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KR20250034289A - 사전 표적화 - Google Patents

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KR20250034289A
KR20250034289A KR1020247040068A KR20247040068A KR20250034289A KR 20250034289 A KR20250034289 A KR 20250034289A KR 1020247040068 A KR1020247040068 A KR 1020247040068A KR 20247040068 A KR20247040068 A KR 20247040068A KR 20250034289 A KR20250034289 A KR 20250034289A
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KR
South Korea
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vhh
present
seq
amino acids
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Pending
Application number
KR1020247040068A
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소피 포티
장-피에르 푸제
토니 라우테
마티아스 브루노 리벤 드휘베테르
야나 데켐페네르
프란시스 산텐스
라우렌트 나바로
Original Assignee
프리시릭스 엔.브이.
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Filing date
Publication date
Application filed by 프리시릭스 엔.브이. filed Critical 프리시릭스 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 VHH 및 표지된 화합물을 포함하는 사전 표적화 조합물에 사용될 수 있는 VHH의 분야에 관한 것이다. 적용 분야에 따라, 표지된 화합물은 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 사전 표적화 조합물은 바람직하게는 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것이다.

Description

사전 표적화
본 발명은 VHH 및 표지된 화합물을 포함하는 사전 표적화 조합물에 사용될 수 있는 VHH의 분야에 관한 것이다. 적용 분야에 따라, 표지된 화합물은 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 사전 표적화 조합물은 바람직하게는 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것이다.
암은 전 세계적으로 이환률과 사망률의 주요 원인에 있어 큰 비중을 차지한다. 부작용을 최소화하면서 암과 싸우는 개선된 치료법에 대한 지속적인 요구가 있다. 방사선 표지된, 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH)은 그러한 치료법에 제안되었다. 그러나, 이러한 치료법 중 일부는 높은 신장 독성과 낮은 치료 지수를 겪는다(Parihar, Ashwin Singh, Sejal Chopra, and Vikas Prasad. "Nephrotoxicity after radionuclide therapies." Translational Oncology 15.1 (2022): 101295.). 따라서, 신장 독성이 낮고 치료 지수가 높은 암에 대한 VHH 방사선 치료법이 당업계에 필요하다.
도 1 ― 30분(A), 2시간(B), 8시간(C) 및 24시간(D)의 지연 시간을 사용하여 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 주사 후 최대 4시간 동안 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 생체분포. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다.
도 2 ― 주사 후(p.i.) 최대 4시간의 동안 177Lu-DOTA-VHH1(A) 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz(B)의 생체분포. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다.
도 3 ― 주사 후 최대 4시간 동안 상이한 지연 시간, 177Lu-DOTA-VHH1 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 이용한 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 생체분포의 통계 분석. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다.
도 4 ― 주사 후 최대 4시간 동안 상이한 분자 질량 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 이용한 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 생체분포의 통계 분석. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다.
도 5 ― 4시간 및 8시간의 지연 시간과 주사 후 최대 96시간 동안 177Lu-DOTA-VHH1을 이용한 사전 표적화 전략을 사용한 신장(A) 및 종양(B) 내 177Lu-VHH1의 생체분포의 통계 분석. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다. (C) 4시간 및 8시간 지연 시간과 주사 후 최대 96시간 동안 177Lu-DOTA-VHH1을 이용한 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 종양 대 신장 비율.
도 6 ― 낮은(A1) 또는 높은(A2) 비활성을 사용하여 177Lu-표지-Tz의 흡수를 설명하는 생체분포 프로파일. A 및 B의 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다. C는 두 전략 모두에 대한 결과 AUC를 반영한다.
도 7 ― 사전 표적화 225Ac-VHH1의 치료 효능. (A) 사전 표적화 225Ac-VHH1 대 직접 표지 225Ac-DOTA-VHH1로 처리된 마우스의 생존을 설명하는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선. 빨간 화살표는 6개의 연속 처리를 나타낸다. (B) 처리 후 종양 성장 역학. (A) 치료된 마우스의 연장된 생존 결과와 (B) 종양 발달을 억제하는 능력에 의해 밝혀진 바와 같이, 고용량 사전 표적화 225Ac-VHH1 및 직접 표지 225Ac-DOTA-VHH1은 확립된 피하 인간 교모세포종 종양(U87 MG)이 있는 마우스에서 효과적이다. (C) 처리 후 체중 감소 MS = 평균 생존, (n = 처리 그룹당 10마리).
도 8 ― 사전 표적화 225Ac-VHH1로 처리된 건강한 암컷 C57Bl/6 마우스의 장기 독성학적 추적 조사. (A) 사전 표적화 225Ac-VHH1 또는 직접 표지 225Ac-DOTA-VHH1로 처리된 마우스의 생존을 설명하는 카플란-마이어 곡선. 빨간 화살표는 6개의 연속 처리를 나타낸다. (B) 처리 후 체중 증가. N = 6개월의 추적 조사 동안 처리 그룹당 5마리.
VHH 또는 이의 단편
본 발명의 제1 양태에서, 약제로 사용하기 위한, 바람직하게는 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 클릭(click) 그룹을 포함하는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인, 또는 이의 단편이 제공된다. 바람직하게는, 상기 클릭 그룹은 상기 약제를 환자에게 투여 시 클릭 반응을 겪지 않았다.
본 발명의 제2 양태에서, 클릭 그룹을 포함하는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 상기 VHH, 또는 이의 단편은 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며; 이는 바람직하게는 약제로 사용하기 위한, 더 바람직하게는 상기 항원과 연관된 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것이다. 바람직하게는, 상기 클릭 그룹은 상기 약제를 환자에게 투여 시 클릭 반응을 겪지 않았다.
중쇄 항체(VHH), 또는 이의 단편이 본 출원에 언급되는 경우, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 이 제1 또는 제2 양태에 정의된 바와 같은 클릭 그룹을 포함하는 중쇄 항체(VHH), 또는 이의 단편을 참조한다. 그러한 VHH, 또는 이의 단편은 또한 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편으로 지칭될 수 있다. 본 명세서에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 바람직하게는 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것으로 이해된다.
구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH는 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 실시예 7은 사전 표적화 접근법에 대한 제한된 koff 속도의 적합성을 나타낸다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬로 이루어진다. 보다 구체적으로, VHH는 선천적 또는 후천적 면역계로부터, 바람직하게는 선천적 또는 후천적 면역계의 단백질로부터 유래된다. 훨씬 더 구체적으로, 본 명세서에 개시된 VHH는 4개의 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR), 또는 이의 임의의 적합한 단편(그러면 이는 보통 CDR 중 적어도 하나를 형성하는 아미노산 잔기 중 적어도 일부를 포함할 것임)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 개시된 VHH는, 바람직하게는 미생물 재조합 발현 시스템에서, 고수율로 생산하기 쉽고, 후속적으로 단리 및/또는 정제하기 편리하다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH는 항체의 CDR(상보성 결정 영역) 서열을 포함할 수 있고(또는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 이러한 CDR 서열을 기반으로 할 수 있고/있거나 이러한 CDR 서열로부터 유래될 수 있음), 또한 일반적으로 본 명세서에서 'CDR 서열들'(즉, 각각 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열)로 지칭될 것이다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 VHH는 본 명세서에 기재된 CDR1 서열, CDR2 서열 및 CDR3 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH는 다음과 같은 (일반) 구조를 가진다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
본 발명의 맥락 내에서, IMGT 명명법은 FR(프레임워크 영역), 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4 및 해당 CDR 영역, 즉 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 정의하는 데 사용된다. 사용된 IMGT 명명법의 정의는 본 명세서에서 이후에 본 발명의 정의에 대한 일반 파트에서 제공된다.
VHH의 단편은 바람직하게는 적어도 VHH의 활성을 어느 정도 나타낸다. "어느 정도"는 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상을 의미할 수 있다. VHH의 단편의 바람직한 활성은, 바람직하게는 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 항원에 대한 특이적 결합이다. 바람직한 항원은 하기 기재되어 있다. VHH의 단편의 더 바람직한 활성은 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 항원에 대한 특이적 결합이다.
VHH의 단편은 바람직하게는 길이가 20 내지 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 150개 아미노산, 또는 50 내지 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 140 또는 150개 아미노산이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 1 내지 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 클릭 그룹을 포함한다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 1개 초과의 클릭 그룹을 포함한다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 2 내지 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3개의 클릭 그룹을 포함한다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 3 내지 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 또는 4개의 클릭 그룹을 포함한다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 클릭 그룹을 포함한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 모든 클릭 그룹은 동일한 유형을 가진다. 바람직한 정의에 따르면, 2개의 클릭 그룹은 서로의 컨포머(conformer), 호변이성질체(tautomer), 동위원소체(isotopologue) 또는 동위원소 이성질체(isotopomer)인 경우, 동일한 유형을 가진다.
본 발명의 제1 양태는 "클릭 그룹을 포함하는 중쇄 항체(VHH), 또는 이의 단편"에 관한 것이다. "클릭 그룹을 포함하는"은 클릭 그룹이 VHH에 접합되거나, 클릭 그룹이 다른 방식으로, 예를 들어 변형된 아미노산에 의해 VHH에 통합되는 것을 지칭할 수 있음이 이해되어야 한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 클릭 그룹은 VHH에 접합된다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 클릭 그룹은 리신 잔기, 시스테인 잔기, 글리칸, 상기 VHH에 포함되는 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 리신 잔기, 상기 VHH에 포함되는 N-말단 또는 C-말단에서 상기 VHH에 접합된다.
구현예에서, 클릭 그룹은 상기 클릭 그룹에 접합되지 않은 해당 VHH를, 상기 VHH에 포함되는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 글리칸, N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 리신 잔기, N-말단 또는 C-말단과 접합할 수 있는 제1 그룹, 및 상기 클릭 그룹 중 하나를 포함하는 화합물과 반응시킴으로써 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 접합된다. 바람직하게는, 상기 반응은 수성 완충액, 더 바람직하게는 염기성 수성 완충액에서 일어난다. 바람직하게는, 상기 제1 그룹은 N-하이드록시석신이미드(NHS)이며, 더 바람직하게는 상기 제1 그룹은 N-하이드록시석신이미드(NHS)이고 상기 클릭 그룹(들)은 (각각) TCO이다.
조합물
본 발명의 일 양태에서,
본 발명에 따른 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편; 및
표지 및 클릭 그룹을 포함하는 표지된 화합물
을 포함하는, 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 조합물이 제공되며;
여기서 상기 VHH, 또는 이의 단편은 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 상기 암과 연관된 항원에 특이적으로 결합할 수 있고;
상기 사용은 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 VHH, 또는 이의 단편을 제1 투여하는 것, 및 이후 상기 표지된 화합물을 후속 투여하는 것을 포함하고;
상기 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 상기 클릭 그룹은 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹과 상기 대상체에서 클릭 반응을 겪을 수 있다.
그러한 조합물은 본 발명에 따른 조합물로 지칭될 수 있으며, 여기서 상기 조합물은 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것으로 이해된다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 VHH는 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
이러한 이론에 구속되지 않지만, 본 발명에 따른 조합물을 사용하면 항원을 (과)발현하는 세포, 조직, 또는 장기에 표지를 선택적으로 또는 특이적으로 전달하게 된다.
본 출원에 개시된 본 발명에 따른 임의의 VHH, 또는 이의 단편, 또는 본 출원에 개시된 임의의 표지된 화합물은 본 발명에 따른 조합물에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 모든 바람직한 구현예는 또한 본 발명에 따른 조합물로서 구상될 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 키트 또는 부품 키트이며, 그 안에 포함되는 VHH 또는 이의 단편 및 표지된 단편은 개별적인 부품 또는 구성요소로 존재한다. 이러한 맥락에서 개별적인 부품 또는 구성요소는 바람직하게는, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, VHH(또는 이의 단편) 및 표지된 단편이 단일 화학 조성물에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 이는 구성요소가 개별 투여(즉, 상기 기재된 바와 같이 제1 및 후속 투여)를 위해 설계되어 있음을 의미한다. 즉, 조합물은 조성물과 혼동되어서는 안 되며, 이는 조성물이 단일 화학 조성물을 의미하기 때문이다.
전문가가 상세한 프로토콜을 쉽게 이용할 수 있는 통상적인 방사선면역요법 및 진단(Cancer Radiotherapy: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine), Huddart RA Ed., Human Press 2002)은 표적화 모이어티(예컨대, VHH 또는 이의 단편)의 생체외 표지화, 및 이어서 그에 따른 생성된 표지-표적화 모이어티 접합체의 단일 투여를 포함한다. 본 명세서에서, 표지는 하기 기재된 바와 같이 진단 또는 치료용 화합물일 수 있다. 즉, 임상 표적(예컨대, 암과 연관된 항원)의 특이적 결합은 치료 또는 진단 활성 물질(표지)의 전달과 동시에 이루어진다.
반면, 암의 치료 및/또는 진단에서 본 발명에 따른 조합물의 사용은 2개의 후속(따라서 개별적인) 투여 단계를 포함하며, 여기서 제1 투여는 상기 VHH, 또는 이의 단편의 투여(항원의 특이적인 결합을 초래함)이고, 제2 투여는 표지를 포함하는 상기 표지된 화합물의 투여(VHH 또는 단편과 표지된 화합물 사이의 클릭 반응을 초래함)이다. 즉, 치료 또는 진단 활성 물질의 특이적 결합 및 전달은 분리된다. 이에 따라, 본 발명에 따른 조합물의 사용은 "사전 표적화"로 지칭될 수 있고, 조합물은 본 발명의 맥락에서 "사전 표적화 조합물"로 지칭될 수 있다.
바람직하게는, 상기 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 상기 클릭 그룹과, 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹 사이의 클릭 반응은 바람직하게는 생체 분자와의 바람직하지 않은 부반응을 야기하지 않고, 즉 특이적 반응이다. 이에 따라, 이러한 이론에 구속되지 않지만, 제1 투여의 결과인 VHH 또는 단편의 특이적 결합은 후속 투여 동안 표지된 화합물의 특이적 전달로 변환된다.
이러한 이론에 구속되지 않지만, 암의 치료 또는 진단에서 단일 투여를 특징으로 하는 통상적인 방사선면역요법 및 진단을 사용하는 방사선표지된 VHH, 또는 이의 단편의 사용과 비교하여 본 발명에 따른 조합물의 사전 표적화 사용의 이점은 다음 중 하나 이상이다:
바람직하게는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%의, 신장에서 표지의 저류 감소;
바람직하게는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240%, 250%, 260%, 270%, 280%, 290%, 300%, 310%, 320%, 330%, 340%, 350%, 360%, 370%, 380%, 390%, 400%, 410%, 420%, 430%, 440%, 450%, 460%, 470%, 480%, 490%, 500%의, 표지의 치료 지수 증가;
바람직하게는, 상기 이점은 실시예 3에 설명된 바와 같이, 종양 표적화 잠재력을 유지하면서 획득된다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 약 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일이며, 바람직하게는 약 X일은 X일의 0.8배에서 최대 X일의 1.2배까지를 의미한다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 약 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간이며, 바람직하게는 약 X시간은 X시간의 0.8배에서 최대 X시간의 1.2배까지를 의미한다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 또는 240분이며, 바람직하게는 약 X분은 X분의 0.8배에서 최대 X분의 1.2배까지를 의미한다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 1일, 더 바람직하게는 적어도 2일이다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 이내이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 1시간, 더 바람직하게는 적어도 2시간이다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여는 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10분 이내이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 10분이다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 30일 미만이다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 또는 72시간이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 72시간 미만이다.
구현예에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 또는 240분이며, 바람직하게는 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 240분 미만이다.
본 발명의 맥락에서, 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 지연 시간으로 지칭될 수 있다.
TCO-VHH1(제1 투여) 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz(제2 투여)를 사용한 사전 표적화를 위한 지연 시간 최적화는 실시예 1에서 수행되었다. 유사한 프로토콜이 다른 적용 분야에 대해 수행될 수 있다.
클릭 그룹을 포함하는 모노클로날 항체와 표지된 화합물을 포함하는 사전 표적화 조합물의 사용은 이미 문헌에 기재되어 있다. 그러나, 모노클로날 항체의 경우, 사전 표적화 조합물의 사용은 긴 혈액 순환으로 인해 높은 독성 문제를 해결한다. 모노클로날 항체는 통상적으로 긴 순환 시간을 가지므로, 이의 방사선표지된 대응물은 직접 투여 후 장시간 동안 순환에 남아 있어 독성 문제를 유발한다. 사전 표지화 접근법은 먼저 표지되지 않은 모노클로날 항체를 투여한 다음, 표적에 특이적으로 결합되지 않은 표지되지 않은 모노클로날 항체를 순환에서 효과적으로 제거하는 소거제(clearing agent)를 투여하고, 후속적으로 표적(즉, 종양)에 특이적으로 결합된 임의의 모노클로날 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 표지된 화합물을 투여함으로써 이러한 문제를 극복할 수 있다. 표지된 화합물은 일반적으로 순환에 장기간 남아 있지 않으므로, 이러한 사전 표적화 접근법은 독성 문제를 극복한다.
대조적으로, 본 발명에 따른 사전 표적화 조합물의 사용은 중쇄 항체(VHH), 또는 이의 단편을 포함한다. 이러한 표적화 화합물은 긴 순환 시간을 특징으로 하지 않는다. 사실, 이들 표적화 화합물은 모노클로날 항체와 비교하여 혈류에서 빠르게 제거된다. 결과적으로, 이들 표적화 화합물은 방사선표지된 모노클로날 항체와 연관된 일반적인 독성 문제에 의한 방해를 덜 받는다. 결과적으로, VHH, 또는 이의 단편이 어떠한 가치를 더하거나 이의 사용과 연관된 특정 문제를 해결할 가능성이 낮기 때문에, 당업자는 VHH, 또는 이의 단편에 대한 사전 표적화 접근법을 사용하는 것을 고려하지 않을 것이다. 본 경우에, 사전 표적화 접근법은 VHH, 또는 이의 단편의 빠른 소거와 연관된 신장 독성 문제를 해결하는데, 이 효과는 선행 기술에서 명백하지 않다. 즉, 당업자가 모노클로날 항체에 대한 사전 표적화에 관한 공개적으로 이용 가능한 지식에 기반하여, VHH, 또는 이의 단편에 대한 사전 표적화 접근법을 사용하는 것은 자명하지 않을 것이다.
또한, 혈액 소거제는 단지 긴 순환 시간을 가지는 모노클로날 항체의 맥락에서만 목적을 제공하므로, 본 발명에 따른 사전 표적화 조합물의 사용은 통상적으로 혈액 소거제의 사용을 포함하지 않는다. 사실, 추가적인 작용제의 투여의 부재는 본 발명에 따른 사전 표적화 조합물의 사용의 이점이 될 수 있다. 분명히, 혈액 소거제를 제외할 가능성은 모노클로날 항체에 대한 사전 표적화에 관한 공개적으로 이용 가능한 지식에 기반하여 당업자에게 자명하지 않을 것이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 사용은 제1 투여와 후속 투여 사이에 대상체에게 혈액 소거제를 투여하는 것을 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 혈액 소거제는 대상체의 혈액 순환으로부터 결합되지 않은 VHH를 제거하거나 소거할 수 있고/있거나 그러한 목적을 가진 작용제이며, 이는 통상적으로 사전 표적화의 맥락에서 제1 투여와 후속 투여 사이에 투여된다. 혈액 소거제의 예로는 아비딘, 갈락토스, 비오틴화 N-아세틸-갈락토사민 및 결합제, 예컨대 VHH에 대해 표적화된 항체 및 이의 단편이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 이론에 구속되지 않지만, 제1 투여는 대상체의 혈액 순환에서 항원에 특이적으로 결합되지 않은, VHH, 또는 이의 단편의 일부 분획을 생성할 수 있다. 일부 분획은, 예를 들어 투여된 VHH, 또는 이의 단편의 0%에서 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%이다. 본 발명에 따른 조합물의 사용의 바람직한 이점은 하기 기재된 바와 같은 치료 또는 진단 효과를 달성하기 위해 제1 투여와 후속 투여 사이에 혈액 소거제가 투여될 필요가 없다는 것이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 사용은 비오틴화 N-아세틸-갈락토사민의 투여를 포함하지 않는다.
하기 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 임의의 바람직한 VHH, 또는 이의 단편은 또한 바람직한 VHH, 또는 이의 단편을 포함하는 본 발명에 따른 바람직한 조합물로 이해되어야 하는 것으로 이해된다. 본 출원에서 본 발명에 따른 조합물의 투여가 언급되는 경우, 제1 투여와 후속 투여를 둘 다 지칭한다.
클릭 그룹 및 쌍
클릭 화학은 2001년에 Sharpless가 도입한 화학적 접근법이며 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 정의에 따르면, 클릭 (화학) 반응은 소분자 모듈 그룹(즉, 반응물(의 일부))을 연결하여, 생체분자와 같은 더 큰 모이어티에 빠른 속도, 높은 수율 및 특이성(입체특이성 및/또는 입체특이성)으로 부착할 수 있는 것을 포함한다. 더 바람직하게는, 바람직하지 않은 부산물은 제한된 양으로만 형성되고, 바람직하게는 크로마토그래피를 사용하지 않고 제한된 노력으로, 생성된 반응 혼합물로부터 제거될 수 있다. 더 바람직하게는, 클릭 반응은 용매 매개변수 및 산소 및/또는 물의 존재에 비교적 민감하지 않다. 가장 바람직하게는, 클릭 반응은 생체적합성이며, 즉 생체분자와 바람직하지 않은 부반응을 유발하지 않고/않거나, 독성이 있고/있거나 생체적합성이 없는 화합물의 형성을 초래하지 않는다.
클릭 반응의 예는 문헌[Kolb, Finn and Sharpless Angewandte Chemie International Edition (2001) 40: 2004- 2021; Evans, Australian Journal of Chemistry (2007) 60: 384-395]에서 확인할 수 있다. 클릭 반응은 활성화된 산 또는 아실 할라이드로부터 에스테르, 티오에스테르, 아미드(예를 들어, 펩타이드 커플링)의 형성; 친핵성 치환 반응(예를 들어, 할라이드의 친핵성 치환 또는 변형된 고리 시스템의 개환); 아지드-알킨 휘스겐(Huisgen) 환 첨가(예를 들어, 1,2,3-트리아졸 링커를 형성하는 아지드와 알킨 사이의 1,3-쌍극자 환 첨가); 티올-인(yne) 첨가; 이민 형성; 테트라진과 트랜스-사이클로옥텐(TCO) 사이의 딜스-알더(Diels-Alder) 반응; 및 마이클 첨가(Michael addition)(예를 들어, 말레이미드 첨가)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
알킨과 아지드 사이의 클릭 화학 반응은 통상적으로 1,3-환 첨가 반응을 촉진시키기 위해 구리 촉매의 첨가를 필요로 하며, 구리-촉매 아지드-알킨 환 첨가(CuAAC) 반응으로 알려져 있다. 그러나, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴 유도체와 아지드 사이의 클릭 화학 반응은 통상적으로 구리 촉매의 첨가를 필요로 하지 않으며, 대신 변형-촉진 아지드-알킨 환 첨가(SPAAC)를 통해 진행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "클릭 그룹"은 클릭 화학 반응에서 모듈 그룹으로, 즉 반응물(의 일부)로 참여할 수 있는 모이어티를 지칭한다. 클릭 그룹은 자연적으로 발생하는 생체분자에서 거의 발견되지 않고 생체분자에 대해 화학적으로 불활성인 모이어티일 수 있지만, 예를 들어 아지드-반응성 또는 알킨-반응성 그룹과 반응할 때, 반응은 생물학적으로 관련이 있는 조건 하에서, 예를 들어 세포 배양 조건에서, 예컨대 과도한 열이나 가혹한 반응물의 부재 하에 효율적으로 일어날 수 있다. 바람직하게는, 클릭 그룹은 생체적합성이다.
이 섹션에서, 바람직한 클릭 그룹이 기재되어 있다. 이러한 선호는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 포함된 클릭 그룹; 및 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지된 화합물에 포함되는 클릭 그룹에 적용되는 것으로 이해된다.
구현예에서, 클릭 그룹은 알켄, 디엔, 알킨, 아지드, 니트론, 테트라진, 또는 시드논이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 클릭 그룹은 알켄, 알킨, 아지드, 니트론, 또는 테트라진이고, 바람직하게는 상기 알켄은 트랜스-사이클로옥텐이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물이 제공되며, 여기서 표지된 화합물에 포함되는 클릭 그룹은 알켄, 알킨, 아지드, 니트론, 또는 테트라진이고, 바람직하게는 상기 알켄은 트랜스-사이클로옥텐이고, 더 바람직하게는 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹은 테트라진이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알켄"은 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 불포화 탄화수소 모이어티 또는 분자를 지칭한다. 바람직한 알켄은 트랜스-사이클로옥텐(TCO)이다. 바람직한 알켄은 2 내지 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개의 탄소 원자의 수를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "디엔"은 1,3-위치에서 접합되는 2개의 이중 결합을 가지는 모이어티 또는 분자를 지칭한다. 디엔의 이중 결합은 시스 또는 트랜스일 수 있다. 바람직한 디엔은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 질소 원자의 수를 갖는다. 바람직한 알켄은 1 내지 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개의 탄소 원자의 수를 갖는다. 바람직한 디엔은 1, 2, 3, 4 또는 4개의 공유 질소-질소 결합을 포함한다. 바람직한 디엔은 테트라진이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알킨"은 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 모이어티 또는 분자를 지칭한다. 알킨 모이어티는 말단 알킨 및 고리형 알킨, 바람직하게는 아지드 기와 반응성인 말단 알킨 및 고리형 알킨을 포함한다. 말단 알킨은 삼중 결합된 탄소 원자에 결합된 적어도 하나의 수소 원자를 갖는다. 고리형 알킨은 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 사이클로알킬 고리이다. 바람직한 알켄은 고리형 알켄이다. 바람직한 고리형 알킨은 사이클로옥틴 및 사이클로옥틴 유도체, 예컨대 바이사이클로노닌(BCN), 바이아릴아자사이클로옥틴온(BARAC), 및 디벤조아자사이클로옥틴(DIBAC)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아지드"는 -N3 작용기를 포함하는 모이어티 또는 분자를 지칭한다. 바람직한 아지드는 1 내지 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개의 탄소 원자의 수를 갖는다. 바람직한 아지드는 NHS-아지드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "니트론"은 >C=N+(-O-)- 작용기를 포함하는, 바람직하게는 -C=N+(-O-)-H를 포함하는 모이어티 또는 분자를 지칭한다. 바람직한 니트론은 1 내지 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개의 탄소 원자의 수를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "테트라진"은 정확히 4개의 질소 원자를 포함하는 6원 방향족 고리를 지칭한다. 바람직한 테트라진은 2 내지 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5개의 탄소 원자의 수를 갖는다. 바람직한 테트라진은 1,2,4,5-테트라진이다.
클릭 반응은 서로 반응할 수 있는 적어도 2개의 클릭 그룹을 필요로 한다. 이러한 맥락에서, 서로 반응할 수 있는 클릭 그룹은 클릭 (화학) 쌍으로 지칭될 수 있다. 클릭 쌍을 구성하는 클릭 그룹은 클릭 쌍 파트너로 지칭될 수 있다. "클릭 반응을 겪을 수 있다" 및 유사한 표현은 본 출원의 맥락에서 "클릭 쌍을 형성한다" 및 유사한 표현과 동의어이다.
오픈 클릭 그룹은 클릭 반응을 겪지 않은 클릭 그룹이다. 즉, 오픈 클릭 그룹은 다른 클릭 그룹과 클릭 반응을 여전히 겪을 수 있는 클릭 그룹이다.
클로즈드 클릭 그룹은 클릭 반응을 겪은 클릭 그룹이다. 즉, 클로즈드 클릭 그룹은 클릭 쌍 파트너에 결합, 통상적으로 공유 결합된 모이어티이다.
이 섹션에서, 바람직한 클릭 쌍이 기재되어 있다. 클릭 그룹 A와 클릭 그룹 B로 이루어진 클릭 쌍에 대한 선호는, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 하나 이상의 클릭 그룹 A를 포함하고 표지된 화합물이 클릭 그룹 B를 포함하는 본 발명에 따른 바람직한 조합; 및 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 하나 이상의 클릭 그룹 B를 포함하고 표지된 화합물은 클릭 그룹 A를 포함하는 본 발명에 따른 바람직한 조합을 함축하는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 클릭 쌍은 아지드 및 알킨, 바람직하게는 고리형 알킨, 예컨대 BCN, BARAC 또는 DIBAC로 이루어진다.
일부 구현예에서, 클릭 쌍은 테트라진 및 알켄 또는 알킨, 바람직하게는 고리형 알켄 또는 알킨으로 이루어진다. 이러한 맥락에서, 고리형 알켄은 바람직하게는 트랜스-사이클로옥텐이다. 이러한 맥락에서, 고리형 알킨은 바람직하게는 BCN, BARAC 또는 DIBAC이다.
표지
본 발명에 따른 조합물은 표지와 클릭 그룹을 포함하는 표지된 화합물을 포함한다. 하기에, 바람직한 표지가 제공된다. 이러한 선호는 본 발명에 따른 선호되는 대응 조합을 의미하는 것으로 이해된다.
구현예에서, 표지는 바람직하게는 본 명세서에 개시된 바와 같은 암의 치료 또는 진단에 유용한, 치료 또는 진단 기이다.
구현예에서, 표지는 소분자이다. 바람직하게는, 소분자는 분자량이 최대 2000 Da, 바람직하게는 최대 1500 Da, 더 바람직하게는 최대 1000 Da, 예컨대 최대 900 Da인 유기 분자 또는 해당 모이어티로 정의된다.
방사성 핵종
구현예에서, 표지는 방사성 핵종이다. 이러한 맥락에서, 방사성 핵종인 표지를 포함하는 해당 표지된 화합물은 방사성표지된 화합물로 지칭될 수 있다.
구현예에서, 표지는 치료적 적용에 적합한 방사성 핵종, 바람직하게는 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무트-212, 비스무트-213, 세슘-137, 크로뮴-51, 코발트-60, 구리-67, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 루테늄-106, 스칸듐-47, 나트륨-24, 스트론튬-89, 테르븀-149, 테르븀-161, 테르븀-149, 토륨-227, 제논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, α-방출 방사성 동위원소 및 β-방출 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 핵종이다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 요오드-131이다. 바람직한 구현예에서, 표지는 악티늄-225, 비스무트-213, 요오드-125, 요오드-131, 루테튬-177, 이트륨-90, 구리-67, 레늄-186, 레늄-188, 테르븀-149, 테르븀-161, 아스타틴-211 또는 플루오린-18로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 아스타틴-211 또는 플루오린-18이다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 악티늄-225 또는 비스무트-213, 가장 바람직하게는 악티늄-225이다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 루테튬-177 또는 테르븀-161, 가장 바람직하게는 루테튬-177이다.
구현예에서, 표지는 진단적 적용에 적합한 방사성 핵종, 바람직하게는 요오드-131, 이트륨-90, 요오드-125, 루테튬-177, 납-203, 레늄-186, 레늄-188, 스칸듐-43, 스칸듐-44, 테크네튬-99m, 테르븀-161, 테르븀-149, 인듐-111, 제논-133, 탈륨-201, 플루오린-18, 갈륨-68, 갈륨-67, 구리-67, 요오드-123, 요오드-124, 지르코늄-89 및 구리-64로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 양전자-방출 방사성 동위원소(PET) 또는 γ-방출 방사성 동위원소(SPECT)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 핵종이다.
더 바람직한 구현예에서, 표지는 요오드-131이다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 악티늄-225 또는 비스무트-213, 가장 바람직하게는 악티늄-225이다. 더 바람직한 구현예에서, 표지는 루테튬-177 또는 테르븀-161, 가장 바람직하게는 루테튬-177이다.
구현예에서, 표지는 하기 기재된 바와 같이, 악티늄-225, 비스무트-212, 비스무트-213, 세슘-137, 크로뮴-51, 코발트-60, 구리-67, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 홀륨-166, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 스칸듐-47, 나트륨-24, 테르븀-149, 테르븀-161, 및 테르븀-149로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이터와 비-공유 배위 결합을 형성할 수 있는 방사성 핵종이다.
구현예에서, 표지는 하기 기재된 바와 같이, 악티늄-225, 비스무트-212, 비스무트-213, 구리-67, 에르븀-169, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 스칸듐-47, 테르븀-149, 테르븀-161, 토륨-227, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 및 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 DOTA와 비-공유 배위 결합을 형성할 수 있는 방사성 핵종이다.
구현예에서, 표지는 하기 기재된 바와 같이, 아스타틴-211, 디스프로슘-165, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 루테늄-106, 스트론튬-89, 및 제논-133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 링커에 공유 결합할 수 있는 방사성 핵종이다.
기타 표지
구현예에서, 표지는 비-방사성 표지이다. 일 구현예에서, 그러한 비-방사성 표지는 형광 표지이다. 그러한 표지, 및 본 발명에 따른 해당 조합은 본 명세서에 정의된 바와 같이 진단적 적용에 사용될 수 있다. 대안적인 적용은 영상-유도 수술(image-guided surgery) 또는 광역학 요법을 포함한다. 진단적 적용에 적합한 형광 표지의 예는 Alexa fluor 변종, Cy3, Cy5, FITC(플루오레세인), 쿠마린, 텍사스 레드(Texas red), 오레곤 그린(Oregon Green), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 퍼시픽 그린(Pacific Green), 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), PE-Cyanine7, PerCP-Cyanine5.5, TRITC(테트라메틸로다민)를 포함한다. 영상-유도 수술에 적합한 형광 표지의 예는 IRDye800CW, IRDye680-RD, ZW800-1, FNIR을 포함한다(예를 들어, 문헌[Pieterjan Debie et al, Front Pharmacology, 2019; 10:510, doi:　10.3389/fphar.2019.00510, PMCID:　PMC6527780, PMID:　31139085] 참조). 광역학 요법에 적합한 형광 표지의 예는 IRDye700DX를 포함한다. 대부분의 표지는 ThermoFisher 또는 Licor로부터 입수할 수 있다.
