TMEM102 30 SLNGNQVTV 79832 QSER1 31 VLPKLYVKL 100996747, 441502, 6231, 643003, 644928, 728937, 729188 RPS26P11, RPS26, RPS26P28, RPS26P15, RPS26P25, RPS26P58 32 YMLDIFHEV 3038 HAS3 33 GLDVTSLRPFDL 2316 FLNA 34 SLVSEQLEPA 11187 PKP3 35 LLRFSQDNA 51056 LAP3 36 FLLRFSQDNA 51056 LAP3 37 YTQPFSHYGQAL 6051 RNPEP 38 IAAIRGFLV 83451 ABHD11 39 LVRDTQSGSL 871 SERPINH1 40 GLAFSLYQA 871 SERPINH1 41 GLESEELEPEEL 8106 PABPN1 42 TQTAVITRI 81610 FAM83D 43 KVVGKDYLL 832 CAPZB 44 ATGNDRKEAAENSL 7531 YWHAE 45 MLTELEKAL 6279 S100A8 46 YTAQIGADIAL 64499, 7177 TPSB2, TPSAB1 47 VLASGFLTV 79183 TTPAL 48 SMHQMLDQTL 7168 TPM1 49 GLMKDIVGA 8942 KYNU 50 GMNPHQTPAQL 471 ATIC 51 KLFGHLTSA 57157 PHTF2 52 VAIGGVDGNVRL 9948 WDR1 53 VVVTGLTLV 396 ARHGDIA 54 YQDLLNVKM 1674, 4741, 4744, 4747, 7431, 9118 DES, NEFM, NEFH, NEFL, VIM, INA 55 GAIDLLHNV 115362 GBP5 56 ALVEVTEHV 54972 TMEM132A 57 GLAPNTPGKA 9055 PRC1 58 LILESIPVV 5597 MAPK6 59 SLLDTLREV 9989 PPP4R1 60 VVMEELLKV 23191 CYFIP1 61 TQTTHELTI 5093 PCBP1 62 ALYEYQPLQI 4331 MNAT1 63 LAYTLGVKQL 158078, 1915, 1917 EEF1A1P5, EEF1A1, EEF1A2 64 GLTDVIRDV 80028 FBXL18 65 YVVGGFLYQRL 4074 M6PR 66 LLDEKVQSV 57616 TSHZ3 67 SMNGGVFAV 23657 SLC7A11 68 PAVLQSSGLYSL 28396, 3500, 3501, 3502, 3503, 3507 IGHV4-31, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHM 69 GLLVGSEKVTM 3861, 3868, 644945 KRT14, KRT16, KRT16P3 70 FVLDTSESV 1291, 1292 COL6A1, COL6A2 71 ASDPILYRPVAV 5315 PKM 72 FLPPAQVTV 65083 NOL6 73 KITEAIQYV 6095 RORA 74 ILASLATSV 10844 TUBGCP2 75 GLMDDVDFKA 10525 HYOU1 76 KVADYIPQL 2744 GLS

Tabelul 2: Peptide în conformitate cu descrierea fără nicio asociere anterioară cu cancerul

SEQ ID NO Secvenţă Cod(uri) genă Simbol(uri) oficial(e) de gene 77 VLVPYEPPQV 8626 TP63 78 KVANIIAEV 5910 RAP1GDS1 79 GQDVGRYQV 6748 SSR4 80 ALQEALENA 9631 NUP155 81 AVLPHVDQV 23379 KIAA0947 82 HLLGHLEQA 63977 PRDM15 83 ALADGVVSQA 27238 GPKOW 84 SLAESLDQA 22894 DIS3 85 NIIELVHQV 6850 SYK 86 GLLTEIRAV 9263 STK17A 87 FLDNGPKTI 1982 EIF4G2 88 GLWEQENHL 79768 KATNBL1 89 SLADSLYNL 23271 CAMSAP2 90 SIYEYYHAL 3091 HIF1A 91 KLIDDVHRL 6734 SRPR 92 SILRHVAEV 1965 EIF2S1 93 VLINTSVTL 23036 ZNF292

Tabelul 3: Pepetide utile pentru, de exemplu, terapii anticancer personalizate

SEQ ID NO Secvenţă Cod(uri) genă Simbol(uri) oficial(e) de gene 94 TLLQEQGTKTV 286887, 3852, 3853, 3854 KRT6C, KRT5, KRT6A, KRT6B 95 LIQDRVAEV 3914 LAMB3 96 GAAVRIGSVL 9150 CTDP1 97 ELDRTPPEV 23450 SF3B3 98 VLFPNLKTV 646 BNC1 99 RVAPEEHPVL 440915, 60, 641455, 71, 728378 POTEKP, ACTB, POTEM, ACTG1, POTEF 100 GLYPDAFAPV 1991 ELANE 101 AMTQLLAGV 3371 TNC

În plus, prezenta invenţie se referă, în general, la peptidele în conformitate cu prezenta invenţie pentru utilizare în tratamentul bolilor proliferative, cum ar fi, de exemplu, cancerul pulmonar, cancerul de vezică urinară, cancerul ovarian, melanomul, cancerul uterin, cancerul hepatocelular, cancerul celulelor renale , cancerul cerebral, cancerul colorectal, cancerul mamar, cancerul gastric, cancerul pancreatic, cancerul de vezică biliară, cancerul de cale biliară, cancerul de prostată şi leucemia.

Sunt descrise peptidele - singure sau în combinaţie - din grupul format din SEQ ID NO:1 până la SEQ ID NO:93. Mai preferate sunt peptidele - singure sau în combinaţie - selectate din grupul format din SEQ ID NO:1 până la SEQ ID NO:76 (a se vedea Tabelul 1) şi utilizările acestora în imunoterapia cancerului esofagian, cancerului pulmonar, cancerului de vezică urinară, cancerului ovarian, melanomului, cancerului uterin, cancerului hepatocelular, cancerului de celule renale, cancerului cerebral, cancerului colorectal, cancerului mamar, cancerului gastric, cancerului pancreatic, cancerului de vezică biliară, cancerului de cale biliară, cancerului de prostată şi leucemiei şi, de preferinţă, a cancerului esofagian.

Sunt prezentate peptidele - singure sau în combinaţie - selectate din grupul format din SEQ ID NO 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 26, 30, 32, 34, 37, 40, 51, 55, 57, 58, 59, 62, 81 şi 82 şi utilizarea lor în imunoterapia cancerului esofagian, cancerului pulmonar, cancerului de vezică urinară, cancerului ovarian, melanomului, cancerului uterin, cancerului hepatocelular, cancerului de celule renale, cancerului cerebral, cancerului colorectal, cancerului mamar, cancerului gastric, cancerului pancreatic, cancerului de vezică biliară, cancerului de cale biliară, cancerului de prostată şi leucemiei, şi, de preferinţă, a cancerului esofagian. Este preferată, mai ales, peptida utilizată conform SEQ ID NO:9.

Aşa cum se arată în Tabelul 4A de mai jos, multe dintre peptidele descrise se găsesc, de asemenea, pe alte tipuri de tumori şi, prin urmare, pot fi utilizate, de asemenea, în imunoterapia altor indicaţii. Consultaţi, de asemenea, Figura 1 şi Exemplul 1.

Tabelul 4A: Peptide conform descrierii şi utilizările lor specifice în alte boli proliferative, în special în alte boli canceroase. SEQ ID NO: 9 este pentru utilizare în conformitate cu invenţia. Tabelul arată, pentru peptidele selectate pe care au fost găsite tipuri de tumori suplimentare, prezentând fie supraprezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate, fie prezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate cu un raport de medii geometrice tumoare vs. ţesuturi normale mai mare de trei. Supraprezentarea este definită ca prezentare mai mare pe proba tumorală în comparaţie cu proba normală cu prezentarea cea mai mare. Ţesuturile normale pentru care a fost testată supraprezentarea au fost: ţesut adipos, glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier, nerv central, colon, duoden, esofag, vezică biliară, inimă, rinichi, ficat, plămân, ganglion limfatic, leucocite mononucleare, pancreas, nerv periferic, peritoneu, hipofiză, pleură, rect, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, timus, glandă tiroidă, trahee, ureter, vezică urinară, venă.

SEQ ID No Secvenţă Alte organe/boli relevante 2 SLYNLGGSKRISI NSCLC 3 TASAITPSV NSCLC, cancer de vezică urinară 4 ALFGTILEL NSCLC 7 SIFEGLLSGV Cancer de vezică urinară 8 ALLDGGSEAYWRV NSCLC, OC 9 HLIAEIHTA NSCLC 11 ALWLPTDSATV NSCLC, melanom 12 GLASRILDA Cancer de vezică urinară 13 SLSPVILGV Cancer uterin 15 LLANGVYAA HCC 17 MISRTPEV NSCLC, RCC, HCC 22 KLNDTYVNV SCLC, cancer cerebral, HCC 26 MLAEKLLQA CRC 29 SLDGTELQL BRCA 31 VLPKLYVKL GC 32 YMLDIFHEV Cancer de vezică urinară 33 GLDVTSLRPFDL GC 34 SLVSEQLEPA CRC, cancer de vezică urinară 35 LLRFSQDNA GC, HCC 36 FLLRFSQDNA GC 37 YTQPFSHYGQAL GC, PC 38 IAAIRGFLV GC 39 LVRDTQSGSL GC 40 GLAFSLYQA NSCLC, PC, BRCA, cancer de vezică urinară 41 GLESEELEPEEL GC 42 TQTAVITRI GC 45 MLTELEKAL GC 46 YTAQIGADIAL GC 47 VLASGFLTV Cancer de vezică urinară 49 GLMKDIVGA HCC 50 GMNPHQTPAQL GC 51 KLFGHLTSA Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 52 VAIGGVDGNVRL GC 54 YQDLLNVKM RCC, GC 55 GAIDLLHNV GC 56 ALVEVTEHV BRCA 57 GLAPNTPGKA NSCLC, SCLC, BRCA, melanom 58 LILESIPVV NSCLC, melanom 61 TQTTHELTI SCLC, leucemie 62 ALYEYQPLQI NSCLC, HCC, cancer de vezică urinară 63 LAYTLGVKQL GC 66 LLDEKVQSV Cancer cerebral, melanom 67 SMNGGVFAV Cancer cerebral, HCC 68 PAVLQSSGLYSL GC, PC 69 GLLVGSEKVTM PC 70 FVLDTSESV GC, HCC, melanom, OC 71 ASDPILYRPVAV GC, PC 72 FLPPAQVTV NSCLC, GC, HCC, leucemie, melanom 73 KITEAIQYV BRCA 74 ILASLATSV CRC, HCC, cancer de vezică urinară 75 GLMDDVDFKA BRCA, melanom, cancer de vezică urinară 76 KVADYIPQL NSCLC, SCLC 77 VLVPYEPPQV NSCLC, cancer de vezică urinară 78 KVANIIAEV PC, leucemie, OC 80 ALQEALENA NSCLC, SCLC, cancer cerebral, CRC, HCC, leucemie, BRCA, OC 81 AVLPHVDQV Cancer cerebral 82 HLLGHLEQA NSCLC, HCC, leucemie, BRCA 83 ALADGVVSQA Cancer cerebral, GC, melanom, cancer de vezică urinară 85 NIIELVHQV Leucemie 86 GLLTEIRAV Cancer cerebral, cancer de vezică urinară 87 FLDNGPKTI Cancer cerebral, PC, OC 88 GLWEQENHL NSCLC, BRCA 89 SLADSLYNL Cancer cerebral, BRCA, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 91 KLIDDVHRL PC, PrC 92 SILRHVAEV NSCLC, CRC, HCC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 94 TLLQEQGTKTV NSCLC NSCLC = cancer pulmonar non-microcelular, SCLC = cancer pulmonar microcelular, RCC = cancer renal, CRC = cancer de colon sau rect, GC = cancer de stomacal, HCC = cancer hepatic, PC = cancer pancreatic, PrC = cancer de prostată, leucemie, BRCA = cancer mamar

Tabelul 4B: Peptide conform descrierii şi utilizările lor specifice în alte boli proliferative, în special în alte boli canceroase (amendament al Tabelului 4). Tabelul arată, ca Tabelul 4A, pentru peptidele selectate pe care au fost găsite tipuri de tumori suplimentare, prezentând supraprezentare (inclusiv prezentare specifică) pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate sau prezentare pe mai mult de 5% din probele tumorale măsurate cu un raport de medii geometrice tumoare vs. ţesuturi normale mai mare de 3. Supraprezentarea este definită ca prezentare mai mare pe proba tumorală în comparaţie cu proba normală cu prezentarea cea mai mare. Ţesuturile normale pentru care a fost testată supraprezentarea au fost: ţesut adipos, glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier, nerv central, colon, duoden, esofag, ochi, vezică biliară, inimă, rinichi, ficat, plămân, ganglion limfatic, leucocite mononucleare, pancreas, glandă paratiroidă, nerv periferic, peritoneu, hipofiză, pleură, rect, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, glandă tiroidă, trahee, ureter, vezică urinară, venă.

SEQ ID No. Secvenţă Entităţi suplimentare 1 STYGGGLSV NSCLC, melanom, HNSCC 2 SLYNLGGSKRISI Cancer de vezică urinară, HNSCC 3 TASAITPSV HNSCC 4 ALFGTILEL Cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, AML, HNSCC 5 NLMASQPQL HNSCC 6 LLSGDLIFL HNSCC 7 SIFEGLLSGV NSCLC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 8 ALLDGGSEAYWRV Cancer de vezică urinară, HNSCC 10 SLDENSDQQV Cancer de vezică urinară, HNSCC 11 ALWLPTDSATV Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 13 SLSPVILGV NSCLC, melanom, cancer de vezică urinară, HNSCC 14 RLPNAGTQV Melanom 15 LLANGVYAA Cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 16 VLAEGGEGV Cancer cerebral, melanom, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 17 MISRTPEV Cancer de vezică urinară 18 FLLDQVQLGL Melanom, NHL, HNSCC 19 GLAPFLLNAV Melanom, NHL, HNSCC 20 IIEVDPDTKEML HNSCC 22 KLNDTYVNV BRCA 23 KLSDSATYL Melanom 25 LLPPPPPPA Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, NHL, HNSCC 28 SLDGFTIQV BRCA, melanom, AML 29 SLDGTELQL Cancer uterin, NHL 30 SLNGNQVTV BRCA, melanom, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 32 YMLDIFHEV Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 34 SLVSEQLEPA HNSCC 40 GLAFSLYQA CRC , melanom, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 42 TQTAVITRI HNSCC 48 SMHQMLDQTL GC 51 KLFGHLTSA Cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 53 VVVTGLTLV GC, cancer de vezică urinară 55 GAIDLLHNV SCLC, melanom, NHL 56 ALVEVTEHV RCC, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară 57 GLAPNTPGKA Cancer de vezică urinară, cancer uterin, HNSCC 58 LILESIPVV SCLC , CLL, cancer de vezică biliară, cancer uterin, NHL, HNSCC 59 SLLDTLREV HNSCC 62 ALYEYQPLQI SCLC, BRCA, melanom, OC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, NHL 66 LLDEKVQSV Cancer de vezică urinară, HNSCC 67 SMNGGVFAV NSCLC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 68 PAVLQSSGLYSL NHL 69 GLLVGSEKVTM HNSCC 72 FLPPAQVTV CLL, cancer de vezică urinară, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 74 ILASLATSV BRCA, HNSCC 75 GLMDDVDFKA GC, HCC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, NHL, HNSCC 76 KVADYIPQL RCC, BRCA, melanom, OC, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, NHL 77 VLVPYEPPQV NHL, HNSCC 78 KVANIIAEV Cancer de vezică urinară, HNSCC 79 GQDVGRYQV SCLC, PC, PrC, CLL, BRCA, OC, cancer de vezică urinară, AML, NHL 80 ALQEALENA Melanom, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, HNSCC 81 AVLPHVDQV Cancer uterin, NHL 82 HLLGHLEQA RCC 83 ALADGVVSQA Cancer uterin 84 SLAESLDQA Melanom, cancer uterin, AML, NHL, HNSCC 85 NIIELVHQV CLL 86 GLLTEIRAV Melanom, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, AML, NHL, HNSCC 87 FLDNGPKTI Cancer de vezică urinară, HNSCC 88 GLWEQENHL CRC, cancer uterin, AML, HNSCC 89 SLADSLYNL Melanom 90 SIYEYYHAL NHL, HNSCC 92 SILRHVAEV BRCA, melanom, AML, NHL

NSCLC = cancer pulmonar non-microcelular, SCLC = cancer pulmonar microcelular, RCC = cancer renal, CRC = cancer de colon sau rect, GC = cancer stomacal, HCC = cancer hepatic, PC = cancer pancreatic, PrC = cancer de prostată, BRCA = cancer mamar, OC = cancer ovarian, NHL = limfom non-Hodgkin, AML = leucemie mieloidă acută, CLL = leucemie limfocitară cronică, HNSCC = carcinom cu celule scuamoase al capului şi gâtului

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea a cel puţin unei peptide descrise în conformitate cu oricare dintre SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 13, 17, 40, 57, 58, 62, 67, 72, 76, 77, 80, 82, 88, 92 şi 94 pentru - într-o concretizare preferată combinată - tratamentul cancerului pulmonar non-microcelular.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenţii se referă la utilizarea peptidelor în conformitate cu prezenta invenţie pentru - preferabil combinat - tratamentul unei boli proliferative selectate din grupul de cancer esofagian, cancer pulmonar, cancer de vezică urinară, cancer ovarian, melanom, cancer uterin, cancer hepatocelular, cancer de celule renale, cancer cerebral, cancer colorectal, cancer mamar, cancer gastric, cancer pancreatic, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, cancer de prostată şi leucemie.

Prezenta invenţie se referă şi la o peptidă pentru utilizare din invenţie şi care are capacitatea de a se lega la o moleculă şi la complexul major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I.

Prezenta invenţie se referă la o peptidă constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 9 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia pentru utilizare în medicină.

Prezenta invenţie se referă în continuare la peptida pentru utilizare conform prezentei invenţii, în care respectiva peptidă include legături non-peptidice.

Prezenta invenţie se referă suplimentar la peptida pentru utilizare conform prezentei invenţii, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, cuprinzând aminoacizi N-terminali 80 ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR sau fuzionată cu un anticorp (sau în secvenţa unui anticorp), cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptida pentru utilizare conform prezentei invenţii. Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic conform prezentei invenţii, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la un vector de exprimare care exprimă un acid nucleic conform prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în tratarea bolilor şi în medicină, în special în tratarea cancerului.

Prezenta invenţie se mai referă la anticorpi care sunt specifici împotriva peptidei pentru utilizare conform prezentei invenţii sau complexe ale peptidei menţionate pentru utilizare conform prezentei invenţii cu MHC şi metode de realizare a acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la receptori de celule T (TCR), în special TCR solubil (sTCR) şi TCR clonate transformate în celule T autologe sau alogene şi metode de realizare a acestora, precum şi celule NK sau alte celule care poartă respectivul TCR sau care reacţionează încrucişat cu TCR menţionate.

Anticorpii şi TCR sunt exemple de realizare suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidelor în conformitate cu invenţia la îndemână.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie sau un vector de exprimare aşa cum a fost descris mai înainte. Prezenta invenţie se referă în continuare la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide pentru utilizare conform prezentei invenţii , metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda menţionată în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO 9.

Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celula T menţionată recunoaşte selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi pentru utilizarea conformitate cu prezenta invenţie.

Este descrisă o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea unui număr eficace de celule T produse în conformitate cu prezenta invenţie la pacient.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la peptida descrisă, acidul nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, vectorul de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, celula în conformitate cu prezenta invenţie, limfocitul T activat, receptorul celulelor T sau anticorpul sau alte molecule de legare peptidică şi/sau peptidă-MHC în conformitate cu prezenta invenţie destinate utilizării ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. De preferinţă, medicamentul menţionat este activ împotriva cancerului.

De preferinţă, respectivul medicament este o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau anticorp solubil.

Prezenta invenţie se mai referă la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie în care celulele canceroase menţionate sunt de cancer esofagian, cancer pulmonar, cancer de vezică urinară, cancer ovarian, melanom, cancer uterin, cancer hepatocelular, cancer de celule renale, cancer cerebral, cancer colorectal, cancer mamar, cancer gastric, cancer pancreatic, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, cancer de prostată şi leucemie şi, de preferinţă, celule de cancer esofagian.

De exemplu, un anticorp sau un TCR solubil poate fi utilizat pentru colorarea secţiunilor tumorii pentru detectarea prezenţei unei peptide de interes în complex cu MHC.

Opţional, anticorpul poartă o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu de stimulare imunitară sau o toxină.

S-a demonstrat că polimorfismele distincte în PTHLH sunt asociate cu riscul şi prognosticul de cancer pulmonar (Manenti et al., 2000). Reglarea în sens crescător a PTHLH-ului într-un model C57BL/6, derivat de la şoarece, de cancer mamar metastatic spontan a fost descrisă ca fiind posibil implicată în diseminarea metastatică a cancerului mamar (Johnstone et al., 2015). S-a dovedit că PTHLH-ul este reglat în sens crescător în carcinomul cu celule scuamoase oral, neoplasmele condroide, leucemia/limfomul cu celule T adulte şi carcinoamele de celule renale cu celule clare (Bellon et al., 2013; Yang et al., 2013a; Yao et al., 2014; Lv et al., 2014). S-a demonstrat că reglarea în sens crescător a PTHLH-ului este asociată cu o diferenţiere patologică slabă şi prognostic slab la pacienţii cu carcinom cu celule scuamoase al capului şi gâtului (Lv et al., 2014). PTHLH-ul s-a dovedit a fi reglat în sens crescător prin semnalizarea MAPK p38, care contribuie la extravazarea celulelor de cancer de colon la plămân prin moarte independentă de caspază în celulele endoteliale ale microvascularizaţiei pulmonare (Urosevic et al., 2014). PTHLH-ul s-a dovedit a fi exprimat diferenţial în mod semnificativ în carcinomul cu celule scuamoase comparativ cu pielea normală (Prasad et al., 2014). PTHLH-ul a fost descris ca parte a unei semnături cu patru gene asociate cu supravieţuirea în rândul pacienţilor cu cancer pulmonar microcelular în stadiu incipient (Chang et al., 2012). Perturbarea funcţiei antiproliferative prin mutaţii cu decalaj de cadru de lectură ale PTHLH-ului a fost descrisă ca având contribuţie la dezvoltarea cancerului colorectal precoce la pacienţi cu cancer colorectal ereditar nepolipozic (Yamaguchi et al., 2006). S-a demonstrat că reglarea în sens crescător a PTHLH-ului este asociată cu un rezultat slab atât în supravieţuirea globală, cât şi în supravieţuirea fără boală pentru pacienţii cu carcinom de celule renale cu celule clare care au suferit nefrectomie (Yao et al., 2014). S-a demonstrat că PTHLH-ul modulează pozitiv progresia ciclului celular şi schimbă exprimarea proteinelor implicate în reglarea ciclului celular prin căile de semnalizare ERK1/2, p38, MAPK şi PI3K din linia celulară a adenocarcinomului colorectal Caco-2 (Calvo et al., 2014).

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢEI

Stimularea unui răspuns imunitar depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent imunoterapia cancerului explorează diferite mecanisme de a valorifica atât componenta umorală cât şi pe cea celulară a sistemului imunitar.

Elemente specifice ale răspunsului imunitar celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile celulare care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule au un rol important în reacţia imunitară naturală împotriva cancerului. În special celulele T CD8-pozitive capabile să recunoască moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare ale complexului major de histocompatibilitate (MHC), care includ, de obicei, 8 până la 10 resturi de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defectuoase (DRIP) localizaţi în citozol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).

După cum sunt folosiţi aici, şi cu excepţia cazurilor în care este altfel specificat, toţi termenii sunt definiţi după cum urmează:

Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă, in vitro sau in vivo. Pentru celule T citotoxice restricţionate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citokine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.

Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, preferabil, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea lungimea de 8 aminoacizi şi de 10, 11, 12, 13, sau 14 sau mai mulţi aminoacizi şi, în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor descrise), pot avea o lungime de 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 sau mai mulţi aminoacizi.

Mai mult, termenul „peptidă» va include săruri ale unei serii de resturi aminoacid conectate între ele, de obicei, prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau acetat (trifluoroacetat). Trebuie menţionat că sărurile peptidelor în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptidele în starea lor in vivo, întrucât peptidele nu sunt săruri in vivo.

Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru invenţie atât timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se includ în aceasta. Oligopeptidele au, de obicei, o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi.

Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi -carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru invenţie atâta timp cât sau epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid.

O peptidă, oligopeptidă, proteină sau polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (desemnată prin termenul „imunogen» în prezenta invenţie) dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei invenţii, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, o „imunogenă» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei invenţii, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a ridica anticorpi sau TCR-uri specifice împotriva acesteia.

Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (catenă alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi.

La oameni există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigeni leucocitari umani desemnaţi (HLA)): HLA-A, HLA-B, and HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, and HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate din aceşti loci.

Tabelul 5: Frecvenţele de exprimare F pentru HLA*A02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori et al., 1997) folosind formula Hardy-Weinberg: F = 1-(1-Gf)2. Combinaţiile de A*02 sau A*24 cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (Chanock et al., 2004).

Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucaziană (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americană (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americană (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americană (America de Nord) 48,3% DR1 Caucaziană (America de Nord) 19,4% DR2 Caucaziană (America de Nord) 28,2% DR3 Caucaziană (America de Nord) 20,6% DR4 Caucaziană (America de Nord) 30,7% DR5 Caucaziană (America de Nord) 23,3% DR6 Caucaziană (America de Nord) 26,7% DR7 Caucaziană (America de Nord) 24,8% DR8 Caucaziană (America de Nord) 5,7% DR9 Caucaziană (America de Nord) 2,1% DR1 Afro-(nord)-americană 13,20% DR2 Afro-(nord)-americană 29,80% DR3 Afro-(nord)-americană 24,80% DR4 Afro-(nord)-americană 11,10% DR5 Afro-(nord)-americană 31,10% DR6 Afro-(nord)-americană 33,70% DR7 Afro-(nord)-americană 19,20% DR8 Afro-(nord)-americană 12,10% DR9 Afro-(nord)-americană 5,80% DR1 Afro-(nord)-americană 6,80% DR2 Afro-(nord)-americană 33,80% DR3 Afro-(nord)-americană 9,20% DR4 Afro-(nord)-americană 28,60% DR5 Afro-(nord)-americană 30,00% DR6 Afro-(nord)-americană 25,10% DR7 Afro-(nord)-americană 13,40% DR8 Afro-(nord)-americană 12,70% DR9 Afro-(nord)-americană 18,60% DR1 Latino-(nord)-americană 15,30% DR2 Latino-(nord)-americană 21,20% DR3 Latino-(nord)-americană 15,20% DR4 Latino-(nord)-americană 36,80% DR5 Latino-(nord)-americană 20,00% DR6 Latino-(nord)-americană 31,10% DR7 Latino-(nord)-americană 20,20% DR8 Latino-(nord)-americană 18,60% DR9 Latino-(nord)-americană 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Neneţia, Rusia 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Samara, Rusia 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%

Peptida pentru utilizare din invenţie, de preferinţă atunci când este inclusă într-un vaccin al invenţiei, aşa cum este descris aici, se leagă de A*02. Un vaccin poate include şi peptide MHC de clasă a II-a cu pan-legare. Prin urmare, vaccinul din invenţie poate fi utilizat pentru tratarea cancerului la pacienţi care sunt A*02 pozitivi, întrucât nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II din cauza pan-legării acestor peptide.

Dacă peptidele A*02 din invenţie sunt combinate cu peptide care se leagă la o altă alelă, de exemplu A*24, un procentaj mai mare din orice populaţie de pacienţi poate fi tratat comparativ cu abordarea oricărei alele de MHC de clasă I singulare. În timp ce în majoritatea populaţiilor, mai puţin de 50% dintre pacienţi pot fi abordaţi printr-o alelă singulară, un vaccin care conţine epitopi de HLA-A*24 şi HLA-A*02 poate trata cel puţin 60% dintre pacienţi din orice populaţie relevantă. În mod specific, următoarele procentaje de pacienţi vor fi pozitive pentru cel puţin una dintre aceste alele în diferite regiuni: SUA 61%, Europa de Vest 62%, China 75%, Coreea de Sud 77%, Japonia 86% (calcule de pe www.allelefrequencies.net).

Într-o realizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.

Secvenţa nucleotidică ce codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele care fac subiectul acestei invenţii sunt asamblate pornind de la fragmente ADNc şi liganzi scurţi oligonucleotidici sau de la serii de oligonucleotide, care asigură o genă sintetică capabilă de a fi exprimată într-o unitate de transcriere recombinantă care conţine elemente regulatoare derivate dintr-un operon microbian sau viral.

Aşa cum se utilizează aici, termenul „o codificare (sau codare) cu nucleotide pentru o peptidă» se referă la o codificare cu o secvenţă de nucleotide pentru peptidă care include coduri de start şi stop artificiale (făcute de om) compatibile pentru sistemul biologic pentru care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR.

Aşa cum este utilizată aici, referirea la o secvenţă de acid nucleic include atât acid nucleic monocatenar, cât şi acid nucleic dublu-catenar. Astfel, de exemplu pentru ADN, secvenţa specifică, dacă contextul nu indică altminteri, se referă la ADN-ul monocatenar al secvenţei respective, la duplexul respectivei secvenţe cu complementul acesteia (ADN dublu catenar) şi la complementul secvenţei respective.

Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de expresie nativ al genei respective.

Regiunea de codificare poate fi derivată dintr-o genă non-mutantă („normală»), mutantă sau alterată ori poate fi derivată chiar dintr-o secvenţă ADN sau o genă sintetizată în întregime în laborator folosindu-se metode bine cunoscute profesioniştilor din domeniul sintezelor ADN.

Termenul „produs de exprimare» se referă la polipeptida sau proteina care reprezintă produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalenţi de codificare a secvenţei de acid nucleic rezultaţi din degenerarea codului genetic care, astfel, codifică aceiaşi aminoacizi.

