KR970005049B1 - 바쿨로비루스 발현 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물 숙주세포, 상기 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형 망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

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Description

바쿨로비루스 발현 벡터 시스템, 이 벡터 시스템을 포함하는 이종성 무척추동물숙주세포, 상기 벡터 시스템에 의해 생산되는 가용성의 정제된 야생형망막아세포종 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드의 생산 방법

제1도는 pp110^RB합성용 바쿨로비루스(baculovirus) 발현 벡터의 제조과정을 나타낸 도식이고 ;

제2A도는 ppRB로 감염된 곤총 세포의 웨스턴 블롯(Western blot)이고 ;

제2b도는 세포를 감염시킨 후 시간 경과에 따른 세포 추출액을 동정하는 웨스턴 블롯이고 ;

제3a도는 RB 단백질의 세포내 위치를 나타낸 광학 현미경 사진이고 ;

제3b도는 감염된 Sf9 세포의 광학 현미경 사진이고 ;

제4도는 곤충 세포 내에서의 RB 단백질의 인산화 반응과 탈인산화 반응의 분석을 나타내는 자동 방사성 사진이고 ;

제5도는 미정제 용해물, 감염된 Sf9 세포, 및 pMG3-245 항-RB로부터의 용출물을 전기 영동 분석한 것이고 ;

제6a도는 10% SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색에 적용된 융합 단백질 및 바쿨로비루스-발현된 pp110^RB의 사우스웨스턴 DNA 결합 분석을 나타낸 것이고 ;

제6b도는³²P-표지된 DNA 단편과 함께 항온 처리하고, 제6a도를 산출하는데 사용된 겔에 평행한 겔에서 취한 블롯의 자동 방사성 사진이고 ;

제7도는 바쿨로비루스-발현된 RB 단백질과 SV40 T 항원과의 복합체 형성을 나타내는 크로마토그램(chromatogram)이며 ;

제8도는 정제된 RB 단백질을 Saos-2 세포의 세포질 속으로 주입한 후의 핵 전위를 나타내는 사진이다.

본 발명은, 일반적으로, 유전자 단백질 생성물의 제조 방법 및 종양 발생을 억제시키기 위하여 세포를 치료하는 세포 치료 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 일반적으로, 세포 요법, 및 종양 발생을 억제시키기 위하여 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 승인번호 제EY05758하의 정부지원과 국립 보건원(National Institu te of Health) 및 캘리포니아 주립대학에 의해 이루어진 것이다. 정부는 본 발명에 있어서 특별한 권리를 갖고 있다.

인간과 동물의 조직(tissue)은 오랫동안 연구되어 왔으며 무수한 결함들이 세포적 수준에서 규명되어졌다. 이러한 결함들 중 상당수가 유전적 근거를 갖고 있으며 많은 경우에 있어서 유전자에 결함이 있거나 유전자가 결손된 것에 기인한 것이다. 상기 결함들은 점 돌연변이 또는 그밖의 원인들에 의한 결과로서 유전자 자체내의 뉴클레오티드 서열의 와해 또는 비정상적 변화를 유발한다. 기능 장애 유전자의 궁극적 결과는 물론 유전자 단백질 생성물을 생성하지 못하거나 나체내에 결함이 있는 유전자 단백질 생성물을 생성하는 것이다.

사람이나 동물에 있어서 결함이 있는 유전자를 확인하는 방법으로서, 유전자 요법을 실시할 수 있다. 이때에는 기형이거나 결함이 있는 유전 물질을 수정할 목적에서 치료할 세포의 핵으로부터 클로닝(cloned)된 유전자를 전달할 수 있다. 이러한 방법에서 사용되는 물질은 생산 비용이 비싸며 정교한 실험장비와 정교한 분자 유전학 기술의 실시가 요구된다. 그러한 기술은, 대부분의 경우에 있어서, 고도로 정교한 비교적 소수의 분자 유전학 실험실에 제한되어 있으므로 보편적으로 이용할 수는 없다.

유전자 치료방법의 높은 비용 및 보편적 이용 가능성의 결여로 인하여 세포 요법의 다른 대응책이 바람직하게 되었다. 단백질 생성물의 분자구조 및 기능을 분석하므로써 그러한 생성물을 생성하는 유전자의 상태에 대한 결론을 이끌어내는 것이 가능하게 되었다. 유전자 단백질 생성물이 가령, 신체의 종양 억제 기전을 결정하기 위하여 유전자간의 상호 작용을 평가하는데 이용되는 경우도 종종 있다. 종양 억제 기전에 관해서는 앞서 출원된 모(parent) 특허 출원들을 참고해 볼수 있다. 유전자의 기능 및 상호 작용을 쉽게 규명하기 위해서는, 확실하고 비용이 적게 들며, 신뢰성 있고 예견할 수 있는 방법으로 많은 양의 단백질을 제공할 수 있는 유전자 단백질 생성물의 제조 방법을 택하는 것이 매우 바람직할 것이다.

유전자의 기능 및 상호 작용을 규명하는데 있어서의 유전자 단백질 생성물의 가치뿐만 아니라, 결함이 있는 유전자 상태를 치료하기 위하여 단백질 그 자체를 사용하기도 한다. 그러한 경우에 있어서는 적당한 유전자 단백질 생성물을 결함이 있는 유전 물질을 가진 세포내로 도입하는 것이 편리하며 효과적이다. 어떤 경우에 있어서는 상기 단백질 생성물을 전달하는 것이 유전물질 그 자체를 투여하여 치료하는 것보다 비용이 적게 들며 훨씬 용이하게 수행할 수 있다.

단백질 요법에 대해서는 본 명세서와 비슷한 시기에 출원된 관련 특허 출원에 언급된 것들을 참고할 수 있다.

유전자 단백질 생성물의 중요성을 인식할 결과, 거의 정제된 형태로 상기 유전자 단백질 생성물을 제조 및 분리하는 기술을 이용하는 것이 매우 유익하게 되었다. 손상되지 않았으며 생화학적으로 활성을 나타내는 단백질을 다량으로 사용할 수 있게 된 것은 치료학적 사용분야 뿐 아니라 유전기전에 게재된 생화학적 특성 및 분자 운동을 연구하는데 있어서 주목할 만한 발전을 나타내는 것이다.

대규모 생산과는 별개로 실험 목적으로 사용될 때는 단백질 자체를 합성하여 생성하는 방법뿐 아니라 세포로부터 유전자 단백질 생성물을 얻는 방법을 이용하는 것이 일반적이다. 세포로부터 유도해내는 경우에, 세포의 단백질은 극히 소량으로 존재할 따름이다. 따라서 천연의 세포로부터 충분한 양의 단백질을 유도하고자 하는 것을 비실용적이다.

단백질을 합성하여 생성하는 방법에 있어서, 유전자의 암호 서열을 박테리아 발현 벡터내로 도입하여 단백질을 발현시키는 방법은 부분적으로만 성공되었다. 박테리아를 이용하여 생성된 단백질들은 용해도가 낮았다. 박테리아 발현 시스템을 사용할 경우의 또 다른 단점은 박테리아 세포가 진핵세포의 단백질을 변형시킬 수 없음으로 인하여, 정상적 기능을 수행하기 위해 해독후(post-translational)변형이 요구되는 단백질의 경우에는 그러한 단백질의 분석결과가 잘못될 수도 있다는 것이다. 요약하면, 박테리아를 통하여 생성된 단백질은 용해도가 낮고 분자적 결함이 있을 수 있으며 따라서 그것의 가치가 제한된다.

단백질 생성물을 제조하는 통상의 실험실적 기술로는 충분한 양을 생산할 수 없으며, 또 일관되게 충분히 정제된 생성물을 얻을 수 없다. 특정 단백질 생성물을 생산하는데 있어서, 대표적인 단점의 예로서는 폴리펩티드를 생성하기 위하여 이. 콜리(E. coli)에서 발현시키며 TrpE-RB 융합 단백질을 형성하고 T7 RNA 폴리머라제의 발현을 이용하는 것을 들 수 있다. 이러한 방법들은 정교한 생화학적 기술이 수행될 것을 요구하는 비교적 복잡한 방법들로 판명되었다. 게다가 그러한 방법들은 목적하는 폴리펩티드를 단지 소량밖에 생성할 수 없는 심각한 한계성을 갖고 있다. 또, 상기 방법들에 의하여 생성된 폴리펩티드들은 인산화되어 있지 않는 등, 분자적으로 적합하지 아니한 경우도 종종 있다.

그러므로 유전자 생성물인 폴리펩티드의 중요성의 견지에서 볼 때 목적하는 생화학적 및 생물리학적 특성을 가진 폴리펩티드를 충분한 양만큼 생산할 수 있는 방법을 택하는 것이 매우 바람직하다.

유기체를 건강한 상태로 유지하는데 있어서의 유전자의 기능을 이해하는데 있어 상당한 진보가 이루어졌다. 적합한 단백질을 생성하는 세포내 유전자의 결함이 유지체에 있어서의 각종 병변의 원인이 된다는 것은 일반적으로 알려진 사실이다. 상기한 결함은 유전자 전체의 결손에 의한 것이거나 또는 다양한 이유로 인한 유전자 기체내의 결함에 기인한 것일 수 있다. 이러한 요인들을 인식하는 것으로부터 유전자 요법에 있어서의 의미있는 발전이 이루어졌다.

