JPH04500603A - クローン化腎炎抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 クローン化腎炎抗原 関連出願 本出願は米国出ＩＪＩＮｏ、０７／２３５．２１１　（１９８８年８月２３日出 願）の一部継続出願である米国特許出願Ｎｏ、　０７／　３１３゜６８２　（１ ９８９年２月２２日出願）の一部継続出願である。

発明の技術分野 本発明は組換え遺伝子に関する。

発明の背景 ハイマン（Ｈｅｙｍａｎｎ）腎炎は、ラブドモデルにおける誘発ヒト膜性糸球体 腎炎として周知である［ハイマンら（Ｈｅｙｍａｎｎ、　Ｗ、　）、全アジュバ ント中の全腎臓ホモジネートでラットを免疫することにより誘発される。この疾 患の原因である抗原［腎炎原（ｎｅｐｈｒｉ　ｔｏｇｅｎ）と呼称〕は近位的尿 細管刷子縁領域から得られた膜製品（ＦｘＩＡとして既知）に含有されているこ とが分かつており、さらに精製された画分（ＲＴＥα５として既知）に腎炎原性 のあることも報他の研究者もそのような尿細管製品に腎炎原性のある糖タンパク を同定した。例えば、ナルセら［Ｎａｒｕｓｅ、Ｔ、、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、 　３３：１４１（１９７５）　］は腎腎炎性のある８、４８細管糖タンパクを単 離、精製したと述べている。カージャシキ（Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ）とファーク ハ−（Ｆａｒｑｕｈａｒ）はハイマン腎炎の病原性抗原である見積もりの分子量 ３３０．　０００ダルトンの糖タンパク　（ｇｐ３３０）を単離した。この刷子 縁膜糖タンパクを精製し、特性化した［カーシャスキ（Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ） ９８６）］。他の研究者は、ＦｘｌＡの一成分である６００．０００ダルトンの 糖タンパク（ｇｐ６００）もこの疾患を誘導し得るということを報告している［ マツカー（Ｍａｋｋｅｒ、　Ｓ、　Ｐ、　）およびシン（Ｓｉｎｇｈ、Ａ、に、 ）、　Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　５０：２８７（１９８４）］　。全体で４個の ｇｐ６００サブユニットｇｐ３３０、ｇｐ１４０、ｇｐｌｌｏおよびｇｐ７０が 単離され、腎炎原性のあることが分かった［Ｓｉｎｇｈ、　Ａ、　Ｋ、およびシ バルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｎ、　Ｍ、　）、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎ＋＋ｏｕｎ ｏ１．　Ｉ＋ｎｍｕｎｏｐａｔｈｏ１．４８：６ｌ−７７８４）コ。ヒト尿細管 の刷子縁にある４００ｋｄのタンパク質（ｇｐ３ｇｐ３３０本来の免疫複合体形 成、これは糸球体腎炎の発現を招（、における病原生理学的な役割はまだ明らか でない。しかしながら、沈着の形成は有足細胞表面での自己抗体とｇｐ３３０と の反応によって開始され、複合体が基膜内部に沈着することによると考えＧａ４ ３０はある種の上皮細胞の先端形質細胞膜領域、特に近位尿細管、糸球体有足細 胞、腸、肺（ＩＩ型肺胞）、表皮および卵黄サック［ドキシーら（Ｄｏｘｅｙ、 　Ｓ、　）、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９７：１７８ａ（１９８３）　；シャ された。免疫電子顕微鏡研究により、ｇｐ３３０はクラスリン（ｃｌａｔｈｒｉ ｎ）被覆小胞に濃縮されていることが示された［バーン（Ｂａｈａｎ、　Ａ。

役割を果たし、特異的なレセプタータンパク質および関連のリガンドのエンドサ イトーンス取り込みを仲介する。ｇｐ３３０は多くの膜レセプターと同様、被覆 小胞に濃縮され、「レセプター仲介エンドサイト−シス」と称される機構により そのリガンドを細胞内にもたらすしブラウン（Ｂ　ｒｏｗｎ、　Ｍ、　Ｓ、　） およびゴールドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｌ、）、　５ｃｉｅｎｃｅ 　５３：４２３（１９８６）　：　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｌ、らＮ　ａｔｕ ｒｅ２７０：６７９（１９７９）］。ハイマン腎炎の研究により発展がもたらさ れたが、ヒト膜性糸球体腎炎および他の状況を診断し、新規な治療形態を開発す るためには自己免疫性腎疾患に関連するポリペプチドおよび糖タンパクを多量に 供給するための供給源が依然として必要である。

発明の要約 本発明は、尿細管刷子縁製品、ＦＸＩＡのｇｐ３３０をコードするクローン化遺 伝子、またはその機能的な誘導体、およびｇｐ３３０タンパク質およびその機能 的な誘導体に関するものである。

本発明はまた、本発明のクローン化遺伝子を含有するベクター、本発明のベクタ ーで形質転換された宿主、および組換え法による該タンパク質の製造方法に関す る。

図面の説明 図１は逆相ＨＰＬＣにより分離したｇｐ３３０トリプシンペプチドのＨＰＬＣ図 である。

図２はｇｐ３３０から得られた５個のトリプシンペプチドのアミノ酸配列を示す 。

図３はこれら３個のｇｐ３３０ＤＮＡ断片（１，４，０，６および０、４　ｋ　 ｂ）の制限地図および２３塩基オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼ ーション部位を同定した図である。

図４は２．９ｋｂｇｐ３３０ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列およびそれにより発現され たアミノ酸配列を示す。この配列は重なり合った２゜４ｋｂの２個のクローンか ら得た。２９アミノ酸トランスメンブランセグメントは１重下線で、ストップコ ドンは２重下線で示されている。

図５は６個の部分ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのヌクレオチド配列がら推定したｇｐ３３０の 構造とヒトＬＤＬレセプターの構造を比較した図である。

２個のｇｐ３３０）リプシンペプチド配列の位置は１個または２個のアストリク ス（＊）を付したセグメントにより示されている。２゜９ｋｂＤＮＡ配列から推 定されるタンパク質配列は　図示するように、２個の重なり合った２、４ｋｂク ローンから得、それは２９アミノ酸トランスメンブランセグメント（Ｘ印）と１ ８８アミノ酸の細胞質テイル（三角（△）で示したストップコドン）を含有する 。

領域ＡからＦは図６および図６Ａに記載されたアミノ酸配列に対応する。

図６はラットｇｐ３３０．ヒトＬＤＬ、およびマウスＥＧＦＰのアミノ酸配列を 比較した図である。

図７はラットｇｐ３３０とヒトＬ　Ｄ　Ｌ　鼠のアミノ酸配列のドツトマトリッ クス分析である。

図８は４８０塩基対ｇｐ３３０ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列およびそれにより発現さ れたアミノ酸配列を示す。塩基対１２２から２３５および２４５から３６１まで にコードされている各配列はそれぞれほぼ４０アミノ酸のシスティンに富むスト レッチからなり、それはＬＤＬレセプターのリガンド結合ドメインとホモロガス である（図６参照）。この領域は、ｇｐ３３０ＤＮＡ中では少なくとも１４回、 ＬＤＬレセプター遺伝子中では少なくとも７回反復されている。２個のセグメン トはそれぞれ５個のシスティン残基を有し、ＬＤＬレセプターのりガント結合領 域に関連するものが塩基対１−１０９および３３７−４８０に認められる。

図９は約２．２ｋｂのｇｐ３３０ＤＮＡ断片のＤＮＡ配列およびそれによりコー ドされているアミノ酸配列を示す。この配列は１゜４ｋｂクローンおよび重なり 合った１、２ｋｂクローンから導かれ（図５参照）、ＬＤＬレセプター結合領域 とホモロガスなシスティン豊富セグメントとホモロガスである（図５および図６ 参照）。

好ましい実施態様 本発明はＦＸＩＡのｇｐ３３０抗原をコードするクローン化遺伝子またはその機 能的な誘導体に関する。また、本発明は本発明のクローン化遺伝子を含有するベ クター、本発明ベクターで形質転換された宿主、および該宿主により発現された タンパク質に関する。また本発明は動物の様々な病理生理学的状況を治療する方 法であって、ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を含有する医薬製剤を投与す ることからなる方法を提供するものである。本発明はまた、ｇｐ３３０をコード する遺伝子と低密度リポタンパク質（ＬＤＬ、）との相同性を利用し、ＬＤＬ、 の生産と機能をコントロールしている遺伝子の異冨に関連した疾患、例えば、Ｆ ａｍｉｌｉａｌ　Ｅｌｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ（家族性高コレ ステロール血症；ＦＨ）の分子診断手段および研究方法を提供するものである。

精製ｇｐ３３０抗涼の見掛けの分子量はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で４４０゜０００であるｅ従って、ｒ ｇｐ３３０ｊという語句はスブラークードーレイまたはリーバイス種の正常なラ ット腎臓の尿細管から得た糖タンパクであッテ、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分子量（Ｍ ｒ）＝４４０ｋＤに相当するバンドを有する糖タンパクを意味する。当該技術分 野で周知のごとく、他の種のラットから得たホモロガスな分子も同様であるが様 々な分子量を有するであろう。

ｇｐ３３０の「機能的な誘導体」とは実質上ｇｐ３３０と同様の生物学的構造、 または機能的な生物学的活性を有する化合物を指す。

「機能的な誘導体」という語句にはｇｐ３３０の「フラグメント」、「変異体」 または「化学的誘導体」を包含することを意図する。「機能的な誘導体」という 語句はまた、他の種、とりわけヒトに存在するｇｐ３３０とホモロガスな糖タン パクであって、自己免疫腎炎における抗体の標的である糖タンパクを包含する。

ｇｐ３３０の「フラグメント」とは、分子のあらゆるポリペプチドまたはグリコ ペプチドのサブセットを指す。ｇｐ３３０の「変異体」とは全分子またはそのフ ラグメントのいずれかと実質上、構造および機能が類似する分子を指す。

分子は、それが他の分子と実質上同様の構造を有するか、両分子が実質上同様の 生物学的活性を有するならば、他の分子と「実質上同一である」という。即ち、 ２個の分子が実質上同じ活性を有することを条件として、例え１方の分子の完全 な構造が他の構造に含まれていなくとも、またアミノ酸残基配列が同一でなかっ たとしても、本明細書中では「変異体」と称する。ｇｌ）３３０の「同族体」と は全分子またはそのフラグメントのいずれかと実質上、機能が同じ分子を指す。

