[go: up one dir, main page]

RS62575B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv hepatocelularnog karcinoma (hcc) i drugih malignih tumora - Google Patents

Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv hepatocelularnog karcinoma (hcc) i drugih malignih tumora

Info

Publication number
RS62575B1
RS62575B1 RS20211420A RSP20211420A RS62575B1 RS 62575 B1 RS62575 B1 RS 62575B1 RS 20211420 A RS20211420 A RS 20211420A RS P20211420 A RSP20211420 A RS P20211420A RS 62575 B1 RS62575 B1 RS 62575B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peptide
cell
cells
peptides
cancer
Prior art date
Application number
RS20211420A
Other languages
English (en)
Inventor
Toni Weinschenk
Andrea Mahr
Jens Fritsche
Phillip Müller
Anita Wiebe
Sarah Missel
Original Assignee
Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1501017.6A external-priority patent/GB201501017D0/en
Application filed by Immatics Biotechnologies Gmbh filed Critical Immatics Biotechnologies Gmbh
Publication of RS62575B1 publication Critical patent/RS62575B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/00111—Hepatocyte growth factor receptor [HGFR or c-met]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1057—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from liver or pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak se konkretno odnosi na imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu, na primer, služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja. Konkretno, predmetni pronalazak odnosi se na nekoliko novih peptidnih sekvenci i njihove varijante dobijene iz HLA molekula klase I i klase II humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski / imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.
Osnovne informacije o pronalasku
Hepatocelularni karcinom (HCC) je jedan od najčešćih tumora u svetu i čini oko 6% svih novih dijagnostikovanih slučajeva karcinoma širom sveta. U svetu je 2012. godine dijagnostikovano oko 782.000 novih slučajeva HCC, što ga čini petim najčešćim malignim tumorom kod muškaraca (554.000 slučajeva) i devetim kod žena (228.000 slučajeva) (http://globocan.iarc.fr). HCC je najčešći primarni malignitet jetre i čini preko 80% svih primarnih karcinoma jetre kod odraslih.
Distribucija HCC se razlikuje geografski, a stope incidencije zavise od pola. Stopa incidencije standardizovana za starosnu dob (eng. age-standardized incidence rate; ASR) HCC kod muškaraca je najviša u Istočnoj Aziji (31,9) i Jugoistočnoj Aziji (22,2), srednja u Južnoj Evropi (9,5) i Severnoj Americi (9,3), a najniža je u Severnoj Evropi (4,6) i Jugocentralnoj Aziji (3,7). Stope incidencije HCC kod žena su manje u odnosu na ASR kod muškaraca. Najviša ASR kod žena je u Istočnoj Aziji (10,2) i Zapadnoj Africi (8,1), dok je najniža u Severnoj Evropi (1,9) i Mikroneziji (1,6).
Celokupna prognoza za pacijente sa HCC je loša. Relativna stopa 5-godišnjeg preživljavanja (5Y-RSR) HCC je oko 15%, u zavisnosti od stadijuma u vreme postavljanja dijagnoze. Za lokalizovani HCC, kod kojeg je karcinom još uvek ograničen na jetru, 5Y-RSR je oko 28%. Za regionalni i udaljen HCC, kod kojeg je karcinom urastao u okolne ili prešao u udaljene organe, stopa 5Y-RSR iznosi 7% odnosno 2%.
U poslednje vreme je sproveden ograničen broj imunoterapijskih ispitivanja za HCC. Citokini su korišćeni za aktivaciju podskupova imunskih ćelija i/ili povećavanje imunogenosti tumora(Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). Druga ispitivanja su se fokusirala na infuziju limfocita koji infiltriraju tumor ili aktiviranih limfocita iz periferne krvi (Shi et al., 2004a; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000).
Do sada je sproveden mali broj ispitivanja sa terapijskom vakcinacijom. Butterfield i sar. su sproveli dva ispitivanja primenom peptida izvedenih iz alfa-fetoproteina (AFP) u vidu vakcine ili dendritičnih ćelija (DĆ) napunjenih AFP peptidima ex vivo (Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). U dve različite studije, autologne dendritične ćelije (DĆ) su bile pulsirane ex vivo sa autolognim lizatom tumora (Lee et al., 2005) ili lizatom ćelijske linije hepatoblastoma HepG2 (Palmer et al., 2009). Do sada su ispitivanja sa vakcinacijom pokazala samo ograničena poboljšanja u kliničkim ishodima.
Williams i sar. (2013) iznose da varijante sekvenci kod SLC16A11 predstavljaju faktor rizika za dijabetes tipa 2, ali ne predstavljaju peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 56 za upotrebu u terapiji, uključujući terapiju raka.
Kratak pregled pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na peptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV 56 kako je definisan u priloženom patentnom zahtevu 1. Dalji aspekti pronalaska definisani su u priloženim patentnim zahtevima.
U prvom aspektu predstavljen je peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovu varijantnu sekvencu koja je najmanje 80%, a poželjno najmanje 90%, homologna (poželjno najmanje 80% ili najmanje 90% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300, naznačeno time što se navedena varijanta vezuje za MHC i/ili indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.
Takođe je predstavljen peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihova varijanta, koja je najmanje 80%, a poželjno najmanje 88%, homologna (poželjno najmanje 80% ili najmanje 88% identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300, naznačeno time što navedeni peptid ili njegova varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.
U sledećim tabelama prikazan je peptid u skladu sa predmetnom objavom, njegov odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) gen za ovaj peptid. Peptid u tabeli 1 vezuje se za HLA-A*02.
Tabela 1: HLA-A*02 peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom - S* = fosfoserin
Dalje su, pored toga, uopšteno predstavljeni peptidi u skladu sa objavom za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, karcinom pankreasa, karcinom kolona ili rektuma, karcinom bubrega, maligni tumor mozga i/ili leukemije.
Naročito su poželjni peptidi – samostalni ili u kombinaciji – u skladu sa predmetnom objavom izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300. Više poželjni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – izabrani iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 124 (vidite tabelu 1), poželjno za vezivanje A*02, i iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 187 do ID BR. SEKV: 218, poželjno za vezivanje A*24, i njihove primene u imunoterapiji HCC, malignog tumora mozga, karcinoma bubrega, karcinoma pankreasa, karcinoma kolona ili rektuma ili leukemije, a poželjno HCC.
Stoga se drugi aspekt predmetne objave odnosi na upotrebu ovde predstavljenih peptida za – poželjno kombinovano – lečenje proliferativne bolesti izabrane iz grupe koju čine HCC, maligni tumor mozga, karcinom bubrega, karcinom pankreasa, karcinom kolona ili rektuma i leukemija.
Predmetna objava se zatim odnosi na ovde predstavljene peptide koji imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili – u produženom obliku, kao što je varijanta dužine – MHC klase II.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što se navedeni peptidi (svaki) sastoje ili esencijalno sastoje od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na (ili u sekvencu) antitela, kao, na primer, antitela koje je specifično za dendritične ćelije.
Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljene peptide. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira i/ili eksprimira ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju bolesti koje obuhvataju rak i autoimunske I zapaljenjske I imunološke patološke bolesti.
Predmetna objava se dalje odnosi na antitela protiv ovde predstavljenih peptida ili kompleksa navedenih, ovde predstavljenih peptida sa MHC i metode za pravljenje istih.
Predmetna objava se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.
Antitela i TCR su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanim pronalaskom.
Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili prethodno opisani vektor ekspresije. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.
Predmetna objava se dalje odnosi na metod proizvodnje ovde predstavljenog peptida, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ovde predstavljene ćelije domaćina i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni navedeni metod, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ili eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV: 300, poželjno sadrži ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 124, i ID BR. SEKV 187 do ID BR. SEKV: 218 ili varijantu aminokiselinske sekvence.
Predmetna objava se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću ovde predstavljenog metoda, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu.
Predmetna objava se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih prema ovoj objavi.
Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, ovde predstavljene nukleinske kiseline, ovde predstavljenog vektora ekspresije, ovde predstavljene ćelije, aktiviranog T limfocita, T receptora ili antitela ili drugog peptida – i/ili molekula koji vezuju peptid-MHC u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, lek je aktivan protiv malignog tumora.
Poželjno, navedeni lek je za ćelijsku terapiju, vakcinu ili zasnovan na proteinu na solubilnom TCR ili antitelu.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačeno time što su navedene ćelije malignog tumora HCC, maligni tumor mozga, karcinom bubrega, karcinom pankreasa, karcinom kolona ili rektuma ili leukemija i poželjno HCC ćelije.
Predmetna objava se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na ovde predstavljenim peptidima, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze HCC. Predmetna objava se takođe odnosi na upotrebu navedenih novih ciljeva u kontekstu lečenja raka.
Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina (MHC klasa I receptori) odnosno alfa i beta lanca (MHC klasa II receptori). Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima. MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju. Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući TCR (T-ćelijski receptor), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.
CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, NK ćelije, makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).
U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).
Elongirani (duži) peptidi iz ove objave mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi. T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.
Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferona-gama (IFNγ).
Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora nije se smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
Antigeni koje prepoznaju tumor-specifični citotoksični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.
Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.
Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji se vezuju za MHC klasa I su obično dužine 8–12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.
U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).
Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena sadrži sledeće velike grupe: a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije ili NY-ESO-1.
b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao; većina njih nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom lozom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate.
c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.
d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.
e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumor-specifični. f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.
Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane citotoksičnih T limfocita kao tumorspecifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumorspecifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektni tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.
U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je
1
prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.
Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA zasnovani su na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva.
Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom primeru je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).
U slučaju TCR i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. Za ovde predstavljene TCR-ove i antitela prezentacija je određujući faktor.
I terapijske i dijagnostičke primene protiv dodatnih malignih bolesti predstavljene su u sledećem detaljnijem opisu osnovnih proteina (polipeptida) peptida u skladu sa objavom.
Peptid koji se sastoji ili se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu može imati zamenjenu jednu ili dve nesidrene aminokiseline (vidite u nastavku u pogledu sidrenog motiva) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom. U drugom primeru, u peptidu koji se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence kako je navedena u ovom dokumentu, jedna ili dve aminokiseline mogu biti zamenjene njihovim partnerima za konzervativnu zamenu (vidite u nastavku dokumenta) bez značajnog menjanja ili negativnog uticaja na sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II, kada se uporedi sa nemodifikovanim peptidom.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, naznačeno time što je navedeni peptid modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze kako je opisano u nastavku dokumenta.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina, konkretno fuziranog na N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii) ili fuziranog na antitelo (ili u sekvencu antitela), kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije, tj. vezuje se za dendritične ćelije.
Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljeni peptid. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira, eksprimira i/ili prezentuje ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u medicini.
Predmetna objava se dalje odnosi na antitela opisana dalje u nastavku, kao i metode njihove proizvodnje. Poželjna su antitela koja su specifična za peptide predmetne objave, i/ili za peptide predmetne objave kada su vezani za svoje MHC. Poželjna antitela mogu biti monoklonalna.
Predmetna objava se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR), konkretno solubilne TCR (sTCR) koji ciljaju ovde predstavljene peptide i/ili njihove komplekse peptid-MHC, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetna objava se dalje odnosi na antitela ili druge vezujuće molekule koji ciljaju ovde predstavljene peptide i/ili njihove komplekse peptid-MHC, kao i metode njihove proizvodnje.
Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili prethodno opisani vektor ekspresije. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina, naznačeno time što je antigen-prezentujuća ćelija dendritična ćelija.
Predmetna objava se dalje odnosi na metod proizvodnje ovde predstavljenog peptida, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ovde predstavljene ćelije domaćina i izolovanja peptida iz ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.
Predmetna objava se dalje odnosi na in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I ili II sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen najmanje jedan peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetna objava se dalje odnosi na metod, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigenprezentujućom ćelijom.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili varijantu njegove aminokiselinske sekvence.
Predmetna objava se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću ovde predstavljenog metoda, koje selektivno prepoznaju ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu.
Predmetna objava se dalje odnosi na metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju ovde predstavljenu aminokiselinsku sekvencu, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja ovde predstavljenih T ćelija.
Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, ovde predstavljene nukleinske kiseline, ovde predstavljenog vektora ekspresije, ovde predstavljene ćelije, ili ovde predstavljene aktivirane T ćelije u vidu leka ili u proizvodnji leka.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačeno time što je navedeni lek vakcina, ćelija, ćelijska populacija, kao, na primer, ćelijska linija,
1
sTCR-ovi i monoklonalna antitela.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačeno time što su navedene ćelije malignog tumora ćelije HCC.
Predmetna objava se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na peptidima u skladu sa predmetnim pronalaskom koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze HCC.
Pored toga, predmetna objava odnosi se na upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.
Nadalje, predmetna objava odnosi se na metod za proizvodnju personalizovane antitumorske vakcine za pojedinačnog pacijenta korišćenjem baze podataka (koja se u ovom tekstu zove i „skladište“) prethodno pretraženih tumor-asociranih peptida.
Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.
Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) i koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).
Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, ili duži sa dužinom od 10, 11, 12 ili 13, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida objave) oni mogu biti dužine od 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 aminokiselina.
Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Napomenuto je da se soli peptida u skladu sa predmetnom objavom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.
Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.
Termin „peptidi predmetnog pronalaska“ će takođe obuhvatati peptide koji se sastoje od ili sadrže peptid kako je definisan ranije u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300.
Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.
Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.
T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za
1
kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8–14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.
Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.
Tabela 2: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori M, et al. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997 Oct 15;64(7):1017-27) primenom Hardi-Vajnbergove formule F=1-(1-Gf)<2>. Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje vidite rad Chanock i sar. (S.J. Chanock, et al (2004) HLA-A, -B, -Cw, -DQA1 and DRB1 in an African American population from Bethesda, USA Human Immunology, 65: 1223-1235).
1
Peptidi iz ove objave, poželjno kada su uključeni u vakcinu iz ove objave kako je ovde opisana, vezuju se za A*02 ili A*24. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina objave može da se koristi za lečenje malignog
1
tumora kod pacijenata koji su pozitivni na A*02, pozitivni na A*24 ili pozitivni na A*02 i A*24, a nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.
Kombinovanje, na primer, A*02 i A*24 peptida u jednoj vakcini ima prednost da veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva sama alela može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina objave može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).
Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na DNK sekvencu obuhvata i jednolančanu i dvolančanu DNK. Tako, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence. Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.
Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.
U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.
Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine iz ove objave sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.
1
Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za peptid“ (ili koji kodira) odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR.
Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).
Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.
Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.
Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.
Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.
Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste
1
izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.
Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito se razmatra.
Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnom objavom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetnu objavu mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku.
Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.
Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer,
2
ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.
U skladu sa predmetnom objavom, termin „procenat homologije“, „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa sekvencom shodno patentnom zahtevu ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili sekvencom shodno patentnom zahtevu („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli:
Procenat identičnosti = 100 [1 -(C/R)]
gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što
(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i
(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i
(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku i (iiii) poravnanje mora da počne na položaju 1 poravnatih sekvenci;
a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.
Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.
