CN116144772B

CN116144772B - 一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用

Info

Publication number: CN116144772B
Application number: CN202211448618.5A
Authority: CN
Inventors: 徐秋月; 赵婷; 段勇; 张艳亮; 龚容; 赵滢
Original assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Kunming Medical University
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2042-11-18
Also published as: CN116144772A

Abstract

本发明公开了一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用。Hsa_circ_0006117在LUAD患者血浆中的相对表达水平与疾病的侵袭现象相关，参与促进LUAD侵袭现象的发生发展。生物信息学分析结果表明，hsa_circ_0006117通过miRNAsponging作用促进LUAD的肿瘤进程。

Description

一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学及免疫学技术技术领域，具体地说，涉及一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是世界范围内严重威胁人类健康和生命的常见恶性肿瘤之一。据GLOBOCAN统计，在2020年，全球肺癌新发病例约占所有新发癌症病例的11.4％，相关死亡病例约占癌症死亡病例的18.0％。近年来，肺腺癌(Lung Adenocarcinoma,LUAD)已成为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)中最常见的组织学类型，发病率明显高与肺鳞癌，约占肺癌的40％。早期肺腺癌一般无明显症状，确诊时多伴神经、胸膜、血管侵犯或发生淋巴转移，预后较差。尽管近年来，肺癌的分子靶向治疗、免疫治疗等治疗手段和临床管理等方面取得了明显进步，但仍只有不到10％的晚期患者生存年限可达五年以上。

目前临床上肿瘤检验主要根据影像学检查和组织病理活检。影像学检查的灵敏度主要取决于分辨力和病灶大小，对肿瘤性质的判断存在客观性，同时会对机体产生一定的放射性损伤；组织病理活检虽是肿瘤诊断的金标准，但仍有高达25％的肺癌活检由于未能获得足够的组织而评估失败。现在临床上常用的血清学肿瘤标志物，检测灵敏度和特异度往往无法满足临床需求。随着高通量RNA测序技术和分子生物学的快速发展，液体活检在生物学领域受到越来越多的关注。液体活检是一种已经由科学家和肿瘤学家研究了数年的非侵入性活检方法，通过识别和量化体液中循环来源的肿瘤生物材料反映肿瘤信息，包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤RNA(circulating tumor RNA,ctRNA)、外囊泡(extracellularvesicles,EV)和肿瘤教育血小板(tumor-educated platelets,TEP)等。

随着对环状RNA(Circular RNA,circRNA)的生物学功能和独特分子结构的深入研究，结果表明，circRNA是肿瘤新型液体活检标志物的理想候选物之一。CircRNA是一类由前体RNA反向剪接形成的具有独特共价闭合结构的RNA分子，在真核生物和病毒中广泛表达。研究表明，circRNA主要通过miRNA sponging、与蛋白的相互作用(蛋白海绵、蛋白支架、蛋白募集)和作为翻译模板三种作用机制，参与调节肿瘤细胞的细胞干性、细胞周期、细胞凋亡、自噬、血管生成、复制永生和细胞能量学等多种病理生理学过程，在肿瘤的形成和病情进展过程中发挥重要生物学作用。研究表明，CircRNA通常以组织特异性甚至细胞类型特异性表达，已经证实其在各种体液(如血浆、唾液和尿液)中的相对稳定性和可检测性，且通过高通量测序方法证实了体液中特异性circRNA的存在。

但是，迄今为止，circRNA在肿瘤液体活检领域的研究和临床转化方面依然面临着巨大的挑战和困难：①circRNA的命名规则尚未统一，在很大程度上阻碍了整个研究领域的快速发展；②由于体液中circRNA丰度相对较低，现有的RNA抽提和富集方法很难在体液中准确检测和识别；③相关的大多数研究基本都集中于基础研究，且各研究平台之间存在异质性，尚无成熟的标准化工作流程，缺乏可比性和一致性，直接影响临床检测的重复性与溯源性。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种Hsa_circ_0006117在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

可选地，Hsa_circ_0006117在肺腺癌(Lung Adenocarcinoma，LUAD)组织和癌旁组织中差异表达，与配对癌旁组织相比，LUAD组织中hsa_circ_0006117过表达。

可选地，Hsa_circ_0006117在LUAD患者和健康对照组血浆中差异表达，与健康对照组相比，hsa_circ_0006117在LUAD患者血浆中明显高表达。

可选地，Hsa_circ_0006117在LUAD患者血浆中的相对表达水平与疾病的侵袭现象相关，参与促进LUAD侵袭现象的发生发展。

可选地，血浆hsa_circ_0006117在术前和术后明显差异表达；hsa_circ_0006117可能通过miRNA sponging作用促进LUAD的肿瘤进程。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)Hsa_circ_0006117具有作为LUAD新型诊断标志物的潜在临床意义。

2)LUAD患者血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平与疾病的侵袭现象相关，且在术前和术后明显差异表达，参与促进LUAD侵袭现象的发生发展过程。