구현예에서, 표지는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 세포, 조직, 장기로 전달되는 분자이다. FAP를 발현하는 세포, 조직, 장기에서 작용하는 것으로 알려진 임의의 모이어티, 분자 또는 약제는 잠재적으로 이러한 구현예에 포함된다. 분자는 펩타이드, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 펩타이드는 사이토카인일 수 있다. 소분자는 화학요법제일 수 있다. 실체는 세포, 예컨대 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, BITE 또는 LITE일 수 있다.
구현예에서, 표지는 AcTakine(표적상 활성 사이토카인(Activity-on-Target cytokine)) 또는 AcTaferon(IFNα-기반 AcTakine), 바람직하게는 WO2017077382A1, WO2017134301A1, WO2017194783A1, WO2017194782A2, WO2018077893A1, WO2018141964A1, WO2018144999A1, WO2019032661A1, WO2019032663A1, WO2019032662A1, WO2019148089A1, WO2019191519A1 또는 WO2020033646A1에 기재된 바와 같은 AcTakine 또는 AcTaferon이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는 피롤로벤조디아제핀; 바람직하게는 WO2014057074A1, WO2015052322A1, WO2014140174A1, WO2015052321A1, WO2017186894A1, WO2017137555A1, WO2017137553A1, WO2016038383A1 또는 WO2018192944A1에 기재된 바와 같은 피롤로벤조디아제핀 이량체이고; 본 명세서에서 더 바람직하게는 상기 피롤로벤조디아제핀 이량체는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- (11S,11aS)-4-((2R,5R)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질 11-하이드록시-8-((5-(((11S,11aS)-11-하이드록시-10-(((4-((10R,13R)-10-이소프로필-13-메틸-8,11-디옥소-2,5-디옥사-9,12-디아자테트라데칸아미도)벤질)옥시)카르보닐)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,10,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-11,11a-디하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트,
- (S)-3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(((8-메톡시-2-(6-메톡시나프탈렌-2-일)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-7-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)프로판아미드,
- (S)-3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-(((2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-7-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)프로판아미드,
- 1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-N-(3-(((S)-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-7-일)옥시)프로필)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드,
- 3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((((S)-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-2-메틸-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-7-일)옥시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)에톡시)에틸)프로판아미드,
- 1-(3-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)프로판아미도)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-7-메톡시-8-((5-(((S)-7-메톡시-2-(4-(4-메틸피페라진-1-일)페닐)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)펜틸)옥시)-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)-3,6,9,12,15,18,21,24-옥타옥사헵타코산-27-아미드,
- 6-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-N-((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[el피롤로[1,2-al[1,41디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-5-옥소-5,11a-디하이드로-1H-벤조[el피롤로[1,2-alH,41디아제핀-2-일)페닐)아미노)-1-옥소프로판-2-일)아미노)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)헥산아미드,
- (R)-2-((3-니트로피리딘-2-일)디설파닐)프로필(11S,11aS)-11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트,
- 4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질(11S,11aS)-11-하이드록시-7-메톡시-8-(3-(((S)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,511a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-벤조[e]피롤로[1,2-a][1,4]디아제핀-10(5H)-카르복실레이트, 및
- 4-((2S,5S)-37-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)-5-이소프로필-2-메틸-4,7,35-트리옥소-10,13,16,19,22,25,28,31-옥타옥사-3,6,34-트리아자헵타트리아콘탄아미도)벤질(11S,11aS)-11-하이드록시-8-(3-(((11S,11aS)-11-하이드록시-10-(((4-((10S,13S)-10-이소프로필-13-메틸-8,11-디옥소-2,5-디옥사-9,12-디아자테트라데칸-14-아미도)벤질)옥시)카르보닐)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,5,10,11,11a-헥사하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-8-일)옥시)프로폭시)-7-메톡시-2-메틸렌-5-옥소-2,3,11,11a-테트라하이드로-1H-피롤로[2,1-c][1,4]벤조디아제핀-10(5H)-카르복실레이트. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2017211809A1에 기재된 8자리(octadentate) 토륨 킬레이터이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는 WO2015162293A1에 기재된 바와 같은 돌라스타틴 또는 오리스타틴이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는 예컨대 WO2015118030A2에 기재된 세포용해소 또는 니그린-b A-사슬이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는 예컨대 WO2015103990A1에 기재된 2-프로필티아졸로 [4,5-c] 퀴놀린-4-아민, 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민, 시메틸페닐)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민,4-[4-아미노-2-에톡시메틸-1-(2-하이드록시-2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-7-일]-N-메톡시-N-메틸벤즈아미드,2-에톡시메틸-N1-이소프로필-6,7,8,9-테트라하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1,4-디아민,1-[4-아미노-2-에틸-7-(피리딘-4-일)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올,N-[4-(4-아미노-2-에틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일)부틸]메탄설폰아미드, 또는 N-[4-(4-아미노-2-부틸-1H-이미다조[4,5-c][1,5]나프티리딘-1-일)부틸]-N'-사이클로헥실우레아이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2015051199A2에 기재된 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소이다. 이러한 구현예에서, 표지는 바람직하게는 암에 대한 약제이다.
WO2017137553A1, WO2016038383A1, WO2018192944A1, WO2015051199A2, WO2017211809A1, WO2014057074A1, WO2015052322A1, WO2014140174A1, WO2015052321A1, WO2017186894A1, WO2017137555A1, WO2015162293A1, WO2015118030A2, WO2015103990A1, WO2017077382A1, WO2017134301A1, WO2017194783A1, WO2017194782A2, WO2018077893A1, WO2018141964A1, WO2018144999A1, WO2019032661A1, WO2019032663A1, WO2019032662A1, WO2019148089A1, WO2019191519A1 및 WO2020033646A1은 전문이 포함되며, 거기에 개시된 모든 화합물은 본 출원의 맥락에서 표지일 수 있다.
구현예에서, 표지는 WO2013064508A1에 기재된 바와 같은 아드레노메둘린의 전구약물, WO2014097151A2에 기재된 바와 같은 오토택신 억제제, WO2014091446A1에 기재된 바와 같은 피리미도[4,5-b]퀴놀린-4,5 (3h,10h)-디온 유도체, WO2013064450A1에 기재된 바와 같은 아밀로라이드 유도체, WO2014177527A1에 기재된 바와 같은 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체, WO2015173683A1에 기재된 바와 같은 피라졸로피리딘 유도체 또는 피라졸로피리미딘 유도체, WO201326797A1에 기재된 바와 같은 피페리디노-디하이드로티에노피리미딘 설폭사이드 유도체, WO2016061161A1에 기재된 바와 같은 2-[피리딘-3-일]-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신 유도체, WO201486705A1에 기재된 바와 같은 피리딘 유도체, WO2011113894A1에 기재된 바와 같은 피리딘 유도체 또는 피라진 유도체, WO201627195A1에 기재된 바와 같은 아미노피리미디닐 유도체, WO2015175796A1에 기재된 바와 같은 카르복스아미드 유도체, WO2010125082A1에 기재된 바와 같은 옥사졸 치환 인다졸 유도체, WO2014126979A1에 기재된 바와 같은 비스페닐 부타노익 포스폰산 유도체, WO201235158A1에 기재된 바와 같은 피라진 유도체, WO201472956A1에 기재된 바와 같은 옥사졸리딘-2-온-피리미딘 유도체, WO201696721A1에 기재된 바와 같은 피라졸로피리딘아민 유도체, WO2010101849A1에 기재된 바와 같은 N-(헤테로)아릴,2-(헤테로)아릴-치환 아세트아미드 유도체, WO2017115205A1에 기재된 바와 같은 3-아자바이사이클로[3.1.0]헥산 유도체, WO201728927A1에 기재된 바와 같은 페녹시아세트아미드 유도체, WO2017221142A1에 기재된 바와 같은 N-(5-(4-아세틸피페라진-l-일)피리딘-2-일)-2-(2'-플루오로-3-메틸-2,4'-비피리딘-5-일) 아세트아미드 유도체 또는 2-(2',3-디메틸-2,4'-비피리딘-5-일)-N-(5-(피라진-2-일)피리딘-2-일)아세트아미드 유도체, WO2013171166A1에 기재된 바와 같은 잔틴 유도체, WO2013174768A1에 기재된 바와 같은 잔틴 유도체, WO2016150901A1에 기재된 바와 같은 헤테로사이클릴메틸-티에노우라실 유도체, WO201637954A1에 기재된 바와 같은 n,2-디아릴퀴놀린-4-카르복스아미드 유도체, WO2012168350A1에 기재된 바와 같은 피리딘-2-아미드 유도체, WO2005044817A1에 기재된 바와 같은 세포 부착 조절제의 역할을 하는 벤즈아미드 유도체, WO2012117000A1에 기재된 바와 같은 3-아미노-피리딘 유도체, WO201267965A1에 기재된 바와 같은 Nampt 또는 rock 억제제, WO201616242A1에 기재된 바와 같은 옥세탄 유도체, WO2018134695A1에 기재된 바와 같은 1,1,1-트리플루오로-3-하이드록시프로판-2-일 카르바메이트 유도체, WO2014135507A1에 기재된 바와 같은 피라졸 유도체, WO2009156462A1에 기재된 바와 같은 인돌 유도체, WO201815088A1에 기재된 바와 같은 [1,2,31트리아졸로[4,5-d]피리미딘 유도체, WO2016177660A1에 개시된 바와 같은 sgc 자극제, WO201760879A1에 기재된 바와 같은 CFTR 단백질, WO2018109607A1에 기재된 바와 같은 벤즈이미다졸 또는 4-아자-, 5-아자-, 7-아자- 또는 4,7-디아자-벤즈이미다졸의 6-카르복실산, WO201728926A1에 기재된 바와 같은 벤즈아미드 유도체, WO201287519A1에 기재된 바와 같은 8-아자바이사이클로 [3.2.1] 옥탄 유도체, WO201671375A1에 기재된 바와 같은 트리아졸로[4,5-d]피리미딘 유도체, WO2015104354A1에 기재된 바와 같은 아릴 설탐 유도체, WO201415905A1에 기재된 바와 같은 2-(아자인돌-2-일)벤즈이미다졸 유도체, 또는 WO2005104745A1에 기재된 바와 같은 퀴누클리딘 또는 이소-퀴누클리딘 유도체이다. 바람직하게는, 표지는 섬유증, 상처 치유, 심근경색증, 죽상경화증, 관절염 및/또는 다른 염증성 및 섬유성 질환을 치료하기 위한 약제이다.
WO2013064508A1, WO2014097151A2, WO2014091446A1, WO2013064450A1, WO2014177527A1, WO2015173683A1, WO201326797A1, WO2016061161A1, WO201486705A1, WO2011113894A1, WO201627195A1, WO2015175796A1, WO2010125082A1, WO2014126979A1, WO201235158A1, WO201472956A1, WO201696721A1, WO2010101849A1, WO2017115205A1, WO201728927A1, WO2017221142A1, WO2013171166A1, WO2013174768A1, WO2016150901A1, WO201637954A1, WO2012168350A1, WO2005044817A1, WO2012117000A1, WO201267965A1, WO201616242A1, WO2018134695A1, WO2014135507A1, WO2009156462A1, WO201815088A1, WO2016177660A1, WO201760879A1, WO2018109607A1, WO201728926A1, WO201287519A1, WO201671375A1, WO2015104354A1, WO201415905A1 및 WO2005104745A1은 전문이 포함되고, 거기에 개시된 모든 화합물은 본 출원의 맥락에서 표지일 수 있다.
구현예에서, 표지는 인간 FOLR1을 발현하는 세포, 조직, 장기로 전달되는 분자이다. FOLR1을 발현하는 세포, 조직, 장기에서 작용하는 것으로 알려진 임의의 모이어티, 분자 또는 약제는 잠재적으로 이러한 구현예에 포함된다.
구현예에서, 표지는 중추신경계(CNS)로 전달되는 분자이다. 더 바람직하게는, 분자는 CNS에서 작용하는, 바람직하게는 뇌에서 작용하는 약제이다. 훨씬 더 바람직하게는, 분자는 인간 FOLR1을 통한 수송을 통해 뇌 혈액 장벽(BBB) 및/또는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 통과하며; 이 메커니즘은 수용체 매개 통과세포외배출(RMT)로 지칭된다. CNS 또는 뇌에서 작용하는 것으로 알려진 임의의 모이어티, 분자 또는 약제는 잠재적으로 본 발명의 맥락에서 표지이다. 그러한 모이어티, 분자는 그 자체로 뇌 혈액 장벽(BBB)을 통과하지 않는 임의의 분자 또는 약제일 수 있다. 분자는 펩타이드, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 펩타이드는 사이토카인일 수 있다. 소분자는 화학요법제일 수 있다. 실체는 세포, 예컨대 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, BITE 또는 LITE일 수 있다.
구현예에서, 뇌에서 작용하는 약제는 맥락막총유두종 및/또는 수두증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제이다. 엽산 수용체 알파(FOLR1)는 맥락막총유두종 또는 종양을 포함한 일부 인간 암에서 과발현된다. 뇌에서 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 발현 증가는 수두증과 연관되어 있다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2007140297A2에 기재된 아지리디닐-에포틸론이고, 바람직하게는 표지는 7,11-디하이드록시-17-[2-하이드록시에틸]-8,8,10,12-테트라메틸-3-[1-메틸-2-(2-메틸-4-티아졸릴)에테닐]-4-옥사-17-아자바이사이클로[14.1.0]헵타데칸-5,9-디온, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2014145051A1에 기재된 1H-피롤로[3,2-b]피리딘 유도체이고, 바람직하게는 표지는 4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(1-(피리딘-2-일)에틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조산, 또는 4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(페닐(피리딘-2-일)메틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조산, 또는 메틸 2-(4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(1-(피리딘-2-일)에틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)페닐)아세테이트, 또는 메틸 4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(피리다진-3-일메틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조에이트, 또는 N-사이클로프로필-4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(1-(피리딘-2-일)에틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤젠설폰아미드, 또는 (4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(페닐(피리딘-2-일)메틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)페닐)메탄올, 또는 3,5-디메틸-4-(1-(피리다진-3-일메틸)-3-(1-(2,2,2-트리플루오로에틸)-1H-피라졸-4-일)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-6-일)이속사졸, 또는 3,5-디메틸-4-(3-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-1-(1-(피리딘-2-일)에틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-6-일)이속사졸, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
일 구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2017053243A1에 기재된 1H-피롤로[3,2-b]피리딘 유도체이고, 바람직하게는 표지는 4-(1-(1,1-디(피리딘-2-일)에틸)-6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조산, 또는 4-(1-(시아노디피리딘-2-일메틸)-6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조산, 또는 4-(6-(3,5-디메틸이속사졸-4-일)-1-(플루오로디피리딘-2-일메틸)-1H-피롤로[3,2-b]피리딘-3-일)벤조산, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 맥락막총유두종의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2018055524A1에 기재된 피롤리딘 설폰아미드 TRPC4 길항제이고, 바람직하게는 표지는 2-(((3R,4S)-4-(4-클로로페녹시)-3-하이드록시-3-(하이드록시메틸)피롤리딘-1-일)설포닐)-5-(트리플루오로메틸)벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4S)-1-((2-시아노-4-(트리플루오로메틸)페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-((S)-1-하이드록시에틸)피롤리딘-3-일)옥시)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2008034863A2에 기재된 설폰피라졸 또는 설포닐피라졸린 카르복스아미딘 5-HT6 길항제이고, 바람직하게는 표지는 N'-(1-아세틸인돌린-5-일설포닐)-N,4-디에틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-(1H-피라졸-1-일)페닐설포닐)-N,4-디에틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 N-((5-(N-((4-에틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(에틸아미노)메틸렌)설파모일)티오펜-2-l)메틸)벤즈아미드, 또는 N'-(5-(5-(클로로메틸)-1,2,4-옥사디아졸-3-일)티오펜-2-일설포닐)-N,4-디에틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2009115515A1에 기재된 아릴설포닐 피라졸린 카르복스아미딘 5-HT6 길항제이고, 바람직하게는 표지는 N'-(4-아미노-3-클로로페닐설포닐)-N-에틸-2,3,8-트리아자스피로[4.5]데크-3-엔-2-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노-3-클로로페닐설포닐)-N-에틸-2,3-디아자스피로[4.4]논-3-엔-2-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노-3-클로로페닐설포닐)-N-에틸-4,4-디메틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노페닐설포닐)-2,3-디아자스피로[4.4]논-3-엔-2-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노페닐설포닐)-8-옥사-2,3-디아자스피로[4.5]데크-3-엔-2-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노페닐설포닐)-N,4-디에틸-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노페닐설포닐)-N-에틸-5-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-카르복스이미드아미드, 또는 N'-(4-아미노페닐설포닐)-N-메틸-8-옥사-2,3-디아자스피로[4.5]데크-3-엔-2-카르복스이미드아미드, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
일 구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2013116200A1에 기재된 사이클로덱스트린-API 접합체이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2018055527A1에 기재된 피롤리딘 설폰아미드 TRPV4 길항제이고, 바람직하게는 표지는 4-(((3S,4R)-1-((2,4-디클로로페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4R)-1-((2-클로로-4-(트리플루오로메틸)페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4R)-1-((5-클로로피리딘-2-일)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)-3-(2,2,2-트리플루오로에톡시)벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4S)-1-((2,4-디클로로페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4R)-1-((2-시아노-4-(트리플루오로메틸)페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4R)-1-((2-클로로-4-시아노페닐)설포닐)-4-하이드록시-4-(하이드록시메틸)피롤리딘-3-일)메틸)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 4-(((3S,4S)-4-(아미노메틸)-1-((5-클로로피리딘-2-일)설포닐)-4-하이드록시피롤리딘-3-일)메틸)-2-플루오로벤조니트릴, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 더 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2016179415A1에 기재된 [5-(5-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일메틸)-피리딘-2-일]-(6-트리플루오로메틸-피리딘-3-일메틸)-아민, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
구현예에서, 표지는, 예컨대 WO2013142427A1에 기재된 N-(피리딘-3-일메틸) 치환 1H-피롤로[2,3-b]피리딘 유도체 또는, 예컨대 WO2017100201A1에 기재된 1H-피롤로[2,3-b]피리딘 유도체, 또는 이의 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이고, 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물이고, 가장 바람직하게는 상기 표지는 수두증의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 조합물에 포함된다.
WO2007140297A2, WO2014145051A1, WO2017053243A1, WO2018055524A1, WO2008034863A2, WO2009115515A1, WO2013116200A1, WO2018055527A1, WO2016179415A1, WO2013142427A1, 및 WO2017100201A1은 전문이 포함되며, 거기에 개시된 모든 화합물은 본 출원의 맥락에서 표지일 수 있다.
링커
본 발명에 따른 조합물은 표지된 화합물을 포함한다. 하기에, 바람직한 표지된 화합물이 제공된다. 이러한 선호는 본 발명에 따른 선호되는 대응 조합을 의미하는 것으로 이해된다.
구현예에서, 표지된 화합물은 CL-L1-L2-R*로 표시될 수 있으며, 여기서 CL은 표지된 화합물에 포함되는 클릭 그룹이고, L1은 제1 링커 또는 결합이고, L2는 제2 링커이고, R*은 표지된 화합물에 포함되는 표지이다. 바람직하게는, R*은 상기 논의된 바와 같은 방사성 핵종이다.
구현예에서, L1은 결합이고 따라서 표지된 화합물은 CL-L2-R*로 표시될 수 있다.
구현예에서, L1은 링커이다. 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 적합한 링커가 본 발명에 사용될 수 있다. 링커는, 예를 들어 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 모이어티, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 하이드라존, 말-카프로일 중합체, 글루쿠로니드(중합체), 석신이미드-티오에테르, 펩타이드 링커(예컨대, 디펩타이드 링커), 당-기반 링커, 또는 절단 가능한 링커, 예컨대 디설파이드 연결 또는 프로테아제 절단 부위, 예컨대 발린-시트룰린, 발린-시트룰린-PAB 또는 PAB 중합체일 수 있다. 이러한 맥락에서, 중합체라는 용어는 올리고머로 해석될 수 있다.
구현예에서, L1은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 잔기를 가지는 올리고머이다. 구현예에서, L1은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 잔기를 가지는 올리고머이다. 구현예에서, L1은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 잔기를 가지는 올리고머이다. 이러한 구현예에서, R*은 바람직하게는 요오드-131, 악티늄-225, 비스무트-213, 루테튬-177, 또는 테르븀-161, 더 바람직하게는 요오드-131, 악티늄-225 또는 루테튬-177이다. 이러한 맥락에서, 1개의 잔기를 가지는 올리고머는 단량체이다.
구현예에서, L1은 PEGn이며, 여기서 n은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이다. 구현예에서, L1은 PEGn이며, 여기서 n은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이다. 구현예에서, L1은 PEGn이며, 여기서 n은 6 내지 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이다. 구현예에서, L1은 PEGn이며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고, 가장 바람직하게는 L1은 PEG7이다. 이러한 구현예에서, R*은 바람직하게는 요오드-131, 악티늄-225, 비스무트-213, 루테튬-177, 또는 테르븀-161, 더 바람직하게는 요오드-131, 악티늄-225 또는 루테튬-177이다.
제2 링커 L2의 유형은 R*의 정체에 따라 다르며, 특히 R*은 상기 논의된 바와 같은 방사성 핵종이다. 제한적이지 않지만, 요오드의 방사성 동위원소(바람직한 R*)는 친전자성 또는 친핵성 치환에 의해 분자에 직접 통합되거나 접합을 통해 간접적으로 통합되는 능력을 가지며, 이는 L2와 R* 사이의 공유 결합을 의미한다. 한편 방사성 금속은 킬레이터와의 착화를 통해 표지되며, 이는 L2와 R* 사이의 결합이 비-공유 결합임을 의미한다.
구현예에서, L2는 킬레이터이며, 바람직하게는 결합 L2-R*은 비-공유 배위 결합이다.
구현예에서, L2는 킬레이터이고 R*은 비-공유적으로 부착된 방사성 핵종, 바람직하게는 악티늄-225, 비스무트-212, 비스무트-213, 세슘-137, 크로뮴-51, 코발트-60, 구리-67, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 홀륨-166, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 스칸듐-47, 나트륨-24, 테르븀-149, 테르븀-161, 또는 테르븀-149, 더 바람직하게는 악티늄-225, 비스무트-212, 비스무트-213, 구리-67, 에르븀-169, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 스칸듐-47, 테르븀-149, 테르븀-161, 토륨-227, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 또는 이트륨-90으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 핵종이고, 가장 바람직하게는 여기서 R*은 악티늄-225, 비스무트-213, 루테튬-177 또는 테르븀-161, 가장 바람직하게는 악티늄-225 또는 루테튬-177이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "킬레이터"는 금속(예컨대, 악티늄-225 또는 루테튬-177)이 배위 결합을 통해 킬레이트화될 수 있는 화학물질 그룹을 지칭한다. 본 개시내용을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 킬레이터가 본 발명에 사용될 수 있다.
구현예에서, 킬레이터는 거대고리를 포함한다. 거대고리를 포함하는 바람직한 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N",N'"-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7,10,13,16-헥사아자사이클로헥사데칸-N,N',N",N'",N"",N'""-헥사아세트산(HEHA), 1,4,7,10,13-펜타아자사이클로펜타나데칸-N,N',N",N'", N""-펜타아세트산(PEPA), N,N'-비스[(6-카르복시-2-피리딜)메틸]-4,13-디아자-18-크라운-6(Macropa)(Thiele et al., An Eighteen-Membered Macrocyclic Ligand for Actinium-225 Targeted Alpha Therapy. Angew Chem Int Ed Engl.2017 Nov 13;56(46): p.14712-14717), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라프로피온산(DOTPA), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라프로피온산(TETPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라메틸렌포스폰산(DOTMP), 3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리아세트산(PCTA), 및 2,2',2'',2'''-(1,10-디옥사-4,7,13,16-테트라아자사이클로옥타데칸-4,7,13,16-테트라일)테트라아세트산(Crown)(Yang, Hua, et al. "Synthesis and Evaluation of a Macrocyclic Actinium-225 Chelator, Quality Control and In Vivo Evaluation of 225Ac-crown-αMSH Peptide." Chemistry-A European Journal 26.50 (2020): 11435-11440)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA), Macropa, PCTA 또는 Crown이다.
구현예에서, 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEGn-CL, 225Ac-HEHA-PEGn-CL, 225Ac-PEPA-PEGn-CL, 225Ac-Macropa-PEGn-CL, 225Ac-TETA-PEGn-CL, 225Ac-DOTPA-PEGn-CL, 225Ac-TETPA-PEGn-CL 또는 225Ac-DOTMP-PEGn-CL, 177Lu-DOTA-PEGn-CL, 177Lu-HEHA-PEGn-CL, 177Lu-PEPA-PEGn-CL, 177Lu-Macropa-PEGn-CL, 177Lu-TETA-PEGn-CL, 177Lu-DOTPA-PEGn-CL, 177Lu-TETPA-PEGn-CL 또는 177Lu-DOTMP-PEGn-CL로 표시될 수 있으며, 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고; 가장 바람직하게는 L1은 PEG7이다. 바람직하게는, CL은 테트라진(Tz)이다.
구현예에서, 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있다.
구현예에서, 킬레이터는 오픈 사슬 리간드를 포함한다. 오픈 사슬 리간드를 포함하는 바람직한 킬레이터는 데페록사민(DFO), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)이지만 이에 제한되지 않는다.
구현예에서, 표지된 화합물은 225Ac-DFO-PEGn-Tz, 225Ac-EDTA-PEGn-Tz, 225Ac-DTPA-PEGn-Tz, 177Lu-DFO-PEGn-Tz, 177Lu-EDTA-PEGn-Tz, 또는 177Lu-DTPA-PEGn-Tz로 표시될 수 있으며, 바람직하게는 여기서 n은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고; 가장 바람직하게는 L1은 PEG7이다. 바람직하게는, CL은 테트라진이다.
구현예에서, 표지된 화합물은 225Ac-EDTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-EDTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있다.
구현예에서, L2는 표지에 공유 결합된 기이다. 즉, L2-R*는 공유 결합이다. 바람직하게는, R*은 아스타틴-211, 디스프로슘-165, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 루테늄-106, 스트론튬-89, 또는 제논-133이다.
구현예에서, L2는 벤조에이트 링커, 바람직하게는 3-피리딘카르복실, 벤조에이트 또는 구아디노메틸 벤조에이트, 훨씬 더 바람직하게는 구아디노메틸 벤조에이트, 가장 바람직하게는 4-구아디노메틸 벤조에이트이다. 이러한 활성 에스테르는 높은 생체내 안정성을 보인다.
구현예에서, 표지된 화합물은 상기 정의된 바와 같은 R*-L2-PEGn-CL로 표시될 수 있으며, 여기서 L2은 벤조에이트 링커, 더 바람직하게는 4-구아디노메틸 벤조에이트이고, 훨씬 더 바람직하게는 R*은 요오드-131이고, 가장 바람직하게는 n은 7이다.
구현예에서, 표지된 화합물은 상기 정의된 바와 같은 [I-131]GMIB-PEGn-CL로 표시될 수 있으며, 여기서 [I-131]GMIB는 4-구아니디노메틸-3-[I-131]요오도벤조에이트이고, 바람직하게는 n은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고; 가장 바람직하게는 L1은 PEG7이다. 그러한 표지된 화합물에서 링커 L2는 구아디노메틸 벤조에이트이고 R*은 요오드-131인 것으로 이해된다.
[I-131]GMIB-PEGn-CL로 표시된 표지된 화합물은 또한 다음 구조로 표시될 수 있다:
구현예에서, 표지된 화합물은 상기 정의된 바와 같은 [I-131]GMIB-CL로 표시될 수 있다. 이러한 구현예에 따른 표지된 화합물은 또한 다음 구조로 표시될 수 있다:
구현예에서, 표지된 화합물을 상기 정의된 바와 같은 [I-131]GMIB-PEGn-Tz로 표시될 수 있으며, 여기서 [I-131]GMIB는 4-구아니디노메틸-3-[I-131]요오도벤조에이트이고, 바람직하게는 n은 1 내지 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 5 내지 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20의 정수이거나; n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이고; 가장 바람직하게는 L1은 PEG7이다. 그러한 표지된 화합물에서 링커 L2는 구아디노메틸 벤조에이트이고 R*은 요오드-131인 것으로 이해된다.
구현예에서, 표지된 화합물은 상기 정의된 바와 같은 [I-131]GMIB-Tz로 표시될 수 있다.
항원
일반
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 여기서 상기 항원은 표적에 포함되고, 상기 항원에 대한 상기 VHH, 또는 이의 단편의 상기 결합은 상기 표적에서 상당한 형태적 변화를 유발한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 항원(여기서, 상기 항원은 종양 세포의 표면 또는 종양 미세환경에 존재함)에, 더 바람직하게는 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 항원(여기서, 상기 항원은 종양 세포의 표면 또는 종양 미세환경에 존재함)에, 더 바람직하게는 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 항원(여기서, 상기 항원은 발암유전자이고/이거나 상기 항원은 암 세포 또는 종양 미세환경에서 발현됨)에, 더 바람직하게는 10-1 s-1 이하, 바람직하게는 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 항원(여기서, 상기 항원은 발암유전자이고/이거나 상기 항원은 암 세포 또는 종양 미세환경에서 발현됨)에, 더 바람직하게는 10-1 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 바람직하게는 10-2 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 더 바람직하게는 10-3 s-1 내지 10-5 s-1의 범위, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 내지 10-5 s-1의 범위의 해리 상수(koff)로 특이적으로 결합할 수 있다.
구현예에서, 상기 항원은 CEA, PSMA, 4Ig-B7-H3, A33, a5β1 인테그린, AGS-16, AGS-8, avβ3 인테그린, CAIX/MN, CCR-2/CCL-2, CD40, CD44v6, CK19, CTLA-4, d9-E-카드헤린, DNA/히스톤 H1, ED-B, 피브로넥틴, EFGL7, EGFR, EGP-1, 엔도글린, EpCAM, FAP, FZD10, GC128, GD2, GD3, HER-2, HER-3, HPV-16 E6, IGF-1R, IL-6, L1-CAM, 루이스y, MAGE-A3, 멜라닌, 메소텔린, MET/HGF, MUC1, NCAM, 뉴로필린-1, PD-1/PD-L1, PDGFR, PSCA, TAG-72, TEM-1, 테나신-C, 트롬보모듈린, TRAIL-R, Tweak-R, VE 카드헤린, VEGFR/VEGF, 또는 VEGFR1이다. 바람직하게는, 상기 항원은 발암유전자이고/이거나 암 세포 또는 종양 미세환경에서 발현된다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1) 또는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2), 바람직하게는 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 또는 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)에 특이적으로 결합할 수 있다.
섬유아세포 활성화 단백질(FAP)
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 결합하기에 특히 적합하다. 일 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편은 인간 및 뮤린 FAP에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP의 세포외 도메인의 일부에 결합한다.
실시예 3, 5 및 6은 암을 치료하기 위한 FAP-결합 VHH의 사전 표적화 접근법의 유용성을 나타낸다. 실시예 3은 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 장기 생체분포 및 종양 표적화를 제시한다. 실시예 5는 급성 독성의 어떠한 관련 징후 없이 종양 이종이식 마우스 모델에서 사전 표적화 225Ac-VHH1의 치료적 잠재력을 입증한다. 실시예 6은 사전 표적화 225Ac-VHH1로 처리된 건강한 암컷 C57Bl/6 마우스의 장기 독성학을 조사하며, 급성 또는 장기 독성의 징후가 나타나지 않았다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편 및 본 발명에 따른 조합물은 바람직하게는 CAF 세포 및/또는 암 세포에서 인간 FAP의 발현과 연관된 암을 치료하는 데 사용된다.
또 다른 적용에서, 모이어티는 섬유증, 상처 치유, 심근경색증, 죽상경화증, 관절염 및 다른 염증성 및 섬유성 질환을 치료하기 위한 약제일 수 있다. 그러한 적용에서, 본 발명의 항체 단편은 열거된 질환을 치료하기 위해 상기 질환의 부위에 약제를 표적화하는 데 사용된다.
인간 FAP는 종양형성 기능을 가지는 암-연관 섬유아세포(CAF)에서 특이적으로 발현되고 보다 특이적으로 과발현되기 때문에 표적화하기에 매우 매력적이다( et al 2018, Oncogene Aug;37(32):4343-4357). 또한 인간 FAP는 일부 암 세포(예컨대, 본 명세서에서 이후에 개시된 바와 같은 백혈병, 뼈암, 자궁암, 췌장암, 피부암, 근육암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간암, 폐암, 난소암, 부갑상선암, 신장암)에서 발현되고 건강한 세포에서는 잘 발현되지 않는다. 따라서 인간 FAP는 종양 항원 또는 암 세포 항원으로 간주될 수 있으므로, 진단 및/또는 치료 표적으로서 사용될 수 있다.
