KR980009281A

KR980009281A - 아연 결합이 향상된 인슐린 유도체

Info

Publication number: KR980009281A
Application number: KR1019970034958A
Authority: KR
Inventors: 요한 에르틀; 파울 하버만; 칼 가이젠; 게르하르트 자이프케
Original assignee: 야코비 쿤켈; 휙스트 아크티엔게젤샤프트
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 1998-04-30
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: AU725201B2; NO973438D0; CZ237097A3; CN1172811A; US6221837B1; TR199700685A2; HUP9701299A1; AR008269A1; EP0821006A3; KR100547922B1; JP4046388B2; HU9701299D0; EP0821006B1; PT821006E; JPH1072496A; ZA976645B; CN1362417A; TW474944B; HK1048125A1; CN1158305C

Abstract

아연 결합을 증가시킨 인슐린은 당뇨병을 치료하기 위한 약제학적 제제의 제조에 적합하다. 인슐린 6량체 및 6량체당 아연을 약 5 내지 9몰 함유하는 인슐린을 함유하는 화학식 1의 인슐린은 아연과 복합체를 형성한다.

위의 화학식 1에서, 2는 히스티딘 잔기이거나 히스티딘 잔기 1개 내지 5개를 함유하며, 유전적으로 코드화 할 수 있는 아미노산 잔기 2개 내지 35개를 갖는 펩타이드 잔기이다.

Description

아연 결합이 향상된 인슐린 유도체

피하 투여된 인슐린의 약물동력학은 인슐린의 연합 거동(association behavior)에 좌우된다. 중성 수용액 속에서 인슐린은 6량체를 형성한다. 인슐린이 조직에서 혈류로 들어가 작용 부위에 도달하는 경우, 먼저 모세관벽을 통과해야 한다. 이는 인술린이 단량체 또는 이량체인 경우에만 가능하고, 인슐린이 6량체이거나 비교적 고분자량의 연합체인 경우에는 불가능하거나 겨우 소량만 통과할 수 있다[문헌 참조: Brange et al., Diabetes Care: 13(1990), pages 923-954; Kang et al., Diabetes Care: 14(1791), pages 942-9480 따라서 피하 조직에서 신속하게 혈류로 통과되기 위해서 먼저 6량체가 해리될 것이 요구된다.

인슐린의 연합 거동과 집합 거동은 Zn⁺⁺에 영향을 받으며, Zn⁺⁺은 6량체를 안정화시키고 중성 주위의 pH에서 침전될 때까지 비교적 고분자량의 집합체를 형성시킨다. 그러나 완충시키지 않은 사람 인슐린 용액(pH 4)에 대한 첨가제로서 Zn⁺⁺은 작용 프로필에 단지 약간의 영향을 미칠 뿐이다. 이러한 용액이 주사시 피하 조직에서 신속하게 중성화되고 인슐린-아연 복합체가 형성되더라도 사람 인슐린과의 자연스러운 아연 결합이 6량체와 더 높은 집합체를 안정화시킬 만큼 충분하지 못하다. 따라서 Zn⁺⁺을 첨가함으로써 사람 인슐린의 유리가 현저하게 지연되지 않으며, 강한 데포 효과가 생기지 않는다. 인슐린 6량체는 인슐린 6량체당 약 2몰의 Zn⁺⁺을 함유한다고 공지되어 있다[문헌 참조: Blundell et al., Adv. Protein Chem. : 26(1972), pages 323-328]. 인슐린 6량체당 2개의 Zn⁺⁺이온이 인슐린 6량체에 단단히 결합되어 있기 때문에 일반적인 투석으로 제거할 수 없다. 이른바 4-아연 인슐린 결정이 명백하게 기술되어 있지만 이 결정은 인슐린 6량체 몰당 Zn⁺⁺을 평균 3물 미만을 함유할 뿐이다[문헌 참조: G.D. Smith et al., Proc Natl. Acad, Sci. USA: 81, pages 7093-7097].

본 발명의 목적은 아연 결합력을 증가하여 인슐린 6량체와 Zn⁺⁺을 함유하는 안정한 복합체를 형성시키며, 사람 인슐린과 비교하여 피하 주사시 지연된 작용 프로필을 나타내는 인슐린 유도체를 발견하는 것이다.

화학식 1의 인슐린 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 다음과 같다.