3)生物信息学分析结果表明，hsa_circ_0006117通过miRNA sponging作用促进LUAD的肿瘤进程。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明不同时期肺癌与癌旁组织间差异表达的circRNAs数量；

图2是本发明候选circRNAs的结构模式图；

图3是本发明circRNA的基本形成方式；

图4是本发明Hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007418和hsa_circ_0000288的cDNA和gDNA扩增产物凝胶电泳结果；

图5是本发明Hsa_circ_0006117circRNA芯片分析结果与circbase比对结果；

图6是本发明Hsa_circ_0000288circRNA芯片分析结果与circbase比对结果；

图7是本发明Hsa_circ_0007418circRNA芯片分析结果与circbase比对结果；

图8是本发明RNase消化前后hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288的表达差异；

图9是本发明β-actin(A)、hsa_circ_0006117(B)及管家基因hsa_circ_0000288(C)标准曲线；

图10是本发明QRT-PCR验证hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288在LUAD组织及癌旁组织中的差异表达；

图11是本发明QRT-PCR验证hsa_circ_0006117在LUAD组及健康对照组血浆样本中的差异表达；

图12是本发明ROC曲线评估血浆hsa_circ_0006117应用于LUAD的诊断价值；

图13是本发明血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平与LUAD侵袭现象间的关系；

图14是本发明肺腺癌患者列线图侵袭预测模型；

图15是本发明肺腺癌患者列线图侵袭预测模型的校准曲线；

图16是本发明DCA曲线评估肺腺癌患者列线图侵袭预测模型的预测能力；

图17是本发明ROC曲线评估肺腺癌患者列线图侵袭预测模型的预测能力；

图18是本发明LUAD患者术前术后血浆hsa_circ_0006117相对表达水平比较；

图19是本发明生物信息学分析预测hsa_circ_0006117的miRNA-mRNA作用网络；

图20是本发明Hsa_circ_0006117靶基因的GO分析结果；

图21是本发明Hsa_circ_0006117靶基因的GO分析结果；

图22是本发明Hsa_circ_0006117靶基因的KEGG分析结果。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1样本准备

1.1组织样本的收集与处理

自2020年9月至2021年11月于本院胸外科、老年胸外科收集肺癌患者手术切除的新鲜肿瘤组织标本及距离肿瘤组织≥3cm的癌旁组织。纳入标准和排除标准如下：

纳入标准：①经病理诊断确诊为LUAD；②手术前未接受过任何治疗，包括手术、放疗、化疗及免疫治疗等；③患者临床信息(如性别、年龄、吸烟史、饮酒史、手术日期、肿瘤组织学类型、大小、血清学肿瘤标志物检测数据、有无淋巴结转移和侵袭现象等)收集完整。

排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②患有免疫系统疾病(包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、甲亢等)；③患有慢性消耗性疾病(包括肺结核、糖尿病等)；④患有传染性疾病。

标本处理步骤：①准备工作：收集标本前于冻存管中加入至少1.5mL RNAstore样本保存液(每100mg组织样本至少需1mL RNAstore)；②组织切割：尽可能将组织样本切割成任何一边厚度不超过0.5cm的细小碎块，放入RNAstore保存液中，置于4℃冰箱渗透过夜；③低温保存：当样本需长期保存时，转移至-80℃冰箱保存，直至使用。

1.2血浆样本的收集与处理

从2020年9月至2021年11月于本院收集自胸外科(包括老年胸外科)LUAD患者手术治疗前后和健康体检者的EDTA抗凝血浆标本，分别为LUAD组和健康对照组。

各组纳入标准为：(1)LUAD组：同LUAD组织标本组；(2)健康对照组：胸部或肺部CT结果无明显异常；各项常规实验室检测结果无明显异常。

各组排除标准均同LUAD组织样本组。

标本处理步骤：①低速离心：在4℃条件下，3000r/min离心10min，将血浆层尽可能转移至1.5mL无酶无菌EP管中；②分装保存：将离心好的血浆样本根据标本量分装保存于无酶无菌的冻存管中，每管至少需留存300L，于管壁作好标记，立即置于-80℃冰箱保存直至使用。

本研究经昆明医科大学伦理委员会审查通过(批准伦理号：8216080364)，入选患者已填写知情同意书。

1.3统计学分析

使用开源统计学软件和GraphPad Rrism(版本8.0.1)进行统计学分析和作图。计量资料的描述用算术均数±标准差。癌组织与癌旁组织、术前术后组之间目的circRNA的相对表达水平采用配对T检验(正态分布)或Wilcoxon符号秩检验(非正态分布)进行分析，其余对照组和实验组之间使用两独立样本T检验(正态分布)或Mann-Whitney U检验(非正态分布)。构建ROC曲线以评估目的circRNA作为LUAD液体活检诊断标志物的潜在临床应用价值。采用点——二列相关性分析方法分析目的circRNA的血浆相对表达水平与临床因素之间的相关性。通过肿瘤预测模型的建立进一步评估血浆circRNA相对表达水平对肿瘤病理特征的判别能力。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