Originalni (nemodifikovani) peptidi kako su ovde predstavljeni mogu biti modifikovani supstitucijom jednog ili više ostataka na različitim, poželjno selektivnim, položajima unutar peptidnog lanca, ako nije navedeno drugačije. Poželjno, te supstitucije nalaze se na kraju aminokiselinskog lanca. Takve supstitucije mogu biti konzervativne prirode, na primer, kada se jedna aminokiselina zamenjuje aminokiselinom slične strukture i sličnih karakteristika, kao kada se hidrofobna aminokiselina zamenjuje drugom hidrofobnom aminokiselinom. Još konzervativnija bi bila zamena aminokiselina iste ili slične veličine i hemijske prirode, kao kada se leucin zamenjuje izoleucinom. U studijama varijacija sekvenci u familijama prirodno javljajućih homolognih proteina, određene supstitucije aminokiselina se češće tolerišu od drugih, i one često pokazuju korelaciju sa sličnostima u veličini, naelektrisanju, polaritetu i hidrofobnosti između originalne aminokiseline i njene zamene, i kao takve predstavljaju osnovu za definisanje „konzervativnih supstitucija“.
Konzervativne supstitucije su ovde definisane kao zamena u okviru jedne od sledećih pet grupa: Grupa 1 – mali alifatični, nepolarni ili malo polarni ostaci (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupa 2 – polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi amidi (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupa 3 – polarni, pozitivno naelektrisani ostaci (His, Arg, Lys); Grupa 4 – veliki, alifatični, nepolarni ostaci (Met, Leu, Ile, Val, Cys); i Grupa 5 – veliki aromatični ostaci (Phe, Tyr, Trp).
Manje konzervativne supstitucije bi mogle da uključuju zamenu jedne aminokiseline drugom koja ima slične karakteristike ali je malo drugačije veličine, kao što je zamena alaninskog ostatka izoleucinskim ostatkom. Veoma nekonzervativne zamene bi mogle da uključuju supstituisanje kisele aminokiseline polarnom, ili čak i aminokiselinom baznog karaktera. Takve „radikalne“ supstitucije ne mogu, ipak, da se odbace kao potencijalno neefikasne jer hemijski efekti nisu potpuno predvidivi a radikalne supstitucije bi mogle da dovedu do srećnih slučajnih otkrića koja inače ne bi mogla da se predvide iz jednostavnih hemijskih principa.
Naravno, takve supstitucije mogu uključivati strukture koje nisu uobičajene L-aminokiseline. Tako, D-aminokiseline bi mogle da supstituišu L-aminokiseline koje se uobičajeno nalaze u antigenim peptidima iz ove objave a da i dalje budu obuhvaćene onim što je ovde objavljeno. Pored toga, aminokiseline koje poseduju nestandardne R grupe (tj. R grupe koje se ne nalaze u uobičajenih 20 aminokiselina prirodnih proteina) takođe se mogu koristiti u svrhe supstituisanja da bi se proizveli imunogeni i imunogeni polipeptidi u skladu sa predmetnom objavom.
Ako se utvrdi da supstitucije na više od jednog položaja rezultuju peptidom sa značajnom jednakom ili većom antigenom aktivnošću kako je definisano u nastavku, onda će kombinacije tih supstitucija biti testirane kako bi se utvrdilo da li kombinovane supstitucije rezultuju aditivnim ili sinergističkim efektima na antigenost peptida. Najviše, u okviru peptida neće biti istovremeno supstituisano više od četiri položaja.
Peptidi iz ove objave mogu biti produženi za najviše četiri aminokiseline, to jest mogu da se dodaju 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline na bilo koji kraj u bilo kojoj kombinaciji između 4:0 i 0:4.
Kombinacije elongacija u skladu sa objavom mogu se videti iz tabele 3:
Aminokiseline za elongaciju/produžavanje mogu biti peptidi originalne sekvence proteina ili bilo koja druga aminokiselina(e). Elongacija može da se koristi za poboljšavanje stabilnosti ili rastvorljivosti peptida.
Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane CTL, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferon-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.
Poželjno, kada se T ćelije specifične za ovde predstavljeni peptid testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pmol/l, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pmol/l.
2
Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.
Tako, epitopi predmetne objave mogu biti identični prirodno javljajućim tumorasociranim ili tumor-specifičnim epitopima ili mogu obuhvatati epitope koji se razlikuju za ne više od četiri ostataka od referentnog peptida, dokle god imaju značajno identičnu antigenu aktivnost.
MHC molekuli klase I se mogu naći na većini ćelija koje sadrže jedro koje prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja uglavnom endogenih proteina, proteina citosola ili jedra, DRIP-ova i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija.
Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8-pozitivnih T ćelija (MHC molekul klase I) ili pomoću CD4-pozitivnih T ćelija (MHC molekul klase II) važna je u razvoju tumorskih vakcina. Zato je cilj predmetne objave, da obezbedi smeše peptida koje sadrže peptide koji se vezuju za MHC komplekse bilo koje od ove dve klase.
Imajući u vidu ozbiljna neželjena dejstva i trošak u vezi sa lečenjem raka preko su potrebni bolji metodi prognoze i dijagnostikovanja. Zato, postoji potreba da se identifikuju drugi faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za HCC. Pored toga, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno HCC.
Predmetna objava obezbeđuje peptide koji su korisni u lečenju raka/tumora, poželjno HCC, koji prekomerno ili isključivo prezentuju peptide iz ove objave. Za ove peptide je pokazano masenom spektrometrijom da ih prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima HCC.
Dokazano je da su izvorni gen/protein (koji se takođe naziva „protein kompletne dužine“ ili „osnovni protein“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u malignom tumoru u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ove objave će označavati ili zdrave ćelije jetre ili normalne ćelije drugih tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu - „tumorsko tkivo“ u pogledu ove objave označava uzorak od pacijenta koji boluje od HCC, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 1).
HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije HCC koje prezentuju dobijene peptide.
Za peptide predmetne objave je dokazano da su sposobni da stimulišu T-ćelijske odgovore i/ili da su prekomerno prezentovani i da samim tim mogu da se koriste za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, predstavljenih u ovom dokumentu (vidite primer 3). Pored toga, peptidi, kada su u kompleksu sa odgovarajućim MHC, mogu takođe da se koriste za proizvodnju ovde predstavljenih antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako su peptidi predmetne objave korisni za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptidi predmetne objave nisu prezentovani na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.
„Farmaceutska smeša“ je poželjno smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).
Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (vidite ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna
2
kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.
U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).
Naročito poželjna je smeša i/ili upotreba navedene smeše, na primer, u obliku vakcine.
Peptidi predmetne objave mogu da se koriste za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.
Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.
Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani
2
glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.
Još jedan aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na metod proizvodnje navedenog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje je u stanju da se specifično veže za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom. Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).
Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska smatra „specifičnim“.
Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhu odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, Liddy et al., 2012). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (vidite rad Boulter et
2
al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.
Pored toga, peptidi i/ili TCR-ovi ili antitela ili drugi vezujući molekuli predmetne objave mogu da se koriste da se potvrdi dijagnoza raka patologa na osnovu bioptiranog uzorka.
Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2007) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995).
Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprejjonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih TUMAP zabeleženog iz uzoraka HCC (N = 16 A*02-pozitivnih uzoraka uključujući trinaest A*02:01-pozitivnih uzoraka, N = 15 A*24-pozitivnih uzoraka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog karcinoma dobijenog od 31 pacijenta sa HCC.
Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-
2
restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.
Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.
Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tumorskog tkiva HCC su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog HCC čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom HCC.
TUMAP identifikovani na multiplim HCC tumorskim i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.
Predmetna objava odnosi se na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovu varijantu koja je najmanje 90% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovom varijantom koja indukuje T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom, naznačeno time što navedeni peptid nije osnovni polipeptid kompletne dužine.
Predmetna objava se dalje odnosi na peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovu varijantu koja je najmanje 90% homologna (poželjno identična) sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV:
2
300, naznačeno time što navedeni peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100, poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14 aminokiselina.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide koji imaju sposobnost da se vežu za molekul klase I ili II humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što se peptid sastoji ili esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačeno time što je peptid (hemijski) modifikovan i/ili sadrži nepeptidne veze.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljene peptide, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteina, konkretno koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii), ili naznačene time što je peptid fuziran na (ili u) antitelo, kao, na primer, antitelo koje je specifično za dendritične ćelije.
Predmetna objava se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira ovde predstavljene peptide, pod uslovom da peptid nije potpun (kompletan) humani protein.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.
Predmetna objava se dalje odnosi na vektor ekspresije koji je u stanju da eksprimira ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni peptid, ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju HCC.
Predmetna objava se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ovde predstavljenu nukleinsku kiselinu ili ovde predstavljeni vektor ekspresije.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu ćeliju domaćina koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljen metod, naznačen time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I ili II eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljeni metod, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili navedenu varijantu aminokiselinske sekvence.
Predmetna objava se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, ovde predstavljene nukleinske kiseline, ovde predstavljenog vektora ekspresije, ovde predstavljene ćelije, ili ovde predstavljenog aktiviranog T limfocita u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što je lek aktivan protiv raka.
Predmetna objava se dalje odnosi na ovde predstavljenu upotrebu, naznačenu time što su navedene ćelije malignog tumora HCC ćelije ili ćelije drugih solidnih ili hematoloških tumora kao što su karcinom pankreasa, maligni tumor mozga, karcinom bubrega, karcinom kolona ili rektuma ili leukemija.
Predmetna objava se dalje odnosi na konkretne markerske proteine i biomarkere zasnovane na ovde predstavljenim peptidima, u ovom tekstu nazvane „ciljevima“, a koji se mogu koristiti kod određivanja dijagnoze i/ili prognoze HCC. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ovih novih ciljeva za lečenje raka.
Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava predstavljenih u ovom dokumentu (npr. specifično vezivanje markerskog polipeptida HCC-a, isporučivanje toksina ćeliji HCC koja eksprimira markerski gen za karcinom u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida HCC-a).
Kad god je to moguće, antitela objave mogu da se nabave iz komercijalnih izvora. Antitela objave mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi
1
stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela objave mogu da se koriste markerski polipeptidi za HCC kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela objave može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.
Na primer, cDNK koja kodira ovde predstavljeni peptid, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300, polipeptid, ili njegova varijanta ili fragment, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za HCC koji se koristi za stvaranje ovde predstavljenog antitela.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela vidite, npr. Harlow and Lane, 2013). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.
Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju
2
drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).
Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.
Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).
Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno, Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.
Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.
Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.
Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koje su sposobne da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira region spajanja teškog lanca antitela kod
4
miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultira kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.
Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.
Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.
Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje HCC, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.
Zato što su peptidi pomenuti u tabelama objave iznad i samim tim i njihovi osnovni polipeptidi visoko eksprimirani u HCC, a eksprimirani u prilično do ekstremno niskim nivoima u normalnim ćelijama, inhibicija proteina izabranog iz grupe koju čine proteinski proizvodi sledećih gena: poželjni za inhibiciju i za antitela i/ili TCR-ove su GLUL, GPAM, PLIN2, SLC16A1, SLC9A3R1, PCBD1, SEC16A, AKR1C4, ABCB11, HAL, CYP2E1, C4A, C4B, ALDH1L1, CRP, ACSL4, EEF2, HLTF, FBXO22, GALK1, TMC01, TMEM33, ZNF318, IPO9, AMACR, C1QTNF3, CYP4F8, CYP4F3, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F2, MOCOS, A1CF, COL18A1, HPR, LBP, C19orf80, CFHR5, ITIH4, TMEM110, LARP4, LMF2, SLC10A5, i SLC16A11; još poželjniji za inhibiciju i za antitela i/ili TCR-ove su ANKFYI, C12orf44, C16orf58, CPSF1, DCAF8, PEX19, DDX11, DDX12P, DECR2, NME4, DENND5B, DYM, EDC4, ERI3, FAM20A, FNDC3A,GPR107, GYG2, HEATR2, IFT81, KCTD3,SHKBP1, KIAA1324L, KLHL24, MARCH6, MBTPS2, MIR1279, CPSF6, NOC4L, NXF1, PANK2, PCNXL3, PIPSL, PSMD4, PSMD14, SLC35B1, TCP11L2, THNSL2, THOC2, T0MM5, TRAPPC6B, TRIM54, TRIM55, TRIM63, UGGT2, URB1, VPS54, WIZ, ZNF451, RFTN2, SCFD1, SERINC5, CCT7P2, CMAS, ANKS1A, C17orf70, CCT7, CDK5RAP2, CLPTM1, a najpoželjniji za inhibiciju i za antitela i/ili TCR-ove su APOB, FASN, i/ili COPA; a ekspresija ili aktivnost ovih markera može poželjno biti integrisana u terapijsku strategiju, npr. za lečenje ili prevenciju HCC.
Princip antisens terapije bazira se na hipotezi da sekvencno-specifična supresija ekspresije gena (preko transkripcije ili translacije) može da se postigne unutarćelijskom hibridizacijom između genomske DNK ili iRNK i komplementarnih antisens vrsta. Obrazovanje takvog dupleksa hibridne nukleinske kiseline ometa transkripciju ciljne genomske DNK koja kodira tumorski antigen, ili obradu/transport/translaciju i/ili stabilnost ciljne iRNK tumorskog antigena.
Antisens nukleinske kiseline mogu da se isporuče raznovrsnim pristupima. Na primer, antisens oligonukleotidi ili antisens RNK može da se direktno da ispitaniku (npr. intravenskom injekcijom) u obliku koji omogućava preuzimanje u ćelije tumora. Alternativno, u ćelije in vivo, mogu da se uvedu virusni ili plazmidni vektori koji kodiraju antisens RNK (ili fragmente RNK). Antisens efekti mogu takođe da se indukuju sens sekvencama; međutim, stepen fenotipskih promena je veoma varijabilan. Fenotipske promene indukovane efikasnom antisens terapijom se procenjuju u skladu sa promenama u, npr. nivoima ciljne iRNK, nivoima ciljnog proteina i/ili nivoima aktivnosti ciljnog proteina.
U specifičnom primeru, inhibicija funkcije HCC cilja/markera pomoću antisens genske terapije može da se postigne direktnim davanjem antisens RNK tumorskog markera ispitaniku. Antisens RNK tumorskog markera može da se proizvede i izoluje pomoću bilo koje standardne tehnike, ali se najčešće proizvodi in vitro transkripcijom pomoću antisens cDNK tumorskog markera pod kontrolom visoko efikasnog promotera (npr. T7 promoter). Unošenje antisens RNK tumorskog markera u ćelije može se izvršiti bilo kojom od metoda za direktno unošenje nukleinskih kiselina koje su opisane u nastavku.
Alternativna strategija za inhibiranje funkcije proteina izabranog iz grupe koju čine gore pomenuti proteini, a najpoželjnije APOB, FASN, i/ili COPA, uključuje upotrebu nukleinske kiseline (npr. siRNK, ili nukleinske kiseline koja kodira anti-protein antitelo ili njegov deo, koja može da se prenese u maligne ćelije ili druge ćelije, dovodeći do unutarćelijske ekspresije i sekrecije antitela), proteina ili malog molekula, ili bilo kojeg drugog jedinjenja koje cilja ekspresiju, translaciju i/ili biološku funkciju ovog proteina.