예를들어 유년기의 신장암인 윌름스(Wilm's) 종양은 제11 염색체상의 유전자 불활성화에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 미세 세포 융합에 의한 단일 염색체 전달 기술을 이용한 결과 정상적인 제11 염색체를 월름스 종양 세포내로 도입하면 종양 발생이 억제된다는 사실이 입증되었다. 한편 X 염색체 및 제13 염색체를 도입하는 것은 이러한 효과를 나타내지 않았다.

사람의 염색체 전부를 전달하는 것이 실험적인 근거에서는 어떤 가치가 있다. 하더라도 유전적 결함을 치료하기 위하여 그러한 전달을 고려하는 것은 가능하지 않다. 한 이유로서, 치료학적으로 사용하기 위하여 적합한 염색체를 제조하는 것은 매우 어렵고 많은 시간이 소요되며 비용이 많이 드는 일이다. 따라서 그러한 기술은 별로 사용되지 않고 있다.

염색체 전부를 치료에 사용하는 것이 바람직하지 않은 상황에서, 다음으로 논리적으로 고려해볼 수 있는 것은 적당한 유전자를 환자의 전신에 또는 최소한 수술 부위에라도 전달하는 것이다. 그러한 시도는 염색체 전부를 전달하는 것보다는 보다 가능성이 있다 하더라도 유전자 요법은 특정하게 사용되는 경우에 한해서만 바람직한 것이다.

이러한 일에 있어서, 적당한 핵산 물질을 분리하고 서열을 결정하여 클로닝(cloning)하는 데에는 많은 비용과 시간이 소모된다. 또 그러한 기술은 정교한 분자 유전학 기술을 필요로 하는 것으로서 전세계적으로 소수의 제한된 지역에서만이 가능하다. 더욱이 오늘날에 있어서는 치료에 사용하기에 적합한 물질을 대량생산하는데 있어 상기 기술은 적합하지 않다.

전술한 사항들을 검토해볼 때, 비교적 비용이 적게 들고, 신뢰성이 있으며, 보다 입수가 용이하고 생화학적 반응이 특이적인 물질을 사용하고 생체 기구적 기술을 이용하여 세포 단계에서의 특이적인 치료방법을 선택하는 것이 매우 바람직할 것이다. 또 억제, 즉 종양의 억제와 같은 변화를 초래하기 위하여 치료용 생성물을 세포 단계에서 전달할 수 있는 치료 방법을 선택하는 것이 매우 바람직할 것이다. 또 결함이 있는 세포에 용이하게 그리고 효과적으로 전달될 수 있는 생성물을 지속적으로 정제된 상태로 다량을 제조하는 것도 물론 매우 바람직한 일이다.

본 발명의 주목적은 일반적으로 안전하고 특이적인 치료방법 및 암 억제의 조절에 유용한 생성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제2의 목적은, 암 종양의 억제 및 제거에 특이적이며 생체 기구적 방법 및 생성물을 이용하는, 암 억제를 조절하기에 유용한 생성물 및 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 제3의 목적은 세포 레벨 및 세포내 레벨에서 작용하여 암을 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제4의 목적은 결함이 있거나 돌연변이인 유전자 또는 결실 암억제 유전자로 야기된 상태를 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이며, 이때 조성물이 활성 성분은 자연적으로 생성되거나 혹은 합성된 생성물이다.

본 발명은 종양을 억제시키기 위하여 특이적인 암 억제 유전자 단백질 생성물을 손상된 세포내로 전달하는 세포 치료방법을 포함한다.

본 발명은 통상적인 방사선 조사나 화학 요법의 필요성을 경감시킨 암 치료 방법을 제공하는 것이다. 또 본 발명 기술은 암에 대한 유전적 소인은 발견되었으나 종양 발생이 시작되기 전인 초기 단계에서도 사용될 수 있다.

본 발명의 중요한 장점은 편리하고 비교적 저렴한 방법으로 암 억제 유전자 단백질 생성물을 이용하여 세포 레벨에서 암을 억제시킨다는 것이다.

세포내에서 하나 혹은 그 이상의 암 억제 유전자의 불활성화가 암을 유발시키기에 충분한 것인가에 대한 의문은 남아 있지만 유전자 단백질 생성물을 세포내로 도입하는 것은 악성 종양의 치료에 있어서 신규하여 유익한 시도이다. 본 발명의 또 다른 장점은, 세포에 유독한 통상적인 암치료 방법과는 달리, 본 명세서에서 개시하고 있는 세포 치료 방법으로는 유기체에 대한 손상을 최소화 하면서 세포 레벨에서 유익한 변화를 달성할 수 있다는 것이다.

본 발명의 주목적은 손상되지 않은 활성 유전자 생성물 폴리펩티드의 충분한 양을 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한, 천연 발생 폴리펩티드와 구조 및 기능면에서 동일한 특이 유전자 생성물인 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하는 것이다.

간단히 말해서, 상기한 본 발명의 목적들은 유전물질을 곤충의 세포내로 전달하여 목적하는 폴리펩티드의 충분한 양을 생성하는 방법을 제공하므로써 실현된다. 예를 들면 적당한 벡터를 이용하여, 클로닝된 유전자, 유전자의 단편 또는 유전자 유도체를 충분한 양의 고순도 단백질을 생성할 수 있는 숙주 세포내로 전달한다.

본 발명의 중요한 장점은 세포 레벨에서 유전자의 기능을 고찰하기 위하여 양질의 폴리펩티드를 충분한 양만큼 생성하는 방법을 제공한다는 것이다.

본 발명의 또 다른 장점은 그러한 생성을 함에 있어서 비교적 저렴한 비용의, 편리하고 신뢰할 수 있으며 재현성 있는 방법을 제공한다는 것이다.

본 발명의 장점은 또한, 세포 및 아세포 레벨에서 유전자간의 상호작용을 규명하기 위한 양질의 폴리펩티드를 충분한 양만큼 제공할 수 있다는 것이다.

상기 언급한 본 발명의 목적 및 다른 목적들, 본 발명의 특징, 그리고 그러한 것들을 얻기 위한 방법 및 발명 그 자체는 첨부한 도면과 함께 본 발명의 실시 양태의 하기 상세한 설명에 의해 좀더 명료하게 이해될 것이다.

본 출원에 인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서에 삽입 기재되어 있다. 상세한 설명은 하기 개요에 의거하여 기술한다.

A. 일반적 설명

B. RB 유전자 생성물의 예

B1. 재조합 바쿨로비루스의 제조

B2. 감염된 곤충 세포에서의 외인성 RB 단백질의 발현

B3. 핵의 위치 탐지 및 외인성 RB 단백질의 해독 이후의 (post-translational) 인산화 반응

B4. 감염된 곤충 세포로부터의 RB 단백질의 정제

B5. DNA-결합 활성 및 SV40 T 항원과의 특이 복합체 형성

B6. 정제된 RB 단백질의 핵의 전위

B7. 요약

A. 일반적 설명

유전 물질을 곤충 세포 배양물에 전달하여 배양시키므로써 특정 유전자 단백질 생성물을 생성하는 유전자 단백질 제조 방법이 발명되었다. 본 발명을 이용하여, 충분히 정제되어 역가가 높고 손상되지 않았으며 생화학적으로 활성을 나타내는 단백질을 생성하였다.

본 발명의 발현 시스템은 다양하게 이용된다. 따라서, 예를 들면 클로닝된 사람 유전자와 동물 유전자 및 그들의 단편, 동류체, 유도체 및 그것들의 일부를 사용하여 목적하는 단백질 생성물을 생성할 수 있다. 유전자는 세포 레벨에서 다른 유전자와 상호 작용하므로 상기 방법으로 생성된 단백질 생성물을 사용하여 결함이 있는 세포를 치료하고 유전자의 기능을 규명할 수 있다.

유전자 단백질을 생성함에 있어서, 곤충 세포를 사용하는 것이 적합한 것으로 확인되었는데, 이는 곤충 세포가 진핵 세포의 특성을 갖고 있기 때문이다. 유전 물질을 세포 배양물로 전달하는 데에는 비루스성 벡터와 같은 통상의 벡터를 사용할 수 있다.

예를 들면 RB 유전자 단백질 생성물을 생성하기 위하여 곤충세포 배양물의 비루스성 벡터가 사용되어 왔다. 이러한 관점에서, 배양된 곤충 세포내에서 재조합 단백질을 다량으로 생성하는 데에는 바쿨로비루스인 오토그라파 캘리포니카 핵의 다면성 비루스증 비루스(Autographa califonica nuclear polyhedrosis virus : AcNPV)가 헬퍼가 필요 없는 비루스성 발현 벡터로서 사용된다. 상기 비루스는 배양된 폴아미윔(Fall Army Worm)이 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda : (Sf9)) 세포내에서 증식된다. 상기 비루스는 폴리헤드린(polyhedrin) 유전자의 일시적으로 조절되는 강력 프로모터를 갖고 있으며 상기 유전자의 생성물은 용균성 감염중에 생성된 세포 단백질 총량의 50% 이상을 차지한다. 생체내 재조합에 의하여 외부 유전자의 암호서열이 폴리헤드린 프로모터 전사 조절하에 놓이게 되어 많은 양의 단백질을 발현시키게 된다. 또 이렇게 생성된 단백질은 정확히 폴딩(folding) 되어 있고 해독후의 변형이 적절하여 본래 고등한 진핵 세포에서 합성된 단백질과 유사하다.