研究对象的一般临床资料如下所示：

本研究纳入EDTA抗凝血浆标本共246例(包括186例LUAD患者，60例健康对照者)，一般临床资料分别见表1。血浆样本中LUAD组患者年龄为54±10岁，健康组为45±12岁。在LUAD组患者中，现在或曾经有吸烟史者41例(22.0％)，现在或曾经有饮酒史者15例(8.1％)，肿瘤大小≥3cm者32例(17.2％)，伴淋巴结转移者9例(4.8％)，发生胸膜、气道、脉管、血管或神经侵袭者42例(22.6％)。

表1血浆样本的一般临床资料

注：*表示临床信息缺失，有13例LUAD患者缺失肿瘤大小信息，55例缺失EGFR水平信息。

实施例2候选circRNAs的筛选及鉴定

2.1候选circRNAs的筛选

2.1.1结合微阵列分析结果和Circbase数据库初步筛选候选circRNAs

通过对26对肺癌组织和邻近正常组织的circRNA芯片分析和验证结果，根据差异倍数FC≥2，Raw Intensity≥200和P值越小越好的条件，筛选候选circRNAs。通过Circbase数据库查询候选circRNAs的基因长度(Genomic length,200bp～2000bp范围内)、亲本基因(Parenal Gene)、染色体位置以及基因序列等基本信息。

2.1.2通过CSCD数据库分析候选circRNAs的潜在功能

肿瘤特异性环状RNA数据库(Cancer-specific circRNA database,CSCD)通过汇总19种癌症类型的87个癌细胞样本和141个正常细胞样本的RNA测序数据，构建了包含多种肿瘤细胞和正常细胞特异性circRNAs数据库。在该数据库中，通过候选circRNAs的染色体位置信息查询其结构模式图，包括miRNA反应原件(MiRNA Response Elements,MREs)、蛋白结合位点和蛋白编码区域(Open Reading Frame,ORF)的相关信息，用于预测候选circRNAs的潜在生物学功能。

circRNA芯片分析结果表明，在Ⅰ期至Ⅲ期肺癌组织与癌旁组织中共有的差异表达circRNAs共537个，包括143个过表达的circRNAs和394个低表达的circRNAs(如图1)。结合Circbase、CSCD等数据库及既往相关研究，初步筛选出4条表达上调且与肿瘤相关的候选circRNAs，分别为：hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007418、hsa_circ_0000288和hsa_circ_0082564，其基本信息见表2。

通过CSCD数据库查询4条候选circRNAs的结构模式图，查询到除hsa_circ_0082564之外的其余三条circRNAs，如图2所示。在结构模式图中，红色小三角形代表circRNAs与miRNA的结合位点，蓝色部分表示circRNA的蛋白结合位点，绿色部分代表circRNA的开放阅读框(即蛋白编码区域)。结果表明：3条候选circRNAs均具有一定数量的miRNA结合位点和蛋白结合位点；此外，hsa_circ_0006117还具有较多蛋白编码区域，具有一定的翻译潜力。即hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007418、hsa_circ_0000288和hsa_circ_0082564既可能起miRNA sponging作用，也可能通过与蛋白质的相互作用在疾病的生物学过程中发挥作用；除此之外，hsa_circ_0006117具有一定的翻译潜力。据Circbank和circinteractome数据库显示，4条候选circRNAs都有一定数量的潜在下游miRNAs。

综上所述，4条候选circRNAs(hsa_circ_0006117、hsa_circ_0000288、hsa_circ_0007418和hsa_circ_0082564)均可作为候选circRNAs。

表2候选circRNAs的基本信息

2.2候选circRNAs的鉴定

与线性RNA分子经典的前向剪接形成模式不同，circRNA是由RNA前体(pre-mRNA)反向(下游的3’端与上游5’端的碱基序列连接)剪接形成独特的共价闭环结构，如图3所示。即除反向剪接位点不同于线性RNA之外，circRNA的其余区域与线性RNA是一致的。因此，circRNA检测的关键步骤是circRNA特异性引物的设计(跨剪接点反向设计)。通过CircInteractome数据库设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。为确保能够特异性检测到目的circRNAs的环状形式，我们对候选circRNAs进行了成环性验证。

2.2.1候选circRNAs仅可由反向设计的引物扩增

由于circRNA独特的反向剪接形成方式，正常设计引物(收敛引物)和跨剪接点反向设计引物(发散引物)均可进行PCR扩增。但收敛引物在扩增出目的circRNA环状形式的同时，也会扩增出同源线性基因，而发散引物仅可扩增出目的基因的环状形式。也就是说，由circRNA逆转录而来的cDNA和直接抽提的gDNA均可由收敛引物进行PCR扩增，而通过发散引物只能由cDNA扩增，而不能直接扩增gDNA。