위의 화학식1에서, R¹은 페닐알라닌 잔기 또는 수소원자이고, R³은 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기이며, Y는 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기이고,2는 a) 아미노산 잔기 His 또는 b) 히스티딘 잔기 1개 내지 5개를 함유하는, 유전적으로 코드화 할 수 있는 아미노산 2개 내지 35개를 갖는 펩타이드이며, A2 내지 A20 잔기는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄 아미노산 서열에 상응차고, B2 내지 B29 잔기는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B쇄 아미노산 서열에 상응한다.

R¹은 페닐알라닌 잔기이고, R³이 Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Ala, Thr, Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고, Z가 a) 아미노산 잔기 His 또는 b) 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는, 아미노산 잔기를 4개 내지 7개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.

R¹은 페닐알라닌 잔기이고 R³이 Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Ala, Thr, ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고 Z가 a)아미노산 잔기 His 또는 b) 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는, 아미노산 잔기를 2개 내지 7개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 더욱 바람직하다.

Z가 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는, 아미노산 잔기를 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.

R¹은 페닐알라닌 잔기이고 R³이 Asn과 Gly로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Thr 과 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고 2가 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는, 아미노산 잔기를 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 특히 바람직하다.

R¹은 페닐알라닌 잔기이고 R⁷이 글리신 잔기이며 Y가 트레오닌 잔기이고 Z가 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개를 함유하는, 아미노산 잔기 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 더욱 더 바람직하다.

Z가 His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린이 매우 특히 바람직하다.

펩타이드와 단백질의 아미노산 서열은 아미노산 쇄의 N-말단에서부터 앞쪽으로의 서열을 나타낸다. 화학식 1의 괄호 속에 주어 항목, 예를 들어 Al, A6, A7, A11, A20, Bl, B7, B19 또는 B30은 인슐린 A쇄 또는 B쇄의 아미노산 잔기 위치에 상응한다.

"유전적으로 코드화 할 수 있는 아미노산 잔기"라는 표현은 아미노산 잔기 Giy, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, He, AsP, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro 및 셀레노시스테인을 나타낸다. 동물 인슐린의 "잔기 A2 내지 A20" 이라는 표현 및 "잔기 B2 내지 B29"이라는 표현은 예를 들어 소, 돼지 또는 닭의 인슐린의 아미노산 서열을 나타내는 것으로 이해하면 된다. 인슐린 유도체의 잔기 A2 내지 A20 및 잔기 B2 내지 B29라는 표현은 유전적으로 코드화 할 수 있는 다른 아미노산으로 아미노산을 치환하여 형성된 사람 인슐린의 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.

사람 인슐린의 A쇄는 하기 서열을 갖는다:

서열 1

Gly, Ile, Val, Glu, Gln, Cys, Cys, Thr, Ser, He, Cys, Ser, Leu, Tyr, Gln, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn.

사람 인슐린의 A쇄는 하기 서열 2를 갖는다:

서열 2

Phe, Val, Asn, Gln, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala, Leu, Tyr, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Tyr, Thr, Pro, Lys, Thr.

화학식 1의 인슐린 유도체는 다양한 유전기술설계에 힘입어 미생물에 형성시킬 수 있다(문헌 참조: 유럽 특허 제0 485 787호, 유럽 특허 제0 347 781호, 유럽 특허 제0 368 177호, 유럽 특허 제0 453 969호). 유전기술설계는 발효 동안 대장균(Escherichia coli) 또는 연쇄상구균(Streptomycetes)과 같은 미생물에 발현시킨다.

형성된 단백질은 미생물 내부에 저장되거나(참조 문헌 : 유럽 특허 제0 489 780호) 발효 용액으로 분비된다.

화학식 1의 인슐린 예는 다음과 같다.

Gly(A2l)-사람 인슐린-His(B3l)-His(B32)-OH

Gly(A2l)-사람 인슐린-His(B3l)-His(B32)-Arg(B33)-OH

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala(B3l)-His(B32)-His(B33)-OH

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala(B3l)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala(B3l)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala (B31)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-Arg(B35)-OH

화학식 1의 인슐린 유도체는 유전기술설계로 표준법에 따라 부위 지향(site-directed) 돌연변이 발생의 방법으로 주로 제조된다. 이를 위하여, 화학식 1의 목적하는 인슐린 유도체에 대한 유전자 구조는 숙주 세포, 바람직하게는 대장균 또는 효모와 같은 세균 특히 맥주 효모군(Saccharomyces cerevisiae)에서 설계하거나 발현시키며 유전자 구조가 융합 단백질에 대해 코드화 되는 경우, 화학식 1의 인슐린 유도체는 융합 단백질에서 유리된다. 유사한 방법이 예를 들어, 유럽 공개특허공보 제0 211 299호, 유럽 공개특허공보 제0 227 938호, 유럽 공개특허공보 제0 229 998호, 유럽 공개특허공보 제0 286 956호 및 독일 특허권 제P 38 21 159호에 기술되어 있다.