U metodima opisanim ranije u tekstu, koji obuhvataju unošenje i preuzimanje egzogene DNK u ćelije ispitanika (tj. transdukciju ili transfekciju gena), nukleinske kiseline predmetne objave mogu biti u obliku ogoljene DNK ili nukleinske kiseline mogu biti u vektoru za dostavljanje nukleinskih kiselina ćelijama u cilju inhibicije ekspresije markerskog proteina HCC. Vektor može biti komercijalno dostupan preparat, kao što je adenovirusni vektor (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Kanada). Dostavljanje nukleinskih kiselina ili vektora ćelijama može biti putem različitih mehanizama. U jednom primeru, dostavljanje je moguće putem lipozoma, primenom komercijalno dostupnih preparata lipozoma kao što su Lipofectin, Lipofectamine (GIBCO-25 BRL, Inc., Gaithersburg, Merilend), Superfect (Qiagen, Inc. Hilden, Nemačka) i Transfectam (Promega Biotec, Inc, Madison, Viskonsin, SAD), kao i drugih lipozoma koji su razvijeni u skladu sa standardnim procedurama u predmetnoj oblasti. Pored toga, nukleinska kiselina ili vektor ove objave mogu da se dostavljaju in vivo pomoću elektroporacije, tehnologije koja je dostupna kod kompanije Genetronics, Inc. (San Diego, SAD) kao i pomoću aparata Sonoporation (ImaRx Pharmaceutical Corp, Tucson, Arizona, SAD).
U jednom primeru, dostavljanje vektora može biti putem virusnog sistema, kao što je sistem retrovirusnog vektora u koji se može upakovati rekombinantni retrovirusni genom. Rekombinantni retrovirus potom može da se koristi za inficiranje i samim tim dostavljanje antisens nukleinske kiseline inficiranim ćelijama koja inhibira ekspresiju proteina izabranog iz grupe koju čine gore pomenuti proteini. Naravno, tačan metod uvođenja izmenjene nukleinske kiseline u ćelije sisara nije ograničen na primenu retrovirusnih vektora. Za ovu proceduru široko su dostupne i druge tehnike, uključujući primenu adenovirusnih vektora, adeno-asociranih virusnih (AAV) vektora, lentivirusnih vektora, pseudotipiziranih retrovirusnih vektora. Takođe mogu da se koriste fizičke tehnike transdukcije, kao što je dostavljanje lipozomom i receptorom-posredovana endocitoza i drugi mehanizmi endocitoze. Ovaj pronalazak može da se koristi zajedno sa bilo kojim od ovih ili drugim često korišćenim metodima za transfer gena.
Antitela se takođe mogu koristiti za in vivo dijagnostičke eseje. Uopšteno, antitelo se obeležava radionuklidom (kao što je<111>In,<99>Tc,<14>C,<131>I,<3>H,<32>P ili<35>S) tako da se tumor može lokalizovati upotrebom imunoscintigrafije. U jednom otelotvorenju, antitela ili njihovi fragmenti se vezuju za vanćelijske domene dva ili više ciljeva proteina izabranih iz grupe koju čine gore pomenuti proteini, a vrednost afiniteta (Kd) je manja od 1 x 10 µmol/l.
Antitela za dijagnostičku primenu mogu biti obeležena probama koje su prikladne za detekciju različitim imidžing metodama. Metode za detekciju proba uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescenciju, svetlosnu, konfokalnu i elektronsku mikroskopiju; imidžing magnetnom rezonancom i spektroskopiju; fluoroskopiju, kompjuterizovanu tomografiju i pozitronsku emisionu tomografiju. Prikladne probe uključuju, ali nisu i ograničene na, fluorescein, rodamin, eozin i druge fluorofore, radioizotope, zlato, gadolinijum i druge lantanide, paramagnetsko gvožđe, fluorin-18 i druge radionuklide koji emituju pozitrone. Pored toga, probe mogu biti bi- ili multi-funkcionalne i mogu se detektovati pomoću više od jednog od navedenih metoda. Ova antitela mogu biti direktno ili indirektno obeležena navedenim probama. Vezivanje proba za antitela uključuje kovalentno vezivanje probe, inkorporaciju probe u antitelo, i kovalentno vezivanje helirajućeg jedinjenja za vezivanje probe, među ostalima koji su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Za imunohistohemiju, uzorak obolelog tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ukalupljen u parafin i fiksiran konzervansom kao što je formalin. Fiksirani ili ukalupljeni isečci koji sadrže uzorak dovode se u kontakt sa obeleženim primarnim antitelom i sekundarnim antitelom, naznačeno time što se antitelo koristi za detekciju ekspresije proteina in situ.
Kao što je ranije pomenuto, predmetna objava tako obezbeđuje peptid koji sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovu varijantu koja je 90% homologna sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili njihovom varijantom koji će indukovati T ćelije koje unakrsno reaguju sa navedenim peptidom. Peptidi iz ove objave imaju sposobnost da se vezuju za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I, a elongirane verzije navedenih peptida za klasu II.
U predmetnoj objavi, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite Procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke za analizu dostupne su u javnim bazama podataka.
Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Fong et al. 2001; Zaremba et al. 1997; Colombetti et al. 2006 ; Appay et al.2006).
Pod „varijantom“ date aminokiselinske sekvence pronalazači podrazumevaju da bočni lanci, na primer, jednog ili dva aminokiselinska ostatka budu izmenjeni (na primer tako što će biti zamenjeni bočnim lancem drugog aminokiselinskog ostatka koji se prirodno pojavljuje ili nekim drugim bočnim lancem) tako da peptid i dalje bude sposoban da se vezuje za HLA molekul na značajno isti način kao i peptid koji sadrži datu aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300. Na primer, peptid može biti modifikovan tako da najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost interakcije sa i vezivanja za udubljenje za vezivanje prikladnog MHC molekula, kao što su HLA-A*02 ili -DR, i na taj način najmanje zadrži, ako ne i poboljša, sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija.
Ove T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave. Kako se može izvesti iz naučne literature (Godkin et al. 1997) i baza podataka (Rammensee et al. 1999), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje. Tako će osoba stručna u predmetnoj oblasti moći da modifikuje aminokiselinske sekvence navedene u ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 300, zadržavanjem poznatih sidrenih ostataka, i biće u stanju da utvrdi da li takve varijante zadržavaju sposobnost vezivanja za MHC molekule klase I ili II. Varijante predmetne objave zadržavaju sposobnost vezivanja za TCR aktiviranih T ćelija, koje naknadno mogu unakrsno reagovati sa i ubiti ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima ove objave.
Aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa T-ćelijskim receptorom mogu da se modifikuju zamenom sa drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid iz ove objave može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinske sekvence ili njihov deo ili njihovu varijantu kako je naznačeno.
Oni aminokiselinski ostaci koji ne doprinose značajno interakcijama sa TCR-om mogu da se modifikuju zamenom sa drugom aminokiselinom čija inkorporacija ne utiče značajno na T-ćelijsku reaktivnost i ne eliminiše vezivanje za relevantni MHC. Stoga, nezavisno od navedenog uslova, peptid pronalaska može biti bilo koji peptid (a pod ovim terminom pronalazači podrazumevaju i oligopeptid ili polipeptid), koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu ili njen deo ili njenu varijantu kako je naznačeno.
Takođe, mogu biti prikladni i duži peptidi. Takođe je moguće da se obradom peptida iz dužih peptida ili proteina koji sadrže sam epitop, stvore epitopi MHC klase I, mada su oni obično dužine između 8 i 11 aminokiselina. Poželjno je da ostaci koji su bočni na aktuelni epitop budu ostaci koji ne ometaju u značajnoj meri proteolitičko cepanje koje je neophodno da bi se aktuelni epitop eksponirao tokom obrade.
Saglasno tome, predmetna objava obezbeđuje peptide i varijante epitopa MHC klase I, naznačene time što peptid ili varijanta ima ukupnu dužinu od između 8 i 100,
4
poželjno između 8 i 30, i najpoželjnije između 8 i 14, naime 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminokiselina, a u slučaju elongiranih peptida koji se vezuju za klasu II, dužina može da iznosi i 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili 22 aminokiseline.
Naravno, peptid ili varijanta u skladu sa predmetnom objavom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I ili II.
Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.
U naročito preferiranom primeru predstavljene objave peptid se sastoji ili se esencijalno sastoji od aminokiselinske sekvence u skladu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300.
„Esencijalno se sastoji od“ znači da peptid u skladu sa predmetnom objavom, pored sekvence u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 300 ili njene varijante, sadrži dodatne N- i/ili C-terminalno locirane produžetke od aminokiselina koji nužno ne obrazuju deo peptida koji funkcioniše kao epitop za epitop MHC molekula.
Ipak, ovi produžeci mogu biti važni za obezbeđivanje efikasnog uvođenja peptida u skladu sa predmetnom objavom u ćelije. U jednom otelotvorenju predmetne objave, peptid je deo fuzionog proteina koji sadrži, na primer, 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „li“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497. U drugim fuzijama, peptidi predmetne objave mogu biti fuzirani na antitelo kako je opisano u ovom dokumentu, ili na njegov funkcionalni deo, naročito u sekvencu antitela, tako da budu specifično ciljani od strane navedenog antitela, ili, na primer, na ili u antitelo koje je specifično za dendritične ćelije kako su opisane u ovom dokumentu.
Pored toga, peptid ili varijanta mogu biti dalje modifikovani da bi se poboljšala stabilnost i/ili vezivanje za MHC molekule kako bi se izazvao jači imunski odgovor. Metodi za takvu optimizaciju peptidne sekvence su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju, na primer, uvođenje reverznih peptidnih veza ili nepeptidnih veza.
U reverznoj peptidnoj vezi, aminokiselinski ostaci nisu povezani peptidnim (-CO-NH-) vezama već je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzni peptidomimetici mogu biti napravljeni pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, na primer poput onih opisanih u radu Meziere et al (1997). Ovaj pristup obuhvata pravljenje pseudopeptida koji sadrže izmene koje uključuju kostur, a ne orijentaciju bočnih lanaca. Meziere i saradnici (1997) pokazuju da su ovi pseudopeptidi korisni za vezivanje MHC i T-pomoćničke ćelijske odgovore. Retro-inverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, mnogo su otporniji na proteolizu.
Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.
Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.
Nadalje, peptidi iz ove objave mogu biti sintetisani tako da se izmeni njihova prostorna konfiguracija. Na primer, može da se koristi D-izomer jednog ili više aminokiselinskih ostataka peptida, umesto uobičajenog L-izomera. Dodatno, najmanje jedan od aminokiselinskih ostataka peptida iz ove objave može da se supstituiše jednim od dobro poznatih aminokiselinskih ostataka koji se normalno ne javljaju u prirodi. Izmene poput ovih mogu služiti da se poveća stabilnost, bioraspoloživost i/ili vezivanje peptida iz ove objave.
Slično tome, peptid ili varijanta iz ove objave može da se modifikuje hemijski, reakcijom sa specifičnim aminokiselinama bilo pre ili nakon sinteze peptida. Primeri za takve modifikacije dobro su poznati u predmetnoj oblasti i sažeto predstavljeni, na primer, u radu R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3. izdanje, CRC Press, 2005. Hemijska modifikacija aminokiselina uključuje, ali nije i ograničeno na, modifikaciju pomoću acilacije, amidinacije, piridoksilacije lizina, redukcione alkilacije, trinitrobenzilacije amino grupa sa 2,4,6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS), amidne modifikacije karboksil grupa i sulfidrilne modifikacije pomoću oksidacije cisteina performinskom kiselinom do cisteinske kiseline, obrazovanja živinih derivata, obrazovanja mešovitih disulfida sa drugim tiolnim jedinjenjima, reakcije sa maleimidom, karboksimetilacije sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom i karbamilacije sa cijanatom u alkalnoj pH sredini, iako bez ograničenja na ovde navedeno. U ovom pogledu, osoba stručna u predmetnoj oblasti se upućuje na poglavlje 15 Trenutno važećih protokola u nauci o proteinima, urednici Coligan i sar. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) za opsežniju metodologiju u vezi sa hemijskim modifikacijama proteina.
Ukratko, modifikacija, na primer, arginilskih ostataka u proteinima često se bazira na reakciji vicinalnih dikarbonilnih jedinjenja kao što su fenilglioksal, 2,3-butandion i 1,2-cikloheksandion kako bi se obrazovao adukt. Drugi primer je reakcija metilglioksala sa argininskim ostacima. Cistein može da se modifikuje bez istovremene modifikacije drugih nukleofilnih mesta kao što su lizin i histidin. Kao rezultat, dostupan je veliki broj reagenasa za modifikaciju cisteina. Veb stranice kompanija kao što je Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) pružaju informacije o specifičnim reagensima.
Selektivna redukcija disulfidnih veza u proteinima je takođe uobičajena. Disulfidne veze mogu da se formiraju i oksidiraju u toku tretiranja biofarmaceutika toplotom. Woodward-ov reagens K može da se koristi za modifikaciju specifičnih ostataka glutaminske kiseline. N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilkarbodiimid može da se koristi za obrazovanje intramolekularnih unakrsnih veza između lizinskog ostatka i ostatka glutaminske kiseline. Na primer, dietilpirokarbonat je reagens za modifikaciju histidilskih ostataka u proteinima. Histidin može takođe da se modifikuje pomoću 4-hidroksi-2-nonenala. Reakcija lizinskih ostataka i drugih α-amino grupa je, na primer, korisna u vezivanju peptida za površine ili unakrsno povezivanje proteina/peptida. Lizin je mesto vezivanja poli(etilen)glikola i glavno mesto modifikacije u glikozilaciji proteina. Metioninski ostaci u proteinima mogu da se modifikuju pomoću npr. jodoacetamida, bromoetilamina i hloramina T.
Tetranitrometan i N-acetilimidazol mogu da se koriste za modifikaciju tirozilskih ostataka. Unakrsno povezivanje pomoću obrazovanja ditirozina može da se postigne vodonik peroksidom/jonima bakra.
U nedavnim studijama o modifikaciji triptofana korišćeni su N-bromosukcinimid, 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromid ili 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmerkapto)-3H-indol (BPNS-skatol).
4
Uspešna modifikacija terapeutskih proteina i peptida sa PEG je često udružena sa produžavanjem poluživota u cirkulaciji dok se unakrsno povezivanje proteina sa glutaraldehidom, polietilen glikol diakrilatom i formaldehidom koristi za pripremanje hidrogelova. Hemijska modifikacija alergena za imunoterapiju se često postiže karbamilacijom sa kalijum cijanatom.
Peptid ili varijanta, naznačeni time što je peptid modifikovan ili sadrži nepeptidne veze, poželjni su primer predstavljene objave. Uopšteno, peptidi i varijante (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmoc-poliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Solid-phase peptide synthesis under continuous-flow conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. May 1981; 78(5): 2791–2795) i referencama citiranim u istom. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih preformiranih simetričnih anhidridnih derivata sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog spajanja posredovane N, N-dicikloheksil-karbodiimid/1 hidroksibenzotriazolom. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (vidite, na primer, rad Bruckdorfer et al., 2004 i reference koje su tamo citirane).
Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).
Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.
Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.
Dalji aspekt objave obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid ili varijantu peptida iz ove objave. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt objave obezbeđuje vektor ekspresije koji je sposoban da eksprimira polipeptid u skladu sa ovom objavom.
Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli
4
rekombinantne DNK.
Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.
Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid objave koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu iz ove objave. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu iz ove objave može da se koristi u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida iz ove objave. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.
DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji sačinjava jedinjenje iz ove objave može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.
Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti
4
neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.
Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.
Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK iz ove objave se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.
Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.
Predmetna objava se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetne objave. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupan kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer,
4
udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.
Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, vidite, na primer, radove Cohen i sar. (1972) i Sambrook i sar. (1989). Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman i sar (1986). Metod koji je izložio Beggs (1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.
Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.
Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini iz ove objave korisne za pripremanje peptida iz ove objave, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida iz ove objave tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.
U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog raka prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
Dalji aspekt objave obezbeđuje metod za proizvodnju peptida ili njegove varijante, metod koji obuhvata kultiviranje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina
4
ili njenog medijuma za kultivaciju.
U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid ili njegova varijanta mogu biti pripremljeni za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).
Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.
Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.
Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Karre i sar. (Ljunggren and Karre.1985).
Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.
U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T
4
ćelije.
Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji je sposoban da eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 ili varijantu njegove aminokiselinske sekvence.
Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Piebanski i sar. (1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnoj objavi, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga, takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.
Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta i sar. (1994) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.
Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.
Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV 300.
Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.
In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).
T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Na taj način, objava takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz ove objave, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kako je definisano ranije.
Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije, ili da je gen neaktivan u tkivu iz kojeg je tumor nastao ali da je eksprimiran u tumoru. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran“ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.
T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.
1
Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u radovima: Gattinoni i sar. (2006) i Morgan i sar. (2006).
Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).
Poželjno, lek predmetnog pronalaska je vakcina. Ona se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (vidite u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (vidite na primer patent WO 95/18145). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.
U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 1 do ID BR. SEKV 300 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest,
2
četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.
U drugom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu navedenu u ID BR. SEKV: 1 do ID BR. SEKV: 300 i najmanje jedan dodatni peptid, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.
Polinukleotid može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Pascolo i sar. (2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.
Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.
U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.
Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, razblaživača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta od A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.
Predmetni pronalazak obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno HCC i drugih maligniteta.
Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:
(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;
(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i
(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.
Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (vii) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.
Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili
4
upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži(e) uputstva na posudi ili uz nju koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.
Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2–6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).
Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta, uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.
Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.
Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.
Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.
Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.
Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz HCC, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje HCC.
Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je specifično dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki HLA-A*02 i/ili HLA-A*24-pozitivan tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Za svaki od podskupova peptida specifičnih za dva alela HLA klase I (A*02 i A*24) ovo je nezavisno osigurano na osnovu osnovnih eksperimentalnih analiza. Tako, vakcina se lako može koristiti „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
Na slikama,
Na slici 1 je prikazana prekomerna prezentacija različitih peptida u normalnim tkivima (tamnosiva) i HCC (svetlosiva). Slika 1A) APOB, Peptid: ALVDTLKFV (A*02) (ID BR. SEKV: 7), tkiva sleva udesno; 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 4 jednjaka, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 16 bubrega, 4 uzoraka leukocita, 45 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 7 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 1 serozna membrana, 3 kože, 4 slezine, 7 želudaca, 1 testis, 2 timus, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 20 jetri; Slika 1B) ALDH1L1, Peptid: KLQAGTVFV (A*02) (ID BR. SEKV: 2), tkiva sleva udesno: 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 4 jednjaka, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 16 bubrega, 4 uzoraka leukocita, 45 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 7 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 1 serozna membrana, 3 kože, 4 slezine, 7 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 20 jetri; Slika 1C) C8B, Peptid: AYLLQPSQF (A*24) (ID BR. SEKV: 200), tkiva sleva udesno: uključujući 2 nadbubrežne žlezde, 1 arteriju, 4 mozga, 1 dojku, 5 kolona, 1 srce, 13 bubrega, 9 pluća, 3 pankreasa, 2 rektuma, 3 kože, 1 slezinu, 12 želudaca, 1 timus, 2 materice i 9 jetri; Slika 1D) RAD23B Peptid: KIDEKNFVV (ID BR. SEKV: 63) 1 serozna membrana, 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 12 bubrega, 4 leukocita, 19 jetri, 43 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 6 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 3 kože, 4 slezine, 5 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 4 jednjaka; Slika 1E) RAD23B Peptid: KIDEKNFVV (ID BR. SEKV: 63), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 5 ćelijskih linija, 1 normalno tkivo (1 nadbubrežna žlezda), 16 malignih tkiva (2 raka mozga, 4 raka jetre, 5 rakova pluća, 1 rak rektuma, 1 rak mokraćne bešike, 3 raka materice) (sleva udesno); Slika 1F) RFNG RLPPDTLLQQV (ID BR. SEKV: 92), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 1 serozna membrana, 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 12 bubrega, 4 leukocita, 19 jetri, 43 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 6 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 3 kože, 4 slezine, 5 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 4 jednjaka; Slika 1G) RFNG Peptid: RLPPDTLLQQV (ID BR. SEKV: 92), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 2 ćelijske linije, 2 normalna tkiva (2 nadbubrežne žlezde), 17 malignih tkiva (1 rak mozga, 1 rak dojke, 1 rak jednjaka, 5 rakova jetre, 4 raka pluća, 1 rak jajnika, 1 rak prostate, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice) (sleva udesno); Slika 1H) FLVCR1 Peptid: SVWFGPKEV (ID BR. SEKV: 104) 1 serozna membrana, 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 12 bubrega, 4 leukocita, 19 jetri, 43 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 6 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 3 kože, 4 slezine, 5 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 4 jednjaka; Slika 1I) FLVCR1 Peptid: SVWFGPKEV (ID BR. SEKV: 104), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 9 ćelijskih linija, 1 normalno tkivo (1 tanko crevo), 16 malignih tkiva (1 rak mozga, 1 rak dojke, 5 rakova jetre, 5 rakova pluća, 1 rak kože, 1 rak želuca, 1 rak mokraćne bešike, 1 rak materice) (sleva udesno); Slika 1J) IKBKAP Peptid: LLFPHPVNQV (ID BR. SEKV: 156) 1 serozna membrana, 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 12 bubrega, 4 leukocita, 19 jetri, 43 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 6 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 3 kože, 4 slezine, 5 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 4 jednjaka; Slika 1K) IKBKAP Peptid: LLFPHPVNQV (ID BR. SEKV: 156), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 7 ćelijskih linija, 2 primarne kulture, 1 normalno tkivo (1 kolon), 34 malignih tkiva (1 malignitet kostne srži, 1 rak dojke, 1 rak kolona, 2 raka jednjaka, 2 leukocitne leukemije, 4 raka jetre, 11 rakova pluća, 3 maligna tumora limfnih čvorova, 5 rakova jajnika, 4 raka mokraćne bešike) (sleva udesno); Slika 1L) NKD1 Peptid: FLDTPIAKV (ID BR. SEKV: 47) 1 serozna membrana, 1 adipozno tkivo, 3 nadbubrežne žlezde, 2 arterije, 2 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 13 kolona, 2 žučne kese, 3 GI trakta, 3 srca, 12 bubrega, 4 leukocita, 19 jetri, 43 pluća, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 6 pankreasa, 1 periferni nerv, 1 hipofiza, 3 pleure, 1 prostata, 6 rektuma, 3 skeletna mišića, 3 kože, 4 slezine, 5 želudaca, 1 testis, 2 timusa, 3 štitaste žlezde, 2 materice, 2 vene i 4 jednjaka; Slika 1M) NKD1 Peptid: FLDTPIAKV (ID BR. SEKV: 47), prikazani su samo uzorci na kojima je peptid prezentovan: 1 drugo oboljenje (encefalokela), 2 normalna tkiva (1 pluća, 1 slezina), 35 malignih tkiva (5 rakova mozga, 6 rakova kolona, 1 rak jednjaka, 6 rakova jetre, 9 rakova pluća, 1 rak jajnika, 1 rak prostate, 4 raka rektuma, 2 raka želuca) (sleva udesno).
Na slici 2 prikazani su primerni profili ekspresije (relativna ekspresija u poređenju sa normalnim bubregom) izvornih gena predmetnog pronalaska koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u HCC u panelu normalnih tkiva (tamnosiva) i 12 uzoraka HCC (siva). Slika 2A) APOB, tkiva sleva udesno: 1 nadbubrežna žlezda, 1 arterija, 1 kostna srž, 1 mozak (ceo), 1 dojka, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetra, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placenta, 1 prostata, 1 pljuvačna žlezda, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 1 mokraćna bešika, 1 grlić materice, 1 materica, 1 vena; Slika 2B) AMACR, tkiva sleva udesno: 1 nadbubrežna žlezda, 1 arterija, 1 kostna srž, 1 mozak (ceo), 1 dojka, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetra, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placenta, 1 prostata, 1 pljuvačna žlezda, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 1 mokraćna bešika, 1 grlić materice, 1 materica, 1 vena; Slika 2C) ALDH1L1, tkiva sleva udesno: 1 nadbubrežna žlezda, 1 arterija, 1 kostna srž, 1 mozak (ceo), 1 dojka, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetra, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placenta, 1 prostata, 1 pljuvačna žlezda, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 1 mokraćna bešika, 1 grlić materice, 1 materica, 1 vena; Slika 2D) FGG, tkiva sleva udesno: 1 nadbubrežna žlezda, 1 arterija, 1 kostna srž, 1 mozak (ceo), 1 dojka, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetra, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placenta, 1 prostata, 1 pljuvačna žlezda, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 1 mokraćna bešika, 1 grlić materice, 1 materica, 1 vena; Slika 2E) C8B, tkiva sleva udesno: 1 nadbubrežna žlezda, 1 arterija, 1 kostna srž, 1 mozak (ceo), 1 dojka, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetra, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placenta, 1 prostata, 1 pljuvačna žlezda, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 1 mokraćna bešika, 1 grlić materice, 1 materica, 1 vena; i Slika 2F) HSD17B6, tkiva sleva udesno: uključujući 1 nadbubrežnu žlezdu, 1 arteriju, 1 kostnu srž, 1 mozak (ceo), 1 dojku, 1 kolon, 1 jednjak, 1 srce, 3 bubrega, 1 uzorak leukocita, 1 jetru, 1 pluće, 1 limfni čvor, 1 jajnik, 1 pankreas, 1 placentu, 1 prostatu, 1 pljuvačnu žlezdu, 1 skeletni mišić, 1 kožu, 1 tanko crevo, 1 slezinu, 1 želudac, 1 testis, 1 timus, 1 štitastu žlezdu, 1 mokraćnu bešiku, 1 grlić materice, 1 matericu i 1 venu.
Na slici 3 prikazani su primerni rezultati protočne citometrije nakon peptid-specifičnog bojenja multimera. Za dalja objašnjenja vidite primer 4.
Na slici 4 prikazani su primerni rezultati protočne citometrije nakon peptid-specifičnog bojenja multimera. Za dalja objašnjenja vidite primer 4.
PRIMERI PRIMER 1: Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije
Uzorci tkiva
Tkiva tumora pacijenata dobijeni su od Universitätsklinik für Allgemeine, Viszeral- und Transplantationschirurgie, Tübingen, Nemačka; Istituto Nazionale Tumori "Pascale". Molecular Biology and Viral Oncology Unit, Via Mariano, Napulj, Italija; BioOptions Inc., Brea, CA, SAD; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SAD; Asterand Europe, Royston Herts, Ujedinjeno Kraljevstvo. Pre operacije su od svih pacijenata pribavljeni pisani informisani pristanci. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.
Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva
Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.
Analize masenom spektrometrijom
Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u orbitrap (R = 30000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona. Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.
Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al. 2007a). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću slabljenja naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja (Mueller et al.2007b; Sturm et al. 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke HCC sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva.
Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 1. Rezultati prezentacije za primerne peptide prikazani su u tabeli 4.
Tabela 4: Rezultati prezentacije. U tabeli su navedeni peptidi koji su veoma visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). S* = fosfoserin
1
PRIMER 2
Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju peptide objave
Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.
RNK izvori i priprema
Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (vidite primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.
Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva dobijena je komercijalno (Ambion, Huntingdon, UK; Clontech, Heidelberg, Nemačka; Stratagene, Amsterdam, Holandija; BioChain, Hayward, CA, SAD). RNK od nekoliko pojedinaca (između 2 i 123 osobe) izmešana je tako da je RNK od svakog pojedinca bila težinski podjednaka.
Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).
Eksperimenti na mikročipu
Analiza genske ekspresije svih uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću Affymetrix Human Genome (HG) U133A ili HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotidnih mikročipova (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD). Svi koraci su
2
izvršeni u skladu sa priručnikom za Affymetrix. Ukratko, sintetisana je dvolančana cDNK iz 5–8 µg ukupne RNK, primenom SuperScript RTII (Invitrogen) i oligo-dT-T7 prajmera (MWG Biotech, Ebersberg, Nemačka) kako je opisano u priručniku. In vitro transkripcija je izvršena sa kompletom BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SAD) za U133A čipove ili sa kompletom GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) za U133 Plus 2.0 čipove, nakon čega je sledila fragmentacija, hibridizacija i bojenje cRNK sa streptavidin-fikoeritrin i biotiniliranim anti-streptavidin antitelom (Molecular Probes, Leiden, Holandija). Slike su skenirane skenerom Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) ili Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), a podaci su analizirani pomoću GCOS softvera (Affymetrix), upotrebom podrazumevanih podešavanja za sve parametre. Za normalizaciju je korišćeno 100 konstitutivnih gena obezbeđenih od strane kompanije Affymetrix. Vrednosti relativne ekspresije izračunate su iz logaritamskih odnosa signala datih od strane softvera a normalni uzorak bubrega je arbitrarno podešen na 1,0. Primerni profili ekspresije izvornih gena predmetne objave koji su visoko prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u HCC prikazani su na slici 2. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 5.
Tabela 5: Rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena koji nisu povezani sa pronalaskom, a koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+).
4
PRIMER 3: Izmene liganada pod UV/vezivanje peptida za HLA-A*02 i HLA-A*24 Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama u skladu sa predmetnom objavom su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC proizvedeni su pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko i sar. (Rodenko et al., 2006).
MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2 ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*0201/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15-500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2 µg/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.
Tabela 6: Rezultati vezivanja MHC klase I
Vezivanje HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*02 ili HLA-A*24 u zavisnosti od peptidne sekvence klasifikovano je pomoću prinosa izmene peptida: ≥ 10% = ; ≥
PRIMER 4
In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide
Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti TUMAP predmetnog pronalaska, istraživači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigenprezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za 22 HLA-A*0201-restrikovanih TUMAP koji su do sada predstavljeni, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije.
In vitro priprema CD8+ T ćelija
Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih od Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.
PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina/100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Keln, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Hajdelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nirnberg, Nemačka).
Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.
Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).
pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-001 (peptid ELAGIGILTV iz modifikovanog Melan-A/MART-1), odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5).
800.000 perli / 200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od medijane stimulacija negativne kontrole).
In vitro imunogenost za HCC peptide
Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon TUMAP-specifičnog bojenja multimera za tri peptida pronalaska prikazani su na slici 3 i slici 4 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama.
Primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*02+ donora (slika 3)
CD8+ T ćelije su pripremljene primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom IMA-APOB-002 (ID br. sekv.7) (A, desni panel) ili IMA-APOB-003 (B, desni panel, ID br. sekv. 1) odnosno IMA-ALDH1L1-001 (C, desni panel, ID br. sekv. 2). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ APOB-002 (A) ili A*02/ APOB-003 (B), ili A*02/ALDH1 L1-001. Levi paneli (A, B, C) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.
Primerni rezultati peptid-specifičnih in vitro CD8+ T-ćelijskih odgovora zdravog HLA-A*24+ donora (slika 4)
CD8+ T ćelije su pripremljene primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*24 u kompleksu sa peptidom IMA-KLHL24-001 (ID br. sekv. 190) (A, desni panel) odnosno IMA-APOB-006 (B, desni panel, ID br. sekv.218). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*24/ KLHL24-001 (A) ili A*24/ APOB-006 (B). Levi paneli (A i B) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*24/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.
Primer 5: Sinteze peptida
Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama > 50%. Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.
Lista referenci
Adler, A. S. et al., Genes Dev. 28 (2014)
Ahn, Y. H. et al., J Proteomics.106 (2014)
Akiyama, H. et al., Oncol Rep. 21 (2009)
Alam, S. M. et al., Endocr.Relat Cancer 16 (2009)
Aleman, G. et al., Am J Physiol Endocrinol.Metab 289 (2005)
Alexanian, A. et al., Cancer Genomics Proteomics.9 (2012)
Altenhofer, S. et al., J Biol.Chem.285 (2010)
Alvarez, C. et al., J Biol.Chem.276 (2001)
Ammerpohl, O. et al., Int.J Cancer 130 (2012)
Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012)
Arai, E. et al., Carcinogenesis 33 (2012)
Araki, T. et al., J Biol.Chem.286 (2011)
Arlt, A. et al., Oncogene 28 (2009)
Arndt, S. et al., Oncol Rep.18 (2007)
Arner, E. S. et al., Eur.J Biochem.267 (2000)
Atienza, J. M. et al., Mol Cancer Ther 4 (2005)
Avery-Kiejda, K. A. et al., BMC.Cancer 14 (2014)
Bachmann, S. B. et al., Mol Cancer 13 (2014)
Balogh, K. et al., Oncogene 31 (2012)
Bani, M. R. et al., Mol Cancer Ther 3 (2004) Bansal, N. et al., PLoS.One. 6 (2011)
Barbarulo, A. et al., Oncogene 32 (2013)
Bell, J. C. et al., Drug Metab Dispos.40 (2012) Ben-Izhak, O. et al., Histopathology 41 (2002) Bergada, L. et al., Lab Invest 94 (2014)
Bergeron, M. J. et al., Mol Aspects Med.34 (2013) Bhattacharya, C. et al., Mol Cancer 11 (2012) Bhogaraju, S. et al., Science 341 (2013)
Bidkhori, G. et al., PLoS.One.8 (2013)
Bieche, I. et al., Breast Cancer Res 6 (2004) Biswas, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1832 (2013) Blanke, K. L. et al., Cancer Causes Control 25 (2014) Bodine, S. C. et al., Science 294 (2001) Boehringer, J. et al., Biochem.J 448 (2012) Bojjireddy, N. et al., J Cell Sci. (2014)
Booth, D. G. et al., EMBO J 30 (2011)
Bouquet, C. et al., Mol Ther 14 (2006)
Boylan, K. L. et al., Proteome.Sci. 8 (2010) Braumuller, H. et al., Nature (2013)
Brockmoller, S. F. et al., J Proteome.Res 11 (2012) Buch, S. C. et al., Mol Carcinog.51 Suppl 1 (2012) Bull, C. et al., Cancer Res 74 (2014)
Burrell, R. A. et al., Nature 494 (2013)
Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006) Butterfield, L. H. et al., Clin.Cancer Res.9 (2003) Byrne, A. et al., Exp.Cell Res 316 (2010)
1 Cadenas, C. et al., Cell Cycle 13 (2014)
Cadoret, A. et al., Oncogene 21 (2002)
Cao, H. et al., Biochemistry 41 (2002)
Cao, Y. et al., Cancer Research 61 (2001)
Cao-Ehlker, X. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)
Carroll, M. et al., J Interferon Cytokine Res 33 (2013) Carrouel, F. et al., J Dent.Res 87 (2008)
Castro, M. et al., J Transl.Med.8 (2010)
Chae, Y. S. et al., Med.Oncol 28 (2011)
Chang, L. O. et al., Cancer Res 33 (1973)
Chang, Y. S. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 59 (2007) Chapiro, J. et al., Radiol.Med. 119 (2014) Charbonneau, B. et al., Am J Hematol. 87 (2012) Chatterjee, M. et al., Haematologica 98 (2013)
Chen, J. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.420 (2012a) Chen, M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 108 (2011a) Chen, R. et al., World J Gastroenterol.17 (2011b) Chen, X. et al., J Dig.Dis.12 (2011c)
Chen, X. Q. et al., Med.Oncol 29 (2012b)
Cheng, L. et al., Genomics 102 (2013)
Choi, Y. W. et al., Int.J Gynecol.Cancer 17 (2007) Christa, L. et al., Gastroenterology 106 (1994)
Clark, A. G. et al., Cytoskeleton (Hoboken.) 69 (2012) Claro da, Silva T. et al., Mol.Aspects Med.34 (2013) Cohen, L. et al., Nature 395 (1998)
Collins, C. L. et al., Surgery 122 (1997)
Com, E. et al., J Proteomics.75 (2012)
2
Copps, K. D. et al., Diabetologia 55 (2012)
Cornen, S. et al., PLoS.ONE.9 (2014)
Cornez, I. et al., Biochem.Pharmacol. 75 (2008)
Cowling, V. H., Oncogene 29 (2010)
Cui, T. et al., Int.J Oncol 39 (2011)
da Silva, M. G. et al., Exp.Clin Cardiol.17 (2012)
Dadkhah, E. et al., Arch.Iran Med. 16 (2013)
Darmanis, S. et al., PLoS.One.8 (2013)
Darvekar, S. et al., Biochem.J 442 (2012)
Darvekar, S. R. et al., PLoS.One. 9 (2014)
Datta, K. et al., J Biol.Chem. 284 (2009)
David, S. et al., Front Biosci.(Elite.Ed) 5 (2013)
de Almagro, M. C. et al., Biochem.Pharmacol. 81 (2011) de Groot, J. F. et al., Cancer Res 65 (2005)
Deb, S. et al., Br.J Cancer 110 (2014)
Debauve, G. et al., Cell Mol Life Sci.65 (2008)
Decker, T. et al., J Clin Invest 109 (2002)
Decock, A. et al., Genome Biol.13 (2012)
Del Campo, E. M. et al., Mol Phylogenet.Evol. 66 (2013) Delaval, B. et al., J Cell Biol.188 (2010)
Deng, X. D. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014)
Di, Gregorio E. et al., J Med.Genet. 50 (2013)
Diggle, C. P. et al., PLoS.Genet. 10 (2014)
Dimitrov, A. et al., Hum.Mol Genet.18 (2009)
Dmitriev, O. Y., Biochem.Cell Biol. 89 (2011)
Doherty, J. A. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.20 (2011) Dong, Z. et al., Crit Rev.Oncol Hematol. 59 (2006)
Dou, R. et al., Cancer Lett.336 (2013)
Drazkowska, K. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013)
Edavana, V. K. et al., Drug Metab Dispos.41 (2013) Edwards, P. A. et al., Breast Cancer Res 14 (2012)
Elvenes, J. et al., PLoS.One. 6 (2011)
Emaduddin, M. et al., Cell Commun.Signal. 6 (2008)
Enguita-German, M. et al., World J Hepatol. 6 (2014) Epelbaum, R. et al., Pathol.Oncol Res 4 (1998)
Fan, T. W. et al., Mol Cancer 8 (2009)
Fang, Z. Q. et al., Genet.Mol Res 12 (2013)
Fassas, A. B. et al., Leuk.Lymphoma 45 (2004)
Feferman, L. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis. 16 (2013) Fei, F. et al., J Cancer Res Clin Oncol (2014a)
Fei, F. et al., Ann Surg.Oncol 21 (2014b)
Feigelson, H. S. et al., Breast Cancer Res 10 (2008)
Feng, L. et al., Cell Biochem.Funct.29 (2011)
Feng, M. et al., J Clin Invest 124 (2014a)
Feng, S. et al., Int.J Biol.Sci.9 (2013)
Feng, Y. et al., J Biol.Chem.289 (2014b)
Feng, Y. et al., Free Radic.Res 46 (2012)
Fernandes, C. F. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.361 (2007) Ferre, S. et al., J Am Soc Nephrol. 25 (2014)
Ferrer-Ferrer, M. et al., Arch.Med.Res 44 (2013)
Filmus, J. et al., FEBS J 280 (2013)
Fiorito, V. et al., Biochim.Biophys.Acta 1839 (2014)
Fojo, A. T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84 (1987) Fonseca, A. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012)
4
Fossdal, G. et al., ScientificWorldJournal.2012 (2012) Fournier, T. et al., Biochim.Biophys.Acta 1482 (2000) Fu, W. et al., J Cell Sci.123 (2010)
Fujitomo, T. et al., Cancer Res 72 (2012)
Furukawa, T. et al., Sci.Rep.1 (2011)
Furutani, M. et al., Hepatology 24 (1996)
Gadd, S. et al., Lab Invest 90 (2010)
Gailani, D., Trends Cardiovasc.Med. 10 (2000) Galamb, O. et al., Helicobacter. 13 (2008)
Galazis, N. et al., Gynecol.Endocrinol. 29 (2013) Gandhi, A. V. et al., Ann Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013) Gao, L. et al., Mol Oncol 6 (2012)
Garcia-Baquero, R. et al., Tumour.Biol.35 (2014) Gardner-Stephen, D. A. et al., Drug Metab Dispos.35 (2007) Garg, M. et al., Cancer 116 (2010a)
Garg, M. et al., Eur.J Cancer 46 (2010b)
Gburcik, V. et al., Mol Cell Biol. 25 (2005)
Gergely, F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97 (2000) Gervasini, G. et al., Cancer 107 (2006)
Getty, A. L. et al., Cell Mol Life Sci.68 (2011)
Gilabert, M. et al., J Cell Physiol 228 (2013)
Gilkes, D. M. et al., Mol Cancer Res 11 (2013) Giovannetti, E. et al., J Natl.Cancer Inst.106 (2014) Gokmen-Polar, Y. et al., Mod.Pathol. (2014)
Goldstein, I. et al., Carcinogenesis 34 (2013)
Gong, Y. et al., Genet.Mol Res 12 (2013)
Goode, E. L. et al., Clin Cancer Res 16 (2010)
Gordon, E. M. et al., Am.J Pediatr.Hematol.Oncol 15 (1993) Gotzmann, J. et al., Crit Rev.Eukaryot.Gene Expr.9 (1999) Gray, L. R. et al., Cell Mol Life Sci.71 (2014)
Gregory, P. A. et al., J Biol.Chem. 278 (2003)
Greif, P. A. et al., Leukemia 25 (2011)
Gu, W. et al., PLoS.One.7 (2012)
Guo, L. et al., Cancer Sci.103 (2012)
Halon, A. et al., Arch.Gynecol.Obstet. 287 (2013) Hamamoto, R. et al., Cancer Sci.97 (2006)
Hamilton, S. R. et al., Glycobiology 15 (2005)
Hamm, A. et al., BMC.Cancer 8 (2008)
Hanioka, N. et al., Basic Clin Pharmacol.Toxicol.110 (2012) Harris, M. et al., Pharmacogenet.Genomics 24 (2014) Hatakeyama, H. et al., Proteomics.6 (2006)
Havens, M. A. et al., PLoS.Genet. 10 (2014)
He, P. et al., Hum.Pathol.35 (2004)
He, X. et al., Neoplasma 61 (2014a)
He, Y. et al., Mol Carcinog. (2014b)
Hellwinkel, O. J. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis.14 (2011) Hemmingsson, O. et al., Oncol Rep. 22 (2009)
Hidalgo-Curtis, C. et al., Br.J Haematol. 148 (2010) Hider, J. L. et al., BMC.Evol.Biol. 13 (2013)
Hinsch, N. et al., BMC.Cancer 9 (2009)
Hirota, Y. et al., Nucleic Acids Res 28 (2000)
Hlavata, I. et al., Mutagenesis 27 (2012)
Hoelz, D. J. et al., Proteomics. 6 (2006)
Holden, H. M. et al., Cell Mol Life Sci. 61 (2004)
Honda, K. et al., PLoS.One. 7 (2012)
Hong, Y. et al., J Biol.Chem. 274 (1999)
Hood, F. E. et al., Bioarchitecture. 1 (2011)
Hood, F. E. et al., J Cell Biol. 202 (2013)
Hopfer, O. et al., Br.J Cancer 93 (2005)
Horani, A. et al., Am J Hum.Genet.91 (2012)
Hou, M. et al., Int.J Mol Med.33 (2014)
Hu, D. G. et al., Drug Metab Rev. 46 (2014)
Hua, D. et al., Int.J Mol Med.30 (2012a)
Hua, T. et al., J Biol.Chem.287 (2012b)
Huang, O. et al., Jpn.J Clin Oncol 43 (2013)
Huang, S. et al., Oncogene 21 (2002)
Huang, Y. et al., Oncotarget. 5 (2014)
Hughes, H. et al., J Cell Sci.123 (2010)
Hunecke, D. et al., J Pathol.228 (2012)
Huopaniemi, L. et al., Glycobiology 14 (2004)
Hyung, S. W. et al., Mol Cell Proteomics. 10 (2011) Iannitti, T. et al., Mar.Drugs 8 (2010)
Ichida, K. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.282 (2001) Ignatova, I. D. et al., Am J Physiol Endocrinol.Metab 296 (2009) Ikeda, R. et al., Int.J Oncol 38 (2011)
Inuzuka, M. et al., J Biol.Chem.280 (2005)
Ishiguro, H. et al., Oncogene 21 (2002)
Ishizaki, F. et al., Sci.Rep.3 (2013)
Ivashchenko, A. T. et al., Biomed.Res Int.2013 (2013) Jacquemier, J. et al., Cancer Res 65 (2005)
Jacques, C. et al., Br.J Cancer 101 (2009)
Jaffe, E. K. et al., Arch.Biochem.Biophys. 530 (2013) Jakobsson, A. et al., Prog.Lipid Res 45 (2006) Jamroziak, K. et al., Eur.J Haematol. 72 (2004) Jeung, H. C. et al., Oncologist.12 (2007)
Jia, Y. et al., Br.J Cancer 110 (2014)
Jiang, J. G. et al., Cancer Res 65 (2005)
Jiang, X. et al., Histol.Histopathol. 25 (2010)
Jiang, X. et al., Mol Carcinog. (2014)
Jin, Z. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014) Jockusch, H. et al., Proteomics.14 (2014)
Johnson, M. A. et al., Ann N.Y.Acad.Sci.1012 (2004) Jose-Eneriz, E. S. et al., Br.J Haematol.142 (2008) Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987) Jung, H. J. et al., J Mol Med.(Berl) 91 (2013)
Kaira, K. et al., Hepatobiliary.Pancreat.Dis.Int. 13 (2014) Kalsotra, A. et al., Toxicol.Appl.Pharmacol. 199 (2004) Kalthoff, S. et al., J Biol.Chem.285 (2010) Kamiyama, S. et al., Glycobiology 21 (2011) Kamiyama, S. et al., J Biol.Chem. 281 (2006)
Kandil, D. H. et al., Adv.Anat.Pathol. 16 (2009) Kandimalla, R. et al., Nat Rev.Urol.10 (2013) Karvonen, U. et al., J Mol Biol. 382 (2008)
Kelleher, D. J. et al., Glycobiology 16 (2006)
Khan, A. P. et al., Neoplasia. 15 (2013)
Kim, Y. et al., Hum.Pathol.46 (2015)
Kim, Y. W. et al., PLoS.One.7 (2012)