본 발명은 특정한 암 억제 유전자 단백질 생성물을 손상된 세포로 전달하여 종양을 억제시키는 세포 치료방법이다. 이때의 유전자가 결손되었거나 유전자에 결함이 있어서 세포내의 단백질 발현에 있어 이상을 초래한다는 점에서 결함이 있는 것이다.

본 발명의 방법은 결함이 있는 유전자에 관련된 유전자 단백질 생성물을 이용하는 것에 관한 것이다. 정제된 단백질 생성물은 손상된 세포내로 전달되어 가령, 종양을 억제시킨다. 상기 생성물은 약학적으로 적합한 담체내에서 전달되어져서 세포 레벨 또는 아세포 레벨에서 단백질 생성물이 작용하는 것을 가능하게 한다.

그러한 방법의 예로서, 암 억제 유전자인 RB 유전자의 단백질을 RB 유전자가 결손되었거나 또는 RB 유전자에 결함이 있는 세포내로 전달하였다. RB 유전자에 관하여 좀더 많은 정보를 얻고자 한다면 본 명세서에 언급된 모(parent) 특허 출원을 참고할 수 있다.

바람직한 예로서, 성장중인 망막의 희귀한 유년기 암인 망막아종(retinoblastoma)은 열성 종약 형성의 연구에 있어서 모범적 모델이 되고 있다. 상기 종양에 게재된 유전 인자가 염색체 13q14에 위치하는 것과 그것이 열성이라는 증거에 근거하여, 암 억제 유전자로 추정되는 망막아종 민감성 유전자(RB)가 클로닝 되었다. 상기 유전자는 2×10⁵개의 염기를 가진 게놈 DNA내에 본산된 27개의 엑손(exon)을 함유하여 검사한 모든 정상조직내에서 4.7×10³개의 염기를 가진 mRNA 전사체를 발현시킨다. 상보적 DNA 클론의 서열을 분석하여 928개의 아미노산을 가졌을 것으로 예상되는 단백질을 암호화할 수 있는 DNA 염기 배열을 밝혀 내었다. RB cDNA 서열로부터 예상할 수 있는 선별된 에피토프(epitope)에 대하여 생성된 항체를 이용하여 RB 유전자 생성물은 110,000-114,000의 상대 분자량(Mr)을 가진 핵의 인산 단백질로서 동정되었으며 pp110^RB로 명명되었다.

망막아종 이외의 몇몇 다른 유형의 종양 형성에도 RB 유전자 기능의 상실이 관련되어 있으며 이런 유형의 종양으로는 유방암, 골육종, 전립선암 및 폐의 소세포 암을 들 수 있다.

레트로비루스(retrovirus)를 매개로 하여 RB 유전자를 망막아종, 골육종 또는 전립선 암종 세포내로 재도입하면 누드 생쥐(nude mouse)에서의 종양 발생과 같은 신생물 표현형의 몇몇 양상이 확실히 억제된다는 것이 최근 입증되었으며 이는 RB 유전자의 종양 억제 기능에 대한 직접적인 증거가 된다. 그러나 이러한 생물학적 활성의 분자적 근거는 아직 밝혀지지 않았다.

현재까지, 암 억제 유전자의 단백질 생성물은 세포내에 소량으로 존재하여 충분한 양을 얻기가 힘들었으므로 그러한 단백질의 생화학적 특성 및 생물학적 기능을 규명하는 데에는 많은 어려움이 있었다. 이점에 관해서는 본 출원과 유사한 시기에 출원된 유전자 단백질 생성물의 제조 방법이란 명칭의 특허 출원을 참고할 수 있다.

특정 유전자 단백질 생성물을 유전자에 결함이 있거나 또는 유전자가 결손된 세포로 전달하는 세포 치료 방법이 발명되었다. 본 발명을 이용하여 충분히 정제된 적당양의, 손상되지 않은 생화학적 활성 유전자 생성물인 단백질을 치료학적으로 유효한 용량으로 결함이 있는 세포에 전달할 수 있다.

본 발명의 세포 치료방법은 이용 범위가 넓다. 상기 단백질 생성물은 결함이 있는 세포의 치료에 이용될 뿐 아니라 유전자의 기능을 규명하는 데에도 이용할 수 있는데 이는 유전자가 세포 레벨에서 다른 유전자와 상호 작용하기 때문이다.

구체적인 예로서 망막아종 유전자 단백질 생성물인 pp110^RB는 RB 유전자에 결함이 있거나 또는 RB 유전자가 결손된 진핵 세포의 치료에 널리 사용되고 있음을 제시할 수 있다.

정제된 상기 단백질은 천연의 사람 pp110^RB와 동일하게 DNA와 결합하여 SV40 T 항원과 함께 특이적인 복합체를 형성할 수 있음이 밝혀졌다. 미량 주입후 단백질의 핵으로의 전위가 급속히 일어나는 것은 정제된 유전자 단백질 생성물의 활성 및 치료학적 이용을 한층 더 지지하는 것이다.

B. RB 유전자 생성물의 예

이하에서는 본 발명의 pp110^RB단백질을 생성하기 위한 방법에 대해 보다 상세히 설명하고자 한다. 망막아종 유전자 뿐 아니라 그러한 단백질에 관한 정보를 점더 얻고자 한다면 하기의 모 특허 출원을 참고할 수 있다.

RB 유전자와 같은 암 억제 유전자 생성물의 생화학적 특성 및 생물학적 기능을 규명하는 데에는, 정제된 단백질의 충분한 양을 얻기가 힘들었으므로 많은 어려움이 있어 왔다. 이는 상기 단백질이 세포내에 소량으로 존재하는 것에 일부 기인하며 또 박테리아성 발현 벡터내로 유전자의 암호서열을 도입하여 단백질을 발현시키고자 한 시도가 단지 부분적으로만 성공한 것 때문이기도 한다. 이러한 점들을 고려해 볼 때 현재의 기술에 의해 야기되는 문제점들은 클론된 유전자를 진핵 세포 시스템에서 발현시키므로써 극복될 수 있다고 결론지어진다. 본 발명의 구체적인 예는 RB 유전자 단백질 생성물의 제조에 관한 것이지만 본 발명은 다른 진핵성 유전자 단백질 생성물에도 관련된 것으로서 이용될 수 있다. 그러한 진핵성 유저자로는 암 억제 유전자를 들 수 있지만 이것에 제한되는 것은 아니다.

바쿨로비루스인 오토그라파 캘리포니카 핵의 다면성 비루스중 비루스(AcNPV)는 배양된 곤충 세포에서 재조합 단백질을 다량 생산하는데 있어서 헬퍼가 필요없는 비루스성 발현 벡터로서 적합하다고 공지되어 있다. 이 비루스는 배양된 폴아미 웜인 스포돕테라 프루지페르다(Sf9) 세포내에서 증식하며 폴리헤드린 유전자의 일시적으로 조절되는 강력 프로모터를 가져서 상기 유전자의 생성물은 용균성 감염 시기 동안 생성된 세포 단백질 총량의 50% 이상을 차지한다. 생체내 재조합에 의하여 외부 유전자의 암호 서열이 폴리헤드린 프로모터의 전사 조절하에 놓여질 수 있으며 이로써 많은 양의 단백질을 발현시킬 수 있다. 또 그러한 단백질들은 원래의 고등 진핵 세포내에서 생성된 단백질과 같이 폴딩이 정확하며 해독후 변형이 적절하게 되어 있다.

바쿨로비루스 시스템에 의하여 기능적인 RB 단백질을 발현시킬 수 있는지를 시험하기 위하여 RB 유전자의 암호 서열 전체를 함유하는 클로닝된 사람 RB cDNA를 AcNPV 발현 벡터내로 도입하여 그 재조합 비루스를 곤충 세포내에서 증식시켰다. 숙주-벡터 시스템에 의하여 고농도의 사람 pp110^RB가 성공적으로 발현되었다. 생성된 상기 단백질은 인산화되어 감염된 세포의 핵에 정확하게 정착한다. RB 단백질의 정제방법 또한 개발되었다. 정제된 상기 단백질은 원래의 사람 pp110^RB와 마찬가지로 DNA와 결합하여 SV40 T 항원과 특이적 복합체를 형성할 수 있음을 발견하였다. 미량 주입후, 상기 단백질의 즉각적인 핵 전위는 정제된 RB 단백질의 활성을 일층 지지하는 것이다.