세포 분열 후 융합 단백질 부분은 시안겐 할라이드로 화학적으로 개열시키거나(문헌 참조: 유럽 공개특허공보 제0 180 920호) 리소스타핀 또는 트립신에 의해 효소적으로 개열시킬 수 있다(문헌 참조: 독일 공개특허 공보 제37 39 347호).

이어서, 인슐린 전구체를 문헌[참조: R.C. Marshall and A.S. Inglis in "Practical Protein Chemistry-A Handbook"(Editor A. Darbre) 1986, pages 49-53]에 기술된 방법에 따라 산화된 설피톨라이시스(Sulfitolysis)시킨 다음, 티올 존재하에 보정된 디설파이드 브릿지를 형성시켜 재네이춰링(renatured)시킨다[문헌 참조: G.H. Dixon and A.C. Wardlow in Nature(1960), pages 721-724]. 그러나 인슐린 전구체를 직접 접합시킬 수도 있다(문헌 참조: 유럽 공개특허공보 제0 600 372호 및 유럽 공개특허공보 제0 668 292호).

C 펩타이드 및 경우에 따라 예비서열(화학식2에 따르는 R²)은 트립신 개열로 제거하고[문헌 참조 : Kemmler et al., J.B.C.(1971), pages 6786-6791] 화학식 1의 인슐린 유도체를 크로마토그래피[문헌 참조 : 유럽 공개특허공보 제0 305 760호] 및 결정화와 같은 공지된 기술로 정제한다.

또한 본 발명은 인슐린 6량체와 인슐린 6량체당 Zn⁺⁺을 약 5 내지 9몰, 바람직하게는 인슐린 6량체당 Zn⁺⁺5 내지 7몰을 함유하는 복합체에 관한 것이며 인슐린 6량체는 화학식 1의 인슐린 분자 6개로 이루어진다.

인슐린 6량체에 대한 아연 결합은 매우 단단하여 인슐린 6량체당 Zn⁺⁺5 내지 9몰은 일반적인 투석, 예를 들어, 수성 10mM 트리스/HCl 완충액 (pH7.4)으로 40시간 실시하여 제거될 수 있다.

피하 투여 후, 필수적으로 아연이 없는 제제(pH 4)로서 화학식 1의 인슐린인 사람 인슐린과 비교하여 매우 미세한 지연 작용을 나타낸다. 아연을 약 200㎍ Zn⁺⁺/㎖로 함유하는 제제를 사람 인슐린에 가한 후 피하 주사하여 작용의 개시를 관찰한다. 지연 작용은 40㎍ Zn⁺⁺/㎖에서 바람직하게 관찰된다. 아연 농도가 더 높을수록 이러한 효과는 증강한다.

또한 본 발명은 화학식 2의 프리프로인슐린(preproinsulin)에 관한 것이다.

위와 화향식 2에서, R³및 Y는 청구항 제1항 내지 제6항 중의 어느 항에서 화학식 1에서 정의한 바와 같고, R¹은 페닐알라닌 또는 공유 결합이며, R²는 a) 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기 또는 b) 아미노산 잔기 2개 내지 45개를 갖는 펩타이드이고 잔기 A2 내지 A20과 잔기 B2 내지 B29는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄 및 B쇄의 아미노산 서열에 상응하고, Z¹은 히스티딘 잔기를 1개 내지 5개 갖는, 유전적으로 코드화 할 수 있는 아미노산 잔기를 2개 내지 40개 갖는 펩타이드이다.

화학식 2의 프로인슐린은 화학식 1의 인슐린 제조에 있어서 중간체로서 유용하다.

R²가 아미노산 잔기 2개 내지 25개를 갖는 펩타이드인 화학식 2의 프로인슐린이 바람직하다.

R²가 아미노산 잔기 2개 내지 15개를 갖는 펩타이드(여기서, Met, Lys 및 Arg로 이루어진 그룹 중의 아미노산 잔기는 카복실 말단에 위치한다)인 화학식 2의 프로인슐린이 특히 바람직하다.

화학식 1의 인슐린 유도체 및/또는 인슐린 6량체 및 6량체당 Zn⁺⁺5 내지 9몰 및/또는 생리학적으로 허용되는 이의 염(예를 들어, 알칼리 금속 또는 암모늄염)을 함유하는 본 발명에 따르는 복합체는 주로 당뇨병, 특히 진성 당뇨병의 치료에 대한 약제학적 제제에 활성 화합물로서 사용한다.