Termenul „fragment», atunci când se referă la o secvenţă de codificare, înseamnă o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine, în principal, aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.

Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN, sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei construcţii ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manipularea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.

Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care se poate împerechea cu o monocatenă ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unei catene de dezoxiribonucleotide.

Termenul „promotor» se referă la o regiune ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcrierea.

Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.

Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene, dezvăluite în conformitate cu prezenta invenţie, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, este inclusă în mod special o polipeptidă revendicată care are o puritate de, preferabil, 99,999%, sau cel puţin 99,99% sau 99,9%; sau chiar şi 99% ca greutate sau mai mare.

Produsele de exprimare a acizilor nucleici şi polipeptidelor descrise conform prezentei invenţii, precum şi vectorii de exprimare care conţin aceşti acizi nucleici şi/sau aceste polipeptide pot fi în „formă îmbogăţită». În accepţiunea documentului, termenul „îmbogăţit» se referă la faptul că materialul respectiv este în concentraţie de cel puţin 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), mai avantajos 0,01% masic, preferabil cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezentul brevet pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată. Termenul „fragment activ» se referă la un fragment, de obicei o peptidă, o polipeptidă sau o secvenţă de acid nucleic, care generează un răspuns imunitar (adică, are activitate imunogenă) la administrare, singur sau, opţional, alături de un adjuvant adecvat, unui animal, cum ar fi de exemplu un mamifer, ca de exemplu un iepure sau cobai, dar care include si un om, răspunsul imunitar putând lua forma unui răspuns de stimulare a celulelor T în cadrul animalului primitor, cum ar fi omul. Alternativ, termenul „fragment activ» se poate utiliza pentru inducerea unui răspuns celular T in vitro.

În accepţiunea prezentului document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt folosiţi în raport cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de resturi, cum ar fi resturi de aminoacid, care secvenţă formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt folosiţi în raport cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produse obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleazele uzuale.

În accepţiunea prezentului brevet, termenul de „identitate procentuală» sau „procentaj identic», cu referire la o secvenţă, presupune că o secvenţă este comparată cu o secvenţă patentată sau descrisă după alinierea secvenţei care se compară („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau patentată („secvenţă de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule:

identitate procentuală = 100 [1-(C/R)]

unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care

(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi (ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi (iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe;

(iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.

Dacă există un aliniament între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată anterior este aproximativ egală cu, sau mai mare decât o identitate procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are o identitate procentuală minimă specificată cu secvenţa de referinţă, deşi pot exista aliniamente pentru care anterior-menţionata identitate procentuală să fie mai mică decât identitatea procentuală specificată.

După cum s-a menţionat mai sus, prezenta invenţie se referă, prin urmare, la peptida constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 9 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia pentru utilizare în medicină. Peptida pentru utilizare din invenţie are capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I.

În prezenta invenţie, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (consultaţi secţiunea „Identitate procentuală» de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. Anterior menţionata „omologie» se stabileşte prin compararea a două secvenţe aliniate in condiţii optime cu secvenţele care vor trebui comparate. O astfel de omologie a secvenţei se poate calcula prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programe de analiză a secvenţei disponibile în mod obişnuit, mai specific Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente sunt furnizate de baze de date publice.

Desigur, peptida pentru utilizare în conformitate cu prezenta invenţie are capacitatea să se lege de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I sau II. Legarea unei peptide sau a unei variante la un complex MHC poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

De preferat, atunci când celulele T specifice pentru o peptidă pentru utilizare în conformitate cu prezenta invenţie faţă de peptide substitute, concentraţia de peptide la care peptidele substituite ating jumătate din creşterea maximă a lizei comparativ cu fundalul este mai mică de 1 mM, preferabil nu depăşeşte 1 μM, şi mai preferabil nu depăşeşte 1 nM, cel mai preferabil nu depăşeşte 100 pM şi în mod ideal nu depăşeşte 10 pM. Este de asemenea de preferat ca peptida substituită să fie recunoscută de celule T provenind de la mai mulţi indivizi, preferabil doi, dar, şi mai preferabil, trei indivizi.

Într-o realizare a prezentei invenţii, peptida pentru utilizare face parte dintr-o proteină de fuziune care conţine cei 80 aminoacizi N-terminali ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (p33, următoarea „Ii») derivaţi din NCBI, număr de identificare GenBank X00497. În alte fuziuni, peptidele pentru utilizare din prezenta invenţie pot fi fuzionate la un anticorp aşa cum este descris aici, sau o parte funcţională a acestuia, în special într-o secvenţă a unui anticorp, astfel încât să fie direcţionate în mod specific de respectivul anticorp, sau, de exemplu, către sau într-un anticorp care este specific pentru celulele dendritice descrise în acest document.

În plus, peptida entru utilizare poate include legături non-peptidice.

Într-o legătură peptidică inversată, reziduurile aminoacidice nu sunt unite prin legături peptidice (-CO-NH-), ci legătura peptidică este inversată. Astfel de retro-inverso peptido-mimetice se pot obţine utilizând metodele cunoscute în literatura de specialitate, cum ar fi de exemplu cele descrise în Meziere et al. (1997) (Meziere et al., 1997). Această abordare implică sinteza de pseudopeptide care conţin modificări care implică scheletul şi nu orientarea lanţurilor secundare. Meziere et al. (Meziere et al. 1997) arată că aceste pseudopeptide sunt utile pentru legarea MHC şi răspunsurile celulelor T helper. Peptidele retro-inversate, care conţin legături NH-CO şi nu legături peptidice CO-NH, sunt mult mai rezistente la proteoliză.

O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, şi -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.

Peptidele care conţin secvenţele descrise mai sus pot fi sintetizate cu ajutorul unor grupări chimice suplimentare prezente la capetele amino- sau carboxi-terminale, pentru a îmbunătăţi stabilitatea, biodisponibilitatea şi/sau afinitatea peptidelor. De exemplu, grupările hidrofobe, cum ar fi carbo-benzoxil, dansil sau T-butil-oxi-carbonil pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal. Similar, o grupare acetil sau o grupare 9-fluorenil-metoxi-carbonil se poate plasa la capătul amino-terminal al peptidei. În plus, grupările hidrofobe, cum ar t-butil-oxi-carbonil, sau o grupare amido- pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal.

Mai mult, peptidele descrise pot fi sintetizate în funcţie de configuraţia lor sterică. De exemplu, se poate utiliza izomerul D al unuia sau mai multor resturi de aminoacid peptidic în locul izomerului L uzual. Ba chiar mai mult, cel puţin unul dintre resturile de aminoacid al peptidei invenţiei poate fi substituit cu unul dintre resturile de aminoacid cunoscute, care nu apar în mod natural. Alterări de tipul acestora pot ajuta la creşterea stabilităţii, biodisponibilităţii şi/sau legării peptidelor care fac obiectul invenţiei.

În general, peptidele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile de acid amino) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lukas et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacizi sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosind proceduri care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic şi izotin-test. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (a se vedea, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004 şi referinţele citate în acest document).

Acidul trifluoroacetic este îndepărtat prin evaporare in vacuo, cu triturarea ulterioară cu dietileter, care duce la formarea peptidei brute. Toate substanţele de curăţare prezente sunt eliminate printr-o procedură simplă de extragere, care, după liofilizare în fază apoasă, conduce la peptida brută fără substanţe de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, de la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).

Purificarea poate fi realizată prin una sau mai multe tehnici, precum recristalizarea, cromatografia cu excludere dimensională, cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu interacţiune hidrofobă şi (de regulă) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, folosind, de exemplu, separare în gradient de acetonitril/apă.

Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.

Pentru a selecta peptide supraprezentate, se calculează un profil de prezentare arătând prezentarea mediană a probei, precum şi variaţia replicării. Profilul juxtapune probe ale entităţii tumorale de interes pentru o linie de bază a probelor de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de supraprezentare, calculându-se valoarea p a unui model liniar cu efecte combinate (Pinheiro et al., 2015), care se ajustează pentru testarea multiplă prin rata de descoperire falsă (Benjamini şi Hochberg, 1995) (conform Exemplului 1).

Pentru identificarea şi cuantificarea relativă a liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, moleculele HLA din probele de ţesut îngheţat prin şoc au fost purificate şi peptidele asociate cu HLA au fost izolate. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente online de nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) prin cromatografie de lichid-spectrometrie de masă (LC-MS). Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a peptidelor asociate tumorilor (TUMAP) naturale înregistrate din probe de cancer esofagian (N = 16 probe A*02-pozitive) cu modele de fragmentare ale peptidelor de referinţă sintetice corespunzătoare ale secvenţelor identice. Deoarece peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA ale tumorilor primare, aceste rezultate furnizează dovezi directe pentru procesarea şi prezentarea naturale ale peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar obţinut de la 16 paciente cu cancer esofagian.

Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (vezi, de exemplu, US 2013-0096016) permite identificarea şi selectarea candidaţilor relevanţi pentru vaccinare cu peptide supraprezentate pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide HLA-restricţionate pe ţesuturile canceroase comparativ cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără etichete utilizându-se datele LC-MS obţinute, procesate de un pipeline patentat de analiză a datelor, combinându-se algoritmi pentru identificarea secvenţelor, gruparea spectrală, numărarea ionilor, alinierea timpului de retenţie, deconvoluţia de stare a încărcării şi normalizarea.

Au fost stabilite nivelurile de prezentare, inclusiv estimările de eroare pentru fiecare peptidă şi probă. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesuturi tumorale şi peptide supraprezentate în tumoră faţă de ţesuturi şi organe necanceroase.

Complexele HLA-peptidă din probe de ţesut de cancer esofagian au fost purificate şi peptidele HLA-asociate au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate peptidele TUMAP conţinute în prezenta aplicaţie au fost identificate cu această abordare pe probe de cancer esofagian primar, confirmându-se prezentarea acestora pe cancer esofagian primar.

Peptidele TUMAP identificate pe mai multe ţesuturi de cancer esofagian şi ţesuturi normale au fost cuantificate utilizându-se numărarea de ioni la datelor LC-MS fără etichete. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide se corelează cu abundenţa sa în probă. Toate semnalele cantitative ale unei peptide în diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, mediate per probă şi fuzionate într-o diagramă de bare, denumită profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în baza de date cu proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia de stare de încărcare (decompresie) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.

În plus faţă de supraprezentarea peptidei, a fost testată exprimarea ARNm-ului genei de bază. Datele despre ARNm au fost obţinute prin analize RNASeq ale ţesuturilor normale şi ale ţesuturilor canceroase (vezi Exemplul 2). O sursă suplimentară de date privind ţesuturile normale a fost o bază de date cu date de exprimare a ARN-ului disponibilă public din aproximativ 3000 de probe de ţesut normal (Lonsdale, 2013). Peptide care sunt derivate din proteine al căror ARNm de codificare este foarte exprimat în ţesutul canceros, dar foarte scăzut sau absent în ţesuturi normale vitale, au fost incluse de preferinţă în prezenta invenţie.

Mai mult, pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2 permite o cuantificare absolută directă a nivelurilor de peptide MHC-restricţionate, de preferinţă HLA-restricţionate, pe ţesuturi de cancer sau alte ţesuturi infectate. Pe scurt, numărul total de celule a fost calculat din conţinutul total de ADN al probei de ţesut analizate. Cantitatea totală de peptidă pentru un TUMAP într-o probă de ţesut a fost măsurată prin nanoLC-MS/MS ca raport între TUMAP-ul natural şi o cantitate cunoscută dintr-o versiune marcată cu izotop de TUMAP, aşa-numitul standard intern. Eficacitatea izolării TUMAP-urilor a fost determinată prin îmbogăţirea complexelor peptidă:MHC ale tuturor TUMAP-urilor selectate în lizatul de ţesut în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor şi detectarea lor prin nanoLC-MS/MS după finalizarea procedurii de izolare a peptidei. Numărul total de celule şi cantitatea de peptidă totală au fost calculate din măsurători triplicate pentru fiecare probă de ţesut. Eficienţele izolării specifice peptidei au fost calculate ca medie din 10 experimente cu îmbogăţire, măsurate fiecare ca triplicat (vezi Exemplul 6 şi Tabelul 2).

Prezenta invenţie furnizează o peptidă care pentru utilizarea în tratarea cancerelor/tumorilor, de preferinţă cancer esofagian care supraprezintă sau prezintă exclusiv peptida pentru utilizare din invenţie. Spectrometria de masă a arătat că peptida este prezentată în mod natural de moleculele HLA pe probe de cancer esofagian uman primar.

S-a constatat că gena-/proteinele-sursă (denumite, de asemenea, „proteine de lungime completă» sau „proteine subiacente») din care se derivă peptidele sunt foarte supraexprimate în cancer comparativ cu ţesuturile normale - „ţesuturi normale», în raport cu această invenţie, înseamnă celule tisulare esofagiene sănătoase sau alte celule tisulare normale care demonstrează un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă (a se vedea Exemplul 2). Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în raport cu această invenţie, înseamnă o probă de la o pacientă care suferă de cancer esofagian -, însă nu şi pe ţesuturi normale (a se vedea Exemplul 1).

Peptidele legate de HLA se pot recunoaşte de către sistemul imunitar, în special de limfocite T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA-peptidă recunoscut, de exemplu celulele de cancer esofagian care prezintă peptidele derivate.

Peptida pentru utilizare din prezenta invenţie s-a dovedit a fi capabilă să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau este supraprezentată şi astfel pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, cum ar fi sTCR-uri solubile, conform prezentei invenţii (a se vedea Exemplul 3, Exemplul 4). Mai mult, complexul format de peptide cu MHC-ul respectiv poate fi folosit şi pentru producţia de anticorpi specifici şi/sau TCR, în particular sTCR, în conformitate cu prezenta invenţie. Metodele respective sunt bine cunoscute de experţii în domeniu şi pot fi găsite şi în literatura de specialitate respectivă. Astfel, peptida pentru utilizare din prezenta invenţie este utilă pentru generarea unui răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imunitar la pacient se poate induce prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursor adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) pacientului, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea. Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei invenţii nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.

Prezenta descriere se referă şi la receptori de celule T (TCR-uri) care cuprind un lanţ alfa şi un lanţ beta („TCR-uri alfa/beta»). Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă pentru exprimarea TCR-urilor şi peptidelor din prezenta descriere, precum şi la metodele de utilizare ale acestora.

Termenul „receptor de celule T» (prescurtat TCR) se referă la o moleculă heterodimerică cuprinzând un lanţ polipeptidic alfa (lanţ alfa) şi un lanţ polipeptidic beta (lanţ beta), în care receptorul heterodimeric este capabil să se lege cu un antigen peptidic prezentat de o moleculă HLA. Termenul include, de asemenea, aşa-numitele TCR-uri gamma/delta.

Într-una dintre concretizări, descrierea oferă o metodă de producere a unui TCR aşa cum este descris aici, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă capabile să exprime TCR-ul în condiţii adecvate pentru promovarea exprimării TCR.

Descrierea într-un alt aspect se referă la metode în conformitate cu descrierea în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen sau antigenul este încărcat pe terameri MHC de clasă I prin tetramerizarea monomerilor complexului antigen/MHC de clasă I.

Lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor alfa/beta şi lanţurile gamma şi delta ale TCR-urilor gamma/delta sunt considerate, în general, ca având fiecare două „domenii», respectiv domenii variabile şi constante. Domeniul variabil constă într-o concatenare a regiunii variabile (V) şi a regiunii de unire (J). Domeniul variabil poate include, de asemenea, o regiune lider (L). Lanţurile beta şi delta pot include, de asemenea, o regiune de diversitate (D). Domeniile constante alfa şi beta pot include, de asemenea, domenii transmembranare C-terminale (TM) care ancorează lanţurile alfa şi beta la membrana celulară.

În ceea ce priveşte TCR-urile gamma/delta, termenul „domeniu variabil TCR gamma», aşa cum este utilizat aici, se referă la concatenarea regiunii TCR gamma V (TRGV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR gamma J (TRGJ), iar termenul „domeniu constant TCR gamma» se referă la regiunea TRGC extracelulară sau la o secvenţă TRGC trunchiată C-terminal. În mod similar, termenul „domeniu variabil TCR delta» se referă la concatenarea regiunii TCR delta V (TRDV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), iar termenul „domeniu constant TCR delta» se referă la regiunea TRDC extracelulară sau la o secvenţă TRDC trunchiată C-terminal.

TCR-urile din prezenta descriere se leagă de preferinţă la un complex de molecule peptidice-HLA cu o afinitate de legare (KD) de aproximativ 100 µM sau mai puţin, de aproximativ 50 µM sau mai puţin, de aproximativ 25 µM sau mai puţin ori de aproximativ 10 µM sau mai puţin. Mai preferate sunt TCR-urile cu afinitate ridicată care au afinităţi de legare de aproximativ 1 µM sau mai puţin, de aproximativ 100 nM sau mai puţin, de aproximativ 50 nM sau mai puţin, de aproximativ 25 nM sau mai puţin. Exemple nelimitatoare de afinitate de legare preferate pentru TCR-urile prezentei invenţii includ: de la aproximativ 1 nM până la aproximativ 10 nM; de la aproximativ 10 nM până la aproximativ 20 nM; de la aproximativ 20 nM până la aproximativ 30 nM; de la aproximativ 30 nM până la aproximativ 40 nM; de la aproximativ 40 nM până la aproximativ 50 nM; de la aproximativ 50 nM până la aproximativ 60 nM; de la aproximativ 60 nM până la aproximativ 70 nM; de la aproximativ 70 nM până la aproximativ 80 nM; de la aproximativ 80 nM până la aproximativ 90 nM; şi de la aproximativ 90 nM până la aproximativ 100 nM.

Aşa cum este utilizat aici în legătură cu TCR-urile din prezenta descriere, „legare specifică» şi variante gramaticale ale acestei sintagme sunt utilizate pentru a desemna un TCR care are o afinitate de legare (KD) pentru un complex molecular peptidă-HLA de 100 µM sau mai puţin.

TCR-uri alfa/beta heterodimerice din prezenta descriere pot avea o legătură disulfurică introdusă între domeniile lor constante. TCR-urile preferate de acest tip le includ pe cele care au o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, cu excepţia faptului că Thr 48 din TRAC şi Ser 57 din TRBC1 sau TRBC2 sunt înlocuite cu reziduuri de cisteină, cisteinele menţionate formând o legătură disulfurică între secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului.

Cu sau fără legătura între lanţuri introdusă menţionată mai sus, TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descriere pot avea o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, iar secvenţa de domeniu constant TRAC şi de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului poate fi legată de legătura disulfurică nativă dintre Cys4 din exonul 2 al TRAC şi Cys2 din exonul 2 al TRBC1 sau TRBC2.

TCR-urile din prezenta descriere pot cuprinde o etichetă detectabilă aleasă din grupul constând dintr-un radionuclid, un fluorofor şi biotină. TCR-urile din prezenta descriere pot fi conjugate cu un agent activ terapeutic, cum ar fi un radionuclid, un agent chimioterapeutic sau o toxină.

Într-una dintre concretizări, un TCR din prezenta descriere care are cel puţin o mutaţie în lanţul alfa şi/sau cel puţin o mutaţie în lanţul beta a modificat glicozilarea în comparaţie cu TCR-ul fără mutaţie.

În altă concretizare, un TCR cuprinzând cel puţin o mutaţie în lanţul alfa TCR şi/sau lanţul beta TCR are o afinitate de legare pentru şi/sau o semiviaţă de legare pentru un complex de molecule peptidă-HLA care este cel puţin dublu faţă de un TCR cuprinzând lanţul alfa TCR fără mutaţie şi/sau lanţul beta TCR fără mutaţie. Creşterea afinităţii TCR-urilor specifice tumorii şi exploatarea acesteia se bazează pe existenţa unei ferestre pentru afinităţi optime ale TCR-urilor. Existenţa unei astfel de ferestre se bazează pe observaţii conform cărora TCR-urile specifice pentru agenţii patogeni cu HLA-A2-restricţionaţi au valori KD care sunt în general de aproximativ 10 ori mai mici în comparaţie cu TCR-uri specifice pentru autoantigenii asociaţi tumorii HLA-A2-restricţionate. Este cunoscut acum că, deşi antigenii tumorali au potenţialul de a fi imunogeni, deoarece tumorile apar din propriile celule ale individului, numai proteinele cu mutaţie sau proteinele cu procesare translaţională modificată vor fi văzute ca străine de către sistemul imunitar. Antigenii care sunt reglaţi în sens crescător sau supraexprimaţi (aşa-numiţii autoantigeni) nu vor induce neapărat un răspuns imun funcţional împotriva tumorii: Celulele T care exprimă TCR-uri foarte reactive la aceşti antigeni au fost selectate negativ în timus într-un proces cunoscut sub numele de toleranţă centrală, ceea ce înseamnă că rămân doar celulele T cu TCR-uri cu afinitate scăzută pentru autoantigeni.

Într-unul dintre aspecte, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descriere, acizii nucleici care codifică lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta din prezenta descriere sunt clonaţi în vectori de exprimare, de exemplu gamma-retrovirus sau gamma-lentivirus. Virusurile recombinante sunt generate şi apoi testate pentru funcţionalitate, cum ar fi specificitatea antigenică şi aviditatea funcţională. O parte alicotă a produsului final este apoi utilizată pentru a transduce populaţia de celule T ţintă (în general purificată din PBMC-urile pacientului), care este extinsă înainte de perfuzare în pacient.

Într-un alt aspect, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-uri din prezenta descriere, ARN-urile TCR-urilor sunt sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu, de exemplu, cu sisteme de transcripţie in vitro. ARN-urile de TCR sintetizate in vitro sunt apoi introduse în celulele T CD8 + primare obţinute de la donatori sănătoşi prin electroporare pentru a reexprima lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta specifice tumorii.

Pentru a creşte exprimarea, acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descriere pot fi legaţi în mod operaţional cu promotori puternici, cum ar fi repetiţiile terminale lungi retrovirale (LTR-uri), citomegalovirusul (CMV), virusul celulelor stem murine (MSCV) U3, fosfogliceratul kinazic (PGK) , ꞵ-actina, ubiquitina şi un promotor compus de virus simian 40 (SV40)/CD43, factorul de alungire (EF)-1a şi promotorul de virus formator de focar splenic (SFFV). Într-o concretizare preferată, promotorul este heterolog cu acidul nucleic exprimat.

În afară de promotori puternici, casetele de exprimare a TCR-urilor din prezenta descriere pot conţine elemente suplimentare care pot îmbunătăţi exprimarea transgenică, inclusiv un tract polipurinic central (cPPT), care promovează translocarea nucleară a construcţiilor lentivirale (Follenzi et al., 2000), şi elementul de reglare post-transcripţional al virusului hepatitei marmotei (wPRE), care creşte nivelul de exprimare transgenică prin creşterea stabilităţii ARN-ului (Zufferey et al., 1999).

Lanţurile alfa şi beta ale unui TCR din prezenta invenţie pot fi codificate de acizi nucleici localizaţi în vectori separaţi sau pot fi codificate de polinucleotide localizate în acelaşi vector.

Realizarea unei exprimări de suprafaţă de nivel ridicat a TCR-urilor necesită ca atât lanţurile TCR-alfa, cât şi lanţurile TCR-beta ale TCR-urilor introduse să fie transcrise la niveluri ridicate. Pentru a realiza acest lucru, lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta din prezenta descriere pot fi clonate în construcţii bi-cistronice într-un singur vector, care s-a dovedit a fi capabil să depăşească acest obstacol. Utilizarea unui loc viral de intrare intra-ribozomal (IRES) între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta are ca rezultat exprimarea coordonată a ambelor lanţuri, deoarece lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta sunt generate dintr-o singură transcriere care este scindată în două proteine în timpul translaţiei, asigurându-se producerea unui raport molar egal al lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta. (Schmitt et al. 2009).

Acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descriere pot fi optimizaţi cu codoni pentru a creşte exprimarea de la o celulă-gazdă. Redundanţa în codul genetic permite codificarea unor aminoacizi de către mai mulţi codoni, însă anumiţi codoni sunt mai puţin „optimi» decât alţii din cauza disponibilităţii relative a ARNt-urilor corespondente, precum şi a altor factori (Gustafsson et al., 2004). Modificarea secvenţelor de gene TCR-alfa şi TCR-beta astfel încât fiecare aminoacid să fie codificat de codonul optim pentru exprimarea genelor de mamifere, precum şi eliminarea motivelor de instabilitate a ARNm-ului sau a locurilor de îmbinare criptice, s-a dovedit că îmbunătăţeşte semnificativ exprimarea genelor TCR-alfa şi TCR-beta (Scholten et al., 2006).

Mai mult, împerecherea greşită între lanţurile de TCR-uri introduse şi endogene poate cauza dobândirea de specificităţi care prezintă un risc semnificativ pentru autoimunitate. De exemplu, formarea de dimeri de TCR-uri mixte poate reduce numărul de molecule CD3 disponibile pentru formarea de complexe TCR împerecheate corespunzător şi, prin urmare, poate scădea semnificativ aviditatea funcţională a celulelor care exprimă TCR-ul introdus (Kuball et al., 2007).

Pentru a reduce împerecherea greşită, domeniul C-terminal al lanţurilor TCR introduse din prezenta descriere poate fi modificat pentru promovarea afinităţii între lanţuri, reducând totodată capacitatea lanţurilor introduse de a se împerechea cu TCR-ul endogen. Aceste strategii pot include înlocuirea domeniilor TCR-alfa şi TCR-beta C-terminale umane cu omologii lor murini (domeniul C-terminal murinizat); generarea unei a doua legături de disulfură între lanţuri în domeniul C-terminal prin introducerea unui al doilea reziduu de cisteină atât în lanţurile TCR-alfa, cât şi în lanţurile TCR-beta ale TCR-ului introdus (modificare a cisteinei); schimbarea între ele a reziduurilor care interacţionează în domeniile C-terminale ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta („buton în gaură»); şi fuzionarea domeniilor variabile ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta direct cu CD3ζ (fuziune CD3ζ). (Schmitt et al. 2009).

Într-una dintre concretizări, o celulă-gazdă este modificată pentru a exprima un TCR al prezentei descrieri. În concretizările preferate, celula-gazdă este o celulă T umană sau un progenitor de celule T. În unele concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un pacient cu cancer. În alte concretizări, celula T sau progenitorul celulei T este obţinut de la un donator sănătos. Celulele-gazdă din prezenta descriere pot fi alogene sau autologe în raport cu un pacient care urmează să fie tratat. Într-una dintre concretizări, gazda este o celulă T gamma/delta transformată pentru a exprima un TCR alfa/beta.

O „compoziţie farmaceutică» este compoziţie potrivită pentru administrarea la o fiinţă umană într-un cadru medical. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă conform recomandărilor GMP.

Compoziţiile farmaceutice conţin peptidele fie în forma liberă fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (a se vedea mai sus). În accepţiunea prezentului document, „sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic» se referă la un derivat al peptidei menţionate în care peptida este modificată prin formarea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide sunt preparate din baza liberă (de obicei, în forma neutră, medicamentul are un grup -NH2 neutru) implicând reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru pregătirea sărurilor acide includ atât acizi organici (de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartaric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metansulfonic, acid etansulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi alţii asemenea lor). cât şi acizi anorganici, cum ar fi acidul clorhidric, acidul bromhidric, acidul sulfuric, acidul azotic, acidul fosforic şi alţii asemenea lor. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.

Într-o concretizare preferată în mod special, compusul farmaceutic cuprinde peptidele sub forma unor săruri de acid acetic (acetaţi), trifluor-acetaţi sau săruri de acid clorhidric (cloruri).

Preferabil, medicamentul pentru utilizare din prezenta invenţie este unul imunoterapeutic, de exemplu un vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau administrat pe cale sistemică, i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. sau aplicat ex vivo celulelor preluate de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt apoi administrate pacientului sau utilizate in vitro pentru selectarea unei subpopulaţii de celule imune derivate de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. Dacă acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citochine imunostimulatoare, cum este interleukina 2. Peptida poate fi substanţial pură sau combinată cu un adjuvant stimulator imun (vezi mai jos) ori poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145 şi (Longenecker et al.1993)). Peptida poate fi, de asemenea, ţintită, o proteină de fuziune sau o moleculă hibridă. Se anticipează că peptidele a căror secvenţă este furnizată în prezenta invenţie vor stimula celule T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa celulelor T helper CD4. În consecinţă, pentru epitopii MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul sau secţiunile de fuziune ale unei molecule hibride furnizează în mod adecvat epitopi care stimulează celule T CD4-pozitive. Epitopii care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine-cunoscuţi în domeniu şi includ pe cei identificaţi în prezenta invenţie.

Într-unul dintre aspecte, vaccinul pentru utilizare cuprinde cel puţin o peptidă care are secvenţa de aminoacizi prezentată SEQ ID NO. 9 şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă două până la 50, mai preferabil două până la 25, chiar mai preferabil două până la 20 şi cel mai preferabil două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece, paisprezece, cincisprezece, şaisprezece, şaptesprezece sau optsprezece peptide. Peptida(ele) poate (pot) fi preluată(e) din unul sau mai multe TAA specifice şi se pot lega de molecule MHC de clasă I.

Un alt aspect al invenţiei furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă pentru utilizare din invenţie. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora, în helix simplu şi/sau dublu sau în forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotidele cu bază de fosforotioat şi poate conţine sau nu introni, cu condiţia să codifice pentru peptidă. Desigur, numai peptidele care conţin resturi de aminoacid existente în mod natural şi unite prin legături peptidice care apar în mod natural sunt codificabile de o polinucleotidă. Un alt aspect al invenţiei constă în furnizarea unui vector de expresie care exprimă o peptidă pentru utilizare conform invenţiei.

Au fost dezvoltate mai multe metode de legare a polinucleotidelor, în special a ADN-ului, de vectori, de exemplu, prin terminale coezive complementare. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul ADN sunt apoi unite prin punţi de hidrogen între cozile complementare homopolimer pentru a forma molecule ADN recombinate.