B1. 재조합 바쿨로비루스의 제조

바쿨로비루스 발현 시스템 내에서 RB 단백질을 최대로 생성하기 위하여 RB 유전자의 5' 비암호 서열의 대부분이 결실된 재조합 전이 벡터를 제조하였다. 부위 특이적 돌연변이에 의하여, 두 개의 BamH1 부위가 RB cDNA의 제116 및 제2935 뉴클레오티드로 도입되어 재조합 전이 벡터의 제조를 용이하게 할 수 있었다. 제1도에 도시된 바와 같이, 생성된 pAcYM1/RB2.8은 폴리헤드린 5' 비암호 서열 및 이것과 융합된 RB cDNA의 5' 비해독 부위(23염기쌍), 그리고 완전한 암호 서열전체(60염기쌍)를 함유하는 mRNA를 암호화 한다. 상기 재조합 유전자는 제139 뉴클레오티드에 위치한 원래의 RB 개시 부위 상부의 ATG 코돈들을 함유하지 않는다. 따라서 이 재조합 유전자는 비융합성의 RB 단백질 전체를 암호화 한다.

제1도는 전이 벡터 pAcYM1을 나타내고 있는데, 이 벡터는 ATG 개시코돈의 A를 포함하여 폴리헤드린 유전자의 상류 서열전부와 이어서 존재하는 독특한 BamH1 부위를 가지고 있다. 상기 전이 벡터는 마쯔라등의 문헌[J. Gen. Virol., 68 : 1233-1250,(1987)]에 제시되어 있다. pRB 44-2플라즈미드성 pGEM1(Promega)의 BamH1 부위내로 서브클로닝된(subcloned) 뉴클레오티드 116 내지 2935의 완전한 RBcDNA 암호 서열을 함유하고 있다. 상기 재조합 바쿨로비루스 벡터 pAcYM1/RB 2.8(미합중국 모식균 배양 수집소에 1991년 6월 18일자로 ATCC 68628호로 기탁)은 pRB 44-2에서 유래한 BamH1 단편(2.8×10³염기)를 pAcYM1의 BamH1 부위에 적절한 배향을 갖도록 삽입하므로써 RB 유전자의 전사가 폴리헤드린 프로모터의 직접적인 조적하에 놓이도록 제조하였다.

pp110^RB의 합성을 위한 바쿨로비루스 발현 벡터를 제조하기 위해서는 하기의 문제들을 고려하였다. pRB 44-2는 pGEM1의 BamH1 부위내로 서브클로닝된 뉴클레오티드 116 내지 2935의 완전한 RB cDNA 암호서열로 구성된다. pAcYM1은 폴리헤드린 유전자에 인접된 비루스성 DNA 서열의 EcoR1 단편(약 7×10³염기)을 함유하고 있는데, 이때 상기 유전자내의 리더(leader) 서열은 완저하게 남아 있지만 폴리헤드린 암호 서열은 ATG의 첫 번째 A를 제와하고는 모두 BamH1 링커(linker)로 대체되어 있다. 상기 재조합 바쿨로비루스 벡터 pAcYM1/RB 2.8은 폴리헤드린 프로모터-RB cDNA 융합체를 함유하는 것으로서 RB BamH1 단편(2.8×10³염기)을 pAcYM1의 BamH1 부위에 삽입하므로써 RB 유전자의 전사의 폴리헤드린 프로모터의 직접적 조절하에 놓이게 되도록 제조하였다. 융합체의 접합부분의 서열이 제1도의 하단에 나타나 있는데 여기에서 밑줄친 부분이 BamH1 링커이며 이를 기준으로 좌측의 부호는 폴리헤드린 므로머터를 나타내며 우측의 부호는 RB cDNA 서열을 나타낸다. 제1도상의 *a(+ 1)은 폴리헤드린 유전자의 해독 개시 코돈 ATG의 첫 번째 A를 나타내며 RB의 ATG(뉴클레오티드 139)를 이용하는 융합된 유전자의 해독은 화살표로 지시해 놓았다.

지질감염(lipofection,BRL)을 이용하여 pAcYM1/RB 2.8 DNA를 야생형 오토그라파 캘리포나키 핵의 다면성 비루스 DNA로 상호 형질 감염(contransfection)시키므로써 재조합 플라드미드에서 비루스 게놈으로 RB cDNA를 전이시킬 수 있다. 상기 재조합 비루스는, 상동 재조합을 통하여 폴리헤드린 유전자를 RB 대립 유전자로 대체하여 불활성화 시킨 것으로서 감염된 세포내에서 폴리헤드린 교합체를 나타내지 않는 뚜렷한 플라크(plaque) 형태에 의해 동정되었다. 상기 비루스의 플라크를 세차례에 걸쳐 정제하여 RB 가 함유된 바쿨로비루스의 순수한 스톡(stock)을 얻고 이를 AcNPV-Y4 RB로 명명했다.

B2. 감염된 곤충 세포에서의 외인성 RB 단백질의 발현

AcNPY 폴리헤드린 프로모터가 이종의 무척추동물 세포내에서 사람의 RB 유전자의 발현을 추진시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 전에 Sf9 세포를 제조하였다.

스포돕테라 프루지페르다 IPLB-SF21-AE(In Vitro, 13 : 213-217, (1977 ) 참고)의 클론 분리체인 Sf9은 이스트올레이트(3.33g/ℓ), 락트알부민 가수분해 물질(GIBCO) 및 열처리하여 불활성화한 태아상태의 소혈청(10%)(GIMINI)(Bull.1555, (1987) 참고 ; 택사스주, 칼리지 스테이션, 텍사스 농업 실험국)으로 보충된 27℃의 그레이스(Grace's) 곤충 배지내에서 단층 또는 현탁 배양물로 성장시켰다. 세포의 용해볼을 대규모로 제조하기 위해서는 Sf9 세포의 스피너(spinner) 배양물을 EX-CELL 400 무혈청 한정 배지(제이.알.사이언티픽)내에서 성장시켰다. 사람의 T세포 백혈병 세포주인 몰트(Molt)-4 세포는 송아지 혈청(20%)으로 보충된 RPM1 1640 내에서 현택액으로 배양되었다. 골육종 세포주인 사오스(Saos)-2 세포는 태아상태의 소혈청(7.5%)을 보충한 둘베코(Dulbeco)의 변형된 이글(Eagle) 배지내에서 성장시켰다.

AcNPV 폴리헤드린 프로모터가 이종의 무척추동물 세포내에서 사람의 RB 유전자를 발현시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, Sf9 세포를 플라크-정제된 AcNPV-Y4 RB로 감염시켰다. 감염후 40시간이 경과한 뒤에 감염된 세포의 용해물을 수거하여 항-RB0.47 항체로 면역 침전시켰다. 표본을 SDS-PAGE 처리한 후 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

제2a도 및 제2b도는 AcNPV-Y4 RB로 감염된 곤충 세포내의 pp110^RB를 웨스턴 블롯 분석으로 동정한 것을 나타낸다. 제2a도를 살펴보면, 모의 감염된(제2열), AcNPV-Y4 RB로 감염된(제3열) 또는 야생형의 AcNPV로 감염된(제4열) Sf9 세포로부터 감염후 40시간이 경과한 뒤에 세포추출액을 준비하였다. 이때 대조군으로는 사람의 백혈병 세포주인 몰트-4(제1열)가 사용되었다.

pMG3-245 단일 클론 항체로 면역 블로팅하여 제2a도에 나타낸 바와 같이 포유류 세포의 RB 단백질과 (제1열) 길이가 유사한 RB 단백질이 AcNPV-Y4 RB로 감염된 세포의 추출액(제3열)에는 나타나고 있으나 모의 감염(제2열) 또는 야생형의 AcNPV로 감염된(제4열)세포의 추출액에는 나타나지 않는다. 제2b도에 있어서는, RB 단백질 생성에 대한 최적 시간을 결정하기 위하여 AcNPV-Y4 RB로 감염된 세포로부터의 세포추출액을 감염후 시간별로 제조하였다.

상기 용해질을 항-RB0.47 항체로 면역 침전시켰으며 pMG3-245 단일 클론 항체로 면역 블로팅시켰다. 제2b도에서 p110^RB및 pp110^RB는 각각 비인산화된 RB 단백질 및 인산화된 RB 단백질을 나타낸다. 세포를 수확하기 위한 최적 시간을 결정하기 위하여 감염후 기간동안에 RB 단백질의 생성이 기록되어졌다. 제2b도에 나타난 바와 같이 RB 단백질의 생성은 감염후 24시간이 되었을 때 검출할 수 있었으며 그후 12시간이 경과되는 동안 상당히 증가하였다. 단백질이 생성되는 수준은 감염후 계속 유지되어지다가 약 72시간이 되면 세포의 비루스성 용해가 시작되었다. 세포의 용해에 연관된 단백질 분해를 최소화하기 위하여 감염후 40시간경에 겸염된 세포를 통상 수확하였다.

RB 단백질의 발현을 감출하는데 있어서는 AcNPV-Y4 RB를 사용하여 Sf9 세포를 0.5 MOI로 감염시켰다. 감염후 24, 36, 48, 60 및 72시간이 되었을 때 1ml의 용해 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.4 ; 0.2% 노니데트 P-40 ; 1mM EDTA ; 100m M.Nacl ; 50mM NaF 및 1mM PMSF)내에서 5×10⁴해시켜 얻은 용해물을 5분간 원심분리(4℃, 20,000×g)로 정화했다. 상기 과정후 용해물을 항-RBO.47 항체와 배양하여 얻은 면역 침전물을 7.5% SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 페이퍼로 옮겨 통상의 방법으로 처리하였다. 밤새 블로킹(blocking)시킨 후 상기 니트로셀룰로스 페이퍼를 pMG3-245 항-fRB 단일 클론 항체와 3시간 동안 배양하고 이어서 알카리성 탈인산 가수분해 효소가 접합된 염소의 항-생쥐 IgG 및 색형성 물질로 배양시켰다. 이것에 관해서는 문헌[Cell, 54 : 275-283, (1988)]을 참고할 수 있다.