그러나 본 발명의 VHH, 또는 이의 단편의 다른 적용(진단 및 치료)도 또한 본 발명에 포함된다. 그러한 다른 진단 및/또는 치료적 적용은 암과 관련되지 않지만 섬유증, 상처 치유, 심근경색증, 죽상경화증, 관절염, 및 다른 염증성 및 섬유성 질환과 관련될 수 있다. 즉, 본 발명의 VHH, 또는 이의 단편은 섬유증, 상처 치유, 심근경색증, 죽상경화증, 관절염 및 다른 염증성 및 섬유성 질환을 진단 및/또는 치료하기 위한 진단 및/또는 치료적 적용에 사용될 수 있다. 더 상세한 설명은 본 명세서에서 이후에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 인간 FAP는 '암 세포-특이적 항원', '암-특이적 항원', '암 항원', '~에 존재하는 표적 단백질', '~에서 발현되는 표적 단백질' 및/또는 '암 세포에 특이적', '암 세포-특이적 표적 (단백질)', '암 (세포)-연관 항원'인 것으로 간주되고, 이들은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 인간 FAP가 주로 암 세포에 및 종양의 부근 및/또는 전이의 부근에 존재한다(또는 주로 여기에서 발현된다)는 사실을 지칭한다. FAP는 종양형성 기능을 가지는 암-연관 섬유아세포(CAF)에서 특이적으로 발현되고 보다 특이적으로 과발현된다. 또한 FAP는 일부 암 세포(예컨대, 본 명세서에서 이후에 개시되는 바와 같은 백혈병, 뼈암, 자궁암, 췌장암, 피부암, 근육암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간암, 폐암, 난소암, 부갑상선암, 신장암( et al 2018, Oncogene Aug;37(32):4343-4357))에서 발현된다. FAP는 건강한 세포에서 잘 발현되지 않는다. 따라서 인간 FAP는 종양 항원 또는 암 세포 항원으로 간주될 수 있으므로, 진단 및/또는 치료 표적으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간 FAP는 암-연관 섬유아세포에서 발현된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FAP 양성" 또는 "FAP 발현" 또는 "FAP 과발현"은 암성 또는 악성 인간 세포 및/또는 FAP 단백질 과발현으로 특성화되는 암-연관 섬유아세포 또는 조직을 지칭할 수 있으며, 따라서 정상적인 건강한 세포와 비교하여 비정상적으로 높은 수준의 FAP 유전자 및/또는 FAP 단백질을 가진다. 이러한 맥락에서, "과발현"은 발현이 대조군 세포주에서의 발현보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상인 것을 의미할 수 있다. 대조군 세포주는 건강하거나 질환에 걸리지 않은 세포일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하고, 다음 중 적어도 하나를 충족시킨다:
a. 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760에 포함되고, 바람직하게는 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨(또는 이를 포함함),
b. 여기서 서열번호 5의 적어도 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458은 상기 VHH 또는 이의 단편과 상호작용함,
c. 상기 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하고, 다음 중 적어도 하나를 충족시킨다:
a. 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760에 포함되고, 바람직하게는 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨(또는 이를 포함함),
b. VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합함:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및/또는 G159, 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및/또는 Y458,
c. VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하고, 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내에 포함되는 에피토프를 가지며, 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및/또는 G159, 및
6) R175, 및
7) D457 및/또는 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하고, 서열번호 5의 아미노산 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함되는 에피토프를 가지며(또는 이를 포함하는 에피토프를 가지며), 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및/또는 G159, 및
6) R175, 및
7) D457 및/또는 Y458.
출원 전반에 걸쳐, FAP는 FAP알파와 동의어이며, 또한 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP알파)로도 지칭되는 폴리펩타이드 프롤릴 엔도펩티아제 FAP에 해당한다. 이러한 단백질을 인코딩하는 유전자는 FAP로 지칭된다.
인간 및/또는 뮤린 FAP에 대한 결합은 상이한 항원의 균질한 혼합물에서 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원을, 일부 구현예에서 약 10 내지 100배 이상을 초과하여(예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 초과) 구별할 것이다.
일 구현예에서, 결합은 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 세포를 사용하여 시험관내에서, 그리고 선택적으로 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같이 생체내 또는 생체외에서 평가될 수 있다. 이들 세포는 인간 세포일 수 있으며 내인성 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현할 수 있다. 대안적으로, 이들 세포는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 과발현할 수 있다. 인간 및/또는 뮤린 FAP를 과발현하는 세포는 인간 또는 비-인간 세포일 수 있다. 바람직한 세포는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 섬유아세포이다. 바람직한 형질감염된 세포주는 HEK293이다. FAP를 발현하는 바람직한 세포주는 GM05389 또는 U-87 MG이다. 인간 FAP를 발현하는 바람직한 암 세포주는 U-87 MG이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합한다. 이러한 평가는 바람직하게는 ELISA, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물층 간섭계를 사용하여 수행된다.
또한 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP의 다수의 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합할 것으로 예상된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 적어도, VHH 또는 이의 단편이 결합하는 (천연/야생형) 항원의 에피토프를 (여전히) 포함하는 인간 및/또는 뮤린 FAP의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 천연 발생, 합성 유사체, 일부 및 단편에 특이적으로 결합할 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편의 인간 FAP의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함된다.
일 구현예에서, 서열번호 5의 다음 아미노산 중 적어도 하나가 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 결합하거나 접촉하거나 상호작용한다: I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및/또는 G159, 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및/또는 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및/또는 G159, 및
6) R175, 및
7) D457 및/또는 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및 G159 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개 아미노산, 및
5) V158 및 G159 및
6) R175, 및
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및 G159 및/또는
6) R175, 및
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및 G159 및
6) R175, 및
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 서열번호 5의 다음 아미노산이 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 결합하거나 접촉하거나 상호작용한다: I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및 Y458. 이러한 맥락에서, FAP의 인간 아미노산은 상기 아미노산이 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프에 속할 때 VHH, 또는 이의 단편에 의해 결합될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은, VHH, 또는 이의 단편이 제2 분자에 결합하는 친화도보다 적어도 5배, 예컨대 적어도 10배, 예컨대 적어도 100배, 바람직하게는 적어도 1000배 더 높은 친화도로 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 관심이 있는 제1 표적 항원과 결합할 때, 제2 분자, 예컨대 FAP의 가장 가까운 상동체 중 하나(즉, DPP IV, 디펩티딜 아미노-펩티다제 IV, 문헌[Juillerat-Jeanneret, L.,et al (2017), Expert Opinion on therapeutic targets, 21: 977-991])와 대조적으로 관심이 있는 제1 표적 항원(즉, 인간 및/또는 뮤린 FAP)에 '특이적'인 것으로 지칭된다. DPP IV의 아미노산 서열은 FAP의 아미노산 서열과 52%의 동일성을 가지며, 또한 VHH, 또는 이의 단편은 2개의 관련된 프롤릴-특이적 세린 프로테아제를 구별할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제2 분자와 대조적으로 관심이 있는 제1 표적 항원에 '특이적'이라고 할 때, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 관심이 있는 제1 표적 항원에 (본 명세서에 정의된 바와 같이) 특이적으로 결합할 수 있지만, 제2 분자에는 그렇지 않다.
본 명세서에서 호환 가능하게 사용되는 바와 같이 용어 '(와) 경쟁하는', '교차 차단하는', '교차 결합하는' 및 '교차 억제하는'은 일반적으로 적합한 시험관내 또는 생체내 분석을 사용하여 측정될 때, 인간 및/또는 뮤린 FAP에 대한 본 발명에 따른 또 다른 VHH, 또는 이의 단편, 또는 다른 분자의 결합을 방해할 수 있는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 지칭한다. 인간 및/또는 뮤린 FAP에 대한 시험관내 결합을 시험하는 데 사용되는 바람직한 세포는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 세포이다. 바람직한 세포주는 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 GM05389, U-87 MG 또는 형질감염된 HEK293일 수 있다. 따라서, 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 사용하여 '(와) 경쟁하는', '교차 차단하는', '교차 결합하는' 및 '교차 억제하는'은, 본 발명에 따른 또 다른 VHH, 또는 이의 단편과 인간 및/또는 뮤린 FAP의 결합을 방해하거나 이와 경쟁하여, '교차 차단하는' 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 사용하지 않는 본 발명에 따른 다른 VHH, 또는 이의 단편과 인간 및/또는 뮤린 FAP의 결합과 비교하여, 적합한 시험관내, 세포 또는 생체내 검정법을 사용하여 측정될 때 적어도 10%, 그러나 바람직하게는 적어도 20%, 예를 들어 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상만큼 해당 결합을 감소시킴을 의미할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 FAP의 리간드와 이에 결합하기 위해 경쟁하지 않는다. 결과적으로, VHH, 또는 이의 단편은 또한 이 수용체의 천연 기능을 방해하지 않을 것으로 예상된다. 이는 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP의 천연 리간드와 경쟁하지 않으며 따라서 시험관내 또는 생체내 또는 생체외 환경에서 인간 및/또는 뮤린 FAP-발현 세포에 결합하기 위해 억제되지 않음을 의미한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 FAP 활성을 실질적으로 변경하지 않으며, 이는 바람직하게는 FAP 활성을 실질적으로 억제하지 않음을 의미한다. 본 발명의 맥락 내에서, '실질적인'은 VHH, 또는 이의 단편이 존재하지 않을 때 동일한 FAP 활성과 비교하여 FAP 활성의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%가 여전히 검출 가능함을 의미할 수 있다. 본 발명의 맥락 내에서, FAP 활성은 엑소펩티다제 및/또는 엔도펩티다제 활성일 수 있다. 이러한 엑소펩티다제 활성은 FAP 디펩티딜 펩티다제 활성일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 FAP 디펩티딜 펩티다제 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 이러한 엔도펩티다제 활성은 젤라티나제 및/또는 콜라게나제 활성일 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 FAP 젤라티나제 및/또는 FAP의 콜라게나제 활성을 실질적으로 억제하지 않는다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP의 조절제가 아니다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 이의 단편은 억제제가 아니고 인간 및/또는 뮤린 FAP의 활성화제가 아니다. 임의의 FAP 활성은 문헌[Juillerat-Jeanneret L. et al, (2017), Expert Opinion on Therapeutic Targets (http://dx.doi.org/10.1080/14728222.2017.1370455)]에 예시된 바와 같이 평가될 수 있다. FAP 디펩티딜 펩티다제 활성은 당업자에게 알려진 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 요컨대, 인간 FAP 효소 활성은 형광 기질인 벤질옥시카르보닐-Gly-Pro-7-아미도-4-메틸쿠마린(Z-Gly-Pro-AMC; Bachem)을 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 VHH, 또는 이의 단편이 관심이 있는 2개의 상이한 표적 단백질 둘 다에 대해 (본 명세서에 정의된 바와 같이) 특이적인 경우 관심이 있는 이들 2개의 상이한 표적 단백질에 대해 '교차 반응성'을 나타낸다고 한다. 일 구현예에서, 관심이 있는 2개의 상이한 표적 단백질은 인간 및 뮤린 FAP일 수 있다.
하기에 본 발명자들은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 여러 가지 바람직한 구조적 특징(즉, 제1, 제2, 제3, 제4 구조적 특징)을 기재한다. VHH, 또는 이의 단편은 이들 4가지 구조적 특징 중 적어도 하나, 또는 전부의 존재로 특성화될 수 있다:
- 제3 및 제4 구조적 특징,
- 제1 및 제2 구조적 특징,
- 제1, 제2 및 제3 구조적 특징
- 제3 및 제4 구조적 특징,
- 제3 구조적 특징,
- 제4 구조적 특징,
- 제1, 제3 및 제4 구조적 특징,
- 제2, 제3 및 제4 구조적 특징,
- 제1 및 제3 구조적 특징,
- 제1 및 제4 구조적 특징,
- 제2 및 제3 구조적 특징,
- 제2 및 제4 구조적 특징
- 제1, 제2, 제3 및 제4 구조적 특징.
본 발명에 따른 이의 단편의 제1 구조적 특징: FAP의 접촉 영역 기반.
제1 구조적 특징은 본 발명에 따른 이의 단편이 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내에 포함되는 인간 FAP의 영역과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용한다는 것이다. VHH, 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 결합되거나 표적화되는 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내의 영역은 상기 1차 아미노산 서열 내의 선형 영역(즉, 선형 에피토프 또는 순차적 에피토프)일 수 있다. 대안적으로 상기 영역은 선형이 아닐 수 있고 형태적 에피토프에 해당할 수 있다. 보통 선형 에피토프는 길이가 5 내지 30개 아미노산인 아미노산의 선형 서열을 포함하며, 즉 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산일 수 있다. 보통 형태적 에피토프는 단백질의 3차원 3차 구조에서 함께 합쳐지고 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되는 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내의 다수의 비-연속적 아미노산으로 특성화된다.
VHH, 또는 이의 단편의 제2 구조적 특징에 대한 다음 단락에서, VHH, 또는 이의 단편의 선형 에피토프 및 형태적 에피토프가 정의되어 있다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 제2 구조적 특징: VHH, 또는 이의 단편의 에피토프 기반.
인간 및/또는 뮤린 FAP의 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 상기에서 정의된 제1 구조적 특징과 조합하여 하기 정의된 제2 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
제2 구조적 특징은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내의 다수의 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다는 것이다. 서열번호 5의 아미노산 26 내지 760 내의 이들 특이적 아미노산은 하기에 추가로 정의되어 있다.
이러한 제2 구조적 특징의 제1 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함되는 아미노산 중 적어도 하나와 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다. 따라서 식별된 66개의 아미노산으로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 또는 66개 아미노산의 각각의 조합이 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되도록 포함된다.
이러한 제2 구조적 특징의 제2 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및 Y458 중 적어도 하나와 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다. 따라서 식별된 37개 아미노산으로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37개 아미노산의 각각의 조합이 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되도록 포함된다.
이러한 제2 구조적 특징의 제3 구현예에서, 서열번호 1의 아미노산 65 내지 90의 스트레치는 hFAP의 제1 영역을 정의하며, 이는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이러한 스트레치 또는 영역 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 스트레치 또는 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이러한 제1 스트레치 또는 영역은 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프이다. 일 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 이러한 제1 스트레치 또는 영역 내에 포함된다.
바람직하게는 이러한 제1 스트레치 내에서 Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90 중 적어도 하나는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
더 바람직하게는 이러한 제1 스트레치 내에서 Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90 중 적어도 2개는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
훨씬 더 바람직하게는 이러한 제1 스트레치 내에서 Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89 및 L90 중 적어도 3개는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
훨씬 더 바람직하게는, 바람직하게는, 이러한 제1 스트레치 내에서 Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90 전부는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
가장 바람직하게는, 이러한 제1 스트레치 내에서 Q65, E66, I76, V77, L78, N80, I81, E82, T83, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90 전부는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
이러한 제2 구조적 특징의 제4 구현예에서, 서열번호 5의 아미노산 101 내지 140의 스트레치는 hFAP의 제2 영역을 정의하며, 이는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이러한 스트레치 또는 영역 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합될 필요가 없다. 일 구현예에서, 이러한 스트레치 또는 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이러한 제2 스트레치 또는 영역은 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프이다. 일 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 이러한 제2 스트레치 또는 영역 내에 포함된다.
바람직하게는 이러한 제2 스트레치 내에서 L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137 중 적어도 하나는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
더 바람직하게는 이러한 제2 스트레치 내에서 L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137 중 적어도 2개는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
훨씬 더 바람직하게는 이러한 제2 스트레치 내에서 L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137 중 적어도 3개는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
가장 바람직하게는 이러한 제2 스트레치 내에서 L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137 전부는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
이러한 제2 구조적 특징의 제5 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 I62, S63, G64, S91, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458과 같은 추가적인 아미노산과 추가로 접촉한다.
이러한 제2 구조적 특징의 제6 구현예에서, 상기 정의된 제1 및 제2 스트레치 또는 영역 각각은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이들 2개 스트레치의 조합은 VHH, 또는 이의 단편의 형태적 에피토프를 정의한다. 일 구현예에서, 형태적 에피토프는 이들 2개 스트레치의 조합 내에 포함된다. 이들 스트레치 또는 영역 각각 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 스트레치 또는 영역 각각의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산(또는 각각의 스트레치의 길이에 따라 그 이상)은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 I62, S63, G64, S91, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458과 같은 추가적인 아미노산과 추가로 접촉한다.
일 구현예에서, 인간 FAP의 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함된다. 선택적으로, VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 I62, S63, G64, S91, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458과 같은 추가적인 아미노산과 추가로 접촉한다.
일 구현예에서, 인간 FAP의 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함된다. 선택적으로, VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 I62, S63, G64, S91, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458과 같은 추가적인 아미노산과 추가로 접촉한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및/또는 G159, 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및/또는 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및/또는 G159, 및
6) R175, 및
7) D457 및/또는 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및 G159 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 2개 또는 적어도 3개 아미노산, 및
5) V158 및 G159 및
6) R175, 및
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
5) V158 및 G159 및/또는
6) R175, 및/또는
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 5의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) I62, S63, G64, Q65, E66으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
4) D134, L135, S136, N137로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
5) V158 및 G159 및
6) R175, 및
7) D457 및 Y458.
일 구현예에서, 서열번호 5의 다음 아미노산이 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 결합하거나 접촉하거나 상호작용한다: I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및 Y458.
일 구현예에서, 서열번호 5의 다음 아미노산이 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 결합하거나 접촉하거나 상호작용한다: I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, N80, I81, E82, T83, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및 Y458.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 제3 구조적 특징: 전장 서열 기반
제3 구조적 특징은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 전장 아미노산 서열과 관련된다는 것이다. 본 발명은 서열번호 4 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되는 구조적으로 밀접하게 관련된 VHH의 패밀리를 개시한다. VHH VHH1은 서열번호 4로 표시된다(하기 표 2 참조).
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 상기 정의된 바와 같은 제1 구조적 특징 및 하기 추가로 정의된 제3 구조적 특징에 의해 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 상기 정의된 바와 같은 제2 구조적 특징 및 하기 추가로 정의된 제3 구조적 특징에 의해 정의될 수 있다.
이러한 제3 구조적 특징의 제1 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, 이러한 서열과의 서열 동일성은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 제3 구조적 특징의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 81% 서열 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, 이러한 서열과의 서열 유사성은 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 제3 구조적 특징의 제2 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지고, 서열번호 4의 정확한 길이 또는 서열번호 4의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개의 아미노산만큼 더 긴 범위의 길이를 가지는 아미노산 서열로 표시된다.
이러한 제3 구조적 특징의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 81% 서열 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지고, 서열번호 4의 정확한 길이 또는 서열번호 4의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개의 아미노산만큼 더 긴 범위의 길이를 가지는 아미노산 서열로 표시된다.
예를 들어, His-태그와 같은 태그가 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 첨가될 수 있다. 보통 His-태그는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 히스티딘을 포함한다. 대안적인 태그는 헤마글루티닌 태그(HA-tag), 즉 YPYDVPDYA(서열번호 11); YPYDVPDYGS(서열번호 12) 또는 시스테인 태그(Cys 태그)일 수 있다. 시스테인 태그는 1개 또는 여러 개의 시스테인을 포함하는 태그이다. 시스테인 태그의 비-제한적인 예는 C; GGC; SPSTPPTPSPSTPPC(서열번호 13)이다.
동일성 및 유사성을 평가하는 방법은 설명 말단 부분의 정의에 대한 파트에 상세히 설명되어 있다. 보통 동일성이 서열번호를 참조하여 정의될 때, 상기 동일성은 전체 서열번호에 대해 평가된다. 그러나, 동일성(또한 유사성)을 상기 서열의 일부분(또는 단편)에 대해 평가하는 것 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 맥락 내에서, 일부분은 서열번호의 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%를 의미할 수 있다. 포함되는 서열의 길이는 여전히 동일성(또는 유사성)이 서열번호의 일부분, 또는 서열번호의 정확한 길이보다 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 아미노산만큼 더 긴 길이에 대하여 평가되더라도 동일성(또는 유사성)(즉, 길이는 서열번호의 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%임)을 평가하는 데 사용되는 서열번호의 길이보다 더 길 수 있고, 서열번호 중 하나와 동일할 수 있다.
이러한 제3 구조적 특징의 제3 구현예에서, VHH, 또는 이의 단편의 길이는 110 내지 130개의 아미노산이거나 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개의 아미노산이다. 이러한 길이는 VHH, 또는 이의 단편의 서열에 첨가될 수 있는 태그, 예컨대 His 태그의 길이를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 길이가 서열번호 4의 정확한 길이 또는 서열번호 4의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 아미노산만큼 더 긴 범위이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 길이가 110 내지 130개 아미노산 또는 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이고 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3을 포함한다.
이러한 제3 구조적 특징의 제4 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분의 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되고 VHH, 또는 이의 단편의 길이는 80 내지 150개 아미노산 또는 90 내지 140 또는 100 내지 130 또는 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산이다. 일 구현예에서, 이들 서열 중 적어도 하나와의 서열 동일성은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 제3 구조적 특징의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 4 또는 이의 일부분의 적어도 하나와 적어도 81% 서열 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되고 VHH, 또는 이의 단편의 길이는 80 내지 150개 아미노산 또는 90 내지 140 또는 100 내지 130 또는 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산이다. 일 구현예에서, 이들 서열 중 적어도 하나와의 서열 유사성은 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 5의 아미노산의 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140) 중 적어도 하나(바람직하게는 둘 다)와 접촉하거나, 이에 결합하거나, 이에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산의 이들 스트레치 또는 영역 내에 포함된다.
더욱이, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 형태적 에피토프에 대하여 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 5의 아미노산의 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140)의 조합을 가진다. 일 구현예에서, 상기 VHH, 또는 이의 단편의 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산의 이들 스트레치 또는 영역 내에 포함된다.
이들 에피토프는 VHH 또는 이의 단편의 패밀리를 정의한다. 이러한 VHH 또는 이의 단편의 패밀리는 이들 에피토프, 선형 에피토프 및/또는 이러한 형태적 에피토프 중 적어도 하나를 공유한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은:
- 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되고(제3 구조적 특징)
- 에피토프에 대하여 서열번호 5의 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함되는 아미노산 스트레치 또는 영역을 가진다(제2 구조적 특징).
일 구현예에서, 이러한 서열과의 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 길이가 서열번호 4의 정확한 길이 또는 서열번호 4의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 아미노산만큼 더 긴 범위이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은:
- 서열번호 4 또는 이의 일부분과 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되고(제3 구조적 특징)
- 서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나와 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다(제2 구조적 특징).
일 구현예에서, 이러한 서열과의 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 길이가 서열번호 4의 정확한 길이 또는 서열번호 4의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 아미노산만큼 더 긴 범위이다.
제2 구조적 특징의 다른 구현예 각각은 제3 구조적 특징의 각각의 구현예와 조합될 수 있다.
제4 구조적 특징: CDR / CDR 이식
제4 구조적 특징에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역을 포함하는 군으로부터 선택되는 CDR 서열의 적어도 하나의 조합을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
상기 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 1개 또는 2개의 아미노산은 수득된 VHH, 또는 이의 단편의 활성을 실질적으로 변경시키지 않으면서 또 다른 하나의 아미노산으로 치환될 수 있었다. VHH, 또는 이의 단편의 프레임워크 영역 중 임의의 것에 대해서도 동일하게 적용된다. 이들 변이체 각각은 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 변이체의 활성은 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 특이적 결합 활성이다. 본 발명의 맥락 내에서, '실질적인'은 VHH, 또는 이의 단편의 활성을 초기 CDR 및/또는 FR 영역과 비교하여 상기 결합 활성의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%가 여전히 검출 가능함을 의미할 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 다음과 같은 (일반) 구조를 가지거나 다음으로부터 유래된 중쇄 항체를 포함하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 제공한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하며, 본 명세서에 추가로 정의된 바와 같다(인간 및/또는 뮤린 FAP에 대해 생성된 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 열거하는 표 2 참조).
본 발명은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 이를 발현하는 뉴클레오타이드 서열)의 기원으로 제한되지 않거나, 본 명세서에 개시된 VHH, 또는 이의 단편, 또는 뉴클레오타이드 서열이 생성되거나 수득되는(또는 생성되었거나 수득된) 방식으로 제한되지 않음에 유의하여야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 천연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종 유래) 또는 합성 또는 반-합성 아미노산 서열일 수 있다. VHH, 또는 이의 단편을 단리하는 방법 및 VHH, 또는 이의 단편을 생산하는 방법뿐만 아니라, VHH, 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 작제물 및 이러한 작제물을 포함하는 세포가 설명 말단 부분의 정의 파트에 상세히 개시되어 있다.
본 발명의 구체적이지만 비-제한적인 양태에서, VHH, 또는 이의 단편의 아미노산 서열은 "인간화된" 면역글로불린 서열(예컨대, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 그리고 구체적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화된 VHH 서열), "낙타화된" 면역글로불린 서열뿐만 아니라, 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 천연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발함), CDR 이식, 베니어링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용하는 PCR 조립, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기법과 같은 기법에 의해 수득된 면역글로불린 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 천연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종 유래) 또는 합성 또는 반-합성 면역글로불린 서열; 또는 상기한 것 중 임의의 것의 임의의 적합한 조합이다. 또한, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화되어 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH, 또는 이의 단편으로부터 유래된다.
본 발명에 따른 바람직한 VHH, 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR2 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR1 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR3 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR2 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
유사하게, 아미노산 서열이 합성 또는 반-합성 서열(예컨대, 부분적으로 인간화된 서열)을 포함하는 경우, 상기 서열은 선택적으로 본 명세서에 마찬가지로 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화되어 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다. 설명 말단 부분에, "효현제", "길항제", "변이체", "번역후 구조적 특성"의 더 상세한 정의가 제공되어 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인간화된 VHH, 또는 이의 단편은 인간화 치환이고/이거나 이에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재하는(구체적으로, 프레임워크 잔기 중 적어도 하나에 존재하는) 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 다른 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 천연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 해당 프레임워크 서열과 비교함으로써 확인될 수 있으며, 후속적으로 이렇게 결정된 잠재적으로 유용한 인간화 치환(또는 이의 조합) 중 하나 이상이 상기 VHH 서열에 (본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 그 자체로 알려진 임의의 방식으로) 도입될 수 있고 생성된 인간화된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 표적에 대한 친화도에 대해, 안정성에 대해, 발현의 용이성 및 수준에 대해, 및/또는 다른 원하는 특성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오에 의해, 다른 적합한 인간화 치환(또는 이의 적합한 조합)이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 상기 정의된 바와 같은 제1 구조적 특징 및 본 명세서에 추가로 정의된 제4 구조적 특징에 의해 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 상기 정의된 바와 같은 제2 구조적 특징 및 본 명세서에 추가로 정의된 제4 구조적 특징에 의해 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 상기 정의된 바와 같은 제2 구조적 특징, 제3 구조적 특징 및 본 명세서에 추가로 정의된 제4 구조적 특징에 의해 정의될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 5의 아미노산의 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140) 중 적어도 하나(바람직하게는 둘 다)와 접촉하거나, 이에 결합하거나, 이에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 상기 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프는 서열번호 5의 아미노산의 이들 스트레치 또는 영역 내에 포함된다.
더욱이, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 형태적 에피토프에 대하여 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 5의 아미노산의 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140)의 조합을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 상기 VHH, 또는 이의 단편의 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산의 이들 스트레치 또는 영역의 조합 내에 포함된다.
이들 에피토프는 VHH 또는 이의 단편의 패밀리를 정의한다. 이러한 패밀리는 이들 에피토프, 선형 에피토프 및/또는 이러한 형태적 에피토프 중 적어도 하나를 공유한다.
본 발명에 따른 바람직한 VHH, 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR2 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR1 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR3 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR2 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음(제4 구조적 특징),
그리고
- 서열번호 5의 65 내지 90 및/또는 101 내지 140에 포함되는 아미노산 스트레치 또는 영역 내에 포함되는 에피토프를 가진다(제2 구조적 특징).
본 발명에 따른 바람직한 VHH, 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR2 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역, 및 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR1 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역, 및 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. FR 영역은 표 2에서 식별된 바와 같을 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음. CDR3 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래임.
- 서열번호 1을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR1 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR2 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 2를 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR2 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR3 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음.
- 서열번호 3을 포함하거나 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 CDR3 영역. VHH, 또는 이의 단편은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래의 CDR1 및 CDR2 영역을 포함하고 표 2에서 식별된 바와 같은 FR을 가질 수 있음. 대안적으로, FR 영역은 또 다른 VHH, 또는 이의 단편 유래일 수 있음(제4 구조적 특징),
그리고
- 서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나와 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다(제2 구조적 특징).
제2 구조적 특징의 다른 구현예 각각은 제4 구조적 특징의 각각의 구현예와 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에서 식별된 바와 같은 제1 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 제4 구조적 특징으로 표시된다. 대안적으로 또는 상기 구조적 특징과 조합하여, 상기 VHH, 또는 이의 단편은 다음 기능적 특징 중 적어도 하나로 특성화된다:
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 것, 바람직하게는 인간 및 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 것, 및
- FAP 활성을 조절하지 않는 것.
특이적 결합은 본 명세서에서 앞서 기재되었다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 바람직하게는 생물층 간섭계를 사용하여 평가된, 10-9 내지 10-12 몰/리터 범위의 KD 및/또는 10-2 내지 10-5 s-1 범위의 koff, 더 바람직하게는 10-9 내지 10-12 몰/리터 범위의 KD 및 10-2 내지 10-5 s-1 범위의 koff로 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합한다.
VHH, 또는 이의 단편이 조절제가 아닐 수 있다(즉, 인간 및/또는 뮤린 FAP의 억제제가 아니고, 활성화제가 아님)는 사실과 관련된 제2 기능적 특징은 또한 본 명세서에 상세히 기재되었다.
따라서 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 구조적 특징 중 적어도 하나 및/또는 기능적 특징 중 적어도 하나를 충족시켜야 한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨); 및 요오드-131 및 GMIB를 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및/또는 101 내지 140 내에 포함됨); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함됨); 및 GMIB 및 요오드-131을 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함됨); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함됨); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 형태적 에피토프는 서열번호 5의 아미노산 스트레치 또는 영역 65 내지 90 및 101 내지 140의 조합 내에 포함됨); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나는 상기 VHH 또는 단편과 상호작용함); 및 GMIB 및 요오드-131을 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나는 상기 VHH 또는 단편과 상호작용함); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나는 상기 VHH 또는 단편과 상호작용함); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(서열번호 5의 아미노산 I62, S63, G64, Q65, E66, I76, V77, L78, Y79, N80, I81, E82, T83, G84, Q85, S86, Y87, T88, I89, L90, S91, L105, S106, P107, D108, R109, Q110, F111, D134, L135, S136, N137, V158, G159, R175, D457 및/또는 Y458 중 적어도 하나는 상기 VHH 또는 단편과 상호작용함); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 상기 VHH 또는 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열로 표시됨); 및 GMIB 및 요오드-131을 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 상기 VHH 또는 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열로 표시됨); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 상기 VHH 또는 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열로 표시됨); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(여기서, 상기 VHH 또는 단편은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 80% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열로 표시됨); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)에 결합하기에 특히 적합하다.
실시예 8은 TCO-접합 FOLR1-결합 VHH가 사전 표적화 적용에 사용될 수 있음을 입증한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1, 서열번호 14로 표시됨)에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 특이적으로 결합하지 않고 본 명세서에 정의된 바와 같은 추가적인 (구조적) 특징(예컨대, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 구조적 특징)으로 추가로 특성화된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1, 서열번호 14로 표시됨)에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 특이적으로 결합하지 않고 본 명세서에 정의된 바와 같은 추가적인 (구조적) 특징(예컨대, 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 구조적 특징)으로 추가로 특성화된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1, 서열번호 14로 표시됨)에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 특이적으로 결합하지 않고(또는 VHH 또는 이의 단편은 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 특이적으로 결합하지 않고) 다음 중 적어도 하나를 충족시킨다:
d. 에피토프는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내에 포함됨,
e. 서열번호 14의 적어도 아미노산 C89, G90, E91, M92, A93, P94, E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, Y150, Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및/또는 T184는 VHH 또는 이의 단편과 상호작용함,
f. VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 또는 이의 일부 중 적어도 하나와 적어도 60% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 VHH 또는 이의 단편은 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 특이적으로 결합하지 않음)이 제공되며 VHH 또는 이의 단편은 a) 및/또는 b)를 충족시킨다:
a. 에피토프는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내에 포함되고 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합함:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산,
b. VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 VHH 또는 이의 단편은 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 특이적으로 결합하지 않음)이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내에 포함되고 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 특이적으로 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 특이적으로 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
본 발명의 맥락 내에서, 엽산 수용체 1 또는 엽산 결합 단백질로도 알려진 엽산 수용체 알파는 단백질 및 유전자 수준에서 약어 FOLR1 또는 FR-알파를 사용하여 명명된다. 공식적으로, FR-알파는 Uniprot에서 권고하는 단백질 명칭이고 FOLR1은 유전자 명칭으로 사용된다.
인간 FOLR1에 대한 결합은 상이한 항원의 균질한 혼합물에서 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원을, 일부 구현예에서 약 10 내지 100배 이상을 초과하여(예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 초과) 구별할 것이다.
일 구현예에서, 결합은 인간 FOLR1을 발현하는 세포를 사용하여 시험관내에서, 그리고 선택적으로 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같이 생체내 또는 생체외에서 평가될 수 있다. 이들 세포는 인간 세포일 수 있으며 내인성 인간 FOLR1을 발현할 수 있다. 대안적으로, 이들 세포는 인간 FOLR1을 과발현할 수 있다. 인간 FOLR1을 과발현하는 세포는 인간 또는 비-인간 세포일 수 있다. 바람직한 세포는 SKOV3 및 OVCAR3이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하고 뮤린 FOLR1 또는 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에 특이적으로 결합하지 않는다. 이러한 평가는 바람직하게는 ELISA 또는 SPR을 사용하여 수행된다.