本明細書中では、ある分子が、通常の状態では他の分子に含まれてない余分の化 学部分を含有するとき、他の分子の「化学的誘導体」であるという。そのような 部分は分子の溶解性、吸収性、レセプターまたはリガンド結合性、生物学的半減 期等を改善するものかもしれない。これらの部分はまた分子固有の毒性を減じ、 分子のなんらかの好ましからざる副作用を消滅または減するもの等であるかもし れない。それらの作用を仲介する部分はレミントンの薬科学に記載されている［ Ｒｅｉｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　 （１９８０）］。これらの部分を結合させる工程は当該技術分野で周知である。

本明細書中、「実質上純粋」または「実質上精製された」という語句は天然状態 でそのタンパク質に通常付随する化合物が付随しないタンパク質、即ち、他のタ ンパク質または炭水化物を伴わないタンパク質であることを意味する。また、こ の語句は、当該技術分野で純粋または同質性（ホモジニティ）を意味する１また はそれ以上の基準に従って同質であるタンパク質をも意味する。例えば、実質上 純粋なｇｐ３３０は分子量、クロマトグラフィー媒質上の挙動における所見等の パラメーターについて、実験的標準偏差の範囲にある、定常的なかつ再現性ある 性質を示すであろう。「実質上純粋」または「実質上精製された」という語句は タンパク質と他の化合物との人工的または合成混合物を排除するものであること を意味しない。さらに、この語句はタンパク質の生物学的活性に干渉しない物質 であって、精製不十分等の理由で存在する微量不純物の存在を妨げるものではな い。

本発明のｇｐ３３０およびその機能的誘導体の遺伝子操作はタンパク質をコード し得る遺伝的配列のクローニングおよびそのような遺伝的配列の発現によりなさ れる。本明細書中、「遺伝的配列」という語句は、核酸分子（好ましくはＤＮＡ ）を指す。ｇｐ３３０および機能的誘導体をコードする遺伝的配列は様々な起源 から得ることができる。そのような起源にはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ、Ａ、合成り ＮＡおよびその組み合わせがある。

ゲノムＤＮＡは天然に存在するイントロンを含んでいてもいなくてもよい。さら に、そのようなゲノムＤＮＡはｇｐ３３０遺伝子配列の５°　プロモーター領域 と一緒に得られるかもしれない。宿主細胞がタンパク質の発現に関連した転写調 節および翻訳開始シグナルをｍ！することができる限り、５゛領域を保持し転写 および翻訳開始調節のために用いることができる。

ｃＤＮＡをクローンし得られたクローンを所望の配列をコードするｃＤＮＡのた めに適当なプローブでスクリーニングする。所望の１またはそれ以上のクローン が１１１１されたら、ゲノムＤＮＡと実質上、同様にしてｃＤＮ、Ａを増幅する ことができる。しかしながら、ｃＤＮＡはイントロンまたは介在配列を含有しな いであろう。

ｇｐ、３３０をコードするＤ　Ｎ　Ａの単離は多くの方法を用いて行うことがで きる。例えば、当業者周知の方法でＤＮＡを適当な細胞から抽出し、精製する。

次いでＤＮＡを開裂し、そのいずれかがｇｐ３３０またはそのフラグメントをコ ードする遺伝子を含有する線状断片とする。そのような断片化は、例えば、ＤＮ Ａを特異的な塩基配列部位で切断する制限エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ 酵素を用いて行うことができる。次いで線状ＤＮＡ断片を通常の方法でサイズに 応じて分離する。そのようｔ組換えＤＮＡ技術はマニアナイスノ方法に従って行 う　［Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｂａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）］。

あるいは、ｇｐ３３０　（またはそのフラグメント）をコードするｍＲＮＡを単 離し、逆転写酵素を用いてそれからｃＤＮＡを製造することによりｇｐ３３０ま たはそのフラグメントをコードするＤＮＡを単離し得る。

ｇｐ３３０遺伝子の好ましいクローニング法はｇｐ３３０タンパク質またはその フラグメントの精製の後、アミノ酸配列を決定することを含む。そのような精製 は、好ましくはポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてアフィニティ ークロマトグラフィーで行う。タンパク質を調製５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび電気溶 出によりさらに精製する。

タンパク質の全アミノ酸配列を決定することは可能であるが、好ましくはペプチ ドフラグメントの配列を決定する。ｇｐ３３０を臭化シアンまたはパパイン、キ モトリプシン、またはトリプシンで開裂する［オーイケら（Ｏｉｋｅ、　Ｙ、　 ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２５７＋９７５１−９ ７５８（１９８２）＋　リューら（Ｌｉｕ、　Ｃ，、、ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｉ ｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　２１：２０９−２１５（１９８３）］　ｏ得られた ペプチドを逆転写液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離し、アミノ酸配列 決定、好ましくは自動配列決定装置を用いてアミノ酸配列決定に付す。

本明細書中、ペプチド中のアミノ酸残基配列を一般に用いられる３文字記載、ま たは文献［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、　Ａ、、　ｆｏ ｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７０）］記載の１文 字表示によって表す。アミノ酸配列を水平に記載する場合、アミン末端を左側に 、カルボキン末端を右側に、各アミノ酸残基をハイフォンで分けて記載する。

そのようなハイフォンは化学結合を意味するものではな（、単に配列を表示しや すくするためである。

１またはそれ以上の適当なペプチドの配列が決定されたら、それらをコードし得 るＤＮＡ配列を調査することができる。遺伝子コードの同義性により、特定のア ミノ酸のコードに１以上のコドンが用いられる［ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ 、　Ｄ、）　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅＧｅｎｅ、 　３ｒｄ　Ｅｄ、、　ＩＦ、　Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌ ｏ　Ｐａｒｋ　ＣＡ　（１９７７）、　ｐｐ、　３５６−３５７１゜ペプチドフ ラグメントを分析し、最も縮重度の低いオリゴヌクレオチドでコードされている アミノ酸を決定する。このことは、ただ−個のコドンでコードされているアミノ 酸を含有する配列を同定することで行い得る。

アミノ酸は単一のオリゴヌクレオチドによってのみコードされる場合もあるが、 たいていは、アミノ酸配列は一群の類似したオリゴヌクレオチドでコードされ得 る。これらオリゴヌクレオチド群の各々が、皆、ペプチドフラグメントをコード し得るオリゴヌクレオチドを含有しており、同一のオリゴヌクレオチド配列を遺 伝子とし、て含有している可能性があるが、遺伝子に含まれている実際のヌクレ オチド配列を含有するものは、このオリゴヌクレオチド群の中で唯一つであると いう点は重要である。このオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド群中に存在 しており、群中に他のヌクレオチドが存在していてもＤＮＡとハイブリダイズし 得るので、ペプチドをコードしている遺伝子のクローニングに際して、単一のオ リゴヌクレオチドを使用する場合と同様に、分画化していないオリゴヌクレオチ ド群を使用することができる。この場合にも縮重度を低下する目的で「不明確な コドン」にデオキシイノシンを用いることができる［オーツカら（Ｏｈｔｓｕｋ ａ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６０：２６０５（１ ９８５）］。

遺伝子コード［ワトソン（マａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、）　ｌ１ｏｌｅｃｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　４ｔｈ　Ｅｄ、、Ｂｅｎｊａｍ ｉｎ　／Ｃｕｍｍｊｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、　Ｍ ｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ　ＣＡ　（１９８７）］を用いていずれもｇｐ３３０をコー ドし得る１またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる 。ある特定のオリゴヌクレオチドが、実際に、現実のｇｐ３３０暗号配列を構成 する可能性は、異常な塩基対の相関関係および個々のコドンが真核細胞内で実際 に用いられる頻度（特定のアミノ酸をコードするために）を考慮して決定される であろう。そのような「コドンユーゼージルール」を用い、レーセらの方法［Ｌ ａｔｈｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１８３： １−１２（１９８５）］に従って理論上、ｇｐ３３０をコードする「可能性が最 高の」ヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド群を決定することができる。

理論的にｇｐ３３０遺伝子フラグメントをコードしている「可能性が最高」であ る配列、これはデオキシイノシンを含有していてもよい、を含有するオリゴヌク レオチドまたはオリゴヌクレオチド群は、その「可能性が最高」である配列また は配列群とハイブリダイズすることができる相補的なオリゴヌクレオチドまたは オリゴヌクレオチド群の配列の同定に使用される。このような相補配列を含有す るオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ製品中のｇｐ３３０遺伝 子を同定し、単離するためのプローブとして使用することができる［マニアチス らのモレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・ スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク（１９ｇ２）コ。

要約すれば、ｇｌ）３３０フラグメントのアミノ酸配列を実際に同定すると、こ のペプチドをコードし得る、理論的に「最も可能性あるＪ　ＤＮＡ配列、または 配列群を同定することが可能となる。この理論的な配列または「最も可能性ある 」配列群と相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド群を構築する ことにより、ｇｐ３３０遺伝子を同定および単離するためのプローブとして有効 に用い得るＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子群が得られる。

ｇｐ３３０遺伝子断片をコードし得る適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ クレオチド群（あるいはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ ド群に相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド群）を、上記の方 法により同定し、合成し、当業者周知の方法でｇｐｓｓｏ遺伝子を発現し得る細 胞から得た標品とハイブリダイゼーションさせる。用いるＤＮＡまたはｃＤＮＡ 供給源はｇｐ３３０配列の豊富なものが好ましい。そのような豊富なものは高濃 度でｇｐ３３０遺伝子を発現する細胞から抽出したＲＮＡから得たｃＤＮＡから 最も容易に得ることができる。次いで、上記ＤＮＡライブラリー中、そのような ハイブリダイゼーション陽性であることが判明したものを分析し、それに含有さ れるｇｐ３３０コード化配列の化度列性質を決定する。

核酸ハイブリダイゼーション技術は、マニアチスらのモレキュラー・クローニン グ・ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−、ニュー ヨーク（１９８２）、およびハイメス（Ｂａｙｉｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、　）らのＮ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　＾Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

ＩＰＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８５）に記載されている。

所望のｇｐ３３０暗号配列の検出を容易にするために好ましくはＤＮＡプローブ を検出可能な基で標識する。そのような検出可能な基は検出可能な物理的または 化学的性質を有する物質なら任意である。そのような物質はイムノアッセイおよ び核酸ハイブリダイゼーションの分野で周知である。該方法に有用なラベルを一 般に本発明に用い得る。特に有用なものは、酵素学的に活性な基、酵素［ＣＣ１ １ｎＣｈｅ、　２２：１２４３（］、９７６）コ、酵素基質（英国特許第１．５ ４８．７４１）、補酵素（米国特許第４．２３０．７９７および４．２３８．５ ６５）および酵素阻害物質（米国特許第４．１３４．７９２）　：蛍光性物質（ Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　２５：３５３（１９７９）　；色素；化学発光または 生物発光物質等の発光体（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　２５：５１２（１９７９） ）　；特異的に結合し得るリガンド：近位で相互作用可能な対；および放射性同 位元素（例えば！Ｈ，３５Ｓ、！１２ｐ、＋２５Ｉ、１４ｃ）である。そのよう なラベルおよびラベル対はその内因性の物性（例えば、発蛍光体、色素および放 射性同位元素）または反応性または結合性（例えば、酵素、基質、補酵素および 阻害物質）に基づいて検出される。例えば、補酵素で８１１−１したプローブは 、該標識が補酵素となるような酵素、および該酵素の基質を加えることにより検 出される。例えば、基質に作用して測定可能な物性を有する生成物を与える酵素 を用いることができる。そのような酵素の例には、β−ガラクトシダーゼ、アル キルホスファターゼおよびペルオキシダーゼがある。

上記の、またはこれらに類似した方法は、ヒトアルデヒド脱水素酵素〔シュー　 （Ｈｓｕ、　Ｌ、　Ｃ，）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２　：３７７１|３ ７７５（１９８５）コ、フィブロネクチン［スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｓ、　） らのＥｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、　Ｊ、　４：２５１９−２ ５２４（１９８５）］、ヒトエストロゲンレセプター遺伝子［ウォルター（ｆａ ｌｔｅｒ、　Ｐ、　）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、 　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２　ニア８８９−７８９３（１９８５）］、組織型プラ スミノーゲンアクチベータ−［ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、　）らのＮａｔ ｕｒｅ　３０１：２１４−２２１（１９８３）］、およびヒト期胎盤アルカリホ スファターゼ相補的ＤＮＡ［カーノ（Ｋａｍ、　ｊ　）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ｌ；、Ｓ、＾８２：８７１５−８７１９（１９ ８５）：ｌの遺伝子クローニングを成功させた。

ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡと常法通 り結合させる。即ち、ライゲーションのための平滑末端または付着端ＤＮＡを含 むｖ　Ｎ　Ａ、制限酵素消化による適当な末端の生成、付着端の適当な充填、望 ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なりガ ーゼによるライゲーションである。そのような操作技術はマニアティス、Ｔ、ら （前掲）によって記されており、当業者には周知である。

ＤＮＡ等の核酸分子は、それが転写および翻・訳調節情報を含有するヌクレオチ ド配列を含有し、しかもそれらの配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列と「操作可能に結合」しているとき、「発現可能」という。「操作可能な結 合」とは調節ＤＮＡ配列と発現させようとしているＤＮＡ配列とが遺伝子発現が 可能な態様で結合しているような結合を指す。遺伝子発現に必要な調節領域の性 質は、正確には生物毎に異なるであろうが、一般に、プロモーター領域を有し、 これは原核性生物においては、プロモーター（ＲＮＡの転写開始を指令する）並 びにＲＮＡに転写されたときタンパク質合成のシグナルとなるＤＮＡ配列を含有 する。そのような領域は通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列 等を包含する。

要すれば、コード化配列の非コード化３′領域を上記方法で得ることができる。

この領域を、転写終止およびポリアデニル化調節配列のために保持しておいても よい。即ち、天然の３′領域を保持させることにより転写終止シグナルを得るこ ともできる。転写終止シグナルが特定の宿主において十分な発現効果を示さない 場合には、該宿主内で機能する３°領域で置換してもよい。

２つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列、およびｇｐ３３０コード化配列など ）は、それら２つのＤＮＡ配列間の連結が（１）フレームシフト突然変異を導入 しない、（２）ｇｐ３３０遺伝子の転写を指令するプロモーター領域配列の機能 を妨害しない、または（３）プロモーター領域配列の調節下で転写されるべきＳ 　Ｆ−２５コ一ド化配列の転写される能力を妨害しない、場合に操作可能に連結 していると言う。したがって、プロモーターがＤＮＡ配列を転写させ得るならば 、そのプロモーター領域はそのＤＮＡ配列に機能的に連結されているであろう。

タンパク質の発現のためには、適当な宿主が認識する転写および翻訳シグナルが 必要である。

本発明は真核性または原核性細胞内でのｇｐ３３０タンパク質（またはその機能 的な誘導体）の発現を包含する。好ましい原核性宿主ｐｈｉｍｕｒｉｕ＋ｉ）、 セラチア・マーセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）バシラス 種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）、シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などの細菌を含む。最も好ま しい原核性宿主は大腸菌である。そのような細菌宿主内で発現されるとｇｐ３３ ０はグリコジル化されないであろう。原核性宿主は発現ベクターまたはプラスミ ドに適合するものでなければならない。

ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を原核性宿主内で発現させるためにはｇｐ ３３０をコードする配列と機能的な原核性プロモーターとを機能的（操作可能に ）に連結する必要がある。そのようなプロモーターは、構成的であるか、より好 ましくは調節的（すなわち、誘導的または脱抑制的）である。構成的なプロモー ターには、ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモ ーターなどがある。誘導可能な原核生物プロモーターには、バクテリオファージ λの主要な右および左プロモーター（ＰＬおよびＰ、）、大腸菌のＶ工、ｒｅｃ ＡｓすｔｃＺ、１ａｃＩおよび赳プロモーター、およびＢサブチリスのα−アミ ラーゼ［ウルマネン（Ｌｌｌｍａｎｅｎ、　Ｉ）らのＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 　１６２：１７６−１８２（１９８５）］、］σ−２８−特異的プロモーターギ ルマン（Ｇｉｌｍａｎ、　ｌ！、　Ｚ、　）らのＧｅｎｅ　３２：１ｌ−２０（ １９８４）］、バシルスのバクテリオファージのプロモーター［グリクザン（Ｇ ｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、　）のＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アゾミック・プレスＩｎｃ、　、　−１− ｓ−ヨーク（１９ｇ２）］、ならびにストレプトマイセスプロモータ一群［ワー ド（Ｗａｒｄ、　Ｊ、　Ｍ、　）らの菖０１、Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０３ ：４６８−４７８（１９８６）］がある。原核性プロモーターの総論は、グリツ ク（Ｇｌｉｃｋ、　Ｂ、　Ｒ，）のＪ、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉ。

９８４）に見られる。

原核性細胞内にて適切に発現するには、暗号配列の上流にリボゾーム結合部位が 存在することが必要である。ンヤイン・デルガーノ配列等のりボゾーム結合部位 は、たとえばゴールド（Ｇｏｌｄ、　Ｌ、　）らのＡ好ましい真核性宿主にはイ ンビボまたは組織培養として、酵母、真菌、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）が含 まれる。哺乳類細胞はタンパク分子の適当な部位にグリコジル化等の翻訳後修飾 をもたらし、適正な３次元ホールディング（折り畳み構造）を与える。宿主とし て有用な哺乳類細胞にはＶＥＲＯ，またはＣＨＯ−Ｋ１等の線維芽細胞起源の細 胞、ハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＣ１４等のリンノ々球起源の細胞、または骨 髄腫Ｐ３ｘ６３Ｓｇ８細胞、またはその誘導体がある。好ましい哺乳類宿主細胞 にはＳ　Ｐ　２／ＧおよびＪ５５８Ｌ、並びにより適正な翻訳後修飾を与える能 力を有すると思われる神経芽細胞腫セルラインＩＭＲ３３２等がある。

哺乳類宿主のためにはｇｐ３３０発現に利用し得る幾つかのベクター系がある。

宿主細胞の性質に応じて広範な転写および翻訳調節配列を用いることができる。

転写および翻訳調節シグナルは、調節シグナルと特定の遺伝子とが高い発現レベ ルで結合しているアデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、シミアンウィルス等か ら得ることができる。あるいはアクチン、コラーゲン、ミオシン等の発現された 哺乳類遺伝子からのプロモーターを用いてもよい。転写開始調節シグナルは遺伝 子調節が可能なよう、制御または活性化するものを選択するとよい。興味あるも のは発現の制御または開始に温度変化を利用することができる温度感受性調節シ グナル、または化学調節されやすいシグナル、例えば代謝物である。

酵母細胞はグリコジル化を含む翻訳後ペプチド修飾を行い得るという点で実質的 に有利な宿主である。酵母で所望のタンパク質を産生ずるのに使用し得る強いプ ロモーター配列と高コピー数プラスミドを用いた数多くの組換えＤＮＡ戦略があ る。酵母細胞はクローン化哺乳類遺伝子産物のリーダー配列を認識し、リーダー 配列を担持するペプチドを分泌する（即ち、プレーペプチド）。

活性に発現されるグルコース分解酵素をコードする遺伝子のプロモーターおよび 終止（ターミネータ−）エレメントであって、酵母をグルコースに富む培地で培 養したとき大量に産生されるものを導入してなる、一連の酵母遺伝子発現系のど れを用いてもよい。既知のグルコース分解遺伝子も、非常に効率的な転写調節シ グナルを与える。例えば、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモーターお よびターミネータ−シグナルを用い得る。

上記のように、真核性宿主におけるｇｐ３３０タンパク質の発現は真核性調節領 域を必要とする。そのような領域は、一般にＲＮＡ合成の開始を指令するのに十 分なプロモーター領域を含む。好ましい真核性プロモーターには、マウスメタロ チオネインＩ遺伝子のプロモーター［バー　７−　（Ｂａｍｅｒ、　Ｄ、　）ら のＪ、　）Ｉｏｌ、　ＡｐＤｌ、　Ｇｅｎ、　１：２７３−２８８（１９８２） ］、ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター［マツフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、 　Ｓ、　）のＣｅ１ｌ　３１：３５５−３６５（１９８２）］、ＳＶ４０初期プ ロモーター［ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，）らのＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　２９０：３０４−３１０（１９８１）コ、および酵母ｇａｌ　４遺伝 子プロモーター［ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、＾、）らのＰｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＩＪ、　Ｓ、＾７９　：６９７１− ６９７５（１９８２）、シルバー（Ｓｉ１ｖｅｒ、　Ｐ、　Ａ、　）らのＰｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、８１　：５９５１ −５９５５（１９W４）］ がある。