Agenţii de legătură sintetici care conţin unul sau mai multe situri limitative oferă o modalitate alternativă de alăturare a segmentelor ADN la vectori. Agenţii de legare care conţin o varietate de situri de endonucleaze de restricţie sunt disponibili comercial de la mai multe surse, dintre care amintim pe International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SUA.

O metodă preferabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida invenţiei utilizează reacţia de polimerază în lanţ descrisă de Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Această metodă poate fi utilizată pentru introducerea ADN-ului într-un vector potrivit, de exemplu prin implementarea în locaţii cu restricţii adecvate sau poate fi utilizată pentru modificarea ADN-ului în alte moduri, după cum este cunoscut în literatura de specialitate. În cazul utilizării unor vectori virali, sunt preferaţi vectorii virus variolic sau adenovirus.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) pot fi apoi exprimaţi într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta invenţiei. Prin urmare, ADN-ul care codifică peptida pentru utilizare din invenţie poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificate corespunzător instrucţiunilor prezente, în vederea construirii unui vector de expresie, care este apoi utilizat pentru transformarea unei celule-gazdă corespunzătoare pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din invenţie. Astfel de tehnici includ cele descrise, de exemplu, în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică peptida pentru utilizare din invenţie poate fi cuplat cu o mare varietate de alte secvenţe ADN pentru introducerea într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi dacă se doreşte integrarea sau întreţinerea episomală.

În general, ADN-ul este inserat într-un vector de expresie, cum ar fi o plasmidă, cu orientarea corectă şi intervalul potrivit de citire pentru expresie. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi corelat cu secvenţele de nucleotide de transcriere şi translaţie corespunzătoare, recunoscute de gazda dorită, cu toate că astfel de controale sunt disponibile în general în vectorul de expresie. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnicile standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selectare implică înglobarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe ADN cu toate elementele de control necesare, care să codifice o trăsătură selectabilă din celula transformată, cum ar fi de exemplu rezistenţa la antibiotic.

Alternativ, gena unei asemenea trăsături selectabile poate fi pe un alt vector, care este folosit pentru a cotransforma celula-gazdă dorită.

Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din cadrul invenţiei sunt apoi cultivate un timp suficient şi în condiţii corespunzătoare, cunoscute celor iniţiaţi, în conformitate cu îndrumările din acest document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.

Sunt cunoscute numeroase sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), drojdii (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule provenite de la insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.

O plasmidă vector tipică din celulă de mamifer pentru expresia constitutivă este compusă din protomerul CMV sau SV40 cu o coadă poli-A adecvată şi un marker de rezistenţă, cum ar fi neomicina. Un exemplu este pSVL, disponibil la Pharmacia, Piscataway, NJ, SUA. Un exemplu de vector de expresie la mamifere inductibil este pMSG, disponibil tot de la Pharmacia. Plasmide-vector utile provenite din drojdii sunt pRS403-406 şi pRS413-416 şi sunt disponibile comercial de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SUA. Plasmidele pRS403, pRS404, pRS405 şi pRS406 sunt plasmide integrative din drojdii (Yeast Integrating plasmids, YIp) şi includ markerii selectabili din drojdii HIS3, TRP1, LEU2 şi URA3. Plasmidele pRS413-416 sunt plasmide centromer provenite din drojdii (Yeast Centromere plasmid, Ycp). Vectorii bazaţi pe stimulenţi CMV (de exemplu de la Sigma-Aldrich) furnizează o expresie tranzitorie sau stabilă, o expresie sau secreţie citoplasmică şi o marcare N-terminală sau C-terminală în diferite combinaţii de FLAG, 3xFLAG, c-myc sau MAT. Aceste proteine de fuziune permit detectarea, purificarea şi analiza proteinei recombinante. Fuziunile marcate dublu oferă flexibilitate la detectare.

Regiunea de reglare promotoare pentru citomegalovirusul uman puternic (CMV) determină creşterea nivelurilor expresiei de proteină constitutivă până la 1 mg/l în celulele COS. Pentru liniile de celule cu potenţial mai mic, nivelurile de proteină sunt în jurul valorii de ~0,1 mg/l. Prezenţa originii de replicare SV40 va conduce la niveluri ridicate de replicare a ADN-ului în celule COS permisive pentru replicarea SV40. Vectorii CMV, de exemplu, pot conţine originea pMB1 (derivată din pBR322) pentru replicare în celule bacteriene, gena b-lactamază pentru selecţia rezistenţei la ampicilină în bacterie, hGH polyA şi originea f1. Vectorii care conţin secvenţa de preprotripsină lider (PPT) pot direcţiona secreţia de proteine de fuziune FLAG în mediul de cultură pentru purificare cu ajutorul anticorpilor ANTI-FLAG, răşinilor şi plăcilor. Ceilalţi vectori şi celelalte sisteme de exprimare sunt bine cunoscute în domeniu pentru că sunt folosite cu o gamă variată de celule-gazdă.

Într-o altă realizare, două sau mai multe peptide aşa cum sunt acestea prezentate sunt codificate şi exprimate astfel în ordine succesivă (similar mărgelelor înşirate pe un fir). Procedând astfel, peptidele sau variantele de peptide pot fi legate sau fuzionate împreună prin benzi de aminoacizi lianţi, cum ar fi de exemplu LLLLLL, sau pot fi legate fără alte peptide suplimentare între ele. Aceste construcţii pot fi utilizate, de asemenea, pentru terapia cancerului şi pot induce răspunsuri imunitare implicând MHC I şi MHC II.

Această invenţie este legată şi de o serie de celule-gazdă transformate cu un vector polinucleotidic, creat în cadrul prezentei invenţii. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Este posibil ca celulele bacteriene să fie celule-gazdă procariote preferate în anumite circumstanţe şi, de regulă, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile E. coli DH5, disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1, disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (No ATCC 31343). Printre celulele-gazdă eucariote se numără celulele de drojdie, insecte şi mamifere, de preferinţă celule de vertebrate precum cele de la şoarece, şobolan, maimuţă sau linii de celule fibroblastice sau de colon umane. Celulele-gazdă provenite din drojdii includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt disponibile în general de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA92037, SUA. Celulele-gazdă preferate provenite de la mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc, disponibile de la ATCC ca CCL61, celulele embrionare de cobai NIH elveţian, NIH/3T3 disponibile de la ATCC ca CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichii de maimuţă disponibile de la ATCC ca CRL 1650 şi celulele 293 care sunt celule embrionare renale umane. Celulele preferate provenite de la insecte sunt celulele Sf9, care pot fi transfectate cu vectori de exprimare a baculovirusului. O prezentare generală a opţiunilor de celule-gazdă adecvate poate fi găsită, de exemplu, în manualul scris de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Partea I, ediţia a doua, ISBN 978-1-58829-262-9 şi în alte lucrări cunoscute în domeniu.

Transformarea celulelor-gazdă adecvate cu un produs ADN obţinut pe baza acestui patent este realizată folosind metode bine cunoscute care depind de obicei de tipul de vector folosit. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, vezi, de exemplu, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) şi (Green and Sambrook, 2012). Transformarea celulelor de drojdii este descrisă în Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metoda lui Beggs (Beggs, 1978) este de asemenea utilă. Referitor la celulele de la vertebrate, reactivii utili în transferul unor astfel de celule, de exemplu, formule pe bază de fosfat de calciu şi DEAE-dextran sau lipozom, sunt disponibili de la Stratagene Cloning Systems sau de la Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD20877, SUA. Electro-permeabilizarea este de asemenea utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este o metodă bine cunoscută pentru transformarea celulelor provenite din drojdii, bacterii, insecte şi a celulelor vertebrate.

Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie ADN din prezenta invenţie, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum este PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.

Se va aprecia că anumite celule-gazdă din cadrul invenţiei sunt utile în pregătirea peptidei pentru utilizare din invenţie, de exemplu celule de bacterii, de drojdii şi de insecte. Totuşi, şi alte celule-gazdă pot fi utile pentru anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi şi ele utile pentru exprimarea peptidei pentru utilizare din invenţie, astfel încât să fie încărcate în moleculele MHC adecvate. Prin urmare, această invenţie prezintă o celulă-gazdă, compusă dintr-un acid nucleic, sau un vector de expresie, conform invenţiei.

Într-o integrare optimă, celula-gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în particular o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. Celulele APC încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă, care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP), sunt în prezent în curs de investigare de către U.S. Food and Drug Administration (FDA) la data de 29 aprilie 2010 pentru tratamentul cancerului de prostată asimptomatic sau minim simptomatic (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Un alt aspect al invenţiei se referă la o metodă de producere a unei peptide pentru utilizare, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Peptida, acidul nucleic sau vectorul de expresie inventat sunt utilizate în medicină. De exemplu, peptida poate fi pregătită pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de administrare injectabilă pentru peptidă sunt s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de administrare injectabilă pentru ADN sunt i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Pot fi date doze de peptidă şi ADN cuprinse, de exemplu, între 50 µg şi 1,5 mg, preferabil între 125 µg şi 500 µg, şi vor depinde de peptida sau ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studii anterioare (Walter et al., 2012).

Polinucleotida utilizată pentru vaccinare activă poate fi substanţial pură sau poate fi conţinută de un vector sau de un sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie dintre acestea. Metodele pentru conceperea şi introducerea unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de (Teufel et al., 2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imunitar nu este pe deplin înţeles. Printre vectorii şi sistemele de livrare adecvate se numără ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, adenovirusuri asociate sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Printre sistemele de livrare nevirale se numără lipide cationice şi polimeri cationici, bine cunoscuţi în domeniul livrării ADN-ului. Se poate folosi administrarea fizică, cum ar fi cea pe calea unui „pistol genic». Peptida sau peptidele codificată(e) de acidul nucleic poate (pot) fi o proteină de fuziune, de exemplu cu un epitop care stimulează celulele T pentru celula CDR opusă respectivă, după cum s-a observat mai sus.

Medicamentul din invenţie poate include şi unul sau mai mulţi adjuvanţi. Adjuvanţii sunt substanţe care ameliorează sau potenţează nespecific răspunsul imunitar (de exemplu, răspunsuri imunitare mediate de celule T CD8-pozitivr şi celule T helper (TH) la un antigen, şi care prin urmare poate fi considerat util în medicamentul din prezenta invenţie. Adjuvanţii adecvaţi includ, dar nu sunt limitaţi la 1018 ISS, săruri de aluminiu, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelină sau liganzi TLR5 derivaţi din flagelină, ligand FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleukine precum IL-2, IL-13, IL-21, interferon alfa sau beta sau derivaţi pegilaţi ai acestuia, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsii apă-în-ulei sau ulei-în-apă, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistem de vectori PepTel®, microparticule pe bază de poli(lactid co-glicolid) [PLG] şi dextran, talactoferină SRL172, virozomi şi alte particule similare virusurilor, YF-17D, capcană VEGF, R848, beta-glucan, Pam3Cys, stimulon Aquila's QS21, care este derivat din saponină, extracte microbacteriene şi imitatoare sintetice ale peretelui celular bacterian şi alţi adjuvanţi patentaţi, cum ar fi Ribi Detox, Quil sau Superfos. Adjuvanţii de tipul Freund sau GM-CSF sunt de preferat. Mai mulţi adjuvanţi imunologici (de exemplu, MF59) specifici pentru celulele dendritice, precum şi prepararea lor, au fost descrişi anterior (Allison şi Krummel, 1995). De asemenea, pot fi utilizate citokine. Mai multe citokine au fost legate direct de influenţarea migrării celulelor dendritice în ţesuturi limfoide (de exemplu, TNF-), accelerând maturarea celulelor dendritice în celule prezentatoare de antigen pentru limfocite T eficace (de exemplu, GM-CSF, IL-1 şi IL-4) (U.S. Pat. No. 5,849,589) şi acţionând ca imunoadjuvanţi (de exemplu, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Oligonucleotidele imunostimulatoare CpG au fost raportate şi ca amelioratoare ale efectelor adjuvanţilor în formulele de vaccin. Fără a fi demonstrat teoretic, oligonucleotidele CpG acţionează prin activarea sistemului imunitar înnăscut (neadaptiv) prin receptori de tip Toll (TLR), în principal TLR9. Activarea TLR9 declanşată prin CpG ameliorează răspunsul umoral şi celular antigen-specific pentru o gamă variată de antigeni, inclusiv antigeni peptidici sau proteici, virus viu sau mort, vaccinuri cu celule dendritice, vaccinuri celulare autologe şi conjugate polizaharidice din vaccinuri profilactice şi terapeutice. Mai important, ameliorează maturizarea şi diferenţierea celulelor dendritice care duce la ameliorarea activării celulelor TH1 şi generarea de limfocite T citotoxice (CTL) puternice, chiar şi în absenţa ajutorului celulelor T CD4. Biasul TH1 indus prin stimularea TLR9 se menţine chiar şi în prezenţa unor adjuvanţi de vaccin cum ar fi alaunul sau adjuvantul Freund incomplet (IFA) care în mod normal promovează biasul TH2. Oligonucleotidele CpG prezintă o activitate adjuvantă chiar mai mare când este formulată sau coadministrată cu alţi adjuvanţi sau în formulări de tip microparticule, nanoparticule, emulsii lipidice sau alte formulări similare, care sunt necesare pentru a induce un răspuns puternic atunci când antigenul este relativ slab. Acestea accelerează şi răspunsul imunitar şi permit dozelor de antigen să fie reduse cu aproximativ două ordine de mărime, cu răspunsuri de tip anticorp comparabile cu vaccinul în doză completă fără CpG conform unor experimente (Krieg, 2006). US 6,406,705 B1 descrie utilizarea combinată de oligonucleotide CpG cu adjuvanţi non-acid nucleic şi un antigen pentru a induce un răspuns imunitar specific antigenului. Un antagonist TLR9 CpG este dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) de la Mologen (Berlin, Germania) care este o componentă preferată din compoziţia farmaceutică a prezentei invenţii. Se pot utiliza şi alte molecule care leagă TLR cum ar fi TLR7, TLR8 şi/sau TLR9 care leagă ARN.

Alte exemple de adjuvanţi utili includ, dar fără a se limita la, celule CpG modificate chimic (de exemplu, CpR, Idera), analogi de ARNdc, cum ar fi Poly(I:C) şi derivaţi ai acestora (de exemplu, AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ADN sau ARN non-CpG bacterian, precum şi molecule mici şi anticorpi imunoactivi, precum ciclofosfamidă, sunitinib, Bevacizumab®, Celebrex, NCX-4016, sildenafil, tadalafil, vardenafil, sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, alţi anticorpi care ţintesc structuri cheie ale sistemului imunitar (de exemplu, receptorul anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-TNF-alfa) şi SC58175, care poate acţiona terapeutic şi/sau ca adjuvant. Cantităţile şi concentraţiile adjuvanţilor şi aditivilor utili în contextul prezentei invenţii se pot determina direct de un profesionist fără a necesita experimente inutile.

Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon alfa, oligonucleotide şi derivaţi de CpG, poli(L:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări sub formă de particule cu PLG sau virozomi.

Într-o formulare preferată a compusului farmaceutic pentru utilizare conform invenţiei, adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon alfa.

În concretizarea preferată a compusului farmaceutic pentru utilizare conform invenţiei adjuvantul este selecţionat dintr-un grup care constă din factori stimulatori ai coloniilor, cum ar fi factorul stimulator al coloniilor de granulocite macrofage (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod şi resiquimod. În formularea preferată a compusului farmaceutic pentru uilizare conform invenţiei, adjuvantul este ciclofosfamidă, imiquimod sau resiquimod. Adjuvanţii şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) şi anticorp monoclonal anti-CD40 sau combinaţii ale acestora.

Această compoziţie este folosită pentru administrare parenterală, cum ar fi subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. Pentru aceasta, peptidele şi opţional alte molecule sunt dizolvate sau in suspensie într-un mediu de transport (transportor) farmacologic acceptabil, preferabil apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi explozivi, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe care stimulează imunitatea, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate, de exemplu, fi preluată din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Compoziţia poate fi folosită pentru prevenirea, profilaxia şi/sau tratamentul bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formule pot fi găsite, de exemplu, în EP2113253.

Este important de înţeles că răspunsul imunitar declanşat de vaccinul pentru utilizare conform invenţiei atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. Mai mult, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care vizează doar una sau câteva ţinte, ceea ce poate determina adaptarea uşoară a tumorii la atac (evadare a tumorii). Mai mult, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorii asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin unele dintre ţinte. Compoziţia este concepută astfel încât fiecare tumoare este de aşteptat să exprime mai mulţi dintre antigeni şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Astfel, vaccinul poate fi „de uz general» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselectare a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi restricţionată la tiparea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerului pentru exprimarea antigenului, dar este totuşi asigurat că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptida pentru utilizare din prezenta invenţie se poate folosi pentru a genera şi a dezvolta anticorpi specifici contra complecşilor MHC/peptidă. Acestea se pot folosi pentru tratament, direcţionarea toxinelor sau substanţelor radioactive către ţesutul bolnav. Un alt uz al acestor anticorpi poate fi ţintirea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Acest uz poate ajuta la depistarea metastazelor mici sau pentru stabilirea dimensiunii şi localizării exacte a ţesutului bolnav.

Prin urmare, un alt aspect al invenţiei este furnizarea unei metode pentru producerea unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman care este complexat cu un antigen HLA-restricţionat, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă respectivul complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman cu o formă solubilă a moleculei MHC de clasă I complexată cu respectivul antigen HLA-restricţionat; izolarea moleculelor ARNm din celulele producătoare de anticorp ale respectivului mamifer non-uman; producerea unei biblioteci de prezentare a fagilor care prezintă molecule de proteină codificate de respectivele molecule ARNm; şi izolarea cel puţin a unui fag din respectiva bibliotecă de prezentare a fagilor, cel puţin un fag care prezintă anticorpul respectiv cu legare specifică la complexul major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I uman complexat cu antigenul HLA-restricţionat menţionat.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific la un complex major de histocompatibilitate (MHC) de clasă I, fiind complexat cu un antigen restricţionat HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.

Metodele respective pentru producerea unor astfel de anticorpi şi complexe majore de histocompatibilitate de clasă I cu catenă unică, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt descrise în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Preferabil, anticorpul se leagă la complex cu o afinitate de legare mai mică de 20 nanomolari, preferabil sub 10 nanomolari, care este, de asemenea, considerată ca fiind „specifică» în contextul prezentei invenţii.

Prezenta invenţie se referă la peptida constând din secvenţa aminoacidică în conformitate cu SEQ ID NO 9 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia pentru utilizare în medicină.

Prezenta invenţie se referă şi la peptida pentru utilizare în conformitate cu invenţia şi care are capacitatea de a se lega la o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) umană de clasă I.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la peptida pentru utilizare în conformitate cu invenţia în care respectiva peptidă include legături non-peptidice.

Prezenta invenţie se referă suplimentar la peptidele în conformitate cu invenţia, în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, care cuprinde aminoacizii N-terminali 80 ai lanţului invariant (Ii) asociat cu antigenul HLA-DR.

O altă concretizare a prezentei invenţii se referă la o peptidă care nu apare în mod natural, în care respectiva peptidă pentru utilizare constă dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 9 şi a fost produsă sintetic (de exemplu, sintetizată) ca o sare acceptabilă farmaceutic. Metodele de producere sintetică de peptide sunt bine cunoscute în domeniu. Sărurile peptidei pentru utilizare în conformitate cu prezenta invenţie diferă în mod substanţial de peptida în starea ei in vivo, întrucât peptida generată in vivo nu este o sare. Forma de sare non-naturală a peptidei mediază solubilitatea peptidei, în special în contextul compoziţiilor farmaceutice care cuprind peptidele pentru utilizare, de exemplu vaccinurile peptidice pentru utilizare descrise în prezentul document. Pentru a furniza în mod eficace peptidele subiectului care trebuie tratat, este necesară o solubilitate suficientă şi cel puţin substanţială a peptidei (peptidelor). De preferinţă, sărurile sunt săruri ale peptidei acceptabile farmaceutic pentru utilizare. Aceste săruri în conformitate cu invenţia includ săruri alcaline şi alcalino-pământoase, cum ar fi sărurile din seria Hofmeister cuprinzând sub formă de anioni PO4 3-, SO4 2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3 -, ClO4 -, I-, SCN- şi de cationi, NH4 +, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ and Ba2+. În special, sărurile sunt alese din (NH4)3PO4, (NH4)2HPO4, (NH4)H2PO4, (NH4)2SO4, NH4CH3COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO4, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO4, RbH2PO4, Rb2SO4, Rb4CH3COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO4, Rb4I, Rb4SCN, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, K2SO4, KCH3COO, KCl, KBr, KNO3, KClO4, KI, KSCN, Na3PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, Na2SO4, NaCH3COO, NaCl, NaBr, NaNO3, NaCIO4, NaI, NaSCN, ZnCI2 Cs3PO4, Cs2HPO4, CsH2PO4, Cs2SO4, CsCH3COO, CsCl, CsBr, CsNO3, CsCIO4, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, LiH2PO4, Li2SO4, LiCH3COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO4, LiI, LiSCN, Cu2SO4, Mg3(PO4)2, Mg2HPO4, Mg(H2PO4)2, Mg2SO4, Mg(CH3COO)2, MgCl2, MgBr2, Mg(NO3)2, Mg(ClO4)2, MgI2, Mg(SCN)2, MnCl2, Ca3(PO4),, Ca2HPO4, Ca(H2PO4)2, CaSO4, Ca(CH3COO)2, CaCl2, CaBr2, Ca(NO3)2, Ca(ClO4)2, CaI2, Ca(SCN)2, Ba3(PO4)2, Ba2HPO4, Ba(H2PO4)2, BaSO4, Ba(CH3COO)2, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)2, Ba(ClO4)2, BaI2 şi Ba(SCN)2. De preferat sunt, în special, acetatul de NH, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, KCl, NaCl şi CaCl2, cum ar fi, de exemplu, sărurile cu clorură sau acetat (trifluoroacetat).

În general, peptidele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între resturile de acid amino) pot fi sintetizate prin modul Fmoc-poliamidă al sintezei peptidelor în stare solidă, după cum se arată în Lukas et al. (Lukas et al., 1981) şi referinţele citate în document. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperidină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în faza solidă este furnizat de un polimer polidimetil-acrilamidă format din cei trei monomeri dimetilacrilamidă (schelet-monomer), bisacriloetilen diamină (agent de legătură) şi acriloilsarcozin-metil-ester (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptidă-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacid sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosindu-se proceduri de testare care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic sau izotină. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Substanţele de curăţare folosite cel mai frecvent includ etan-ditiol, fenol, anisol şi apă, alegerea exactă fiind dependentă de aminoacizii constituenţi ai peptidei sintetizate. De asemenea, pentru sintetizarea peptidelor, se poate utiliza o combinaţie de metode în stare solidă şi în stare de soluţie (a se vedea, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004 şi referinţele citate în acest document).

Prezenta invenţie se referă în continuare la un acid nucleic care codifică peptida pentru utilizare în conformitate cu invenţia.

Prezenta invenţie se referă în continuare la acidul nucleic în conformitate cu invenţia, care este ADN, ADNc, APN, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o peptidă conform prezentei invenţii, un acid nucleic conform prezentei invenţii sau un vector de exprimare conform prezentei invenţii pentru utilizare în medicină, în special în cancerul esofagian.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o celulă-gazdă cuprinzând un acid nucleic conform invenţiei sau un vector conform invenţiei.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la celula-gazdă în conformitate cu prezenta invenţie care este o celulă prezentatoare de antigen şi, preferabil, este o celulă dendritică.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o metodă de producere a unei peptide pentru utilizare în conformitate cu prezenta invenţie, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform prezentei invenţii şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul său de cultură.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu prezenta invenţie în care antigenul este încărcat pe molecule de MHC de clasă I exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta invenţie se referă în continuare la metoda în conformitate cu invenţia în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare care exprimă respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 9.

Prezenta invenţie se referă în continuare la celulele T activate produse prin metoda în conformitate cu prezenta invenţie, în care celulele T menţionate recunosc selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi pentru utilizare în conformitate cu prezenta invenţie.

Este descrisă o metodă de ucidere a celulelor ţintă la un pacient la care celulele ţintă exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând orice secvenţă de aminoacizi conform prezentei invenţii, metoda cuprinzând administrarea pacientului unui număr eficace de celule T în conformitate cu prezenta invenţie.

Este descrisă utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic în conformitate cu prezenta invenţie, a unui vector de exprimare în conformitate cu prezenta invenţie, a unei celule în conformitate cu prezenta invenţie sau a unei limfocite T citotoxice activate în conformitate cu prezenta invenţie ca medicament sau în fabricarea unui medicament.. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu prezenta invenţie, în care respectivul medicament este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este un vaccin. Prezenta invenţie se referă, de asemenea, la o utilizare în conformitate cu invenţia în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta invenţie se referă în continuare la o utilizare în conformitate cu invenţia, în care numitele celule canceroase sunt celule canceroase esofagiene sau alte celule tumorale solide sau hematologice, cum ar fi cele de cancer pulmonar, cancer al vezicii urinare, cancer ovarian, melanom, cancer uterin, cancer hepatocelular, cancer al celulelor renale, cancer cerebral, cancer colorectal, cancer mamar, cancer gastric, cancer pancreatic, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară, cancer prostatic şi leucemie.

Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat aici într-un sens larg şi include anticorpi atât policlonali, cât şi monoclonali. În plus faţă de moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul „anticorpi» sunt incluse, de asemenea, fragmente (de exemplu, fragmente de CDR, Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acelor molecule de imunoglobulină şi versiunile umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atât timp cât acestea manifestă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică a unei (poli)peptide marker de cancer esofagian, livrarea unei toxine într-o celulă de cancer esofagian care exprimă o genă marker de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide marker de cancer esofagian) în conformitate cu invenţia.

Ori de câte ori este posibil, anticorpii invenţiei pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii conform invenţiei pot fi generaţi, de asemenea, folosindu-se metode bine cunoscute. Specialiştii în domeniu vor înţelege că pot fi utilizaţi fie polipeptide markeri de cancer de esofagian de lungime completă, fie fragmente ale acestora pentru generarea anticorpilor în conformitate cu invenţia. O polipeptidă de utilizat pentru generarea unui anticorp al invenţiei poate fi purificată parţial sau complet dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă utilizându-se tehnici cu ADN recombinant.

De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă pentru utilizare conform prezentei invenţii, cum ar fi o peptidă cu SEQ ID NO 9, poate fi exprimat în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau celule eucariote (de exemplu, celule de drojdii, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorpi monoclonali sau policlonali care leagă în mod specific polipeptida marker de cancer esofagian utilizată conform invenţiei.

Un specialist în domeniu va realiza că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea obţinerii unui anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare utilizării sale preconizate (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care anticorpii urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.), pentru îndrumări suplimentare privind generarea şi testarea anticorpilor (vezi, de exemplu, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi în teste ELISA, imunoamprente (Western blots), colorare imunohistochimică a cancerelor fixate cu formalină sau secţiuni de ţesut îngheţat. După caracterizarea iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării diagnostice terapeutice sau in vivo sunt testaţi conform metodelor cunoscute de testare clinică.

Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat aici, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali cuprinzând populaţia sunt identici, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali descrişi în mod specific includ anticorpi „himerici», în care o porţiune din catena grea şi/sau uşoară este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o specie particulară sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul catenei (catenelor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât aceştia prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567).

Anticorpii monoclonali ai invenţiei pot fi generaţi folosindu-se metode de hibridom. Într-o metodă de hibridom, un şoarece sau alt animal-gazdă adecvat este, de obicei, imunizat cu un agent de imunizare pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific la agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.

Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai invenţiei poate fi izolat uşor şi secvenţializat utilizându-se proceduri convenţionale (de exemplu, prin utilizarea probelor oligonucleotidice care sunt capabile să se lege în mod specific la genele codificatoare ale catenelor grele şi uşoare ale anticorpilor murinici).

Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în particular fragmente Fab, poate fi realizată folosindu-se tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată folosindu-se papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaină a anticorpilor produce, de obicei, două fragmente identice de legare la antigen, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul pepsinei generează un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.

Fragmentele de anticorpi, fie că sunt ataşate la alte secvenţe sau nu, pot include de asemenea inserţii, deleţii, substituţii sau alte modificări selectate ale unor regiuni particulare sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau degradată în mod semnificativ faţă de anticorpul nemodificat sau fragmentul de anticorp. Aceste modificări pot furniza unele proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legare la disulfuri, creşterea biolongevităţii, modificarea caracteristicilor secretoare etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legării la domeniul de legare, etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza specifică situsului acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.

Anticorpii conform invenţiei pot cuprinde suplimentar anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, catene de imunoglobulină sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab 'sau alte subsecvente de legare la antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulină non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care resturile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a recipientului sunt înlocuite cu resturi dintr-o CDR a unei specii non-umane (anticorp donor), de exemplu de şoarece, şobolan sau iepure cu specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, resturile de cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu resturi non-umane corespunzătoare. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, resturi care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele de CDR sau de cadru importate. În general, anticorpul umanizat va cuprinde, practic, toate cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile în care toate sau, practic, toate regiunile CDR corespund cu cele ale unei imunoglobuline non-umane şi toate sau, practic, toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe de consens a imunoglobulinelor umane. Anticorpul umanizat optim va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă de imunoglobulină (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.

Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are unul sau mai multe resturi de aminoacid introduse în el dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacid non-umane sunt adesea denumite reziduuri de „import», care sunt, de obicei, luate dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată, practic, prin substituirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de la rozătoare pentru secvenţele corespunzătoare unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care, practic, mai puţin de un domeniu variabil uman intact a fost substituit cu secvenţa corespunzătoare de la o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele resturi CDR şi, posibil, unele resturi FR sunt substituite cu resturi din situsuri analoage în anticorpi de la rozătoare.