약제학적 제제는 주사용의 액제 또는 현탁제가 바람직하며, 이는 화학식 1의 유도체 및/또는 본 발명에 따르는 복합체 하나 이상 및/또는 무정형 및/또는 결정형으로 용해시킨, 바람직하게는 용해시킨, 생리학적으로 허용되는 이의 염을 하나 이상 포함한다.

바람직하게는 제제의 pH는 약 2.5 내지 8.5 특히 약 4.0 내지 8.5이며, 적합한 등장화제, 적합한 보존제 및 경우에 따라, 적합한 완충제를 함유하고, 또한 바람직하게는 모두 무균의 수용액 속에 특이한 아연 이온 농도를 함유한다. 활성화합물은 별도로 차고 제제 성분 전체는 약물 담체 용액을 형성한다.

화학식 1의 인슐린을 함유하는 제제의 pH는 2.5 내지 4.5, 특히 3.5 내지 4.5, 바람직하게는 4.0이다. 화학식 1의 인슐린 현탁제를 함유하는 제제의 pH는 6.5 내지 8.5, 특히 7.0 내지 8.0, 바람직하게는 7.4이다.

적합한 등장화제는 예를 들어, 글리세롤, 글루코즈, 만니톨, NaC₁, CaCl₂또는 MgCl₂와 같은 칼슘 화합물 또는 마그네슘 화합물이다.

등장화제 및/또는 보존제를 선택한 결과로 인슐린 유도체 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염은 약산성 pH에서 효과적으로 된다.

적합한 보존제는 예를 들어 페놀, m-크레졸, 벤질 알콜 및/또는 p-하이드록시벤조산 에스테르이다.

사용할 수 있는 완충 물질, 특히 pH를 약 4.0 내지 8.5로 적정한 수 있는 완충 물질은 예를 들어, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 또는 인산나트륨이다. 한편, 생리학적으로 허용되는 희석산(통상 HCI) 또는 희석염기(통상 NaOH)가 또한 PH를 적정하는데 적합하다.

제제의 Zn⁺⁺함량이 1㎍ 내지 2㎎ Zn⁺⁺/㎖, 특히 5㎍ 내지 200㎍ Zn⁺⁺/㎖인 경우가 바람직하다.

본 발명에 따르는 제제의 작용 영역을 다양하게 하기 위해서, 변형시키지 않은 인슐린, 바람직하게는 소, 돼지 또는 사람 인슐린, 특히 사람 인슐린, 또는 예를 들어 단량체 인슐린, 속효성 인슐린 또는Gly(A2l)-Arg(B3l)-Arg(B32)-사람 인슐린과 같은 변형시킨 인슐린을 혼합할 수 있다.

바람직한 활성 화합물 농도는 약 1 내지 1500국제단위/㎖, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 1000국제단위㎖, 특히 약 40 내지 400국제단위/㎖에 상응하는 농도이다.

[실시예 1]

Gly(A2l)- 사람 인슐린 - His(B32)-OH의 제조

발현 시스템의 제조는 필수적으로 미국 특허 제5,358,857호에 따라 실시한다. 벡터 pINT90d 및 벡터 pINT 91d(실시예 17 참조), PCR프라이머 TIR 및 Insull은 또한 이 문헌에 기술되어 있다. 이러한 4개의 성분은 특히 다음에 기술하는 벡터 설계에 출발 물질로서 사용한다.

먼저 Gly(A2l)에 대한 코돈을 소형 프로인슐린 서열 코드에 삽입한다. 이렇게 하기 위해서 pINT 91d를 형판으로서 사용하고 PCR 반응을 프라이머 TIR과 Insul1(서열 3)로 실시한다.

서열 3

5'TTT TTT GTS GAC CTA TTAGCCGCA GTA GTT CTC CAG CTG 3'

PCR 사이클온 다음과 같이 실시한다. 첫 번째 분 94℃, 두 번째 분 55℃, 세 번째 분 72℃. 이 사이클을 25분 반복한 다음 혼합물을 72℃에서 7분 동안 배양하고 이어서 4℃에서 밤새 배양한다.

