KR20240113600A

KR20240113600A - 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질의 안정한 제제

Info

Publication number: KR20240113600A
Application number: KR1020247022666A
Authority: KR
Inventors: 비살 씨. 나신; 루시케쉬 케이. 파텔
Original assignee: 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2024-07-22
Also published as: IL305625A; AU2024204870A1; AU2018261154A1; WO2018204617A1; IL305625B2; JP7442595B2; JP7157082B2; CA3062797A1; US20200129595A1; KR102683806B1; JP2023011601A; WO2018204617A8; IL270233B2; AU2018261154B2; IL305625B1; IL270233B1; CN110621302A; JP2020518603A; SG11201909709SA; MX2019012506A

Abstract

본 발명은 일반적으로 근육 소모 및 대사 장애를 치료하기 위한, 피하 (SC)를 포함한 다양한 경로를 통해 투여하기 위한, 미오스타틴에 결합하는 ¹⁰Fn3 도메인을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 안정한 액체 제제 및 그의 단위 투여 형태에 관한 것이다.

Description

미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질의 안정한 제제{STABLE FORMULATIONS OF FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD DOMAIN PROTEINS THAT BIND TO MYOSTATIN}

관련 출원 정보

본 특허 출원은 2017년 5월 3일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/500,649를 우선권 주장한다. 상기 언급된 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 근육-소모 질환 및 대사 장애를 치료하기 위한 치료 용도에 사용하기 위한, 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴-기반 스캐폴드 도메인 단백질을 포함하는 동결건조 및 액체 제제를 비롯한 안정한 제제에 관한 것이다.

성장 및 분화 인자-8 (GDF-8)로도 또한 공지된 미오스타틴은 분비 성장 인자의 형질전환 성장 인자-β (TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 미오스타틴 발현은 주로 골격근 및 지방 조직에 제한되며, 여기서 미오스타틴은 골격근 발달의 음성 조절제인 것으로 밝혀졌다 (Lee LS, Immunol Endocr Metab Agents Med Chem. 2010;10:183-194). 유전적 및 약리학적 발견 둘 다는 미오스타틴이 에너지 대사를 조절하고 그의 억제가 비만 및 당뇨병을 비롯한 대사 질환의 진행을 유의하게 약화시킬 수 있는 것으로 나타낸다. 예를 들어, 미오스타틴 널 마우스는 동일한 연령의 야생형 마우스와 비교할 때 감소된 체지방 축적을 나타낸다 (McPherron & Lee, J. JCI 109:595, 2002). 이러한 체지방 감소는 감소된 지방세포 수 및 크기의 징후이며, 근발생에서 뿐만 아니라 지방생성에서 미오스타틴의 유의한 역할을 암시한다. 추가로, 골격근 질량 및 강도의 증가는 신체 조성, 에너지 소비량, 글루코스 항상성 및 인슐린 요건에 긍정적으로 영향을 미치는 대사 적응과 연관된다.

지난 20년에 걸쳐, 재조합 DNA 기술은 상당수의 단백질 치료제가 발견되도록 하였다. 예를 들어, 시험관내 및 생체내에서 미오스타틴 활성을 효과적으로 억제하는 항-미오스타틴 애드넥틴이 기재되었다 (미국 특허 8,933,199; 8,993,265; 8,853,154; 및 9,493,546). 이들 항-미오스타틴 애드넥틴은 미오스타틴 활성의 억제가 유익한 장애, 질환 및 상태, 예를 들어 근육 소모 질환, 대사 장애 및 근육 위축을 일으키는 상태의 치료에 유용하다.

단백질 약물에 대한 가장 통상적인 전달 경로는, 대부분의 다른 경로에 의한 불량한 생체이용률, 임상 투여 동안 보다 큰 제어, 및 보다 신속한 제약 개발로 인해 정맥내 (IV) 투여였다. 빈번하고 만성적인 투여를 필요로 하는, 예컨대 근육 소모 질환 및 대사 장애를 위한 제품의 경우, 대안적인 피하 (SC) 전달 경로가 보다 더 매력적이다. 사전-충전 시린지 및 자가주사기 장치 기술과 커플링되는 경우, SC 전달은 가정 투여 및 개선된 투여 순응도를 가능하게 한다.