Pot fi folosite animale transgenice (de exemplu, şoareci), care sunt capabile, după imunizare, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă. De exemplu, s-a descris că deleţia homozigotă a genei regiunii de legare a catenei grele de anticorp la şoareci mutanţi himeric şi de filiaţie germinală conduce la inhibarea completă a producţiei de anticorpi endogeni. Transferul seriei de gene de imunoglobulină cu filiaţie germinală umană în astfel de şoareci mutanţi cu filiaţie germinală va conduce la producerea de anticorpi umani după provocarea de către un antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare a fagilor.

Anticorpii din invenţie sunt, preferabil, administraţi unui subiect într-un agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. În mod obişnuit, o cantitate adecvată dintr-o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic este utilizată în formulă pentru a face formularea izotonică. Exemplele de agent purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţia salină, soluţia Ringer şi soluţia de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 până la aproximativ 7,5. Agenţii purtători suplimentari includ preparate cu eliberare prelungită, de exemplu matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matricele fiind sub formă de articole formate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Va fi evident pentru persoanele de specialitate din domeniu că anumiţi agenţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie de, de exemplu, calea de administrare şi concentraţia anticorpului care este administrat.

Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzia, care asigură eliberarea sa în sânge într-o formă eficace. De asemenea, anticorpii pot fi administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale pentru a exercita efecte terapeutice locale, precum şi sistemice. Este preferabilă injectarea locală sau intravenoasă.

Dozele şi schemele eficace pentru administrarea anticorpilor pot fi determinate empiric şi realizarea unor astfel de determinări se află în domeniul de specialitate. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorpi care trebuie administrată va varia în funcţie de, de exemplu, subiectul care va primi anticorpul, calea de administrare, de tipul particular de anticorp utilizat şi alte medicamente administrate. O doză zilnică tipică de anticorp utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. După administrarea unui anticorp, preferabil pentru tratarea cancerului esofagian, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către specialiştii în domeniu. De exemplu, mărimea, numărul şi/sau distribuţia cancerului la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate utilizându-se tehnici standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat terapeutic care opreşte creşterea tumorii, are ca rezultat contracţia tumorală şi/sau împiedică dezvoltarea de tumori noi în comparaţie cu evoluţia bolii care ar avea loc în absenţa administrării anticorpului este un anticorp eficace pentru tratamentul cancerului.

Un alt aspect al invenţiei este acela de a furniza o metodă pentru producerea unui receptor de celule T solubil (sTCR) care să recunoască un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori de celule T solubili pot fi generaţi din clone de celule T specifice şi afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile determinante de complementaritate. În scopul selectării receptorilor de celule T, poate fi utilizat o afişare de fagi (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). În scopul stabilizării receptorilor celulelor T în timpul afişării fagilor şi în cazul utilizării practice ca medicament, catena alfa şi catena beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfurice non-native, alte legături covalente (receptor de celulă T cu o singură catenă) sau prin domenii de dimerizare (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (a se vedea, de exemplu, US 2013/0115191), domenii care recrutează celule efectoare precum domeniul anti-CD3, etc. pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. Mai mult, poate fi exprimată în celule T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode pentru producere sunt prezentate în WO 2013/057586A1.

În plus, peptidele şi/sau TCR ori anticorpii sau alte molecule de legare ale prezentei invenţii pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer de la un patolog pe baza unei probe biopsiate.

Anticorpii sau TCR-urile pot fi utilizate, de asemenea, pentru teste diagnostice in vivo. În general, anticorpii sunt etichetaţi printr-o radionucleotidă (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P sau 35S), astfel încât tumora să poată fi localizată folosind imunoscintiografie. Într-una dintre realizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă la domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea de afinitate (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.

Anticorpii pentru utilizare diagnostică pot fi etichetaţi cu sonde adecvate pentru detectarea prin diferite metode imagistice. Metodele pentru detectarea sondelor includ, dar nu se limitează la, fluorescenţă, lumină, microscopie confocală şi electronică; imagistică prin rezonanţă magnetică şi spectroscopie; fluoroscopie, tomografie computerizată şi tomografie cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi cu emisie de pozitron. În plus, probele pot fi bi- sau multifuncţionale şi pot fi detectate folosind una sau mai multe dintre metodele prezentate aici. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea probelor la anticorpi implică ataşarea covalentă a probei, încorporarea probei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea probei, printre alte acţiuni bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, proba de ţesut bolnav poate fi proaspătă sau congelată ori poate fi încorporată în parafină şi fixată cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau încorporată care conţine proba intră în contact cu un anticorp etichetat principal şi cu un anticorp secundar, anticorp folosit pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.

Un alt aspect al acestei invenţii include o metodă in vitro de producere a celulelor T activate, metoda constând în contactarea celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru activarea celulelor T într-un mod specific antigenului, antigenul fiind o peptidă conform invenţiei. Este de preferat să se utilizeze o cantitate suficientă de antigen împreună cu celula prezentatoare a antigenului.

Este de preferat o celulă de mamifer, care are un nivel redus sau inexistent de funcţionare ca transportator de peptidă TAP. Printre celulele adecvate, care nu sunt transportatoare de peptidă TAP se numără celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.

Linia de celule umane T2 deficiente în încărcarea peptidei este disponibilă de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, având Nr. de catalog CRL 1992; linia de celule Drosophila, linia Schneider 2 este disponibilă de la ATCC cu NR. de catalog CRL 19863; linia de celule RMA-S de şoarece este descrisă în Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă în mod substanţial nicio moleculă MHC de clasă I. Este, de asemenea, de preferat ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal de costimulare pentru celule T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroase molecule de MHC de clasă I şi ale moleculelor de costimulator sunt disponibile public în bazele de date GenBank şi EMBL.

În cazul unui epitop MHC de clasă I utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.

Dacă o celulă care prezintă antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitrop, este de preferat ca celula să conţină un vector care exprimă peptida care conţine SEQ. ID NO: 9.

Se pot folosi o serie de alte metode pentru generarea celulelor T in vitro. De exemplu, în generarea CTL pot fi folosite limfocite cu infiltrare tumorală autologe. Piebanski et al. (Piebanski et al., 1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în pregătirea celulelor T. Mai mult, este posibilă producerea de celule T autolog prin pulsarea de celule dendritice cu peptidă sau polipeptidă sau prin infectare cu un virus recombinant. De asemenea, pot fi folosite celule B pentru producerea de celule T autologe. În plus, celule macrofage pulsate cu peptidă sau polipeptidă sau infectate cu virus recombinant pot fi utilizate pentru prepararea de celule T autologe. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descriu pregătirea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta invenţie, celulele aAPC au fost generate prin cuplarea unor complexe de peptide MHC preformate pe suprafaţa unor particule de polistiren (microgranule) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe celulele aAPC, fapt ce permite amplificarea selectivă a răspunsurilor de aviditate ridicată sau scăzută a celulei T specifice antigenului cu eficienţă crescută, din probele de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, celulele aAPC trebuie să poarte alte proteine cu activitate de costimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. Mai mult, astfel de sisteme bazate pe aAPC necesită adesea adăugarea unor factori solubili adecvaţi, de exemplu citokine precum interleukina-12.

Pentru pregătirea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă detaliat în WO 97/26328. De exemplu, pe lângă celulele de Drosophila şi celulele T2, se pot utiliza şi alte celule pentru prezentarea antigenilor, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu bacilovirus, bacterii, drojdii, celule ţintă infectate cu vaccin. În plus, pot fi folosiţi viruşi vegetali (a se vedea, de exemplu, Porta et al. (Porta et al., 1994), care descrie dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata, ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine.)

Celulele T activate, care sunt orientate spre peptida pentru utilizare din invenţie, sunt utile în terapie. Astfel, un aspect suplimentar al invenţiei constă în descrierea celulelor T activate care se pot obţine prin metodele anterior menţionate în această invenţie.

Celulele T activate, care sunt produse de metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă ce conţine o secvenţă de aminoacizi cu SEQ ID NO: 9.

Este de preferat ca celula T să recunoască celula interacţionând prin TCR cu complexul HLA/peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, atunci când pacientului îi este administrat un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi preluate de la pacient şi activate conform descrierii de mai sus (adică sunt celule T autologe). Alternativ, celulele T nu sunt preluate de la pacient, ci de la alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul are o stare generală de sănătate bună, de preferat un sistem imunitar puternic şi, mai bine, nu suferă de nicio boală care să poată fi testată sau detectată.

In vivo, celulele ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei invenţii pot fi celule tumorale (care, uneori, exprimă MHC de clasă II) şi/sau celulele stromale care înconjură tumoarea (celule tumorale) (care, uneori, pot şi ele exprima MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).

Celulele T din prezenta invenţie pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. Astfel, invenţia dezvăluie, de asemenea, o metodă de ucidere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din invenţie, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului, aşa cum s-a arătat mai sus.

Prin „exprimată aberant», inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supra-exprimată în comparaţie cu nivelurile de exprimare pe ţesuturi normale (sănătoase) sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care este derivă tumoarea, însă în tumoare este exprimată. Prin „supraexprimată», inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât în ţesutul normal; de preferat de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât nivelul prezent în ţesutul normal.

Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, precum cele descrise mai sus.

Protocoale pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattioni et al. şi Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Un alt aspect al prezentei invenţii include utilizarea peptidei pentru utilizare complexate cu MHC pentru generarea unui receptor de celule T al cărui acid nucleic este clonat şi introdus într-o celulă gazdă, de preferinţă o celulă T. Această celulă T modificată poate fi transferată unui pacient pentru terapia cancerului.

Toate moleculele din această invenţie, adică peptida pentru utilizare, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula T activată, receptorul celulei T sau acidul nucleic care îl codifică sunt utile pentru tratamentul unor afecţiuni caracterizate de celule care evită un răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta invenţie poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă(e) moleculă(e) din invenţie sau cu o moleculă/molecule cunoscută(e).

Este prezentată un kit care cuprinde:

(a) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descrierii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată; (b) opţional, un al doilea container care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi (c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate. Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat. Trusele prezentate vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată. Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu). La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare. Trusele prezentate pot avea un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus. Preferabil, trusele prezentate includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct. Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor prezentaţi care intră în componenţa trusei. Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat. Deoarece peptida pentru utilizare din invenţie este izolată din cancer esofagian, medicamentul din invenţie este folosit, de preferinţă, pentru tratarea cancerului esofagian. Într-un exemplu de concretizare, peptidele incluse în vaccin sunt identificate prin: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri) prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual; şi (b) selectarea a cel puţin unei peptide identificate de novo la litera (a) şi confirmarea imunogenităţii acesteia. După ce sunt selectate peptidele pentru un vaccin peptidic personalizat, vaccinul este produs. De preferinţă, vaccinul este o formulare lichidă care constă din peptidele individuale dizolvate între 20%-40% DMSO, de preferinţă aproximativ 30%-35% DMSO, de exemplu aproximativ 33% DMSO. Fiecare peptidă care trebuie inclusă într-un produs este dizolvată în DMSO. Concentraţia soluţiilor peptidice unice trebuie aleasă în funcţie de numărul de peptide care trebuie incluse în produs. Soluţiile de peptidă-DMSO individuale se amestecă în părţi egale pentru a se obţine o soluţie care conţine toate peptidele care trebuie incluse în produs cu o concentraţie de ~2,5 mg/ml per peptidă. Soluţia amestecată este apoi diluată la 1:3 cu apă pentru injecţii pentru a se atinge o concentraţie de 0,826 mg/ml per peptidă în 33% DMSO. Soluţia diluată este filtrată folosindu-se un filtru steril de 0,22 µm. Se obţine soluţia vrac finală. Soluţia vrac finală este introdusă în flacoane şi este depozitată la -20°C până în momentul utilizării. Un flacon conţine 700 µl de soluţie care conţine 0,578 mg din fiecare peptidă. Din această cantitate, 500 μl (aproximativ 400 µg per peptidă) vor fi aplicaţi pentru injectare intradermală. Prezenta invenţie va fi descrisă acum în următoarele exemple care arată încorporările preferate ale acesteia şi cu referire la figurile însoţitoare, fără a fi totuşi limitată la acestea.

FIGURI

Figurile 1A-1V arată supraprezentarea diverselor peptide în ţesuturi normale (barele albe) şi cancer esofagian (barele negre). A) Simbol genă KRT14/KRT16, Peptidă: STYGGGLSV (SEQ ID NO: 1) Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 8 artere, 5 măduve osoase, 7 creiere, 5 sâni, 2 cartilaje, 1 nerv central, 13 colonuri, 1 duoden, 2 vezici biliare, 5 inimi, 14 rinichi, 21 ficaţi, 44 plămâni, 4 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 8 pancreasuri, 5 nervi periferici, 1 peritoneu, 3 glande hipofizare, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 recturi, 7 glande salivare, 4 muşchi scheletici, 6 piei, 2 intestine subţiri , 4 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 3 timusuri, 3 glande tiroidiene, 7 trahee, 2 uretere, 6 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 6 esofage, 16 probe de cancer esofagian. Peptida a fost detectată suplimentar pe 4/91 cancere pulmonare. Figura 1B) Simbol genă: GJB5, Peptidă: SIFEGLLSGV (SEQ ID NO:7). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 8 artere, 5 măduve osoase, 7 creiere, 5 sâni, 2 cartilaje, 1 nerv central, 13 colonuri, 1 duoden, 2 vezici biliare, 5 inimi, 14 rinichi, 21 ficaţi, 44 plămâni, 4 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 8 pancreasuri, 5 nervi periferici, 1 peritoneu, 3 glande hipofizare, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 recturi, 7 glande salivare, 4 muşchi scheletici, 6 piei, 2 intestine subţiri , 4 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 3 timusuri, 3 glande tiroidiene, 7 trahee, 2 uretere, 6 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 6 esofage, 16 probe de cancer esofagian. Peptida a fost depistată în plus pe 1/43 cancere de prostată, 1/3 cancere de vezică biliară, 1/20 cancere ovariene, 5/91 cancere pulmonare şi 1/4 cancere de vezică urinară. Figura 2C) Simbol genă: PKP3, Peptidă: SLVSEQLEPA (SEQ ID NO: 34). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 8 artere, 5 măduve osoase, 7 creiere, 5 sâni, 2 cartilaje, 1 nerv central, 13 colonuri, 1 duoden, 2 vezici biliare, 5 inimi, 14 rinichi, 21 ficaţi, 44 plămâni, 4 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 8 pancreasuri, 5 nervi periferici, 1 peritoneu, 3 glande hipofizare, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 recturi, 7 glande salivare, 4 muşchi scheletici, 6 piei, 2 intestine subţiri , 4 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 3 timusuri, 3 glande tiroidiene, 7 trahee, 2 uretere, 6 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 6 esofage, 16 probe de cancer esofagian. Peptida a fost depistată în plus pe 8/24 cancere colorectale, 1/20 cancere ovariene, 1/46 cancere gastrice, 5/91 cancere pulmonare şi 2/4 cancere de vezică urinară. Figura 3D) Simbol genă: RNPEP, Peptidă: YTQPFSHYGQAL (SEQ ID NO: 37). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut adipos, 3 glande suprarenale, 8 artere, 5 măduve osoase, 7 creiere, 5 sâni, 2 cartilaje, 1 nerv central, 13 colonuri, 1 duoden, 2 vezici biliare, 5 inimi, 14 rinichi, 21 ficaţi, 44 plămâni, 4 ganglioni limfatici, 4 probe de leucocite, 3 ovare, 8 pancreasuri, 5 nervi periferici, 1 peritoneu, 3 glande hipofizare, 4 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 recturi, 7 glande salivare, 4 muşchi scheletici, 6 piei, 2 intestine subţiri , 4 spline, 5 stomacuri, 6 testicule, 3 timusuri, 3 glande tiroidiene, 7 trahee, 2 uretere, 6 vezici urinare, 2 utere, 2 vene, 6 esofage, 16 probe de cancer esofagian. Peptida a fost depistată în plus pe 1/19 cancere pancreatice, 7/46 cancere gastrice şi 1/91 cancere pulmonare. Figura 4E) Simbol genă: NUP155, Peptidă: ALQEALENA (SEQ ID NO: 80). Probe de la stânga la dreapta: 4 linii celulare (1 rinichi, 1 pancreas, 1 prostată, 1 leucemie mieloidă), 3 ţesuturi normale (1 plămân, 1 prostată, 1 intestin subţire), 47 ţesuturi canceroase (5 cancere cerebrale, 2 cancere mamare, 1 cancer de colon, 2 cancere esofagiene, 1 leucemie leucocitară cronică, 2 cancere hepatice, 22 cancere pulmonare, 7 cancere ovariene, 4 cancere de prostată, 1 cancer rectal). Figura 5F) Simbol genă: KRT5, Peptidă: SLYNLGGSKRISI (SEQ ID NO: 2). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 20 de ţesuturi canceroase (9 cancere de cap şi gât, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de esofag şi stomac, 7 cancere pulmonare, 1 cancer de vezică urinară). Figura 6G) Simbol genă: KRT5, Peptidă: TASAITPSV (SEQ ID NO: 3). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 17 ţesuturi canceroase (2 cancere esofagiene, 6 cancere ale capului şi gâtului, 7 cancere pulmonare, 2 cancere de vezică urinară). Figura 7H) Simbol genă: S100A2, Peptidă: SLDENSDQQV (SEQ ID NO: 10). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 7 ţesuturi canceroase (3 cancere de cap şi gât, 2 cancere esofagiene, 1 cancer pulmonar, 1 cancer de vezică urinară). Figura 8I) Simbol genă: LAMB3, Peptidă: ALWLPTDSATV (SEQ ID NO: 11). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 12 ţesuturi canceroase (2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 8 cancere pulmonare, 1 cancer de piele). Figura 9J) Simbol genă: IL36RN, Peptidă: SLSPVILGV (SEQ ID NO: 13). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 26 de ţesuturi canceroase (8 cancere de cap şi gât, 3 cancere esofagiene, 10 cancere pulmonare, 3 cancere de piele, 1 cancer de vezică urinară, 1 cancer uterin). Figura 10K) Simbol genă: ANO1, Peptidă: LLANGVYAA (SEQ ID NO: 15). Ţesuturi de la stânga la dreapta:8 ţesuturi canceroase (2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer de ficat, 1 cancer pulmonar, 1 cancer de stomac, 1 cancer de vezică urinară, 1 cancer uterin). Figura 11L) Simbol genă: F7, IGHV4-31, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHM, Peptidă: MISRTPEV (SEQ ID NO: 17). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 19 ţesuturi canceroase (2 cancere esofagiene, 2 cancere renale, 2 cancere hepatice, 9 cancere pulmonare, 1 cancer de ganglioni limfatici, 1 cancer testicular, 2 cancere de vezică urinară. Figura 12M) Simbol genă: QSER1, Peptidă: SLNGNQVTV (SEQ ID NO: 30). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 linie celulară (1 pancreas), 14 ţesuturi canceroase (1 cancer de cap şi gât, 1 cancer de cale biliară, 1 cancer cerebral, 1 cancer mamar, 1 cancer esofagian, 1 cancer renal, 1 cancer pulmonar, 2 cancere de piele, 3 cancere de vezică urinară, 2 cancere uterine). Figura 13N) Simbol genă: HAS3, Peptidă: YMLDIFHEV (SEQ ID NO: 32). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut normal (1 uter), 15 ţesuturi canceroase (1 cancer cerebral, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 3 cancere de cap şi gât, 4 cancere pulmonare, 4 cancere de vezică urinară). Figura 14O) Simbol genă: PKP3, Peptidă: SLVSEQLEPA (SEQ ID NO: 34). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 linie celulară (1 pancreas), 1 ţesut normal (1 colon), 28 ţesuturi canceroase (6 cancere de cap şi gât, 1 cancer mamar, 1 cancer de cec, 3 cancere de colon, 1 cancer colorectal, 3 cancere esofagiene, 6 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian, 3 cancere rectale, 3 cancere de vezică urinară). Figura 15P) Simbol genă: SERPINH1, Peptidă: GLAFSLYQA (SEQ ID NO: 40). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 3 linii celulare (1 rinichi, 2 pancreasuri), 4 ţesuturi normale (1 glandă suprarenală, 1 plămân, 2 placente), 41 ţesuturi canceroase (3 cancere de cap şi gât, 3 cancere mamare, 2 cancere de colon, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer hepatic, 15 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian, 1 cancer de pancreas, 3 cancere rectale, 2 cancere de piele, 1 cancer de stomac, 4 cancere de vezică urinară, 2 cancere uterine). Figura 1Q) Simbol genă: TMEM132A, Peptidă: ALVEVTEHV (SEQ ID NO: 56). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 7 ţesuturi normale (5 plămâni, 1 glandă tiroidiană, 1 trahee), 64 ţesuturi canceroase (6 cancere de cap şi gât, 12 cancere cerebrale, 4 cancere mamare, 3 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 5 cancere renale, 21 cancere pulmonare , 1 cancer de ganglioni limfatici, 7 cancere ovariene, 1 cancer de pancreas, 1 cancer de piele, 2 cancere uterine). Figura 2R) Simbol genă: PRC1, Peptidă: GLAPNTPGKA (SEQ ID NO: 57). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 14 ţesuturi canceroase (1 cancer de cap şi gât, 1 cancer mamar, 2 cancere esofagiene, 6 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian, 1 cancer de piele, 1 cancer de vezică urinară, 1 cancer uterin). Figura 3S) Simbol genă: MAPK6, Peptidă: LILESIPVV (SEQ ID NO: 58). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 linii celulare (1 celule sanguine, 1 piele), 25 ţesuturi canceroase (5 cancere de cap şi gât, 1 cancer de colon, 2 cancere esofagiene, 1 cancer leucemic leucocitar, 8 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 3 cancere de piele, 2 cancere de vezică urinară, 1 cancer uterin). Figura 4T) Simbol genă: PPP4R1, Peptidă: SLLDTLREV (SEQ ID NO: 59). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 1 ţesut normal (1 intestin subţire), 8 ţesuturi canceroase (1 cancer de cap şi gât, 2 cancere esofagiene, 4 cancere pulmonare, 1 cancer ovarian). Figura 5U) Simbol genă: TP63, Peptidă: VLVPYEPPQV (SEQ ID NO: 77). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 2 ţesuturi normale (1 esofag, 1 trahee), 47 ţesuturi canceroase (8 cancere de cap şi gât, 4 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 14 cancere pulmonare, 7 cancere de ganglioni limfatici, 2 cancere de prostată, 1 cancer de piele, 8 cancere de vezică urinară. Figura 6V) Simbol genă: KIAA0947, Peptidă: AVLPHVDQV (SEQ ID NO: 81). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 3 linii celulare (1 celule sanguine, 1 pancreas), 12 ţesuturi canceroase (5 cancere cerebrale, 2 cancere esofagiene, 1 cancer pulmonar, 3 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer uterin).

Figurile 2A-D arată exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă, astfel cum sunt descrise, care sunt foarte supraexprimate sau exprimate exclusiv în cancer esofagian într-un panel de ţesuturi normale (bare albe) şi 11 probe de cancer esofagian (bare negre). Ţesuturi de la stânga la dreapta: 7 artere, 1 creier, 1 inimă, 2 ficaţi, 2 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 4 măduve osoase, 1 colon, 2 esofage, 2 vezici biliare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 1 pancreas, 1 glanda hipofizară, 1 rect, 1 muşchi scheletic, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 timus, 1 glandă tiroidă, 5 trahei, 1 vezică urinară, 1 sân, 3 ovare, 3 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 uter, 11 probe de cancer esofagian. Figura 2A) Simbol genă: PTHLH; Figura 2B) Simbol genă: KRT14; Figura 2C) Simbol genă: FAM83A; Figura 2D) Simbol genă: PDPN.

Figurile 3A-E arată rezultate exemplificative de răspunsuri in vitro ale celulelor T CD8+ specifice peptidei ale unui donator sănătos de HLA-A*02+, adică date exemplificative de imunogenitate: rezultate ale citometriei în flux după colorarea cu multimeri specifică peptidei.

Figura 3A) Simbol genă: SF3B3, Peptidă: ELDRTPPEV (SEQ ID NO: 97); Figura 3B) Simbol genă: TNC, Peptidă: AMTQLLAGV (SEQ ID NO: 101).

De asemenea, celulele T CD8 + au fost amorsate utilizându-se APC-uri artificiale acoperite cu anticorp monoclonal anti-CD28 şi HLA-A*02 în complex cu peptidă SEQ ID NO: 5 (C, panoul din stânga), peptidă SEQ ID NO: 2 (D, panoul din stânga) şi, respectiv, peptidă SEQ ID NO: 77 (E, panoul din stânga).

După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide s-a efectuat prin colorare multimerică 2D cu A*02/SEQ ID NO 5 (C) A*02/SEQ ID NO 2 (D) sau A*02/SEQ ID NO 77 (E). Panourile din dreapta (C, D şi E) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*02/peptidice irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate prin gating pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals pozitive detectate cu multimeri specifici pentru diferite peptide. Sunt indicate frecvenţele celulelor multimer+ specifice între limfocitele CD8+.

EXEMPLE

EXEMPLUL 1

Identificarea şi cuantificarea peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară

Probe de ţesut

Ţesuturile tumorale ale pacienţilor au fost obţinute de la Asterand (Detroit, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); ProteoGenex Inc., (Culver City, CA, SUA); Tissue Solutions Ltd. (Glasgow, Regatul Unit); Spitalul Universitar din Tubingen. Ţesuturile normale au fost obţinute de la Asterand (Detroit, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); Bio-Options Inc. (CA, SUA); BioServe (Beltsville, MD, SUA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Spitalul Universitar din Geneva; Spitalul Universitar din Heidelberg; Universitatea de Medicină Prefecturală din Kyoto (KPUM); Spitalul Universitar din Munchen; ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA); Spitalul Universitar din Tubingen; Tissue Solutions Ltd. (Glasgow, Regatul Unit). Consimţămintele informate scrise ale pacienţilor a fost obţinut înainte de intervenţiile chirurgicale sau autopsii. Ţesuturile au fost congelate rapid imediat după excizare şi stocate până la izolarea TUMAP la -70°C sau temperaturi mai joase.

Izolarea peptidelor HLA din probe de ţesut.

Seturile de peptide HLA din probe de ţesut congelate rapid au fost obţinute prin precipitare imună din ţesuturi solide conform unui protocol uşor modificat (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) utilizându-se anticorpul HLA-A*02-specific BB7.2, anticorpul HLA-A, -B, -C-specific W6/32, sefaroză CNBr-activată, tratament cu acid şi ultrafiltrare.

Analize prin spectrometrie de masă

Seturile de peptide HLA obţinute au fost separate în funcţie de hidrofobie prin cromatografie în fază inversă (sistem nanoAcquity UPLC, Waters), iar peptidele eluate au fost analizate în spectrometre de masă hibride LTQ-velos şi cu fuziune (ThermoElectron) echipate cu o sursă ESI. Seturile de peptide au fost încărcate direct în coloana de analiză microcapilară cu siliciu infuzat (75 µm i.d. x 250 mm) prevăzută cu material în fază inversă C18, de 1,7 µm (Waters) cu aplicarea unui debit de 400 nl pe minut. Apoi, peptidele au fost separate cu ajutorul unui gradient binar de 180 minute în două trepte, de la 10% la 33% B la un debit de 300 nl pe minut. Gradientul a fost compus din solvent A (0,1% acid formic în apă) şi solvent B (0,1% acid formic în acetonitril). Un capilar din sticlă aurită (PicoTip, New Objective) a fost utilizat pentru introducerea în sursa nanoESI. Spectrometrele de masă LTQ-Orbitrap au fost operate în modul dependent de date utilizându-se o strategie TOP5. Pe scurt, un ciclu de scanare a fost iniţiat cu o scanare completă de mare precizie masică în Orbitrap (R = 30.000), urmată de scanări MS/MS tot în Orbitrap (R = 7500) pe cei mai abundenţi 5 ioni precursori cu excluderea dinamică a ionilor selectaţi anterior. Spectrul de masă tandem a fost interpretat de SEQUEST şi alte controale manuale. Secvenţa peptidică identificată a fost asigurată pin compararea modelului de fragmentare a peptidei naturale generat cu modelul de fragmentare a peptidei sintetice de referinţă, cu secvenţă identică.

Cuantificarea LC-MS relativă fără marker a fost efectuată prin numărarea ionilor, adică prin extracţie şi analiză a caracteristicilor LC-MS (Mueller et al., 2007). Metoda presupune că zona de semnal LC-MS a peptidei se corelează cu abundenţa sa în probă. Caracteristicile extrase au fost ulterior prelucrate prin deconvoluţia de stare a încărcării şi alinierea timpului de retenţie (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). În final, toate caracteristicile LC-MS au fost referenţiate încrucişat cu rezultatele identificării secvenţei pentru a combina datele cantitative ale diferitelor probe şi ţesuturi cu profilurile de prezentare ale peptidelor. Datele cantitative au fost normalizate pe două niveluri în funcţie de tendinţa centrală pentru a ţine cont de variaţiile în cadrul replicilor tehnice şi biologice. Astfel, fiecare peptidă identificată poate fi asociată cu date cantitative care permit cuantificarea relativă între probe şi ţesuturi. În plus, toate datele cantitative obţinute pentru candidaţii peptidici au fost inspectate manual pentru a se asigura consecvenţa datelor şi a se verifica acurateţea analizei automate. Pentru fiecare peptidă a fost calculat un profil de prezentare care arată prezentarea medie a probei, precum şi variaţiile replicilor.

Profilurile juxtapun probe de cancer esofagian cu o referinţă de probe de ţesut normal. Profilurile de prezentare ale peptidelor exemplificate supraprezentate sunt prezentate în Figura 1. Scorurile de prezentare pentru exemple de peptide sunt prezentate în Tabelul 8.