생성된 PCR 절편을 정제하기 위해서 에탄올에 침전시키고, 건조시킨 다음 제한 효소 Nc0l과 Sall을 제조원의 설명서에 따라 사용하여 제한 완충제 속에서 소화시킨다. 이어서 반응 혼합물을 겔 전기영동으로 분리하고 Nc0l-프리-프로인슐린-Sall 절편을 분리한다. 플라스미드 pINT90d의 DNA를 Nc0l과 Sall을 사용하여 동일하게 개열시키고 원숭이 프로인슐린 절편을 이런 식으로 pINT 잔기 플라스미드로부터 유리시킨다. 절편 둘다 겔 전기영동으로 분리하고 전기 플라스미드 DNA를 분리한다 이 DNA를 리가제 반응으로 Nc0l-Sall PCR 절편과 반응시킨다. 따라서 플라스미드 pINT150d를 수득하며, 이는 대장균으로 형질 전환시킨 후에 복제한 다음 재분리한다.

플라스미드 pINT150d의 DNA를 플라스미드 pINT302에 대한 출발 물질로서 사용하며, 목적하는 인슐린 변종을 제조할 수 있게 한다.

이러한 플라스미드를 설계하기 위해서 미국 특허 제5, 358, 제7호(실시예 6 참조)에 기술되어 있는 경로를 취한다. 서로 독립적인 2개의 PCR 반응은 이러한 목적으로 실시되고, 이를 위하여 플라스미드 pINT150d의 DNA를 형판으로 사용한다. 한 반응은 프라이머 쌍 TIR과 pINT B5(서열 4)를 사용하여 실시하며,

서열 4

5'GAT GCC GCGGTG GTGCTT GGG TGT GTAG 3'

또 다른 반응은 프라이머 쌍 Insull 및 pINT B6(서열 5)을 사용하여 실시한다.

서열 5

5'A CCC AAG ACCCAC CACCGC ATC GTG CAG 3'

생성된 PCR 절편은 부분적으로 대상성이기 때문에 세 번째 PCR 반응에서 B3l과 B32에 연장시킨 Gly(A2l) 소형 프로인슐린을 코드화하여 절편으로 한다. 이 절편을 Nc0l과 Sall을 사용하여 개열시킨 다음 리가제 반응으로 기술되어 있는 pINT90d 잔기 플라스미드의 DNA와 반응시켜 플라스미드 pINT302를 수득한다. 이 플라스미드로 형질전환시킨 대장균 Kl2 W3110을 발효시키고 미국 특허 제5, 227, 273호의 실시예 4와 같이 후처리한다. 중간체(트림신 개열 전)로서 수득된 프리프로인슐린 유도체는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 6)을 갖는다.

서열 6

Met Ala Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Ser His Leu Val Giu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

His His Arg

Gly He Val Glu Lin Cys Sys Thr Ser no Cys Ser

Leu Try Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

프리프로인슐린 1은 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에 R²는 아미노산 잔기를 11개 갖는 펩타이드이고, R¹은 Phe(Bl)이며, Y는 Thr(B3O)이고, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다

프리프로인슐린 1은 실시예 4에 따라 미국 특허 제5, 227, 293에서와 같이 트립신으로 개열시킨다. 이어서 수득된 생성물을 실시예 11에 따라 카복시펩티다 제B와 반응시켜 인슐린 1을 수득한다. 인슐린 1인 화학식 1에 상응하며, 이 경우에 R¹은 Phe(B1)이고, Y는 Thr(B30)이며, Z는 His His(B3l-B32)이고, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

인슐린 1은 다음과 같은 아미노산 서열(서열 7)을 갖는다.

서열 7

B쇄 : Pho Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu ABa Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

His His

A쇄 : Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lIne Cys Ser

Leu Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

디설파이드 브릿지는 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.

[실시예 2]

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala(B3l)-His(B32)-His(B33)-Arg(B34)-OH

발현 벡터를 실시예 1에 따라 설계한다. 플라스미드 pINT50d를 프라이머 쌍 TIR 및 pINT B7(서열 8) 또는 Insull 및 pINT B88(서열 9)과의, 서로 독립적인, 2개의 PRC 반응에 대한 형판으로서 사용한다.

서열 8

5' GAT GCC GCGGTG GTGCGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3'

서열 9

5' ACCC AAG ACCGCG CAC CACCGC GGC ATC GTG GAG 3'

두 반응이 이끄는 PCR 절편은 부분적으로 상대성이고 세 번째 PCR 반응에서 목적하는 인슐린 변종을 코드화하는 완전한 서열을 제공한다. 반응의 절편을 효소Nc0l과 Sall로 처리한 다음, pINT97d DNA의 Nc01/Sall-풀린 잔기 플라스미드로 리게이션시킨다. 플라스미드 pINT303이 생성되며, 대장균 K12 W3110으로 형질전환시킨 후 목적하는 프리-프로인슐린을 발현시키기 위한 기제로 사용한다. 발효와 후처리를 실시예 1에서와 같이 실시하고 카복시펩티다제 B반응을 실시한다.