또한 VHH 또는 이의 단편은 인간 FOLR1의 다수의 천연 발생 또는 합성 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 일부 및 단편에 결합할 것으로 예상된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 적어도, VHH 또는 이의 단편이 결합하는 (천연/야생형) 항원의 에피토프를 (여전히) 포함하는 인간 FOLR1의 유사체, 변이체, 돌연변이체, 대립유전자, 천연 발생, 합성 유사체, 일부 및 단편에 특이적으로 결합할 것이다. 본 발명의 VHH 또는 이의 단편에 대한 인간 FOLR1의 에피토프는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내에 포함된다.
일 구현예에서, 서열번호 14의 이 부분의 다음 아미노산 중 적어도 하나는 VHH 또는 이의 단편에 의해 결합된다: 서열번호 14의 C89, G90, E91, M92, A93, P94, E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, Y150, Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및/또는 T184.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) 또는 Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 중 다음 아미노산은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 의해 결합된다: C89, G90, E91, M92, A93, P94, E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, Y150, Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및 T184.
이러한 맥락에서, FOLR1의 인간 아미노산은 상기 아미노산이 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프에 속할 때 VHH, 또는 이의 단편에 의해 결합될 수 있다.
VHH 또는 이의 단편의 제1 구조적 특징
제1 구조적 특징은 본 발명의 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내에 포함되는 인간 FOLR1의 영역과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다는 것이다. 서열번호 14는 인간 FOLR1의 인간 아미노산 서열이다. 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233(R25-M233)은 인간 FOLR1(UniProt Knowledgebase: 등록 P15328)의 세포외 도메인(신호 펩타이드 M1 내지 T24 및 GPI 앵커 S234 및 프로-펩타이드 G235 내지 S257이 없음)으로 정의된다. VHH, 또는 이의 단편에 의해 특이적으로 결합되거나 표적화되는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내의 영역은 상기 1차 아미노산 서열 내의 선형 영역(즉, 선형 에피토프 또는 순차적 에피토프)일 수 있다. 대안적으로 상기 영역은 선형이 아닐 수 있고 형태적 에피토프에 해당할 수 있다. 보통 선형 에피토프는 길이가 5 내지 30개 아미노산인 아미노산의 선형 서열을 포함하며, 즉 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산일 수 있다. 보통 형태적 에피토프는 단백질의 3차원 3차 구조에서 함께 합쳐지고 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되는 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내의 다수의 비-연속적 아미노산으로 특성화된다.
VHH, 또는 이의 단편의 제2 구조적 특징에 대한 다음 단락에서, VHH, 또는 이의 단편의 선형 에피토프 및 형태적 에피토프가 정의되어 있다.
VHH 또는 이의 단편의 제2 구조적 특징
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제2 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제2 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
제2 구조적 특징은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내의 다수의 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다는 것이다. 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 내의 이들 특이적 아미노산은 하기에 추가로 정의되어 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 아미노산 C89, G90, E91, M92, A93, P94, E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, Y150, Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및/또는 T184 중 적어도 하나와 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다. 따라서 식별된 26개 아미노산으로부터 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개 아미노산의 각각의 조합이 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되도록 포함된다.
일 구현예에서, 서열번호 14의 아미노산 89 내지 94의 선형 스트레치는 hFOLR1의 제1 선형 영역을 정의하며, 이는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이러한 스트레치 또는 영역 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 선형 스트레치 또는 영역의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산은 VHH 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이러한 제1 선형 스트레치 또는 영역은 VHH, 또는 이의 단편의 에피토프이다.
일 구현예에서, 서열번호 14의 아미노산 140 내지 150의 선형 스트레치는 hFOLR1의 제2 선형 영역을 정의하며, 이는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이러한 스트레치 또는 영역 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합될 필요가 없다. 일 구현예에서, 이러한 선형 스트레치 또는 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 아미노산은 VHH 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이러한 제2 선형 스트레치 또는 영역은 VHH, 또는 이의 단편의 제2 에피토프이다.
일 구현예에서, 서열번호 14의 아미노산 176 내지 184의 선형 스트레치는 hFOLR1의 제3 선형 영역을 정의하며, 이는 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이러한 스트레치 또는 영역 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합될 필요가 없다. 일 구현예에서, 이러한 선형 스트레치 또는 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 아미노산은 VHH 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 일 구현예에서, 이러한 제3 선형 스트레치 또는 영역은 VHH, 또는 이의 단편의 제3 에피토프이다.
일 구현예에서, 상기 정의된 제1, 제2 및 제3 선형 스트레치 또는 영역 각각은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다. 이들 3개 스트레치의 조합은 VHH, 또는 이의 단편의 형태적 에피토프를 정의한다. 이들 스트레치 또는 영역 각각 내 각각의 아미노산은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합되지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 선형 스트레치 또는 영역 각각의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산(또는 각각의 스트레치의 길이에 따라 그 이상)은 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함한다.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함한다.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 제공되며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
- C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
- E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는 Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
- C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개 또는 6개 모두의 아미노산, 및
- E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개 또는 적어도 9개 또는 적어도 10개 또는 11개 모두의 아미노산, 및
- Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 9개 모두의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 2개, 또는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
3) Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
1) C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
2) E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산, 및
3) 또는 Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 3개의 아미노산.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다: C89, G90, E91, M92, A93 및/또는 P94.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다: E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149 및/또는 Y150.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다: Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및/또는 T184.
일 구현예에서, 서열번호 14의 아미노산 25 내지 233 중 다음 아미노산은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 의해 접촉되거나, 결합되거나, 특이적으로 결합된다: C89, G90, E91, M92, A93, P94, E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, Y150, Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183 및 T184.
VHH 또는 이의 단편의 제3 구조적 특징
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제3 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제3 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
제3 구조적 특징은 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 패밀리를 정의하는 방법을 나타내는 (전장) 아미노산 서열과 관련된다. 본 발명은 서열번호 21 또는 22를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되는 구조적으로 밀접하게 관련된 VHH 또는 이의 단편의 패밀리를 개시한다. VHH VHH2는 서열번호 21로 표시되고 VHH3은 서열번호 22로 표시된다(하기 표 4 참조).
서열번호 15, 17 및 18 각각은 VHH 또는 이의 단편의 패밀리에서 보존된 VHH2의 일부이다(하기 표 4 참조).
서열번호 16, 19 및 20 각각은 VHH 또는 이의 단편의 패밀리에서 보존된 VHH3의 일부이다(하기 표 4 참조).
VHH VHH2 및 VHH3은 둘 다 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 14의 아미노산의 선형 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184) 각각과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다. 더욱이, VHH2 및 VHH3 둘 다 형태적 에피토프에 대해 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같은 서열번호 14의 아미노산의 스트레치 또는 영역(즉, 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184)의 조합을 가진다. VHH2 및 VHH3은 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편의 패밀리의 2개 구성원이다. 이러한 VHH 또는 이의 단편의 패밀리는 이들 선형 에피토프 및/또는 이러한 형태적 에피토프 중 적어도 하나를 공유한다. 이러한 VHH 또는 이의 단편의 패밀리는 본 발명에 따른 조합물로 사용될 때 이례적인 운동 특성 및/또는 이례적인 조직 분포를 가진다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 이러한 제3 구조적 특징은 여러 가지 방법으로 정의될 수 있다:
이러한 제3 구조적 특징의 제1 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 적어도 하나 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, 이들 서열 중 적어도 하나와의 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 제3 구조적 특징의 제2 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 중 적어도 하나 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지고, 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22의 정확한 길이 또는 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22의 정확한 길이보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개의 아미노산만큼 더 긴 범위의 길이를 가지는 아미노산 서열로 표시된다. 예를 들어, His 태그와 같은 태그가 본 발명의 VHH 또는 이의 단편에 첨가될 수 있다. 보통 His 태그는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 히스티딘을 포함한다. 대안적인 태그는 헤마글루티닌 태그(HA-tag), 즉 YPYDVPDYA(서열번호 37); YPYDVPDYGS(서열번호 38) 또는 시스테인 태그(Cys 태그)일 수 있다. 시스테인 태그는 1개 또는 여러 개의 시스테인을 포함하는 태그이다. 시스테인 태그의 비-제한적인 예는 C; GGC; SPSTPPTPSPSTPPC(서열번호 39)이다.
동일성 및 유사성을 평가하는 방법은 설명 말단 부분의 정의에 대한 파트에 상세히 설명되어 있다. 보통 동일성이 서열번호를 참조하여 정의될 때, 상기 동일성은 전체 서열번호에 대해 평가된다. 그러나, 동일성(또한 유사성)을 상기 서열의 일부분(또는 단편)에 대해 평가하는 것 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 맥락 내에서, 일부분은 서열번호의 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%를 의미할 수 있다. 포함되는 서열의 길이는 동일성(또는 유사성)을 평가하는 데 사용되는 서열번호의 길이보다 여전히 더 길 수 있다(즉, 길이가 서열번호의 길이의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%이거나, 동일성(또는 유사성)이 이 서열번호의 일부분에 대해 평가되더라도 서열번호의 길이와 동일하거나, 길이가 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22의 정확한 길이보다 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60개 아미노산만큼 더 김).
이러한 제3 구조적 특징의 제3 구현예에서, VHH 또는 이의 단편의 길이는 110 내지 130개의 아미노산이거나 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개의 아미노산이다. 이러한 길이는 VHH 또는 이의 단편의 서열에 첨가될 수 있는 태그, 예컨대 His 태그의 길이를 포함하지 않는다.
이러한 제3 구조적 특징의 제4 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 또는 이의 일부분의 적어도 하나와 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시되고, VHH 또는 이의 단편의 길이는 80 내지 150개 아미노산 또는 90 내지 140 또는 100 내지 130 또는 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산이다. 일 구현예에서, 이들 서열 중 적어도 하나와의 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이러한 제3 구조적 특징의 제5 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 15 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지는 아미노산 서열로 표시되고, 길이가 78 내지 130개 아미노산 또는 78 또는 130 또는 90 내지 120 또는 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이다. 일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이의 부분은 이미 본 명세서에서 정의되었다.
이러한 제3 구조적 특징의 제6 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 17 및/또는 18 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 17 및/또는 18 또는 이의 일부분 중 임의의 것과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지는 아미노산 서열로 표시되고, 길이가 14 내지 130개 아미노산 또는 20 내지 120 또는 30 내지 110 또는 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이다. 일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이의 부분은 이미 본 명세서에서 정의되었다.
이러한 제3 구조적 특징의 제7 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 16 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 16 또는 이의 일부분 중 임의의 것과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지는 아미노산 서열로 표시되고, 길이가 76 내지 130개 아미노산 또는 76 또는 120 또는 90 내지 110 또는 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이다. 일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이의 부분은 이미 본 명세서에서 정의되었다.
이러한 제3 구조적 특징의 제8 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 19 및/또는 20 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 19 및/또는 20 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지는 아미노산 서열로 표시되고, 길이가 13 내지 150개 아미노산 또는 13 내지 140 또는 30 내지 130 또는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이다. 일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이의 부분은 이미 본 명세서에서 정의되었다.
이러한 제3 구조적 특징의 제9 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21 및/또는 22 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21 및/또는 22 또는 이의 일부분과 적어도 60% 서열 동일성(또는 유사성)을 가지는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지는 아미노산 서열로 표시되고, 길이가 110 내지 130개 아미노산 또는 100 내지 130 또는 110 내지 120 또는 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산의 범위이다. 일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이의 부분은 이미 본 명세서에서 정의되었다.
이러한 제3 구조적 특징의 제10 구현예에서, VHH 또는 이의 단편, 바람직하게는 VHH 또는 이의 기능적 단편은 서열번호 15, 16, 17, 18, 19 및/또는 20 중 임의의 것을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 길이가 13 내지 130개 아미노산 또는 20 내지 120 또는 30 내지 121개 아미노산의 범위이다. 더 바람직하게는, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21 또는 22를 포함하는 아미노산 서열로 표시된다. 훨씬 더 바람직하게는, VHH 또는 이의 단편은 길이가 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 또는 130개 아미노산이다.
추가 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 이러한 제3 구조적 특징의 제9 구현예에 따르고 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
- C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
- E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
- Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
추가 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 이러한 제3 구조적 특징의 제10 구현예에 따르고 서열번호 14의 다음 아미노산과 접촉하거나 이에 결합하거나 이에 특이적으로 결합한다:
- C89, G90, E91, M92, A93, 또는 P94로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
- E140, Q141, W142, W143, E144, D145, C146, R147, T148, S149, 또는 Y150으로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산, 및/또는
Q176, P177, F178, H179, F180, Y181, F182, P183, 또는 T184로부터 선택되는 적어도 1개, 또는 적어도 2개 또는 적어도 3개의 아미노산.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함하고, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함하고, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함하고, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않으며, 여기서 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함하고, VHH 또는 이의 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.
일 구현예에서, 서열 동일성(또는 유사성)은 적어도 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
제4 구조적 특징
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제4 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 대안적으로 또는 조합하여 제4 구조적 특징에 의해 추가로 정의될 수 있다.
제4 구조적 특징에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 CDR 서열의 적어도 하나의 조합을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다:
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역, 및/또는
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역(표 5 참조).
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 다음과 같은 (일반) 구조를 가지거나 다음으로부터 유래된 중쇄 항체를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 제공한다:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
여기서, FR1 내지 FR4는 각각 프레임워크 영역 1 내지 4를 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 각각 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭하며, 본 명세서에 추가로 정의된 바와 같다.
서열번호 21 및 22(표 5 참조)는 인간 FOLR1에 대해 생성된 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 제공한다.
본 발명은 VHH 또는 이의 단편(또는 이를 발현하는 뉴클레오타이드 서열)의 기원으로 제한되지 않거나, 본 명세서에 개시된 VHH 또는 이의 단편, 바람직하게는 VHH 또는 이의 단편 또는 뉴클레오타이드 서열이 생성되거나 수득되는(생성되었거나 수득된) 방식으로 제한되지 않음에 유의하여야 한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 VHH 또는 이의 단편은 천연 발생 아미노산 서열(임의의 적합한 종 유래) 또는 합성 또는 반-합성 아미노산 서열일 수 있다. VHH 또는 이의 단편을 단리하는 방법 및 이를 생산하는 방법뿐만 아니라, VHH 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 작제물 및 이러한 작제물을 포함하는 세포가 설명 말단 부분의 정의 파트에 상세히 개시되어 있다.
본 발명의 구체적이지만 비-제한적인 양태에서, VHH 또는 이의 단편의 아미노산 서열은 "인간화된" 면역글로불린 서열(예컨대, 부분적으로 또는 완전히 인간화된 마우스 또는 토끼 면역글로불린 서열, 그리고 구체적으로 부분적으로 또는 완전히 인간화된 VHH 서열), "낙타화된" 면역글로불린 서열뿐만 아니라, 친화도 성숙(예를 들어, 합성, 무작위 또는 천연 발생 면역글로불린 서열로부터 출발함), CDR 이식, 베니어링(veneering), 상이한 면역글로불린 서열로부터 유래된 단편의 조합, 중첩 프라이머를 사용하는 PCR 조립, 및 당업자에게 잘 알려진 면역글로불린 서열을 조작하기 위한 유사한 기법과 같은 기법에 의해 수득된 면역글로불린 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는 천연 발생 면역글로불린 서열(임의의 적합한 종 유래) 또는 합성 또는 반-합성 면역글로불린 서열; 또는 상기한 것 중 임의의 것의 임의의 적합한 조합이다. 또한, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 적합하게 인간화되어 본 발명의 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역, 또는
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역.
이러한 VHH 또는 이의 단편 각각은 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역,
이러한 VHH 또는 이의 단편 각각은 또 다른 VHH 유래의 CDR2 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역,
서열번호 23을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 31을 갖는 CDR2 영역,
서열번호 30을 갖는 CDR1 영역 및 서열번호 24를 갖는 CDR2 영역,
이러한 VHH 또는 이의 단편 각각은 또 다른 VHH 유래의 CDR3 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 24를 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 24를 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 31을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 32를 갖는 CDR3 영역,
서열번호 31을 갖는 CDR2 영역 및 서열번호 25를 갖는 CDR3 영역,
이러한 VHH 또는 이의 단편 각각은 또 다른 VHH 유래의 CDR1 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 23 또는 30을 가지는 CDR1 영역. VHH 또는 이의 단편은 또 다른 VHH 유래의 CDR2 및 CDR3 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 24 또는 31을 가지는 CDR2 영역. VHH 또는 이의 단편은 또 다른 VHH 유래의 CDR1 및 CDR3 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 VHH 또는 이의 단편은 CDR 이식을 사용하여 상기 기재된 VHH 또는 이의 단편으로부터 유래된다. 바람직한 VHH 또는 이의 단편은 다음을 포함한다:
서열번호 25 또는 19를 가지는 CDR3 영역. VHH 또는 이의 단편은 또 다른 VHH 유래의 CDR1 및 CDR2 영역을 포함할 수 있고 표 5에 식별된 바와 같은 VHH2 또는 VHH3의 FR을 가질 수 있다. 그러나, 별개의 FR이 존재할 수 있다.
유사하게, 아미노산 서열이 합성 또는 반-합성 서열(예컨대, 부분적으로 인간화된 서열)을 포함하는 경우, 상기 서열은 선택적으로 마찬가지로 본 명세서에 기재된 바와 같이 추가로 적합하게 인간화되어 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 추가의 (부분적으로 또는 완전히) 인간화된 아미노산 서열을 제공할 수 있다. 설명 말단 부분에, "효현제", "길항제", "변이체", "번역후 구조적 특성"의 더 상세한 정의가 제공되어 있다.
구체적으로, 인간화된 VHH는 인간화 치환이고/이거나 이에 해당하는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 존재하는(구체적으로, 프레임워크 잔기 중 적어도 하나에 존재하는) 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 다른 잠재적으로 유용한 인간화 치환은 천연 발생 VHH 서열의 프레임워크 영역의 서열을 하나 이상의 밀접하게 관련된 인간 VH 서열의 해당 프레임워크 서열과 비교함으로써 확인될 수 있으며, 후속적으로 이렇게 결정된 잠재적으로 유용한 인간화 치환(또는 이의 조합) 중 하나 이상이 상기 VHH 서열에 (본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 그 자체로 알려진 임의의 방식으로) 도입될 수 있고 생성된 인간화된 VHH 서열 또는 이의 기능적 단편은 표적에 대한 친화도에 대해, 안정성에 대해, 발현의 용이성 및 수준에 대해, 및/또는 다른 원하는 특성에 대해 시험될 수 있다. 이러한 방식으로, 제한된 정도의 시행착오에 의해, 다른 적합한 인간화 치환(또는 이의 적합한 조합)이 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에서 식별된 바와 같은 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 구조적 특징으로 표시된다. 대안적으로 또는 상기 구조적 특징과 조합하여, VHH 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)에 특이적으로 결합하지만, (바람직하게는 뮤린 FOLR1에 결합하지 않고), 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 및 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에 결합하지 않는 기능적 특징으로 특성화된다. 일 구현예에서, VHH 또는 이의 단편은 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)에 특이적으로 결합하지만, (바람직하게는 뮤린 FOLR1에 결합하지 않고), 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 및 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에 결합하지 않는 기능적 특징으로 특성화된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함함); 및 요오드-131 및 GMIB를 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함함); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함함); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및/또는 176 내지 184를 포함함); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함함); 및 요오드-131 및 GMIB를 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함함); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함함); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 에피토프는 서열번호 14의 선형 아미노산 스트레치 또는 영역 89 내지 94, 140 내지 150 및 176 내지 184의 조합을 포함함); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 다음을 포함한다:
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 상기 항체 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨); 및 요오드-131 및 GMIB를 포함하는 표지된 화합물,
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 상기 항체 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨); 및 DOTA 또는 DTPA 및 루테튬-177을 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 또는 177Lu-DTPA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음),
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 상기 항체 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨); 및 DOTA 및 악티늄-225를 포함하는 표지된 화합물(바람직하게는, 여기서 표지된 화합물은 225Ac-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있음), 또는
- 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 뮤린 FOLR1 또는 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편(또는 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하지만, 인간 FOLR2 또는 인간 FOLR3에는 결합하지 않는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편)(여기서, 상기 항체 단편은 서열번호 21, 22, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 적어도 하나와 상기 서열의 전장에 걸쳐서 또는 상기 서열의 길이의 적어도 50%에 걸쳐서 적어도 63% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열로 표시됨); 및 테크네튬-99m을 포함하는 표지된 화합물.
인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 인간 표피 성장 인자 수용체 2에 결합하기에 특히 적합하다. 실시예 8은 TCO-접합 HER2-결합 VHH가 사전 표적화 적용에 사용될 수 있음을 입증한다. 바람직하게는, VHH 또는 이의 단편은 적합한 경쟁 검정법을 사용하여 결정되는 바와 같이, HER2에 결합하기 위해 모노클로날 항체 트라스투주맙(Herceptin®) 또는 모노클로날 항체 퍼투주맙(Perjeta®)과 경쟁하지 않는다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 CDR 조합 중 하나를 포함한다:
- 서열번호 40을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 41을 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 42를 갖는 CDR3 영역, 및/또는
- 서열번호 43을 갖는 CDR1 영역, 서열번호 44를 갖는 CDR2 영역, 및 서열번호 45를 갖는 CDR3 영역.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 46 또는 47의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 아미노산 동일성을 가진다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 46 또는 47의 아미노산 서열을 포함한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 60% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 70% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 95% 아미노산 동일성을 가진다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 60% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 70% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 80% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 90% 아미노산 동일성을 가진다. 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 서열번호 48 내지 88의 아미노산 서열 중 적어도 하나와 적어도 95% 아미노산 동일성을 가진다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 1가 형식으로 존재한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에는 시스테인-포함 태그, 바람직하게는 GGC-태그가 없다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에는 카르복시-말단 폴리펩타이드 태그가 없으며, 바람직하게는 상기 VHH 또는 이의 단편은 태그되지 않는다.
FAP 또는 FOLR1에 결합하는 항체 및 항체 단편을 포함하는 조합물
본 발명의 일 양태에서,
- 클릭 그룹을 포함하는 항체, 또는 이의 단편; 및
- 표지 및 클릭 그룹을 포함하는 표지된 화합물
을 포함하는, 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 조합물이 제공되며;
여기서, 상기 항체, 또는 이의 단편은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합할 수 있거나, 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1)의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있지만 인간 엽산 수용체 베타(FOLR2) 또는 인간 엽산 수용체 감마(FOLR3)에는 결합하지 않고;
상기 사용은 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 항체, 또는 이의 단편을 제1 투여하는 것, 및 이후 상기 표지된 화합물을 후속 투여하는 것을 포함하고;
상기 항체, 또는 이의 단편에 포함되는 상기 클릭 그룹은 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹과 상기 대상체에서 클릭 반응을 겪을 수 있다.
본 발명에 따른 조합물과 관련된 모든 바람직한 양태 및 구현예는 이러한 양태의 조합물에 따른 조합물에 준용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조합물의 일부인 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 바람직한 클릭 그룹은 또한 상기 기재된 항체, 또는 이의 단편에 포함되는 바람직한 클릭 그룹이다. 또한, 본 발명에 따른 조합물의 일부일 수 있는 VHH, 또는 이의 단편의 모든 바람직한 서열과 다른 구조적 및 기능적 변형체는 또한 항체, 또는 이의 단편에 적용될 수 있다. 분명히, 암, 표지된 화합물, 제1 투여, 제2 투여 및 클릭 반응(이에 제한되지 않음)과 같은 요소에 관련된 본 발명에 따른 조합물의 다른 바람직한 특징은 상기 기재된 조합물에 준용된다.
조성물
추가 양태에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 조성물이 제공된다. 그러한 조성물은 본 출원의 맥락에서 본 발명에 따른 조성물로 지칭된다. 선택적으로 본 발명에 따른 조합물에 포함되는, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 관련된 모든 바람직한 구현예는 그러한 조성물에 준용된다. 본 발명에 따른 조합물에서, VHH 또는 이의 단편은 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 조합물에 사용된 바와 같은 표지된 화합물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 조합물에서, 표지된 화합물은 그러한 조성물에 포함될 수 있다.
상기 조성물은 부형제를 포함할 수 있다. 부형제는 진단 및/또는 치료 목적에 허용 가능하여야 한다. 일 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 진단용 조성물이다. 또한 조성물이 약제학적 및 진단용 조성물이라는 것이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 적합한 제형은 설명 말단 부분의 정의 파트에 개시되어 있다.
조성물은 하나 이상의 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 적어도 하나의 다른 화합물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 구상되는 바와 같은 약제학적 조성물은 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
조합물의 진단 용도
추가 양태에서, 본 발명에 따른 조합물이 대상체 또는 상기 대상체의 단리된 샘플에서 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1의 발현을 평가하는 데 사용되는 방법이 제공된다. 이 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) 본 발명에 따른 조합물을 제공하는 단계,
b) 이를 필요로 하는 대상체 또는 대상체의 단리된 샘플에 상기 조합물에 포함되는 상기 VHH, 또는 이의 단편을 제1 투여하고, 상기 조합물에 포함되는 상기 표지된 화합물을 후속 투여하는 단계,
c) 상기 대상체에서 또는 상기 대상체의 상기 단리된 샘플에서 항원의 발현을 평가하는 단계.
이 방법은 진단 방법으로 지칭될 수 있다. 이 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 이 방법은 대상체 또는 상기 대상체의 단리된 샘플에서 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1의 발현의 국소화를 가능하게 할 수 있고, 상기 대상체에서 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 예측 및/또는 예후를 가능하게 할 수 있다. 일 구현예에서, 이 방법은 특정 치료, 예컨대 암 치료 또는 상처 치유 치료 또는 섬유증 치료에 반응할 가능성이 있는 환자를 식별하기 위한 계층화 방법일 수 있다. 따라서, 추가 양태에서, 본 발명에 따른 조합물이 대상체를 계층화하고 대상체가 특정 치료, 예컨대 암 치료 또는 상처 치유 치료 또는 섬유증 치료에 반응할 가능성이 있는지 여부를 평가하는 데 사용되는 방법이 제공된다. 이 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) 본 발명에 따른 조합물을 제공하는 단계,
b) 이를 필요로 하는 대상체 또는 대상체의 단리된 샘플에 상기 조합물에 포함되는 상기 VHH, 또는 이의 단편을 제1 투여하고, 상기 조합물에 포함되는 상기 표지된 화합물을 후속 투여하는 단계,
c) 상기 대상체에서 또는 상기 대상체의 상기 단리된 샘플에서 항원의 발현을 평가하는 단계, 및
d) 대상체가 의학적 치료에 반응할 가능성이 있는지 여부를 결정하는 단계.
바람직하게는, 조합물에 포함되는 표지는 방사성 핵종이다. 대상체는 바람직하게는 인간이다. 본 발명에 따른 조합물을 생산/제공하기 위한 그리고 이를 투여하기 위한 상세한 정보가 설명 말단 부분의 정의 파트에 개시되어 있다. 진단 또는 치료 목적을 위한 조합물의 투여는 유사하다. 이 양태에 따른 방법은 시험관내, 생체외 방법일 수 있다.
일 구현예에서, 스크리닝 용량 또는 바이오마커 용량이 대상체 또는 상기 대상체의 단리된 샘플에 투여된다. 상세한 정의는 특히 치료 용량의 정의와 비교하여 이후에 제공된다.
진단 방법의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지된 화합물은 [I-131]GMIB를 포함하거나, DTPA 또는 DOTA 링커 및 루테튬-177 방사성 핵종을 포함하거나, 테크네튬-99m 방사성 핵종을 포함한다.
대상체에서 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1의 발현 평가는 바람직하게는 설명 말단 부분의 정의에 대한 파트에 개시된 바와 같은 영상화를 사용하여 수행된다. 대안적으로, 대상체에서 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1의 발현 평가는 바람직하게는 대상체의 단리된 샘플을 사용하여 수행된다. 본 발명의 맥락 내에서, 대상체의 단리된 샘플은 상기 대상체 유래의 조직 또는 액체 샘플일 수 있다. 액체는 혈청일 수 있다. 환자 유래의 단리된 샘플은 생검 또는 종양 생검으로 지칭될 수 있다.
조합물의 치료 용도
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물, 및 이에 상응하는 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편은 고형암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 고형암은 상피 세포 또는 조직에서 유래한다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 해당 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1을 발현하거나 과발현하는 세포, 조직, 장기에 전달될 분자인 표지를 포함한다. 분자는 펩타이드 또는 소분자, 핵산일 수 있다. 펩타이드는 사이토카인일 수 있다. 소분자는 화학요법제일 수 있다. 실체는 세포, 예컨대 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, BITE 또는 LITE일 수 있다. 이러한 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 항원, 바람직하게는 FAP 또는 FOLR1의 발현 또는 과발현과 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제일 수 있다.
항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1을 발현하는 세포, 조직, 기관에서 작용하는 것으로 알려진 임의의 모이어티, 분자 또는 약제는 잠재적으로 본 발명에 포함되며 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지일 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 암의 치료에 사용하기 위한 것이다. 추가 구현예에서, 상기 암은 암 세포 또는 종양 세포 또는 전이된 병변 상의 인간 FAP의 발현과 연관된다. 치료되는 암은 전이성일 수 있으며, 바람직하게는 여기서 전이성 세포는 뇌, 뼈, 간, 폐에서 발견된다. FAP의 발현과 연관된 암은 백혈병, 뼈암, 자궁암, 췌장암, GEP-NET(gastroenteropancreatic neuroendocrine tumor; 위장관 및 췌장 신경내분비 종양), 피부암, 근육암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간암, 폐암, NSCLC(비소세포 폐암), 난소암, 부갑상선암, 신장 암 세포, CUP(cancer of unknown primary; 원발부위 불명암), 전립선암, 소장암, CCC(Cholangiocellular Carcinoma; 담관세포 암종), 육종 중 임의의 것일 수 있다( et al 2018, Oncogene Aug;37(32):4343-4357 및 Frederik Giesel et al J Nucl Med　May 1, 2019　vol. 60　no. supplement 1　Abstract 289). 그러나, 본 발명은 이러한 유형의 암에 제한되지 않는다. 대상체가 인간 FAP를 발현하거나 과발현하는 암 세포를 가지는 것으로 의심되자마자, 본 발명에 따른 조합물이 사용될 수 있다.
대안적인 추가 구현예에서, 상기 암은 인간 FOLR1의 발현과 연관된다. 일 구현예에서, 조합물에 포함되는 표지는 중추신경계(CNS)로 전달되는 분자이다. 분자는 바람직하게는 그 자체로 뇌 혈액 장벽(BBB)을 통과하지 않는다. 분자는 펩타이드 또는 소분자, 핵산일 수 있다. 펩타이드는 사이토카인일 수 있다. 소분자는 화학요법제일 수 있다. 실체는 세포, 예컨대 CAR-T 세포, CAR-NK 세포, BITE 또는 LITE일 수 있다. 이러한 화합물은 뇌와 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제일 수 있거나, 약제는 뇌 활동의 변경이 대상체의 다른 장기에 영향을 미치는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것이다.
더 바람직하게는, 분자는 CNS에서 작용하는, 바람직하게는 뇌에서 작용하는 약제이다. 훨씬 더 바람직하게는, 분자는 인간 FOLR1을 통한 수송을 통해 뇌 혈액 장벽(BBB) 및/또는 혈액-뇌척수액 장벽(BCSFB)을 통과하며; 이 메커니즘은 수용체 매개 통과세포외배출(RMT)로 지칭된다. CNS 또는 뇌에서 작용하는 것으로 알려진 임의의 약제는 잠재적으로 본 발명에 포함된다.
CNS 또는 뇌와 연관된 질환 또는 병태 또는 장애는 CNS 또는 뇌와 연관되는 것으로 당업자에게 알려진 임의의 질환, 병태 또는 장애일 수 있다. 그러한 질환, 병태 또는 장애는 변경된 CNS 활동 또는 변경된 뇌 활동을 반영할 수 있다. 그러한 질환, 병태 또는 장애의 예는 간질, 자폐 스펙트럼 장애, 자폐증, 음식 섭취 변화, 열 조절 변화, 통증 감각 변화, 만성 통증, 우울증, 편두통, 청력 상실, 양극성 장애, 알츠하이머병, 조현병, 뇌 손상, 실명, 뇌졸중, 파킨슨병, 다발성 경화증, 척수 손상, 근위축성 측색 경화증을 포함한다.
일 구현예에서, 암은 암 세포 또는 종양 세포 또는 전이된 병변 상의 인간 FOLR1의 발현과 연관된다. 치료되는 암은 전이성일 수 있으며, 바람직하게는 여기서 전이성 세포는 뇌에서 발견된다. 이는 표지된 화합물이 BBB를 통과할 수 있기 때문에 매력적인 구현예이다.
FOLR1의 발현과 연관된 암은 난소암, 자궁내막암, 뇌암, 폐암, 부신암종, 두경부암, 유방암, 위암, 결장-직장암 중 임의의 것일 수 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 유형의 암에 제한되지 않는다. 대상체가 인간 FOLR1을 발현하거나 과발현하는 암 세포를 가지는 것으로 의심되자마자, 본 발명에 따른 조합물이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 대상체는 동일하거나 상이한 표지, 바람직하게는 방사성 핵종을 포함하는 조합물로 치료되기 전에, 본 발명에 따른 조합물을 사용하여 먼저 진단되었다. 방사성 핵종의 정체는 진단 및 치료적 적용에서 동일하지 않을 수 있다.