2.2.1.1LUAD组织gDNA的提取：

本发明使用TianGen组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)进行组织gDNA的提取。实验前，按试剂盒说明书事先在缓冲液GD、漂洗液PW加入适量无水乙醇。具体实验步骤如下：

①样本处理：称取组织样本10mg(不超过15mg)，用匀浆器打碎处理为细胞悬液，10,000r/min离心1min，弃上清；

②加入200μL缓冲液GA，涡旋震荡使其彻底悬浮；

③向上述悬浮液中加入20μL蛋白酶K，震荡混匀，于56℃水浴震荡器放置40min-1h以使组织完全溶解，简短离心；

④向上述溶液中加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，于70℃水浴震荡器放置10min，使白色沉淀变清亮，简短离心；

⑤向上述溶液中加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心；

⑥事先将吸附柱CB3放入收集管中，将上一步所得样品(包括沉淀物)转入吸附柱CB3中，12,000r/min离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

⑦向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000r/min离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑧向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000r/min离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

⑨重复操作步骤⑧；

⑩12,000r/min离心2min，倒尽废液。打开吸附柱CB3盖子，置于室温干燥5min左右，将吸附材料中残余的漂洗液彻底晾干；

将吸附柱CB3转入新的1.5mL Ep管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加80μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12,000r/min离心2min，将得到的DNA溶液收集到离心管中；

DNA保存：直接进行qRT-PCR反应，或置于-80℃保存。

2.2.1.2LUAD组织cDNA的制备：

(1)RNA提取：

本发明使用RNeasyMini Kit(Qiagen)试剂盒提取组织标本的总RNA。实验前需作好试剂准备，包括裂解液处理(按照20μL/mL加入β-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇后可置于室温保存1个月)和缓冲液RPE稀释(按试剂盒说明添加适量96％-100％无水乙醇)。具体提取步骤如下：

①样本切割处理：用电子天平称取样本，每个样本25mg(不超过30mg)，尽量将其剪成细小碎块；

②样本匀浆处理：每25mg组织加入500μL裂解液RLT，放入2-3颗浸泡干净的磁珠，置于电动组织研磨机中彻底匀浆(65Hz,120s左右)。匀浆完成后，12,000r/min离心2min；

③小心转移上清液于新的1.5mL无酶无菌Ep管中，加入1倍体积的70％乙醇，吹吸混匀；

④将混匀样品(包括沉淀物)，立即转入RneasyMini吸附柱中，轻盖上盖，12,000r/min离心30s(当样品体积超过700μL时，分两次过柱)，弃流出液；

⑤加入700μL缓冲液RW1至RneasyMini吸附柱中，轻盖上盖，12,000r/min离心30s，弃流出液；

⑥加入500μL缓冲液RPE至RneasyMini吸附柱中，轻盖上盖，12,000r/min离心30s，弃流出液；

⑦加入500μL缓冲液RPE至RneasyMini吸附柱中，轻盖上盖，12,000r/min离心2min，弃流出液；

⑧将RneasyMini吸附柱置于新的1.5mL无酶无菌Ep管中，打开吸附柱盖子，于室温干燥2-5min；

⑨RNA洗脱：向吸附柱中悬空滴加30μL RNase-Free ddH₂0，盖上吸附柱盖子，室温放置2min，10,000r/min离心1min以洗脱RNA；

⑩RNA保存：用移液器吹吸混匀RNA溶液，直接进行逆转录反应或置于-80℃暂存；

RNA的纯度和浓度测定：检测前使用RNase-Free ddH₂0清洗两遍加样孔。以RNase-Free ddH₂0为空白对照，取1μL加至加样孔(切忌不要产生气泡)，通过A260/A280、A260/A230以及连续波长吸收峰，从而判断RNA的提取质量。A260/A280值一般在1.8-2.1范围内，否则，可能产生DNA或者蛋白质污染。

(2)逆转录反应

本实验使用的逆转录试剂盒为FastKing RT Kit(with gDNase)。实验前将所有试剂放置于室温解冻，溶解后将每种溶液涡旋混匀，短暂离心后使用。具体实验步骤如下：

1)gDNA去除反应：该步骤在冰上进行，如表3配制反应混合液。加样完成后简短离心，置于42℃孵育3min；

表3gDNA去除反应体系

2)逆转录反应：按表4配制逆转录反应体系。为保证加样的准确性，至少需按反应孔数+1的量将各试剂组分混合配制于同一EP管中，彻底混匀，再分别加入每个反应孔中。

表4逆转录反应体系

3)将配制好的逆转录反应体系加到上述gDNA去除反应体系中，简短离心。反应条件为：45℃孵育45min，95℃孵育5min。逆转录结束后，将得到的cDNA放置于冰上进行后续实验，或保存于-20℃以备使用。

(3)QRT-PCR反应

本发明中qRT-PCR反应使用的是Tiangen SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒，需置于-20℃避光保存。在发明前，将所有试剂于室温溶解并彻底混匀，短暂离心后使用。具体实验步骤如下：