수득된 프리프로인슐린 유도체는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 10)을 갖는다.

서열 10

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Asn Glu His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Thr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Ala His His Arg

Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser file Cys Ser

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

프리프로인슐린 Z는 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에 R¹은 Phe(Bl)이고, R²는 아미노산 잔기 11개를 갖는 펩타이드이며, Y는 Thr(B30)이고, Z는 Ala His His Arg(B3l-B34)이며, R³은 Gly(A2l)이고, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고, B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

이어서 프리프로인슐린 2를 트립신과 반응시켜 인슐린 2를 수득한다. 인슐린 Z는 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에 R¹은 Phe(Bl)이고, Y는 Thr(B3O)이며, Z¹는 Ala His His Arg(B3l-B34)이고, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

인슐린 2은 다음과 같은 아미노산 서열(서열 11)을 갖는다.

서열 11

B쇄 ; Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

쑈r Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Ala His His Arg

A쇄 : Gly lle Val Glu Gln Cys Thr Ser He Cys Ser

Leu Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

[실시예 3]

Gly(A2l)-사람 인슐린-Ala(B3l)-Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH의 제조

발현 벡터를 실시예 1에 따라 설계한다. 플라스미드 pINT50d를 프라이머 쌍 TIR 및 pINT316a(서열 12) 또는 Insult 및 pINT316b(서열 13)와의, 서로 독립적인, 2개의 PCR 반응에 대한 형판으로서 사용한다.

서열 12

5' GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3'

서열 13

5' A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3'

두 반응이 이끄는 PCR 절편은 부분적으로 상대성이고 세 번째 PCR 반응에서 목적하는 인슐린 변종을 코드화하는 완전한 서열을 제공한다. 반응의 절편을 효소Nc0l과 Sall로 처리한 다음, pINT90d DNA의 Nc0l/Sall-풀린 잔기 플라스미드로 리게이션시킨다. 플라스미드 pINT303이 생성되며, 대장균 Kl2 W3110으로 형질전환시킨 후 목적하는 프리-프로인슐린을 발현시키기 위한 기제로 사용한다. 발효와 후처리를 실시예 1에서와 같이 실시하고 카복시펩티다제 B반응을 실시한다.

수득된 프리프로인슐린 3온 다음과 같은 아미노산 서열(서열 14)을 갖는다.

서열 14

Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg

Phe Val Asn Glu His Leu Cys G1y Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr fro Lys Thr

Ala Ala His His Arg

Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser

Leu Tyr Gln Leu Glu Tyr Cys Gly

프리프로인슐린 3는 화학식 2의 인슐린에 상응하며, 이 경우에 R¹은 Phe(Bl)이고, R²는 아미노산 잔기 11개를 갖는 펩타이드이며, Y는 Thr(B30)이며, Z는 Ala Ala His His Arg(B3l-B35)이며, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

이어서 프리프로인슐린 3를 트립신 및 실시예 11에 따라 카복시펩티다제 B와 반응시켜 인슐린 3을 수득한다. 인슐린 3은 화학식 1의 인슐린에 상응하며, 이 경우에 R¹은 Phe(Bl)이고, Y는 Thr(B30)이며, Z는 Ala His His(B3l-B34)이고, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 29)이다.

인슐린3은 다음과 같은 아미노산 서열(서열15)을 갖는다.

서열 15

B쇄 : Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Yal Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg 71y Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Ala Ala His His

A쇄 : Gly lle Val Glu Gln Cys Thr Ser lie Cys Ser

Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

[실시예 4]

실시예 2에 따라 제조한 인슐린 2를 실시예 11에 따르는 카복시펩티다제 B와 반응시켜 인슐린 4를 수득한다. 인슐린 4는 화학식 1의 인슐린에 상응하며 이 경우에 R¹은 Phe(Bl)이고, Y는 Thr(B30이며, Z는 Ala His His(B3l-B33)이고, R³은 Gly(A2l)이며, A2 내지 A20은 사람 인슐린 A쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 20)이고 B2 내지 B29는 사람 인슐린 B쇄의 아미노산 서열(아미노산 잔기 2 내지 7)이다.

인슐린 4는 다음과 같은 아미노산 서열(서열 16)을 갖는다.

서열 16

B쇄 : Phe Val Asn Gln Mis Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr

Ala His His

A쇄 : Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser file Cys Ser

Leu Tyr Glu Leu Glu Asn Tyr Cys Gly

디성파이드 브릿지는 화학식 1에 기술된 것과 같이 형성시킨다.