B3. 핵의 위치 탐지 및 외인성 RB 단백질의 해독 이후의 인산화 반응

상기 RB 유전자는 분자량 110,000인 핵의 인산 단백지을 암호화한다. 바쿨로부루스에 의해 생성된 RB 단백질이 곤충 세포내에서 핵에 정착되는지를 결정하기 위하여, AcNPV-Y4 RB로 감염된 Sf9 세포를 감염후 40시간이 지난뒤에 항-RBO.47 항체로 면역 염색시켰다 면역 염색에 의하여 곤충 세포내에서 발현된 RB 단백질의 세포내 위치는 제3a도 및 제3b도에 나타나 있다. 제3a도는 모의 감염된 Sf9 세포를 나타내며 제3B도는 AcNPV-Y4 RB로 감염된 Sf9 세포를 나타낸다. 제3a도 및 제3b도에 나타난 바와 같이 감염된 세포는 비정성적인 거대한 핵을 함유하고 있다. 그러한 상태는 바쿨로비루스의 감염으로 인한 세포병변적 특징이다. 모의 감염된 또는 야생형의 AcNPV로 감염된 Sf9 세포를 항-RBO.47 항체와 배양시켰을 때는 아무것도 염색되지 않았다(제3a도). 그러나 AcNPV-Y4 RB로 감염된 세포의 핵에서만 강력한 염색이 관찰되었다(제3b도). AcNPV-Y4 RB로 감염된 Sf9 세포로부터의 핵 및 세포질 추출물을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅으로 분석한 결과 외인성 RB 단백질이 핵분획에 우세하게 많이 존재함을 확증할 수 있었다.

면역염색분성을 실시함에 있어서 하기의 단계들이 수행되었다. 모의 감염, 야생형 AcNPV 감염 또는 AcNPV-Y4 RB 감염후 40시간 뒤에 Sf9 세포를 폴리-_L-리신(시그마)로 피복된 체임버슬라이드(마일스사이언티픽)상에 뿌리고 밤새 배양시켰다. 스라이드를 하기하는 각 단계 사이사이에 인산염 완충 염수로 세촉하였다 : 세포를 0.04M 인산염 완충액(pH 7.4)에 용해된 4% 포름알데히드로 20분간 또는 아세톤(-20℃)으로 10분간 먼저 고정시키고 메탄올에 용해된 1% H₂O₂내에서 10분간 침지시켰다. 고정된 세포를 PBS내의 정상 염소 혈청으로 10분간 예비 배양한 후, 0.02%트리톤 X-100내에 희석된 토끼의 항-RBO.47 항체로 밤새 배양하였다. 세척후 바이오티닐화된, 염소의 항-토끼 IgG(캘리포니아주, 벌링감, TAGO)를 첨가하였다. 1시간 후, 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제가 접합된 AB 복합체(캘리포니아주, 벌링감, 벡터 연구실)로 45분간 배양한 뒤, 기질과 함께 배양하였다. 상기 기질은 0.05%의 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 및 0.05M의 트리스-HCl(pH 7.6 : 시그마)에 용해된 0.01%의 H₂O₂를 포함하였다. 3 내지 5분 뒤에 세포를 PBS로 세척하여 반응을 중단시켰다. 이어서 상기 세포를 니콘(Nikon)제 광학 조리개 현미경으로 촬영하였다.

제4도는 곤충 세포내에서 생성된 RB 단백질의 인산화 반응 탈인산화 반응의 분석 결과를 나타낸 것이다. AcNPV-Y4 RB로 감염시킨 후 40시간 뒤에 Sf9 세포를³⁵S- 메티오닌 또는³⁵P-오르토포스페이트로 3시간 동안 대사 과정을 이용하여 표지시켰다. 대조군으로서 몰트-4를 포함시켜 세포 용해물을 항-RBO.47항체를 면역 침전시켰다.

³⁵S- 및³⁵P-로 포지된 RB 단백질 면역 복합체를 감자산 탈인산 가수 부해 효소(PAP)로 처치전(제1,2,3 및 4열)또는 후(제1',2',3' 및 4'열)에 SDS-PAGE 로 분리한 뒤 자동 방사성 사진으로 분석했다. 표지되지 않은 세포로부터의 용해물을 이용하는 유사산 탈인산화 반응 실험을 실시했으며 감자산 탈인산 가수분해 효소 처치전(제5 및 6열) 및 후(제5' 및 6'열)에 웨스턴 블롯 분석을 실시했다.

제4도를 좀더 자세히 살펴보면 RB 단백질의 인산화 반응은 다수의 세린 및 트레오닌 잔기에서 일어남을 알 수 있으며 이는 문헌[Oncogene Res, 1:205-214(1989) 및 Cell, 56:57-65(1989)]의 SDS-PAGE에서 나타난 RB 단백질이 분자량이 서로 다른 것에 대한 설명이 된다. 곤충 세포내에서 생성된 RB 단백질이 해독후 인산화 반응이 진행되는지의 여부를 결정하기 위하여 AcNPV-Y4 RB로 감염된 Sf9 세포를 감염후 40시간이 경과했을 때로부터 3시간 동안³⁵S-메티오닌 또는³⁵P-오르토포스페이트로 대사 반응을 이용하여 표지시켰다. 세포추출물을 면역 침전시켜 SDS-PAGE로 분석한후 자동 방사성 사진을 촬영하였다. 이점에 관해서는 제4도의 제2열 및 제4열을 살펴볼 수 있다. 이와 병행하여, SDS-PAGE에서 RB 단백질의 이동성에 미치는 탈인산화 반응 효과를 시험하기 위하여 동일한 추출물에서 유래한 면역 침전성 RB 단백질을 감자산 탈인산 가수 분해 효소(PAP)로 처리하였다. 탈이산 반응 후에는³⁵S 로 표지된 RB 단백질이 이중 밴드에서 분자량 110,000의 단일 밴드(제4도, 제2'열)로 감소되었으며,³⁵P 로 표지된 RB 단백질(제4도, 제4'열)로부터 방사성은 거의 완전히 방출되었다. AcNPV-Y4 RB로 감염된 표지되지 않은 세포로부터의 용해물을 웨스턴 블로팅하여 탈인산화 반응을 분석한 결과 PAP 처리 이후에 밴드가 동일한 양상으로 감소되었음이 나타났다(제4도, 제6열 및 6'열). 이러한 고찰들을 곤충 세포내에서 생성된 RB 단백질이 인산화 되었음을 제시하는 것이며, 상기의 변형은 SDS-PAGE에서 관찰되는 RB 단백질의 분자량이 서로 다를 수 있는 이유가 되고 있다.

Sf9 곤충 세포의 방사성 표지 및 탈인산화 반응 분석을 실시함에 있어서는 하기의 단계들이 수행되어졌다. 감염 후 40시간이 경과했을 때, 60mm 접시(dish)내의 Sf9 세포 (3×10⁶)를 메티오닌 또는 포스페이트가 결핍되고 태아상태의 소혈청(10%)이 보충된 DME 배지로 30분간 배양시켰다. 이어서 상기 세포 배양물에 0.25Ci/ml³⁵S-메티오닌(1134Ci/mmole,NEN) 또는 0.25mCi/ml³²P-오르토포스페이트(담체없음,ICN)를 보충하여 3시간 동안 배양하여 세포를 방사성 표지시켰다. 용해 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.4 ; 0.2% 노니데트 P-40 ; 1mM EDTA ; 100mM MaCl ; 50mM NaF 및 1mM PMSF)내에서 세포추출물을 제조하여 항-RBO.47 항체로 면역 침전을 실시하였다.

표지되지 않은 세포 용해물 뿐 아니라³⁵S또는³²P로 표지된 세포 용해물로부터 면역 침전된 RB 단백질의 2/3를 감자산 탈인산 가수 분해 효소(PAP, 뵈링거)에 의한 탈인산화 반응을 분석하였다1 : 205-214, (1989)). RB 단백질을 함유하는 면역 복합체를 37℃의 반응 완충액(20mM MES, pH 5.5 ; 100mM NaCl ; 1mM MgCl₂; 50류펩틴)내에서 60분 동안 1.5 유니트의 PAP와 함께 배양하였다. 반응이 완료된 후, 7.5% SDS-PAGE에 의하여 RB 단백질을 분석하고 자동 방서성 사진을 촬영하거나 또는 웨스턴 블로팅을 실시하였다.

B4. 감염된 곤충 세포로부터의 RB 단백질의 정제

Sf9 세포를 감염 배수(MOI)가 0.1이 되도록 AcNPV-Y4로 감염시킨 후, 40시간 뒤에 세포 용해물을 준비하였다. 이러한 조건하에서 바쿨로비루스 시스템내에서 발현된 RB 단백질의 총 농도는 감염된 곤충 세포 배양물 1ℓ당 약 17-18mg(10⁹세포)이였다. 이 점에 관해서는 표 1을 참고할 수 있다.