1)引物稀释：

将装有引物干粉的EP管用低温高速离心机10,000r/min离心30s，根据说明书提示加入相应体积的RNase-Free ddH₂0，吹吸混匀，稀释为浓度100mM/μL的溶液。为能够长期保存及避免损耗，根据实验需求分装保存于-20℃，使用时现稀释为浓度10mM/μL。

2)QRT-PCR反应：

按表6配制反应体系，该步骤在冰上操作。为保证加样的准确性，至少按照加样孔数+1的量，先将反应体系中除cDNA以外的其他反应组分混合配置于同一Ep管中，彻底混匀，短暂离心后使用。为保证扩增效率，该反应体系中cDNA模板的使用量最好不超过100ng。经三次重复检测，组织cDNA浓度大多在1000-1300ng/μL范围内，故需将组织cDNA稀释20倍后再进行后续实验。加样完成后，确保八联管盖盖紧，轻弹混匀并去除所有气泡，短暂离心将所有液体收集至管底，然后按表5(反应体系)和表6(扩增程序)进行qRT-PCR反应(扩增时尽量将反应液中的气泡去除干净)。每个样本均进行三次重复实验。本实验采用两步法扩增程序。

表5QRT-PCR反应体系

表6两步法QRT-PCR反应程序

(4)2％琼脂糖凝胶电泳

QRT-PCR反应结束后，对gDNA和cDNA的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，以确定单带是否清晰且单一，同时比较扩增子大小是否与预期一致。具体操作步骤为：

①TAE电泳缓冲液稀释：将50×TAE电泳缓冲液稀释为1×TAE电泳缓冲液(50×TAE缓冲液：去离子水＝1：49)；

②制作2％琼脂糖凝胶：将2g琼脂糖粉溶解于100μL 1×TAE电泳缓冲液中，于微波炉中加热至透明；待温度冷却至不烫手时，加入6μL核酸染料，轻轻摇匀，将胶倒入提前准备好的电泳模具中，待25min左右琼脂糖胶完全凝固；

③加样电泳：取5μL扩增产物，与1μL 6×Loading Buffer混匀后加样，于120V电压下电泳20-30min；

④电泳完毕后，取出凝胶置于凝胶成像仪上曝光并拍照留存。

2.2.2Sanger测序

为确保设计的引物序列可以准确扩增出circRNA的环状形式，对上述特异性扩增且符合预期大小的cDNA扩增子进行Sanger测序。然后，将测序结果与circbase数据库中的circRNA基因序列进行比对，以确定扩增产物是否为目的circRNA。

2.2.3RNase R消化实验

由于circRNA特殊的闭环结构，缺少5'帽结构和3'A尾，对外切核糖核酸酶(RNaseR)具有高度抗性。RNase R能消化大部分线性RNA，而一般不消化环状circRNA。为进一步消除检测线性RNA的可能性，随机选取3个组织标本将提取的总RNA分成两份，一份用RNase R酶作消化处理，另一份不作任何处理，然后同时进行RT-qPCR反应。RNase R酶消化实验步骤如下：

(1)配制RNase R酶消化反应体系：见表7。

表7RNase R酶消化反应体系

注：*在该体系中RNA总量不超过5mg。为使试验具有可比性，该体系中RNA使用体积与上述逆转录反应体系中保持一致，均为8L。

(2)将上述反应体系放置于37℃孵育15min；

(3)消化完成后，保持70℃，10min使酶灭活；

(4)分别按上述表3、表4和表6进行逆转录和qRT-PCR反应。

对以上三条具有潜在生物学功能的候选circRNAs进行qRT-PCR验证(引物特异性验证)。如上述2.2.1.2中进行组织RNA的提取，按照表3和表4进行逆转录反应，按照表6进行qRT-PCR反应。经多次引物设计，候选circRNAs hsa_circ_0006117、hsa_circ_0000288和hsa_circ_0007418的扩增曲线呈S型，溶解曲线呈单一峰，可实现特异性扩增，引物序列如表8所示。

通过gDNA与cDNA扩增比较、cDNA产物测序和RNase R酶消化实验对以上三条候选circRNAs进行成环性验证。首先，利用发散引物对直接提取的gDNA和由RNA逆转录而来的cDNA进行qRT-PCR扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图4所示)，结果表明：hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007418和hsa_circ_0000288的cDNA扩增产物条带单一且明亮，大小与预期一致，而gDNA扩增产物基本无。说明hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007418和hsa_circ_0000288的发散引物可实现circRNA的特异性扩增。

为保证circRNA环状形式的准确扩增，将上述cDNA产物进行Sanger测序。通过比对Sanger测序结果与circbase数据库中候选circRNAs的基因序列，结果表明：hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288测序结果与circbase数据库中的circRNA反向连接序列完美匹配(分别见图5和图6，图中箭头代表circRNA的剪接位点)，而hsa_circ_0007418引物未成功扩增出目的片段(图7)。