広く知られているように、真菌生物のｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコ ードしているコドンから開始される。そのため、真菌生物プロモーターと、ｇｐ ３３０分子（またはその機能性誘導体）をコードしているＤＮＡ配列との間の連 結に、メチオニンをコードし得るコドン（すなわちＡＵＧ）を介在させないよう にすることが好ましい。このようなコドンが存在すると、融合タンパク質（ＡＵ Ｇコドンがｇｐ３３０をコードするＤＮＡ配列と同一の解読フレーム内にある場 合）、またはフレームシフト突然変異体（ＡＵＧコドンがｇｐ３３０暗号配列と 同じ解読フレームにない場合は）のいずれかが生成される。

ｇｐ３３０暗号配列および機能的に結合したプロモーターは、線状分子、または より好ましくは共有結合で閉鎖した環状分子のいずれかの形の非複製型ＤＮＡ（ またはＲＮＡ）分子として原核性または真核性受容細胞に導入され得る。このよ うな分子は自律的に複製できないので、ｇｐ３３０タンパク質の発現は導入され た配列の一時的な発現として起こる。あるいは、宿主の染色体への配列の組み込 みにより、永久発現が起こる場合もある。

１態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体に組み込み得るベクターを用 いる。導入されたＤＮＡをその染色体に安定に組み込んだ細胞に、その発現ベク ターを含有する宿主細胞の選択を可能ならしめる１またはそれ以上のマーカーを 導入することができる。

マーカーは栄養要求宿主に原栄養性を付与する、抗生物質、または銅等の重金属 のような殺生物剤に対する耐性を与えるものであってよい。選択可能マーカー遺 伝子は発現すべきＤＮＡ遺伝子配列と直接結合させるか、同一の細胞に同時形質 転換またはコトランスフェクションによって導入してもよい。また、一本鎖結合 タンパク質ｍＲＮＡの最適な合成に必要な付加的要素がある。これら要素には、 スプライシングシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサ−１終始シグナ ルがある。そのような要素を導入するｃＤＮＡ発現ベクターには、オカヤマが記 載したものがある［Ｏｋａｙａｍａ、　ＨｏＭｏｌ、　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、 　３：２８０（１９８３）］。

好ましい態様では導入遺伝子配列を、受容宿主内で自律的に複製できるプラスミ ドまたはウィルス性ベクターに挿入する。この目的には、広範なベクターのうち いずれを用いてもよい。特定のプラスミドまたはウィルス性ベクターを選択する に当たって重要な因子は以下の通りである。ベクターを含有する受容細胞を認識 しベクターを含有しない受容細胞から選択することの容易性：特定の宿主内で望 まれるベクターのコピー数：およびベクターの異なる種の宿主細胞間における「 シャトル」機能を望むか否か。好ましい原核性ベクターとしては、大腸菌内で複 製することのできるプラスミドが挙げられる［例えば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ １、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸ］。このようなプラスミドは、た とえばマニアチスらによって開示されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ、　：ｌ−ルド・スプリング−ハーバ−・ブレス、コールド・ スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）］。

バシルスのプラスミドには、ｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７などがある。

このようなプラスミドはグリシザンによって開示されている［グリスザン（Ｇｒ ｙｃｚａｎ、　Ｔ、　）　、　Ｉｎ　：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プレス、ニューヨーク （１９８２）、　３０７−３２９頁コ。適当なストレプトマイセスのプラスミド は、ｐｌＪ１００ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ、　Ｋ、　Ｊ、　）らのＪ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：４１７７−４１８３（１９８７）］、およびφＣ３ １などのストレプトマイセスバクテリオファーン［チェイタ−（Ｃｈａｔｅｒ、 　Ｋ、　Ｆ、　）らの５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓ ｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｓｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｋａｄｅ ｍ釉ｉ　Ｋａｉｄｏ、　Ｂｕｄａｐｅｓｔ、　Ｂｕｎｇａｒｙ　（１９８６）、 　４５−５４頁］である。シュードモナスのプラスミドは、ジョーン（Ｊｏｈｎ 。

Ｊ、　Ｆ、　）らのＲｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｊｓ、　８：６９３−７０４ （１９８６）、およびイザキ（Ｉｚａｋｉ。

Ｋ、）のＪｐｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３３ニア２９２９−７４２（ １９７に記載されている。

好ましい真核生物プラスミドは、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０゜２ミクロン環 状などである。このようなプラスミドは当業界では周知である［ボッラスティン （Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　）らのｌｌｉａｍｉ　１１ｎｔｒ、Ｓｙｍｐ、　 １９：２６５−２７４（１９８２）、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，） のＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　５ ａｃｃｈａｒｏｉｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔ ａｎｃｅ、　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプ リング・ハーバ−、ニューヨーク、　４４５−４７０（＋９８１）、ブローチ（ Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ）のＣｅ１ｌ　２８：２０３−２０４（１９１１ｉ２ ）、ポｏ　−ン（Ｂｏｌｌｏｎ、　Ｄ、　Ｐ、　）らのＪ、　Ｃ１１ｎ、　Ｈｅ ｍａｔｏｌ、０ｎｃｏ１．　１０：３９−４８（１９８０）、マニアチスらのＣ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓ ｅ、　３巻、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、アカデミツク鳴プレス、ニュー ヨーク、　５６３−６０８（１９８０）］。

発現のための、構築物（類）含有ベクターまたはＤＮＡ配列が調製されれば、そ のＤＮＡ構築物（類）を適当な宿主細胞に種々の適当な手段、たとえば形質転換 、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔 法、カルシウム沈澱法、直接マイクロインジェクション等のいずれかにより導入 する。ベクターの挿入後、受容細胞を、ベクター含有細胞を選択するための選択 培地で培養する。クローン化遺伝子配列（類）の発現によりｇｐ３３０タンパク 質か、該タンパク質のフラグメントが生成する。これは、形質転換体をそのまま 、またはこれらの細胞の分化を誘導（例えば、神経芽細胞腫細胞等にブロモデオ キシウリジンを与えることにより）した後、起こすことができる。

発現したタンパク質を、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロ マトグラフィー、電気泳動等の常法に従って単離、精製する。

本発明はまた、ｇｐ３３０またはそのフラグメントとベータガラクトシダーゼ等 の検出可能な酵素からなる融合タンパク質をコードするクローン化遺伝子に関す るものである。そのような融合タンパク質の製造方法は、例えば、パイ［Ｂａｉ 、　Ｄ、　Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２６１＋１２３９５−１２３９９（１９８６）］またはヒユー［Ｄ Ｎ／Ｈｕｙｎｈ、　Ｔ、　ＴＪ、　ｅｔａｌ、、　ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：＾、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　Ｄ 、　Ｇｌｏｖｅｒ　（ｅｄ、）、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、　（１ ９８５）、　ｐｐ、４９−７７］により記載されている。

ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体、またはｇｐ３３０またはそのフラグメン トと検出可能な酵素とを含有する融合タンパク質は当業者周知の方法で単離する ことができる。例えば、この細胞は遠心、または適当なバッファーを用いて採取 し、溶解し、ＤＥＡＥ−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸− アガロース、ヒドロキシアパタイト等のカラムクロマトグラフィー、あるいは電 気泳動または免疫沈降等に付して、タンパク質を単離することができる。

ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体、またはｇ　ｐ　３３’０と検出可能な酵 素とを含有する融合タンパク質は抗−ｇｐ３３０抗体を用いても単離することが できるポリクローナルウサギ抗ｇｐ３３０血清の調製は後述の実施例２に記載さ れている。

従って、上記の方法により、ｇｐ３３０タンパク質または該タンパク質のフラグ メントをコードし得る遺伝的配列を同定することができる。そのような遺伝的配 列をさらに特性化するために、これらの配列がコードするタンパク質を発現させ 、それらがｇｐ３３０ペプチドの性質を有することを確認することが望ましい。

そのような性質には、抗ｇｐ３３０抗体との結合活性、抗ｇｐ３３０抗体の産生 を惹起する能力、またはｇｐ３３０のリガンドであると思われる７６ｋＤ血清タ ンパク質［（Ｉａｎａｌａｓ、ＪＪ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ｌ１ｎｕｎｏ１ ．１４１：４１５２（１９８８）］との結合等のｇｐ３３０の生物学的作用のい ずれかを表す作用が含まれる。

抗体については、それが、ある分子と非共有結合を形成して特異的ｌ二反応し得 る場合、その分子と「結合できるＪと言う。「エピトープ」なる用語は、抗体が 認識することができ、結果的に結合する、大きい構造の最小部分を指す。エピト ープは、このように、該エピトープとは特異的に結合するが、大きい構造に存在 している他のエピトープとは結合しない抗体について定義される。当該技術分野 で用いられ、本明細書においても用いるように、「抗原」という語句は１または それ以上のエピトープを含有する分子構造を包含する。

適切に与えられた「抗原」は、該抗原のあるエピトープに特異的に結合し得る抗 体を産生する能力を動物にもたらす。「特異的」という語句は抗体が高い選択性 をもって対応する抗原と反応し、それ以外の抗原とは反応しないことを示唆して いる。逆に特異抗原は他の抗原によって惹起された他の複数の抗体とは反応しな い。

本明細書で使用している「抗体（Ａｂ）Ｊまたは「モノクローナル抗体（Ｍａｂ ）Ｊなる用語は、抗原と結合できる無傷の分子およびそのフラグメント（たとえ ば、ＦａｂおよびＦ　（ａｂ’　）、フラグメントなど）を包含する。Ｆａｂお よびＦ　（ａｂ’　）　ｚフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠 いており、循環系からより迅速に消失し、また無傷の抗体分子より低い非特異的 組織結合性を示すらしい［ウオール（Ｗａｈｌ）ら、Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ 、　２４：３１６−３２５（１９８３）］。

本発明の抗体は、種々の方法のいずれによっても調製することができる。たとえ ば、ｇｐ３３０タンパク質またはその機能的な誘導体を発現する細胞を動物に投 与してもよい。このようにして免疫された動物の血清中にはｇｐ３３０と結合し 得るポリクローナル抗体が存在する。