이러한 치료 방법 또는 용도의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지된 화합물은 [I-131]GMIB를 포함하거나, DTPA 또는 DOTA 링커 및 루테튬-177 방사성 핵종을 포함하거나, 테크네튬-99m 방사성 핵종을 포함한다.
본 발명의 맥락 내에서, 질환 또는 병태 또는 장애는 본 발명에 따른 조합물의 투여가 수행될 때 예방 또는 치료되었으며, 다음을 초래하였다:
- 상기 질환 또는 병태 또는 장애와 연관된 적어도 하나의 증상의 개선, 및/또는
- 상기 질환 또는 병태 또는 장애와 연관된 적어도 하나의 매개변수의 개선.
화합물, 각각의 표지된 화합물이 투여된 후 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주 후에 개선이 관찰될 수 있다. 대안적으로, 조합물의 투여 후 적어도 1개월, 6개월째에 개선이 관찰될 수 있다. 구상된 용량 및 투여 방식은 설명 말단 부분의 정의 파트에 추가로 개시되어 있다.
본 발명에 따른 조합물의 (치료적) 용도는 다음 중 적어도 하나가 충족될 경우 항암 활성을 야기하거나 보인다:
- 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1을 발현하는 종양 세포, 암 세포 및/또는 CAF를 사멸시킬 수 있음,
- 이러한 종양 세포 또는 암 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키거나 늦출 수 있음.
- 원발성 종양 또는 전이성 병변의 크기를 감소시킬 수 있음,
- 전이 및/또는 종양 세포 이동의 발생을 지연시킬 수 있음,
- 종양 중량 또는 성장의 증가를 지연시킬 수 있음, 및
- 환자 생존을 적어도 1개월, 수개월 또는 그 이상 연장시킬 수 있음
(대조군으로 치료하거나 치료하지 않은 것과 비교하거나 치료 개시시의 대상체와 비교함).
항암 활성은 본 발명에 따른 조합물의 투여 후 생존 가능한 암 세포 및/또는 생존 가능한 종양 세포의 수가 초기 생존 가능한 암 세포 및/또는 초기 생존 가능한 종양 세포의 수의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만인 경우 식별되거나 결정될 수 있다.
항암 활성은 본 발명에 따른 조합물의 투여 후 원발성 종양의 크기 및/또는 전이성 병변의 크기가 상기 원발성 종양의 크기 및/또는 상기 전이성 병변의 크기의 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만인 경우 식별되거나 결정될 수 있다.
종양 세포 사멸은 ICH와 같은 암 환자에서 시험관내에서 비침습적으로 세포 사멸을 측정하기 위한 분자 영상화제인 방사성표지된 Annexin A5의 측정에 의해 평가될 수 있다(Schutters K. et al., Apoptosis 2010; de Saint-Hubert M. et al., Methods 48: 178, 2009). ICH는 본 설명 마지막의 정의 파트에 정의되어 있다.
종양 성장은 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%, 또는 그 이상 억제될 수 있다. 종양 성장은 당업자에게 알려진 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 종양 성장은 MRI(Magnetic Resonance Imaging; 자기 공명 영상) 또는 CT(Computer Tomography; 컴퓨터 단층 촬영)를 사용하여 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 종양 중량 증가 또는 종양 성장은 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75%, 또는 그 이상 억제될 수 있다. 종양 중량 또는 종양 성장은 당업자에게 알려진 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 종양 성장의 검출 또는 종양 세포 증식의 검출은 양전자 방출 단층 촬영에 의해 글루코스 유사체인 2-[18F]-플루오르-2-데옥시-D-글루코스(FDG-PET) 또는 [18F]-'3-플루오로-'3-데옥시-L-티미딘(FLT-PET)을 이용하여 글루코스 이용의 변화를 측정함으로써 생체내에서 평가될 수 있다. 생체외 대안은 Ki67로 종양 생검을 염색하는 것일 수 있다.
전이 및/또는 종양 세포 이동의 발생 지연은 적어도 1주, 1개월, 수개월, 1년 또는 그 이상의 지연일 수 있다. 전이의 존재는 MRI, CT 또는 초음파 검사 또는 순환 종양 세포(CTC)의 검출을 가능하게 하는 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 후자 시험의 예는 말초 혈액으로부터의 CTC를 EpCam 기반으로 자기 분류하는 CellSearch CTC 시험(Veridex)이다.
특정 구현예에서, 종양 성장은 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월 또는 그 이상 지연되거나 억제될 수 있다. 특정 구현예에서, 전이의 발생은 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 지연된다.
본 발명에 따른 조합물은 일단 암 또는 종양 세포 또는 전이성 병변, 또는 항원, 바람직하게는 인간 FAP 또는 인간 FOLR1을 발현하는 CAF에 결합되면 방사성 독성의 메커니즘을 통해 항암 활성을 발휘한다.
종양 세포, 암 세포, 병변, 전이성 병변 및 조합물의 용량은 표제가 정의인 섹션에서 정의되어 있다.
추가 양태에서, 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 조합물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 예방 및/또는 치료 방법이 제공된다. 본 방법의 모든 특징은 본 명세서에서 앞서 정의되었다.
정의
다음 용어 또는 정의는 단지 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 명세서에서 특별히 정의되어 있지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어는 본 발명 분야의 당업자가 인식하는 것과 동일한 의미를 가진다. 실무자에게는 특히 당업계의 정의 및 용어에 대해 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989)]; 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)]이 안내된다. 본 명세서에서 제공되는 정의는 당업자가 이해하는 것보다 작은 범주를 가지는 것으로 해석되어서는 안 된다.
달리 표시되지 않는 한, 구체적으로 상세하게 기재되지 않은 모든 방법, 단계, 기법 및 조작이 수행될 수 있으며, 당업자에게 명백한 바와 같이 그 자체로 알려진 방식으로 수행되었다. 예를 들어 표준 핸드북, 상기에 언급된 일반 배경 기술 및 거기에 인용된 추가 참조문헌을 다시 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태('a', 'an', 및 'the')는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 단수 및 복수 지시대상 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 '포함하는(comprising)', '포함한다(comprises)' 및 '~로 구성된(comprised of)'은 '포함하는(including)', '포함한다(includes)' 또는 '함유하는(containing)', '함유한다(contains)'와 동의어이고, 포괄적이거나 개방형이며, 추가적인 비-인용된 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 생성물 또는 조성물의 맥락에서 사용되는 표현 "~로 본질적으로 이루어진"(~로 본질적으로 이루어진 생성물" 또는 "~로 본직적으로 이루어진 조성물")은 추가적인 분자가 존재할 수 있지만 이러한 분자가 상기 생성물 또는 조성물의 특성/활성/기능성을 변화/변경시키지 않음을 의미한다. 예를 들어, 조성물이 본 발명에 따른 VHH로서 유사한 특성/활성/기능성을 보인다면, 그러한 조성물은 상기 VHH로 본질적으로 이루어질 수 있다.
종점에 의한 수치 범위의 인용은 각각의 범위 내에 포괄되는 모든 숫자 및 분수뿐만 아니라 인용된 종점을 포함한다.
측정 가능한 값, 예컨대 매개변수, 양, 시간의 지속기간 등을 지칭할 때 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 '약'은 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절한 범위 내에서, 명시된 값의 그리고 명시된 값으로부터 +/-10% 이하, 바람직하게는 +/-5% 이하, 더 바람직하게는 +/-1% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 +/-0.1% 이하의 변동을 포함하는 것을 의미한다. 수식어 '약'이 지칭하는 값은 그 자체가 또한 구체적이고, 바람직하게 개시된다는 것이 이해되어야 한다.
용어 "약제에서 사용하기 위한" 및 "약제로서 사용하기 위한"은 본 출원에서 호환 가능하게 사용된다.
폴리펩타이드, 핵산, 동일성, 유사성
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 잔기는 전체 명칭에 의해 또는 표준 3문자 또는 1문자 아미노산 코드에 따라 표시될 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '폴리펩타이드' 또는 '단백질'은 호환 가능하게 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하며, 이는 코딩 및 비-코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 백본을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. "펩타이드"는 또한 보통 최대 50개의 아미노산 길이를 가지는 아미노산의 중합체이다. 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 서열로 표시된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '핵산 분자', '폴리뉴클레오타이드', '다중핵산', '핵산'은 호환 가능하게 사용되고, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 유사체 중 어느 하나의 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 핵산 분자는 주로 염기 서열로 특성화되는 핵산 서열로 표시된다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 제어 영역, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 고리형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '상동성'은 동일하거나 상이한 분류군으로부터 2개 거대분자 사이, 특히 2개 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 사이에서 적어도 2차 구조적 동일성 또는 유사성을 의미하며, 여기서 상기 유사성은 공유 조상에 기인한다. 따라서, 용어 '상동성'은 상기 2차 및 선택적으로 3차 구조적 유사성을 가지는 이와 관련된 거대분자를 의미한다. 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 비교하기 위하여, 제1 뉴클레오타이드 서열과 제2 뉴클레오타이드 서열 사이의 '서열 동일성(의 백분율)'이 당업자에게 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 제2 뉴클레오타이드 서열의 해당하는 위치에 있는 뉴클레오타이드와 동일한 제1 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드의 수를 제1 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드의 총 수로 나누고 100%를 곱함으로써 또는 NCBI Blast와 같은 서열 정렬을 위한 알려진 컴퓨터 알고리즘을 사용함으로써 계산될 수 있다. 2개 아미노산 서열 사이의 서열 유사성의 정도를 결정함에 있어서, 당업자는, 일반적으로 아미노산 잔기가 유사한 화학 구조의 다른 아미노산 잔기로 대체되고 폴리펩타이드의 기능, 활성 또는 다른 생물학적 특성에 거의 영향을 미치지 않거나 본질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환으로 기재될 수 있는, 소위 '보존적' 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 가능한 보존적 아미노산 치환은 당업자에게 명백할 것이다. 아미노산 서열 및 핵산 서열은 전체 길이에 걸쳐 100% 서열 동일성을 가지는 경우 '정확히 동일'하다고 한다.
본 출원 전반에 걸쳐, 특정 아미노산 서열 서열번호(예로서 서열번호 Y라 함)를 지칭할 때마다, 이는 서열번호 Y의 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성 또는 유사성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 대체될 수 있다.
주어진 아미노산 서열 각각과의 동일성 백분율(적어도 80%)을 바탕으로 본 명세서에 기재된 각각의 아미노산 서열은 추가의 바람직한 구현예에서 주어진 아미노산 서열 각각과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%의 동일성 또는 그 이상의 동일성을 가진다. 바람직한 구현예에서, 서열 동일성은 본 명세서에서 식별된 바와 같은 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다. 주어진 아미노산 서열 각각과의 유사성 백분율(적어도 81%)에 의해 본 명세서에 기재된 각각의 아미노산 서열은 추가의 바람직한 구현예에서 주어진 아미노산 서열 각각과 적어도 81%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 유사성을 가진다. 바람직한 구현예에서, 서열 유사성은 본 명세서에서 식별된 바와 같은 서열의 전체 길이를 비교함으로써 결정된다. 본 명세서에 달리 표시되지 않는 한, 주어진 서열번호와의 동일성 또는 유사성은 상기 서열의 전체 길이를 기반으로 한(즉, 전체 길이에 걸쳐 또는 전체적으로) 동일성 또는 유사성을 의미한다.
"서열 동일성"은 본 명세서에서 서열을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상 핵산(폴리뉴클레오타이드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 2개 아미노산 서열 사이의 동일성은 바람직하게는 본 명세서에서 식별된 바와 같은 전체 서열번호 또는 이의 일부 내에서 이들 서열의 동일성을 평가함으로써 정의된다. 이의 일부는 서열번호 길이의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 의미할 수 있다.
당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라 아미노산 서열의 문자열 사이의 일치에 의해 결정되는 바와 같을 수 있는, 이러한 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 2개 아미노산 서열 사이의 "유사성"은 하나의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존된 아미노산 치환체를 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 결정된다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌[Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994]; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987]; [Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991]; 및 [Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)]에 기재된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 알려진 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 가장 큰 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램으로 코딩되어 있다. 2개 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, FASTA, BLASTN, 및 BLASTP(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), EMBOSS Needle(Madeira, F., et al., Nucleic Acids Research 47(W1): W636-W641 (2019))을 포함한다. BLAST 프로그램은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공개적으로 이용 가능하다(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)). EMBOSS 프로그램은 EMBL-EBI로부터 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘이 또한 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다. EMBOSS Needle 프로그램은 사용되는 바람직한 프로그램이다.
폴리펩타이드 서열 비교를 위한 바람직한 매개변수는 다음을 포함한다: 알고리즘: 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (3):443-453 (1970)]; 비교 매트릭스: 문헌[Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)]의 BLOSUM62; 갭 오픈 페널티: 10; 및 갭 확장 페널티: 0.5. 이들 매개변수와 함께 유용한 프로그램은 EMBL-EBI의 EMBOSS Needle 프로그램으로 공개적으로 이용 가능하다. 상기 언급한 매개변수는 단백질의 전체적인 쌍형성 서열 정렬(Global Pairwise Sequence alignment)(말단 갭에 대한 페널티 없음)에 대한 디폴트 매개변수이다.
핵산 비교를 위한 바람직한 매개변수는 다음을 포함한다: 알고리즘: 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]; 비교 매트릭스: DNAfull; 갭 오픈 페널티: 10; 갭 확장 페널티: 0.5. 이들 매개변수와 함께 유용한 프로그램은 EMBL-EBI의 EMBOSS Needle 프로그램으로 공개적으로 이용 가능하다. 상기 언급한 매개변수는 뉴클레오타이드 서열의 전체적인 쌍형성 서열 정렬(말단 갭에 대한 페널티 없음)에 대한 디폴트 매개변수이다.
선택적으로, 아미노산 유사성 정도를 결정함에 있어서, 당업자는 또한 당업자에게 명백한 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 가지는 잔기의 호환 가능성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-포함 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 아스파라긴, 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 산성 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 아스파르테이트 및 글루타메이트이고; 황-포함 측쇄를 가지는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 천연 발생 아미노산 각각에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 Ser; Arg에서 Lys 또는 Gln; Asn에서 Asp, His 또는 Ser; Asp에서 Glu 또는 Asn; Gln에서 Glu, Lys 또는 Arg; Glu에서 Lys, Asp, Gln; His에서 Tyr 또는 Asn; Ile에서 Leu, Val, 또는 Met; Leu에서 Ile, Met 또는 Val; Lys에서 Arg, Gln 또는 Glu; Met에서 Val, Leu 또는 Ile; Phe에서 Trp 또는 Tyr; Ser에서 Thr, Ala 또는 Asn; Thr에서 Ser; Trp에서 Tyr 또는 Phe; Tyr에서 His, Trp 또는 Phe; 및 Val에서 Ile, Leu 또는 Met. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열에서 적어도 하나의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다.
항체
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '항체'는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 단일-사슬 항체, 및 이의 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, scFv, VHH 및 모 항체의 항원 결합 기능을 유지하는 다른 단편을 지칭한다. 이와 같이, 항체는 면역글로불린 또는 당단백질, 또는 이의 단편 또는 일부, 또는 변형된 면역글로불린-유사 프레임워크 내에 포함되는 항원-결합 부분을 포함하는 작제물, 또는 비-면역글로불린-유사 프레임워크 또는 스캐폴드를 포함하는 작제물 내에 포함되는 항원-결합 부분을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '모노클로날 항체'는 균질한 항체 집단을 가지는 항체 조성물을 지칭한다. 이 용어는 항체의 종 또는 공급원과 관련하여 제한되지 않으며, 항체가 제조되는 방식에 의해 제한되고자 하지 않는다. 이 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 단편 및 항체의 항원 결합 기능을 유지하는 다른 것들을 포함한다. 모든 포유동물 종의 모노클로날 항체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 그러나, 실제로 모노클로날 항체를 생산하기 위해 필요한 하이브리드 세포주 또는 하이브리도마를 제조하는 데 사용하기 위한 래트 또는 뮤린 세포주의 가용성 때문에, 항체는 통상적으로 래트 또는 뮤린 기원의 것일 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '폴리클로날 항체'는 이질적인 항체 집단을 가지는 항체 조성물을 지칭한다. 폴리클로날 항체는 종종 면역화된 동물 유래 또는 선택된 인간 유래의 풀링된 혈청으로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 '항체의 중쇄 가변 도메인 또는 이의 단편'은 (i) 낙타류 또는 상어류의 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 자연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인(또는 이하 VHH로 표시함), 또는 (ii) 예컨대 이에 제한되지 않지만 종양 항원 또는 암 세포 상에 존재하는 항원에 결합하기에 특히 적합하고 본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH에 존재하고/하거나 이에 혼입될 수 있는(또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 VHH의 CDR 서열을 기반으로 하고/하거나 이로부터 유래될 수 있는) 아미노산 잔기의 하나 이상의 스트레치(즉, 소형 펩타이드)와 같은, 통상적인 4개 사슬 항체의 중쇄의 낙타화된(본 명세서에 추가로 정의된 바와 같음) 가변 도메인(또한 이하 낙타화된 VH로 표시함) 또는 이의 임의의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 통상적인 4개 사슬 항체의 중쇄의 가변 도메인(또한 이하 VH로 표시함)을 의미한다. 일 구현예에서, VHH의 단편은 기능적 단편이다.
그러나, 본 명세서에서 하기에 추가로 기재된 바와 같이, 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 서열 및 구조는 이에 제한되지 않지만, 당업계 및 본 명세서 하기에서 '프레임워크 영역 1' 또는 'FR1'; '프레임워크 영역 2' 또는 'FR2'; '프레임워크 영역 3' 또는 'FR3'; 및 '프레임워크 영역 4' 또는 'FR4' 각각으로 지칭되는 4개의 프레임워크 영역 또는 'FR'로 구성되는 것으로 간주될 수 있고, 이들 프레임워크 영역에는 당업계에서 각각 '상보성 결정 영역 1' 또는 'CDR1'; '상보성 결정 영역 2' 또는 'CDR2'; 및 '상보성 결정 영역 3' 또는 'CDR3'으로 지칭되는 3개의 상보성 결정 영역 또는 'CDR'이 개재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항체의 맥락 내에서 용어 '상보성 결정 영역' 또는 'CDR'은 H(중쇄) 또는 L(경쇄) 사슬(또한 각각 VH 및 VL로 약칭됨)의 가변 영역을 지칭하며 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이들 CDR 영역은 특정 항원 결정인자 구조에 대한 항체의 기본 특이성을 설명한다. 이러한 영역은 또한 "초가변 영역"으로 지칭된다. CDR은 가변 영역 내 아미노산의 비-연속적 스트레치를 나타내지만, 종에 관계 없이 가변 중쇄 및 경쇄 영역 내에서 이러한 중요한 아미노산 서열의 주위 조건에 따른 위치는 가변 사슬의 아미노산 서열 내에서 유사한 위치를 가지는 것으로 밝혀졌다. 모든 표준 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 각각은 3개의 CDR 영역을 가지며, 각각의 CDR 영역은 각각의 경쇄(L) 및 중쇄(H)에 대해 다른 것들과 비-인접한다(L1, L2, L3, H1, H2, H3으로 명명됨).
또한 본 명세서에서 하기에 추가로 기재되는 바와 같이, 항체의 중쇄 가변 도메인(VHH 또는 VH를 포함함)에서 아미노산 잔기의 총 수는 110 내지 130개의 영역에 있을 수 있다. 그러나 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부, 단편 또는 유사체가 기능적 활성(의 적어도 일부)을 유지하고/하거나, 이들 일부, 단편 또는 유사체가 유래한 항체의 원래 중쇄 가변 도메인의 결합 특이성(의 적어도 일부)을 유지하는 한, 이러한 일부, 단편 또는 유사체는 길이 및/또는 크기에 대해 특별히 제한되지 않음에 유의하여야 한다. 기능적 활성(의 적어도 일부)을 유지하고/하거나, 이들 부분, 단편 또는 유사체가 유래한 항체의 원래 중쇄 가변 도메인의 결합 특이성(의 적어도 일부)을 유지하는 일부, 단편 또는 유사체는 또한 본 명세서에서 중쇄 가변 도메인의 '기능적 단편'으로 추가로 지칭된다.
항체의 가변 도메인(VHH 또는 VH를 포함함)의 아미노산 잔기는 바람직하게는 문헌[Lefranc M.P. et al 1997 Immunology today, 18: 509, PMID: 9386342; Lefranc, M.-P., 1999 The Immunologist, 7: 132-136] 및 [Lefranc M.P. et al 2003, Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 PMID: 12477501]에 기재된 바와 같은 IMGT 명명법에 의해 주어진 V-도메인(면역글로불린 및 T 세포 수용체)에 대한 IMGT 고유 넘버링에 따라 넘버링된다. 이러한 넘버링에 따르면(예를 들어, Lefranc 2003의 표 1 참조), 보존된 아미노산은 항상 동일한 위치, 예를 들어 시스테인 23(1st-CYS), 트립토판 41(보존된-TRP), 소수성 아미노산 89, 시스테인 104(2nd-CYS), 페닐알라닌 또는 트립토판 118(J-PHE 또는 J-TRP)을 가진다. IMGT 고유 넘버링은 프레임워크 영역의 표준화된 경계(FR1-IMGT: 위치 1 내지 26, FR2-IMGT: 39 내지 55, FR3-IMGT: 66 내지 104 및 FR4-IMGT: 118 내지 128) 및 상보성 결정 영역의 표준화된 경계(CDR1-IMGT: 27 내지 38, CDR2-IMGT: 56 내지 65 및 CDR3-IMGT: 105 내지 117)를 제공한다. 갭은 비점유 위치를 나타낸다. CDR1-IMGT 및 CDR2-IMGT의 갭(각각 12 미만 및 10개 미만의 아미노산 길이)은 CDR-IMGT 루프의 상단에 배치된다. 재배열된 CDR3-IMGT의 기본 길이는 13개 아미노산(위치 105 내지 117)이며, 이는 15개 아미노산의 접합부(2nd-CYS 104 내지 J-TRP 또는 J-PHE 118)에 해당한다. CDR3-IMGT 길이가 13개 아미노산 미만인 경우, 루프 상단으로부터 111, 112, 110, 113, 109, 114 등의 순서로 갭이 형성된다. CDR3-IMGT 길이가 13개 아미노산을 초과하는 경우, CDR3-IMGT 루프의 상단에서 112.1,111.1, 112.2, 111.2, 112.3, 111.3 등의 순서로 위치 111과 112 사이에 추가적인 위치가 형성된다.
이와 관련하여, VHH 도메인에 대해 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 각각의 CDR에서 아미노산 잔기의 총 수는 다양할 수 있으며, IMGT 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수와 일치하지 않을 수 있음에 유의하여야 한다(즉, IMGT 넘버링에 따른 하나 이상의 위치는 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열은 IMGT 넘버링에 의해 허용된 수보다 더 많은 아미노산 잔기를 포함할 수 있음). 이는 일반적으로 IMGT에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링과 일치할 수 있거나 일치하지 않을 수 있음을 의미한다.
대안적으로, 항체 가변 도메인(VHH 또는 VH를 포함함)의 아미노산 잔기는 Kabat 넘버링에 따라 넘버링될 수 있다(Kabat et al 1987, National Institute of Health; 1987. 804 pp., Publication no. 165-462.). 면역글로불린 V-영역에 대한 IMGT와 Kabat 넘버링 사이의 대응관계는, 예를 들어 Lefranc et al., 2003의 표 2에서 확인할 수 있다.
중쇄 항체 및 이의 가변 도메인의 일반적인 설명을 위하여, 특히 일반적인 배경 기술로서 문헌[Muyldermans S., et al 2013 Annual Review of Biochemistry, 82: 775-797]을 참조한다.
일반적으로, 본 명세서에서 가장 넓은 의미로 사용되는 용어 '중쇄 가변 도메인'은 특정 생물학적 공급원 또는 특정 제조 방법으로 제한되지 않는다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, 하기에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명에 따른 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(즉, VHH)은 (1) 천연 발생 중쇄 항체의 VHH 도메인을 단리함으로써; (2) 천연 발생 VHH 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해; (3) 임의의 동물 종, 구체적으로 포유동물의 종, 예컨대 인간 유래의 천연 발생 VH 도메인의 (하기 기재된 바와 같은) '낙타화'에 의해, 또는 이러한 낙타화 VH 도메인을 인코딩하는 핵산의 발현에 의해; (4) 문헌[Weizao C., et al Methods Mol Biol 2009, 525:81-99]에 기재된 바와 같은 '도메인 항체' 또는 'dAb'의 '낙타화'에 의해, 또는 이러한 낙타화 VH 도메인을 인코딩하는 핵산의 발현에 의해; (5) 단백질, 폴리펩타이드 또는 다른 아미노산 서열을 제조하기 위한 합성 또는 반-합성 기법을 사용하여; (6) 핵산 합성을 위한 기법을 사용하여 VHH를 인코딩하는 핵산을 제조한 후, 이렇게 수득된 핵산의 발현에 의해; 및/또는 (7) 상기한 것의 임의의 조합에 의해 수득될 수 있다. 상기한 것을 수행하기 위한 적합한 방법 및 기법은 본 명세서의 개시내용을 기반으로 하여 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어 본 명세서의 하기에 더 상세히 기재되는 방법 및 기법을 포함한다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이, 생산된 숙주 세포 및/또는 배지로부터 추출되거나 정제되었을 때, 상기 VHH, 또는 이의 단편은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 '본질적으로 단리된 (형태)'인 것으로 간주된다.
항원에 대한 적합한 VHH를 단리하는 방법
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 고형 종양 및/또는 암 세포에 존재하고/하거나 이에 특이적인 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP, 또는 인간 FOLR1에 대한 친화도 선택에 의해 수득된다. 특정 고형 종양 항원 또는 암 세포에 대한 친화도 선택에 의해 적합한 폴리펩타이드를 수득하는 것은, 예를 들어 종양-특이적 항원 및/또는 암 세포-특이적 항원에 대한 결합을 위해 표면에서 VHH를 발현하는 세포의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리(예를 들어, 박테리오파지)를 스크리닝함으로써 수행될 수 있고; 이들 모두 그 자체로 알려진 방식으로 수행될 수 있으며, 다음 비-제한적인 단계를 본질적으로 포함한다: a) 종양-특이적 또는 암 세포-특이적 단백질 표적 분자의 단리된 용액 또는 현탁액을 수득하는 단계로서, 상기 분자는 잠재적인 암 약물에 대한 표적인 것으로 알려져 있는, 단계; b) 상기 단백질 표적 분자에 대한 VHH 라이브러리 유래의 파지 또는 다른 세포를 바이오패닝하는 단계; c) 종양-특이적 또는 암 세포-특이적 단백질 표적 분자에 결합하는 파지 또는 다른 세포를 단리하는 단계; d) 개별 결합 파지 또는 다른 세포로부터 VHH 삽입체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계; e) 재조합 단백질 발현을 사용하여 이 서열에 따라 일정량의 VHH를 생산하는 단계; f) 상기 종양-특이적 또는 암 세포-특이적 단백질 표적 분자에 대한 상기 VHH 도메인의 친화도를 결정하는 단계; 및 선택적으로 g) 생물학적 검정(bio-assay)에서 상기 VHH 도메인의 살종양 또는 항암 활성을 시험하는 단계. 예를 들어 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정법을 포함하여 다양한 방법이 VHH 도메인 및 종양-특이적 또는 암 세포-특이적 단백질 표적 분자 사이의 친화도를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재된 바와 같이 당업계에서의 일반적인 실무이다. 평형 해리 상수는 일반적으로 폴리펩타이드와 이의 표적 분자 사이의 친화도를 설명하는 데 사용된다. 통상적으로, 평형 해리 상수는 10-7 M 미만이다. 바람직하게는, 평형 해리 상수는 10-8 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10-9 M 내지 10-12 M의 범위이다.
VHH의 변이체
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 VHH 또는 단편(또는 이를 발현시키는 데 사용되는 본 발명의 뉴클레오타이드 서열)의 기원에 대해 제한되지 않음에 유의하여야 한다. 더욱이, 본 발명은 또한 VHH, 또는 이의 단편이 생성되거나 수득된 방법에 대해 제한되지 않는다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 아미노산 서열은 합성 또는 반-합성 아미노산 서열, 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 VHH, 또는 이의 단편의 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 및/또는 유도체, 및/또는 이들 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 및/또는 유도체가 본 명세서에서 구상되는 목적에 적합하다면 이러한 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 및/또는 유도체 중 하나 이상을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 목적은 바람직하게는, 방사성 핵종에 연결될 때 진단 및 치료적 적용에 사용하기에 적합하고 VHH, 또는 이의 단편에 연결된 항원, 바람직하게는 FAP 또는 FOLR1을 발현하는 CNS 분자, 세포, 조직 또는 장기로 전달하는 것이다. 본 발명에 따른 그러한 일부, 단편, 유사체, 돌연변이체, 변이체, 및/또는 유도체는, 바람직하게는 여전히 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 바람직하게는
- 인간 및/또는 뮤린 FAP에, 바람직하게는 이들 둘 다의 FAP에 특이적으로 결합하고/하거나,
- 바람직하게는 FAP의 조절제가 아니며, 바람직하게는 FAP의 억제제가 아니고/아니거나,
- 인간 FOLR1에 특이적으로 결합하고 뮤린 FOL1 및 인간 FOLR2 및 인간 FOLR3에 특이적으로 결합할 수 없다.
예를 들어, 본 명세서에서 CDR 서열, 또는 VHH, 또는 이의 단편의 일부로도 지칭되고 서열번호 1, 2, 3으로 식별되는 아미노산 잔기의 다수의 스트레치(즉, 소형 펩타이드), 예컨대 VHH, 또는 이의 단편의 서열을 표시하는 서열번호 4와 적어도 80% 동일성을 가지는 서열을 제공하며, 이들은 인간 및/또는 뮤린 FAP에 결합하기에 특히 적합하다.
예를 들어, 본 명세서에서 CDR 서열, 또는 VHH, 또는 이의 단편의 일부로도 지칭되고 서열번호로 식별되는 아미노산 잔기의 다수의 스트레치(즉, 소형 펩타이드), 예컨대 VHH, 또는 이의 단편의 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31, 32 중 적어도 하나와 적어도 60% 동일성을 가지는 서열을 제공하며, 이들은 인간 FOLR1에 결합하기에 특히 적합하다.
이들 스트레치는 VHH의 기능적 단편인 것으로 간주될 수 있고, 구체적으로 이들이 해당 적합한 스캐폴드 또는 VHH의 항원 결합 부위(의 일부)를 형성하는 방식으로, 임의의 적합한 스캐폴드(단백질)에 존재할 수 있고/있거나, 이에 포함될 수 있다. 그러나, 가장 넓은 의미에서 본 발명은, 아미노산 잔기의 이러한 스트레치가 본 명세서에 개시된 바와 같은 이러한 스캐폴드 또는 VHH가 상기 항원에 특이적으로 결합할 수 있도록 하는 한, 아미노산 잔기의 이러한 스트레치가 본 명세서에 개시된 바와 같은 스캐폴드 또는 VHH에서 가질 수 있는 특정 구조적 역할 또는 기능에 제한되지 않음에 유의하여야 한다.
VHH 또는 이의 단편의 추가의 번역후 구조적 특성화
특정 양태에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 선택적으로 하나 이상의 링커를 통해 하나 이상의 추가 기, 모이어티, 또는 잔기에 연결될 수 있다. 이러한 하나 이상의 추가 기, 모이어티 또는 잔기는 관심이 있는 다른 표적에 결합하는 역할을 할 수 있다. 이러한 추가의 기, 잔기, 모이어티 및/또는 결합 부위는 VHH에 추가의 기능성을 제공할 수 있거나 제공하지 않을 수 있고 본 명세서에 개시된 바와 같은 특성을 변형시킬 수 있거나 변형시키지 않을 수 있음이 명백할 것이다. 그러한 기, 잔기, 모이어티 또는 결합 단위는 또한, 예를 들어 생물학적으로 활성일 수 있는 화학 기일 수 있다.
이러한 기, 모이어티 또는 잔기는 특정 구현예에서 중쇄 가변 도메인에 N- 또는 C-말단으로 연결되고, 구체적으로 C-말단으로 연결된다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 또한 화학적으로 변형되었을 수 있다. 예를 들어, 그러한 변형은 VHH 내에 또는 그 상에 하나 이상의 작용기, 잔기 또는 모이어티의 도입 또는 연결을 수반할 수 있다. 이들 기, 잔기 또는 모이어티는 VHH에 대해 하나 이상의 원하는 특성 또는 기능성을 부여할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 당업자에게 명백할 것이다.
예를 들어, VHH에 대한 그러한 작용기의 도입 또는 연결은 VHH의 용해도 및/또는 안정성의 증가, VHH의 독성의 감소, 또는 임의의 바람직하지 않은 부작용의 제거 또는 약화, 및/또는 다른 유리한 특성을 초래할 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 기, 잔기 또는 모이어티는 하나 이상의 적합한 링커 또는 스페이서를 통해 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 연결된다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 둘 이상의 결합 부위 전부가 본 명세서에 개시된 바와 같은 항원의 아미노산 잔기의 동일한 부위, 결정인자, 일부, 에피토프, 도메인 또는 스트레치에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하는 경우, VHH, 또는 이의 단편은 '2가'(VHH 또는 이의 단편 상의 2개의 결합 부위의 경우) 또는 다가(VHH 또는 이의 단편 상의 2개 초과의 결합 부위의 경우), 예를 들어 3가로 지칭된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 1가 형식으로 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 '1가'는 단량체 형태의 VHH, 또는 이의 단편을 의미한다. 1가 VHH 또는 이의 단편은 하나의 결합 부위만을 포함한다. 이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 결합 부위는 항원의 특정 부위, 결정인자, 일부, 에피토프, 도메인 또는 스트레치에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 '상보적 결정 영역' 또는 'CDR'을 포함한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 결합 부위는 서열번호 1, 2 및/또는 3으로 표시되는 하나 이상의 '상보성 결정 영역' 또는 'CDR', 및/또는 인간 및/또는 뮤린 FAP의 아미노산 잔기의 특정 부위, 결정인자, 부분, 에피토프, 도메인 또는 스트레치에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하는 VHH의 서열번호 4와 적어도 80% 동일성을 가지는 것으로 본 명세서에서 식별된 하나 이상의 영역을 포함한다.