피하 전달을 수반하는 치료는 종종 적은 부피 (<1.5 ml)로 전달될 수 있는 단백질 제제의 개발을 필요로 한다. 응집하는 경향을 갖는 단백질의 경우 안정한 제제를 달성하는 것이 개발 과제이다. 부형제의 첨가는 응집체의 형성을 방지할 수 있지만, 단백질 안정성을 제공하기 위해 필요한 부형제의 수 및 농도는 피하 전달에 의한 적은 부피의 신속한 투여에 부적합한 오스몰랄농도 및/또는 점도의 증가를 가져올 수 있다.

단백질 용해도를 지배하는 원리는 소형 합성 분자에 대한 것보다 더 복잡하고, 따라서 단백질 용해도 문제를 극복하는 것은 상이한 전략을 취한다. 작동상, 단백질에 대한 용해도는 용액이 시각적으로 투명하게 유지되는 (즉, 단백질 침전물, 결정 또는 겔을 보이지 않는), 공동-용질 존재 하의 단백질의 최대량으로 설명될 수 있다. 이온 강도, 염 형태, pH, 온도 및 특정 부형제에 대한 단백질 용해도의 의존성은, 문헌 [Arakawa et al. in Theory of protein solubility, Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985; Schein in Solubility as a function of protein structure and solvent components, BioTechnology 8(4):308-317, 1990; Jenkins in Three solutions of the protein solubility problem, Protein Science 7(2):376-382, 1998] 등에서 벌크 물 표면 장력의 변화 및 물 및 이온에 대한 단백질 결합 대 자기-회합에 의해 기계론적으로 설명되어 왔다. 특정 부형제 또는 염에 대한 단백질의 결합은 단백질 입체형태의 변화 또는 자가-상호작용에 관여하는 특정 아미노산의 차폐를 통해 용해도에 영향을 미친다. 단백질은 또한 특정 염, 아미노산 및 당에 의해 우선적으로 수화되어 (그리고 보다 치밀한 입체형태로서 안정화되어) 그의 용해도가 변경되도록 한다.

2-분자 충돌을 필요로 하는 응집은 단백질 용액에서의 1차 분해 경로일 것으로 예상된다. 응집체 형성에 대한 농도의 관계는 응집체의 크기 뿐만 아니라 회합 메카니즘에 좌우된다. 단백질 응집은 공유 (예를 들어, 디술피드 연결) 또는 비-공유 (가역적 또는 비가역적) 회합을 일으킬 수 있다. 비-공유 회합에 의한 비가역적 응집은 일반적으로 단백질의 천연 입체형태를 변경시키는 열적, 기계적 또는 화학적 공정에 의해 노출된 소수성 영역을 통해 일어난다. 단백질 응집은 단백질 활성, 약동학 및 예를 들어 면역원성으로 인해 안전성에 영향을 미칠 수 있다.

피하 전달에 적합한 안정한 제제를 수득하기 위해 단백질 농도 및 부형제의 유형, 수 및 농도를 결정하는 것은 단백질 입체형태의 불안정한 성질, 및 그 자체, 표면 및 특정 용질과 상호작용하는 경향으로 인해 실험적 연습으로 남아있다. 예를 들어, 야생형 ¹⁰Fn3은 극히 안정하고 가용성인 반면, 야생형 서열로부터 대략 4-31개의 돌연변이를 함유하는 ¹⁰Fn3의 표적-결합 변이체는 안정성 및 용해도가 폭넓게 달라진다.

따라서, 미오스타틴을 억제하는 피브로넥틴 기반 분자를 함유하는 안정한 제약 제제가, 근육 질량, 근육 강도 및/또는 대사의 증가로부터 이익을 얻을 장애 또는 상태 (예를 들어, 근육 이영양증, 노쇠, 불사용 위축 및 악액질), 근육 소모와 연관된 장애 (예를 들어, 신질환, 심부전 또는 심장 질환 및 간 질환), 및 대사 장애 (예를 들어, 제II형 당뇨병, 대사 증후군, 비만 및 골관절염)의 치료 및/또는 예방에 필요하다.