より好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。そのようなモノク ローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって調製することができる［コーラ−ら （Ｋｏｈｌｅｒ）　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）、コーラ−ら、 Ｅｕｒ、ＪＪｍｍｕｎｏｌ、６：５１１（１９７６）、コーラ−ら、Ｅｕｒ、　 Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６：２９２（１９７６）、ハンマーリング（Ｈａａ＋ ｍｅｒｌｉｎｇ）ら、１１ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ 　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、エルセピア、ニューヨーク、５６３− ６８１頁（１９ｇり］。一般に、このような方法は、マウスまたはラットをｇｐ ３３０抗原で免疫することを包む。次いで、膵臓細胞を採取し適当な骨髄腫セル ラインと融合させる。本発明にはあらゆる適当な骨髄腫セルラインを使用するこ とができる。融合した後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的し 、次いでウォンズ（Ｗａｎｄｓ、　Ｊ、　Ｒ，ら［Ｇａｓｔｏｅｎｔｅｒｏｌｏ ｇｙ　８０：２２５−２３２（１９８１）、これを引用によって本明細書に包含 させる］記載の限界希釈法等の既知の方法の任意の方法を用いてクローニングす る。次いで、このような方法によって得たハイブリドーマ細胞を分析し、ｇｌ） ３３０と結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。

ｇｐ３３０またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を用い、上記の標識 プローブを用いるラットｇｐ３３０の単離と同様に、ヒトにおける類似分子「ヒ ト類似体」を単離することができる。次いで、ヒト遺伝子をクローニングし、宿 主内で発現させ、ヒトｇｐ３３０類似体（アナロガス）を製造することができる 。このヒトタンパク質または糖タンパクは対応する自己抗体を検出するための診 断分析、およびヒト膜性糸球体腎炎の治療的処置に用いることができる。

本発明はまた、糸球体腎炎の治療方法であって、ｇｐ３’３０またはその機能的 な誘導体をポリフェノールと結合（カップリング）させた後、ポリフェノール− ｇｐ３３０で動物を免疫し、それにより糸球体腎炎に特徴的な抗体の産生を抑制 し、該疾患の症状を予防または改善する方法に関する。そのようなポリフェノー ル結合物（コンジュゲート）は米国特許第４，７０２，９０７　（ベラカーら（ Ｂｅｃｋｅｒ））に記載されている。とりわけ、発明はこの点で選択的な抗ｇｐ ３３０抗体の免疫抑制法に関しくここに該抗体はＩｇＥアイソタイプでない）、 該方法は、以下の方法からなる。

（ａ）少なくとも２個の水酸基を有するルチン様ポリフェノールと、腎炎を誘発 し得るｇｐ３３０またはその機能的な誘導体とを結合させて生成物を得（ここに 、該ポリフェノールに２個の水酸基のみが存在する場合には、これら水酸基は互 いにオルト配位であることを条件とする）、 （ｂ）得られた結合物を対象に注射することにより、ｇｐ３３０またはその機能 的な誘導体に対する特異抗体を選択的に抑制する。

ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体はまた、動物またはヒトの血清からｇｐ３ ３０反応性自己抗体を選択的に除去するのにも用いることができる。この態様で は、ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を固相支持体に固定化する。動物の血 液または血清をこの抗原含有支持体の上に通過させて選択的に自己抗体を除去す る。表面にペプチドを結合（アタッチ）させる方法は当業者に周知であり、本発 明に容易に援用することができる。例えば、ポリペプチド抗原の末端アミノ酸を 、固相ポリマーの反応性のカルボニル、カルボキンレート、ヒドロキシル、また はアミノ基（あるいはポリマーに結合させた連結基）と反応させることができる 。プラスチックまたはガラス表面を非修飾ペプチドで被覆する方法を用いても免 疫学的に反応性の表面を得ることができる（ＰＣＴ出ａＮｏ、　ＷＯ３６１０４ ０９３および米国特許第４．３６２．１５５参照）。

このように、本発明の１態様はヒト膜性糸球体腎炎の治療方法に関し、該方法は 、 （ａ）ヒト膜性糸球体腎炎に特徴的な自己抗体と結合し得る、ｇｐ３３０、また はその機能的な誘導体、またはそのヒト類似体を固定化した固相支持体を得、 （ｂ）患者の血液を（ａ）で得た固定化した、ｇｐ３３０、その機能的な誘導体 、またはそのヒト類似体と接触させることにより、血液からヒト糸球体腎炎に特 徴的な自己抗体を除去することを含む。

患者の血液中のｇｐ３３０抗体の除去は生体内での免疫複合体の生成を減少し、 以後の炎症性疾患の軽減をもたらすであろう。

本発明に従って産生されるｇｐ３３０またはその機能的な誘導体はまた、免疫複 合体の生成を混乱させる目的で、罹患している患者に直接投与することもできる 。ＰＣＴ出願Ｎｏ、　Ｙ０８６１０４０９３参照。

自己免疫状態における免疫複合体の生成は臨界濃度の抗原および抗体の存在に依 存しており、複合体形成はある比率においてのみ起こる。この比率は自己免疫疾 患の危機期間に最もあり得ると推測される。本発明方法によれば、実質的に純粋 なｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を注射することで抗原−抗体の比率を変 化させ、そのことにより新規な複合体の生成を阻害することになろう。細網内皮 系および食細胞は、既に形成された免疫複合体を除去し、糸球体腎炎を導く免疫 複合体の腎臓への沈着を首尾よく妨害することができる。

合成の免疫原性ｇｐ３３０ペプチドまたはその機能的な誘導体は、ｇｐ３３０ま たは類似のヒト膜性糸球体腎炎−関連抗原に特異的な、抗原特異的ヘルパーおよ び細胞毒性Ｔ−細胞の活性化または作用に対する阻害活性の故に治療上有用であ る［ギレット；　（Ｇｕｉｌｌｅｔ、　Ｊ。

−Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５：８６５−８７０（１ ９８７）］　、そのような免疫原性ペプチドを、重なり合う（オーバーラツプす る）入れ予成の一連のペプチドを合成し、それらをリンパ球増殖に関して試験す るか、または細胞毒性分析に付すことで製造、選択する。そのような治療は自己 免疫膜性糸球体腎炎において作用しているＴ細胞応答、これは抗原特異的Ｔヘル パー細胞の調節下にあって、細胞仲介性免疫および自己抗体の産生の両方を含む が、を減少することを目的とするものである。

合成または先端を切断した融合タンパク質もＢリンパ球またはＴリンパ球が認識 するｇｐ３３０の免疫ドミナント（優勢）部位の位置決定に有用である。このよ うに、これらある種の抗原性ペプチドにより、ｇｐ３３０に特異的な自己抗体、 およびｇｐ３３０または近縁の腎炎原性抗原に特異的なヘルパー、細胞毒性、ま たはサプレッサーＴ細胞を検出することができる。

また、抗原製品および抗体製品を含めて本発明の免疫診断試薬は内因性自己免疫 膜性糸球体腎炎を発症し得る患者、並びに腎移植後に自己免疫膜性糸球体腎炎を 発症する可能性ある患者の同定に有用である。

驚くべきことには、本発明者らは、ｇｌ）３３０のタンパク質配列がマウス表皮 成長因子前駆体（ＥＧＦ、）およびヒト低密度リボプロティンレセプター（ＬＤ Ｌ、）と相同性（ホモロジー）を示すことを見いだした。ＬＤＬ、は約１４アミ ノ酸の７個の伸長リピート（反復配列）を有している［Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３９：２７（１９８４）］。ｇｐ３３０には、少 なくとも１４の別個のリピートに約４゜アミノ酸のホモロガス（同質の）な配列 が認められた。ＬＤＬ、の高度に保存された細胞質領域は肝臓アシアログリコプ ロティンレセプターに見いだされている２個の配列と同一の７アミノ酸からなる 配列（ＮＦＤＮＰＶＹ）を含有している。ｇｐ３３０のタンパク質配列は３個の そのような反復配列を含有する：第１は２３７０から出発し配列ＩＦＥＮＰＭＹ を有する（図４）：第２は２４７０から出発し配列ＮＶＥＮＱＮＹを有する（図 ４）；第３は２６０８から出発し配列ＮＩＥＮＰＩＹを有する。これら反復配列 はエンドサイト−シスの工程に重要と考えられている。即ち、これらを知ること により（これら配列の１またはそれ以上を含有する）組換えレセプタータンパク を構築し、そのような人工的なレセプターを細胞内取り込みビヒクル内に配置す ることができる。１またはそれ以上の反復配列を分子のカルボキシ末端に結合さ せることでその分子をエンドサイトに出し入れ（シャトル）することができる。

ｇｐ３３０分子は１８８アミノ酸長さのカルボキシ末端テイルを有し、トランス メンブラン領域の末端から分子のカルボキシ末端に至る配列がＬＤＬ、と異なっ ている。

ｇｐ３３０とＥＧＦ前駆体ペプチドとの相同性を知ることにより、ｇｐ３３０ま たはその機能的な誘導体を用いて動物の病理生理学的状況を診断することができ る。例えば、実質上純粋なｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を動物に与えて ＥＧＦに特徴的な応答を誘発し、例えば、火傷や擦過傷等の傷の治癒を促進する ことができる。

米国特許第４．７４３，６７９　（１９８８）参照。

本発明の１態様は傷の治療法であって、動物に、（ａ）ｇｐ３３０、その機能的 な誘導体、またはそのヒト類似体、および （ｂ）薬学的に許容し得る担体 を含有する医薬組成物を、該ｇｐｇｐ３３０、その機能的な誘導体、またはその ヒト類似体が傷の治療に有効な量で存在するように投与することからなる方法に 関する。

傷の治療に有効なｇｐ３３０、その機能的な誘導体、またはそのヒト類似体の量 は当該技術分野における通常の技術者が、単なる日常的な実験で決定することが できる。

ＥＧＦはまた胃酸分泌の強力な阻害物質であることも知られている［米国特許第 ４．７４３，６７９　（１９８８）　、欧州特許公開第０　１７７　９１５（１ ９８６年公開）およびＰＣＴ出願公開Ｎｏ。

ＷＯ３５１００３６９参照］。従って、ｇｐ３３０、その機能的な誘導体、また はそのヒト類似体は胃潰瘍の治療または予防に有用である。

即ち本発明は、動物の胃潰瘍の予防または治療法であって、動物に、 （ａ）ｇｐ３３０、その機能的な誘導体、またはそのヒト類似体、および （ｂ）薬学的に許容し得る担体 を含有する医薬組成物を、該ｇｐ３３０、その誘導体、またはそのヒト類似体が 該潰瘍の予防または治療に有効な量で存在するように投与することからなる方法 に関する。