구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 결합 부위는 하나 이상의 '상보성 결정 영역' 또는 'CDR', 및/또는 인간 FOLR1의 아미노산 잔기의 특정 부위, 결정인자, 부분, 에피토프, 도메인 또는 스트레치에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하는 VHH의 서열번호 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 31 중 적어도 하나와 적어도 60% 동일성을 가지는 것으로 본 명세서에서 식별된 하나 이상의 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 치료/진단적 적용에 매력적이다. 특정 적용을 위해, 그러한 작은 크기는 또한 최적의 치료 효과에 도달하기 위해 높은 조직 침투가 필요한 경우 매력적일 수 있다.
일부 특히 적합한 링커 또는 스페이서는, 예를 들어 폴리펩타이드 링커, 예컨대 글리신 링커, 세린 링커, 혼합 글리신/세린 링커, 글리신-풍부 및 세린-풍부 링커 또는 대체로 극성인 폴리펩타이드 단편으로 구성된 링커, 또는 동종이작용성 또는 이종이작용성 화학적 가교결합 화합물, 예컨대 글루타르알데하이드, 또는 선택적으로 PEG-스페이스, 말레이미드 또는 NHS 에스테르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 폴리펩타이드 링커 또는 스페이서는 길이가 1 내지 50개 아미노산, 예컨대 1 내지 30개, 구체적으로 1 내지 10개 아미노산 잔기인 적합한 아미노산 서열일 수 있다. 링커(들)의 길이, 가요성 정도 및/또는 기타 특성은 종양 표적 또는 암 세포 상의 표적에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력, 또는 약리학적 거동을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 특성에 일부 영향을 미칠 수 있음이 명백할 것이다. 2개 이상 링커가 사용될 때, 이들 링커는 동일하거나 상이할 수 있음이 명백할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 '비태그'는 외래 폴리펩타이드 서열을 포함하지 않는(예를 들어, 상기 VHH 또는 이의 단편 서열만을 포함하는) VHH 또는 이의 단편을 의미한다. 예시적인 외래 폴리펩타이드 서열은 카르복시-말단 폴리펩타이드 태그, 예를 들어 His-태그, 시스테인-포함 태그(예를 들어, 문헌[Pruszynski et al 2013 Nucl Med Biol 40: 52-59]에 기재된 바와 같은 GGC-태그), 및/또는 Myc-태그를 포함한다. His-태그는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 6개의 히스티딘이 존재한다.
또한 일 구현예에서, 존재할 수 있는 하나 이상의 기, 잔기 또는 모이어티는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 다량체화, 예컨대 이량체화를 유도하지 않는다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에는 다량체화, 예컨대 이량체화를 유도하는 태그가 없으며, 바람직하게는 시스테인-포함 태그, 바람직하게는 GGC-태그가 없다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에는 카르복시-말단 폴리펩타이드 태그가 없으며, 바람직하게는 태그되지 않는다.
유리하게는, 폴리펩타이드 태그된, 예컨대 His-태그 및 Myc-His-태그된 항체 단편과 비교하여 카르복시-말단 폴리펩타이드 태그가 없는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 사용할 때, 신장 저류가 상당히 감소되는 것으로 나타났다(D'Huyvetter et al. (2014), Theranostics. 4(7):708-20).
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 '이중특이적'은, a) VHH 또는 단편의 2개 이상의 결합 부위가 항원에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하지만 항원의 아미노산 잔기의 동일하지 않은(즉, 상이한) 부위, 결정인자, 일부, 에피토프, 도메인 또는 스트레치에 대해 지시되거나 특이적으로 결합하면, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 '이중특이적'(VHH 또는 단편 상의 2개 결합의 결합 부위의 경우) 또는 다중특이적(VHH 또는 단편 상의 2개 초과의 결합 부위의 경우)이라고 하거나, b) VHH 또는 단편의 2개 이상의 결합 부위가 관심이 있는 상이한 표적 분자에 대해 지시되거나 이에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 용어 '다중특이적'은 2개 초과의 결합 부위가 VHH 또는 단편에 존재하는 경우에 사용된다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 '반감기'는 일반적으로 VHH 또는 단편의 생체내 혈청 농도가 50%만큼 감소되는 데 필요한 시간으로 정의될 수 있다. 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 생체내 반감기는 당업자에게 알려진 임의의 방식으로, 예컨대 약동학 분석에 의해 결정될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 반감기는 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 하 면적(AUC)과 같은 매개변수를 사용하여 표현될 수 있다. 생체내 반감기 증가는 일반적으로 매개변수 t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 하 면적(AUC) 중 하나 이상, 바람직하게는 3가지 전부의 증가로 특성화된다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 "연장된 수명"은 VHH 또는 단편이 변형되어 VHH 또는 단편의 반감기를 연장시켰음을 의미하는 데 사용된다. VHH의 반감기를 연장시키기 위한 전략은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 제한 없이, 반감기를 연장시키는 하나 이상의 기 또는 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 소 혈청 알부민(BSA) 또는 인간 혈청 알부민(HSA), 항체 Fc 단편, 또는 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질을 표적화하는 항원-결합 항체 단편에 대한 연결(화학적 또는 다른 방식)을 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 수명이 연장되지 않은 것이다.
결합
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 특이적 결합은, 예를 들어 바이오패닝, 스캐차드 분석(Scatchard analysis) 및/또는 경쟁 결합 검정법, 예컨대 방사선 면역 검정법(RIA), 효소 면역 검정법(EIA)(또한 효소 연결 면역 흡착 검정법(ELISA)으로도 지칭됨), 샌드위치 경쟁 검정법, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 또는 생물층 간섭계 및 당업계에 알려진 이들의 다양한 변형을 포함한 그 자체로 알려진 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다. 이들 검정법 각각은 지지체 상 또는 용액 중에 고정될 수 있는 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 재조합 단백질 또는 인간 FOLR1 재조합 단백질 또는 인간 HER2 재조합 단백질을 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 일부 특정 상황 하에서, 이들 검정법 중 일부는 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP, 또는 인간 FOLR1, 또는 인간 HER2를 발현하는 세포를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 그러한 세포는 내인적으로 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP, 또는 인간 FOLR1, 또는 인간 HER2를 발현하거나 과발현할 수 있다. 평가는 보통 배양 배지 또는 PBS 또는 적합한 배지 또는 완충액에서 시험관내에서 수행된다.
바람직한 세포는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 섬유아세포이다. 바람직한 세포주는 GM05389 또는 U-87 MG일 수 있다. 대안적으로 바람직한 세포는 인간 및/또는 뮤린 FAP를 발현하는 형질감염된 세포이다. 바람직한 형질감염된 세포주는 HEK293일 수 있다.
바람직한 세포는 인간 FOLR1을 발현하는 SKOV3 또는 OVCAR3이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 결합은 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2를 발현하는 동물에서 생체내에서 평가될 수 있으며, 바람직하게는 영상화 기법이 사용된다. 바람직한 영상화 기법은 SPECT/CT, PET/CT, SPECT/MRI 또는 PET/MRI이다. 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2를 과발현하는 세포는 또한 동물 내로 이종이식될 수 있다. 또한 인간 FAP 또는 FOLR1 또는 HER2를 발현하는 본 발명의 인간 FAP 또는 FOLR1 또는 HER2 녹인(knock-in) 마우스를 사용하는 것도 가능하다.
따라서 용어 "시험관내"는 본 명세서에서 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR 또는 인간 HER2 재조합 단백질이 지지체 상 또는 용액 중에 고정되는 경우 무세포 검정의 맥락에서, 또는 배양 중인 세포의 맥락에서 사용된다. 이와 대조적으로, 용어 "생체내" 또는 "생체외"는 본 명세서에서 비-인간 동물 또는 이러한 비-인간 동물의 조직 또는 장기의 맥락에서 사용된다. 보통 "생체외"는 정량화가 비-인간 또는 인간 동물의 조직 또는 장기에서 수행될 경우 사용되고, "생체내"는 영상화 방법을 통한 정량화가 비-인간 또는 인간 동물에서 수행될 때 사용된다. 보통 "결합"은 시험관내 조건을 사용하여 평가되고, 생체내 조건을 사용하여 추가로 확인된다.
본 명세서에 개시된 시험관내, 생체내 및 생체외 검정법에서, 음성 대조군을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 명세서에서 이후에 설명되는 바와 같이 다른 항원의 존재 하에 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 대한 특이적 결합을 평가하는 것도 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "친화도", "특이적 결합", "결합", "결합 활성" 또는 "특이적 결합 활성"은 VHH 또는 단편 및 항원의 평형을 이들의 결합에 의해 형성된 복합체의 존재 쪽으로 이동시키기 위해 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 결합하는 정도를 지칭한다. 결합은 SPR 또는 생물층 간섭계를 사용하여 평가될 수 있다. 따라서, 예를 들어 인간 및/또는 뮤린 FAP 및 VHH 또는 단편이 비교적 동일한 농도로 조합되는 경우, 고친화도의 VHH 또는 단편은 이용가능한 인간 및/또는 뮤린 FAP에 결합하여 평형을 생성된 복합체의 고농도 쪽으로 이동시킬 것이다. 평형 해리 상수(KD)는 일반적으로 단백질 결합 도메인(VHH 또는 단편)과 항원 사이의 친화도를 설명하는 데 사용된다.
통상적으로, 평형 해리 상수는 10-7 M 미만이다. 바람직하게는, 평형 해리 상수는 10-8 M 미만, 또는 10-9 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10-9 M 내지 10-12 M의 범위이다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 VHH 또는 이의 단편은, 바람직하게는 생물층 간섭계를 사용하여 평가된, 바람직하게는 10-9 내지 10-12 몰/리터 또는 10-10 내지 10-12 몰/리터 범위의 평형 해리 상수(KD)로 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 (본 명세서에서 정의된 바와 같이) 특이적으로 결합하도록 한다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 '특이성'은 친화도 및/또는 결합력을 기반으로 하여 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 '친화도'는 VHH 또는 단편과 VHH 또는 단편이 결합하는 항원의 해리에 대한 평형 상수로 표시된다. KD 값이 더 낮을수록, VHH 또는 단편과 VHH 또는 단편이 결합하는 관심이 있는 표적 단백질(항원) 사이의 결합 강도가 더 강하다. 대안적으로, 친화도는 또한 1/KD에 해당하는 평형 회합 상수(KA)의 단위로 표현될 수 있다. 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 결합 친화도는 관심이 있는 특정 표적 단백질에 따라서 당업자에게 알려진 방식으로 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 '결합력'은 VHH 또는 단편과 관심이 있는 적절한 표적 단백질 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합력은 관심이 있는 표적 단백질 상의 결합 부위와 VHH 또는 단편 상의 결합 부위 사이의 친화도 및 VHH 또는 단편에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 둘 다와 관련된다. VHH는 단 하나의 단일-도메인을 가지고 따라서 단 하나의 단일 결합 부위를 가진다. VHH에 의해 보이는 친화도는 나노몰 이하의 범위이고 따라서 단일 결합 부위의 존재를 고려하면 상당히 이례적이다. 약 1 밀리몰 초과의 KD 값은 일반적으로 비-결합 또는 비-특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 일반적으로 KD는 또한 koff 또는 kd(초-1 또는 s-1 단위로 표현됨)로 표시되는 복합체의 해리 속도 상수 대 kon 또는 ka(몰-1 초-1 또는 M-1 s-1 단위로 표현됨)로 표시되는 복합체의 회합 속도 상수의 비율로 표현될 수 있는 것으로 당업계에 알려져 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 0.1 내지 0.00001 s-1 범위, 또는 10-2 내지 10-5 s-1, 또는 10-3 내지 10-5 s-1 범위, 또는 10-4 내지 10-5 s-1 범위의 koff 및/또는 1,000 내지 10,000,000 M-1 s-1 범위 또는 104 내지 107 M-1s-1 또는 105 내지 107 M-1s-1 범위의 kon으로 관심이 있는 표적 단백질(즉, 항원)에 결합할 수 있다. 결합 친화도, koff 및 kon 속도는 당업자에게 알려진 방법, 예를 들어 ELISA 방법, 등온 적정 열량측정법, SPR, 생물층 간섭계, 형광-활성화 세포 분류 분석법 등에 의해 결정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체 단편은, 바람직하게는 생물층 간섭계를 사용하여 평가된, 0.1 내지 0.00001s-1 범위, 또는 10-2 내지 10-5 s-1 또는 10-3 내지 10-5 s-1 범위, 또는 10-4 내지 10-5 s-1 범위의 koff로 인간 및/또는 뮤린 FAP에 특이적으로 결합한다.
바람직한 구현예에서, 본 명세서에 개시된 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 바람직하게는 생물층 간섭계를 사용하여 평가된, 10-9 내지 10-12 몰/리터 범위의 KD 및/또는 10-2 내지 10-5 s-1 범위의 koff, 더 바람직하게는 10-9 내지 10-12 몰/리터 범위의 KD 및 10-2 내지 10-5 s-1 범위의 koff로 인간 및/또는 뮤린 FAP에 (본 명세서에서 정의된 바와 같이) 특이적으로 결합하도록 한다.
따라서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은, 해당 VHH 또는 이의 단편이 해당 항원(또는 이의 적어도 일부분 또는 단편)에 대해 친화도, 특이성을 가지고/가지거나 이에 대해 특이적으로 지시될 때, 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 '특이적으로 결합한다'고 한다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편과 관련하여, VHH 또는 단편에 존재하는 용어 '결합 영역', '결합 부위' 또는 '상호작용 부위'는 본 명세서에서 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 대한 결합 또는 특이적 결합을 담당하는 VHH 또는 단편에 존재하는 아미노산 잔기의 특정 부위, 일부, 유전자좌, 도메인 또는 스트레치의 의미를 가진다. VHH 또는 단편에 존재하는 이러한 결합 영역은 파라토프로 지칭된다. 그러한 결합 영역은 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2와 접촉하는 VHH 또는 단편의 본 명세서에 개시된 바와 같은 아미노산 서열 유래의 특정 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 상기 VHH 또는 단편과 접촉하는 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2의 세포외 도메인의 영역 또는 일부 또는 별개 아미노산은 에피토프로 지칭될 수 있고 본 명세서에서 이후에 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '특이적으로 결합하다' 및 '특이적 결합'은 일반적으로 폴리펩타이드, 구체적으로 면역글로불린, 예컨대 항체, 또는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편, 예컨대 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 특정 항원, 예컨대 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 우선적으로 결합하는 능력을 지칭한다. 본 발명에 따른 그러한 VHH, 또는 이의 단편은 또한 해당 특정 항원에 대해 생성된 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편으로 식별될 수 있다.
VHH를 생산 및 제조하는 방법
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 하기 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생산 또는 제조될 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 제조하는 특히 유용한 하나의 방법은 일반적으로 다음 단계를 포함한다:
(a) VHH 및 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계, 및
(b) 선택적으로 VHH 또는 단편을 단리 및/또는 정제하는 단계.
VHH 또는 단편을 인코딩하는 핵산은 벡터 또는 유전자 작제물에 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, VHH 또는 단편은 VHH 서열의 무작위 라이브러리를 생성하는 단계 및 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 VHH 서열에 대한 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 단계를 수반하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 제조하는 특정 방법은 다음 단계를 포함한다:
a) VHH 도메인의 아미노산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계; 및
b) 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 결합하고/하거나 이에 대해 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열의 상기 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계,
및
c) 항원에 결합하고/하거나 이에 대해 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열(들)을 단리하는 단계.
그러한 방법에서, VHH 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는 아미노산 서열의 임의의 적합한 세트, 컬렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는 면역글로불린 단편 서열(본 명세서에 기재된 바와 같음)의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리, 예컨대 면역글로불린 단편 서열의 미경험(naive) 세트, 컬렉션 또는 라이브러리; 면역글로불린 단편 서열의 합성 또는 반-합성 세트, 컬렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화성 성숙을 거친 면역글로불린 단편 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
이러한 방법의 특정 구현예에서, VHH 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는, 예를 들어 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2로 또는 이를 기반으로 하거나 이로부터 유래된 적합한 항원 결정인자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 포유동물로부터 유래된, 면역글로불린 단편 서열의 면역 세트, 컬렉션 또는 라이브러리일 수 있다. 특정 일 양태에서, 상기 항원 결정인자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
상기 방법에서, VHH 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물(예컨대, 효모)에서 디스플레이되어, 예컨대 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 아미노산 서열(의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리)을 디스플레이하고 스크리닝하는 데 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들어 본 명세서의 추가 개시내용을 기초로 당업자에게 명백할 것이다. 또한 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에서의 검토를 참조한다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 생성하는 특정 방법은 적어도 다음 단계를 포함한다:
a) VHH 도메인 아미노산 서열을 발현하는 세포의 컬렉션 또는 샘플을 제공하는 단계;
b) 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 결합하고/하거나 이에 대해 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열을 발현하는 세포에 대해 상기 세포의 컬렉션 또는 샘플을 스크리닝하는 단계;
및
c) (i) 상기 아미노산 서열을 단리하는 단계; 또는 (ii) 상기 세포로부터 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계.
세포의 컬렉션 또는 샘플은, 예를 들어 B-세포의 컬렉션 또는 샘플일 수 있다. 또한, 이러한 방법에서, 세포의 샘플은 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2로 또는 이를 기반으로 하거나 이로부터 유래된 적합한 항원 결정인자, 예컨대 이의 항원 부분, 단편, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 에피토프로 적합하게 면역화된 포유동물로부터 유래될 수 있다. 특정 일 구현예에서, 항원 결정인자는 세포외 부분, 영역, 도메인, 루프 또는 다른 세포외 에피토프(들)일 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 생성하는 특정 방법은 적어도 다음 단계를 포함할 수 있다:
a) VHH 도메인 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 해당 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 결합하고/하거나 이에 대해 친화성을 가질 수 있는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열에 대한 핵산 서열의 상기 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계;
및
c) 상기 핵산 서열을 단리한 후, 상기 아미노산 서열을 발현시키는 단계.
상기 방법에서, 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는, 예를 들어 면역글로불린 단편 서열의 미경험 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 인코딩하는 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리; 면역글로불린 단편 서열의 합성 또는 반-합성 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 인코딩하는 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리; 및/또는 친화성 성숙을 거친 면역글로불린 단편 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 인코딩하는 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리일 수 있다.
구체적으로, 그러한 방법에서, 핵산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 대해 지시된 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 인코딩한다.
상기 방법에서, 뉴클레오타이드 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리는 파지, 파지미드, 리보솜 또는 적합한 미생물(예컨대, 효모)에서 디스플레이되어, 예컨대 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열(의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리)을 디스플레이하고 스크리닝하는 데 적합한 방법, 기법 및 숙주 유기체는, 예를 들어 본 명세서의 추가 개시내용을 기초로 당업자에게 명백할 것이다. 또한 문헌[Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005)]에서의 검토를 참조한다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해, 또는 대안적으로 상기 방법 중 하나, 및 추가적으로 적어도 상기 VHH 또는 단편의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열을 결정하는 단계; 및 그 자체로 알려진 방식으로, 예컨대 적합한 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 상기 VHH 또는 단편을 발현시키거나 합성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득 가능한 또는 수득되는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편에 관한 것이다.
일부 경우에서, 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 생산하는 방법은 항원에 대한 검출 가능한 결합 친화성, 또는 이에 대한 검출 가능한 시험관내 효과를 가지는 적어도 하나의 VHH 또는 이의 단편을 아미노산 서열 라이브러리로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 방법은 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2의 활성에 대한 검출 가능한 결합 친화성, 또는 이에 대한 검출 가능한 시험관내 효과를 가지는 적어도 하나의 VHH 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법의 선택 단계로부터 수득된, 특정 아미노산 서열을 디스플레이하는 파지 클론은 숙주 박테리아의 재감염 및 성장 배지에서의 인큐베이션에 의해 증폭될 수 있다.
특정 방법은 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 결합할 수 있는 하나 이상의 아미노산 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
아미노산 서열의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리에 포함된, 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편이 적합한 세포 또는 파지 또는 입자 상에 디스플레이되는 경우, 상기 세포 또는 파지 또는 입자로부터, 해당 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 단리하는 것이 가능하다. 이러한 방식으로, 선택된 아미노산 서열 라이브러리 구성원(들)의 뉴클레오타이드 서열은 일상적인 서열결정 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 생산하는 특정 방법은 적합한 조건 하에 숙주 유기체에서 상기 뉴클레오타이드 서열(들)을 발현시켜 실제 원하는 아미노산 서열을 수득하는 단계를 포함한다. 이러한 단계는 당업자에게 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다.
추가적으로, 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2의 활성에 대한 검출 가능한 결합 친화성을 갖고/갖거나 이에 대한 검출 가능한 시험관내 효과를 갖지 않는 수득된 VHH 또는 단편은, 선택적으로 이들 서열이 식별된 후에, 가용성 단백질 작제물로서 합성될 수 있다.
예를 들어, 상기 방법에 의해 수득되거나 수득 가능하거나 선택되는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은 당업계에 알려진 재조합 또는 화학적 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 수득되거나 수득 가능하거나 선택되는 아미노산 서열은 유전자 조작 기법에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의해 수득되거나 수득 가능하거나 선택되는 VHH 또는 단편을 합성하는 방법은 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2의 활성에 대한 검출 가능한 결합 친화성을 갖고/갖거나 이에 대한 검출 가능한 시험관내 효과를 갖지 않는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 또는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키거나 감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 항원의 활성에 대한 검출 가능한 결합 친화성을 갖고/갖거나 검출 가능한 시험관내 효과를 갖지 않는 VHH 또는 단편은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 일단 제조되면, DNA는 발현 벡터 내로 도입되고, 그 다음 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 또는 임의의 적합한 발현 시스템 내로 형질전환 또는 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 및/또는 이들 재조합 숙주 세포가 상주하는 배지에서 아미노산 서열의 발현을 달성할 수 있다.
단백질 발현 및 정제 업계의 당업자에게 알려진 바와 같이, 적합한 발현 시스템을 사용하여 발현 벡터로부터 생산된 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편은, 예를 들어 His-태그 또는 용이한 정제를 위한 다른 서열 태그로 (통상적으로 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에서) 태그될 수 있음이 이해될 것이다.
숙주 세포로의 핵산 또는 벡터의 형질전환 또는 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 폴리브렌-매개 형질감염, 전기천공법, 미세주사법, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총을 비롯하여 당업자에게 알려진 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
원하는 중쇄 가변 도메인 서열의 발현에 적합한 숙주 세포는 시험관내 또는 생체내 위치 여부에 관계없이 임의의 진핵 세포 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 예컨대 이. 콜라이, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 양서류 세포, 식물 세포, 어류 세포, 및 곤충 세포)일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 유전자이식 식물에 위치할 수 있다.
따라서, 본 출원은 또한 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2의 활성에 대한 검출 가능한 결합 친화성, 또는 이에 대한 검출 가능한 시험관내 효과를 가지는 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 그러한 VHH 또는 단편을 인코딩하는 핵산 서열 또는 벡터로 숙주 세포를 형질전환, 형질감염 또는 감염시키는 단계 및 적합한 조건 하에 이의 아미노산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
본 출원은 본 발명에 따른 조성물의 제조(동등한 용어인 '또는 ~의 생산') 방법을 추가로 제공한다.
특히, 본 출원은 적어도 다음 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 조성물을 생산하는 방법을 제공한다:
- 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편을 수득하는 단계, 및
- 상기 VHH 또는 단편을 약제학적 조성물로 제형화하는 단계.
이러한 방법의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 VHH 또는 단편을 수득하는 단계는 다음을 포함한다:
(a) 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는, 본 발명에 따른 VHH 또는 이의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현시키는 단계, 및 선택적으로
(b) VHH 또는 단편을 단리 및/또는 정제하는 단계.
이러한 방법의 다른 특정 구현예에서, 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는, 적어도 하나의 VHH 또는 단편을 수득하는 단계는 다음을 포함한다:
a) VHH 도메인 서열 또는 VHH 서열의 단편의 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 제공하는 단계;
b) 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하고/하거나 이에 대해 친화성을 가지는 서열에 대한 VHH 도메인 서열 또는 이의 단편의 서열의 상기 세트, 컬렉션 또는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, 및 선택적으로
c) 항원, 바람직하게는 인간 및/또는 뮤린 FAP 또는 인간 FOLR1 또는 인간 HER2에 특이적으로 결합하고/하거나 이에 친화성을 가지는 VHH 서열 또는 이의 단편의 서열을 단리하는 단계.
치료법/진단에서의 제형/용도
본 발명에 따른 조합물의 치료 또는 진단적 용도의 맥락에서, 용량은 투여되는 표지된 화합물 또는 표지의 양으로 정의된다. 이에 따라, 진단 또는 치료적 목적 또는 용도를 위해, 표지 또는 표지된 화합물의 주어진 용량의 투여는 본 발명에 따른 조합물의 용도와 관련되며, 여기서 후속 투여 동안 표지된 화합물의 양은 상기 용량이다.
당업자는 질환의 성질 및 환자의 체질에 따라, 본 발명에 따른 조합물의 맥락에서 제1 및 후속 투여 둘 다의 적절한 투약 및 적용 스케줄을 결정하는 방법을 안다. 구체적으로, 당업자는 선량-제한 독성(DLT)를 평가하는 방법 및 이에 따라 최대 허용 선량(MTD)을 결정하는 방법을 안다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 사용은 약 800 mCi 미만, 예컨대 약 150 mCi 미만, 예컨대 약 30 mCi 미만, 예컨대 약 15 mCi 미만의 방사성 투약량으로, 표지된 화합물을 후속 투여하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물의 사용은 방사성 핵종에 따라 비활성이 약 0.5 mCi/mg 내지 약 8000 mCi/mg, 예컨대 1 mCi/mg 내지 약 1500 mCi/mg, 예컨대 1 mCi/mg 내지 약 300 mCi/mg, 예컨대 1 mCi/mg 내지 약 150 mCi/mg인 표지된 화합물을 후속 투여하는 것을 포함한다. 제1 및/또는 후속 투여는 정맥내, 복강내 투여이거나, 척수강내와 같은 다른 경로를 통한 것일 수 있다. 치료의 원하는 기간 및 효과에 따라, 조합물은 1회 또는 수회, 다른 치료 약물 또는 방사선 감작제와 조합하여 투여될 수 있다. 적용되는 표지된 화합물의 양은 암종의 정확한 성질에 따라 다르다. 투여당 방사능 선량은 효과적일 만큼 충분히 높아야 하지만, 선량 제한 독성(DLT) 미만이어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "스크리닝 용량" 또는 "바이오마커 용량"은 치료를 위해 대상체를 선택하기에 충분한, 본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제, 예컨대 표지된 화합물의 용량, 예컨대 대상체에서 암 세포 또는 고형 종양에 결합할 수 있고, 선택적으로 비핵 영상화 기법, 예컨대 X-선 영상화, 컴퓨터 단층 촬영 및/또는 자기 공명 영상과 조합되는, 예를 들어 감마 카메라 영상화, 예컨대 평면 감마 카메라 영상화, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영, 또는 양전자 방출 단층 촬영을 사용하여 대상체를 영상화함으로써 후속적으로 암 세포 또는 고형 종양의 위치에서 검출될 수 있는 용량이다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량은 치료적으로 유효하지 않은 용량이다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 용량과 상이하다(예를 들어, 치료 용량 미만임).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "치료 용량"은 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 암에 걸린 대상체)의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%에서 치료적으로 효과적인, 본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제, 예컨대 표지된 화합물의 용량이다. 일부 구현예에서, 치료 용량은 본 명세서에 기재된 스크리닝 용량보다 더 많다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "대상체를 영상화하는 것"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지를 검출할 수 있는 장치를 사용하여 대상체의 하나 이상의 영상을 캡처하는 것을 지칭한다. 하나 이상의 영상은 (예를 들어, 하나 이상의 영상의 콘트라스트 또는 밝기를 조정함으로써) 이미지를 향상시키기 위해 컴퓨터 프로그램 및/또는 당업자에 의해 추가로 변경될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지를 검출할 수 있는 임의의 장치는, 예컨대 감마 카메라 영상화, 예컨대 평면 감마 카메라 영상화를 위한 장치, 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영, 또는 양전자 방출 단층 촬영을 위한 장치, 또는 핵 영상화 기법을 해부학적 영상화 기법, 예컨대 X-선 영상화, 컴퓨터 단층 촬영 및/또는 자기 공명 영상과 조합할 수 있는 장치의 사용이 고려된다. 예를 들어, 이러한 장치는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영(SPECT/CT) 또는 양전자 방출 컴퓨터 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영(PET/CT) 영상화를 위한 장치일 수 있다. 그러한 장치는 당업계에 알려져 있으며, 상업적으로 입수 가능하다.
일부 구현예에서, 스크리닝 용량의 투여 및 영상화에 의한 검출은 적어도 약 1분, 적어도 약 5분, 적어도 약 10분, 적어도 약 20분, 적어도 약 30분, 적어도 약 40분, 적어도 약 50분, 적어도 약 1시간, 적어도 약 1.5시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 7시간, 적어도 약 8시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 11시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 2일, 또는 적어도 약 7일만큼 떨어져 있다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량의 투여 및 검출은 약 1시간 내지 약 24시간만큼 떨어져 있다.
일부 구현예에서, 스크리닝 용량 및 치료 용량은 적어도 약 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 1개월, 적어도 약 2개월, 또는 적어도 약 6개월 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량 및 치료 용량은 약 1일 내지 약 6개월 간격(예를 들어, 약 1일 내지 약 2개월, 약 1일 내지 약 1개월, 또는 약 1일 내지 약 1주 간격)으로 투여된다.
스크리닝 용량 및 치료 용량은 임의의 적합한 경로, 예컨대 전신, 국부 또는 국소로 각각 독립적으로 투여될 수 있다. 예시적인 경로는 정맥내, 복강내, 및 척수강내 투여를 포함한다. 이용되는 특정 경로는, 일부 구현예에서, 질환의 성질(예를 들어, 종양 또는 암 세포의 유형, 등급, 위치 및 병기 등) 및 대상체의 유형(예를 들어, 종, 체질, 연령, 성별, 체중 등)에 따라 다를 수 있다.
모든 진단 및 치료적 적용에 대해 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 일반적으로 포유동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류, 래트, 마우스, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 말, 염소, 또는 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 암에 걸린 대상체(예를 들어, 암에 걸린 인간 대상체)이다. 암에 걸린 대상체를 식별하기 위한 방법은 종양 항원 또는 다른 종양 바이오마커의 검출, 유전자 검사, MRI, X-선, PET 또는 SPECT 스캔, 생검, 및 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 '진단', '예측' 및/또는 '예후'는 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태를 진단, 예측 및/또는 예후하여, 이에 의해 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 발병 및/또는 존재를 예측하는 것, 및/또는 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 진행 및/또는 기간을 예측하는 것, 및/또는 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태를 앓고 있는 환자의 치료법에 대한 반응을 예측하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 스크리닝 용량(즉, 진단 방법에서 사용됨)은 치료적으로 유효하지 않은 용량이다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 용량보다 더 적다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 용량보다 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1000배 더 낮거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 선량보다 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 320, 적어도 약 340, 적어도 약 360, 적어도 약 380, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 500, 적어도 약 1000, 적어도 약 5000, 적어도 약 10000, 적어도 약 13000, 적어도 약 15000, 적어도 약 18000, 또는 적어도 약 20000 MBq 더 낮음). 일부 구현예에서, 스크리닝 용량은 약 10 MBq 내지 약 400 MBq, 약 20 MBq 내지 약 400 MBq, 약 30 MBq 내지 약 400 MBq, 약 40 MBq 내지 약 400 MBq, 약 50 MBq 내지 약 400 MBq, 약 100 MBq 내지 약 400 MBq, 약 200 MBq 내지 약 400 MBq, 약 300 MBq 내지 약 400 MBq, 약 10 MBq 내지 약 300 MBq, 약 20 MBq 내지 약 300 MBq, 약 30 MBq 내지 약 300 MBq, 약 40 MBq 내지 약 300 MBq, 약 50 MBq 내지 약 300 MBq, 약 100 MBq 내지 약 300 MBq, 또는 약 200 MBq 내지 약 300 MBq이다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량은 3 약 7 MBq 내지 약 370 MBq이다. 본 명세서에 기재된 임의의 스크리닝 용량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 치료 용량과 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 치료 용량은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 용량보다 더 높다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 용량보다 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1000배 더 높거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 용량보다 적어도 약 10, 적어도 약 20, 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 약 60, 적어도 약 70, 적어도 약 80, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 130, 적어도 약 140, 적어도 약 150, 적어도 약 160, 적어도 약 170, 적어도 약 180, 적어도 약 190, 적어도 약 200, 적어도 약 210, 적어도 약 220, 적어도 약 230, 적어도 약 240, 적어도 약 250, 적어도 약 260, 적어도 약 270, 적어도 약 280, 적어도 약 290, 적어도 약 300, 적어도 약 320, 적어도 약 340, 적어도 약 360, 적어도 약 380, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 500, 적어도 약 1000, 적어도 약 5000, 적어도 약 10000, 적어도 약 13000, 적어도 약 15000, 적어도 약 18000, 또는 적어도 약 20000 MBq 더 높음). 일부 구현예에서, 치료 용량은 약 300 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 400 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 500 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 1000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 2000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 3000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 4000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 5000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 10000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 5000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 10000 MBq 내지 약 20000 MBq, 약 300 MBq 내지 약 10000 MBq, 약 400 MBq 내지 약 10000 MBq, 약 500 MBq 내지 약 10000 MBq, 약 1000 MBq 내지 약 10000 MBq, 약 2000 MBq 내지 약 10000MBq, 약 3000 MBq 내지 약 10000 MBq, 약 4000 MBq 내지 약 10000 MBq, 또는 약 5000 MBq 내지 약 10000 MBq이다. 제공된 방법 중 임의의 하나의 일부 구현예에서 치료 용량은 약 370 MBq 내지 약 18500 MBq이다.