본 발명은 미오스타틴 활성을 억제하며 안정하게 유지되고 응집체 또는 입자를 형성하지 않는 소정 농도의 애드넥틴 분자를 함유하는 제약 제제를 제공한다. 이들 제제는 그를 필요로 하는 환자 (예를 들어, 근육 소모 및 대사 장애)에서 근육 질량, 근육 강도 및/또는 대사를 증가시키는데 유용한 안전하고 편리한 주사가능한 치료제 (예를 들어, 매주 1회, 피하)를 나타낸다.

한 측면에서, (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 적어도 10 mg/mL; (ii) 적어도 5% 농도의 디사카라이드; (iii) 약 20 내지 약 60 mM 농도의 히스티딘 완충제; 및 (iv) 제약상 허용되는 수성 담체를 포함하며, 약 6.5 내지 약 7.8의 pH 범위를 갖는 안정한 제약 제제가 제공된다.

한 실시양태에서, 제제는 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 하나의 루프는 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 0, 1, 2 또는 3개 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 하나는 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 BC, DE 또는 FG 루프 중 하나의 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인은 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 또는 FG 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는다. 한 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프는 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 아미노산 서열을 포함한다.

관련 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인은 서열식별번호: 8, 9 또는 10의 비-BC, DE 및 FG 루프 영역에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 관련 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다.

특정 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc는 인간 IgG이다. 일부 실시양태에서, Fc는 인간 IgG1이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열식별번호: 78 또는 서열식별번호: 70에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78을 포함한다. 한 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드는 서열식별번호: 78로 이루어진다. 특정 실시양태에서, ¹⁰Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 이량체이다.

일부 실시양태에서, 제제 중 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 농도는 약 10 mg/mL 내지 200 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 폴리펩티드 농도는 약 10 mg/mL 내지 약 140 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL 내지 약 85 mg/mL이다. 다른 실시양태에서, 제제 중 폴리펩티드의 단백질 농도는 약 10.7 mg/mL, 21.4 mg/mL, 50 mg/mL 또는 71.4 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 디사카라이드는 적어도 5:1의 단백질 대 당의 중량 (w/w) 비로 존재한다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 중량비는 약 5:1 내지 10:1이다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 비는 약 10:1이다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 비는 약 6.75:1이다.

일부 실시양태에서, 제제는 약 5% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 또는 약 20% 내지 약 25%의 디사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 디사카라이드의 농도는 약 150 내지 약 800 mM 또는 약 300 내지 약 700 mM이다. 일부 실시양태에서, 디사카라이드의 농도는 약 600 mM이다. 일부 실시양태에서, 디사카라이드는 트레할로스이다. 특정 실시양태에서, 디사카라이드는 트레할로스 2수화물이다. 일부 실시양태에서, 디사카라이드는 약 600 mM 농도의 트레할로스 2수화물이다.

일부 실시양태에서, 히스티딘은 제제 중에 적어도 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘은 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 히스티딘은 약 20 mM의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 히스티딘의 농도는 약 25 mM이다. 일부 실시양태에서, 히스티딘은 약 30 mM의 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 제약 제제는 약 0.01% 내지 0.5% 농도의 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 0.02% PS80이다.

일부 실시양태에서, 제약 제제는 약 0.01 mM 내지 0.1 mM 농도의 킬레이트화제를 추가로 포함한다. 허용가능한 킬레이트화제는 EDTA, DTPA 및 EGTA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 킬레이트화제는 DPTA이다. 한 실시양태에서, 제제는 0.05 mM DTPA를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 5 내지 20 cp이다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 5 내지 15 cp이다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 7 내지 12 cp이다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 8 cp 미만이다.

일부 실시양태에서, 제약 제제는 약 0.3 mL 내지 1 mL의 부피의 단위 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 제제는 약 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 0.6 mL, 0.7 mL, 0.8 mL, 0.9 mL 또는 1.0 mL의 부피의 단위 투여 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제제는 0.7 mL의 단위 투여 형태로 제공된다.