胃潰瘍の治療または予防に有効なｇｐ３３０、その機能的な誘導体、またはその ヒト類似体の量は当該技術分野における通常の技術者が、単なる日常的な実験で 決定することができる。

家族性高コレステロール血症（ＦＨ）を有する個人はＬＤＬレセプターをコード する遺伝子における突然変異の存在を調べることで診断することができる。これ は患者から得た断片化ＤＮＡをＬＤＬレセプタータンパク質をコードする組換え ｃＤＮＡでスクリーニングすることで行うことができる。米国特許第４．　７４ ５．　０６０　（１９８８）参照。ｇｐ３３０の部分をコードするｃＤＮＡクロ ーンはＬＤＬレセプター遺伝子と４１および３５％の相同性を示すので、ｇｐ３ ３０ｃＤＮＡまたはそのフラグメントはＬＤＬ遺伝子に突然変異を有する患者の 診断にも有用である。当業者周知のごとく適当なストリンジエン一度で行うハイ ブリダイゼーションにより、ＬＤＬレセプター遺伝子に突然変異を有する個人か ら得たゲノムＤＮＡは、ｇｐ３３０またはそのフラグメントに、正常な個人から 得たＤＮＡよりも強くまたは弱く、ハイブリダイズすることができる。このよう なハイブリダイゼーションの変化に基づいて患者のＦＨを検出することができる 。

本発明は動物における、ＬＤＬレセプター遺伝子に関連した遺伝的な異常（例え ばＦＨ）を検出する方法であって、（ａ）ＦＨを有することが疑われる動物から ＤＮＡを単離し、（ｂ）ステップ（ａ）で単離したＤＮＡを断片化してＤＮＡ断 片を得、 （Ｃ）工程（ｂ）で得たＤ　Ｎ　Ａ断片を分離し、（ｄ）工程（Ｃ）で分離した ＤＮＡ断片を検出可能にラベルしたｇｐ３３０ｃＤＮＡ、またはその断片と接触 させ、（ｅ）ｇｐ３３０ｃＤｓＡまたはその断片と該分離したＤＮＡ断片とのハ イブリダイゼーションを検出することからなる方法に関する。

ＦＨの存在が疑われる個人から得たＬＤＬ遺伝子断片のパターンを正常人から得 たパターンと比較する。疑わしい個人において同定したＬＤＬＲレセプター遺伝 子断片のパターンの、対照パターンからの相対的な変化が分かれば、遺伝的な異 常または突然変異が検出されたことになる。そのような遺伝的異常は当業者周知 であり、例えば点突然変異、フレームシフト、欠失、挿入、逆位等を含む。

本発明に従い、例えば制限酵素消化等の当業者既知の方法でＤＮＡを断片化する 。得られたＤＮＡ断片を、例えば、密度勾配法等を用いる重力沈降法のごとく分 子量に応じて分離するか、排除ゲルクロマトグラフィーを用い、分子の大きさに 応じて分離することができる。あるいは、アガロースまたはポリアクリルアミド ゲルマトリックスを用いる電気泳動で断片を分離してもよい。ハイブリダイゼー ションおよびオートラジオグラフィーの後に、対応するゲノムＬＤＬレセプター ＤＮＡ断片パターンが容易に観察できるよう、ｇｐ３３０　ｃ　ＤＮＡまたはそ のフラグメントを放射性核種で検出可能にラベルするとよい。重同位体を用いる 他の標識方法も有用である。

以上、本発明を一般的に論じてきたが、本発明をより容易に理解し得るよう、以 下に具体的な実施例を挙げて説明する。これらの実施例は例示を目的とするもの であり、本発明またはその態様を制限する意図ではない。

寒奥男 正常ラットの細尿管に富む粗画分（ＦＸＩＡ）を、糸球体をろ去した後、分画遠 心に付すことからなる既述の方法で調製した［Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、Ｔ、Ｓ、ｅ ｔ　ａｌ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１２７：５５５−５７２（１９６ｇ）コ。タン パク質濃度３　ｍｇ／ｍｌでＦＸＩＡを用い、可溶性膜タンパク質（ＦｘＤＯＣ ）を１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および１％デオキ シコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８，６ ）で氷上にて１時間抽出した。２７，０００ｘｇで２０分間遠心することにより ＦｘＤＯＣを不溶性物質から分離した。

抗−ｇｐ３３０モノクローナル抗体、１４Ｃ１［バーンら（Ｂｈａｎ。

Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　５３：４２１−４３２ （１９８５）］を用い、グルツク（Ｇｌｕｃｋ、　Ｆ、）およびカルドウエル（ Ｃａｌｄｗｅｌｌ、　Ｊ、）　Ｄ、　Ｂｉｏｌ。

てアフィニティー精製ラットｇｐ３３０を、ＦｘＤＯＣから調製した。

精製ｇｐ３３０を還元および非還元条件下、４−１２％アクリルアミドグラジェ ントを用い、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　［レムリ（Ｌａｅｎ＋ｍｌｉ。

Ｕ、）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０）コで分析した。分子量 マーカーとして非還元フィブロネクチンを用いた。ゲルをクーマシーブルーで染 色した。

モノクローナルアフィニティー精製ｇｐ３３０は還元および非還元条件下で、見 掛けの分子量４４０，０００において単一のクーマシーブルー染色バンドを示し た。

実施例２　ウサギ抗−ｇｐ３３０の調製ウサギ抗ｇｐ３３０ポリクローナル抗体 は、ニューシーラント白ウサギに、完全フロイントのアジュバント中アフィニテ ィー精製うットｇｐ３３０約２５μｇを皮肉投与した後、不完全フロインドアジ ュバント中のタンパク質を用いて２および４週間後に追加免疫することにより該 ウサギを免疫して調製した。最終注射の２週間後に動物から採血した。

ウサギ抗血清の免疫原との反応性を固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により カマツらの方法で調べた［ＫａＩＩｌａｔａ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ ＋ｕｕｎｏ１．１３５：２４００−２４０８（１９８５）］　、抗血清は１　： 　１０．０００希釈免疫原と反応した。

実施例３　ハイマン腎炎糸球体溶出液の調製ラットＦＸＩＡ＋アジュバントを用 いてニシントン［Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ。

Ｔ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１２７：５５５−５７２（１ ９６８）］の方法で免疫して誘発した活性なハイマン腎炎ラットから腎臓を得た 。

既述の方法で糸球体溶出液を調製した（Ｋａｍａｔａ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　 ］、　Ｉりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）　、ｐＨ７，３で洗浄して赤血球を除去 し、積層金属ふるいに強制的に通した。２００メ・ンシュのふるＬｌから糸球体 に富む画分を得、４００Ｘｇで５分間遠心してペレット化しｌｎＭ　ＰＭＳＦ含 有ＰＢＳで上清が清澄になるまで洗浄した。

最終の遠心後、０．０２Ｍクエン酸ノ〈・ノファー、ｐＨ３，２を加えて１０％ 懸濁液を得た。この懸濁液を氷上において緩やかな条件下でソニファイアーセル ディスラブタ−（ｓｏｎｉｆｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ。

Ｊ（ｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｌｌｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｐｌ ａｉｎｖｉｅｗ、　Ｌｏｎｇ　ｌ５ｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて音波処理した。３ ７℃で４時間インキュベーションした後、懸濁液を１０．０００ｘｇで２０分間 遠心し、上清を回収し、ｐＨをＩＭＴｒｉｓ塩基を加えてｐＨ７，３に調節した 。溶出液を陰圧限外ろ過（Ｃｘ−１０ｉｍｍｅｒｓｉｂｌｅ　ｆｉｌｔｅｒ、　 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、　；　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍａ）で濃縮し、５ ０倍容量のＰＢＳに対して４℃で１夜透析した（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ　２．　 Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇ ｅｌｓ、　ＣＡ）。

ｇｐ３３０のトリプンンフラグメントはウォンら［Ｗｏｎｇ、　１．　ｆ、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（ＩｊＳ人）　８２ニア７１１（１９８５ ）］の方法に従って調製した。７Ｍグアニジン塩酸塩中３ｎＭの精製ｇｐ３３０ をジチオスレイトール処理して還元し、３７℃において［１４Ｃ］　ヨード酢酸 でアルキル化した［Ａｍｅｒｓｈａｍ、　５６Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　１ｃｉｘ３７ ＧＢｑ］ｏ　４容量のアセトン−メタノール（５０：５０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で 放射アルキル化タンパク質を沈澱させた後、タンパク質を０２％　Ｚｗｉｔｔｅ ｒｇｅｎｔ　３−１４　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）含有０．１ Ｍ　ＮＨ，ＨＣＯ３中に７０℃で１５分間加熱して再度溶解させ、Ｌ−１，−１ シルアミド−２−フェニルメチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシ ン（Ｅ。

Ｃ，３，４，２１，４；　Ｃｏｏｐｅｒ　ＢｉｏＩＩｌｅｄｊｃａｌ、　１ｌａ ｌｖｅｒｎ、　ＰＡ）で３７℃において２２時間処理し、−夜開裂させた。試料 を１％５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付し、Ｍｒ＞２０，０００以上のｇｌ）３３０フ ラグメントの不存在を認めた。

Ｂ、）リブシンペプチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）ウオン ら（ｌｏｎｇ、　１．　Ｌ、前掲）およびベネットら（Ｂｅｎｎｅｔｔ、　Ｅｌ 。

Ｐ、　Ｊ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１６８：９）の方法に従ってｇｐ３３０ ）リプシンペプチドを精製した。凍結乾燥してＮ　Ｈａ　ＨＣＯｓを除去した後 、ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中６Ｍグアニジン２００μｌ に再懸濁し、Ｖ　ｙｄａｃフェニルカラム（２５ｘ０．４６ｃｍ）と０．１％Ｔ ＦＡ中０−６０％アセトニトリルの線状グラディエンドを用いる逆相高速液体ク ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離した。手動でクロマトグラフィーピークを 採取し凍結乾燥してペプチドを回収した。選択した画分を再クロマトグラフィー で精製した。ペプチドを２１４および２８０ｎｍの吸収に基づいて検出した。ア ミノ酸配列決定のために、再クロマ）・グラフィーで５個のペプチドを精製し、 ペプチド５３．５４．６０，７４および７７を同定した（ｒＡｌ）。