스크리닝 및/또는 치료 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량(또한 하위 용량일 수 있음)으로 편리하게 제공될 수 있다. 치료 용량의 투여 요법은 장기(예를 들어, 적어도 2주, 예를 들어 수개월 또는 수년) 또는 매일 치료를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 용량의 투여 요법은 1일 1회 내지 1개월 1회, 예컨대 1일 1회 내지 2주 1회, 예컨대 1주 1회(이에 제한되지 않음)로 다양할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조합물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들어 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 투여될 수 있다.
이용되는 특정 스크리닝 용량 및 치료 용량은, 일부 구현예에서, 질환의 성질(예컨대, 암뿐만 아니라, 종양 또는 암 세포의 유형, 등급, 및 병기 등, 또는 예컨대 본 명세서에서 식별된 다른 질환 중 임의의 것) 및 대상체의 유형(예를 들어, 종, 체질, 연령, 성별, 체중 등)에 따라 다를 수 있다.
일부 양태에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지된 화합물의 스크리닝 용량 및 동일한 화합물의 치료 용량을 포함한다. 스크리닝 용량 및 치료 용량은 본 명세서에 기재되어 있다.
키트 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 키트는 스크리닝 용량 및 치료 용량의 주사를 위한 하나 이상의 수단을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 스크리닝 용량 및 치료 용량은 주사용 수단에 각각 개별적으로 수용된다. 일부 구현예에서, 주사용 수단은 주사기이다. 키트 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 대상체를 계층화하고 치료하는 방법)을 수행하기 위한 지침을 추가로 포함한다. 지침은 임의의 적합한 형태, 예를 들어 인쇄된 형태(예를 들어, 종이 또는 적층 삽입물 또는 라벨) 또는 전자 형태(예를 들어, 디스크 또는 USB 스틱)일 수 있다.
용량, 투여 경로, 적용 계획, 반복 및 치료 기간은 일반적으로 질환의 성질(종양 또는 암 세포의 유형, 등급, 및 병기 또는 본 명세서에 추가로 정의된 질환 또는 병태의 유형, 등급 및 병기) 및 환자(체질, 연령, 성별 등)에 따라 다를 것이고, 치료를 담당하는 숙련된 의료 전문가에 의해 결정될 것이다. 상기 기재된 개시된 조합물의 구성요소에 대한 가능한 용량과 관련하여, 치료를 담당하는 의료 전문가가 임의의 용량-제한 독성 또는 다른 심각한 부작용이 발생하는지 여부를 주의 깊게 모니터링하고 이의 관리에 필요한 조치를 수행할 것임이 명백하다.
일반적으로, 약제학적(진단 및 치료) 용도를 위해, 제형에 따른 조합물의 구성요소는 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제 및/또는 아쥬반트, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 폴리펩타이드 및/또는 화합물을 포함하는 약제학적 제제 또는 조성물로 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 복강내, 정맥내, 또는 척수강내와 투여와 같은 다른 투여에 적합할 수 있다. 따라서, 제1 및 후속 투여는, 종양 또는 암 세포의 위치, 유형 및 기원에 따라 관심이 있는 조직 또는 장기로, 전신, 국부 또는 국소로, 바람직하게는 사용되는 특정 약제학적 제형 또는 조성물에 따라 복강내, 정맥내 또는 척수강내로 이루어질 수 있다. 임상의는 적합한 투여 경로 및 이러한 투여에 사용되는 적합한 약제학적 제형 또는 조성물을 선택할 수 있을 것이다.
주사 또는 주입에 적합한 약제학적 투약 형태는, 선택적으로 리포좀에 캡슐화된, 멸균 주사가능 또는 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조에 적당한 활성 성분을 포함하는 멸균 수용액 또는 분산액 또는 멸균 분말을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 최종 투약 형태는 제조 및 보관 조건 하에서 멸균 상태이고, 유동적이며 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 적합한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 액체 분산 매질일 수 있다.
예방 및/또는 치료에 사용하는 데 필요한 본 명세서에서 구상되는 바와 같은 표지된 화합물의 양은 투여 경로, 치료될 병태의 성질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 다를 수 있으며, 궁극적으로 주치의 또는 임상의의 재량에 따를 것이다. 또한, 본 명세서에서 구상되는 표지된 화합물의 투약량은 표적 세포, 종양, 조직, 이식편, 또는 장기에 따라 다를 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에서 구상되는 바와 같은 표지된 화합물은 특히 치료될 병태의 중증도 및 환자를 기반으로 의사에 의해 결정될 양으로 투여될 것이다. 통상적으로, 각각의 질환 적응증에 대해, 최적 투약량은 하루에 체중(kg)당 투여될 양, 연속적으로(예를 들어, 주입), 단회 1일 용량으로서 또는 하루 동안의 다회 분할 용량으로서 지정하여 결정될 것이다. 임상의는 일반적으로 본 명세서에 언급된 인자에 따라 적합한 1일 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한 특정 경우에, 임상의는, 예를 들어 상기 언급된 인자 및 그의 전문적인 판단에 기초하여, 이들 양을 벗어나도록 선택할 수 있음이 명백할 것이다.
본 명세서에서 구상되는 바와 같은 이의 표지된 화합물의 유용한 투약량은 시험관내 활성, 및/또는 동물 모델에서 생체내 활성을 결정함으로써 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 조합물은 표지된 화합물을 10 μg 내지 10 mg 또는 10 μg 내지 7 mg 또는 10 μg 내지 5 mg 또는 10 μg 내지 2 mg 또는 10 g 내지 1.5 mg 또는 10 g 내지 1 mg 범위의 VHH의 용량으로 후속 투여함으로써 암(바람직하게는 암 세포 및/또는 CAF에서 인간 FAP의 발현과 연관된 암)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 추가의 특정 구현예에서, 표지된 화합물은 10 μg 내지 2 mg의 표지된 화합물, 예컨대 구체적으로 10 g 내지 1.5 mg의 범위 또는 100 μg 내지 1 mg 범위의 표지된 화합물의 용량으로 투여된다.
따라서, 투여당 환자에게 적용되는 방사능 선량은 효과적일 만큼 충분히 높아야 하지만, 선량 제한 독성(DLT) 미만이어야 한다. 예를 들어 131-요오드가 있는 본 발명에 따른 조합물의 경우, 치료 환경에서 초과해서는 안 되는 최대 허용 선량(MTD)이 결정되어야 한다.
제1 및 후속 투여는 바람직하게는 예방 또는 치료될 질환 또는 장애를 예방 및/또는 치료하는 데 적합한 치료 요법에 따른다. 임상의는 일반적으로 적합한 치료 요법을 결정할 수 있을 것이다. 일반적으로, 치료 요법은 표지된 화합물, 또는 이를 포함하는 하나 이상의 조성물을 하나 이상의 약제학적으로 유효한 양 또는 용량으로 투여하는 것을 포함할 것이다.
원하는 용량은 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량(또한 하위 용량일 수 있음)으로 편리하게 제공될 수 있다. 투여 요법은 장기(즉, 적어도 2주, 예를 들어 수개월 또는 수년) 또는 매일 치료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 투여 요법은 1일 1회 내지 1개월 1회, 예컨대 1일 1회 내지 2주 1회, 예컨대 1주 1회(이에 제한되지 않음)로 다양할 수 있다. 따라서, 원하는 치료 기간 및 유효성에 따라, 본 명세서에 개시된 바와 같은 표지된 화합물 또는 이를 포함하는 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들어 수일, 수주 또는 수개월 동안 매일 그리고 상이한 투약량으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 개시된 표지된 화합물 또는 조성물의 적용된 양은 특정 암 질환의 성질에 따라 다르다. 다중 투여가 바람직하다. 그러나, 방사성표지된 물질은 통상적으로 1 내지 20주, 2 내지 10주, 또는 2 내지 8주, 또는 3 내지 6주, 또는 3 내지 5주, 또는 각각 4주의 간격으로 투여된다. 그러나 숙련된 기술자는 투여를 2회 이상의 적용으로 분할하는 것을 선택하는 방법을 알고 있으며, 이는 서로 직후에, 또는 예를 들어 1일 내지 4주 범위의 일부 다른 미리 결정된 간격으로 적용될 수 있다.
구체적으로, 본 명세서에서 구상되는 바와 같이 조합물, 및 이에 상응하는 표지된 화합물은 본 명세서에 인용된 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료에 사용되거나 사용될 수 있는 다른 약제학적으로 활성인 화합물 또는 원리와 함께 사용될 수 있으며, 그 결과 시너지 효과를 얻을 수 있거나 얻지 못할 수 있다. 이러한 화합물 및 원리뿐만 아니라 이들을 투여하기 위한 경로, 방법 및 약제학적 제형 또는 조성물의 예는 임상의에게 명백할 것이다.
본 발명의 맥락에서, "~와 조합하는", "병용 요법으로" 또는 "병용 치료로"는 본 발명에 따른 조합물이 하나 이상의 다른 약제학적으로 활성인 화합물 또는 원리와 함께 환자가 유익한 효과로부터 이익을 얻을 수 있는 요법으로 환자에게 적용되는 것을 의미할 것이다. 구체적으로, 두 치료 모두는 시간적으로 근접하여 환자에게 적용된다. 바람직한 구현예에서, 두 치료 모두는 4주(28일) 이내에 환자에게 적용된다. 더 바람직하게는 두 치료 모두는 2주(14일) 이내, 더 바람직하게는 1주(7일) 이내에 적용된다. 바람직한 구현예에서, 2가지 치료는 2 또는 3일 이내에 적용된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 2가지 치료는 동일한 날에, 즉 24시간 이내에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 2가지 치료는 4시간, 또는 2시간 이내에, 또는 1시간 이내에 적용된다. 또 다른 구현예에서, 2가지 치료는 병행하여, 즉 동시에 적용되거나, 2가지 투여는 시간상 중첩된다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 분자 또는 이를 포함하는 조성물과 함께 적용되며, 여기서 상기 분자 또는 이를 포함하는 조성물은 최적화될 수 있고 상기 조합물에 포함되는 표지의 신장 저류를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 문맥에서, "함께 적용된"은 광범위하게 해석되어야 한다. 이는 하나 또는 2가지의 별개 조성물로 동시에 적용되는 것을 포함함을 의미한다. 또한 2가지 별개 조성물로 순차적으로 적용되는 것도 포함한다.
그러한 분자는 혈장 또는 혈액 대체물, 예컨대 변형된 젤라틴일 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 변형된 젤라틴의 예는 GelofusineTM이다. 이러한 혈장 또는 혈액 대체물의 사용은 최적화되고 따라서 신장에서 표지된 화합물의 저류를 감소시키며, 따라서 원치않는 부작용을 최적화할 것으로 예상된다.
그러한 분자의 또 다른 예는 양으로 하전된 아미노산 또는 적어도 하나의 양으로 하전된 아미노산을 포함하는 조성물일 수 있다. 적합한 양으로 하전된 아미노산의 예는 아르기닌, 라이신 및/또는 히스티딘이다. 이러한 조성물의 예는 AminomedixTM이다. 양으로 하전된 아미노산의 사용은 참조로 명시적으로 포함되는 WO 2014/204854에 광범위하게 기재되어 있다.
비-제한적인 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 면역요법과 함께 적용된다. 일 구현예에서, 하나 이상의 치료용 항체 또는 치료용 항체 단편으로. 따라서, 이러한 비-제한적인 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물을 이용한 사전 표적화 방사선면역요법은 하나 이상의 치료용 항체 또는 치료용 항체 단편을 이용하는 일반 면역요법과 조합된다. 추가의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조합물은 하나 이상의 치료용 항체 또는 치료용 항체 단편을 이용하는 병용 요법 또는 병용 치료 방법으로 사용된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지 및 하나 이상의 치료용 항체 또는 치료용 항체 단편은 동시에 주사될 수 있거나, 주사는 시간상 중첩될 수 있다. 이들이 동시에 투여되는 경우, 이들은 하나의 단일 약제학적 제제로 함께 제형화될 수 있거나, 예를 들어 하나의 단일 주사 용액으로 용해하거나 희석함으로써, 2가지 상이한 약제학적 제제로부터 투여 직전에 함께 혼합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 2가지는 개별적으로, 즉 2가지 독립적인 약제학적 조성물로 투여된다. 바람직한 일 구현예에서, 2가지 치료제의 투여는 환자의 신체 내 종양 세포가 유효량의 세포독성 약물 및 방사선에 동시에 노출되는 방식으로 이루어진다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 두 가지 화합물(본 발명에 따른 조합물에 포함되는 표지, 하나 이상의 치료용 항체 또는 이의 단편)의 유효량은 동시에 종양 부위에 존재한다. 본 발명은 또한 추가 작용제의 사용을 포함하며, 이는 정의된 바와 같은 조합에 추가적으로 투여된다. 이는, 예를 들어 하나 이상의 추가 화학요법제(들)일 수 있다. 이는 또한 다른 주어진 약물 중 임의의 것의 원치않는 부작용을 예방, 억제, 또는 개선하기 위해 적용되는 하나 이상의 작용제(들)일 수 있다. 예를 들어, 백혈구의 증식을 자극하는 사이토카인은 백혈구감소증 또는 호중구감소증의 효과를 개선하기 위해 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 조합물의 효능은 수반되는 특정 질환 또는 장애에 따라 임의의 적합한 시험관내 검정법, 세포-기반 검정법, 생체내 검정법 및/또는 그 자체로 알려진 동물 모델, 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 시험될 수 있다. 적합한 검정법 및 동물 모델은 당업자에게 명백할 것이다.
당업자는 일반적으로 적합한 시험관내 또는 생체내 검정법, 세포 검정법 또는 동물 모델을 선택하여 본 발명에 따른 VHH, 또는 이의 단편을 인간 및/또는 뮤린 FAP에 대한 결합뿐만 아니라, 하나 이상의 암-관련 질환 및 섬유성 장애에 관한 치료 및/또는 예방 효과에 대하여 시험할 수 있을 것이다. 그러한 검정법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 영상화 검정법일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '유효량'은 원하는 결과 또는 결과들을 달성하는 데 필요한 양을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '결정하는', '측정하는', '평가하는', '모니터링하는' 및 '분석하는'은 호환 가능하게 사용되며, 정량적 및 정성적 결정 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '예방 및/또는 치료'는 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태를 예방 및/또는 치료하는 것, 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 발병을 예방하는 것, 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 진행을 늦추거나 역전시키는 것, 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 발병을 예방하거나 늦추는 것, 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 완화시키는 것, 특정 질환 및/또는 장애 및/또는 병태의 중증도 및/또는 지속 기간을 감소시키는 것, 그리고 일반적으로 치료될 대상체 또는 환자에게 유익한 본 발명에 따른 조합물의 임의의 예방 또는 치료 효과를 포함한다.
암, 종양, 전이 세포
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '종양 세포'는 원발성 또는 전이성 종양 병변에 존재하는 세포를 지칭한다. 이러한 맥락에서, 종양은 암 세포로 이루어질 뿐만 아니라, 형질전환된 세포와 비-형질전환 세포 사이에 복잡한 양방향 상호작용이 존재하는 장기-유사 구조로서 간주되어야 한다. 형질전환된 세포의 악성 잠재력은 섬유아세포, 지방세포, 혈액 및 림프관으로 이루어질 수 있지만 또한 광범위한 면역 세포에 의해 상당히 침윤될 수 있는 기질로부터 적절한 지지 구조를 필요로 한다. 본 발명의 맥락 내에서, 종양 세포는 또한 섬유아세포, 바람직하게는 CAF일 수 있다.
"고형 종양(들)" 또는 "종양(들)"은 원발성 종양 및/또는 전이(위치에 관계없음)를 의미한다. 고형암 및 고형 종양이라는 용어는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 고형 종양의 예로는 육종, 암종, 및 림프종이 있다. 육종의 예로는 골육종 또는 골원성 육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종, 중피 육종 또는 중피종, 섬유육종, 혈관육종 또는 혈관내피종, 지방육종, 신경아교종 또는 성상세포종, 점액육종, 및 중간엽종 또는 혼합 중배엽종이 있다. 암종의 예로는 선암종 및 편평세포 암종이 있다. 림프종의 예로는 비-호지킨 림프종 및 호지킨 림프종이 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '암 세포'는 성장이 제어되지 않으면서 비정상적이고 무한하게 분열하고 번식하며, 떨어져 나가서 신체의 다른 부분으로 이동하고 전이로 지칭되는 또 다른 부위를 설정할 수 있는 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 '병변'은 상해 또는 질환으로 인한 신체 조직 또는 장기의 비정상적인 변화를 지칭할 수 있다. 암 용어에서, 병변은 통상적으로 종양을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 '원발성 종양(들)'은 종양 진행이 시작되고 진행되어 암성 덩어리를 생성하는 해부학적 부위에서 성장하는 종양이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 '전이성 병변(들)'은 원래 위치에서 신체의 다른 부분으로 퍼진 악성, 또는 암성의 종양을 지칭한다. 호환 가능하게 사용될 수 있는 관련된 의학 용어는 후기 암, 진행성 암, 또는 전이성 질환을 포함한다. 일반적으로, 전이성 병변은 치료가 불가능한 것으로 간주되지만, 암성 세포의 확산을 제어하고 개인의 기대 수명을 잠재적으로 증가시키는 치료가 종종 이용 가능하다.
전이는 신체의 원래 부위를 넘어 암이 퍼지는 것에 대한 용어이다. 따라서, 전이성 병변은 원발성 종양의 원래 시작점과 떨어진 위치에서 발견되는 암성 종양이다. 전이성 종양은 원발성 종양 유래의 세포가 떨어져 나와 림프계 및 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 이동할 때 발생한다. 대안적으로, 원래 종양 유래의 세포는 인접한 장기 또는 조직에서 새로운 종양을 뿌릴 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 '전이성 질환'은 말기 암으로 지칭되며, 암의 의학적 분류는 암 세포가 원래 종양 근처의 림프절에서 발견되는 경우 III기인 것으로 지칭되거나, 암 세포가 원발성 종양 부위를 넘어 신체의 먼 부위로 이동한 경우 IV기로 지칭된다. 전이성 병변은 뇌, 폐, 간, 또는 뼈에서 가장 흔하게 발견된다. 전이성 암이 있는 개체는 임의의 증상을 경험할 수 있거나 경험하지 않을 수 있고, 증상은 전이된 세포가 재배치된 영역과 관련될 수 있다. 일단 전이성 병변이 신체에 존재하면, 개체의 암은 대부분의 암 유형에 대해 불치인 것으로 간주될 것이다. 이는 이용 가능한 치료로 기존의 모든 암 세포를 근절시키는 것이 매우 어렵다는 것을 의미한다. 이 경우에, 치료 목표는 종양의 성장을 늦추어 가능한 최고의 삶의 질을 유지하고 잠재적으로 개체의 기대 수명을 연장하는 것이다. 일부 경우에, 전이성 병변이 있는 사람은 증상 관리를 위한 적절한 치료를 받으면 수년 동안 살 수 있다.
방사성 핵종
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 '방사성 핵종', '방사능 핵종', '방사성 동위원소', '방사능 동위원소'는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 핵 내부에 또는 내부 전환을 통해 새로 형성된 방사선 입자로 부여될 이용 가능한 과도한 에너지로 특성화되는 불안정한 핵이 있는 원자를 지칭한다. 이러한 과정 동안, 방사성 핵종은 방사능 붕괴를 겪어 감마선(들), 및/또는 아원자 입자, 예컨대 알파 또는 베타 입자의 방출을 초래한다고 한다. 이러한 방출은 이온화 방사선을 구성한다. 방사성 핵종은 자연적으로 발생하거나 인위적으로 생산될 수 있다.
IHC 기법
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 '면역조직화학(IHC)'은 생물학적 조직 절편의 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 원리를 활용함으로써 조직 절편 세포에서 항원(예를 들어, 단백질)을 검출하는 과정을 지칭한다. 면역조직화학적 염색은 비정상적인 세포, 예컨대 암성 종양에서 발견되는 세포의 진단에 광범위하게 사용된다. IHC는 또한 생물학적 조직의 상이한 부분에서 바이오마커 및 차별적으로 발현되는 단백질의 분포 및 위치를 이해하기 위한 기초 연구에서 광범위하게 사용된다.
본 명세서에 인용된 모든 문서는 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 기술 및 과학 용어를 비롯하여 본 발명을 개시하는 데 사용된 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 추가 지침에 의해, 용어 정의는 본 발명의 교시내용을 더 잘 이해하기 위해 포함된다. 본 명세서에 기재된 각각의 구현예는 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 임의의 다른 구현예와 함께 조합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되는 하기 실시예에 의해 추가로 기재된다.
실시예
실시예에서, 다음 VHH가 사용된다:
실시예 1: 사전 표적화 전략을 사용한 177 Lu-VHH1에 대한 지연 시간의 최적화
이 실시예는 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1의 생체 분포를 기재하며, 여기서 트랜스사이클로옥탄(TCO)으로 작용화된 VHH1과, 177Lu-DOTA-PEG7-Tz는 건강한 C57BL/6 마우스에 순차적으로 정맥 주사(i.v.)로 투여된다. 여기서, 본 발명자들은 2가지 화합물의 순차적 투여 사이의 상이한 지연 시간을 고려할 때 장기 및 조직 흡수의 잠재적인 차이를 평가하였다: (1) TCO-VHH1 및 (2) 177Lu-DOTA-PEG7-Tz. 이를 위해, 건강한 C57BL/6 마우스에게 50 μg(4 nmol) TCO-VHH1을 먼저 i.v. 투여한 후, 50 μCi(± 5 μg, 2 nmol) 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 투여하였다. 4가지의 상이한 지연 시간(30분, 2, 8 및 24시간)을 평가하였다. 결과로 나온 생체분포를 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 단독 및 177Lu-DOTA-VHH1에 대해 얻은 결과와 비교하였다. 다음으로, 주사 후 최대 4시간까지 경추탈구로 마우스를 안락사시키고, 해부한 후 여러 장기 및 조직을 수집하였다. 관심이 있는 장기 및 조직의 무게를 측정하고 주사 표준물과 함께 자동 감마 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다. 결과를 주사된 활성(IA)/조직(g)의 %로서 표현하였다.
사전 표적화 전략을 사용하면 177Lu-DOTA-VHH1의 신장 저류와 비교하여(표 7 및 도 2A), 모든 지연 시간을 평가한 177Lu-VHH1 신장 저류의 상당한 감소를 초래하였다(P < 0.0001)(표 6, 도 1의 A 내지 D 및 도 3의 A 내지 C). 177Lu-DOTA-VHH1의 투여는 1시간 후 82.8 ± 15.7%IA/g의 신장 흡수를 초래한 반면, 30분의 지연 시간으로 사전 표적화 전략을 이용하면, 신장 흡수의 3배 감소가 관찰되었다(주사 후 1시간째에 29.4 ± 3.9%IA/g). 더 긴 지연 시간(2, 8, 및 24시간)은 신장에 저류하는 방사능 양을 추가로 감소시켰다. 더 긴 지연 시간(2, 8 및 24시간)은 30분의 더 짧은 지연 시간과 비교하여 유의하게 더 낮은 신장 저류를 초래한다(P < 0.0001)(도 3의 A 내지 C). 지연 시간이 2, 8 및 24시간인 경우, 177Lu-DOTA-VHH1에 대해 관찰된 신장 흡수와 비교하여, 신장 흡수의 10배 감소가 관찰되었다. 후자의 지연 시간 사이에서 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1 신장 저류의 상당한 차이가 관찰되지 않았다(P > 0.59)(도 3의 A 내지 C). 더욱이, 2 내지 24시간 사이의 지연 시간을 적용할 때 신장 흡수는 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 단독의 신장 흡수와 유사하였다(P > 0.59)(표 8, 도 2. VHH1 및 도 3의 A 내지 C). 이 관찰에 기반하면, 2시간 초과의 지연 시간에서는 TCO-VHH1이 신장에서 177Lu-DOTA-PEG7-Tz와 상호작용하기에 적절한 양으로 더 이상 이용 가능하지 않은 것으로 보인다. 이 결과에 기반하면, 신장에서 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1의 저류를 감소시키기 위한 TCO-VHH1 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz의 투여 사이의 최적 지연 시간은 2 내지 8시간인 것으로 정의되는 것으로 보인다.
i.v. 주사 후 최대 4시간까지 177Lu-DOTA-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 데이터는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현되며, 평균 ± SD(n = 5)으로 제시되어 있다.
30분 1시간 4시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 1.69 0.37 0.89 0.06 0.26 0.06
심장 0.47 0.07 0.32 0.02 0.15 0.04
폐 1.04 0.30 0.66 0.05 0.23 0.04
간 0.88 0.20 0.81 0.04 0.83 0.14
비장 0.54 0.05 0.41 0.05 0.36 0.08
췌장 0.64 0.06 0.63 0.26 0.25 0.04
위 0.38 0.07 0.45 0.17 0.14 0.02
소장 0.57 0.26 0.45 0.05 0.18 0.04
대장 0.33 0.04 0.31 0.06 0.66 0.15
신장 82.75 15.68 82.36 6.31 63.74 3.79
근육 0.58 0.04 0.45 0.21 0.21 0.04
뼈 1.48 0.09 1.27 0.13 0.95 0.25
피부 1.99 0.26 1.30 0.16 0.87 0.09
꼬리 4.89 2.90 3.74 2.52 1.21 0.67
조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된, i.v. 주사 후 최대 4시간까지 177Lu-DOTA-PEG7-Tz에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
30분 1시간 4시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 4.06 0.87 1.39 0.13 0.25 0.03
심장 1.31 0.11 0.46 0.03 0.10 0.00
폐 2.24 0.26 0.84 0.09 0.28 0.01
간 1.19 0.21 0.56 0.07 0.24 0.01
비장 0.82 0.02 0.32 0.04 0.11 0.03
췌장 0.73 0.11 0.39 0.26 0.06 0.01
위 0.79 0.15 0.22 0.08 0.34 0.20
소장 1.66 0.18 1.40 0.46 0.17 0.05
대장 0.51 0.03 0.66 0.50 1.76 0.05
신장 7.18 0.27 3.15 0.47 1.12 0.06
근육 0.77 0.27 0.30 0.21 0.04 0.01
뼈 1.03 0.24 0.30 0.06 0.06 0.01
피부 2.43 0.32 0.61 0.03 0.11 0.04
꼬리 3.18 0.15 2.20 0.84 0.21 0.05
실시예 2: 사전 표적화 전략을 사용한 TCO-VHH1의 투여 질량의 최적화
이 실시예는 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1의 생체 분포를 기재하며, 여기서 트랜스사이클로옥탄(TCO)으로 작용화된 VHH1과, 177Lu-DOTA-테트라진(Tz)은 건강한 C57BL/6 마우스에 순차적으로 정맥 주사(i.v.)로 투여된다. 여기서, 본 발명자들은 TCO-VHH의 투여 질량을 변화시킬 때 장기 및 조직 흡수의 잠재적인 차이를 평가하였다. 이를 위해, 건강한 C57BL/6마우스에게 4가지 상이한 질량으로 TCO-VHH1을 i.v. 주사하였다: 0.8 - 1.6 - 4 - 16 nmol에 해당하는 10 - 20 - 50 - 200 μg. TCO-VHH1을 i.v. 투여하고 8시간 후, 동물을 10 - 20 - 50 - 200 μCi(0.4 - 0.8 - 2 - 8 nmol에 해당함)의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz로 처리하였다. 결과로 나온 177Lu-VHH1의 생체분포를 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 50 μCi(± 2 nmol) 단독의 생체분포와 비교하였다. 다음으로, 주사 후 최대 4시간까지 경추탈구로 마우스를 안락사시키고, 해부한 후 여러 장기 및 조직을 수집하였다. 관심이 있는 장기 및 조직의 무게를 측정하고 주사 표준물과 함께 자동 감마 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다. 결과를 주사된 활성(IA)/조직(g)의 %로서 표현하였다.
TCO-VHH1의 투여 질량을 변화시키는 것은(10 내지 200 μg) 주사 후 30분째에 신장에서의 방사능 흡수에 영향을 미치지 않았다(도 4의 A). 예를 들어, TCO-VHH1(10 내지 200 μg) 다음 177Lu-DOTA-PEG7-Tz(8시간의 지연 시간)는 항상 표 9에 나타낸 바와 같이 177Lu-DOTA-PEG7-Tz의 주사 후 30분째에 약 7%IA/g의 신장 흡수를 초래하였다. 더욱이, 이는 주사 후 30분째에 177Lu-DOTA-PEG7-Tz 단독(표 10; 7.0 ± 0.27%IA/g)에 대해 관찰된 것과 유사하였다. 주사 후 1시간째부터 시작하여, 더 적은 질량의 TCO-VHH1(예를 들어, 10 내지 20 μg)의 주사와 비교하여 더 많은 주사량의 TCO-VHH1(예를 들어, 50 내지 200 μg)에 대해 유의하게 더 낮은 신장 흡수가 관찰되었다(P < 0.0001)(도 4의 B, C). 이 데이터는 더 많은 TCO-VHH1 투여 질량이 사전 표적화 전략을 사용하여 생성된 177Lu-VHH1의 신장 흡수에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된, i.v. 주사 후 최대 4시간까지 177Lu-DOTA-PEG7-Tz에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
30분 1시간 4시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 4.06 0.87 1.39 0.13 0.25 0.03
심장 1.31 0.11 0.46 0.03 0.10 0.00
폐 2.24 0.26 0.84 0.09 0.28 0.01
간 1.19 0.21 0.56 0.07 0.24 0.01
비장 0.82 0.02 0.32 0.04 0.11 0.03
췌장 0.73 0.11 0.39 0.26 0.06 0.01
위 0.79 0.15 0.22 0.08 0.34 0.20
소장 1.66 0.18 1.40 0.46 0.17 0.05
대장 0.51 0.03 0.66 0.50 1.76 0.05
신장 7.18 0.27 3.15 0.47 1.12 0.06
근육 0.77 0.27 0.30 0.21 0.04 0.01
뼈 1.03 0.24 0.30 0.06 0.06 0.01
피부 2.43 0.32 0.61 0.03 0.11 0.04
꼬리 3.18 0.15 2.20 0.84 0.21 0.05
실시예 3: 사전 표적화 전략을 사용한 177 Lu-VHH1의 장기 생체분포 및 종양 표적화
이 실시예는 자연적으로 인간 FAP를 발현하는 인간 교모세포종 종양(U-87 MG)을 가지는 마우스에서 i.v. 주사 후 4일에 걸쳐 평가한 TCO-VHH1 및 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 사용한 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 종양 표적화 잠재력을 설명한다. 이를 위해, 무흉선 누드 마우스(n=시점당 5마리)에 인간 FAP-발현 U-87 MG 세포를 목에 피하로 접종하였다. 종양 성장(150 내지 250 mm3)을 검증한 후, 마우스에게 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1을 먼저 i.v. 주사한 후 약 80 μCi(± 5 μg)의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 i.v. 주사하였다. 4시간과 8시간의 2가지 상이한 지연 시간을 동시에 평가하였다. 사전 표적화 전략을 사용하여 결과로 나온 177Lu-VHH1의 생체분포를 177Lu-DOTA-VHH1(80 μCi; ± 5 μg)로 수득한 생체분포와 비교하였다. 다음으로, 주사 후 최대 96시간까지 경추탈구로 마우스를 안락사시키고, 해부한 후 여러 장기 및 조직을 수집하여 무게를 측정하고, 이어서 주사 표준물과 함께 자동 감마 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다. 결과를 주사된 활성(IA)/조직(g)의 %로서 표현하였다.
사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1의 경우(표 11 및 표 12) 177Lu-DOTA-VHH1로 얻은 생체분포(표 13)와 비교하여 신장에서의 방사능 양이 항상 유의하게 더 낮았으며(P < 0.0001), 177Lu-VHH1(4시간 지연 시간)의 경우 주사 후 1시간째에 흡수 값이 6.76 ± 0.87이고 177Lu-VHH1(8시간 지연 시간)의 경우 주사 후 1시간째에 3.12 ± 0.75인 반면 177Lu-DOTA-VHH1의 경우 동일한 시점에서 45.70 ± 13.40%IA/g이었다(도 5의 A). 신장에서의 흡수는 모든 시점에서 더 낮았지만, 사전 표적화 전락을 사용하여 177Lu-VHH1(4시간 지연 시간)에 대해 얻은 값과 비교하여 177Lu-VHH1(8시간 지연 시간)에 대하여 유의한 차이는 없었다(P > 0.384)(도 5의 A).