Klein, C. J. et al., Neurology 82 (2014)
Kobayashi, T. et al., Biochem.J 400 (2006) Kollmann, K. et al., Cancer Cell 24 (2013)
Komatsu, M. et al., Pharmacol.Res 66 (2012)
Kong, S. Y. et al., Cancer Sci. 99 (2008)
Kovacevic, Z. et al., Biochim.Biophys.Acta 1783 (2008) Kracmarova, A. et al., Leuk.Lymphoma 49 (2008) Kraemer, N. et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011) Kress, T. R. et al., Mol Cell 41 (2011)
Krohn, A. et al., J Pathol.231 (2013)
Krupenko, S. A. et al., Cell Growth Differ.13 (2002) Kubota, H. et al., Cell Stress.Chaperones.15 (2010) Kummel, D. et al., EMBO Rep.6 (2005)
Kunutsor, S. K. et al., Int.J Cancer (2014) Kuriyama, H. et al., Gene 253 (2000)
Laezza, F. et al., Mol Cell Neurosci.34 (2007) Lahiri, S. et al., PLoS.Biol.12 (2014)
Lando, M. et al., J Pathol. 230 (2013)
Lapucci, A. et al., FASEB J 24 (2010)
Lascorz, J. et al., BMC.Med.Genet. 13 (2012) Lauffart, B. et al., BMC.Womens Health 5 (2005) Laverdiere, I. et al., Endocr.Relat Cancer (2014) Leasure, C. D. et al., Plant Physiol 150 (2009)
Lee, C. H. et al., Hum.Reprod. 24 (2009)
Lee, K. W. et al., J Biol.Chem.288 (2013)
Lee, S. J. et al., Toxicol.Lett. (2014)
Lee, W. C. et al., J Immunother.28 (2005)
Lee, Y. C. et al., Int.J Cancer 122 (2008)
Lekva, T. et al., PLoS.One. 8 (2013)
LeRoy, P. J. et al., Cancer Res 67 (2007)
Leung, T. et al., Breast Cancer Res 15 (2013) Levenson, V. V. et al., Somat.Cell Mol Genet.25 (1999) Levi, S. et al., Front Pharmacol. 5 (2014)
Li, D. et al., Protein Cell 5 (2014a)
Li, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.455 (2014) Li, X. et al., Med.Oncol 31 (2014b)
Li, Y. et al., Mol Cell Biol.29 (2009)
Li, Y. H. et al., World J Gastroenterol.18 (2012) Liang, J. et al., PLoS.One.3 (2008)
Lillig, C. H. et al., Antioxid.Redox.Signal. 9 (2007) Lin, C. H. et al., J Cell Biol.189 (2010)
Lin, M. C. et al., Oral Oncol 50 (2014)
Lin, S. H. et al., Oncogene 23 (2004)
Lin, Z. et al., Cell Rep.5 (2013)
Linderoth, J. et al., Br.J Haematol. 141 (2008)
Line, A. et al., Cancer Immunol Immunother.51 (2002) Ling, C. et al., EMBO J 26 (2007)
Linge, A. et al., J Proteome.Res 13 (2014)
Lioutas, A. et al., EMBO Rep.14 (2013)
Liu, C. et al., Nat Med.20 (2014)
Liu, C. et al., J Natl.Cancer Inst.105 (2013a)
Liu, H. et al., Carcinogenesis 34 (2013b)
Liu, T. W. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 106 (2009a) Liu, W. et al., J Biol.Chem.279 (2004)
Liu, Y. et al., Curr.Drug Targets.13 (2012)
Liu, Y. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.18 (2009b) Liu, Y. et al., Oncol Rep.18 (2007)
Ljungberg, B., Curr.Opin.Urol.17 (2007)
Llovet, J. M. et al., N.Engl.J Med. 359 (2008)
Lo Re, A. E. et al., J Biol.Chem. 287 (2012)
Lo, W. Y. et al., J Proteome.Res 6 (2007)
Lombardo, Y. et al., Breast Cancer Res 16 (2014)
Lourenco, G. J. et al., Breast Cancer Res Treat.100 (2006) Lovelace, L. L. et al., J Biol.Chem. 286 (2011)
Lung, H. L. et al., Int J Cancer 127 (2010)
Lutcke, H., Eur.J Biochem.228 (1995)
Ma, X. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003) Mackiewicz, A. et al., Glycoconj.J 12 (1995)
Mahajan, K. et al., Cancer Lett. 338 (2013)
Mamtani, M. et al., BMC.Res Notes 5 (2012)
Mariani, L. et al., Clin Cancer Res 7 (2001)
Marina, M. et al., Front Biosci.(Landmark.Ed) 19 (2014) Markiewski, M. M. et al., Nat Immunol 9 (2008)
Martin, T. A. et al., Eur.J Cancer 40 (2004)
Martinez, H. D. et al., Genes Cancer 2 (2011)
Mathison, J. et al., Pathobiology 59 (1991)
Matsubara, J. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.20 (2011) Matusiak, D. et al., J Histochem.Cytochem. 55 (2007) McGuire, T. A., Md Med.J 40 (1991)
Medjkane, S. et al., Cell Cycle 11 (2012)
Meijers, J. C. et al., Br.J Haematol. 108 (2000)
Mercer, C. A. et al., Autophagy. 5 (2009)
1
Mercurio, F. A. et al., Biochemistry 51 (2012) Midorikawa, Y. et al., Jpn.J Cancer Res.93 (2002) Miled, C. et al., Cancer Res 65 (2005)
Milkereit, P. et al., J Biol.Chem.278 (2003)
Miller, J. C. et al., Mol Carcinog.48 (2009) Mohelnikova-Duchonova, B. et al., Pancreas 42 (2013) Monaco, M. E. et al., Transl.Oncol 3 (2010)
Morandi, F. et al., PLoS.One.7 (2012)
Morrissey, J. J. et al., Urology 83 (2014)
Mu, J. et al., J Biol.Chem.272 (1997)
Murray, D. W. et al., Br.J Cancer 110 (2014)
Murray, J. I. et al., Mol Biol.Cell 15 (2004)
Murrin, L. C. et al., J Neuroimmune.Pharmacol.2 (2007) Murthy, K. G. et al., Genes Dev.9 (1995)
Mydlikova, Z. et al., Neoplasma 57 (2010)
Narita, T. et al., Mol Cell Biol. 23 (2003)
Narjoz, C. et al., PLoS.One. 9 (2014)
Nelson, E. R. et al., Science 342 (2013)
Ngeow, J. et al., Cancer Discov.4 (2014)
Nibbe, R. K. et al., Mol.Cell Proteomics.8 (2009) Nielsen, M. J. et al., Blood 108 (2006)
Noda, T. et al., Hepatology 55 (2012)
Noh, C. K. et al., Clin Biochem.47 (2014)
Ntikoudi, E. et al., Cancer Treat.Rev. 40 (2014) Nwosu, V. et al., Hum.Mol Genet.10 (2001)
Obholz, K. L. et al., Dev.Biol. 298 (2006)
Oeffner, F. et al., Am J Hum.Genet.84 (2009)
2
Ofman, R. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.281 (2001) Ohshima, K. et al., Mol Biol.Evol. 27 (2010)
Oiso, S. et al., Oncol Rep.31 (2014)
Oji, Y. et al., Int.J Oncol 44 (2014)
Osada, H. et al., Int.J Cancer 112 (2004)
Otero-Rey, E. M. et al., Oral Oncol 44 (2008)
Palmer, D. H. et al., Hepatology 49 (2009)
Panico, F. et al., Adv.Cancer Res 105 (2009)
Park, B. L. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.363 (2007) Patel, M. R. et al., Laryngoscope 121 (2011)
Patel, S. A. et al., Br.J Cancer (2014)
Pattani, K. M. et al., PLoS.ONE.7 (2012)
Pavelec, D. M. et al., Genetics 183 (2009)
Pawlowska, M. et al., Drug Metab Dispos.41 (2013) Pehlivan, D. et al., Eur.J Hum.Genet.22 (2014)
Pei, Z. et al., PLoS.One.8 (2013)
Pellanda, H. et al., Int.J Biochem.Cell Biol.44 (2012)
Peng, R. et al., J Cell Biol. 157 (2002)
Perera, S. et al., J Muscle Res Cell Motil.33 (2012)
Persaud-Sawin, D. A. et al., Hum.Mol Genet.11 (2002) Peters, D. G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.14 (2005) Pizon, V. et al., J Cell Sci. 115 (2002)
Placke, T. et al., Blood 124 (2014)
Plebani, R. et al., Neoplasia. 14 (2012)
Poh, W. et al., Mol Cancer 11 (2012)
Porkka, K. P. et al., Genes Chromosomes.Cancer 39 (2004) Pylypenko, O. et al., Mol Cell 11 (2003)
Qi, L. et al., Cancer Res 74 (2014)
Qin, Y. et al., Pigment Cell Melanoma Res 26 (2013) Quayle, S. N. et al., Neuro Oncol 14 (2012)
Quek, H. H. et al., DNA Cell Biol. 16 (1997)
Quidville, V. et al., Cancer Res 73 (2013)
Rajadhyaksha, A. M. et al., Am.J Hum.Genet.87 (2010) Rajasekaran, A. K. et al., Nucleic Acids Res 23 (1995) Rajendran, M. et al., Cancer Metastasis Rev.29 (2010) Rakheja, D. et al., Mol Genet.Metab 93 (2008)
Ramana, C. V. et al., EMBO J 19 (2000)
Rashad, N. M. et al., Cytokine 68 (2014)
Rath, N. et al., EMBO Rep.13 (2012)
Recupero, D. et al., Rom.J Morphol.Embryol. 51 (2010) Reinisch, W. et al., J Immunother.25 (2002)
Rekdal, C. et al., J Biol.Chem. 275 (2000)
Ren, Y. G. et al., Mol Biol.Cell 15 (2004)
Rennoll, S. A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.443 (2014) Rifas, L. et al., Arthritis Rheum.60 (2009)
Riihila, P. M. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014) Rodriguez, F. J. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol. 67 (2008) Rogov, V. et al., Mol Cell 53 (2014)
Romanuik, T. L. et al., BMC.Genomics 10 (2009) Roodman, G. D., Ann N.Y.Acad.Sci. 1192 (2010)
Rosado, I. V. et al., RNA. 10 (2004)
Rose, A. E. et al., Cancer Res 71 (2011)
Ross, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med.136 (2012)
Rossi, M. R. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 161 (2005)
4
Rotondo, R. et al., Int.J Cancer 125 (2009)
Rucksaken, R. et al., Cancer Biomark. 12 (2012)
Ruiz, F. X. et al., Biochem.J 440 (2011)
Ruiz, F. X. et al., Front Pharmacol.3 (2012)
Rutkowski, M. J. et al., Mol Cancer Res 8 (2010) Rylova, S. N. et al., Cancer Res 62 (2002)
Sahm, F. et al., Cancer Res 73 (2013)
Sahu, A. et al., Immunol Res 17 (1998)
Saito, T. et al., J Biol.Chem. 278 (2003)
Salahshor, S. et al., J Clin Pathol. 58 (2005)
Sang, W. et al., Zhonghua Bing.Li Xue.Za Zhi.42 (2013) Sangro, B. et al., J Clin Oncol 22 (2004)
Sanz, L. et al., Mol Cell Biol. 15 (1995)
Saponaro, C. et al., Cancer Biomark.14 (2014)
Sarajlic, A. et al., Breast Cancer Res Treat.143 (2014) Sasahira, T. et al., Eur.J Cancer 50 (2014)
Schneider, E. et al., Clin Chim.Acta 374 (2006) Schofield, A. V. et al., Crit Rev.Biochem.Mol Biol.48 (2013) Schulz, E. G. et al., Immunity.30 (2009)
Seifert, M. et al., J Pathol.205 (2005)
Senchenko, V. et al., Oncogene 22 (2003) Shaughnessy, J. D., Jr. et al., Blood 118 (2011)
Shen, F. et al., J Cell Biochem.112 (2011)
Shi, M. et al., World J Gastroenterol.10 (2004a)
Shi, Y. et al., Exp.Cell Res 296 (2004b)
Shi, Z. Z. et al., Clin Transl.Oncol 16 (2014)
Shinji, S. et al., Oncol Rep.15 (2006)
Shodeinde, A. et al., J Mol Biochem.2 (2013)
Shubbar, E. et al., BMC.Cancer 13 (2013)
Shurbaji, M. S. et al., Am J Clin Pathol.96 (1991)
Sillars-Hardebol, A. H. et al., Gut 61 (2012)
Singh, S. et al., Tumour.Biol. (2014)
Smith, P. et al., Clin Cancer Res 13 (2007)
Song, C. et al., J Biol.Chem. 288 (2013)
Srivenugopal, K. S. et al., Cancer Lett.117 (1997)
Staal-van den Brekel AJ et al., Br.J Cancer 76 (1997)
Steen, H. C. et al., J Interferon Cytokine Res.32 (2012) Stefanska, B. et al., Clin Cancer Res 20 (2014)
Strassburg, C. P. et al., J Biol.Chem. 273 (1998)
Strassburg, C. P. et al., Mol Pharmacol. 52 (1997)
Sudo, H. et al., Genomics 95 (2010)
Sugihara, T. et al., J Biol.Chem. 276 (2001)
Sun, C. et al., Pathol.Res Pract.210 (2014)
Sun, X. et al., J Pathol.226 (2012)
Sun, X. et al., Protein Cell 4 (2013)
Sun, X. J. et al., Zhonghua Yi.Xue.Yi.Chuan Xue.Za Zhi.22 (2005) Supernat, A. et al., Oncol Lett.4 (2012)
Surmacz, E., J Mammary.Gland.Biol.Neoplasia. 18 (2013) Suzuki, K. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.368 (2008) Swallow, C. J. et al., Oncogene 24 (2005)
Tabuchi, K. et al., J Neurosci. 22 (2002)
Taguchi, O. et al., Clin Chim.Acta 244 (1996)
Takayama, T. et al., Cancer 68 (1991)
Takayama, T. et al., Lancet 356 (2000)
Takeda, Y. et al., Glycobiology 24 (2014)
Takemasa, I. et al., Int.J Oncol 40 (2012)
Takeuchi, A. et al., Mol Cell Endocrinol. 384 (2014)
Tan, L. Z. et al., Am J Pathol.183 (2013)
Tan, M. K. et al., Mol Cell Biol. 31 (2011)
Tanahashi, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.243 (1998) Tanaka, M. et al., Mol Med.Rep. 7 (2013)
Tang, L. et al., Arch.Med.Res 43 (2012)
Tang, X. H. et al., Annu.Rev.Pathol. 6 (2011)
Tao, J. et al., Sci.Transl.Med. 3 (2011)
Tao, R. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.341 (2006) Tao, T. et al., Cell Res 23 (2013)
Tarao, K. et al., Cancer 86 (1999)
Tarao, K. et al., Cancer 79 (1997)
Tasker, P. N. et al., Osteoporos.Int. 17 (2006)
Telikicherla, D. et al., Clin Proteomics. 9 (2012)
Tian, T. et al., Eur.J Cancer 48 (2012)
Tian, Y. et al., BMC.Cancer 14 (2014)
Tomiyama, K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 107 (2010) Tomoda, T. et al., J Gastroenterol.Hepatol.27 (2012) Tong, J. et al., PLoS.One. 8 (2013)
Tortorella, S. et al., J Membr.Biol. 247 (2014)
Tran, E. et al., Science 344 (2014)
Trougakos, I. P., Gerontology 59 (2013)
Tsai, H. Y. et al., Oncogene 32 (2013)
Uddin, S. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 4 (2011)
Uehara, Y. et al., Cancer Res 43 (1983)
Urig, S. et al., Semin.Cancer Biol. 16 (2006)
Vainio, P. et al., Am.J Pathol. 178 (2011)
van der Spek, P. J. et al., Genomics 31 (1996)
van Zuylen, W. J. et al., PLoS.Pathog. 8 (2012)
van, den Broek, I et al., Proteomics.Clin Appl.4 (2010) van, Duin M. et al., Haematologica 96 (2011) Vejda, S. et al., Mol Cell Proteomics.1 (2002) Vincent, F. et al., Cancer Res 69 (2009)
Wang, B. S. et al., Cell Stress.Chaperones. 18 (2013a) Wang, D. et al., J Biol.Chem.277 (2002)
Wang, J. et al., Eur.J Cancer Prev.22 (2013b) Wang, J. et al., J Clin Invest 112 (2003)
Wang, J. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 6 (2013c) Wang, J. C. et al., Oncology 81 (2011)
Wang, M. et al., Chin J Physiol 55 (2012)
Wang, S. K. et al., PLoS.Genet.9 (2013d)
Wang, S. S. et al., PLoS.One.5 (2010)
Wang, X. et al., Urol.Int.92 (2014)
Wang, Y. et al., J Biol.Chem.274 (1999)
Wang, Y. et al., Med.Oncol 32 (2015)
Wazir, U. et al., Cell Mol Biol.Lett.18 (2013)
Wazir, U. et al., Anticancer Res 32 (2012)
Weiss, J. et al., Int.J Antimicrob.Agents 41 (2013) Welsh, M. M. et al., Carcinogenesis 29 (2008) Wieser, R., Leuk.Lymphoma 43 (2002)
Wilhelm, S. M. et al., Cancer Res.64 (2004) Williams, A. L. et al., Nature 506 (2014)
Witte, I. et al., Cell Death.Dis.2 (2011)
Wong, K. K. et al., Leukemia 28 (2014)
Wong, N. et al., J Hepatol.38 (2003)
Wu, L. et al., Ann Hematol.91 (2012)
Wu, N. et al., Int.J Mol Sci.14 (2013a)
Wu, W. et al., Sci.China Life Sci.56 (2013b)
Wu, X. et al., Am.J Clin Exp.Urol.2 (2014)
Wu, Y. M. et al., Cancer Res 71 (2011)
Xiao, J. et al., J Biol.Chem. 276 (2001)