Ｃ，タンパク質配列の決定 トリプシンペプチドのアミノ酸配列をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　４ ７０Ａ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ　および１２０Ｐｔｈ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、 自動化エドマン分解法で決定した。これら５個のペプチドの配列を図２に示す。

Ｄ、縮重オリゴヌクレオチドプローブの合成図２記載のペプチド＃７７の最初の ９アミノ酸に対応する２３塩基のオリゴヌクレオチドを縮重度１６倍で、Ａｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８０＾ＤＮＡ合成装置を用いて合成し、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で精製した。「あいまいなコドン位置」には、縮重 度を２５６から１６倍に下げるためにデオキシイノシン（１）を用いた［オーツ カら（Ｏｈｔｓｕｋａ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｗ、　２６０：２６０５（１９８５）＋ラーセ（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，）　、　 Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８３：１（１９８５）］　、合成オリゴヌクレオ チドプローブは以下の配列を有する：　ＴＡ　（Ｔ／Ｃ）−ＴＧＧ−ＧＴ　（１ ）−ＧＡ　（Ｔ／Ｃ）−ＧＣ（１）−ＴＴ　（Ｔ／Ｃ）−ＴＴ　（Ｔ／Ｃ）−Ｇ Ａｏ Ｅ、ラット腎臓のλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング ラット腎臓のλｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　；　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、　ＣＡ）をヒュン（Ｈｕ ｙｎｈ）らの方法［Ｈｕｙｎｈ、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇｓ：　Ａ　Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、Ｄ、Ｍ、　Ｇｉｏｖｅｒ　ｅｄ、。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　ｌ：４９ｚ（１９８５）コに従い、ウサ ギ抗ｇｌ）３３０抗血清でスクリーニングした。ウサギ抗血清をＴＢＳＴ（５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７，９−’、１５０ｍＭ　ＮａＣ１−＋−０，０５％ 　”ｌ”　ｗｅｅｎ２０）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および００２ ％ＮａＮ３で１・１０００希釈し、さらに精製することな（用いた。結合した抗 体を西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギの抗ウサギ抗体またはビオチ ニル化第２抗体と一緒にインキュベートした後、アビジン−ビオチン−西洋ワサ ビベルオキシダーゼ複合体を形成させた（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）。ペルオキシダーゼの基質には４−クロロ−１−ナフト ールを用いた。３ラウンド目のスクリーニングでプラーク精製を得た。免疫反応 性が同定された７個のクローンをさらに検査し０．４．０．４８．０．６．１． ２．１．４および２個の２．４ｋｂのｇｐ３３０ＤＮＡ断片が含まれていること を見２３塩基のオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ［Ｎｅｖ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓコと　［７−３２Ｐコ　ＡＴＰ　（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　ＮｕｃｌｅａｒＸＺｏｅｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｍ、、 　ＤＮＡ　３：４７９（１９８４）］を用いて比活性１０　”ｃｐｍ／ｌｔ　ｇ 　Ｄ　Ｎ　Ａで末端標識した。

全ファージＤＮＡを免疫反応性クローンから単離し［１ｌａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ 、　。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ 、３６３］　、ＥｃｏＲＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消 化した。１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分離し、サザーン［５ｏｕ ｔｈｅｒｎ、　Ｅ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：５０３（１９７５ 月記載の方法でＺ　ｅｔａｂｉｎｄフィルター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に移し た。このフィルターは、あらかじめ６ｘＳＳＣ，５ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ、　０ ．０５％ピロりん酸ナトリウム、０．０５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌニシ ン精子ＤＮＡを含有する溶液中、４２℃で１夜ハイブリダイゼーシヨンに付され た。次いでフ゛イルターを６ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ，１ｘＤｅｎｈａｒｄｔｓ、　０． ５％ピロりん酸ナトリウム、および１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含有す る溶液中、放射能標識したオリゴヌクレオチド製品と５０℃で１夜ハイブリダイ ゼーシヨンした。プロットを、６ＸＳＳＣおよび０．０５％ピロりん酸ナトリウ ムにより室温で２回洗浄し、５０℃で５分間の洗浄を１回行った後、Ｋｏｄａｋ 　ＸＡＲフィルムに一７０℃で１夜露出した。

オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションした１゜４　ｋｂＤ　Ｎ 　Ａ断片をゲル精製し、このゲルに、ＢＲＬ　（Ｂ６ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｉｒｉｅｓ）のニックトランスレーションキツトを用い てニックトランスレーションにより［α−３２Ｐ］　ｄＣＴＰ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）を導入した。このニックトランスレートしたプロ ーブを用いるハイブリダイゼーションも行った。

Ｇ、ＤＮＡ配列決定 ＥｃｏＲＩ消化陽性クローンのゲル精製ｃＤＮＡ挿入体をマニアテイスの方法［ Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　、　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｊｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　３６３コに従って、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）にサブクローニングした。

バーンポイムとドーりの方法［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ヱ：　１５１３（１９７９）］に従ってプラスミドＤＮＡ を単離し、サンガーらのジデオキシヌクレオチド鎖配列決定法［Ｓａｎｇｅｒ、 　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　７４：５４６３（１９７７）］でＤＮＡ配列を決定した。

Ｂ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした挿入体の部分制限地図をＡｃＥ ＣＣ１ａＩ、ＥＣ０ＲＩ、　ＨｉｎｄＩＩＩ、およびｂす制限酵素（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄＢ　１ｏｌａｂｓ）で単一または２重消化して得た。

図３はオリゴヌクレオチドプローブの実際のハイブリダイゼーション部位を示す 。図３はまた３個の挿入体がオーバーラツプする制限地図を有することをも示し ている。

実施例６　ハイマン腎炎からの溶出抗体と部分ｇｐ３３０融合タンパク質の反応 図２記載の部分クローンによってコードされている融合タンパク質を、パイら［ Ｂａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６１：１２３９５ （１９８６）コのプレートリゼート（ｐｌａｔｅ　１ｙｓａｔｅ）法を用いて製 造した。大腸菌Ｙ１０９０にファージクローンおよびλｇｉｌｌを感染させた。

ファージを、大腸菌上で４２℃で３５時間で増加させた。３７℃でさらに３．５ 時間、プレートに５．ＱｍＭ　イソプロピル　β−Ｄ−チオガラクトピラノンド （Ｉ　ＰＴＧ　：　Ｓ］ｇｍａ）０．８＋ｏｌを重層した。等量の水を対照とし て用いた。誘導後、プレートを２倍強度のレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプルバ ッフｙ　−（Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉ、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０（１９７０） コ０８ｍｌと一緒に、穏やかに回転振盪しながら室温でさらに１５分間インキュ ベーションした。得た溶液を合し、７．５％Ｎ　ａＤｏｓＯ４−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により可溶化タンパク質の試料８０μｍを分離した。分子量を 決定するために１つのゲルをクーマシーブルー染色した。他のゲルから得たタン パク質はツービンらの方法に従って［Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７６：４３５０（１９７ ９）：Ｉ電気泳動的にニトロセルロースペーパー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し ポリクローナル抗ｇｐ３３０抗血清（１：１０００希釈）と反応させ、フィルタ ーを３％ＢＳＡ含有バッファーでブロックした後、室温で穏やかに振盪しながら １夜、ハイマン腎炎自己抗体（０，５ｏｇＩｇＧ／ｍｌに希釈）と−緒に溶出さ せた。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したヤギ抗マウスＩｇＧ　（Ｂ　１ｏ −ｒａｄ）をハイマン溶出液の２次抗体に用いた。

免疫プロット分析で、融合タンパク質はｇｐ３３０に対するポリクローナル抗血 清と反応性を示した。組換えλｇｔｌｌに感染した大腸菌は、ＩＰＴＧによって 誘導された大腸菌と比較して、ＩＰＴＧなしに少量の免疫反応性の融合タンパク 質を産生する。非組換えλｇｔｌｌに感染した大腸菌から産生されたタンパク質 とは反応しなかった β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質とハイマン溶出液とのウェスタンプロット 分析で融合タンパク質は強い反応を示した。即ち、各融合タンパク質は病原性自 己抗体によって認識される、少なくとも１個の抗原性部位を有する。０．４ｋｂ 挿入体（図５、領域り上の黒い線）はｇｐ３３０の免疫反応性部位を有する。興 味深いことには、領域りは８個のＬＤＬ、コンセンサスリピートを含有する（図 ５．６．７および８）。さらに、ｇｐ３３０のこの領域はＮＨ２末端に位置する （ただし、ｇｐ３３０中でのその正確な位置決定は全ヌクレオチド配列の完成を 待つ必要がある）ことから、この抗原性部位はｇｐ３３０の、上皮細胞の外表面 から伸びる領域を占めるとも思われる。この部位に接する領域に、さらに免疫反 応性の領域が存在するか否かは不明である。オーバーラツプする２、４ｋｂ挿入 体から導かれた、他の融合タンパク質は、これら各融合タンパク質に他のコンセ ンサスリピート（図５．６、および７、領域Ｅ）が含有されているにもかかわら ず、自己抗体と反応しなかった。融合タンパク質はグリコジル化されないので、 抗原性部位はｇｐ３３０のタンパク質成分に含まれているにちがいない。

要約 要約すると、ｇｐ３３０に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を用い てラット腎臓λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｇｐ３３ ０の部分ｃＤＮＡりＯ−：／（０，４，０，４８，０，６，１，２，１，４およ び２個の２．４ｋｂクローン）を単離した。１，４ｋｂ挿入体の５°末端にスク リーニング用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が存在することから、それ がｇｐ３３０のｃＤＮＡクローンの１部であることが明らかになった。さらにこ れらクローンの３個によって発現された融合タンパク質はこの抗体と強く反応し 、発現したタンパク質がｇｐ３３０の１部であることを示唆していた。抗体はポ リクローナルであるために、認識されたエピトープの中にはインビボでの免疫複 合体の形成に関与する組織抗原でないものも含まれるであろう。

発現された融合タンパク質のエピトープ特異性を確かめるために、それらをｇｐ ３３０に特異的な自己抗体を有することが分かつているハイマン腎炎ラットの糸 球体溶出液で試験した。全融合タンパク質がハイマン腎炎自己抗体と強く反応し た。これら３個のクローンの制限地図から、ハイマン腎炎自己抗体によって認識 されるエピトープの１つがクローンの重なり合った領域に存在するＤＮＡによっ てコードされているものに相違ないことが示唆された。