对上述两条测序成功的候选circRNAs(hsa_circ_0006117和hsa_circ_0007418)进行RNase R酶消化实验。结果表明：与未处理组相比，RNase R消化处理组中hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288的β-actin标准化相对表达水平无明显变化(如图8所示)。

综上所述，本发明设计的hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288发散引物可实现目的circRNA环状形式的特异性扩增，且不会扩增同源线性RNA。

表8候选circRNAs的引物序列

实施例3LUAD组织中候选circRNAs的相对表达水平

本发明采用qRT-PCR方法检测了29对LUAD组织及其癌旁组织中候选circRNAs的相对表达水平。

3.1QRT-PCR反应

组织RNA的提取、逆转录及qRT-PCR反应按照上述2.2.1中进行。每个样本均进行三次重复实验。

3.2QRT-PCR反应的结果判定

在本研究中，需使用2^-ΔΔCt法计算样本中目的基因的相对表达水平以及确定组间差异表达倍数。2^-ΔΔCt算法是将实验样品的结果与校准物(例如未处理或野生型样品)或标准化物(例如内参基因)进行比较。使用这种方法，样本组和对照组中的目的基因的Ct值，根据来自相同样本的内参基因Ct进行校准，通过计算2^-ΔΔCt来确定表达的倍数差异。使用该计算方法的一个重要前提条件是，目的基因与内参基因的扩增效率均接近100％(90％-110％)。

3.2.1扩增效率的验证

选取一例Ct值较低(内参)的LUAD组织，将新鲜提取的RNA以10倍梯度进行倍比稀释，共4个梯度，按照表6和表7进行qRT-PCR反应，每个基因每个浓度均进行三个复孔检测。以模板浓度以10为底的对数为横坐标，对应的平均Ct值为纵坐标绘制标准曲线，从而判断候选circRNAs hsa_circ_0006117、hsa_circ_0000288和管家基因β-actin的扩增效率。

3.2.2结果计算

将目的基因的结果用标准化物(内参基因β-actin)标化后，通过以下公式确定目的基因的相对表达水平以及差异表达倍数。计算公式如下：

ΔCt(实验组)＝Ct(实验组_目的基因)－Ct(实验组_内参基因)

ΔCt(对照组)＝Ct(对照组_目的基因)－Ct(对照组_内参基因)

ΔΔCt＝ΔCt(实验组)－ΔCt(对照组)

2^-ΔΔCt＝差异倍数

3.2.3结果

3.2.3.1两条候选circRNAs和管家基因β-actin的扩增效率

系列梯度浓度对应的平均Ct值整理见表9。以模板浓度以10为底的对数为横坐标，对应的平均Ct值为纵坐标绘制标准曲线(如图9)，β-actin、hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288的扩增效率均在90％-110％之间，且R²＞0.99，具有良好的相关性，符合有效扩增的要求。同时，两个目的circRNAs与内参基因β-actin的扩增效率基本一致。结果表明，可将β-actin选做本实验的内参基因，且可使用2^-ΔΔCt方法计算样本组之间目的基因的相对表达水平以及确定组间的差异表达倍数。

表9内参基因β-actin及两条候选circRNAs梯度浓度对应的平均Ct值

3.2.3.2两条候选circRNAs在肺腺癌组织中的差异表达验证

采用qRT-PCR法对29对LUAD组织及其癌旁组织中候选circRNAs(hsa_circ_0006117和hsa_circ_0000288)的相对表达水平进行检测。采用2^-ΔΔCt算法和Wilcoxon符号秩检验进行数据分析，如图10所示。结果表明：与配对癌旁组织相比，LUAD组织中hsa_circ_0006117的相对表达水平上调，差异具有统计学意义(P＝0.02，P＜0.05)；而hsa_circ_0007418的相对表达水平无明显差异，差异无统计学意义(P＝0.063)。该结果与circRNA芯片分析结果一致，遂选取hsa_circ_0006117为本发明的目的基因。

实施例4血浆标本中候选circRNAs的相对表达水平

4.1血浆总RNA的提取

Trizol是一种常用的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，同时可保持RNA的完整性。本发明采用Trizol法进行血浆标本总RNA的提取，具体操作步骤如下：

①标本处理：从-80℃冰箱中取出收集的血浆标本，在室温下自然解冻，解冻完成后，至少转移280μL至新的无菌Ep管中，4℃条件下12,000r/min离心10min，以消除细胞沉淀物；

②加裂解液：取250μL血浆样本转移至另一新的无酶无菌EP管中，加入500μL裂解液RNAiso(样本的2倍体积)，涡旋震荡混匀，室温静置10min；

③加氯仿萃取RNA：向上述溶液中加入200μL氯仿，上下颠倒混匀10次左右，静置5min，4℃12,000r/min离心15min，将无色的上层溶液转移至新的无酶无菌EP管中；

④加异丙醇沉淀RNA：加入等体积的异丙醇和40μL核酸结合增强剂，彻底混匀，室温静置10min(由于血浆样本中RNA含量较少，故加入核酸结合增强剂以提高RNA提取效率)；