표 1에 나타난 바와 같이 발현된 RB 단백질의 90%(16mg)는 세포 파과후의 상층액에서 나타났으며 불용성분획에는 10%만이 남아 있었다. 상기의 RB 단백질은 세포 용해물(제5도, 제2열)내에서 즉시 검출되었으며, 세포의 단백질 총량의 2.3%를 차지하였다. 단일 단계의 면역 친화성 크로마토그래피 정제 후, 컬럼의 알칼리성 용출물로부터 약 13.5mg의 단백질을 회수하였다. 용출된 RB 단백질의 수도를 측정하기 위하여 25×10 세포에 해당하는 용출물의 분취량을 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색으로 분석했다.

이러한 점에 있어서는 면역 친화성 크로마토그래피에 의한 pp110 의 정체를 나타내고 있는 제5도를 참고할 수 있다. pMG3-245 항-RB 면역 친화성 크로마토그래피로부터의 용출물의 분취량(2.5×10 개의 감염된 세포에 해당) (제3열)뿐 아니라 1×10 개의 모의 감염된(제1열) 또는 AcNPV-Y4로 감염된(제2열) Sf9 세포로부터의 미정제 용해물을 10% SDS-폴리아크릴아미드겔상에서 전기영동시키고 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 분석하였다. 화살표는 예상되는 분자량을 가진 RB 단백질의 위치를 제시하는 것이다.

밀도 측정법으로 판단해 볼 때 본 명세서에서 제시한 단일 정제 단계는 효과적인 것으로서 95%의 순도, 2%의 수율 및 41.3배의 정제 배수를 가진 RB 단백질 제제(제5도, 제3열)을 생성시켰다.

면역 친화성 컬럼의 제조는 슈나이더(Schneider) 등 및 시마니스(Simanis) 등에 의해 제시된 방법에 약간의 변형을 가하여 수행하였다(Chem., 257 : 1076 6-10769, (1982)114 : 88-100,(1985) 참고). 2ml의 단백질 G-아가로스(Genex)를 바이오-래드 컬럼에 채워 넣어 0.01N의 HCl 및 결합 완충액(0.1M 아세트산 나트륨, pH 5.0 ; 0,1M NaCl)로 세척하였다. 15mg의 항-fRB 단일 클론 항체(pMG3-245)를 컬럼에 두 번 적용하여 결합되도록 하였다. 상기 과정 후 컬럼을 0.1M의 보레이트 완충액(pH 9.0)으로 광범위하게 세척한 후, 20ml의 완충액 내에서 비드(bead)를 재현탁시켰다. 디메틸피멜리미데이트 디히드로클로라이드(시그마)를 최종 농도가 40mM이 될 때까지 첨가한 후 생성된 혼합액을 실온에서 1시간 동안 교반하여 가교 결합 반응이 일어나게 하였다. 세척 후 비드에 잔류하는 반응기를 0.1M의 보레이트 완충액(20ml, pH 8.0)내에 용해된 40mM의 에탄올아민-HCl로 실온에서 10분간 차단하였다. 상기 컬럼을 0.2M의 글리신(pH 2.3)으로 세척한 후 트리스 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.4 ; 100mM NaCl ; 1mM PMSF ; 1mM EDTA)으로 중화하여 그 생태로 보관하였다. 원래의 단일 클론 항체 샘플 및 연속되는 단계의 병류 분획의 OD₂₈₀을 측정한 결과 약 10mg의 pMG3-245가 2ml의 단백질 G-아가로스 비드와 쌍을 이루었음을 알 수 있었다.

B5. DNA-결합 활성 및 SV40 T 항원과의 특이 복합체 형성

현재 제시되고 있는 RB 단백질의 생화학적 특성으로는 2가지를 들 수 있다. 그 하나는 DNA에 내재적으로 결합할 수 있는 능력(329 : 642-645(1987) 참고)이며, 다른 하나는 몇몇 DNA 종양 비루스의 종양 단백질과 특이 복합체를 형성할 수 있는 능력54 : 275-283,(1988) ;243 : 934-937, (1989) ;334 : 124-129, (1988) 참고)이다. 바쿨로비루스로 감염된 곤충 세포로부터 정제된 RB 단백질로 공지된 두 개의 생화학적 특성을 시험했으며 이는 단백질의 생물학적 기능과도 연관된 것이다.

제6a도 및 6b도는 사우스웨스턴 DNA 결합 분석을 나타낸 것이다. 바쿨로비루스로 발현시킨 정제된 pp110^RB뿐 아니라 정제된 trpE-RB 융합 단백질(6㎍)을 10% SDS-PAGE에 적용시켰다. 제6a도에 제시된 분석에서는 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 사용한 반면 제6b도의 분석에서는 평행한 겔을 니트로셀룰로스 페이퍼상으로 전기적으로 전달시켰다. 상기 블롯을³²P로 표지된 DNA 단편으로 배양하여 자동 방사성 사진으로 분석했다. 제6a 및 6b도에서는 하기의 것들이 나타나 있다 : 제1열 : RB19-22 ; 제2열 : RB23-27 ; 제3열 : RB19-27 ; 제4열 : AcNPV-Y4 RB로 감염된 곤충 세포로부터 정제된 RB 단백질로 제6a도 및 제6도에 있어서, DNA-결합은 사우스웨스턴 분석법에 의해 분석되었는데 이때 곤충 세포로부터 정제한 RB 단백질 뿐만 아니라 동일한 양의E-RB 융합 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리시켰다. 적재된 단백질의 양은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색으로 확이하였다(제6a도). 이에 평행한 다른 겔은 니트로셀룰로스 막으로 전기적으로 전달한 후³²P로 표지된 DNA로 배양하였다. 단백질에 결합된 DNA를 자동 방사성 사진으로 분석하였다(제6b도). DNA와 상호 작용하는 주도메인을 함유하는 융합 단백질 RB19-27은 두 개의 아(sub)부위 RB19-22 및 RB23-27에 비하여 DNA에 대한 친화력이 20배나 높은 것으로 고찰되었다. 이러한 점에서 볼 때, 정제된 완전한 길이의 RB 단백질이 RB19-27(제6b도, 제4열)과 유사한 강력한 DNA-결합 활성을 나타내는 반면에 제6B도의 제3열은 제1열 및 제2열과 비교할 수 있다. 곤충 세포로부터 정제한 RB 단백질의 DNA 결합 활성은 DNA-셀룰로스 컬럼을 통과시켜 이어서 약 400mM의 MaCl로 용출시켰을 때 잔류하는 단백질에 의해서도 입증될 수 있다.

감염된 곤충 세포로부터 pp110^RB를 정제하는 데에는 하기의 방법을 실시하였다. Sf9 세포를 MOI 0.1의 AcNPV-Y4로 감염시켜서 현탁액(1×10⁶세포/ml, 1000ml )으로 배양시켰다. 감염 후 40시간 뒤에 저속원심 분리로 펠릿(pellet)을 수거하여 세척한 후 추출 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 7.4 ; 0.2% NP-40 ; 1mM EDTA ; 100mM NaCl ; 10%(v/v) 글리세롤 ; 1mM DTT ; 1mM PMSF ; 25㎍/ml 류펩틴 및 50 유니트/ml 아프로티닌 함유)에 재현탁시켰다. 얼음상에서 15분간 배양한 후 상기 표본을 원심분리 (10,000×g, 4℃,10분)로 정화하여 RB가 함유된 상층액을 수거하였다. pp110^RB의 면역 친화성 크로마토그래피를 전술한 바와 같이 단백질 G-아가로스에 연결된 항-fRB 단일 클론 항체를 함유하는 2ml 부피 컬럼상에서 실시하였다. 상기의 상층액을 컬럼을 통하여 4회 통과시킨 후 각 200 베드(bed) 부피씩의 하기 용액들로 연속하여 세척하였다 : 용해 완충액, 500mM의 NaCl을 함유하는 용해 완충액 및 세척액(200mM NaCl ; 1mM EDTA ; 1mM DTT ; 1mM PMSF ; 10% 글리세롤). 결합된 단백질은 알카리성 용출 완충액(20mM 트리에틸아민, pH 10.8 ; 200mM NaCl ; 1mM EDTA ; 1mM DTT ; 1mM PMSF 및 10% 글리세롤 함유)을 이용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 1ml 분획들을 수거하여 1/20 부피의 1M 트리스-HCl(pH 7.5)로 즉시 중화하여 -70℃d서 10% 글리세롤내에 보관하였다.

감염된 곤충 세포로부터 pp110^RB를 정제하는 단계에 있어서, 단백질 총량이 결정되었으며, 이어서 사우스웨스턴 DNA-결합 분석 및 SV40 T 항원 결합 분석이 실시되었다.

면역 친화성 컬럼의 용출 분획내의 단백질 총량은 마이크로-BCA 분석 (PIER CE)에 의해 결정되었다. 용출된 단백질 표본은 SDS-PAGE로 분석했으며, 용출물내의 단백질 총량은 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 및 농도 측정에 의하여 평가되었다. 세포추출물내의 단백질 총량은 블래드포드(바이오-래드) 방법으로 측정되었다(72 : 248-254,(1976) 참고). 새포 용출물내의 RB 단백질을 정량하기 위하여 순차적으로 희석된 정제된 RB 단백질을 표준액으로 이용하여 웨스턴 블로팅을 실시하고 농도계에 의하여 밴드의 강도를 비교하였다. 이것에 관해서는 표1을 참고할 수 있다.