最小の挿入体によって産生される融合タンパク質は１３０ｋＤである。β−ガラ クトンダーゼの見掛けの分子量は１１６ｋＤなので、ノλイマン腎炎自己抗体は 見掛けの分子量が１４ｋＤと小さいタン／くり質内に含有されているエピトープ と反応した。

実施例６　ｇｐ３３０ＤＮＡとヒトＬＤＬ、＄よびマウスＥＧＦ、配列との比較 推定のｇｐ３３０部分配列が他のタンパク質配列と同一の配列を有するが否かを 調べるためにＮａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆ ｏｕｎｄａｔｉｏｎのタンパク質データベースおよびＦＡＳＴＰプログラム［Ｄ ｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１２：３８７（１９８４）　；　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ。

による研究を行った。タンパク質配列の同一性はラットｇｐ３３０、図６は５個 のｃＤＮＡ部分のヌクレオチド配列から推定されたｇｐ３３０の構造とヒトＬＤ Ｌアとを比較したものである。図８に示したクローンは他の５個のどれともオー バラップせず、その配列内の位置はまだ決定されていない。中断の印の間の２領 域のｇｐ３３０タンパク質配列は未だ決定されていない。領域Ａ−Ｄを含む領域 のタンパク質配列は０．４ｋｂ、　０．６ｋｂ、および１．４ｋｂクローンから 導かれた、入れ子のｃＤＮＡから推定した。ｇｐ３３０カルボキン末端のタンパ ク質配列（領域ＥおよびＦを含む２９残基のトランスメンブランセグメント（マ ークＸ）、および細胞質ティルセグメント）を、部分的にオーバラップする、２ 個の２．４ｋｂＤＮＡ配列含有部分ｃＤＮＡクローンから推定し、−緒にして２ ．９ｋｂのヌクレオチド配列を得た。自動エドマン分解法でめた２個のｇｐ３３ ０トリプシンペプチド配列の位置を１または２個のアストリスクを付した線で示 した。領域Ａ−Ｆは図６に示したアミノ酸配列に対応する。Ｌ　Ｄ　Ｌ　Ｒ内の 交差斜線（即ち重なり合った斜線）領域はｇｐ３３０の領域りおよびＥに相当す る。図６はラットｇｐ３３０、ヒトＬＤＬＲおよびマウスＥＧＦ、のアミノ酸配 列の比較をしたものである。アミノ酸の１文字表示を採用した。番号付は公表さ れた配列のアミノ酸残基番号［Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ １ｌ　３９：２７（１９８４）；　５ｃｏｔｔ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２２１：２３６（１９８３）コまたは１．４ｋｂ（領域Ａ−Ｄ） および２．９ｋｂ（領域ＥおよびＦ）ヌクレオチド配列から導かれたｇｐ３３０ 配列から帰属されるアミノ酸残基番号（即ち、ＮＨ２末端残基を１に帰属する） に対応する。ｇｐ３３０、Ｌ　Ｄ　Ｌ　＊およびマウスＥ　Ｇ　Ｆ　ｐのアミノ 酸配列の比較は領域Ａ−ＣおよびＦについて示した（図６参照）。それぞれ約４ ０アミノ酸を含有するコンセンサスリピート（反復）配列は領域りおよびＥに示 されている。配列を最適化するためにギャップを挿入した。ｇｐ３３０およびＬ ＤＬ、のコンセンサスリピートの比較は領域りおよびＥについて別個に示されて いる。

図７はラットｇｐ３３０のアミノ酸配列とヒトＬＤＬ、のアミノ酸配列［Ｄｅｖ ｅｒｅｕｘ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １２：３８７（１９８４）；　Ｍａｉｚｅｌ、　Ｊ、　Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８ニア６６５（１９ ８１）］の比較である。ｇｐ３３０のタンパク質配列はｌ、４ｋｂと２゜９ｋｂ （２個のオーバラップする２、４ｋｂを含有する）ｃＤＮＡ配列から推定された 。ヒトＬＤＬ、のタンパク質配列は前掲による（Ｙａｍａｍｏｔｏら）。大文字 は図６に対応する領域を指す。ｒＴＭＪは両タンパク質のトランスメンブランセ グメントの位置を表す。

オリゴヌクレオチドは１．４ｋｂ挿入体の５′末端（１個のアストリスクを有す る線）にハイブリダイズした。オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションす る領域はトリプシンペプチドで定義される暗号配列を含有しており、これはＬＤ Ｌ、と部分的に同一である（図６、領域Ａ）。Ｑ、４ｋｂ挿入体のＤＮＡ配列は Ｑ、５ｋｂ挿入体に完全に含まれており、それはまた１、４ｋｂ挿入体に完全に 含まれている。２個のオーバラップする２、４ｋｂ挿入体から、さらに２．９ｋ ｂヌクレオチド配列が得られた（図５、領域ＥおよびＦを含有するセグメント） 。この２．９ｋｂＤＮＡ配列から推定されるタンパク質配列は他のトリプシンペ プチド、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌと同一の配列（図５の２個のアストリスクで示した線） 、２９アミノ酸のトランスメンブランセグメント（図５のマークＸ）、並びにｇ ｐ３３０のカルボキシ末端部分を含有していた。ＬＤＬ。

およびｇｐ３３０は別個の８領域で同一であった（図６、領域Ａ−Ｆ、および図 ８の４８０塩基対のセグメント（未だ他のｇｐ３３０配列に相対的な位置が決定 されていない）内の２個のコンセンサス配列）。興味ある点は、ｇｐ３３０およ びＬＤＬ、が反復性／スティン豊富コンセンサス配列（約４０アミノ酸残基／リ ピート）を領域りおよびＥに有する点であるに６）。ｇｐ３３０分子の間隙には 、少なくとも１４のコンセンサスリピートが分布していた（図５、斜交線１．お よび図８の１セグメント）のに対し、ＬＤＬＰはそのＮＨ２末端に８個のコンセ ンサスリピートを有している［Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｔ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　３９：２７（１９８４）］　（図５、交差斜線）　 。ＬＤＬ、およびｇｐ３３０は互いに著しい同一性を示すので、同じ遺伝子ファ ミリーに属するのかもしれない。ヒト補体タンパク質Ｃ８αおよびβ鎖およびＣ ９前駆体も単一のＬＤＬ、コンセンサスリピートのコピーを含有する［ラオら（ Ｒａｏ、　Ａ、　Ｇ１．　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２ ６：３５５６（１９８７）：　ハワードら（ｌｌｌｏｗａｒｄ、　Ｏ，Ｍ、　Ｚ 、、　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔは非−反復領域においてタン パク質配列の同一性を示した（図６、領域Ａ−ＣおよびＦ）。

本発明は、完全に説明されたので、当業者ならば、広範囲におよぶ同等パラメー ター内で、本発明の思想または範囲、あるいはそのあらゆる実施態様の範囲を越 えることなく、本発明を実施し得るということを理解するであろう。

ｌＱ　３０　５０ ＴＧＴ　Ｔ　ＴＣＴＧＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＧＴＣＴＡ　ＴＧＡＧＴ ＡＣＣＣＡＴＴＡ　ＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＴ　ＧＴ　ＧＣＡfＣＴ Ｆ／Ｇ、　４Ａ Ｆ７Ｇ、　４Ｂ ＦＩＧ、　４Ｃ じヒ　ＬＤＬしｆ７°ｑ一つアミノ＠賢ｆ’Ｊ−そ５５ＦＩＧ、７Ａ ＦＩＧ、９Ｃ 国際調査報告 ＰＣＴ／υ５８９１０３６２１ １ｊ、Ｓ、Ｃ１，＋　４３５７６ア４３５／Ｌ７２．３．４３５／２５２．３． ４３５／３５ｔ）；　５３６／２７．５１４／２

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ハイマン腎炎抗原ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体をコードする遺伝的 配列を含有する組換えＤＮＡ分子。
2. ２．該遺伝的配列が図４記載の配列を含んでいる、組換えＤＮＡ分子。
3. ３．該遺伝的配列が図８記載の配列を含んでいる、請求項１記載の組換えＤＮＡ 分子。
4. ４．該遺伝的配列が図９記載の配列を含んでいる、請求項１記載の組換えＤＮＡ 分子。
5. ５．複製可能なベクターである、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
6. ６．請求項５記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主 。
7. ７．実質上純粋でありラット起源の不純物を含有しないハイマン腎炎抗原分子ｇ ｐ３３０またはその機能的な誘導体。
8. ８．図４記載のアミノ酸配列を含んでいる請求項７記載の分子。
9. ９．図８記載のアミノ酸配列を含んでいる請求項７記載の分子。
10. １０．図９記載のアミノ酸配列を含んでいる請求項７記載の分子。
11. １１．ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体の製造方法であって、（ａ）請求項 ５記載のベクターで形質転換またはトランスフェクションされた宿主を得、 （ｂ）該宿主を該遺伝的配列を発現させるに十分な条件下で培養し、（ｃ）該発 現されたｇｐ３３０またはその機能的な誘導体を回収することからなる方法。
12. １２．動物のＬＤＬレセプター遺伝子の遺伝的異常を検出する方法であって、 （ａ）該異常の存在が疑われる動物からＤＮＡを単離し、（ｂ）ステップ（ａ） で得た該ＤＮＡとｇｐ３３０またはその機能的な誘導体をコードするＤＮＡ配列 とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、 （ｃ）該ｇｐ３３０ＤＮＡ配列と該単離したＤＮＡとのハイブリダイゼーション を検出することからなる方法。
13. １３．該遺伝的異常が家族性高コレステロール血症である請求項１２記載の方法 。
14. １４．傷の治療法であって、動物に、 （ａ）ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体、および（ｂ）薬学的に許容し得る 担体を含有する医薬組成物を、該ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体が該傷の 治療に有効な量、存在するように投与することからなる方法。
15. １５．動物の胃腸潰瘍の予防または治療法であって、動物に、（ａ）ｇｐ３３０ またはその機能的な誘導体、および（ｂ）薬学的に許容し得る担体を含有する医 薬組成物を、該ｇｐ３３０またはその機能的な誘導体が該潰瘍の予防または治療 に有効な量、存在するように投与することからなる方法。