종양에서의 흡수는 177Lu-VHH1(4시간 지연 시간)의 경우 1시간 후에 7.36 ± 1.64%IA/g이고 177Lu-VHH1(8시간 지연 시간)의 경우 1시간 후에 8.24 ± 0.94%IA/g으로 측정되었으며, 이는 177Lu-DOTA-VHH1로 얻은 8.52 ± 2.88%IA/g의 값과 유의한 차이가 없었다(P = 0.452)(도 5의 B). 모든 다른 장기 및 조직에서의 흡수는 사전 표적화 전략을 사용한 177Lu-VHH1에 대하여 모든 시점에서 낮았다. 얻은 흡수 값으로부터, 시간 경과에 따른 해당 종양-대-신장(T/K) 비율을 계산하였다(표 11, 12 및 13). 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1(4시간 및 8시간 지연 시간)로 얻은 T/K 비율은 항상 177Lu-DOTA-VHH1에 대해 계산된 비율보다 높았으며(도 5의 C), 이는 시간 경과에 따라 177Lu-VHH1의 종양 표적화 잠재력을 유지하면서 신장 저류 감소에 대한 사전 표적화 전략의 유익한 효과를 반영한다. 8시간 지연 시간이 있는 177Lu-VHH1에 대한 T/K는 4시간 지연 시간이 있는 177Lu-VHH1에 대해 얻은 값과 비교하여 항상 유의하게 더 높았다(P < 0.0027)(도 5의 B).
4시간의 지연 시간을 사용하여 i.v. 주사 후 최대 96시간까지 사전 표적화 전략을 사용하는 177Lu-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 값은 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
1시간 3시간 24시간 96시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 0.68 0.13 0.30 0.07 0.04 0.01 0.01 0.01
심장 0.26 0.07 0.19 0.03 0.09 0.01 0.05 0.01
폐 0.83 0.07 0.54 0.14 0.31 0.05 0.25 0.04
간 0.43 0.04 0.30 0.09 0.24 0.02 0.16 0.02
비장 0.37 0.04 0.30 0.11 0.16 0.02 0.11 0.03
췌장 0.24 0.04 0.17 0.04 0.06 0.01 0.03 0.01
위 0.32 0.14 0.20 0.05 0.06 0.01 0.07 0.01
소장 0.75 0.21 0.40 0.14 0.06 0.01 0.06 0.01
대장 0.26 0.04 0.43 0.08 0.09 0.01 0.10 0.02
신장 6.76 0.87 6.48 1.74 6.58 0.88 1.42 0.22
근육 0.30 0.04 0.17 0.04 0.08 0.01 0.03 0.01
뼈 1.26 0.88 0.22 0.12 0.15 0.05 0.05 0.02
관절 1.17 0.13 0.69 0.16 0.37 0.05 0.12 0.03
피부 0.67 0.04 0.44 0.08 0.24 0.02 0.12 0.01
종양 7.36 1.64 6.50 0.94 6.18 1.90 1.97 0.33
종양-신장 비율 1.08 0.25 1.05 0.26 0.94 0.27 1.41 0.29
8시간의 지연 시간을 사용하여 i.v. 주사 후 최대 96시간까지 사전 표적화 전략을 사용하는 177Lu-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 값은 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
1시간 3시간 24시간 96시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 0.59 0.06 0.36 0.02 0.05 0.01 0.01 0.00
심장 0.24 0.04 0.20 0.11 0.10 0.03 0.06 0.02
폐 0.67 0.08 0.58 0.22 0.33 0.10 0.29 0.04
간 0.35 0.04 0.30 0.03 0.20 0.07 0.17 0.03
비장 0.30 0.04 0.23 0.07 0.18 0.07 0.11 0.01
췌장 0.15 0.03 0.13 0.03 0.06 0.02 0.03 0.01
위 0.25 0.09 0.16 0.07 0.10 0.04 0.10 0.02
소장 0.88 0.31 0.17 0.07 0.09 0.02 0.09 0.05
대장 0.19 0.07 0.42 0.05 0.11 0.03 0.09 0.02
신장 3.12 0.75 3.57 0.47 2.65 0.78 0.82 0.26
근육 0.20 0.05 0.19 0.07 0.05 0.02 0.04 0.01
뼈 0.34 0.20 0.28 0.07 0.05 0.03 0.03 0.04
관절 0.74 0.22 0.57 0.06 0.26 0.10 0.17 0.02
피부 0.64 0.07 0.46 0.07 0.20 0.08 0.14 0.02
종양 8.24 0.94 6.72 0.71 5.04 1.04 2.34 0.33
종양-신장 비율 2.73 0.50 1.89 0.18 1.95 0.33 3.08 1.07
조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된, i.v. 주사 후 최대 96시간까지 177Lu-DOTA-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
1시간 24시간 96시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 1.20 0.39 0.02 0.01 0.00 0.00
심장 0.38 0.05 0.05 0.01 0.02 0.01
폐 0.66 0.12 0.05 0.01 0.01 0.00
간 0.46 0.04 0.36 0.10 0.12 0.02
비장 0.32 0.07 0.27 0.09 0.05 0.01
췌장 0.61 0.12 0.05 0.01 0.02 0.00
위 0.57 0.34 0.04 0.01 0.02 0.01
소장 0.46 0.26 0.08 0.02 0.02 0.00
대장 0.28 0.03 0.21 0.13 0.04 0.00
신장 45.70 13.40 26.03 3.18 5.49 1.39
근육 0.69 0.18 0.08 0.03 0.02 0.01
뼈 1.15 0.17 0.34 0.09 0.08 0.02
관절 2.37 0.36 0.60 0.09 0.22 0.09
피부 1.88 0.33 0.33 0.03 0.06 0.02
종양 8.52 2.88 10.64 1.66 3.77 0.99
종양-신장 비율 0.19 0.02 0.42 0.09 0.71 0.21
실시예 4: 사전 표적화 전략을 사용한 177 Lu-VHH1의 생체분포에 대한 177 Lu-DOTA-PEG 7 -Tz의 비활성 증가의 영향.
이 실시예에서 본 발명자들은 사전 표적화 전략을 사용하여 177Lu-VHH1의 결과로 나온 생체분포에 대한 177Lu-DOTA-PEG7-Tz의 비활성의 영향을 설명한다. 이를 위해, 낮은 비활성 및 높은 비활성 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 사용하는 177Lu-VHH1의 생체분포 및 종양 표적화를 인간 FAP를 발현하는 종양이 있는 마우스에서 평가하였다. 두 경우 모두, 확립된 작은 종양을 가지는 마우스에게 먼저 꼬리 정맥을 통해 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1을 주사하였다. TCO-VHH1의 투여 4시간 후 ± 80 μCi 또는 ± 500 μCi의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 다음으로, 주사 후 최대 96시간까지 경추탈구로 마우스를 안락사시키고, 해부한 후 여러 장기 및 조직을 수집하였다. 관심이 있는 장기 및 조직의 무게를 측정하고 주사 표준물과 함께 자동 감마 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다. 결과를 주사된 활성(IA)/조직(g)의 %로서 표현하였다. 얻은 업데이트 값을 사용하여 두 조건 모두에 대한 각각의 곡선 하 면적을 계산하였다.
높은 비활성 177Lu-DOTA-PEG7-Tz의 사용은 표 16 및 도 6c에서 강조된 바와 같이 여러 장기 및 조직에서 곡선 하 면적(AUC)의 상당한 증가를 초래하였다(혈액, 심장, 비장, 소장 및 췌장의 경우 P < 0.001). 그러나 이러한 증가하는 흡수 값 중 어느 것도 사전 표적화 전략에 대한 높은 비활성 177Lu-DOTA-PEG7-Tz의 사용을 방해하지 않는다. 더욱이, 종양(P = 0.706) 및 신장(P = 0.850)에서 흡수 값 및 결과 AUC는 두 조건 모두에서 매우 유사하여, 177Lu-VHH1의 치료적 양을 가능하게 하였다(표 14, 15, 16 및 도 6).
4시간의 지연 시간과 ± 50 μCi의 높은 비활성의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 사용하여 i.v. 주사 후 최대 96시간까지 사전 표적화 전략을 사용하는 177Lu-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 결과는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
1시간 3시간 24시간 96시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 0.68 0.13 0.30 0.07 0.04 0.01 0.01 0.01
심장 0.26 0.07 0.19 0.03 0.09 0.01 0.05 0.01
폐 0.83 0.07 0.54 0.14 0.31 0.05 0.25 0.04
간 0.43 0.04 0.30 0.09 0.24 0.02 0.16 0.02
비장 0.37 0.04 0.30 0.11 0.16 0.02 0.11 0.03
췌장 0.24 0.04 0.17 0.04 0.06 0.01 0.03 0.01
위 0.32 0.14 0.20 0.05 0.06 0.01 0.07 0.01
소장 0.75 0.21 0.40 0.14 0.06 0.01 0.06 0.01
대장 0.26 0.04 0.43 0.08 0.09 0.01 0.10 0.02
신장 6.76 0.87 6.48 1.74 6.58 0.88 1.42 0.22
근육 0.30 0.04 0.17 0.04 0.08 0.01 0.03 0.01
뼈 1.26 0.88 0.22 0.12 0.15 0.05 0.05 0.02
관절 1.17 0.13 0.69 0.16 0.37 0.05 0.12 0.03
피부 0.67 0.04 0.44 0.08 0.24 0.02 0.12 0.01
종양 7.36 1.64 6.50 0.94 6.18 1.90 1.97 0.33
종양-신장 비율 1.08 0.25 1.05 0.26 0.94 0.27 1.41 0.29
4시간의 지연 시간과 ± 500 μCi의 높은 비활성의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 사용하여 i.v. 주사 후 최대 96시간까지 사전 표적화 전략을 사용하는 177Lu-VHH1에 대한 여러 장기 및 조직에서의 흡수 값. 결과는 조직 그램당 주사된 활성 %(%IA/g)로 표현된다. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시되어 있다.
1시간 3시간 24시간 96시간
장기/조직 평균 SD 평균 SD 평균 SD 평균 SD
혈액 2.51 0.38 1.13 0.12 0.19 0.02 0.03 0.01
심장 0.79 0.27 0.43 0.04 0.14 0.01 0.06 0.02
폐 1.21 0.24 0.90 0.15 0.40 0.05 0.25 0.10
간 0.68 0.13 0.55 0.02 0.28 0.03 0.14 0.05
비장 0.55 0.10 0.38 0.05 0.27 0.04 0.15 0.04
췌장 0.50 0.14 0.31 0.05 0.09 0.01 0.04 0.01
위 0.44 0.12 0.75 0.41 0.15 0.03 0.11 0.06
소장 0.81 0.09 1.01 0.20 0.12 0.02 0.07 0.02
대장 0.28 0.03 0.77 0.17 0.21 0.07 0.15 0.06
신장 5.64 0.56 7.25 1.29 4.74 1.00 1.52 0.57
근육 0.47 0.09 0.31 0.12 0.08 0.01 0.04 0.02
뼈 0.62 0.18 0.46 0.14 0.18 0.06 0.06 0.02
관절 1.19 0.21 0.97 0.28 0.35 0.08 0.15 0.08
피부 0.95 0.11 0.75 0.15 0.29 0.02 0.14 0.06
종양 7.04 1.35 7.15 0.71 6.49 1.25 2.04 0.65
종양-신장 비율 1.24 0.17 1.00 0.12 1.41 0.37 1.42 0.37
높은 분자 활성(약 500 μCi) 또는 낮은 분자 활성(약 80 μCi)의 177Lu-DOTA-PEG7-Tz를 사용한 사전 표적화 전략을 사용하는 177Lu-VHH1에 대한 곡선 하 면적(AUC) 결과.
사전 표적화 4시간 지연 시간
낮은 분자 활성 높은 분자 활성
장기/조직 평균 SEM 평균 SEM
혈액 6.08 0.90 25.42 1.562
심장 8.47 0.63 14.41 0.9539
폐 29.96 2.37 39.16 4.363
간 21.12 1.04 25.07 2.137
비장 14.91 1.13 22.88 2.147
췌장 6.23 0.71 9.69 0.7536
위 8.725 0.58 20 4.965
소장 9.13 0.94 20.53 2.354
대장 16.23 2.29 24.3 3.843
신장 373.10 25.09 364.1 44.86
근육 7.87 0.80 9.195 1.506
뼈 12.04 1.57 16.44 2.79
관절 32.48 3.38 34.02 5.11
피부 19.64 1.66 28.1 2.78
종양 440.70 37.07 464.5 52.94
실시예 5: 사전 표적화 225 Ac-VHH1의 치료 잠재력.
이 실시예는 사전 표적화 전략을 사용하여 TCO-VHH1 및 225Ac-DOTA-PEG7-Tz의 생체내 커플링으로 얻은 사전 표적화 225Ac-VHH1의 치료 잠재력을 설명하며, 이는 FAP-발현 인간 교모세포종 종양(U87 MG) 이종이식 마우스에서 종양 성장을 억제하는 능력을 측정하여 평가하였다. 확립된 작은 종양(50 내지 80 mm3)을 가지는 마우스를 3주에 걸쳐 6회 연속하여 처리하였다. 사전 표적화 전략을 사용한 2개 그룹에 먼저 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1을 i.v. 주사한 후, (i) 고선량(2.70 μCi; ± 3.5 μg) 또는 (ii) 저선량(0.54 μCi; ± 3.5 μg)의 225Ac-DOTA-PEG7-Tz를 i.v. 주사하였다. 제1 주사(TCO-VHH1)와 제2 주사(225Ac-DOTA-PEG7-Tz) 사이의 지연 시간은 8시간이었다. 사전 표적화 전략으로 i.v. 주사한 마우스에서 얻은 평균 생존율을 (i) 직접 표지된 225Ac-DOTA-VHH1(0.54 μCi; ± 5 μg), 또는 (ii) 직접 표지된 무관한 225Ac-DOTA-R3B23(0.54 μCi; ± 5 μg)을 i.v. 주사한 마우스의 평균 생존율과 비교하였다. 마지막 그룹은 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1만 투여받았다. 종양 부피 및 동물 체중을 반복하여 측정하였다. 다음 평가변수 중 하나에 도달하였을 경우, 중간탈락으로 간주하였다: 피하 종양의 경우 (i) 1500 mm3 초과의 종양 크기, (ii) 20% 초과의 체중 감소 또는 (iii) 괴사성 종양 조직의 존재.
고선량의 사전 표적화 225Ac-VHH1로 처리한 마우스는 종양 성장을 효과적으로 감소시킬 수 있고(도 7B) 225Ac-DOTA-R3B23(p = 0.01, 로그-순위 맨텔-콕스 검정(Log-rank Mantel-cox test)) 또는 비히클 용액(p = 0.01, 로그-순위 맨텔-콕스 검정)으로 처리한 마우스와 비교하여 현저하게 더 오래 살았다(도 7A). 더욱이, 이들 그룹 간에 체중 감소에 있어서는 유의한 차이가 관찰되지 않았으며(도 7C), 이는 상이한 활성의 225Ac-VHH1을 주사한 후 급성 독성 징후가 존재하지 않았음을 나타낸다. 높은 방사능 수준(고선량)의 사전 표적화 225Ac-VHH1로의 처리는 도 7A 및 7B에 도시된 바와 같이 낮은 방사능 수준(저선량)의 사전 표적화 225Ac-VHH1과 비교하여 더 효과적이었다(p < 0.0001, 로그-순위 맨텔 콕스 검정). 실제로, 직접 표지된 225Ac-DOTA-VHH1을 주사한 마우스는 저선량 사전 표적화 225Ac-VHH1을 주사한 마우스와 비교하여 현저하게 더 오래 살았으며, 이는 사전 표적화가 직접 표지화 전략과 동일한 치료 효과를 얻기 위해 더 높은 수준의 방사능 투여를 필요로 한다는 것을 시사한다.
결론적으로, 사전 표적화 225Ac-VHH1은 어떠한 급성 독성의 관련 징후 없이 FAP+ 발현 종양 이종이식 마우스 모델에서 효과적이다.
실시예 6: 사전-표적화 225 Ac-VHH1로 처리된 건강한 암컷 C57Bl/6 마우스의 장기 독성학적 추적 조사
이 실시예는 사전-표적화 225Ac-VHH1로 처리된 건강한 암컷 C57Bl/6 마우스의 장기 독성학적 추적 조사를 설명한다. 처리된 마우스의 건강 상태를 6개월 동안 평가하며, 이 후 마우스를 희생시켜 전체 조직병리학적 분석을 위해 처리한다. 이를 위해, 건강한 암컷 C57Bl/6에게 0, 4, 7, 11, 14 및 18일째에 6회 연속 주사를 통해 사전 표적화 225Ac-VHH1 및 직접 표지된 225Ac-DOTA-VHH1을 i.v. 주사하였다. 사전 표적화 화합물을 받은 그룹에 먼저 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1을 i.v. 주사한 후, (i) 높은 방사능 선량(2.70 μCi; ± 3.5 μg) 또는 (ii) 낮은 방사능 선량(0.54 μCi; ± 3.5 μg)의 225Ac-DOTA-PEG7-Tz를 i.v. 주사하였다. 제1 주사(TCO-VHH1)와 제2 주사(225Ac-DOTA-PEG7-Tz) 사이의 지연 시간은 8시간이었다. 사전 표적화 화합물을 i.v. 주사한 마우스에서 얻은 평균 생존율 및 체중 감소를 (i) 직접 표지된 225Ac-DOTA-VHH1(0.54 μCi; ± 5 μg), 또는 (ii) 직접 표지된 무관한 225Ac-DOTA-R3B23(0.54 μCi; ± 5 μg)을 i.v. 주사한 마우스의 평균 생존율 및 체중 감소와 비교하였다. 마지막 그룹은 200 μg(16 nmol) TCO-VHH1만 투여받았다. 다음 평가변수 중 하나에 도달하였을 경우, 연구 중간탈락으로 간주하였다: (i) 갑작스러운 20% 초과의 체중 감소, (ii) 5 초과의 신체 상태 점수.
지금까지, 상이한 실험 그룹 간에 유의한 생존율 차이(도 8A) 또는 유의한 체중 감소는 관찰되지 않았다. 고선량의 사전 표적화 225Ac-VHH1을 받은 마우스의 평균 체중은 다른 그룹과 비교하여 약간 더 낮은 것으로 보이지만, 유의하게 더 낮은 것은 아니다(도 8B). 조직병리학적 분석을 6개월 후에 수행할 것이다.
결론적으로, 사전 표적화 225Ac-VHH1을 사용한 지속적인 독성 평가는 처리 개시 후 3개월까지 체중 증가에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 이는 사전 표적화 225Ac-VHH1이 안전하고, 급성 독성 징후를 야기하지 않으며, 높은 방사능량의 225Ac-표지 방사성의약품의 투여를 가능하게 함을 나타낸다.
실시예 7: 클릭 반응에 대한 최소 VHH 해리 속도 상수(koff) 결정
이 실시예는 상이한 해리 속도 상수(koff)로 동일한 표적에 결합하는 상이한 TCO 접합 VHH(TCO-VHH)의 비교 및 테트라진을 이용한 클릭 반응에 대한 해당 해리 속도 상수의 영향을 설명한다.
상이한 해리 속도 상수로 표적(인간 FAP)에 결합하는 5개의 VHH를 TCO-NHS에 접합시켰다. Octet 시스템에서 BLI 기술을 사용하여 TCO 접합 전 및 후 5개 VHH 각각에 대하여 인간 FAP에 대한 결합 동역학을 결정하였다. 하기 표는 이 실험의 결과를 나타내며, 이로부터 본 발명자들은 TCO 접합 전과 후의 해리 속도 상수가 유의하게 변하지 않았고, VHH에 TCO 그룹이 존재하여도 이의 결합 동역학을 유의하게 변경시키지 않는다는 결론을 내렸다.
접합 전 접합 후
VHH k on (1/Ms) k off (1/s) K D (M) k on (1/Ms) k off (1/s) K D (M)
VHH1 1.77E+06 8.52E-05 4.82E-11 6.94E+05 4.99E-05 7.19E-11
VHH6 3.41E+06 1.88E-04 5.51E-11 1.07E+06 1.57E-04 1.47E-10
VHH7 2.40E+06 1.97E-04 8.19E-11 7.46E+05 1.23E-04 1.66E-10
VHH8 1.01E+06 6.79E-04 6.72E-10 8.33E+05 5.59E-04 6.71E-10
VHH9 3.98E+06 1.80E-03 4.53E-10 1.26E+06 1.20E-03 9.51E-10
다음으로, Octet 스트렙타비딘(SA) 바이오센서를 검정 완충액(HBS + 0.5% BSA + 0.1% Tween20)에서 5분 동안 5 μg/mL 비오틴화 인간 FAP로 코팅하였다. 그 다음 센서를 20분 동안 여러 VHH(TCO 접합 및 비접합 대조군 모두)의 5 nM 용액을 포함하는 웰에 담그고(회합 단계) 추가로 30분 동안 검정 완충액으로 옮겼다(해리 단계). 지연 시간을 시뮬레이션하는 해리 단계 후, 센서를 50 nM의 테트라진-커플링, 비-FAP 결합 R3B23(Tz-R3B23)을 포함하는 웰 또는 대조군으로 검정 완충액을 포함하는 웰로 옮겼다. 이 반응을 20분(실험 1) 또는 30분(실험 2) 동안 진행시킨 후, 센서를 검정 완충액에서 30분 동안 세척하였다. 제2 실험에서는, TCO-VHH를 이중으로 측정하였다(하기 표에서는 '실험 2'의 검정 1 및 2로 지칭함).
그 다음 'Octet Analysis Software'의 에피토프 비닝 기능을 사용하여, 본 발명자들은 Tz-R3B23과 인큐베이션한 VHH 및 검정 완충액과 인큐베이션한 VHH 사이의 신호 차이를 결정하였다. 이 값은 스팬으로 지칭되며 하기 표에 표시되어 있다. 비접합 VHH의 스팬은 노이즈로 간주하였다. TCO-VHH가 노이즈의 스팬 값보다 더 높은 스팬 값을 나타낼 때, 본 발명자들은 클릭 반응이 일어났다고 결론을 내렸다.
실험 1 실험 2
1차 검정 		실험 2
2차 검정
VHH 스팬 스팬 스팬
VHH1 0.0089 0.0004
VHH6 0.0021 0.0017
VHH7 0.0082 0.0018
VHH8 0.0096 0.0028
VHH9 0.0040 -0.0008
TCO-VHH1 0.0237 0.0334 0.0257
TCO-VHH6 0.0230 0.0287 0.0229
TCO-VHH7 0.0145 0.0186 0.0230
TCO-VHH8 0.0224 0.0218 0.0341
TCO-VHH9 0.0015 0.0091 0.0113
두 실험 모두에서, 비접합 VHH8의 스팬(상기 표에서 굵은 글씨로 나타냄)이 가장 높았으며, 노이즈 값으로 결정하였다. '실험 1'에서, TCO-VHH9는 노이즈 값보다 낮은 유일한 값이었으며, 이는 TCO-VHH9에 대해서는 클릭 반응이 일어나지 않은 한편, 다른 4개의 VHH에 대해서는 클릭 반응이 일어났음을 나타낸다. '실험 2'에서, TCO-VHH9는 두 검정 모두에서 노이즈 값 바로 위의 스팬을 나타냈지만, 이 스팬은 검정에서 검출된 가장 낮은 것이었으며, 이는 TCO-VHH9가 분석한 모든 VHH 중에서 최악의 클릭 반응을 보였다는 것을 다시 나타낸다.
이 데이터로부터 본 발명자들은 TCO-VHH로 인간 FAP 표적을 사전 표적화하는 것은 해리 상수가 10-4 이하인 항원에 결합하는 VHH를 포함하는 것이 바람직하다는 결론을 내렸다.
실시예 8: hHER2 및 hFOLR1에 대한 사전 표적화
이 실시예는 인간 HER2(hHER2) 또는 인간 FOLR1(hFOLR1)을 표적화하는 TCO-접합 VHH에서 테트라진 접합 분자의 클릭 반응을 설명한다.
2가지 상이한 VHH, 즉 hFOLR1에 결합하는 VHH2 및 hHER2에 결합하는 VHH4를 NHS-TCO에 접합시켰다. 표면 플라즈몬 공명(Biacore)을 사용하여 본 발명자들은 앞서 VHH2 및 VHH8에 대해 기재한 바와 같이(EP3718574A1) 각각의 표적에 대한 비접합 및 TCO-접합 VHH(TCO-VHH)의 결합 동역학을 결정하였다. TCO 접합 후 VHH의 표적에 대한 VHH의 결합 동역학이 크게 감소한 경우, VHH는 추가 사전 표적화 실험에 적절하지 않았을 것이다. 표 19는 hFOLR1에 대한 VHH2와, hHER2에 대한 VHH4의 결합 동역학이 TCO 접합 후 거의 영향을 받지 않았음을 나타낸다. 이는 사전 표적화 적용에서 사용할 이러한 VHH와 이의 표적의 추가 탐색을 계속할 수 있게 하였다.
적절한 표적에 대한 TCO 접합 전과 후의 VHH의 결합 동역학.
접합 전 접합 후
VHH k on (1/Ms) k off (1/s) K D (M) k on (1/Ms) k off (1/s) K D (M)
VHH2 3.54E+06 1.67E-04 4.70E-11 2.61E+06 1.92E-04 7.34E-11
VHH4 2.22E+05 4.47E-04 2.01E-09 1.05E+05 7.91E-04 7.57E-09
다음으로, 클릭 반응을 SPR을 사용하여 검증하였다. 10 mM NaOAc pH 4.5 중 5 μg/mL 재조합 hHER2 또는 10 mM NaOAc pH 5.5 중 5 μg/mL 재조합 hFOLR1을 각각 740 반응 단위(RU) 및 250 RU의 목표 수준으로 Biacore Sensor Chip CM5에 고정화하였다. 클릭 반응을 검증하기 위해, 62.5 nM TCO-VHH4 또는 비접합 VHH4로 180초 동안 회합 단계를 시작한 후, 600초 동안 해리 단계를 수행하였다. VHH7 비닝 FOLR1의 경우, 5 nM의 VHH 농도를 사용하였고, 회합 및 해리 단계는 각각 450초 및 900초가 걸렸다. 클릭 반응을 유도하기 위해, Tz 커플링 R3B23(Tz-R3B23; R3B23은 hHER2 또는 hFOLR1에 결합하지 않음)을 350초 동안 유동 세포에 100배 몰 과량(6250 nM 또는 500 nM)으로 주사한 후, 해리 단계를 수행하였다. 클릭 반응에 대한 음성 대조군으로, 본 발명자들은 유동 세포에 Tz-R3B23 대신 검정 완충액(HBS)을 주사하였다. Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여, 본 발명자들은 Tz-R3B23 또는 음성 대조군 검정 완충액을 이용한 클릭 반응 전과 후의 상대 반응의 차이를 결정하였다. 이러한 차이는 이후 스팬으로 지칭된다. 표 20은 얻은 결과를 나타낸다.
각각의 표적에 결합된 TCO-VHH와 비접합 VHH에 테트라진 접합 클릭 리간드의 투여 시 Biacore에서 상대 반응의 스팬.
TCO-VHH 비접합 VHH
VHH 스팬 스팬
VHH2 12.3 RU 0.6 RU
VHH4 17.1 RU 1.0 RU
두 실험 모두에서 TCO-VHH의 스팬은 비접합 VHH와 비교하여 적어도 10배 더 높았으며, 이는 클릭 반응이 TCO-VHH가 표적에 결합되었을 때에만 일어나는 반면, 비접합 VHH가 표적에 결합되었을 때에는 일어나지 않았음을 나타낸다.
이러한 데이터로부터, 본 발명자들은 TCO-VHH가 hHER2 또는 hFOLR1에 결합되었을 때 테트라진 접합 분자에 특이적인 클릭 반응을 겪을 수 있다는 결론을 내렸다. 이는 본 발명자들이 사전 표적화 작업의 범주를 표적인 hHER2 및 hFOLR1로 확장할 수 있게 하였다.
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Claims (17)

  1. 약제로 사용하기 위한 클릭 그룹을 포함하는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편으로서, 상기 클릭 그룹은 상기 약제를 환자에게 투여 시 클릭 반응을 겪지 않았고, 바람직하게는 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것인, VHH, 또는 이의 단편.
  2. 클릭 그룹을 포함하는 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편으로서, 상기 VHH, 또는 이의 단편은 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 항원에 특이적으로 결합할 수 있고; 바람직하게는 약제로 사용하기 위한 것으로서, 상기 클릭 그룹은 상기 약제를 환자에게 투여 시 클릭 쌍을 형성하지 않았고, 더 바람직하게는 상기 항원과 연관된 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 것인, VHH, 또는 이의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 클릭 그룹은 알켄, 알킨, 아지드, 니트론, 또는 테트라진이고, 바람직하게는 상기 알켄은 트랜스-사이클로옥텐이며, 바람직하게는 상기 알킨은 BCN, BARAC 또는 DIBAC인, VHH, 또는 이의 단편.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 항원은 종양 세포의 표면 또는 종양 미세환경에 존재하는, VHH, 또는 이의 단편.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 인간 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 인간 엽산 수용체 알파(FOLR1), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)인, VHH, 또는 이의 단편.
  6. 암의 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한 조합물로서,
    - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 중쇄 항체로부터 유래된 중쇄 가변 도메인(VHH), 또는 이의 단편; 및
    - 표지 및 클릭 그룹을 포함하는 표지된 화합물
    을 포함하며;
    여기서 상기 VHH, 또는 이의 단편은 10-2 s-1 이하, 더 바람직하게는 10-3 s-1 이하, 가장 바람직하게는 10-4 s-1 이하의 해리 상수(koff)로 상기 암과 연관된 항원에 특이적으로 결합할 수 있고;
    상기 사용은 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 VHH, 또는 이의 단편을 제1 투여하는 것, 및 이후 상기 표지된 화합물을 후속 투여하는 것을 포함하고;
    상기 VHH, 또는 이의 단편에 포함되는 상기 클릭 그룹은 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹과 클릭 쌍을 형성하는, 조합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹은 알켄, 알킨, 아지드, 니트론, 또는 테트라진이고, 바람직하게는 상기 알켄은 트랜스-사이클로옥텐이거나 상기 알킨은 BCN, BARAC 또는 DIBAC이며, 더 바람직하게는 상기 표지된 화합물에 포함되는 상기 클릭 그룹은 테트라진인, 조합물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 표지된 화합물은 CL-L1-L2-R*로 표시될 수 있으며, 여기서 CL은 상기 클릭 그룹이고, L1은 제1 링커 또는 결합이며, L2는 제2 링커이고, R*은 상기 표지인, 조합물.
  9. 제8항에 있어서, L1은 PEGn이며, 여기서 n은 1 내지 10의 정수이고, 바람직하게는 n은 5 내지 9의 정수이며, 더 바람직하게는 n은 7인, 조합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, L2는 킬레이터 또는 벤조에이트 링커이며, 바람직하게는 여기서 상기 킬레이터는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 1,4,7-트리아자사이클로로난-1,4,7-트리아세트산(NOTA), N,N'-비스[(6-카르복시-2-피리딜)메틸]-4,13-디아자-18-크라운-6(Macropa), 2,2',2'',2'''-(1,10-디옥사-4,7,13,16-테트라아자사이클로옥타데칸-4,7,13,16-테트라일)테트라아세트산(Crown) 또는 3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9-트리아세트산(PCTA)이고, 바람직하게는 상기 벤조에이트 링커는 구아디노메틸 벤조에이트(GMIB)인, 조합물.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 방사성 핵종인, 조합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방사성 핵종은 α-방출 방사성 핵종 또는 β-방출 방사성 핵종이고, 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무트-212, 비스무트-213, 세슘-137, 크로뮴-51, 코발트-60, 구리-67, 디스프로슘-165, 에르븀-169, 페르뮴-255, 금-198, 홀륨-166, 요오드-125, 요오드-131, 이리듐-192, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 몰리브덴-99, 팔라듐-103, 인-32, 칼륨-42, 레늄-186, 레늄-188, 사마륨-153, 라듐-223, 라듐-224, 루테늄-106, 나트륨-24, 스트론튬-89, 스칸듐-47, 테르븀-149, 테르븀-161, 테르븀-149, 토륨-227, 제논-133, 이테르븀-169, 이테르븀-177, 또는 이트륨-90이며, 더 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 루테튬-177, 테르븀-161 또는 요오드-131이고, 가장 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 루테튬-177 또는 요오드-131인, 조합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 방사성 핵종은 양전자-방출 방사성 동위원소(PET) 또는 γ-방출 방사성 동위원소(SPECT)이고, 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 요오드-131, 이트륨-90, 요오드-125, 루테튬-177, 레늄-186, 레늄-188, 테르븀-161, 테르븀-149, 테크네튬-99m, 인듐-111, 제논-133, 탈륨-201, 플루오린-18, 갈륨-68, 갈륨-67, 구리-67, 스칸듐-44, 스칸듐-43, 요오드-123, 요오드-124, 지르코늄-89, 또는 구리-64이며, 더 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 루테튬-177, 테르븀-161 또는 요오드-131이고, 가장 바람직하게는 상기 방사성 핵종은 루테튬-177 또는 요오드-131인, 조합물.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지된 화합물은 177Lu-DOTA-PEG7-Tz로 표시될 수 있으며, 여기서 Tz는 테트라진인, 조합물.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 소거제는 상기 제1 투여와 후속 투여 사이에 상기 대상체에게 투여되지 않는, 조합물.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 투여와 후속 투여 사이의 시간은 적어도 2시간, 바람직하게는 적어도 4시간, 더 바람직하게는 적어도 8시간인, 조합물.
  17. 제1항 내지 제5항, 또는 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형암인, VHH, 또는 이의 단편, 또는 조합물.
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