통상적인 방법을 이용하여 단백질 블로팅을 실시하였다. 방사성 표지된 DNA로 블롯을 배양시킨 후 보웬(Bowen) 등의 문헌[8 : 1-21(1980)]에 게재된 프로토콜을 실시하였다. 상기 방법은 실온에서 수행되었다. 블롯은 물로 간단히 세정하고, 6M의 우레아 ; 0.2% NP-40으로 각 20분씩 3차례 세척한 후, DNA-결합 완충액(10mM 트리스-HCl, pH 7.0 ; 1mM EDTA ; 50mN NaCl ; 0.2% BSA ; 0.2% 피콜(Ficoll) 400 및 0.2% 폴리비닐 피롤리돈 함유)으로 각 30분씩 4차례 세척하였다. 상기 블롯을³²P로 표지된 DNA를 함유하는 DNA-결합 완충액내에서 30분간 배양시켰다. EcoR1에 의하여 선형화된 pGEM1 DNA를 임의 프라이밍(priming)에 의하여 α-³²P 데옥시뉴클레오티드(아머샴, 3000Ci/mmol 이상)로 포지시킨 후, 프로브(probe)로 사용하였다. 하이브리드화시킨 후, 블롯을 DNA-결합 완충액으로 각10분씩 3차례 세척하고 공기 건조시킨 후 자동 방사성 사진으로 분석하였다.-융합 단백질을 대조군으로 포함시켰다. 각각의-RB 융합 단백질은 함유된 RB 유전자의 액손에 따라 명명되었다. 따라서 RB19-22, RB23-27 및 RB19-27은 각각 19 내지 22의 엑손(아미노사 612-775), 23 내지 27의 엑손(아미노산 776-928) 및 19 내지 27의 엑손(아미노산 612-928)으로부터의 pp110^RB지역에 걸쳐 있다.

SV40 T 항원은 면역 친화성 크로마토그래피에 의하여 Ad-SV X1으로 감염된 293 세포로부터 정제했으며 (53 : 1001-1004, (1985) ;뉴욕 콜드 스프링 하버 187-192면, (1982) 참고), 항-T 단일 클론 PAB 419 항체는 온코진 인코오포레이티드에서 입수하였다. 공지된 복합체 형성 분석을 약간의 변형을 가하여 실시했는데, 이때 바쿨로비루스에 의해 발현된 RB 단백질(800ng)을 1mM PMSF, 25㎍/ml 류펩틴 및 50 유니트/ml 아프로티닌이 함유된 1ml의 EBC 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.0 ; 120mM NaCl 및 0.5% 노니데트 P-40)과 혼합하였다. 정제된 T(800ng)를 혼합액에 첨가하여 얼음상에서 90분간 배양하였다. 혼합액의 분취량을 항-RBO.47 항체 또는 PAB419 항체로 면역 침전시키고, 웨스턴 블롯 분석하였다. 블롯들은 순차적으로 pMG3-245와 PAB419와 반응시켰다. 알킬리 탈인산 가수분해 효소-접합된 염소의 항-생쥐 IgG와 배양한 후, 블롯들은 발색 기지로 전개시켰다.

SV40 T 항원과 특이적 복하체를 형성함에 있어서 정제된 RB 단백질의 능력을 시험하기 위하여 동일량의 RB 단백질 및 T 항원을 혼합하고, 혼합물의 분취량을 항-RBO.47 항체 또는 항-T 항체 PAB419로 면역 침전시켰다.

이러한 점에서, 제7도는 바쿨로비루스에 의해 발현된 RB 단백질과 SV40 T 항원과의 복합체 형성을 나타내고 있다. 바쿨로비루스에 의해 발현된 정제된 RB 단백질을 정제된 T 항원과 시험관내에서 혼합하였다. 상기 혼합물의 동일한 분취량을 PAB41 9(제2열) 또는 항-PBO.47(제3열)로 면역 침전시켜 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 제1열 및 제4열은 각각 PAB419로 면역 침전된 정제된 SV40 T 항원, 및 항-PBO.47 항체로 면역 침전된 바쿨로비루스에 의해 발현된 정제된 RB 단백질을 나타낸다.

제7도에 나타나 있듯이, RB 단백질을 T 항원과 시험관내에서 혼합하는 것은 항-RBO.47 항체와 T를 상호 면역 침전(제3열)시킬 뿐 아니라, PAB419와 RB 단백질을 상호 면역 침전(제2열)시키는 결과를 초래했다. 이러한 결과는 바쿨로비루스로 감염된 곤충 세포로부터의 RB 단백질이 SV40 T 항원과 특이적 복합ㅊ를 합성하는 능력이 있음을 입증하는 것이다.

B6. 정제된 RB 단백질의 핵의 전위

시험관적 방법으로 정제된 단백질의 RB의 두 공지된 생화학적 활성을 유지하고 있는지를 측정한 후 생체내 방법으로 정제된 단백질의 양상을 고찰하였다. 정제된 RB 단백질을 사오스-2 세포의 세포질내로 주입하였다. 상기 세포는 골육종 세포주로서 21-27 엑손이 결여된 결함이 있는 RB 유전자를 함유하고 C-말단이 절두된 RB 단백질(p95)를 암호화한다(87 : 6-10, (1990) 참고). 이 단백질은 세로질내에서 매우 소량으로 존재하므로, 본 발명에 사용된 항-RBO.47 항체가 RB 단백질 C-말단에 직접 작용한다는 견지에서 볼 때, 상기 하체로서는 인지할 수가 없다. 주입 직후에 세포를 고정하여 면역 염색 분석을 실시하였다.

제8도는 사오스-2 세포의 세포질 내로 정제된 RB 단백질을 미량 주입한 후 발생한 핵의 전위를 나타낸 것이다. 정제된 RB 단백질을 주입시킨 상기 세포에 면역 염색 분석을 실시하였다. 도면내의 화살표는 비주입된 세포의 핵과 비교하여, 미량 주입후 강렬하게 염색된 핵을 지시하고 있다.

제8도에 나타난 바와 같이, 주입된 세포의 핵이 강렬하게 염색되는 것(화살표로 지시)은, 비주입된 대조군과 비교하여 볼 때, 감염된 단백질이 핵속으로 급속하게 이동되는 것을 제시하는 것이다. RB 단백질은 핵단백질로 공지되어 있으므로, 미량 주입후 정제된단백질의 즉각적이고 정확한 핵전위 현상은 상기 단백질이 생체내에서 활성을 나타낸다는 것을 한층 더 뒷받침해 주고 있다.

미량 주입을 하기 위해서는 정제된 RB 단백질을 20mM 트리스-HCl, pH 7.4 ; 10mM KCl ; 0.1mM EDTA ; 0.1mM DTT 및 2% 글리세롤을 함유하는 주입 완충액내에 트석하여 최종 농도가 0.5mg/ml가 되게 하였다. 유리 체임버 슬라이드상에서 증식한 사오스-2 세포를 유리 모세니들(에펜드르프)을 이용하는 통상적인 방법으로 미량 주입하였다. 진공장치 및 압력장치를 구비한 에펜도르프 미동장치 및 역위상차 현미경(니콘)을 사용하여 모세관을 미세 조작하고 미량 주입과정을 시각화하였다. 미량 주입 후 상기 세포를 0.04M 인산염 완충액(pH 7.4)내에 4%로 존재하는 포름알데히드로 즉시 고정하여 면역 염색 분석을 실시하였다.

B7. 요약

상기 개시한 바와 같이, 사람의 망막아종 유전자 생성물이 바쿨로비루스의 폴리헤드린 프로모터의 전사조절하에 효과적으로 발현될 수 있음이 입증되었다. RB 단백질은 세포의 성장을 방해하거나 심지어는 세포의 성장에 치명적인 것으로 간주되어 왓으므로, 다량의 RB 단백질을 발현시키기 위한 이러한 시도는 오랫동안 어려운 것으로 생각되어 왔다. 폴리헤드린 프로모터로부터의 외부 유전자의 전사는 세포외의 비루스 입자의 생성 및 세포내의 대부분의 비루스 유전자의 작용이 완료된 후 감염 후기에 일어난다. 따라서 RB 단백질과 같이 고다 생성시 세로 성장에 유해한 단백질을 합성하는데에는 바쿨로비루스-곤충 세포 시스템을 이용하는 것이 유리하다. 이 시스템의 또 다른 장점은 곤충 세포와 포유류 세포의 단백질 처리과정이 유사하다는 것이다.

생성된 RB 단백질은 곤충 세포의 핵에 정확히 정착하는 것으로 나타났으며 이는 포유류의 핵의 전위 신호가 곤충 세포의 의해서도 인식될 수 있음을 의미하는 것이다. 바쿨로비루스 발현 시스템내에서 재조합 단백질의 당 부가 반응은 O-에 결합된 그리고 N-에 결합된 고급 만노즈 유형의 올리고당에 제한된 것처럼 보이지만, 외부 단백질의 적합한 인산화 반응이 c-myc 및 HTLV-I p40^x의 발현에 대해서도 보고된 바있다(J. Virol). RB 단백질은 인산화 반응은 일어나지만 당 부가 반응은 일어나지 않음이 이전부터 알려져 있으며 이는 기능적인 RB 단백질 생성에 있어서 바쿨로비루스 발현 시스템이 적합하다는 것을 시사하는 것이다.