Xie, F. W. et al., Neoplasma 61 (2014)
Xu, H. et al., Cell Rep.9 (2014)
Xu, X. et al., Proteomics.10 (2010)
Yan, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001)
Yang, C. et al., Virchows Arch.463 (2013)
Yang, C. Y. et al., J Immunol 192 (2014a)
Yang, H. et al., Oncol Rep. 24 (2010)
Yang, H. W. et al., Oncogene 0 (2014b)
Yang, R. et al., Mol Cell Biol. 31 (2011a)
Yang, Z. J. et al., Mol Cancer Ther 10 (2011b)
Yau, C. et al., Breast Cancer Res 12 (2010)
Ye, X. H. et al., Mol Genet.Genomics (2014)
Yoon, J. K. et al., J Transl.Med. 12 (2014)
Yoshimura, S. et al., J Cell Biol. 191 (2010)
Yoshizuka, N. et al., Mol Cancer Res 10 (2012)
Yosten, G. L. et al., Am J Physiol Regul.Integr.Comp Physiol 303 (2012) Yu, J. H. et al., RNA.11 (2005)
Yu, K. et al., PLoS.Genet.4 (2008)
Yue, C. et al., Int.J Cancer 136 (2015)
Zamanian-Daryoush, M. et al., J Biol.Chem. 288 (2013) Zarling, A. L. et al., Cancer Res 74 (2014)
Zekri, A. R. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.13 (2012) Zelcer, N. et al., Mol Cell Biol. 34 (2014)
Zhang, D. et al., Pak.J Med.Sci.29 (2013a)
Zhang, H. et al., Oncotarget.4 (2013b)
Zhang, H. T. et al., Biochim.Biophys.Acta 1839 (2014a) Zhang, J. et al., Drug Metab Dispos. 34 (2006)
Zhang, S. et al., BMC.Cancer 11 (2011)
Zhang, X. et al., PLoS.One.7 (2012)
Zhang, X. D. et al., Int.J Clin Exp.Med. 7 (2014b) Zhao, Y. et al., Cell Death.Dis. 4 (2013)
Zhou, B. et al., Cancer Biol.Ther 13 (2012)
Zhou, D. et al., PLoS.One.8 (2013a)
Zhou, J. et al., Oncol Rep.30 (2013b)
Zhou, J. et al., Lung Cancer 14 (1996)
Zhu, H. et al., Cell Stress.Chaperones. (2014a)
Zhu, W. L. et al., Anticancer Res 29 (2009)
Zhu, X. et al., Biomed.Pharmacother. 68 (2014b) Zhuang, Z. et al., J Neurosurg.115 (2011)
Zietek, Z. et al., Pol.Tyg.Lek. 51 (1996)
Zou, W. et al., Cancer Sci.101 (2010)
Zu, X. et al., Molecules.18 (2013)
Zu, X. Y. et al., Recent Pat Anticancer Drug Discov.7 (2012) Zynda, E. R. et al., Cell Cycle 13 (2014)
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 56 i njegova farmaceutski prihvatljiva so, naznačeno time što navedeni peptid ima celokupnu dužinu od najviše 30 aminokiselina, i naznačeno time što navedeni peptid ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I i ima sposobnost da, kada je vezan za MHC, bude prepoznat od strane CD8 T ćelija.
2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što navedeni peptid ima ukupnu dužinu od najviše 16 aminokiselina, i poželjno naznačeno time što peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV 56.
3. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze i/ili naznačeno time što je navedeni peptid deo fuzionog proteina koji sadrži N-terminalne aminokiseline HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).
4. Antitelo, solubilno ili vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, poželjno peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 koji je vezan za MHC molekul.
5. T-ćelijski receptor (TCR), solubilni ili vezan za membranu, koji je reaktivan sa HLA ligandom, naznačeno time što je navedeni ligand najmanje 88% identičan sa, i poželjno sadrži, aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV 56, naznačeno time što je opciono navedeni TCR obezbeđen u obliku solubilnog molekula i dalje opciono nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.
6. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 3, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.
7. Ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, ili nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigen-prezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija ili T ćelija ili NK ćelija.
8. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, antitela u skladu sa patentnim zahtevom 4, ili TCR-a u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja prezentuje peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, i izolovanja navedenog peptida, navedenog antitela ili navedenog TCR-a iz ćelije domaćina i/ili njenog medijuma za kultivaciju.
9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigen-specifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2.
10. Aktivirana T ćelija, proizvedena metodom u skladu sa patentnim zahtevom 9, koja selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1 ili 2.
11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 3, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.
12. Peptid u skladu bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 3, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u medicini.
13. Peptid u skladu bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 3, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim
1
zahtevom 10 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u lečenju malignog tumora.
14. Peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 3, antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 4, TCR u skladu sa patentnim zahtevom 5, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, ćelija domaćin koja sadrži vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirana T ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili farmaceutska smeša u skladu sa patentnim zahtevom 11 za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačeno time što je navedeni maligni tumor izabran iz grupe koju čine HCC, maligni tumor mozga, maligni tumor bubrega, maligni tumor pankreasa, maligni tumor kolona ili rektuma ili leukemija i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju SLC16A11.
15. Komplet koji se sastoji od:
(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu u skladu sa patentnim zahtevom 11, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;
(b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;
(c) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije, i opciono, dodatno sadrži jedno ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) iglu ili (vii) brizgalicu.
1
RS20211420A 2014-12-23 2015-12-16 Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv hepatocelularnog karcinoma (hcc) i drugih malignih tumora RS62575B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462096165P 2014-12-23 2014-12-23
GB201423016 2014-12-23
GBGB1501017.6A GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-01-21 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
EP19199125.6A EP3626731B1 (en) 2014-12-23 2015-12-16 Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62575B1 true RS62575B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=66846825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211420A RS62575B1 (sr) 2014-12-23 2015-12-16 Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv hepatocelularnog karcinoma (hcc) i drugih malignih tumora

Country Status (29)

Country Link
US (11) US12076380B2 (sr)
EP (1) EP4461371A3 (sr)
JP (9) JP2020191866A (sr)
KR (4) KR20240033128A (sr)
AU (1) AU2022268329A1 (sr)
CL (1) CL2021001479A1 (sr)
CO (1) CO2017003772A2 (sr)
CR (1) CR20210289A (sr)
CY (5) CY1122491T1 (sr)
DK (1) DK3236985T4 (sr)
ES (5) ES2896919T3 (sr)
FI (1) FI3236985T4 (sr)
HR (5) HRP20211753T1 (sr)
HU (5) HUE046641T2 (sr)
IL (1) IL281752A (sr)
LT (5) LT3626729T (sr)
MA (6) MA48487B1 (sr)
MD (5) MD3236985T3 (sr)
MX (6) MX2020011794A (sr)
MY (2) MY178137A (sr)
PE (1) PE20211740A1 (sr)
PL (4) PL3545965T3 (sr)
PT (5) PT3545965T (sr)
RS (1) RS62575B1 (sr)
SG (2) SG10202101444UA (sr)
SI (2) SI3616706T1 (sr)
TW (3) TW202321273A (sr)
UA (1) UA124331C2 (sr)
ZA (1) ZA201701762B (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2896919T3 (es) * 2014-12-23 2022-02-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos péptidos y nueva combinación de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el carcinoma hepatocelular (CHC) y otros tipos de cáncer
CN114720691B (zh) * 2022-05-10 2022-12-09 深圳粒影生物科技有限公司 一种检测生物标志物的试剂盒及其制备方法和应用
CN119391711A (zh) * 2024-10-17 2025-02-07 合肥综合性国家科学中心大健康研究院 小蛋白UFD1s及其在预防、治疗和诊断非酒精性脂肪性肝炎中的应用

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4440859A (en) 1977-05-27 1984-04-03 The Regents Of The University Of California Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
DK171727B1 (da) 1978-12-22 1997-04-14 Biogen Inc Rekombinante hepatitis B virus DNA-molekyler, værtsorganismer transformeret hermed, HBV-antigenspecifikke polypeptider, DNA-sekvenser kodende for HBV-antigenspecifikke polypeptider, metoder til påvisning af hepatitis B virus-antistoffer, metoder til fremstilling af nævnte DNA-molekyler, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte polypeptider og midler til påvisning af HBV-infektion
US4530901A (en) 1980-01-08 1985-07-23 Biogen N.V. Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides
US4342566A (en) 1980-02-22 1982-08-03 Scripps Clinic & Research Foundation Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes
US4678751A (en) 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4766075A (en) 1982-07-14 1988-08-23 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator
US4582800A (en) 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4677063A (en) 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
US4897445A (en) 1986-06-27 1990-01-30 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide bond
ATE183513T1 (de) 1993-06-03 1999-09-15 Therapeutic Antibodies Inc Herstellung von antikörperfragmenten
AUPM322393A0 (en) 1993-12-24 1994-01-27 Austin Research Institute, The Mucin carbohydrate compounds and their use in immunotherapy
JP4767371B2 (ja) 1996-01-17 2011-09-07 インペリアル・イノベイションズ・リミテッド 細胞障害性ｔリンパ球（ｃｔｌ）を用いた免疫療法
US5849589A (en) 1996-03-11 1998-12-15 Duke University Culturing monocytes with IL-4, TNF-α and GM-CSF TO induce differentiation to dendric cells
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US20020177551A1 (en) * 2000-05-31 2002-11-28 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
WO2001044279A2 (en) 1999-12-17 2001-06-21 Chiron Corporation Mammalian dishevelled-associated proteins
WO2001062908A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Ahuva Nissim Chimeric and tcr phage display libraries, chimeric and tcr reagents and methods of use thereof
EP2316950A1 (en) 2000-03-27 2011-05-04 Technion Research and Development Foundation, Ltd. Single chain class I major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same
US20040191260A1 (en) 2003-03-26 2004-09-30 Technion Research & Development Foundation Ltd. Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof
AU2001275246B2 (en) 2000-06-05 2006-06-29 Altor Bioscience Corporation T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
US20020048550A1 (en) 2000-07-20 2002-04-25 Vallera Daniel A. Radiolabeled immunotoxins
US7919467B2 (en) 2000-12-04 2011-04-05 Immunotope, Inc. Cytotoxic T-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
US20050053918A1 (en) 2001-05-16 2005-03-10 Technion Research & Development Foundation Ltd. Method of identifying peptides capable of binding to MHC molecules, peptides identified thereby and their uses
US6867283B2 (en) 2001-05-16 2005-03-15 Technion Research & Development Foundation Ltd. Peptides capable of binding to MHC molecules, cells presenting such peptides, and pharmaceutical compositions comprising such peptides and/or cells
US20070134261A1 (en) * 2001-12-03 2007-06-14 Hancock Robert E Effectors of innate immunity
US6992176B2 (en) 2002-02-13 2006-01-31 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease
CA2476625A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Dyax Corp. Mhc-peptide complex binding ligands
US7311914B2 (en) 2002-08-13 2007-12-25 Ludwig Institute For Cancer Research MAGE-A4 antigenic peptides and uses thereof
US20040091503A1 (en) * 2002-08-20 2004-05-13 Genitrix, Llc Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen
JP4406607B2 (ja) * 2002-08-26 2010-02-03 オンコセラピー・サイエンス株式会社 ペプチド及びこれを含む医薬
AU2003271904B2 (en) 2002-10-09 2009-03-05 Adaptimmune Limited Single chain recombinant T cell receptors
PT1558643E (pt) 2002-11-09 2009-08-24 Immunocore Ltd Apresentação de um receptor das células t
US20040096982A1 (en) 2002-11-19 2004-05-20 International Business Machines Corporation Methods and apparatus for analysis of mass spectra
US20040265230A1 (en) 2003-01-06 2004-12-30 Martinez Robert Vincent Compositions and methods for diagnosing and treating colon cancers
GB0304068D0 (en) 2003-02-22 2003-03-26 Avidex Ltd Substances
US20090304679A1 (en) 2004-05-27 2009-12-10 Weidanz Jon A Antibodies as T cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
US20090233318A1 (en) 2004-12-28 2009-09-17 Weidanz Jon A Methods of assaying vaccine potency
US20090075304A1 (en) 2004-05-27 2009-03-19 Weidanz Jon A Methods of assaying vaccine potency
SI1760089T1 (sl) 2005-09-05 2009-12-31 Immatics Biotechnologies Gmbh S tumorjem povezani peptidi, ki se veĹľejo na molekule humanega levkocitnega antigena (HLA) razreda I ali II in ustrezno cepivo proti raku
ES2341295T3 (es) 2005-09-05 2010-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase ii.