Tabelul 8: Scoruri de prezentare

Tabelul enumeră peptide care sunt foarte puternic supraprezentate pe tumori comparativ cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraprezentate pe tumori comparativ cu un panel de ţesuturi normale (++) sau supraprezentate pe tumori comparativ cu un panel de ţesuturi normale (+). Panelul de ţesuturi normale a constat din: ţesut adipos, glandă suprarenală, arteră, venă, măduvă osoasă, creier, nerv central şi nerv periferic, colon, rect, intestin subţire (inclusiv duoden), esofag, vezică biliară, inimă, rinichi, ficat, plămân, ganglion limfatic, leucocite mononucleare, pancreas, peritoneu, hipofiză, pleură, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, splină, stomac, timus, glandă tiroidă, trahee, ureter , vezică urinară.

SEQ ID NO Secvenţă Prezentare a peptidei 1 STYGGGLSV +++ 2 SLYNLGGSKRISI +++ 3 TASAITPSV +++ 4 ALFGTILEL ++ 5 NLMASQPQL +++ 6 LLSGDLIFL +++ 7 SIFEGLLSGV +++ 8 ALLDGGSEAYWRV +++ 9 HLIAEIHTA +++ 10 SLDENSDQQV +++ 11 ALWLPTDSATV +++ 12 GLASRILDA +++ 13 SLSPVILGV +++ 14 RLPNAGTQV +++ 15 LLANGVYAA +++ 16 VLAEGGEGV +++ 17 MISRTPEV +++ 18 FLLDQVQLGL +++ 19 GLAPFLLNAV +++ 20 IIEVDPDTKEML +++ 21 IVREFLTAL +++ 22 KLNDTYVNV +++ 23 KLSDSATYL +++ 24 LLFAGTMTV +++ 25 LLPPPPPPA +++ 26 MLAEKLLQA +++ 27 NLREGDQLL +++ 28 SLDGFTIQV +++ 29 SLDGTELQL +++ 30 SLNGNQVTV +++ 32 YMLDIFHEV +++ 33 GLDVTSLRPFDL +++ 34 SLVSEQLEPA + 35 LLRFSQDNA +++ 36 FLLRFSQDNA +++ 37 YTQPFSHYGQAL +++ 38 IAAIRGFLV +++ 39 LVRDTQSGSL +++ 40 GLAFSLYQA +++ 41 GLESEELEPEEL + 44 ATGNDRKEAAENSL +++ 45 MLTELEKAL +++ 47 VLASGFLTV +++ 48 SMHQMLDQTL +++ 50 GMNPHQTPAQL +++ 51 KLFGHLTSA +++ 52 VAIGGVDGNVRL +++ 55 GAIDLLHNV +++ 57 GLAPNTPGKA +++ 58 LILESIPVV +++ 59 SLLDTLREV +++ 61 TQTTHELTI +++ 62 ALYEYQPLQI +++ 63 LAYTLGVKQL +++ 64 GLTDVIRDV ++ 65 YVVGGFLYQRL +++ 66 LLDEKVQSV + 68 PAVLQSSGLYSL +++ 70 FVLDTSESV + 71 ASDPILYRPVAV + 72 FLPPAQVTV + 73 KITEAIQYV + 75 GLMDDVDFKA + 77 VLVPYEPPQV ++ 78 KVANIIAEV + 80 ALQEALENA ++ 81 AVLPHVDQV +++ 82 HLLGHLEQA +++ 84 SLAESLDQA + 86 GLLTEIRAV + 87 FLDNGPKTI + 88 GLWEQENHL + 89 SLADSLYNL + 91 KLIDDVHRL + 92 SILRHVAEV + 94 TLLQEQGTKTV +

EXEMPLUL 2

Profilarea exprimării genelor care codifică peptidele descrise

Supraprezentarea sau prezentarea specifică a unei peptide pe celule tumorale în comparaţie cu celule normale este suficientă pentru utilitatea sa în imunoterapie, iar unele peptide sunt specifice tumorii în pofida proteinei-sursă care apare şi în ţesuturile normale. Totuşi, profilarea exprimării ARNm adaugă un nivel suplimentar de siguranţă în selectarea ţintelor peptidice pentru imunoterapii. În special pentru opţiunile terapeutice cu riscuri mari de siguranţă, cum ar fi TCR-urile maturizate în funcţie de afinitate, peptida-ţintă ideală va fi derivată dintr-o proteină care este unică pentru tumoare şi care nu se găseşte pe ţesuturi normale.

Surse de ARN şi pregătirea acestora

Eşantioanele de ţesut prelevate chirurgical au fost furnizate aşa cum este indicat mai sus (a se vedea Exemplul 1) după obţinerea consimţământului informat scris de la fiecare pacient. Probele de ţesut tumoral au fost îngheţate instantaneu imediat după intervenţia chirurgicală şi au fost ulterior omogenizate cu mojar şi pistil sub azot lichid. ARN-ul total a fost preparat din aceste probe, utilizându-se reactiv TRI (Ambion, Darmstadt, Germania), urmat de o curăţare cu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Germania); ambele metode au fost executate conform protocolului producătorului.

ARN-ul total din ţesut tumoral pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la: ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA); Tissue Solutions Ltd. (Glasgow, Regatul Unit).

ARN-ul total din ţesuturi umane sănătoase pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la: Asterand (Detroit, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Institutul Naţional al Cancerului „Pascale», Unitatea de Biologie Moleculară şi Oncologie Virală (IRCCS) (Napoli, Italia); Spitalul Universitar din Heidelberg (Germania); BioCat GmbH (Heidelberg, Germania).

Calitatea şi cantitatea tuturor probelor de ARN au fost evaluate printr-un bioanalizor Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Germania) cu trusă RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimente RNAseq

Analiza exprimării genice a probelor de ARN tumoral şi de ţesut normal a fost realizată prin secvenţiere de generaţie următoare (RNAseq) de către CeGaT (Tubingen, Germania). Pe scurt, bibliotecile de secvenţiere sunt pregătite utilizându-se kitul de reactivi Illumina HiSeq v4 conform protocolului furnizorului (Illumina Inc, San Diego, CA, SUA), care include fragmentarea ARN-ului, conversia ADNc-ului şi adăugarea de adaptoare de secvenţiere. Bibliotecile obţinute din mai multe probe sunt amestecate echimolar şi secvenţiate pe secvenţiatorul Illumina HiSeq 2500 conform instrucţiunilor producătorului, generându-se citiri de capete singulare de 50 bp. Citirile procesate sunt cartografiate la genomul uman (GRCh38) utilizându-se software-ul STAR. Datele de exprimare sunt furnizate la nivel de transcripţie sub formă de RPKM (citiri cartografiate Reads Per Kilobase per Million generate de software-ul Cufflinks) şi la nivel de exon (citiri totale generate de software-ul Bedtools), pe baza adnotărilor bazei de date de secvenţe ensembl (Ensembl77). Citirile la nivel de exon sunt normalizate pentru lungimea exonului şi dimensiunea alinierii pentru a se obţine valori RPKM.

Exemplele de profiluri de exprimare ale genelor-sursă descrise care sunt puternic supraexprimate sau exprimate exclusiv în cancerul esofagian sunt prezentate în Figura 2. Scorurile de exprimare pentru alte exemple de gene sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9: Scoruri de exprimare.Tabelul enumeră peptide din gene care sunt extrem de supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+++), foarte supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panou de ţesuturi normale (++) sau supraexprimate pe tumori în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale (+). Valoarea de referinţă pentru acest scor a fost calculată din măsurători ale următoarelor ţesuturi normale: ţesut adipos, glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier, colon, esofag, vezică biliară, inimă, rinichi, ficat, plămân, ganglion limfatic, pancreas, hipofiză, rect, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, timus, glanda tiroidă, trahee, vezică urinară, venă.

SEQ ID NO Secvenţă Exprimare genă 1 STYGGGLSV +++ 2 SLYNLGGSKRISI +++ 3 TASAITPSV +++ 4 ALFGTILEL ++ 5 NLMASQPQL +++ 6 LLSGDLIFL +++ 7 SIFEGLLSGV +++ 8 ALLDGGSEAYWRV +++ 9 HLIAEIHTA +++ 10 SLDENSDQQV +++ 11 ALWLPTDSATV +++ 12 GLASRILDA +++ 13 SLSPVILGV +++ 14 RLPNAGTQV +++ 15 LLANGVYAA +++ 16 VLAEGGEGV +++ 17 MISRTPEV +++ 18 FLLDQVQLGL +++ 24 LLFAGTMTV +++ 25 LLPPPPPPA + 26 MLAEKLLQA ++ 27 NLREGDQLL +++ 32 YMLDIFHEV +++ 49 GLMKDIVGA + 55 GAIDLLHNV ++ 57 GLAPNTPGKA + 67 SMNGGVFAV ++ 69 GLLVGSEKVTM +++ 71 ASDPILYRPVAV + 77 VLVPYEPPQV +++ 80 ALQEALENA + 94 TLLQEQGTKTV +++

EXEMPLUL 3

Imunogenitatea in vitro pentru peptide prezentate MHC de clasă I

Pentru a obţine informaţii cu privire la imunogenitatea TUMAP-urilor descrise, inventatorii au efectuat investigaţii utilizând un test in vitro de amorsare a celulelor T pe baza stimulărilor repetate de celule T CD8+ cu celule care prezintă un antigen artificial (aAPC) încărcate cu complexe de peptide/MHC şi anticorp anti-CD28. Astfel, inventatorii au putut arăta imunogenitatea pentru TUMAP-uri restricţionate de HLA-A*0201 în conformitate cu invenţia, demonstrând că aceste peptide sunt epitopi ai celulelor T împotriva cărora există celule T precursoare CD8+ la oameni (Tabelul 10).

Stimularea in vitro a celulelor T CD8+

Pentru a efectua stimulări in vitrode către celule prezentatoare de antigen artificiale încărcate cu complex peptidă-MHC (pMHC) şi anticorp anti-CD28, inventatorii au izolat mai întâi celule T CD8+ din produse de leucafereză HLA-A*02 proaspete prin selectare pozitivă utilizând microgranule CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germania) de la donatori sănătoşi, obţinute de la University Clinics Mannheim, Germania, după consimţământ informat.

PBMC-urile şi limfocitele CD8+ izolate au fost incubate până la utilizare în mediu de celule T (TCM) constând din RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) suplimentat cu ser AB uman inactivat la căldură 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, 100 U/ml penicilină/100 µg/ml streptomicină (Cambrex, Köln, Germania), 1 mM piruvat de sodiu (CC Pro, Oberdorla, Germania), 20 µg/ml gentamicină (Cambrex). În această etapă s-au adăugat, de asemenea, la TCM 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germania) şi 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germania).

Generarea granulelor acoperite cu pMHC/anti-CD28, stimularea celulelor T şi citirea au fost realizate într-un sistem in vitro înalt definit utilizându-se 4 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de stimulare şi 8 molecule diferite de pMHC pentru fiecare condiţie de citire.

Anticorpul purificat costimulator 9.3 anti-uman IG2a CD28 de şoarece (Jung et al., 1987) a fost biotinilat chimic utilizându-se sulfo-N-hidroxisuccinimicobiotină în condiţiile recomandate de producător (Perbio, Bonn, Germania). Granulele utilizate au fost de particule de polistiren de 5,6 µm acoperite cu streptavidină (Bangs Laboratories, Illinois, SUA).

pMHC-ul utilizat pentru stimularea controalelor pozitiv şi negativ a fost A*0201/MLA-001 (peptidă ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 102) din Melan-A/MART-1) modificat şi, respectiv, A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI din DDX5, SEQ ID NO. 103).

800.000 de granule I 200 µl au fost acoperite în plăci cu 96 de godeuri în prezenţa a 4x12,5 ng de biotină-pMHC diferite, au fost spălate şi apoi s-au adăugat 600 ng de biotină anti-CD28 într-un volum de 200 µl. Stimulările au fost iniţiate în plăci de 96 de godeuri prin coincubare cu 1x106 celule T CD8+ cu 2x105 perle tapetate spălate în 200 µl TCM suplimentat cu 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) pentru 3 zile la 37°C. Jumătate din mediu a fost apoi schimbat cu TCM proaspete suplimentate cu 80 U/ml IL-2, iar incubarea a fost continuată timp de 4 zile la 37°C. Acest ciclu de stimulare s-a efectuat în total de trei ori. Pentru citirea multimerului pMHC utilizându-se 8 molecule pMHC diferite per condiţie, a fost utilizată o abordare de codificare combinatorică bidimensională, aşa cum a fost descris anterior (Andersen et al., 2012), cu modificări minore care cuprind cuplarea la 5 fluorocromuri diferite. În final, s-au efectuat analize multimerice prin colorarea celulelor cu colorant aproape IR viu/mort (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), clonă de anticorp CD1-FITC SK1 (BD, Heidelberg, Germania) şi multimeri fluorescenţi pMHC. Pentru analiză a fost utilizat un citometru BD LSRII SORP echipat cu lasere şi filtre adecvate. Celulele specifice peptidei au fost calculate ca procentaje din totalul celulelor CD8+. Evaluarea analizei multimerice a fost efectuată utilizându-se software-ul FlowJo (Tree Star, Oregon, SUA). Amorsarea <Italic>in vitro</Italic> a limfocitelor multimer+ CD8+ specifice a fost detectată prin comparaţie cu stimulări de control negative. Imunogenitatea pentru un antigen dat a fost detectată dacă cel puţin un godeu evaluabil stimulat in vitro al unui donor sănătos a fost găsit conţinând o anumită linie de celule T CD8+ după stimulare in vitro (adică acest godeu conţine cel puţin 1% de multimer+ specific între celulele T CD8+ şi procentajul celulelor tetramer+ este de cel puţin 10 ori mediana stimulărilor negative).

Imunogenitatea in vitro pentru peptide de cancer esofagian

Pentru peptidele HLA de clasă I testate, imunogenitatea in vitro se poate demonstra prin generarea de linii de celule T specifice peptidelor. Exemple de rezultate ale citometriei de flux după colorarea cu multimer TUMAP-specific pentru două peptide descrise (SEQ ID NO 97 şi SEQ ID NO 101) sunt prezentate în Figura 3 împreună cu controalele negative corespunzătoare. Rezultatele pentru cinci peptide din invenţie sunt rezumate în Tabelul 10A.

Tabelul 10A: Imunogenitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro efectuate de către solicitant pentru peptidele descrise. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

SEQ ID No Secvenţă godeuri Donatori 94 TLLQEQGTKTV + ++ 95 LIQDRVAEV + ++ 97 ELDRTPPEV ++ ++++ 98 VLFPNLKTV + ++++ 101 AMTQLLAGV ++ +++

Tabelul 10B: Imunogenicitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro efectuate de către solicitant pentru peptidele descrise. Rezultatele exemplificative ale experimentelor de imunogenitate in vitro efectuate de către solicitant pentru peptidele descrise. Procentajele de godeuri şi donatori pozitivi (printre evaluabili) sunt rezumate după cum este indicat; <20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 69% = +++; >= 70% = ++++

SEQ ID No Secvenţă Godeuri pozitive [%] 1 STYGGGLSV + 2 SLYNLGGSKRISI + 5 NLMASQPQL +++ 6 LLSGDLIFL ++ 12 GLASRILDA + 19 GLAPFLLNAV + 29 SLDGTELQL + 47 VLASGFLTV +++ 69 GLLVGSEKVTM + 77 VLVPYEPPQV +

EXEMPLUL 4

Sinteza peptidelor

Toate peptidele au fost sintetizate utilizându-se sinteza standard şi bine stabilită de peptide în fază solidă utilizându-se strategia Fmoc. Identitatea şi puritatea fiecărei peptide individuale au fost determinate prin spectrometrie de masă şi RP-HPLC analitic. Peptidele au fost obţinute sub formă de liofilizaţi de culoare albă până la albă (sare de trifluoroacetat) cu purităţi >50%. Toate TUMAP-urile se administrează preferabil ca săruri de trifluoroacetat sau de acetat, fiind posibile şi alte săruri.

EXEMPLUL 5

Teste de legare la MHC

Peptidele candidate pentru terapii bazate pe celule T, aşa cum sunt descrise, au fost testate în continuare în privinţa capacităţii lor de legare la MHC (afinitate). Complecşii peptidă-MHC individuali au fost produse prin schimb UV-ligand, unde o peptidă sensibilă la UV este scindată la iradiere UV şi schimbată cu peptida de interes, aşa cum a fost analizată. Doar candidaţii peptidici care se pot lega şi stabiliza în mod eficient moleculele de MHC receptive la peptide împiedică disocierea complexelor MHC. Pentru a determina randamentul reacţiei de schimb, a fost efectuat un ELISA bazat pe detectarea lanţului uşor (02m) al complexelor MHC stabilizate. Testul a fost efectuat aşa cum este descris cu caracter general în Rodenko et al., 2006).

Plăci de 96 de godeuri MAXISorp (NUNC) au fost acoperite peste noapte cu 2 ug/ml streptavidină în PBS la temperatura camerei, au fost spălate de 4 ori şi au fost blocate pentru 1 oră la 37°C în 2% BSA care conţinea tamponul de blocare. Monomerii HLA-A*02:01/MLA-001 reasamblaţi au servit ca standarde, acoperind domeniul 15-500 ng/ml. Monomerii peptidă-MHC ai reacţiei de schimb UV au fost diluaţi de 100 de ori în tampon de blocare. Probele au fost incubate timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate de patru ori, au fost incubate cu 2ug/ml HRP de anti-β2m HRP conjugat timp de 1 oră la 37°C, au fost spălate din nou şi au fost detectat cu soluţia TMB stopată cu NH2SO4. Absorbţia a fost măsurată la 450 nm. Peptidele candidate care prezintă un randament de schimb mare (preferabil mai mare de 50%, cele mai preferabil mai mare de 75%) sunt, în general, preferate pentru o generare şi producţie de anticorpi sau fragmente ale acestora şi/sau receptori de celule T sau fragmente ale acestora, deoarece arată suficientă aviditate la molecule de MHC şi împiedică disocierea complecşilor MHC.

Tabelul 11: Scoruri de legare MHC clasă I.

Legarea peptidelor restricţionate HLA de clasă I la HLA-A*02:01 fost clasificată prin randamentul schimbului peptidic: ≥10% = +; ≥20% = ++; ≥50 = +++; ≥ 75% = ++++

SEQ ID Secvenţă Schimb de peptide 1 STYGGGLSV +++ 2 SLYNLGGSKRISI ++++ 3 TASAITPSV +++ 5 NLMASQPQL +++ 6 LLSGDLIFL +++ 7 SIFEGLLSGV ++ 8 ALLDGGSEAYWRV +++ 9 HLIAEIHTA +++ 10 SLDENSDQQV +++ 11 ALWLPTDSATV +++ 12 GLASRILDA +++ 13 SLSPVILGV ++++ 14 RLPNAGTQV ++++ 15 LLANGVYAA + 16 VLAEGGEGV +++ 17 MISRTPEV ++ 18 FLLDQVQLGL +++ 19 GLAPFLLNAV +++ 21 IVREFLTAL +++ 22 KLNDTYVNV +++ 23 KLSDSATYL +++ 24 LLFAGTMTV ++ 25 LLPPPPPPA +++ 26 MLAEKLLQA + 27 NLREGDQLL +++ 28 SLDGFTIQV ++ 29 SLDGTELQL +++ 30 SLNGNQVTV + 31 VLPKLYVKL ++ 32 YMLDIFHEV ++ 33 GLDVTSLRPFDL +++ 34 SLVSEQLEPA +++ 35 LLRFSQDNA +++ 36 FLLRFSQDNA ++ 37 YTQPFSHYGQAL +++ 38 IAAIRGFLV +++ 39 LVRDTQSGSL ++ 40 GLAFSLYQA ++ 41 GLESEELEPEEL ++ 42 TQTAVITRI + 43 KVVGKDYLL + 44 ATGNDRKEAAENSL +++ 45 MLTELEKAL ++ 46 YTAQIGADIAL +++ 47 VLASGFLTV ++++ 48 SMHQMLDQTL ++ 49 GLMKDIVGA +++ 51 KLFGHLTSA ++ 52 VAIGGVDGNVRL ++ 53 VVVTGLTLV ++ 54 YQDLLNVKM +++ 55 GAIDLLHNV ++ 56 ALVEVTEHV ++ 57 GLAPNTPGKA +++ 58 LILESIPVV ++ 59 SLLDTLREV +++ 60 VVMEELLKV ++ 61 TQTTHELTI +++ 62 ALYEYQPLQI ++ 63 LAYTLGVKQL +++ 64 GLTDVIRDV ++++ 65 YVVGGFLYQRL +++ 66 LLDEKVQSV +++ 67 SMNGGVFAV ++ 68 PAVLQSSGLYSL ++ 69 GLLVGSEKVTM +++ 70 FVLDTSESV +++ 71 ASDPILYRPVAV +++ 72 FLPPAQVTV ++ 73 KITEAIQYV +++ 74 ILASLATSV +++ 76 KVADYIPQL +++ 77 VLVPYEPPQV ++ 78 KVANIIAEV ++ 79 GQDVGRYQV ++ 80 ALQEALENA ++ 81 AVLPHVDQV +++ 82 HLLGHLEQA +++ 83 ALADGVVSQA +++ 84 SLAESLDQA +++ 85 NIIELVHQV ++++ 87 FLDNGPKTI +++ 89 SLADSLYNL ++ 90 SIYEYYHAL +++ 91 KLIDDVHRL ++++ 92 SILRHVAEV ++ 93 VLINTSVTL +++

EXEMPLUL 6

Cuantificarea absolută a peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulară Generarea de lianţi, cum ar fi anticorpi şi/sau TCR-uri, este un proces laborios, care poate fi realizat numai pentru o serie de ţinte selectate. În cazul peptidelor asociate tumorii şi specifice tumorii, criteriile de selecţie includ, dar nu sunt limitate la exclusivitatea prezentării şi la densitatea peptidei prezentate pe suprafaţa celulei. Cuantificarea copiilor de TUMAP-uri per celulă în probe tumorale solide necesită cuantificarea absolută a TUMAP-urilor izolate, a eficacităţii izolării TUMAP-urilor şi a numărului de celule din proba de ţesut analizată.

Cuantificarea peptidelor prin nanoLC-MS/MS

Pentru o cuantificare precisă a peptidelor prin spectrometrie de masă, a fost generată o curbă de calibrare pentru fiecare peptidă utilizându-se metoda standard internă. Standardul intern este o variantă marcată cu dublu izotop a fiecărei peptide, adică, în sinteza TUMAP-urilor, au fost incluşi doi aminoacizi marcaţi cu izotopi. Aceasta diferă de peptida asociată tumorii doar prin masa sa, însă nu prezintă nicio diferenţă privind alte proprietăţi fizico-chimice (Anderson et al., 2012). Standardul intern a fost îmbogăţit la fiecare probă pentru MS şi toate semnalele MS au fost normalizate la semnalul MS al standardului intern pentru a se nivela variaţiile tehnice potenţiale dintre experimentele cu MS.

Curbele de calibrare au fost preparate în cel puţin trei matrice diferite, adică peptida HLA eluează din probe naturale similare cu probele pentru MS de rutină şi fiecare preparat a fost măsurat în faze de MS dublate. Pentru evaluare, semnalele SM au fost normalizate la semnalul standardului intern şi o curbă de calibrare a fost calculată prin regresie logistică.

Pentru cuantificarea peptidelor asociate tumorii din probe de ţesut, probele respective au fost, de asemenea, îmbogăţite cu standardul intern; semnalele MS au fost normalizate la standardul intern şi cuantificate utilizându-se curba de calibrare peptidică.

Eficacitatea izolării peptidelor/MHC-urilor

În ceea ce priveşte orice proces de purificare a proteinelor, izolarea proteinelor din probele de ţesut este asociată cu o anumită pierdere a proteinei de interes. Pentru a determina eficienţa izolării TUMAP-urilor, complexele peptidice/MHC au fost generate pentru toate TUMAP-urile selectate pentru cuantificare absolută. Pentru a putea discrimina complexele peptidice/MHC naturale de cele îmbogăţite, s-au utilizat versiuni de TUMAP-uri marcate cu un singur izotop, adică în sinteza TUMAP-urilor a fost inclus un aminoacid marcat izotop. Aceste complexe au fost îmbogăţite în lizate de ţesut proaspăt preparate, adică în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor, şi apoi au fost capturate precum complexele peptidice/MHC naturale în următoarea purificare de afinitate. Prin urmare, măsurarea recuperării TUMAP-urilor marcate cu un singur izotop permite concluzii cu privire la eficienţa izolării TUMAP-urilor naturale individuale.

Eficienţa izolării a fost analizată pe un număr redus de probe şi a fost comparabilă între aceste probe de ţesut. În schimb, eficienţa izolării diferă între peptidele individuale. Acest lucru sugerează că eficienţa izolării, deşi este determinată doar la un număr limitat de probe de ţesut, poate fi extrapolată la orice alt preparat tisular. Cu toate acestea, este necesar să se analizeze fiecare TUMAP individual, deoarece eficienţa izolării nu poate fi extrapolată de la o peptidă la altele.

Determinarea numărului de celule în ţesut solid, îngheţat

Pentru a determina numărul de celule din probele de ţesut supuse cuantificării peptidice absolute, inventatorii au aplicat analiza conţinutului de ADN. Această metodă este aplicabilă unei mari varietăţi de probe de origine diferită şi, cel mai important, probelor congelate (Alcoser et al., 2011; Forsey şi Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). În timpul protocolului de izolare peptidică, o probă de ţesut este prelucrat la un lizat omogen, din care se prelevează o parte alicotă mică de lizat. Partea alicotă este împărţită în trei părţi, din care se izolează ADN-ul (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germania). Conţinutul total de ADN de la fiecare izolare de ADN este cuantificat utilizându-se un test de cuantificare a ADN-ului bazat pe fluorescenţă (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germania) în cel puţin două replicări.

Pentru a calcula numărul de celule, a fost generată o curbă ADN standard din părţile alicote de celulelor sanguine sănătoase singulare, cu un interval de numere de celule definit. Curba standard este utilizată pentru a calcula conţinutul total de celule din conţinutul total de ADN de la fiecare izolare de ADN. Numărul mediu total de celule din proba de ţesut utilizată pentru izolarea peptidelor este extrapolat luându-se în considerare volumul cunoscut al părţilor alicote de lizat şi volumul total de lizat.

Copii de peptide per celulă

Cu datele din experimentele menţionate mai sus, inventatorii au calculat numărul de copii de TUMAP-uri per celulă prin împărţirea cantităţii totale de peptide la numărul total de celule din probă, urmată de împărţirea la eficienţa izolării. Numerele de copii celulare pentru peptidele selectate sunt arătate în Tabelul 12.

Tabelul 12: Numere absolute de copii. Tabelul prezintă rezultatele cuantificării peptidice absolute la probe tumorale de NSCLC. Numărul median de copii per celulă este indicat pentru fiecare peptidă: <100 = +; >=100 = ++; >=1000 +++; >=10.000 = ++++. Este indicat numărul de probe în care sunt disponibile date de MS evaluabile de înaltă calitate.