⑤离心：在4℃条件下，12,000r/min离心10min，弃上清；

⑥清洗RNA沉淀：加入与RNAiso Plus等量的75％乙醇，上下颠倒，8000r/min离心10min，弃上清；

⑦干燥：打开管盖，室温放置5-10min；

⑧溶解RNA沉淀：加入30μL Rnase-Free ddH₂O溶解沉淀；

⑨RNA保存：由于RNA极易降解，在本研究中RNA提取完成后均直接进行逆转录反应。

⑩总RNA的质量控制：同上述组织RNA质量控制。

4.2RNA逆转录反应和QRT-PCR反应

按上述表1.1和表1.2进行逆转录反应，反应条件为：45℃孵育45min，95℃孵育5min，qRT-PCR反应的反应体系和扩增程序分别见表1.4和表1.5。在该扩增体系中，需将DNA稀释10倍后再使用(该反应体系中cDNA模板的使用量不超过100ng，经三次重复检测，经血浆RNA逆转录而来的cDNA浓度约在700-900ng/μL范围内)。

4.3结果判定

使用2^-ΔΔCt方法计算LUAD组与健康组之间目的基因的相对表达水平以及确定组间的差异表达倍数。计算公式如上述3.2.2。

4.4结果

4.4.1LUAD患者血浆中hsa_circ_0006117的差异表达验证

运用qRT-PCR方法对186例LUAD患者和60例健康对照者血浆标本中hsa_circ_0006117的相对表达水平进行检测。采用2^-ΔΔCt算法和Mann-Whitney U检验进行分析，如图11所示。结果表明：相比于健康对照者，LUAD患者血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平明显上调(P＜0.001)。

根据血浆中hsa_circ_0006117的相对表达水平绘制ROC曲线，评估其作为LUAD液体活检诊断标志物的潜在价值，如图12所示。结果表明：血浆hsa_circ_0006117在LUAD诊断中的AUC^ROC值为0.73，灵敏度和特异性分别为53％、86％(P＜0.0001)。

目前，美国临床生化科学院与欧洲肿瘤标志物专家组推荐使用的肺癌血清肿瘤标志物为：癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)、细胞角蛋白19的可溶性片段抗原21-1(cyto-keratin19fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)、胃泌素释放肽前体(progastrin releasingpeptide,ProGRP)和鳞状上皮细胞癌抗原(Squamous cell carcinoma antigen,SCC-Ag)。通过对上述5个临床常用肿瘤标志物数据进行收集和整理，SCC-Ag数据较少，对其余4个肿瘤标志物进行ROC曲线分析。结果表明：CEA、NSE、CYFRA21-1、和ProGRP在LUAD诊断中的AUC^ROC值分别为0.60、0.87、0.61和0.72。其中，NSE和ProGRP具有相对较好的临床应用价值。当血浆hsa_circ_0006117与NSE、ProGRP三者联合诊断时，AUC^ROC值提高至0.83，灵敏度和特异性分别为76％、84％(P＜0.0001)。

4.4.2通过公式(约登指数＝灵敏度－(1－特异度))计算最大约登指数，对应的血浆hsa_circ_0006117相对表达水平即为cut-off值。以cut-off值(cut-off＝2.73)为界，将LUAD组分为高表达组(n＝99)和低表达组(n＝87)(见表10)。整理临床资料，采用点——二列相关性分析法分析hsa_circ_0006117相对表达水平与8个临床病理特征之间的相关性，如表3.2所示。结果表明：LUAD组患者血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平与肿瘤的侵袭现象(包括胸膜、脉管、气道或神经侵犯)有关(P＝0.036，P＜0.05)，而与性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤大小、淋巴结转移和EGFR水平间的相关性均无统计学意义。

为了更清晰地了解血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平与肿瘤侵袭现象之间的关系，将LUAD患者分为Aggression组和Non-Aggression组，两组之间hsa_circ_0006117的相对表达水平如图13所示。结果表明：相比于Non-Aggression组，Aggression组LUAD者血浆hsa_circ_0006117高表达(P＜0.05)。

表10LUAD患者血浆hsa_circ_0006117相对表达水平与临床病理特征的相关性

注：*表示临床信息缺失，缺失信息与表2.1一致。

4.4.3为了进一步确定血浆hsa_circ_0006117与肿瘤侵袭现象之间的关系，我们通过肿瘤侵袭预测模型评估血浆hsa_circ_0006117对肿瘤侵袭现象的预测和判别能力。首先，通过Lasso cox回归逐步分析，从11个变量(年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤大小、淋巴结转移、4个常用肿标(CEA、NSE、CYFRA21-1、和ProGRP)和血浆hsa_circ_0006117相对表达水平)中，筛选出Sex+Tumor.size+CEA+hsa_circ_0006117 4个变量作为拟合因子来构建肺腺癌患者列线图侵袭预测模型(如图14)。然后，通过校准曲线对列线图的判别和校准能力进行评估，评估结果显示：该模型预测的肿瘤侵袭现象与实际相对吻合(如图15)。