US8586006B2 (en) 2006-08-09 2013-11-19 Institute For Systems Biology Organ-specific proteins and methods of their use
CA2690627C (en) 2007-06-15 2014-12-02 Genelux Corporation Microorganisms for imaging and/or treatment of tumors
WO2009026547A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Receptor Logi, Ltd. Methods of assaying vaccine potency
WO2009034172A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Vrije Universiteit Brussel Enhancing the t-cells stimulatory capacity of human antigen presenting cells and their use in vaccination
EP2262834A4 (en) 2008-02-27 2011-08-17 Receptor Logic Inc ANTIBODIES AS T-CELL RECEPTOR MIMETICS, MANUFACTURING METHOD AND ITS USES
US20090263574A1 (en) 2008-04-21 2009-10-22 Quinn Daniel E Method of restoring an article
WO2009151487A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Receptor Logic, Inc. Methods of assaying vaccine potency
DE102008049136B4 (de) 2008-09-26 2012-10-25 Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie e.V. Neue Regulatoren des angeborenen Immunsystems
RS53782B1 (sr) * 2008-10-01 2015-06-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Preparati tumor-asociranih peptida i odgovarajuća antikancerska vakcina za tretman glioblastoma (gbm) i drugih kancera
EP2366162A1 (en) * 2008-11-18 2011-09-21 Collabrx, Inc. Individualized cancer treatment
CA2780753A1 (en) 2009-11-14 2011-05-19 Kuang-Yuh Chyu Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis
US8506964B2 (en) 2010-02-05 2013-08-13 Cardiovax, Llc Fusion proteins and related compositions, methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis
GB201006360D0 (en) 2010-04-16 2010-06-02 Immatics Biotechnologies Gmbh Method for differentially quantifying naturally processed HLA-restricted peptides for cancer, autoimmune and infectious diseases immunotherapy development
WO2012056407A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies which bind soluble t-cell receptor ligands
US9205139B2 (en) 2010-11-12 2015-12-08 Cardiovax, Llc Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of aneurysms
RU2013126626A (ru) 2010-11-12 2014-12-20 Седарс-Синаи Медикал Сентер Иммуномодулирующие способы и системы для лечения и/или предотвращения гипертензий
CN103561760A (zh) * 2010-11-12 2014-02-05 赛达斯西奈医疗中心 包含apob100的免疫原性片段的免疫调节组合物、方法和系统
EP2697368B1 (en) * 2011-04-15 2019-06-05 Genelux Corporation Clonal strains of attenuated vaccinia viruses and methods of use thereof
WO2013057586A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and methods for producing soluble t - cell receptors
WO2013070603A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treatment of kidney diseases
EP3656394A1 (en) * 2011-12-09 2020-05-27 Stealth Peptides International, Inc. Aromatic-cationic peptides and uses of same
GB201208293D0 (en) 2012-05-11 2012-06-20 Circassia Ltd Hydrochlorice salt of peptide
GB201209862D0 (en) * 2012-06-01 2012-07-18 Circassia Ltd Cladosporium peptides
AU2013312529A1 (en) 2012-09-05 2015-04-16 The University Of Birmingham Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics
WO2014071978A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Roche Diagnostics Gmbh Nucleic acids encoding chimeric polypeptides for library screening
GB201301632D0 (en) 2013-01-30 2013-03-13 Imp Innovations Complement System
US9134326B2 (en) * 2013-03-14 2015-09-15 Battelle Memorial Institute Biomarkers for liver fibrosis
EP2808392A1 (en) 2013-05-28 2014-12-03 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Aptamers and use of the aptamers in the diagnosis and treatment of cancer
CN103739667B (zh) 2013-09-24 2017-08-25 上海宇研生物技术有限公司 卵巢癌特异的肿瘤抗原肽及其制备方法
RU2722696C2 (ru) 2014-03-14 2020-06-03 Иммунокор Лимитед Библиотеки tcr
ES2896919T3 (es) * 2014-12-23 2022-02-28 Immatics Biotechnologies Gmbh Nuevos péptidos y nueva combinación de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el carcinoma hepatocelular (CHC) y otros tipos de cáncer
GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
GB201507719D0 (en) 2015-05-06 2015-06-17 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (CRC) and other cancers
NL2014935B1 (en) 2015-06-08 2017-02-03 Applied Immune Tech Ltd T cell receptor like antibodies having fine specificity.
US20180179283A1 (en) 2015-06-08 2018-06-28 Adicet Bio Inc. T cell receptor like antibodies having fine specificity
BR112018070637A2 (pt) 2016-04-08 2019-02-05 Adaptimmune Ltd receptores de células t
BR112018070600A2 (pt) 2016-04-08 2019-02-05 Adaptimmune Ltd receptores de células t
JP7240176B2 (ja) 2016-04-08 2023-03-15 アダプティミューン・リミテッド Ｔ細胞受容体
EP3491856B1 (en) 2016-07-27 2025-09-17 Sharp Kabushiki Kaisha Wireless telecommuncations methods and apparatus using system information value tag
CN110809580A (zh) 2017-01-24 2020-02-18 安贝科思生物制剂公司 用于靶向癌症中包含非典型hla-i和新抗原的复合体的方法和组合物
US20200325244A1 (en) 2020-05-18 2020-10-15 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies and methods of use thereof
US11497768B2 (en) 2017-06-05 2022-11-15 Mie University Antigen-binding protein that recognizes MAGE-A4-derived peptide
US10988754B2 (en) 2017-07-04 2021-04-27 Cure Vac AG Nucleic acid molecules
KR20250040097A (ko) 2017-08-18 2025-03-21 그릿스톤 바이오, 인코포레이티드 공유된 항원을 표적화하는 항원-결합 단백질
US12221465B2 (en) 2017-09-06 2025-02-11 California Institute Of Technology Signaling and antigen-presenting bifunctional receptors (SABR)
JP2021508475A (ja) 2017-12-28 2021-03-11 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド 共有抗原を標的とする抗原結合タンパク質
CA3097399A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 The Board Of Regents, The University Of Texas System T cell receptors with mage-b2 specificity and uses thereof
CN112368386A (zh) 2018-05-23 2021-02-12 磨石肿瘤生物技术公司 共有抗原
US20200291127A1 (en) 2020-05-18 2020-09-17 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies and methods of use thereof
US20200291116A1 (en) 2020-05-18 2020-09-17 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies and methods of use thereof
US20200291128A1 (en) 2020-05-18 2020-09-17 Abexxa Biologics, Inc. Antibodies and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020191869A (ja) 2020-12-03
JP2023100927A (ja) 2023-07-19
ES2899425T3 (es) 2022-03-11
US11672848B2 (en) 2023-06-13
IL281752A (en) 2021-05-31
MD3616706T2 (ro) 2022-01-31
PT3626731T (pt) 2021-11-29
KR20240033128A (ko) 2024-03-12
US20220118071A1 (en) 2022-04-21
JP2020191864A (ja) 2020-12-03
MA48487A (fr) 2020-03-04
UA124331C2 (uk) 2021-09-01
MA49157A (fr) 2021-06-02
LT3236985T (lt) 2019-12-27
ES2763911T5 (es) 2023-01-05
JP2020191867A (ja) 2020-12-03
DK3236985T4 (da) 2022-11-28
FI3236985T4 (fi) 2022-12-15
TWI794679B (zh) 2023-03-01
MY199068A (en) 2023-10-12
MA49155B1 (fr) 2021-11-30
US12070491B2 (en) 2024-08-27
MA46913A (fr) 2021-03-24
MA46913B1 (fr) 2021-09-30
JP2020191868A (ja) 2020-12-03
CL2021001479A1 (es) 2022-02-04
US11679147B2 (en) 2023-06-20
TW202321273A (zh) 2023-06-01
US20220023404A1 (en) 2022-01-27
MA48487B1 (fr) 2021-11-30
MD3545965T2 (ro) 2021-10-31
US20230031307A1 (en) 2023-02-02
CY1124533T1 (el) 2022-07-22
PL3545965T3 (pl) 2021-12-27
US20220354939A1 (en) 2022-11-10
US11559573B2 (en) 2023-01-24
JP7109801B2 (ja) 2022-08-01
MA49155A (fr) 2021-04-28
JP7448423B2 (ja) 2024-03-12
CY1122491T1 (el) 2020-10-14
CY1124846T1 (el) 2022-11-25
US12076380B2 (en) 2024-09-03
LT3626729T (lt) 2021-10-25
US20220257739A1 (en) 2022-08-18
MX2020011794A (es) 2020-12-07
HRP20211327T1 (hr) 2022-01-21
MD3626729T2 (ro) 2021-12-31
US12121572B2 (en) 2024-10-22
US11576956B2 (en) 2023-02-14
MX2020011793A (es) 2020-12-07
US20220054613A1 (en) 2022-02-24
US20220016227A1 (en) 2022-01-20
MA50819A (fr) 2021-04-07
PT3545965T (pt) 2021-09-20
TW202124426A (zh) 2021-07-01
HRP20211580T1 (hr) 2022-01-21
HRP20192212T1 (hr) 2020-03-20
HRP20211753T1 (hr) 2022-04-01
AU2022268329A1 (en) 2023-02-02
HUE057014T2 (hu) 2022-04-28
HUE056607T2 (hu) 2022-02-28
MX2020011787A (es) 2020-11-24
TWI754892B (zh) 2022-02-11
MD3236985T2 (ro) 2020-02-29
ES2887107T3 (es) 2021-12-21
SI3626731T1 (sl) 2021-12-31
MD3236985T3 (ro) 2023-03-31
PL3626729T3 (pl) 2022-02-21
JP2020191865A (ja) 2020-12-03
JP7026411B2 (ja) 2022-02-28
JP7358299B2 (ja) 2023-10-10
DK3236985T3 (da) 2020-01-20
PE20211740A1 (es) 2021-09-06
MA49156A (fr) 2020-03-25
JP2025134788A (ja) 2025-09-17
EP4461371A3 (en) 2025-02-26
ZA201701762B (en) 2018-05-30
HRP20211754T1 (hr) 2022-03-04
TW202028231A (zh) 2020-08-01
MY178137A (en) 2020-10-05
US20220023403A1 (en) 2022-01-27
JP7346361B2 (ja) 2023-09-19
MX2020004757A (es) 2020-08-20
JP2020191866A (ja) 2020-12-03
LT3545965T (lt) 2021-09-10
MX2020011791A (es) 2020-11-24
PL3626731T3 (pl) 2022-05-02
KR20200123269A (ko) 2020-10-28
SI3616706T1 (sl) 2021-12-31
CO2017003772A2 (es) 2017-09-20
ES2900106T3 (es) 2022-03-15
MD3626731T2 (ro) 2022-01-31
US11779638B2 (en) 2023-10-10
US20220339272A1 (en) 2022-10-27
PT3616706T (pt) 2021-11-23
SG10202101444UA (en) 2021-03-30
US12097248B2 (en) 2024-09-24
PT3626729T (pt) 2021-11-03
HUE046641T2 (hu) 2020-03-30
KR20220118565A (ko) 2022-08-25
HUE056087T2 (hu) 2022-01-28
LT3616706T (lt) 2022-02-10
KR20200066382A (ko) 2020-06-09
HUE055489T2 (hu) 2021-11-29
LT3626731T (lt) 2022-02-10
US20240408166A1 (en) 2024-12-12
EP4461371A2 (en) 2024-11-13
KR102435015B1 (ko) 2022-08-22
PL3616706T3 (pl) 2022-02-07
KR102395995B1 (ko) 2022-05-09
CR20210289A (es) 2021-06-30
MX2020005188A (es) 2020-08-20
JP2020191873A (ja) 2020-12-03
ES2896919T3 (es) 2022-02-28
PT3236985T (pt) 2020-01-22
US20220031824A1 (en) 2022-02-03
CY1124847T1 (el) 2022-11-25
HRP20192212T4 (hr) 2022-11-25
ES2763911T3 (es) 2020-06-01
SG10202102698VA (en) 2021-04-29
CY1124813T1 (el) 2022-11-25
KR102643923B1 (ko) 2024-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3626729B1 (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
JP7142957B2 (ja) 前立腺がんおよびその他のがんに対する免疫療法において使用するための新規ペプチドおよびペプチドの組み合わせ
EP3291830B1 (en) Novel peptides and combination of peptides and scaffolds thereof for use in immunotherapy against colorectal carcinoma (crc) and other cancers
US10385111B2 (en) Immunotherapy against melanoma and other cancers
CN109152813B (zh) 作为靶标以及用于胆囊癌和胆管癌以及其他癌症免疫治疗的新型肽、肽组合物
RS61787B1 (sr) Peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka dojke i drugih malignih tumora
RS59471B1 (sr) Nova imunoterapija za lečenje nekoliko tumora krvi, kao što je akutna mijeloidna leukemija (aml)
RS64217B1 (sr) Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka jajnika i drugih malignih tumora
ES2981540T3 (es) Péptidos novedosos y combinación de péptidos para usarse en inmunoterapia contra diferentes tumores (SEQ ID 274 - IGF-004)
US20190322722A1 (en) Immunotherapy against melanoma and other cancers
RS62575B1 (sr) Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv hepatocelularnog karcinoma (hcc) i drugih malignih tumora
US11897935B2 (en) Peptides, combination of peptides as targets and for use in immunotherapy against gallbladder cancer and cholangiocarcinoma and other cancers
HK40016907B (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
HK40016907A (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
HK40016904A (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
HK40016904B (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
HK40016908B (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers
HK40016908A (en) Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (hcc) and other cancers