SEQ ID No. Cod peptidă Copii per celulă (valoare mediană) Număr de probe 9 PTHL-001 + 31

Referinţe

Abbas, W. et al., Front Oncol 5 (2015): 75

Adams, S. et al., PLoS.One. 9 (2014): e112945

Al Moustafa, A. E. et al., Oncogene 21 (2002): 2634-2640

Al-Mahdi, R. et al., Cell Adh.Migr. (2015): 0

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124

Alholle, A. et al., Epigenetics. 8 (2013): 1198-1204

Ali, R. H. et al., Hum.Pathol. 45 (2014): 2453-2462

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Alper, M. et al., Mol.Cell Biochem. 393 (2014): 165-175

Alsagaby, S. A. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5051-5062

Altmannsberger, M. et al., Am.J Pathol. 118 (1985): 85-95

Ammendola, M. et al., PLoS.One. 9 (2014): e99512

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Arentz, G. et al., Clin Proteomics. 8 (2011): 16

Arif, Q. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 978-980

Auvinen, P. et al., Breast Cancer Res Treat. 143 (2014): 277-286

Avasarala, S. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76895

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Bandres, E. et al., Oncol Rep. 12 (2004): 287-292

Banerjee, K. et al., Int.J Cancer (2015)

Barros-Filho, M. C. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E890-E899

Bashyam, M. D. et al., Neoplasia. 7 (2005): 556-562

Basu, S. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0123979

Baxter, P. A. et al., Acta Neuropathol.Commun. 2 (2014): 160

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Becker, S. A. et al., Cancer Res 56 (1996): 5092-5097

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bellon, M. et al., Blood 121 (2013): 5045-5054

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Bhattacharjee, R. B. et al., Cell Biol Int. 36 (2012): 697-704

Bin Amer, S. M. et al., Saudi.Med.J 29 (2008): 507-513

Blanch, A. et al., PLoS.One. 8 (2013): e66436

Blanco, M. A. et al., Cell Res 22 (2012): 1339-1355

Blenk, S. et al., Cancer Inform. 3 (2007): 399-420

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Boyer, A. P. et al., Mol.Cell Proteomics. 12 (2013): 180-193

Bozza, W. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 32723-32736

Braulke, T. et al., Arch.Biochem.Biophys. 298 (1992): 176-181

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brechmann, M. et al., Immunity. 37 (2012): 697-708

Bredholt, G. et al., Oncotarget. 6 (2015): 39676-39691

Breuninger, S. et al., Am.J Pathol. 176 (2010): 2509-2519

Brezinova, J. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 173 (2007): 10-16

Broghammer, M. et al., Cancer Lett. 214 (2004): 225-229

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Buckley, N. E. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1070

Bui, P. H. et al., Mol.Pharmacol. 76 (2009): 1044-1052

Buim, M. E. et al., Oncology 69 (2005): 445-454

Bujas, T. et al., Eur.J Histochem. 55 (2011): e7

Cai, J. L. et al., Chin J Cancer Res 23 (2011): 59-63

Cai, Q. et al., Nat Genet. 46 (2014): 886-890

Calmon, M. F. et al., Epigenetics. 10 (2015): 622-632

Calvo, N. et al., Biochem.Cell Biol 92 (2014): 305-315

Canet, B. et al., Hum.Pathol. 42 (2011): 833-839

Cao, Z. et al., Mol.Oncol 8 (2014): 285-296

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Carinci, F. et al., Int.J Immunopathol.Pharmacol. 18 (2005): 513-524

Cazier, J. B. et al., Nat Commun. 5 (2014): 3756

Cetindis, M. et al., Eur.Arch.Otorhinolaryngol. (2015)

Chakrabarti, G. et al., Cancer Metab 3 (2015): 12

Chaneton, B. et al., Trends Biochem.Sci. 37 (2012): 309-316

Chang, I. W. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 5441-5450

Chang, J. W. et al., Anticancer Res 32 (2012): 1259-1265

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Chauvet, C. et al., PLoS.One. 6 (2011): e22545

Che, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6559-6568

Chen, B. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 305-315

Chen, K. D. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014a): e1244

Chen, L. et al., Int.J Mol.Sci. 15 (2014b): 11435-11445

Chen, Q. et al., Cell Physiol Biochem. 35 (2015a): 1052-1061

Chen, R. S. et al., Oncogene 28 (2009): 599-609

Chen, S. et al., Cancer Epidemiol. 37 (2013): 172-178

Chen, W. M. et al., Dig.Dis.Sci. 60 (2015b): 1655-1662

Chen, Y. et al., Med.Oncol 31 (2014c): 304

Chen, Y. C. et al., Int.J Cancer 135 (2014d): 117-127

Chen, Z. T. et al., Int.J Mol.Sci. 16 (2015c): 15497-15530

Cheon, D. J. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 711-723

Cheuk, W. et al., Pathology 33 (2001): 7-12

Cho, S. J. et al., PLoS.One. 8 (2013): e71724

Choi, W. I. et al., Cell Physiol Biochem. 23 (2009): 359-370

Chuang, W. Y. et al., Histol.Histopathol. 28 (2013): 293-299

Chung, J. et al., J Cell Biol 158 (2002): 165-174

Chung, T. K. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 776-783

Cimino, D. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 1327-1338

Cipriano, R. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1156-1165

ClinicalTrials.gov, (2015), http://www.clinicaltrials.gov

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Council, L. et al., Mod.Pathol. 22 (2009): 639-650

Crossen, P. E. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 113 (1999): 126-133

Cui, D. et al., Oncogene 33 (2014): 2225-2235

Daigeler, A. et al., J Exp.Clin Cancer Res 27 (2008): 82

Dang, C. V. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 6479-6483

Dang, Q. et al., Med.Oncol 31 (2014): 24

Dar, A. A. et al., Immunology (2015)

Davids, M. S. et al., Leuk.Lymphoma 53 (2012): 2362-2370

Davidson, B. et al., Hum.Pathol. 45 (2014): 691-700

de Groen, F. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 53 (2014): 339-348

de Jonge, H. J. et al., Leukemia 25 (2011): 1825-1833

de Sa, V. K. et al., Braz.J Med.Biol Res 46 (2013): 21-31

De, Keersmaecker K. et al., Haematologica 99 (2014): 85-93

De, Ponti A. et al., Cancer Lett. 369 (2015): 396-404

Deacu, E. et al., Cancer Res 64 (2004): 7690-7696

Deb, S. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 1223-1230

Debiec-Rychter, M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 38 (2003): 187-190

DeLaBarre, B. et al., Chem Biol 21 (2014): 1143-1161

Delker, D. A. et al., PLoS.One. 9 (2014): e88367

Demirag, G. G. et al., Med.Oncol 29 (2012): 1518-1522

Demirci, H. et al., J Ophthalmic Vis.Res 8 (2013): 303-307

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Depianto, D. et al., Nat Genet. 42 (2010): 910-914

Ding, L. et al., Nature 481 (2012): 506-510

Dotlic, S. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 22 (2014): 537-542

Downie, D. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 7369-7375

Draberova, E. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 74 (2015): 723-742

Drayton, R. M. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 1990-2000

Du, J. et al., Int.J Mol.Sci. 13 (2012): 15755-15766

Duanmin, H. et al., Hepatogastroenterology 60 (2013): 870-875

Dubrowinskaja, N. et al., Cancer Med. 3 (2014): 300-309

Ehrlichova, M. et al., Genomics 102 (2013): 96-101

El-Naggar, A. M. et al., Cancer Cell 27 (2015): 682-697

Espinosa, A. M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e55975

Esseghir, S. et al., J Pathol. 210 (2006): 420-430

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fang, J. et al., BMC.Cancer 8 (2008a): 69

Fang, W. et al., J Transl.Med. 6 (2008b): 32

Fejzo, M. S. et al., Int.J Mol.Sci. 14 (2013): 3094-3109

Fellenberg, F. et al., J Invest Dermatol. 122 (2004): 1510-1517

Feng, G. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014): 2699-2705

Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No.11 [Internet], (2013), http://globocan.iarc.fr

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Fontaine, J. F. et al., PLoS.One. 4 (2009): e7632

Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett. 31 (2009): 819-823

Fu, A. et al., Mol.Med.Rep. 11 (2015a): 4727-4733

Fu, Y. et al., Cancer Biol.Ther 5 (2006): 741-744

Fu, Z. C. et al., Med.Sci.Monit. 21 (2015b): 1276-1287

Fujita, A. et al., Genet.Mol.Res 7 (2008): 371-378

Fujita, N. et al., J Biochem. 152 (2012): 407-413

Fujiwara, K. et al., PLoS.One. 9 (2014): e107247

Furukawa, C. et al., Cancer Res 65 (2005): 7102-7110

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gao, Y. B. et al., Nat Genet. 46 (2014): 1097-1102

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giallourakis, C. C. et al., J Immunol. 190 (2013): 5578-5587

Giovinazzo, F. et al., Cell Signal. 25 (2013): 651-659

Gkika, D. et al., J Cell Biol 208 (2015): 89-107

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Goode, G. et al., PLoS.One. 9 (2014): e100103

Gordon, G. J. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 169

Gorski, J. J. et al., Breast Cancer Res Treat. 122 (2010): 721-731

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Groulx, J. F. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1217-1227

Guo, X. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 11846

Gupta, V. et al., Curr.Pharm.Des 20 (2014): 2595-2606

Hagel, C. et al., J Neurooncol. 112 (2013): 191-197

Haggman, M. J. et al., Urology 50 (1997): 643-647

Hammam, O. et al., J Egypt.Soc.Parasitol. 44 (2014): 733-740

Hapgood, G. et al., Blood 126 (2015): 17-25

Haraguchi, N. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 425-430

Harris, T. M. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 494-507

Haslene-Hox, H. et al., Biochim.Biophys.Acta 1834 (2013): 2347-2359

Hatina, J. et al., Neoplasma 59 (2012): 728-736

Hauser, A. D. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 130-142

He, X. et al., Int.J Biol Macromol. 72 (2015): 1081-1089

Heffler, M. et al., Anticancer Agents Med.Chem 13 (2013): 584-594

Heubeck, B. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): e1-e7

Hoeflich, K. P. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 839-849

Hofsli, E. et al., Br.J Cancer 99 (2008): 1330-1339

Hogan, L. E. et al., Blood 118 (2011): 5218-5226

Hountis, P. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 7327-7333

Hu, C. K. et al., Mol.Biol Cell 23 (2012): 2702-2711

Huang, F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 1093-1100

Huang, S. L. et al., Cancers (Basel) 7 (2015): 1052-1071

Huang, Y. D. et al., Hua Xi.Kou Qiang.Yi.Xue.Za Zhi. 25 (2007): 500-503

Huang, Z. et al., Indian J Otolaryngol.Head Neck Surg. 66 (2014b): 120-125

Huang, Z. et al., J Oral Pathol.Med. 43 (2014c): 191-198

Hussey, G. S. et al., Mol Cell 41 (2011): 419-431

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Ichinose, J. et al., Cancer Sci. 105 (2014): 1135-1141

Ida-Yonemochi, H. et al., Mod.Pathol. 25 (2012): 784-794

Ii, M. et al., Int.J Oncol 39 (2011): 593-599

Inoue, H. et al., Int.J Cancer 63 (1995): 523-526

Inoue, K. et al., Subcell.Biochem. 85 (2014): 17-40

Iqbal, M. A. et al., FEBS Lett. 588 (2014): 2685-2692

Irifune, H. et al., Cancer Biol Ther. 4 (2005): 449-455

Ismail, M. F. et al., Tumour.Biol (2015)

Israelsen, W. J. et al., Semin.Cell Dev.Biol 43 (2015): 43-51

Jamieson, N. B. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 3316-3331

Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 240-245

Jiang, L. et al., Cell Cycle 14 (2015): 2881-2885

Jin, J. et al., Int.J Hematol. 99 (2014): 750-757

Johnson, R. H. et al., Oncotarget. (2015)

Johnstone, C. N. et al., Dis.Model.Mech. 8 (2015): 237-251

Joosse, S. A. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 993-1003

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Kabbage, M. et al., J Biomed.Biotechnol. 2008 (2008): 564127

Kanehira, M. et al., Cancer Res 67 (2007): 3276-3285

Kang, S. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 5638-5645

Kao, C. J. et al., Oncogene 27 (2008): 1397-1403

Karlsson, J. et al., Cancer Lett. 357 (2015): 498-501

Kato, I. et al., Pathol.Int. 59 (2009): 38-43

Katoh, M., Int.J Oncol 41 (2012): 1913-1918

Kaz, A. M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012): 384-393

Kazma, R. et al., PLoS.One. 7 (2012): e51680

Kerley-Hamilton, J. S. et al., Oncogene 24 (2005): 6090-6100

Khakpour, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 4905-4912

Khalil, A. A., Cancer Sci. 98 (2007): 201-213

Khapare, N. et al., PLoS.One. 7 (2012): e38561

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)

Kido, T. et al., Genes (Basel) 1 (2010): 283-293

Kim, S. W. et al., OMICS. 15 (2011): 281-292

Kimura, H. et al., Int.J Oncol 30 (2007): 171-179

Kinoshita, T. et al., Oncotarget. 3 (2012): 1386-1400

Kirov, A. et al., J Cell Biochem. (2015)

Kita, Y. et al., Eur.J Surg.Oncol 35 (2009): 52-58

Klopfleisch, R. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 6380-6391

Koizume, S. et al., Cancer Res 66 (2006): 9453-9460

Koizume, S. et al., World J Clin Oncol 5 (2014): 908-920

Koizume, S. et al., Biomark.Cancer 7 (2015): 1-13

Kono, K. et al., Cancer Sci. 100 (2009): 1502-1509

Kottorou, A. E. et al., Acta Histochem. 114 (2012): 553-561

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Krisenko, M. O. et al., Biochim.Biophys.Acta 1853 (2015): 254-263

Kruse, A. J. et al., Int.J Gynecol.Cancer 24 (2014): 1616-1622

Kulkarni, G. et al., Breast Cancer Res Treat. 102 (2007): 31-41

Kultti, A. et al., Biomed.Res Int. 2014 (2014): 817613

Kumar, M. et al., J Transl.Med. 13 (2015): 8

Kumarakulasingham, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 3758-3765

Kuramitsu, Y. et al., Anticancer Res 30 (2010): 4459-4465

Kurimoto, F. et al., Int.J Mol.Med. 8 (2001): 89-93

Kwon, O. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 406 (2011): 539-545

Larrinaga, G. et al., Dis.Markers 35 (2013): 825-832

Lauvrak, S. U. et al., Br.J Cancer 109 (2013): 2228-2236

Leal, M. F. et al., World J Gastroenterol. 18 (2012): 1531-1537

Ledet, E. M. et al., Prostate 73 (2013): 614-623

Lee, E. J. et al., J Genet.Genomics 42 (2015a): 355-371

Lee, H. W. et al., Dis.Esophagus. (2015b)

Lee, J. et al., Oncoscience. 2 (2015c): 410-418

Lee, J. M., Reprod.Biol Endocrinol. 1 (2003): 69

Lee, M. H. et al., J Cell Sci. 126 (2013): 1744-1752

Lee, M. H. et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 1171 (2009): 87-93

Lee, S. H. et al., EMBO J 25 (2006): 4008-4019

Lee, S. Y. et al., J Clin Invest 122 (2012): 3211-3220

Lei, Y. Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014): 8539-8548

Leithner, K. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 40

Leitlinie Magenkarzinom, 032-009OL, (2012)

Lexander, H. et al., Anal.Quant.Cytol.Histol. 27 (2005): 263-272

Li, C. et al., Oncogene 23 (2004): 9336-9347

Li, C. et al., Am.J Cancer Res 5 (2015a): 1635-1648

Li, R. et al., Oncogene 25 (2006): 2628-2635

Li, X. et al., Pancreas 40 (2011): 753-761

Li, X. Q. et al., PLoS.One. 7 (2012): e31146

Li, Y. et al., Neoplasia. 7 (2005): 1073-1080

Li, Y. et al., Cell Rep. 12 (2015b): 388-395

Li, Y. et al., Lung Cancer 58 (2007): 171-183

Li, Z. et al., Biochim.Biophys.Acta 1846 (2014): 285-296

Liang, B. et al., World J Gastroenterol. 11 (2005a): 623-628

Liang, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6391-6399

Liang, L. et al., Int.J Oncol 45 (2014): 659-666

Liang, Z. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi. 27 (2005b): 534-537

Liao, J. S. et al., Zhejiang.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 44 (2015a): 329-334

Liao, W. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 24132-24147

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lim, M. Y. et al., Int.J Chronic.Dis. 2013 (2013): 578613

Lim, R. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 406 (2011): 408-413

Lin, C. et al., Oncotarget. 6 (2015): 8434-8453

Lin, S. J. et al., J Proteomics. 94 (2013): 186-201

Lin, X. et al., Med.Oncol 31 (2014): 42

Linher-Melville, K. et al., Mol.Cell Biochem. 405 (2015): 205-221

Liu, B. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014a): E786-E795

Liu, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014b): 690-698

Liu, D. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014c): 8153-8162

Liu, J. P. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 87 (2007a): 2719-2723

Liu, L. et al., Oncol Lett. 7 (2014d): 2192-2198

Liu, Y. et al., J Neurooncol. 99 (2010): 13-24

Liu, Y. et al., Cell Death.Dis. 6 (2015): e1630

Liu, Y. et al., Oncol Rep. 18 (2007b): 943-951

Liu, Y. F. et al., Tumour.Biol 35 (2014e): 3731-3741

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Lo, P. K. et al., Oncogene 31 (2012): 2614-2626

Lo, R. K. et al., J Biol Chem 278 (2003): 52154-52165

Lo, W. Y. et al., J Proteome.Res 6 (2007): 2143-2151

Lohr, J. G. et al., Cancer Cell 25 (2014): 91-101

Long, W. et al., J Clin Invest 122 (2012): 1869-1880

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Longerich, T., Pathologe 35 Suppl 2 (2014): 177-184

Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lou, S. et al., Stem Cells 31 (2013): 1942-1953

Lu, Z. et al., Cell Physiol Biochem. 33 (2014): 859-868

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)

Luo, W. et al., Trends Endocrinol.Metab 23 (2012): 560-566

Lv, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 33 (2014): 100

Ma, Y. et al., Mol.Cell Proteomics. 8 (2009): 1878-1890

Madanayake, T. W. et al., BMC.Genomics 14 (2013): 833

Maiso, P. et al., Cancer Res 75 (2015): 2071-2082

Manenti, G. et al., Toxicol.Lett. 112-113 (2000): 257-263

Mao, P. et al., J Biol Chem 286 (2011): 19381-19391

Mao, P. et al., PLoS.One. 8 (2013): e81803

Marcinkiewicz, K. M. et al., Exp.Cell Res 320 (2014): 128-143

Marg, A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 401 (2010): 143-148

Marhold, M. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 556-564

Martin-Rufian, M. et al., J Mol.Med.(Berl) 92 (2014): 277-290

Matassa, D. S. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013): e851

Mayas, M. D. et al., Anticancer Res 32 (2012): 3675-3682

Mazan-Mamczarz, K. et al., PLoS.Genet. 10 (2014): e1004105

Mazurek, S., Ernst.Schering.Found.Symp.Proc. (2007): 99-124

Mazurek, S., Int.J Biochem.Cell Biol 43 (2011): 969-980

McBride, D. J. et al., J Pathol. 227 (2012): 446-455

Melaiu, O. et al., Mutat.Res 771 (2015): 6-12

Messina, M. et al., Blood 123 (2014): 2378-2388

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Mimori, K. et al., Int.J Oncol 11 (1997): 959-964

Mirza, Z. et al., Anticancer Res 34 (2014): 1873-1884

Missero, C. et al., Exp.Dermatol. 23 (2014): 143-146

Moretti, R. M. et al., Oncol Rep. 9 (2002): 1139-1143

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Morris, L. G. et al., Nat Genet. 45 (2013): 253-261

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Mountzios, G. et al., Ann.Oncol 25 (2014): 1889-1900

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211

Mustacchi, G. et al., Int.J Mol.Sci. 14 (2013): 9686-9702

Naba, A. et al., Elife. 3 (2014): e01308

Naboulsi, W. et al., J Proteome.Res (2015)

Naderi, A., Exp.Cell Res 331 (2015): 239-250

Nakao, K. et al., J Gastroenterol. 49 (2014): 589-593

Navara, C. S., Curr.Pharm.Des 10 (2004): 1739-1744

Naz, S. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 14-23

Neumann, M. et al., Blood 121 (2013): 4749-4752

Ng, S. K. et al., Clin Experiment.Ophthalmol. 43 (2015): 367-376

Nikitakis, N. G. et al., Am.J Clin Pathol. 119 (2003): 574-586

Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502

Nwosu, V. et al., Hum.Mol Genet. 10 (2001): 2313-2318

Nykopp, T. K. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 512

O'Gorman, D. B. et al., Endocrinology 143 (2002): 4287-4294

Oh, H. R. et al., Cell Oncol (Dordr.) 37 (2014): 455-461

Ohigashi, Y. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 2947-2953

Okayama, H. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 23 (2014): 2884-2894

Okoh, V. O. et al., PLoS.One. 8 (2013): e54206

Olstad, O. K. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2201-2216

Ordonez, N. G., Arch.Pathol.Lab Med. 129 (2005): 1407-1414

Orzol, P. et al., Histol.Histopathol. 30 (2015): 503-521

Padden, J. et al., Mol.Cell Proteomics. 13 (2014): 2661-2672

Pan, B. et al., Mol.Biol Rep. 40 (2013): 27-33

Pan, T. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 456 (2015): 452-458

Papagerakis, S. et al., Hum.Pathol. 34 (2003): 565-572

Park, Y. et al., Oncogene 34 (2015): 5037-5045

Parker, L. P. et al., Cancer Genomics Proteomics. 6 (2009): 189-194

Pathak, S. et al., Nutr.Cancer 66 (2014): 818-824

Peng, H. et al., Cell Oncol (Dordr.) 38 (2015): 165-172

Penney, K. L. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 24 (2015): 255-260

Perez, I. et al., Int.J Med.Sci. 12 (2015): 458-467

Persson, F. et al., Cancer Lett. 260 (2008): 37-47

Pflueger, D. et al., Neoplasia. 15 (2013): 1231-1240

Pickering, C. R. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 6582-6592

Pillay, V. et al., S.Afr.Med.J 105 (2015): 656-658

Pils, D. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 178

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Prasad, N. B. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 945-957

Puente, X. S. et al., Nature 526 (2015): 519-524

Qendro, V. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5031-5040

Qi, Y. et al., Proteomics. 5 (2005): 2960-2971

Qi, Y. et al., J Breast Cancer 18 (2015): 218-224

Qie, S. et al., J Cell Biochem. 115 (2014): 498-509

Qu, Y. M. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 90 (2010): 1958-1962

Qu, Z. et al., Cancer Med. 3 (2014): 453-461

Quillien, V. et al., Anticancer Res. 17 (1997): 387-391

Rabinovitz, I. et al., Biochem.Cell Biol 74 (1996): 811-821

Rabinovitz, I. et al., Clin Exp.Metastasis 13 (1995): 481-491

Rad, E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1149-1160

Rai, R. et al., Oral Oncol 40 (2004): 705-712

Raica, M. et al., Anticancer Res 28 (2008): 2997-3006

Ramirez-Exposito, M. J. et al., Maturitas 72 (2012): 79-83

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Reeb, A. N. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E232-E242

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Rehman, I. et al., PLoS.One. 7 (2012): e30885

Reis, S. T. et al., Clinics.(Sao Paulo) 68 (2013): 652-657

Remmelink, M. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 247-258

Revill, K. et al., Gastroenterology 145 (2013): 1424-1435

Ricketts, C. J. et al., Clin Epigenetics. 5 (2013): 16

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132

Roemer, A. et al., J Urol. 172 (2004): 2162-2166

Romana, S. P. et al., Leukemia 20 (2006): 696-706

Rozenblum, E. et al., Hum.Genet. 110 (2002): 111-121

Ruminy, P. et al., Leukemia 25 (2011): 681-688

Safadi, R. A. et al., Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol. 121 (2016): 402-411

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Sanchez-Palencia, A. et al., Int.J Cancer 129 (2011): 355-364

Santarpia, L. et al., Oncologist. 18 (2013): 1063-1073

Sarma, S. N. et al., Environ.Toxicol.Pharmacol. 32 (2011): 285-295

Sathyanarayana, U. G. et al., Cancer Res 64 (2004): 1425-1430

Sato, T. et al., Oncogene 33 (2014): 2215-2224

Sato, Y. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 28 (2013): 1422-1429

Savaskan, N. E. et al., Ann.Anat. 192 (2010): 309-313

Savaskan, N. E. et al., Curr.Neuropharmacol. 13 (2015): 258-265

Savoy, R. M. et al., Endocr.Relat Cancer 20 (2013): R341-R356

Schlieben, P. et al., Vet.J 194 (2012): 210-214

Schmitt-Graeff, A. et al., Histopathology 51 (2007): 87-97

Schuld, N. J. et al., Cell Cycle 13 (2014): 941-952

Schumann, H. et al., Br.J Dermatol. 167 (2012): 929-936

Scrideli, C. A. et al., J Neurooncol. 88 (2008): 281-291

Seda, V. et al., Eur.J Haematol. 94 (2015): 193-205

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Seitz, S. et al., Eur.J Cancer 36 (2000): 1507-1513

Semenza, G. L., Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol 76 (2011): 347-353

Seong, J. et al., Mol.Biol.Rep. 39 (2012): 3597-3601

Sethi, M. K. et al., J Proteomics. 126 (2015): 54-67

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Shi, Z. et al., Int.J Gynecol.Cancer 22 (2012): 1125-1129

Shi, Z. G. et al., Clin Transl.Oncol 17 (2015): 65-73

Shibano, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0127271

Shin, S. H. et al., Lab Invest 94 (2014): 1396-1405

Shruthi, D. K. et al., J Oral Maxillofac.Pathol. 18 (2014): 365-371

Silva, J. M. et al., Cell 137 (2009): 1047-1061

Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542

Singh, V. et al., OMICS. 19 (2015): 688-699

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Slaga, T. J. et al., J Investig.Dermatol.Symp.Proc. 1 (1996): 151-156

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Sobolik-Delmaire, T. et al., Cell Commun.Adhes. 14 (2007): 99-109

Spurr, I. B. et al., Chembiochem. 13 (2012): 1628-1634

Stahl, M. et al., Ann.Oncol. 24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56

Stull, R. A. et al., BMC.Genomics 6 (2005): 55

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Sugimoto, K. J. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8980-8987

Suh, J. H. et al., J Korean Med.Sci. 28 (2013): 593-601

Sun, M. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 340 (2006): 209-214

Sun, Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 450 (2014): 1-6

Suzuki, S. et al., Pathol.Res Pract. 210 (2014): 130-134

Swain, N. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 8407-8413

Szeliga, M. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 1855-1862

Takabe, P. et al., Exp.Cell Res 337 (2015): 1-15

Takahashi, H. et al., Urology 79 (2012): 240-248

Takeda, H. et al., Nat Genet. 47 (2015): 142-150

Tamada, M. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 5554-5561

Tan, B. S. et al., Mol.Cancer Ther. 10 (2011): 1982-1992

Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10 (1997): 1113-1117

Tang, H. et al., Anticancer Drugs 18 (2007): 633-639

Tang, H. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 1577-1586

Tang, J. Q. et al., Beijing Da.Xue.Xue.Bao. 41 (2009): 531-536

Tang, J. Q. et al., Chin Med.J (Engl.) 123 (2010): 3559-3565

Tanis, T. et al., Arch.Oral Biol 59 (2014): 1155-1163

Tech, K. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 268-272

Teng, B. P. et al., Anticancer Agents Med.Chem 11 (2011): 620-628

Terada, T., Int.J Clin Exp.Pathol. 5 (2012): 596-600

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Tew, G. W. et al., J Biol Chem 283 (2008): 963-976

Thomas, A. et al., Cancer Med. 2 (2013): 836-848

Tian, S. Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 3752-3762

Tofuku, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 175-183

Toh, U. et al., Int.J Clin Oncol 7 (2002): 372-375

Toh, U. et al., Clin Cancer Res. 6 (2000): 4663-4673

Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42

Tota, G. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 963

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Truong, T. et al., Endocr.Relat Cancer 21 (2014): 629-638

Tsujimoto, H. et al., Mol.Carcinog 26 (1999): 298-304

Tuupanen, S. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 1657-1662

Tuval-Kochen, L. et al., PLoS.One. 8 (2013): e77260

Twa, D. D. et al., J Pathol. 236 (2015): 136-141

Twarock, S. et al., Mol.Cancer 10 (2011): 30

Tzellos, T. G. et al., J Eur.Acad.Dermatol.Venereol. 25 (2011): 679-687

Urosevic, J. et al., Nat Cell Biol 16 (2014): 685-694

Vachani, A. et al., Clin Cancer Res. 13 (2007): 2905-2915

Valladares-Ayerbes, M. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 19 (2010): 1432-1440

Valletta, D. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1407-1415

van, Geldermalsen M. et al., Oncogene (2015)

Varga, A. E. et al., Oncogene 24 (2005): 5043-5052

Varona, A. et al., Am.J Physiol Renal Physiol 292 (2007): F780-F788

Vasca, V. et al., Oncol Lett. 8 (2014): 2501-2504

Venneti, S. et al., Brain Pathol. 23 (2013): 217-221

Virtakoivu, R. et al., Cancer Res 75 (2015): 2349-2362

Volkmer, J. P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2078-2083

Volpi, A. et al., G.Chir 32 (2011): 59-63

Vui-Kee, K. et al., Kaohsiung.J Med.Sci. 28 (2012): 243-250

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Wang, D. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 458 (2015a): 313-320

Wang, H. et al., Front Oncol 4 (2014): 377

Wang, H. et al., Cancer Cell 18 (2010): 52-62

Wang, J. et al., Oncol Rep. 33 (2015b): 1326-1334

Wang, T. et al., Tumour.Biol (2015c)

Wang, W. M. et al., J Biol Chem 278 (2003): 19549-19557

Wang, X. et al., Eur.J Pharmacol. 768 (2015d): 116-122

Wang, X. M. et al., PLoS.One. 8 (2013a): e55714

Wang, X. Y. et al., Int J Hyperthermia 29 (2013): 364-375

Wang, Y. et al., Neoplasma 62 (2015e): 966-973

Wang, Z. et al., Oncotarget. 4 (2013b): 2476-2486

Wang, Z. et al., Melanoma Res 14 (2004): 107-114

Warner, S. L. et al., Future.Med.Chem 6 (2014): 1167-1178

Watanabe, Y. et al., Gastroenterology 136 (2009): 2149-2158

Wegdam, W. et al., PLoS.One. 9 (2014): e108046

Wehner, M. et al., FEBS J 277 (2010): 1597-1605

Weiss, I. et al., Int.J Mol.Sci. 13 (2012): 12925-12938

Weissbach, S. et al., Br.J Haematol. 169 (2015): 57-70

Wiedl, T. et al., J Proteomics. 74 (2011): 1884-1894

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Willoughby, V. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 16 (2008): 344-348

Wittke, I. et al., Cancer Lett. 162 (2001): 237-243

Wojtalewicz, N. et al., PLoS.One. 9 (2014): e90461

Wong, N. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 184-191

Woo, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0142642

World Cancer Report, (2014)

Wu, G. et al., Onco.Targets.Ther. 8 (2015): 2067-2074

Wu, S. et al., Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 45 (2013): 27-35

Wu, X. et al., Cancer Res 70 (2010): 2718-2727

Xiang, Y. et al., J Clin Invest 125 (2015): 2293-2306

Xu, J. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014): 5732-5744

Xu, X. et al., Oncotarget. 6 (2015): 26161-26176

Xue, L. Y. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi. 32 (2010): 838-844

Yager, M. L. et al., Br.J Cancer 89 (2003): 860-863

Yamaguchi, T. et al., Dis.Colon Rectum 49 (2006): 399-406

Yamamoto, M. et al., PLoS.One. 6 (2011): e17149

Yamamoto, N. et al., Int.J Oncol 42 (2013): 1523-1532

Yang, C. et al., Tumour.Biol (2015a)

Yang, C. et al., Exp.Cell Res 331 (2015b): 377-386

Yang, H. Y. et al., J Proteomics. 75 (2012): 3639-3653

Yang, J. Y. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 388

Yang, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015c): 1265-1275

Yang, W. et al., Cancer Lett. 339 (2013): 153-158

Yang, W. et al., Nature 499 (2013a): 491-495

Yang, W. et al., Int.J Oncol 42 (2013b): 690-698

Yao, M. et al., Cancer Med. 3 (2014): 845-854

Yao, R. et al., Histol.Histopathol. 22 (2007): 1025-1032

Yu, D. et al., Oncotarget. 6 (2015a): 7619-7631

Yu, X. et al., Cancer Res 73 (2013): 2093-2103

Yu, Y. et al., Cancer Cell 28 (2015b): 82-96

Yuan, B. et al., Immunobiology 217 (2012): 738-742

Zang, W. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 37

Zanini, S. et al., Cell Signal. 27 (2015): 899-907

Zare, M. et al., Mol.Carcinog 51 (2012): 796-806

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zha, C. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0122322