[실시예 5]

인슐린 유도체의 아연 결합

인슐린 제제(0.243mM 사람 인슐린, 0.13M NaC1, 0.1% 페놀, Zn⁺⁺80㎍/㎖(1.22mM), 10mM 트리스/HCl, pH 7.4)를 157℃서 10mM 트리스/HCl(pH 7.4)에 대해 총 40시간(16시간 후 완충제를 교환하고 24시간)동안 투석시킨다. 투석액을 산성화하고 인슐린 농도는 HPLC로 결정하고 아연 농도는 원자흡수 분광기로 결정한다. 아연값은 인슐린을 함유하지 않는 대조 뱃치의 아연 함량을 사용하여 보정한다. 표1에 결과를 나타내었다:

[표 1]

[실시예 6]

개에서의 사람 인슐린의 작용 프로필의 아연 의존도

투여 : 피하

용량 : 0.31U/㎏; 제제의 pH 4.0

실험당 사용한 개의 수(n)는 6이다.

표 2에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.

[표 2]

[실시예 7]

개에서의 Gly(A2l)ABa(B3l)His(B32), His(B33), Arg(B34) 사람 인슐린의 작용 프로필

인슐린 2

실시예 2에 따라 제조한 인슐린 2를 다음 배합으로 사용한다:

글리세를 20㎎/㎖, m=크레졸 2.7㎎/㎖, 인슐린 2 40IU/㎖

IU는 국제단위를 나타내며 인슐린, 예를 들어, 사람 인슐린 또는 화학식 1의 인슐린 차 6nmol에 상응한다. pH는 NaOH 또는 HCl을 사용하여 적정한다.

투여 : 피하

용량 : 0.31U/㎏

시험 개의 수는 6이며 제제의 pH는 4.0이다.

표 3에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.

[표 3]

[실시예 8]

개에서의 Gly(A2l)Ala(B3l)His(B32), His(H33) 사람 인슐린의 작용 프로필

실시예 4에 따라 제조한 인슐린 4를 실시예 7에서와 같이 배합으로 사용한다.

투여 : 피하

용량 : 0.31U/㎏

n=6

제제의 pH 4.0

표 4에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.

[표 4]

[실시예 9]

개에서의 Gly(A2l)His(B32), His(B32) 사람 인슐린의 작용 프로필

실시예 1에 따라 제조한 인슐린 2를 다음 배합으로 사용한다

투여 : 피하

용량 : 0.31U/㎏

n=6

제제의 pH 4.0

표 5에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.

[표 5]

[실시예 10]

개에서의 Gly(A2l)Ala(B3l)Ala(B32)His(B33)His(B34) 사람 인슐린의 작용 프로필

실시예 1에 따라 제조한 인슐린 3을 실시예 7에서와 같이 배합하여 사용한다.

투여 : 피하

용량 : 0.31U/㎏

n=6

제제의 pH 4.0

표 6에 혈중 글루코즈를 출발값에 대한 %로 나타내었다.

[표 6]

[실시예 11]

프리프로인슐린 1로부터의 인슐린 제조

실시예1에 따라 제조한 B쇄의 카복시 말단에 하나의 Arg가 있는 인슐린 200㎎을 10mM HCl 95㎖에 용해시킨다. pH가 8인 1M 트리스/HCl(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 5㎖를 가한 후 pH를 HCI 또는 NaCl을 사용하여 8로 적정한다. 카복시켑티다제 B 0.1㎎을 가한다. 90분 후, 아르기닌의 개열이 종결된다 혼합물에 HCI을 가하여 pH를 3.5로 적정하고 역상 칼럼에 펌핑시킨다(PLRP-S RP 300 10μ, 2.5×30㎝, Polymer Laboratories Amherst, MT, USA). 이동상 A는 트리플루오로아세트산 0.1%를 함유하는 몰이다. 상 B는 프리플루오로아세트산 0.09%를 함유하는 아세토니트릴로 이루어진다. 칼럼을 5㎖/분의 유속으로 조작한다. 사용 후, 칼럼을 A 150㎖로 세척한다. 분획 용출을 400분으로 40% B에 대해 22.5의 선형 그래디언트를 적용시켜 실시한다. 분획을 분석상 역상 HPLC로 각각 분석하고 충분한 순도의 Des-Arg-인슐린을 함유하는 분획을 합한다. NaOH를 사용하여 pH를 3.5로 적정하고 아세토니트릴을 회전식 증발기로 제거한다. pH를 6.5로 맞추어서 Des-Arg-인슐린을 침전시킨다. 침전을 원심분리시키고, 물 50㎖로 2회 세척하고 최종적으로 동결건조시킨다. 인슐린 1의 수율은 60 내지 80%이다.