본 명세서에 개시된 바와 같이 감염된 곤충 세포에서 생성된 RB 단백질은 해독 후 인산화되며, 원래의 포유류 RB 단백질과 같이 웨스턴 블로팅 분석에 의해 여러 밴드로 나위어진다. 그러나 밴드의 강도로 판단할 수 있듯이 과인산화된 RB 단백질보다는 비인산화- 및 아(hypo) 인산화된 밴드가 우세하다. 이러한 현상이 비루스의 용균성 감염시기 동안의 세포 주기 양상을 반영하는 것인지 혹은 단순히 세포내에 존재하는 막대한 양의 외인성 RB고 인하여 곤충의 키나제에 의한 단백질의 인산화가 불충분하여서 인지는 오늘날까지도 알려지지 않았다. RB 단백질내에서의 인산화 부위의 정확한 지도화(mapping)는 인산화 반응의 양상이 포유류 단백질에서와 실제로 동일한지를 결정하기 위하여 필수적이다.

바쿨로비루스 시스템내에서 발현된 재조합 RB 단백질의 총량은 감염된 곤충 세포 배양물 1ℓ당 약 17-18mg(10⁹세포)이다. 이와 같은 수준의 형질 발현은 상기 시스템에 의해 생성된 다른 포유류 단백질의 수준, 가령 인터루킨 2에 있어서는 10-20mg/ℓ(필즈, 비, 마틴, 엠. 에이. 및 캠리, 디.(편집) 22 : 319-328(1985) 콜드 스프링 하버 소재의 콜드 스프링 하버 래버러토리 프레스) 및 P210 BCR-ABL에 있어서는 4-5mg/ℓ(4 : 759-766, (1989))와 비교할만한 것이다. 5' 암호 지역의 대분분이 소실된 RB cDNA와 융합된 손상되지 않은 폴리헤드린 5' 비해독 부위를 함유하는 재조합 전이 벡터를 이용하므로써 RB 단백질의 발현 레벨을 증가시킬 수 있다. RB mRNA의 서열에는 G+C 염기가 매우 풍부하며 이는 안정한 2차 구조를 형성할 수 있는 용인이 된다. 이러한 구조가 개시코돈 앞에 존재하면 이에 상응하는 mRNA의 해독 효율을 저하시키리라 사료된다. RB 5' 비해독 서열을 알팔파 모자이크 비루스(alfalfa mosaic virus : AMV) RNA 4 또는 β- 글로빈 mRNA로 대체하므로써 RB mRNA의 시험관내 해독을 5 내지 10배 증가시킬 수 있음이 입증되었으며 이는 RB 5' 비암호 서열의 해독에 있어서의 잠재적 역효과를 더욱 뒷받침하는 것이다((발행중),(1990)). 외부 유전자에 5' 비해독 서열이 길게 존재하는 것이 바쿨로비루스 시스템내에서의 재조합 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있음을 알게되었다. 폴리헤드린 프로모터에는 A+T 염기가 매우 풍부하므로, pp110^RB의 적절한 발현을 위해서는 RB cDNA를 전이 벡터내로 삽입하기에 앞서 G+C 염기가 풍부한 5'-비암호 성려을 절단해야 하는 것이다. 결론지어졌다.

정제 과정 동안 단백질이 변성되는 것을 최소화하기 위하여 친화성 컬럼으로부터 RB 단백질을 용출시키는 몇가지 다른 프로토콜이 시험되었다. RB 단백질의 생화학적 특성 및 생물학적 기능에 대해서는 많이 알려진 바가 없으므로, 정제된 단백질의 완전성을 측정할 수 있는 변수는 DNA-결합 활성 및 SV40 T 항원과의 복합체 형성 활성 뿐이다. 20mM의 트리에틸아민(pH 10.8)을 이용하는 본 용출 조건은 상기 단백질의 생화학적 특성을 유지하는데 효과적임이 발견되었다. 미량 주입후 세포질로부터 정제된 단백질의 급속한 핵전위는 상기 단백질이 이러한 용출 조건하에서 활성을 나타낸다는 것을 한층 더 입증하는 것이다. 극단적인 pH(200mM 글리신, pH2-3 또는 100mM 트리에틸아민, pH11.5)에서 단백질을 용출하면 단백질이 변성되어 전술한 두 활성이 크게 감소되는 경향이 있다. 이것은 또한 오랫동안 보관시에 형성되는 불용성 응집물로도 입증된다.

SV 40 T 항원에 의하여 안정하게 형질 전환된 원숭이 신장 세포주인 D2C2 세포내에서 SV40 T 항원과 결합할 수 있는 것은 비인산화된 RB 단백질 뿐임이 이미 보고된 바 있으나(cell, 56 : 57-65, (1989)), RB 단백질의 특정 아인산화형이 SV40 T 항원과 복합체를 형성할 수 있음이 밝혀졌다. 그것은 AcNPV-Y4 RB로 감염된 곤충 세포로부터 정제된 RB 단백질 또는 몰트-4 용해물과 T 항원을 시험관내에서 혼합시키므로써 계속 입증되어 왔다. 생체내의 복합체 형성을 위하여 코스(Cos) 세포를 사용할 때도 동일한 현상이 관찰되었다.(제7도). RB 단백질의 인산화 반응은 세포 주기가 반복되는 동안 단계-특이적인 방법으로 수행되며 RB와 비루스의 종양 단백질간의 형성은 이러한 DNA 종양 비루스의 형질전환 활성과 연관되어 있으며 아인산화된 RB 단백질과 SV40 T 항원간의 결합의 중요성은 앞으로 더욱 규명되어야 할 문제이다.

바쿨로비루스-곤충 세포 시스템을 이용하여, 가용성이며 손상되지 아니하였고 활성을 가졌으리라 예상되는 RB 단백질의 상당량을 얻을 수 있게 된 것은 RB 유전자 생성물의 생화학적 및 생물학적 특성을 연구하는데 있어서 중요한 향상을 나타낸는 것이다. 이는, 연관된 세포 단백질의 분석, 상기 단백질과 상호 작용하는 특정 DNA 서열의 분리, 및 X-선 결정학을 이용한 RB 단백질의 3차 구조 연구 등에 사용가능하다. 암을 억제시키는데 있어서의 망막아종 유전자의 생물학적 기능을 규명하는 것도 용이해졌다. 미량 주입에 의하여 직접 시험된 세포의 성장 및 분화에 있어서 RB의 관련 가능성은 현재 활발히 연구되고 있다.

본 명세서에 사용된 몇몇 약자의 의미는 하기와 같다 :

cDNA, 상보적 DNA ; kd, 킬로달톤 ; kd, 1×10³염기 ; SDS, 소듐 도데실 설페이트 ; PAGE, 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 ; NP-40, 노니데트 P-40 ; MES, (2-[N-모폴리노]에탄설폰산) 나트륨염 ; MOI, 감염 배수 ; Mr, 상대분자량 ; PAP, 감자산 탈인산 가수 분해 효소.

본 명세서에서 pp110^RB로 규정된 단백질 생성물은 ppRB¹¹⁰으로 명시된 단백질과 동일한 것이다.

본 발명의 특정 실시 태양이 개시되었지만 첨부하는 청구 범위의 범위내에서 다양한 변형이 가능함을 숙재해야 한다. 그러므로 본 출원에서 제시한 요약서 및 멩세서에는 어떠한 제한도 가하지 않겠다.

Claims (5)

1. 폴리헤드린 유전자의 전사 조절을 받고, 뉴클레오티드 +1 부근에서 뉴클레오티드 +115 부근 사이의 G 및 C 밀집영역이 5' 비암호화 영역으로부터 결실된 가용성의 인간 망막아세포종 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 서열을 함유하는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵의 다면성 비루스중 바쿨로비루스 벡터를 함유하는 바쿨로비루스 발현 시스템.
2. 제1항의 바쿨로비루스 발현 시스템을 함유하는 이종성 무척추 동물 숙주 세포.
3. 제2항에 있어서, 상기 숙주 세포가 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera frugiperda) 세포인 숙주 세포.
4. a. 가용성의 인간 야생형 망막아세포종 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 분자를 오토그라파 켈리포니카 핵의 다면성 비루스중 바쿨로비루스 벡터내로 삽입하는 단계 ; b. 생성된 벡터를 스포돕테라 프루지페르다 곤충 숙주 세포내로 삼입하는 단계 ; c. 가용성의 인간 야생형 망막아세포종 폴리펩티드를 발현시키는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및 d. 생성된 가용성의 인간 야생형 망막아세포종 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는 가용성의 정제된 인간 망막아세포종 폴리펩티드를 생산하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 cDNA는 뉴클레오티드 +1 부근에서 뉴클레오티드 +115 부근 사이의 G 및 C 밀집 영역이 5' 비암호화 영역으로부터 결실된 것인 방법.