Zhang, D. et al., J Cell Mol.Med. 16 (2012): 1047-1059

Zhang, H. Y. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014): 5519-5524

Zhang, Q. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015a): 691-703

Zhang, S. et al., Cancer Res 64 (2004): 2977-2983

Zhang, S. et al., J Mol.Histol. 45 (2014): 283-292

Zhang, S. N. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 85 (2005): 1348-1351

Zhang, T. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 72

Zhang, X. et al., Int.J Cancer 137 (2015b): 2803-2814

Zhang, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015c): 5979-5985

Zhang, X. et al., PLoS.One. 8 (2013): e72458

Zhang, Y. et al., Cancer Metastasis Rev 34 (2015d): 249-264

Zhang, Z. Z. et al., Mol.Cancer Ther. 14 (2015e): 1162-1170

Zhao, D. et al., J Neurooncol. 118 (2014a): 39-47

Zhao, G. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 408 (2011): 154-159

Zhao, H. et al., Gene 548 (2014b): 234-243

Zhao, L. J. et al., Chin Med.J (Engl.) 126 (2013): 4260-4264

Zheng, Q. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 6255-6264

Zheng, R. et al., Int.Immunopharmacol. 29 (2015): 919-925

Zhi, H. et al., J Pathol. 217 (2009): 389-397

Zhou, Y. F. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 13172-13177

Zhu, H. et al., Cancer Lett. 245 (2007a): 303-314

Zhu, L. et al., J Dermatol.Sci. 72 (2013a): 311-319

Zhu, S. et al., J Biol Chem 282 (2007b): 14328-14336

Zhu, Y. et al., Prostate 73 (2013b): 1614-1622

Zhu, Y. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 14488-14496

P87776746MD

NOI PEPTIDE ŞI COMBINAŢII DE PEPTIDE PENTRU UTILIZARE ÎN IMUNOTERAPIE ÎMPOTRIVA CANCERULUI ESOFAGIAN ŞI A ALTOR CANCERE

FUNDAMENTELE INVENŢIEI

g) Antigeni pentru cancer testicular: Primele TAA identificate vreodată care se pot recunoaşte de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece expresia membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, în ţesuturile naturale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, din placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi prin urmare pot fi consideraţi specifici tumorii din punct de vedere imunologic specifice tumorii. Exemple bine cunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1. h) Antigeni de diferenţiere: Aceste TAA sunt comune tumorilor şi ţesutului normal din care provin tumorile. Majoritatea antigenilor de diferenţiere cunoscuţi sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine corelate cu linia melanocitară sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi Melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic. i) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA-uri larg exprimate au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu nivele reduse de expresie. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei anterior stabilite. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza sau WT1. j) Antigeni specifici tumorii: Aceste TAA unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabile să inducă un răspuns imunitar puternic fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA sunt în majoritatea cazurilor relevante numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea (sau asocierea) cu tumoarea a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon din tumoare (asociat tumorii) în cazul izoformelor specifice tumorii (asociate tumorii). k) TAA care apar prin modificări anormale post-translaţie: aceste TAA apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supra-exprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în mod principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindarea proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii. l) Proteine oncovirale: aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervical. Imunoterapia bazată pe celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate tumorii sau specifice tumori, care sunt prezentate de molecule ale complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T specifice tumorii, epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum ar fi enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, sunt, de obicei, suprareglate în celulele respectivei tumori. Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ greu alfa şi din beta-2-microglobuline, molecule MHC de clasă II ale unui lanţ alfa şi ale unui lanţ beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă o incizură de legare care este folosită pentru interacţiuni necovalente cu peptide. Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. MHC de clasă I prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribozomale defecte (DRIP) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimentele endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatura de specialitate ca „prezentare încrucişată» (Brossart şi Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri, de exemplu în timpul endocitozei, şi care sunt procesate ulterior. Complexele de peptidă şi MHC de clasă I sunt recunoscute de celule T CD8-pozitive purtătoare de receptor de celule T (TCR) adecvat, în timp ce complexele de peptidă şi molecule MCH de clasă II sunt recunoscute de celule T helper CD4-pozitive cu TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut că TCR, peptida şi MHC sunt prezente în raport stoechiometric 1:1:1. Celulele T pozitive pentru CD4 joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice pozitive pentru CD8. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigenii asociaţi tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imunitare antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu citokinic favorabil celulelor T (CTL-favorabil) (Mortara et al., 2006) şi atrag celulele efectoare, de exemplu CTL-uri, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007). În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele profesioniste prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, celulele tumorale au fost identificate că exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006). Peptidele alungite (mai lungi) din invenţie pot acţiona ca epitopi activi ai MHC de clasă II. Celulele T helper, activate de epitopii MHC de clasă II, joacă un rol important în modularea rolului efector al CTL în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe MHC/peptide asociate tumorii. Astfel epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singur sau asociat cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral. S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8 pozitive, celulele T CD4-pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ) (Beatty şi Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi pentru celule T CD4 ca efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014). Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este, de obicei, limitată la celulele imune, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice un număr de epitopi MHC de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1). Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de celule T CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) este important în dezvoltarea de vaccinuri tumorale. Pentru ca o peptidă MHC de clasă II să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie, de asemenea, să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu incizura de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de incizura de legare. În cazul reacţiile imunitare dependente de MHC de clasă I, peptidele nu numai că se pot lega de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, dar trebuie să fie şi recunoscute ulterior de celulele T care prezintă receptori specifici pentru celulele T (TCR). Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici tumorii sau asociaţi tumorii, şi pentru a putea fi utilizate în terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul trebuie să fie exprimat preponderent în celulele tumorale, şi deloc sau nici măcar în cantităţi mici în ţesuturile sănătoase. Într-o realizare preferată, peptida trebuie să fie supraprezentată de celulele tumorale comparativ cu ţesuturile sănătoase normale. Este, de asemenea, de dorit ca respectivul antigen să nu fie prezent într-un singur tip de tumoare, şi să fie prezent în concentraţii mari (de exemplu, număr de copii per celulă pentru respectiva peptidă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorale datorită funcţiei lor, de exemplu, în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Aceşti antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi de asemenea ţinta unei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţială prezenţa epitopilor în secvenţa de aminoacizi a antigenului pentru a se asigura faptul că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), fiind derivată dintr-un antigen asociat tumorii, duce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T. În principiu, orice peptidă care se poate lega de o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vitro sau in vivo, este prezenţa unei celule având TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop. Prin urmare, TAA sunt un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, incluzând, însă nelimitându-se la vaccinuri tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care se pot izola de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Cu toate acestea, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Aceasta deoarece numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie deoarece o linie de celule T cu TCR corespunzător trebuie să fie prezentă iar toleranţa imunologică pentru acest anumit epitop trebuie să fie absentă sau minimală. Într-o concretizare foarte preferată a invenţiei este, deci, important să se selecteze numai acele peptide prezentate peste sau selectiv împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un anumit antigen, pot fi extinse clonal şi pot executa funcţii efector („celule T efectoare»).

REZUMATUL INVENŢIEI

Tabelul 3: Pepetide utile pentru, de exemplu, terapii anticancer personalizate

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢEI

identitate procentuală = 100 [1-(C/R)]

(iv) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată şi (v) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă şi (vi) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă diferenţe;

(iiii) alinierea trebuie să înceapă la poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

În plus, peptida entru utilizare poate include legături non-peptidice.

Este prezentată un kit care cuprinde:

(d) un recipient conţinând o compoziţie farmaceutică conform descrierii de mai sus, în soluţie sau în formă liofilizată; (e) opţional, un al doilea container care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi (f) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate. Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este, preferabil, o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă, şi poate fi un recipient reutilizabil. Compusul farmacologic este, preferabil, liofilizat. Trusele prezentate vor conţine, preferabil, formula liofilizată care face obiectul prezentului brevet într-un recipient adecvat şi instrucţiunile pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, fiole (de exemplu fiole dublu compartimentate), seringi (cum ar fi seringile dublu-compartimentate) şi eprubete. Recipientul poate fi construit dintr-o varietate de materiale, de exemplu sticlă sau plastic. Preferabil, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni privind (sau asociate cu) recipientul, care prezintă instrucţiunile de reconstituire şi/sau administrare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrarea subcutanată. Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu). La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi preferabil nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). În plus trusa poate include şi alte materiale necesare din punct de vedere comercial şi al utilizării, inclusiv alte soluţii tampon, alţi dizolvanţi, filtre, ace, seringi şi pliante cu instrucţiuni de utilizare. Trusele prezentate pot avea un singur recipient care conţine formula compusului farmacologic conform cu prezentul brevet, cu sau fără alte componente (de exemplu alţi compuşi sau alte formule farmacologice ale acestor alţi compuşi) sau pot prezenta câte un recipient distinct pentru fiecare compus. Preferabil, trusele prezentate includ o formă de condiţionare care face obiectul brevetului ambalată pentru utilizarea în combinaţie cu coadministrarea cu un al doilea compus (cum ar fi adjuvanţii (de exemplu GM-CSF, agent chimioterapeutic, produs natural, hormon sau antagonist, agent antiangiogenetic sau inhibitor de angiogeneză, agent inductor de apoptoză sau chelator) sau cu un compus farmacologic al acestora. Componentele trusei pot fi pre-amestecate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat, distinct, înainte de administrarea către pacient. Componentele trusei se pot furniza în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil soluţii apoase, şi în mod ideal ca soluţii apoase sterile. Componentele trusei pot fi furnizate de asemenea şi în stare solidă, care se poate converti în stare lichidă prin adăugarea solvenţilor adecvaţi, care se vor furniza preferabil într-un recipient distinct. Recipientul unei truse terapeutice poate fi fiolă, eprubetă, flacon, sticlă, seringă sau orice altă formă de depozitare a unui solid sau lichid. De obicei, dacă este vorba de mai mult de un singur component, trusa va include şi o a doua fiolă sau un alt recipient, care permite dozarea separată. Trusa poate include şi un alt recipient pentru un lichid farmacologic acceptabil. Preferabil, trusa terapeutică va include şi un sistem (de exemplu unul sau mai multe ace, seringi, picurătoare pentru ochi, pipete etc.) care permit administrarea agenţilor prezentaţi care intră în componenţa trusei. Formula prezentă este una adecvată pentru administrarea peptidelor pe o cale de administrare acceptabilă, cum ar fi orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. Preferabil, administrarea va fi subcutanată şi, cel mai preferabil, intradermică. Administrarea se poate face prin injectomat. Deoarece peptida pentru utilizare din invenţie este izolată din cancer esofagian, medicamentul din invenţie este folosit, de preferinţă, pentru tratarea cancerului esofagian. Într-un exemplu de concretizare, peptidele incluse în vaccin sunt identificate prin: (a) identificarea peptidelor asociate tumorii (TUMAP-uri) prezentate de o probă tumorală de la pacientul individual; şi (b) selectarea a cel puţin unei peptide identificate de novo la litera (a) şi confirmarea imunogenităţii acesteia. După ce sunt selectate peptidele pentru un vaccin peptidic personalizat, vaccinul este produs. De preferinţă, vaccinul este o formulare lichidă care constă din peptidele individuale dizolvate între 20%-40% DMSO, de preferinţă aproximativ 30%-35% DMSO, de exemplu aproximativ 33% DMSO. Fiecare peptidă care trebuie inclusă într-un produs este dizolvată în DMSO. Concentraţia soluţiilor peptidice unice trebuie aleasă în funcţie de numărul de peptide care trebuie incluse în produs. Soluţiile de peptidă-DMSO individuale se amestecă în părţi egale pentru a se obţine o soluţie care conţine toate peptidele care trebuie incluse în produs cu o concentraţie de ~2,5 mg/ml per peptidă. Soluţia amestecată este apoi diluată la 1:3 cu apă pentru injecţii pentru a se atinge o concentraţie de 0,826 mg/ml per peptidă în 33% DMSO. Soluţia diluată este filtrată folosindu-se un filtru steril de 0,22 µm. Se obţine soluţia vrac finală. Soluţia vrac finală este introdusă în flacoane şi este depozitată la -20°C până în momentul utilizării. Un flacon conţine 700 µl de soluţie care conţine 0,578 mg din fiecare peptidă. Din această cantitate, 500 μl (aproximativ 400 µg per peptidă) vor fi aplicaţi pentru injectare intradermală. Prezenta invenţie va fi descrisă acum în următoarele exemple care arată încorporările preferate ale acesteia şi cu referire la figurile însoţitoare, fără a fi totuşi limitată la acestea.

FIGURI

EXEMPLE

EXEMPLUL 1

Probe de ţesut

Izolarea peptidelor HLA din probe de ţesut.

Analize prin spectrometrie de masă

Tabelul 8: Scoruri de prezentare

EXEMPLUL 2

Profilarea exprimării genelor care codifică peptidele descrise

Surse de ARN şi pregătirea acestora

Experimente RNAseq

EXEMPLUL 3

Imunogenitatea in vitro pentru peptide prezentate MHC de clasă I

Stimularea in vitro a celulelor T CD8+

Imunogenitatea in vitro pentru peptide de cancer esofagian

Tabelul 10A: Imunogenitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

Tabelul 10B: Imunogenicitatea in vitro a peptidelor HLA de clasă I descrise

EXEMPLUL 4

Sinteza peptidelor

EXEMPLUL 5

Teste de legare la MHC

Tabelul 11: Scoruri de legare MHC clasă I.

EXEMPLUL 6

Cuantificarea peptidelor prin nanoLC-MS/MS

Eficacitatea izolării peptidelor/MHC-urilor

Determinarea numărului de celule în ţesut solid, îngheţat

Copii de peptide per celulă

Referinţe

Abbas, W. et al., Front Oncol 5 (2015): 75

Adams, S. et al., PLoS.One. 9 (2014): e112945

Al Moustafa, A. E. et al., Oncogene 21 (2002): 2634-2640

Al-Mahdi, R. et al., Cell Adh.Migr. (2015): 0

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124

Alholle, A. et al., Epigenetics. 8 (2013): 1198-1204

Ali, R. H. et al., Hum.Pathol. 45 (2014): 2453-2462

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

Alper, M. et al., Mol.Cell Biochem. 393 (2014): 165-175

Alsagaby, S. A. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5051-5062

Altmannsberger, M. et al., Am.J Pathol. 118 (1985): 85-95

Ammendola, M. et al., PLoS.One. 9 (2014): e99512

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Arentz, G. et al., Clin Proteomics. 8 (2011): 16

Arif, Q. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 978-980

Auvinen, P. et al., Breast Cancer Res Treat. 143 (2014): 277-286

Avasarala, S. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76895

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Bandres, E. et al., Oncol Rep. 12 (2004): 287-292

Banerjee, K. et al., Int.J Cancer (2015)

Barros-Filho, M. C. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E890-E899

Bashyam, M. D. et al., Neoplasia. 7 (2005): 556-562

Basu, S. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0123979

Baxter, P. A. et al., Acta Neuropathol.Commun. 2 (2014): 160

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Becker, S. A. et al., Cancer Res 56 (1996): 5092-5097

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bellon, M. et al., Blood 121 (2013): 5045-5054

Bhattacharjee, R. B. et al., Cell Biol Int. 36 (2012): 697-704

Bin Amer, S. M. et al., Saudi.Med.J 29 (2008): 507-513

Blanch, A. et al., PLoS.One. 8 (2013): e66436

Blanco, M. A. et al., Cell Res 22 (2012): 1339-1355

Blenk, S. et al., Cancer Inform. 3 (2007): 399-420

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Boyer, A. P. et al., Mol.Cell Proteomics. 12 (2013): 180-193

Bozza, W. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 32723-32736

Braulke, T. et al., Arch.Biochem.Biophys. 298 (1992): 176-181

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brechmann, M. et al., Immunity. 37 (2012): 697-708

Bredholt, G. et al., Oncotarget. 6 (2015): 39676-39691

Breuninger, S. et al., Am.J Pathol. 176 (2010): 2509-2519

Brezinova, J. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 173 (2007): 10-16

Broghammer, M. et al., Cancer Lett. 214 (2004): 225-229

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Buckley, N. E. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1070

Bui, P. H. et al., Mol.Pharmacol. 76 (2009): 1044-1052

Buim, M. E. et al., Oncology 69 (2005): 445-454

Bujas, T. et al., Eur.J Histochem. 55 (2011): e7

Cai, J. L. et al., Chin J Cancer Res 23 (2011): 59-63

Cai, Q. et al., Nat Genet. 46 (2014): 886-890

Calmon, M. F. et al., Epigenetics. 10 (2015): 622-632

Calvo, N. et al., Biochem.Cell Biol 92 (2014): 305-315

Canet, B. et al., Hum.Pathol. 42 (2011): 833-839

Cao, Z. et al., Mol.Oncol 8 (2014): 285-296

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Carinci, F. et al., Int.J Immunopathol.Pharmacol. 18 (2005): 513-524

Cazier, J. B. et al., Nat Commun. 5 (2014): 3756

Cetindis, M. et al., Eur.Arch.Otorhinolaryngol. (2015)

Chakrabarti, G. et al., Cancer Metab 3 (2015): 12

Chaneton, B. et al., Trends Biochem.Sci. 37 (2012): 309-316

Chang, I. W. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 5441-5450

Chang, J. W. et al., Anticancer Res 32 (2012): 1259-1265

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Chauvet, C. et al., PLoS.One. 6 (2011): e22545

Che, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6559-6568

Chen, B. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 305-315

Chen, K. D. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014a): e1244

Chen, L. et al., Int.J Mol.Sci. 15 (2014b): 11435-11445

Chen, Q. et al., Cell Physiol Biochem. 35 (2015a): 1052-1061

Chen, R. S. et al., Oncogene 28 (2009): 599-609

Chen, S. et al., Cancer Epidemiol. 37 (2013): 172-178

Chen, W. M. et al., Dig.Dis.Sci. 60 (2015b): 1655-1662

Chen, Y. et al., Med.Oncol 31 (2014c): 304

Chen, Y. C. et al., Int.J Cancer 135 (2014d): 117-127

Chen, Z. T. et al., Int.J Mol.Sci. 16 (2015c): 15497-15530

Cheon, D. J. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 711-723

Cheuk, W. et al., Pathology 33 (2001): 7-12

Cho, S. J. et al., PLoS.One. 8 (2013): e71724

Choi, W. I. et al., Cell Physiol Biochem. 23 (2009): 359-370

Chuang, W. Y. et al., Histol.Histopathol. 28 (2013): 293-299

Chung, J. et al., J Cell Biol 158 (2002): 165-174

Chung, T. K. et al., Int.J Cancer 137 (2015): 776-783

Cimino, D. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 1327-1338

Cipriano, R. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1156-1165

ClinicalTrials.gov, (2015), http://www.clinicaltrials.gov

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Council, L. et al., Mod.Pathol. 22 (2009): 639-650

Crossen, P. E. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 113 (1999): 126-133

Cui, D. et al., Oncogene 33 (2014): 2225-2235

Daigeler, A. et al., J Exp.Clin Cancer Res 27 (2008): 82

Dang, C. V. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 6479-6483

Dang, Q. et al., Med.Oncol 31 (2014): 24

Dar, A. A. et al., Immunology (2015)

Davids, M. S. et al., Leuk.Lymphoma 53 (2012): 2362-2370

Davidson, B. et al., Hum.Pathol. 45 (2014): 691-700

de Groen, F. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 53 (2014): 339-348

de Jonge, H. J. et al., Leukemia 25 (2011): 1825-1833

de Sa, V. K. et al., Braz.J Med.Biol Res 46 (2013): 21-31

De, Keersmaecker K. et al., Haematologica 99 (2014): 85-93

De, Ponti A. et al., Cancer Lett. 369 (2015): 396-404

Deacu, E. et al., Cancer Res 64 (2004): 7690-7696

Deb, S. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 1223-1230

Debiec-Rychter, M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 38 (2003): 187-190

DeLaBarre, B. et al., Chem Biol 21 (2014): 1143-1161

Delker, D. A. et al., PLoS.One. 9 (2014): e88367

Demirag, G. G. et al., Med.Oncol 29 (2012): 1518-1522

Demirci, H. et al., J Ophthalmic Vis.Res 8 (2013): 303-307

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Depianto, D. et al., Nat Genet. 42 (2010): 910-914

Ding, L. et al., Nature 481 (2012): 506-510

Dotlic, S. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 22 (2014): 537-542

Downie, D. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 7369-7375

Draberova, E. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 74 (2015): 723-742

Drayton, R. M. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 1990-2000

Du, J. et al., Int.J Mol.Sci. 13 (2012): 15755-15766

Duanmin, H. et al., Hepatogastroenterology 60 (2013): 870-875

Dubrowinskaja, N. et al., Cancer Med. 3 (2014): 300-309

Ehrlichova, M. et al., Genomics 102 (2013): 96-101

El-Naggar, A. M. et al., Cancer Cell 27 (2015): 682-697

Espinosa, A. M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e55975

Esseghir, S. et al., J Pathol. 210 (2006): 420-430

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Fang, J. et al., BMC.Cancer 8 (2008a): 69

Fang, W. et al., J Transl.Med. 6 (2008b): 32

Fejzo, M. S. et al., Int.J Mol.Sci. 14 (2013): 3094-3109

Fellenberg, F. et al., J Invest Dermatol. 122 (2004): 1510-1517

Feng, G. et al., Leuk.Lymphoma 55 (2014): 2699-2705

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Fontaine, J. F. et al., PLoS.One. 4 (2009): e7632

Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett. 31 (2009): 819-823

Fu, A. et al., Mol.Med.Rep. 11 (2015a): 4727-4733

Fu, Y. et al., Cancer Biol.Ther 5 (2006): 741-744

Fu, Z. C. et al., Med.Sci.Monit. 21 (2015b): 1276-1287

Fujita, A. et al., Genet.Mol.Res 7 (2008): 371-378

Fujita, N. et al., J Biochem. 152 (2012): 407-413

Fujiwara, K. et al., PLoS.One. 9 (2014): e107247

Furukawa, C. et al., Cancer Res 65 (2005): 7102-7110

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gao, Y. B. et al., Nat Genet. 46 (2014): 1097-1102

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giallourakis, C. C. et al., J Immunol. 190 (2013): 5578-5587

Giovinazzo, F. et al., Cell Signal. 25 (2013): 651-659

Gkika, D. et al., J Cell Biol 208 (2015): 89-107

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Goode, G. et al., PLoS.One. 9 (2014): e100103

Gordon, G. J. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 169

Gorski, J. J. et al., Breast Cancer Res Treat. 122 (2010): 721-731

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Groulx, J. F. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1217-1227

Guo, X. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 11846

Gupta, V. et al., Curr.Pharm.Des 20 (2014): 2595-2606

Hagel, C. et al., J Neurooncol. 112 (2013): 191-197

Haggman, M. J. et al., Urology 50 (1997): 643-647

Hammam, O. et al., J Egypt.Soc.Parasitol. 44 (2014): 733-740

Hapgood, G. et al., Blood 126 (2015): 17-25

Haraguchi, N. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 425-430

Harris, T. M. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 139 (2015): 494-507

Haslene-Hox, H. et al., Biochim.Biophys.Acta 1834 (2013): 2347-2359

Hatina, J. et al., Neoplasma 59 (2012): 728-736

Hauser, A. D. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 130-142

He, X. et al., Int.J Biol Macromol. 72 (2015): 1081-1089

Heffler, M. et al., Anticancer Agents Med.Chem 13 (2013): 584-594

Heubeck, B. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): e1-e7

Hoeflich, K. P. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 839-849

Hofsli, E. et al., Br.J Cancer 99 (2008): 1330-1339

Hogan, L. E. et al., Blood 118 (2011): 5218-5226

Hountis, P. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 7327-7333

Hu, C. K. et al., Mol.Biol Cell 23 (2012): 2702-2711

Huang, F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 1093-1100

Huang, S. L. et al., Cancers (Basel) 7 (2015): 1052-1071

Huang, Y. D. et al., Hua Xi.Kou Qiang.Yi.Xue.Za Zhi. 25 (2007): 500-503

Huang, Z. et al., Indian J Otolaryngol.Head Neck Surg. 66 (2014b): 120-125

Huang, Z. et al., J Oral Pathol.Med. 43 (2014c): 191-198

Hussey, G. S. et al., Mol Cell 41 (2011): 419-431

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

Ichinose, J. et al., Cancer Sci. 105 (2014): 1135-1141

Ida-Yonemochi, H. et al., Mod.Pathol. 25 (2012): 784-794

Ii, M. et al., Int.J Oncol 39 (2011): 593-599

Inoue, H. et al., Int.J Cancer 63 (1995): 523-526

Inoue, K. et al., Subcell.Biochem. 85 (2014): 17-40

Iqbal, M. A. et al., FEBS Lett. 588 (2014): 2685-2692

Irifune, H. et al., Cancer Biol Ther. 4 (2005): 449-455

Ismail, M. F. et al., Tumour.Biol (2015)

Israelsen, W. J. et al., Semin.Cell Dev.Biol 43 (2015): 43-51

Jamieson, N. B. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 3316-3331

Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 240-245

Jiang, L. et al., Cell Cycle 14 (2015): 2881-2885

Jin, J. et al., Int.J Hematol. 99 (2014): 750-757

Johnson, R. H. et al., Oncotarget. (2015)

Johnstone, C. N. et al., Dis.Model.Mech. 8 (2015): 237-251

Joosse, S. A. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 993-1003

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Kabbage, M. et al., J Biomed.Biotechnol. 2008 (2008): 564127

Kanehira, M. et al., Cancer Res 67 (2007): 3276-3285

Kang, S. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 5638-5645

Kao, C. J. et al., Oncogene 27 (2008): 1397-1403

Karlsson, J. et al., Cancer Lett. 357 (2015): 498-501

Kato, I. et al., Pathol.Int. 59 (2009): 38-43

Katoh, M., Int.J Oncol 41 (2012): 1913-1918

Kaz, A. M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012): 384-393

Kazma, R. et al., PLoS.One. 7 (2012): e51680

Kerley-Hamilton, J. S. et al., Oncogene 24 (2005): 6090-6100

Khakpour, G. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 4905-4912

Khalil, A. A., Cancer Sci. 98 (2007): 201-213

Khapare, N. et al., PLoS.One. 7 (2012): e38561

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)

Kido, T. et al., Genes (Basel) 1 (2010): 283-293

Kim, S. W. et al., OMICS. 15 (2011): 281-292

Kimura, H. et al., Int.J Oncol 30 (2007): 171-179

Kinoshita, T. et al., Oncotarget. 3 (2012): 1386-1400

Kirov, A. et al., J Cell Biochem. (2015)

Kita, Y. et al., Eur.J Surg.Oncol 35 (2009): 52-58

Klopfleisch, R. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 6380-6391

Koizume, S. et al., Cancer Res 66 (2006): 9453-9460

Koizume, S. et al., World J Clin Oncol 5 (2014): 908-920

Koizume, S. et al., Biomark.Cancer 7 (2015): 1-13

Kono, K. et al., Cancer Sci. 100 (2009): 1502-1509

Kottorou, A. E. et al., Acta Histochem. 114 (2012): 553-561

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Krisenko, M. O. et al., Biochim.Biophys.Acta 1853 (2015): 254-263

Kruse, A. J. et al., Int.J Gynecol.Cancer 24 (2014): 1616-1622

Kulkarni, G. et al., Breast Cancer Res Treat. 102 (2007): 31-41

Kultti, A. et al., Biomed.Res Int. 2014 (2014): 817613

Kumar, M. et al., J Transl.Med. 13 (2015): 8

Kumarakulasingham, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 3758-3765

Kuramitsu, Y. et al., Anticancer Res 30 (2010): 4459-4465

Kurimoto, F. et al., Int.J Mol.Med. 8 (2001): 89-93

Kwon, O. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 406 (2011): 539-545

Larrinaga, G. et al., Dis.Markers 35 (2013): 825-832

Lauvrak, S. U. et al., Br.J Cancer 109 (2013): 2228-2236

Leal, M. F. et al., World J Gastroenterol. 18 (2012): 1531-1537

Ledet, E. M. et al., Prostate 73 (2013): 614-623

Lee, E. J. et al., J Genet.Genomics 42 (2015a): 355-371

Lee, H. W. et al., Dis.Esophagus. (2015b)

Lee, J. et al., Oncoscience. 2 (2015c): 410-418

Lee, J. M., Reprod.Biol Endocrinol. 1 (2003): 69

Lee, M. H. et al., J Cell Sci. 126 (2013): 1744-1752

Lee, M. H. et al., Ann.N.Y.Acad.Sci. 1171 (2009): 87-93

Lee, S. H. et al., EMBO J 25 (2006): 4008-4019

Lee, S. Y. et al., J Clin Invest 122 (2012): 3211-3220

Lei, Y. Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014): 8539-8548

Leithner, K. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 40

Leitlinie Magenkarzinom, 032-009OL, (2012)

Lexander, H. et al., Anal.Quant.Cytol.Histol. 27 (2005): 263-272

Li, C. et al., Oncogene 23 (2004): 9336-9347

Li, C. et al., Am.J Cancer Res 5 (2015a): 1635-1648

Li, R. et al., Oncogene 25 (2006): 2628-2635

Li, X. et al., Pancreas 40 (2011): 753-761

Li, X. Q. et al., PLoS.One. 7 (2012): e31146

Li, Y. et al., Neoplasia. 7 (2005): 1073-1080

Li, Y. et al., Cell Rep. 12 (2015b): 388-395

Li, Y. et al., Lung Cancer 58 (2007): 171-183

Li, Z. et al., Biochim.Biophys.Acta 1846 (2014): 285-296

Liang, B. et al., World J Gastroenterol. 11 (2005a): 623-628

Liang, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 6391-6399

Liang, L. et al., Int.J Oncol 45 (2014): 659-666

Liang, Z. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi. 27 (2005b): 534-537

Liao, J. S. et al., Zhejiang.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 44 (2015a): 329-334

Liao, W. et al., Oncotarget. 6 (2015b): 24132-24147

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lim, M. Y. et al., Int.J Chronic.Dis. 2013 (2013): 578613