본 발명은 아연 결합력을 증가하여 인슐린 6량체와 Zn⁺⁺을 함유하는 안정한 복합체를 형성하여, 피하 주사시 사람 인슐린 보다 지연된 작용 프로필을 나타내는 인슐린 유도체를 제공한다.

Claims

화학식 1의 인슐린 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염.

위의 화학식1에서, R¹은 페닐알라닌 잔기 또는 수소원자이고, R³유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기이며, Y는 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기이고, Z는 a) 아미노산 잔기 His 또는 b) 히스티딘 잔기를 1개 내지 5개 함유하는, 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산을 2개 내지 35개 갖는 펩타이드이며, A2 내지 A20 잔기는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 A쇄 아미노산 서열 에 상응하고, B2 내지 B29 잔기는 사람 인슐린, 동물 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B쇄 아미노산 서열에 상응한다.
제1항에 있어서, R¹이 페닐알라닌 잔기이고 R³은 Asn, Gly, Ser, Thy, Ala, Asp Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Ala, Thr, Ser 및 His로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고 Z는 a) 아미노산 잔기 His b) 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는 아미노산 잔기를 4개 내지 7개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제1항에 있어서, R¹이 페닐알라닌 잔기이고 R³은 Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu 및 Gln으로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Ala, Thr, Ser 및 His로 이루러진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고 Z는 a) 아미노산 잔기 His 또는 b) 히스티딘 잔기를 1개 내지 2개 함유하는 아미노산 잔기를 2개 내지 7개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제3항에 있어서, 2가 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는 아미노산 잔기를 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, R¹이 페닐알라닌 잔기이고 R⁷이 Asn과 Gly로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이며 Y가 Thr과 His로 이루러진 그룹으로부터의 아미노산 잔기이고 Z가 히스티딘 잔기를 1개 또는 2개 함유하는 아미노산 잔기를 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제1항에 있어서, R¹이 페닐알라닌 잔기이고 R³이 글리신 잔기이며 트레오닌 잔기이고 Z가 아미노산 잔기를 1개 내지 5개 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제5항에 있어서, 2가 His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg 또는 Ala Ala His His 서열을 갖는 펩타이드인 화학식 1의 인슐린.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 1의 인슐린 여섯 분자로 이루어진 인슐린 6량체와 인슐린 6량체당 아연 5 내지 9물, 특히 인슐린 6량체당 Zn⁺⁺5 내지 7몰을 함유하는 복합체.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따르는 화학식 1의 인슐린 하나 이상 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 하나 이상을 용해된 무정형 및/또는 결정형으로 유효량 함유하는 약제학적 제제.
제9항에 있어서, 아연을 1㎍ 내지 2㎎ 아연/㎖, 바람직하게는 5㎍ 내지 200㎍ 아연/㎖루 추가로 함유하는 약제학적 가제.
제9항 또는 제10항에 있어서, pH가 2.5 내지 8.5인 약제학적 제제.
제9항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 2.5 내지 4.5인 약제학적 제제.
제9항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형시키지 않은 인슐린, 바람직하게는 변형시키지 않은 사람 인슐린, 또는 변형시킨 인슐린, 바람직하게는 Gly(A2l)- Arg(B3l)-Arg(B32)-사람 인슐린을 추가로 함유하는 약제학적 제제.
화학식2의 프로인슐린.

위의 화학식 2에서, R³및 Y는 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식1에서 정의한 바와 같고, R¹은 페닐알라닌 잔기 또는 공유 결합이며, R²은 a) 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기 또는 b) 아미노산 잔기 2개 내지 45개를 갖는 펩타이드이고 잔기 A2 내지 A20과 B2 내지 B29는 사람 인슐린 동물 인슐린, 또는 인슐린 유도체의 A쇄 및 B쇄 아미노산 서열에 상응하고, 21은 히스티딘 잔기를 1개 내지 5개 갖는, 유전적으로 코드화할 수 있는 아미노산 잔기를 2개 내지 40개 갖는 펩타이드이다.
제14항에 있어서, R²가 아미노산 잔기를 2개 내지 25개 갖는 펩타이드인 화학식 2의 프로인슐린.
제14항 또는 제15항에 있어서, R⁷가 아미노산 잔기를 2개 내지 15개 갖는 펩타이드이며 Met Lys 및 Arg로 이루어진 그룹으로부터의 아미노산 잔기가 카복실 말단에 위치하는 화학식 2의 프로인슐린.

※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.