通过DCA曲线和ROC曲线对该列线图预测模型的预测能力进行评估。DCA曲线分析结果显示：该预测模型对肿瘤侵袭现象的有无有一定提示作用(如图16)。ROC曲线分析结果显示：Sex+Tumor.size+CEA+血浆hsa_circ_0006117相对表达水平4个因素，在肿瘤侵袭预测中具有一定的应用价值，AUC^ROC＝0.71(如图17)。

通过上述研究虽已验证了血浆hsa_circ_0006117在LUAD患者与健康对照者之间的差异表达，且可能与肿瘤侵袭现象的发生有关，但它是否参与LUAD的病程进展仍然未知。为此，我们收集了29例LUAD患者术前和术后(术后≥3d)的血浆样本，通过qRT-PCR法检测hsa_circ_0006117的相对表达水平。结果表明：LUAD患者术后(术后≥3d)血浆hsa_circ_0006117的相对表达水平较术前显著下调(P＜0.001，如图18)。

实施例5CircRNA-miRNA-mRNA网络预测

首先，通过CircInteractome和CircBank数据库分别查询目的circRNAs的下游miRNAs，综合分析预测目的circRNAs的前5个潜在下游miRNAs。CircInteractome数据库提供circRNA上miRNA和RBP结合位点的生物信息学分析，并额外分析连接和连接侧翼序列上的miRNA和RBP位点。CircBank数据库是一个整合的人类circRNA数据库，包含circRNA的miRNA结合位点、circRNA的保守性、circRNA的m6A修饰、circRNA的突变和circRNA的蛋白质编码潜力等基本信息。

然后，通过TargetScan和Miranda数据库综合预测候选miRNAs的靶基因。TargetScan和Miranda数据库是常用的预测人类miRNA靶基因数据库。TargetScan数据库主要通过搜索与miRNA种子区域匹配的保守的8mer和7mer位点来预测靶基因。Miranda数据库主要收集实验验证的miRNA靶标。

最后，绘制CircRNA-miRNA-mRNA网络图。

CircInteractome和CircBank数据库显示，hsa_circ_0006117分别具有20个、35个miRNA结合位点，综合预测评分最高的前5个可能的下游miRNAs为：hsa-miR-1250-5P、hsa-miR-578、hsa-miR-636、hsa-miR-582-3p和hsa-miR-671-5p。通过TargetScan和Miranda数据库综合预测了上述5个miRNAs的靶基因，最终得到4个miRNAs(hsa-miR-1250-5P、hsa-miR-152-5p、hsa-miR-578和hsa-miR-636)和594个靶mRNAs。绘制CircRNA-miRNA-mRNA网络关系图(如图19)，结果表明：hsa_circ_0006117通过与hsa-miR-1250-5P、hsa-miR-671-5P、hsa-miR-636或hsa-miR-578结合，发挥miRNA sponging作用，作用于TMEM、LRRC、SOX和ZNF等疾病进展相关基因，从而促进LUAD的疾病进程。

实施例6靶基因的功能富集分析

为了预测hsa_circ_0006117在LUAD中的潜在生物学功能，我们对预测到的CircRNA-miRNA-mRNA网络的靶基因进行GO和KEGG功能富集分析。分别从MF、BP、CC中选取前20个显著富集的条目，以GO名称(terms)为横坐标，以差异基因数目为纵坐标，采用二级条目频率分析图和气泡图展示GO分析结果。通过对circRNA靶基因进KEGG通路分析，按照P值从小到大、通路下差异基因富集数目≥5筛选出Top 20的KEGG通路，从而了解circRNA可能参与的细胞信号通路。GO分析结果表明，hsa_circ_0006117靶基因主要涉及细胞组成(CC)和分子功能(MF)两方面。其中，CC多位于细胞膜和细胞质中，MF主要是结合蛋白质和金属离子，参与ATP(Adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)、细胞核、高尔基体、高尔基膜、Ca²⁺结合、细胞黏附和核苷酸结合等的调节(图20和图21)。KEGG通路分析结果富集到的前20条信号通路中，主要富集到胰岛素分泌、胰岛素抵抗和miRNAs作用等肿瘤细胞代谢相关通路(图22)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。围内。

Claims

1.检测hsa_circ_0006117的试剂在制备用于预测肺腺癌患者中发生肿瘤侵袭风险的产品中的用途，其特征在于，所述试剂为F: CCAGATAACCAGTTCACGGATG，R:GGAATCCATGCTTATCTGAAGG；所述产品是通过qPCR检测患者血浆中hsa_circ_0006117的含量来实现肺腺癌肿瘤侵袭风险的预测，其中hsa_circ_0006117在手术治疗后肺腺癌肿瘤侵袭患者血浆中的表达量相对于手术治疗前患者中的表达量显著下调。