Lim, R. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 406 (2011): 408-413

Lin, C. et al., Oncotarget. 6 (2015): 8434-8453

Lin, S. J. et al., J Proteomics. 94 (2013): 186-201

Lin, X. et al., Med.Oncol 31 (2014): 42

Linher-Melville, K. et al., Mol.Cell Biochem. 405 (2015): 205-221

Liu, B. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014a): E786-E795

Liu, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014b): 690-698

Liu, D. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014c): 8153-8162

Liu, J. P. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 87 (2007a): 2719-2723

Liu, L. et al., Oncol Lett. 7 (2014d): 2192-2198

Liu, Y. et al., J Neurooncol. 99 (2010): 13-24

Liu, Y. et al., Cell Death.Dis. 6 (2015): e1630

Liu, Y. et al., Oncol Rep. 18 (2007b): 943-951

Liu, Y. F. et al., Tumour.Biol 35 (2014e): 3731-3741

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Lo, P. K. et al., Oncogene 31 (2012): 2614-2626

Lo, R. K. et al., J Biol Chem 278 (2003): 52154-52165

Lo, W. Y. et al., J Proteome.Res 6 (2007): 2143-2151

Lohr, J. G. et al., Cancer Cell 25 (2014): 91-101

Long, W. et al., J Clin Invest 122 (2012): 1869-1880

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Longerich, T., Pathologe 35 Suppl 2 (2014): 177-184

Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lou, S. et al., Stem Cells 31 (2013): 1942-1953

Lu, Z. et al., Cell Physiol Biochem. 33 (2014): 859-868

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)

Luo, W. et al., Trends Endocrinol.Metab 23 (2012): 560-566

Lv, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 33 (2014): 100

Ma, Y. et al., Mol.Cell Proteomics. 8 (2009): 1878-1890

Madanayake, T. W. et al., BMC.Genomics 14 (2013): 833

Maiso, P. et al., Cancer Res 75 (2015): 2071-2082

Manenti, G. et al., Toxicol.Lett. 112-113 (2000): 257-263

Mao, P. et al., J Biol Chem 286 (2011): 19381-19391

Mao, P. et al., PLoS.One. 8 (2013): e81803

Marcinkiewicz, K. M. et al., Exp.Cell Res 320 (2014): 128-143

Marg, A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 401 (2010): 143-148

Marhold, M. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 556-564

Martin-Rufian, M. et al., J Mol.Med.(Berl) 92 (2014): 277-290

Matassa, D. S. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013): e851

Mayas, M. D. et al., Anticancer Res 32 (2012): 3675-3682

Mazan-Mamczarz, K. et al., PLoS.Genet. 10 (2014): e1004105

Mazurek, S., Ernst.Schering.Found.Symp.Proc. (2007): 99-124

Mazurek, S., Int.J Biochem.Cell Biol 43 (2011): 969-980

McBride, D. J. et al., J Pathol. 227 (2012): 446-455

Melaiu, O. et al., Mutat.Res 771 (2015): 6-12

Messina, M. et al., Blood 123 (2014): 2378-2388

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Mimori, K. et al., Int.J Oncol 11 (1997): 959-964

Mirza, Z. et al., Anticancer Res 34 (2014): 1873-1884

Missero, C. et al., Exp.Dermatol. 23 (2014): 143-146

Moretti, R. M. et al., Oncol Rep. 9 (2002): 1139-1143

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Morris, L. G. et al., Nat Genet. 45 (2013): 253-261

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Mountzios, G. et al., Ann.Oncol 25 (2014): 1889-1900

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211

Mustacchi, G. et al., Int.J Mol.Sci. 14 (2013): 9686-9702

Naba, A. et al., Elife. 3 (2014): e01308

Naboulsi, W. et al., J Proteome.Res (2015)

Naderi, A., Exp.Cell Res 331 (2015): 239-250

Nakao, K. et al., J Gastroenterol. 49 (2014): 589-593

Navara, C. S., Curr.Pharm.Des 10 (2004): 1739-1744

Naz, S. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 14-23

Neumann, M. et al., Blood 121 (2013): 4749-4752

Ng, S. K. et al., Clin Experiment.Ophthalmol. 43 (2015): 367-376

Nikitakis, N. G. et al., Am.J Clin Pathol. 119 (2003): 574-586

Nishida, C. R. et al., Mol.Pharmacol. 78 (2010): 497-502

Nwosu, V. et al., Hum.Mol Genet. 10 (2001): 2313-2318

Nykopp, T. K. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 512

O'Gorman, D. B. et al., Endocrinology 143 (2002): 4287-4294

Oh, H. R. et al., Cell Oncol (Dordr.) 37 (2014): 455-461

Ohigashi, Y. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 2947-2953

Okayama, H. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 23 (2014): 2884-2894

Okoh, V. O. et al., PLoS.One. 8 (2013): e54206

Olstad, O. K. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2201-2216

Ordonez, N. G., Arch.Pathol.Lab Med. 129 (2005): 1407-1414

Orzol, P. et al., Histol.Histopathol. 30 (2015): 503-521

Padden, J. et al., Mol.Cell Proteomics. 13 (2014): 2661-2672

Pan, B. et al., Mol.Biol Rep. 40 (2013): 27-33

Pan, T. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 456 (2015): 452-458

Papagerakis, S. et al., Hum.Pathol. 34 (2003): 565-572

Park, Y. et al., Oncogene 34 (2015): 5037-5045

Parker, L. P. et al., Cancer Genomics Proteomics. 6 (2009): 189-194

Pathak, S. et al., Nutr.Cancer 66 (2014): 818-824

Peng, H. et al., Cell Oncol (Dordr.) 38 (2015): 165-172

Penney, K. L. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 24 (2015): 255-260

Perez, I. et al., Int.J Med.Sci. 12 (2015): 458-467

Persson, F. et al., Cancer Lett. 260 (2008): 37-47

Pflueger, D. et al., Neoplasia. 15 (2013): 1231-1240

Pickering, C. R. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 6582-6592

Pillay, V. et al., S.Afr.Med.J 105 (2015): 656-658

Pils, D. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 178

Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Prasad, N. B. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 945-957

Puente, X. S. et al., Nature 526 (2015): 519-524

Qendro, V. et al., J Proteome.Res 13 (2014): 5031-5040

Qi, Y. et al., Proteomics. 5 (2005): 2960-2971

Qi, Y. et al., J Breast Cancer 18 (2015): 218-224

Qie, S. et al., J Cell Biochem. 115 (2014): 498-509

Qu, Y. M. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 90 (2010): 1958-1962

Qu, Z. et al., Cancer Med. 3 (2014): 453-461

Quillien, V. et al., Anticancer Res. 17 (1997): 387-391

Rabinovitz, I. et al., Biochem.Cell Biol 74 (1996): 811-821

Rabinovitz, I. et al., Clin Exp.Metastasis 13 (1995): 481-491

Rad, E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1149-1160

Rai, R. et al., Oral Oncol 40 (2004): 705-712

Raica, M. et al., Anticancer Res 28 (2008): 2997-3006

Ramirez-Exposito, M. J. et al., Maturitas 72 (2012): 79-83

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Reeb, A. N. et al., J Clin Endocrinol.Metab 100 (2015): E232-E242

Rehman, I. et al., PLoS.One. 7 (2012): e30885

Reis, S. T. et al., Clinics.(Sao Paulo) 68 (2013): 652-657

Remmelink, M. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 247-258

Revill, K. et al., Gastroenterology 145 (2013): 1424-1435

Ricketts, C. J. et al., Clin Epigenetics. 5 (2013): 16

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132

Roemer, A. et al., J Urol. 172 (2004): 2162-2166

Romana, S. P. et al., Leukemia 20 (2006): 696-706

Rozenblum, E. et al., Hum.Genet. 110 (2002): 111-121

Ruminy, P. et al., Leukemia 25 (2011): 681-688

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Sanchez-Palencia, A. et al., Int.J Cancer 129 (2011): 355-364

Santarpia, L. et al., Oncologist. 18 (2013): 1063-1073

Sarma, S. N. et al., Environ.Toxicol.Pharmacol. 32 (2011): 285-295

Sathyanarayana, U. G. et al., Cancer Res 64 (2004): 1425-1430

Sato, T. et al., Oncogene 33 (2014): 2215-2224

Sato, Y. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 28 (2013): 1422-1429

Savaskan, N. E. et al., Ann.Anat. 192 (2010): 309-313

Savaskan, N. E. et al., Curr.Neuropharmacol. 13 (2015): 258-265

Savoy, R. M. et al., Endocr.Relat Cancer 20 (2013): R341-R356

Schlieben, P. et al., Vet.J 194 (2012): 210-214

Schmitt-Graeff, A. et al., Histopathology 51 (2007): 87-97

Schuld, N. J. et al., Cell Cycle 13 (2014): 941-952

Schumann, H. et al., Br.J Dermatol. 167 (2012): 929-936

Scrideli, C. A. et al., J Neurooncol. 88 (2008): 281-291

Seda, V. et al., Eur.J Haematol. 94 (2015): 193-205

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Seitz, S. et al., Eur.J Cancer 36 (2000): 1507-1513

Semenza, G. L., Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol 76 (2011): 347-353

Seong, J. et al., Mol.Biol.Rep. 39 (2012): 3597-3601

Sethi, M. K. et al., J Proteomics. 126 (2015): 54-67

Shi, Z. et al., Int.J Gynecol.Cancer 22 (2012): 1125-1129

Shi, Z. G. et al., Clin Transl.Oncol 17 (2015): 65-73

Shibano, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0127271

Shin, S. H. et al., Lab Invest 94 (2014): 1396-1405

Shruthi, D. K. et al., J Oral Maxillofac.Pathol. 18 (2014): 365-371

Silva, J. M. et al., Cell 137 (2009): 1047-1061

Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542

Singh, V. et al., OMICS. 19 (2015): 688-699

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Slaga, T. J. et al., J Investig.Dermatol.Symp.Proc. 1 (1996): 151-156

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Sobolik-Delmaire, T. et al., Cell Commun.Adhes. 14 (2007): 99-109

Spurr, I. B. et al., Chembiochem. 13 (2012): 1628-1634

Stahl, M. et al., Ann.Oncol. 24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56

Stull, R. A. et al., BMC.Genomics 6 (2005): 55

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Sugimoto, K. J. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8980-8987

Suh, J. H. et al., J Korean Med.Sci. 28 (2013): 593-601

Sun, M. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 340 (2006): 209-214

Sun, Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 450 (2014): 1-6

Suzuki, S. et al., Pathol.Res Pract. 210 (2014): 130-134

Swain, N. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 8407-8413

Szeliga, M. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 1855-1862

Takabe, P. et al., Exp.Cell Res 337 (2015): 1-15

Takahashi, H. et al., Urology 79 (2012): 240-248

Takeda, H. et al., Nat Genet. 47 (2015): 142-150

Tamada, M. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 5554-5561

Tan, B. S. et al., Mol.Cancer Ther. 10 (2011): 1982-1992

Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10 (1997): 1113-1117

Tang, H. et al., Anticancer Drugs 18 (2007): 633-639

Tang, H. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 1577-1586

Tang, J. Q. et al., Beijing Da.Xue.Xue.Bao. 41 (2009): 531-536

Tang, J. Q. et al., Chin Med.J (Engl.) 123 (2010): 3559-3565

Tanis, T. et al., Arch.Oral Biol 59 (2014): 1155-1163

Tech, K. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 268-272

Teng, B. P. et al., Anticancer Agents Med.Chem 11 (2011): 620-628

Terada, T., Int.J Clin Exp.Pathol. 5 (2012): 596-600

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Tew, G. W. et al., J Biol Chem 283 (2008): 963-976

Thomas, A. et al., Cancer Med. 2 (2013): 836-848

Tian, S. Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 3752-3762

Tofuku, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 175-183

Toh, U. et al., Int.J Clin Oncol 7 (2002): 372-375

Toh, U. et al., Clin Cancer Res. 6 (2000): 4663-4673

Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42

Tota, G. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 963

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Truong, T. et al., Endocr.Relat Cancer 21 (2014): 629-638

Tsujimoto, H. et al., Mol.Carcinog 26 (1999): 298-304

Tuupanen, S. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 1657-1662

Tuval-Kochen, L. et al., PLoS.One. 8 (2013): e77260

Twa, D. D. et al., J Pathol. 236 (2015): 136-141

Twarock, S. et al., Mol.Cancer 10 (2011): 30

Tzellos, T. G. et al., J Eur.Acad.Dermatol.Venereol. 25 (2011): 679-687

Urosevic, J. et al., Nat Cell Biol 16 (2014): 685-694

Vachani, A. et al., Clin Cancer Res. 13 (2007): 2905-2915

Valletta, D. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1407-1415

van, Geldermalsen M. et al., Oncogene (2015)

Varga, A. E. et al., Oncogene 24 (2005): 5043-5052

Varona, A. et al., Am.J Physiol Renal Physiol 292 (2007): F780-F788

Vasca, V. et al., Oncol Lett. 8 (2014): 2501-2504

Venneti, S. et al., Brain Pathol. 23 (2013): 217-221

Virtakoivu, R. et al., Cancer Res 75 (2015): 2349-2362

Volkmer, J. P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2078-2083

Volpi, A. et al., G.Chir 32 (2011): 59-63

Vui-Kee, K. et al., Kaohsiung.J Med.Sci. 28 (2012): 243-250

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Wang, D. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 458 (2015a): 313-320

Wang, H. et al., Front Oncol 4 (2014): 377

Wang, H. et al., Cancer Cell 18 (2010): 52-62

Wang, J. et al., Oncol Rep. 33 (2015b): 1326-1334

Wang, T. et al., Tumour.Biol (2015c)

Wang, W. M. et al., J Biol Chem 278 (2003): 19549-19557

Wang, X. et al., Eur.J Pharmacol. 768 (2015d): 116-122

Wang, X. M. et al., PLoS.One. 8 (2013a): e55714

Wang, X. Y. et al., Int J Hyperthermia 29 (2013): 364-375

Wang, Y. et al., Neoplasma 62 (2015e): 966-973

Wang, Z. et al., Oncotarget. 4 (2013b): 2476-2486

Wang, Z. et al., Melanoma Res 14 (2004): 107-114

Warner, S. L. et al., Future.Med.Chem 6 (2014): 1167-1178

Watanabe, Y. et al., Gastroenterology 136 (2009): 2149-2158

Wegdam, W. et al., PLoS.One. 9 (2014): e108046

Wehner, M. et al., FEBS J 277 (2010): 1597-1605

Weiss, I. et al., Int.J Mol.Sci. 13 (2012): 12925-12938

Weissbach, S. et al., Br.J Haematol. 169 (2015): 57-70

Wiedl, T. et al., J Proteomics. 74 (2011): 1884-1894

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Willoughby, V. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol. 16 (2008): 344-348

Wittke, I. et al., Cancer Lett. 162 (2001): 237-243

Wojtalewicz, N. et al., PLoS.One. 9 (2014): e90461

Wong, N. et al., Cancer Lett. 356 (2015): 184-191

Woo, T. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0142642

World Cancer Report, (2014)

Wu, G. et al., Onco.Targets.Ther. 8 (2015): 2067-2074

Wu, S. et al., Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 45 (2013): 27-35

Wu, X. et al., Cancer Res 70 (2010): 2718-2727

Xiang, Y. et al., J Clin Invest 125 (2015): 2293-2306

Xu, J. et al., Genet.Mol.Res 13 (2014): 5732-5744

Xu, X. et al., Oncotarget. 6 (2015): 26161-26176

Xue, L. Y. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi. 32 (2010): 838-844

Yager, M. L. et al., Br.J Cancer 89 (2003): 860-863

Yamaguchi, T. et al., Dis.Colon Rectum 49 (2006): 399-406

Yamamoto, M. et al., PLoS.One. 6 (2011): e17149

Yamamoto, N. et al., Int.J Oncol 42 (2013): 1523-1532

Yang, C. et al., Tumour.Biol (2015a)

Yang, C. et al., Exp.Cell Res 331 (2015b): 377-386

Yang, H. Y. et al., J Proteomics. 75 (2012): 3639-3653

Yang, J. Y. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 388

Yang, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015c): 1265-1275

Yang, W. et al., Cancer Lett. 339 (2013): 153-158

Yang, W. et al., Nature 499 (2013a): 491-495

Yang, W. et al., Int.J Oncol 42 (2013b): 690-698

Yao, M. et al., Cancer Med. 3 (2014): 845-854

Yao, R. et al., Histol.Histopathol. 22 (2007): 1025-1032

Yu, D. et al., Oncotarget. 6 (2015a): 7619-7631

Yu, X. et al., Cancer Res 73 (2013): 2093-2103

Yu, Y. et al., Cancer Cell 28 (2015b): 82-96

Yuan, B. et al., Immunobiology 217 (2012): 738-742

Zang, W. et al., Mol.Cancer 14 (2015): 37

Zanini, S. et al., Cell Signal. 27 (2015): 899-907

Zare, M. et al., Mol.Carcinog 51 (2012): 796-806

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zha, C. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0122322

Zhang, D. et al., J Cell Mol.Med. 16 (2012): 1047-1059

Zhang, H. Y. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014): 5519-5524

Zhang, Q. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015a): 691-703

Zhang, S. et al., Cancer Res 64 (2004): 2977-2983

Zhang, S. et al., J Mol.Histol. 45 (2014): 283-292

Zhang, S. N. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. 85 (2005): 1348-1351

Zhang, T. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 72

Zhang, X. et al., Int.J Cancer 137 (2015b): 2803-2814

Zhang, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015c): 5979-5985

Zhang, X. et al., PLoS.One. 8 (2013): e72458

Zhang, Y. et al., Cancer Metastasis Rev 34 (2015d): 249-264

Zhang, Z. Z. et al., Mol.Cancer Ther. 14 (2015e): 1162-1170

Zhao, D. et al., J Neurooncol. 118 (2014a): 39-47

Zhao, G. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 408 (2011): 154-159

Zhao, H. et al., Gene 548 (2014b): 234-243

Zhao, L. J. et al., Chin Med.J (Engl.) 126 (2013): 4260-4264

Zheng, Q. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 6255-6264

Zheng, R. et al., Int.Immunopharmacol. 29 (2015): 919-925

Zhi, H. et al., J Pathol. 217 (2009): 389-397

Zhou, Y. F. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 13172-13177

Zhu, H. et al., Cancer Lett. 245 (2007a): 303-314

Zhu, L. et al., J Dermatol.Sci. 72 (2013a): 311-319

Zhu, S. et al., J Biol Chem 282 (2007b): 14328-14336

Zhu, Y. et al., Prostate 73 (2013b): 1614-1622

Zhu, Y. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 14488-14496

LISTARE SECVENŢE

<110> immatics biotechnologies GmbH

<120> Noi peptide şi combinaţii de peptide pentru utilizare în imunoterapie

împotriva cancerului esofagian şi a altor cancere

<130> I32873WO

<150> US62/188,870

<151> 2015-07-06

<150> GB1511792.2

<151> 2015-07-06

<160> 103

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Ser Val

1 5

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Leu Tyr Asn Leu Gly Gly Ser Lys Arg Ile Ser Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Thr Ala Ser Ala Ile Thr Pro Ser Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Asn Leu Met Ala Ser Gln Pro Gln Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Leu Leu Ser Gly Asp Leu Ile Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Ser Ile Phe Glu Gly Leu Leu Ser Gly Val

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ala Leu Leu Asp Gly Gly Ser Glu Ala Tyr Trp Arg Val

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

His Leu Ile Ala Glu Ile His Thr Ala

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Ser Leu Asp Glu Asn Ser Asp Gln Gln Val

1 5 10

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Leu Trp Leu Pro Thr Asp Ser Ala Thr Val

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Gly Leu Ala Ser Arg Ile Leu Asp Ala

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ser Leu Ser Pro Val Ile Leu Gly Val

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Arg Leu Pro Asn Ala Gly Thr Gln Val

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Leu Leu Ala Asn Gly Val Tyr Ala Ala

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Val Leu Ala Glu Gly Gly Glu Gly Val

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Phe Leu Leu Asp Gln Val Gln Leu Gly Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Gly Leu Ala Pro Phe Leu Leu Asn Ala Val

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ile Ile Glu Val Asp Pro Asp Thr Lys Glu Met Leu

1 5 10

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Ile Val Arg Glu Phe Leu Thr Ala Leu

1 5

<210> 22

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Lys Leu Asn Asp Thr Tyr Val Asn Val

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Lys Leu Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu

1 5

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Leu Leu Phe Ala Gly Thr Met Thr Val

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Met Leu Ala Glu Lys Leu Leu Gln Ala

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Asn Leu Arg Glu Gly Asp Gln Leu Leu

1 5

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Ser Leu Asp Gly Phe Thr Ile Gln Val

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ser Leu Asp Gly Thr Glu Leu Gln Leu

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ser Leu Asn Gly Asn Gln Val Thr Val

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Val Leu Pro Lys Leu Tyr Val Lys Leu

1 5

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val

1 5

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Gly Leu Asp Val Thr Ser Leu Arg Pro Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ser Leu Val Ser Glu Gln Leu Glu Pro Ala

1 5 10

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Leu Leu Arg Phe Ser Gln Asp Asn Ala

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Phe Leu Leu Arg Phe Ser Gln Asp Asn Ala

1 5 10

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Tyr Thr Gln Pro Phe Ser His Tyr Gly Gln Ala Leu

1 5 10

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Ile Ala Ala Ile Arg Gly Phe Leu Val

1 5

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Leu Val Arg Asp Thr Gln Ser Gly Ser Leu

1 5 10

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Gly Leu Ala Phe Ser Leu Tyr Gln Ala

1 5

<210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Gly Leu Glu Ser Glu Glu Leu Glu Pro Glu Glu Leu

1 5 10

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Thr Gln Thr Ala Val Ile Thr Arg Ile

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Lys Val Val Gly Lys Asp Tyr Leu Leu

1 5

<210> 44

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala Ala Glu Asn Ser Leu

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Leu Thr Glu Leu Glu Lys Ala Leu

1 5

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu

1 5 10

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Val Leu Ala Ser Gly Phe Leu Thr Val

1 5

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Ser Met His Gln Met Leu Asp Gln Thr Leu

1 5 10

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Gly Leu Met Lys Asp Ile Val Gly Ala

1 5

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

Gly Met Asn Pro His Gln Thr Pro Ala Gln Leu

1 5 10

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

Lys Leu Phe Gly His Leu Thr Ser Ala

1 5

<210> 52

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Val Ala Ile Gly Gly Val Asp Gly Asn Val Arg Leu

1 5 10

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

Val Val Val Thr Gly Leu Thr Leu Val

1 5

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val Lys Met

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

Gly Ala Ile Asp Leu Leu His Asn Val

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

Ala Leu Val Glu Val Thr Glu His Val

1 5

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

Gly Leu Ala Pro Asn Thr Pro Gly Lys Ala

1 5 10

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

Leu Ile Leu Glu Ser Ile Pro Val Val

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Ser Leu Leu Asp Thr Leu Arg Glu Val

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Val Val Met Glu Glu Leu Leu Lys Val

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

Thr Gln Thr Thr His Glu Leu Thr Ile

1 5

<210> 62

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Ala Leu Tyr Glu Tyr Gln Pro Leu Gln Ile

1 5 10

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Leu Ala Tyr Thr Leu Gly Val Lys Gln Leu

1 5 10

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

Gly Leu Thr Asp Val Ile Arg Asp Val

1 5

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Tyr Val Val Gly Gly Phe Leu Tyr Gln Arg Leu

1 5 10

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Leu Leu Asp Glu Lys Val Gln Ser Val

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Ser Met Asn Gly Gly Val Phe Ala Val

1 5

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

1 5 10

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Gly Leu Leu Val Gly Ser Glu Lys Val Thr Met

1 5 10

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

Phe Val Leu Asp Thr Ser Glu Ser Val

1 5

<210> 71

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val

1 5 10

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

Phe Leu Pro Pro Ala Gln Val Thr Val

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Lys Ile Thr Glu Ala Ile Gln Tyr Val

1 5

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Ile Leu Ala Ser Leu Ala Thr Ser Val

1 5

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Gly Leu Met Asp Asp Val Asp Phe Lys Ala

1 5 10

<210> 76

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Lys Val Ala Asp Tyr Ile Pro Gln Leu

1 5

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

Val Leu Val Pro Tyr Glu Pro Pro Gln Val

1 5 10

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Lys Val Ala Asn Ile Ile Ala Glu Val

1 5

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

Gly Gln Asp Val Gly Arg Tyr Gln Val

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

Ala Leu Gln Glu Ala Leu Glu Asn Ala

1 5

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 81

Ala Val Leu Pro His Val Asp Gln Val

1 5

<210> 82

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

His Leu Leu Gly His Leu Glu Gln Ala

1 5

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 83

Ala Leu Ala Asp Gly Val Val Ser Gln Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

Ser Leu Ala Glu Ser Leu Asp Gln Ala

1 5

<210> 85

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 85

Asn Ile Ile Glu Leu Val His Gln Val

1 5

<210> 86

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 86

Gly Leu Leu Thr Glu Ile Arg Ala Val

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 87

Phe Leu Asp Asn Gly Pro Lys Thr Ile

1 5

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 88

Gly Leu Trp Glu Gln Glu Asn His Leu

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 89

Ser Leu Ala Asp Ser Leu Tyr Asn Leu

1 5

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 90

Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu

1 5

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 91

Lys Leu Ile Asp Asp Val His Arg Leu

1 5

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 92

Ser Ile Leu Arg His Val Ala Glu Val

1 5

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 93

Val Leu Ile Asn Thr Ser Val Thr Leu

1 5

<210> 94

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

Thr Leu Leu Gln Glu Gln Gly Thr Lys Thr Val

1 5 10

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 95

Leu Ile Gln Asp Arg Val Ala Glu Val

1 5

<210> 96

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

Gly Ala Ala Val Arg Ile Gly Ser Val Leu

1 5 10

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 97

Glu Leu Asp Arg Thr Pro Pro Glu Val

1 5

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

Val Leu Phe Pro Asn Leu Lys Thr Val

1 5

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 99

Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu

1 5 10

<210> 100

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Phe Ala Pro Val

1 5 10

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 101

Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val

1 5

<210> 102

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val

1 5 10

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 103

Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile

1 5

Claims

1. O peptidă constând din secvenţa de aminoacizi conformă cu SEQ ID NO 9 sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia pentru utilizare în medicină.

2. Peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1, în care respectiva peptidă include şi legături non-peptidice.

3. Peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1 sau 2, în condiţiile în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, care conţine aminoacizii N-terminali 80 ai lanţului invariabil asociat antigenului HLA-DR (Ii).

4. Un receptor de celule T, preferabil un receptor de celule T recombinant, solubil sau legat de membrană care este reactiv în mod specific cu un ligand HLA atunci când se leagă de o moleculă HLA, unde respectivul ligand constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO 9.

5. Un anticorp, în particular un anticorp solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1, preferabil peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1 atunci când este legată de o moleculă MHC.

6. Un acid nucleic care codifică o peptidă pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3 pentru un TCR în conformitate cu Revendicarea 4 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 5, opţional legat la o secvenţă de promotori heterologi sau un vector de exprimare care exprimă respectivul acid nucleic.

7. O celulă-gazdă recombinantă care cuprinde peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1 sau 3 ori acidul nucleic ori vectorul de exprimare conform Revendicării 6, în care respectiva celulă-gazdă este preferabil o celulă prezentatoare de antigen, cum ar fi o celulă dendritică, sau respectiva celulă-gazdă este, de preferinţă, o celulă T ori o celulă NK.

8. O metodă pentru producerea peptidei pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3 ori pentru producerea receptorului de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 sau un anticorp în conformitate cu Revendicarea 5, metoda care cuprinde cultivarea unei celule-gazdă în conformitate cu Revendicarea 7, care prezintă peptida pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1 sau exprimă acidul nuceli ori vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6 şi izolarea peptidei sau a TCR-ului ori a anticorpului din celula-gazdă sau mediul său de cultură.

9. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând contactarea in vitro a celulelor T cu molecule de MHC de clasă I umane încărcate cu antigen exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau o construcţie artificială care imită o celulă prezentatoare de antigen pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa numitele celule T într-o manieră specifică antigenului, în care respectivul antigen este o peptidă pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 1.

10. O limfocită T activată produsă prin metoda în conformitate cu Revendicarea 9 care recunoaşte selectiv o celulă care exprimă aberant o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi dată în Revendicarea 1.

11. O compoziţie farmaceutică cuprinzând cel puţin un ingredient activ selectat din grupul constând din peptida pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5 ori receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, excipienţi şi/sau stabilizatori acceptabili farmaceutic pentru utilizarea în medicină.

12. Peptida pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5, receptorul de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare conform Revendicării 11 pentru utilizare în medicină, de preferinţă pentru utilizare în tratarea cancerului.

13. Peptida pentru utilizare în conformitate cu oricare dintre Revendicările 1 sau 3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare în conformitate cu Revendicarea 6, celula în conformitate cu Revendicarea 7, limfocita T activată în conformitate cu Revendicarea 10 sau anticorpul în conformitate cu Revendicarea 5, receptor de celule T în conformitate cu Revendicarea 4 sau compoziţia farmaceutică pentru utilizare în în conformitate cu Revendicarea 11 pentru utilizare în conformitate cu Revendicarea 12, în care cancerul menţionat este selectat din grupul de cancer ovarian, cancer pulmonar cu celule non-mici, cancer pulmonar cu celule mici, cancer renal, cancer cerebral, cancer de colon sau rect, cancer de stomac, cancer hepatic, cancer pancreatic, cancer de prostată, leucemie, cancer de glandă mamară, carcinom cu celule Merkel, melanom, cancer esofagian, cancer de vezică urinară, cancer uterin, cancer de vezică biliară, cancer de cale biliară şi alte tumori care arată o supraexprimare a unei proteine din care provine o peptidă în conformitate cu SEQ ID NO 9.

14. 999. SDODR

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

65.

66.

67.

68.

69.

70.

71.

72.

73.

74.

75.

76.

77.

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

87.

88.

89.

90.

91.

92.

93.

94.

95.

96.

97.

98.

99.