관련 실시양태에서, 단위 투여 형태는 5 mg 내지 200 mg의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 약 5 mg, 7.5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 35 mg, 45 mg, 50 mg, 90 mg 또는 180 mg의 단백질을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 제제는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사용으로 제제화된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 상기 기재된 제약 제제를 투여함으로써 대상체에서 미오스타틴-관련 질환 또는 장애를 약화시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애는 대상체에서의 근육의 변성 또는 소모와 연관된다. 일부 실시양태에서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애는 대사 장애이다.

특정 실시양태에서, 제약 제제는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 베커 근육 이영양증 (BMD), 및 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD), 척수성 근육 위축 (SMA), 뿐만 아니라 높은 발생률의 상태, 예컨대 고령 집단에서의 근육감소증 및 제II형 당뇨병으로부터 선택된 상태를 치료하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 제약 제제는 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)을 치료하는데 사용된다.

일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 21세 이하의 소아 환자이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 약 6 내지 12세의 소아 환자이다.

일부 실시양태에서, 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 약 5 mg 내지 200 mg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 약 5 mg, 7.5 mg, 10 mg, 15 mg, 20 mg, 35 mg, 45 mg, 50 mg, 90 mg 또는 180 mg의 투여량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 7.5, 15, 35 또는 50 mg의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 제제는 매주 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 약 45 kg 미만이고 약 7.5 mg 내지 약 35 mg의 투여량을 투여받는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 약 45 kg 초과이고 약 15 mg 내지 약 50 mg의 투여량을 투여받는다.

관련 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 제약 제제 및 사용에 대한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다.

도 1A는 미오스타틴에 결합하는 2가 폴리펩티드의 구조를 도시한다. 도 1B는 2가 분자의 각각의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 도시하며, Fc 부분의 아미노산 서열은 볼드체로 표시되어 있고, 링커의 아미노산은 밑줄표시되어 있고, ¹⁰Fn3 도메인의 아미노산 서열은 이탤릭체로 표시되어 있다.
도 2는 사카라이드 농도 10% (좌측 패널) 및 20% (우측 패널)로 5℃에서 저장된 제제 중 고분자량 종의 시간 경과에 따른 백분율을 그래프로 도시한 것이다.
도 3은 사카라이드 농도 10%로 25℃에서 저장된 제제 (상부 좌측 패널); 사카라이드 농도 20%로 25℃에서 저장된 제제 (상부 우측 패널); 사카라이드 농도 10%로 35℃에서 저장된 제제 (하부 좌측 패널); 및 사카라이드 농도 20%로 35℃에서 저장된 제제 (하부 우측 패널) 중 고분자량 종의 백분율을 그래프로 도시한 것이다.
도 4는 상이한 온도에서 다양한 농도의 수크로스 또는 트레할로스를 함유하는 제제의 점도를 그래프로 도시한 것이다.
도 5는 수크로스 또는 트레할로스의 존재 하에 pH 6.5 또는 pH 7.0에서 25℃ 및 35℃에서 2주 동안 저장한 후 고분자량 종의 백분율을 그래프로 도시한 것이다.
도 6은 30 mM 히스티딘, 600 mM 트레할로스 2수화물, 0.05 mM DTPA, 0.02% PS80, pH 7.1을 함유하는 제제 중 점도 vs. 단백질 농도를 그래프로 도시한 것이다.

I. 정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 조성물이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다.

단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.

용어 "약"은, 특히 주어진 양 또는 수와 관련하여, 플러스 또는 마이너스 10 퍼센트 (± 10%) (예를 들어, ± 5%) 내의 편차를 포괄한다는 것을 의미한다.

"안정한" 제제 또는 약물 제품은 그 안의 항-미오스타틴 애드넥틴이 저장시 본질적으로 그의 물리적 및 화학적 안정성 및 완전성을 유지하는 것이다. 항-미오스타틴 애드넥틴 분자 제제의 안정성은 선택된 기간 후 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 동결건조 및 저장 후 응집체 형성의 증가는 동결건조된 항-미오스타틴 애드넥틴 분자 제제의 불안정성에 대한 지표이다. 응집체 형성 이외에, 보관 수명 전반에 걸친 원래 투명도, 색상 및 냄새의 유지는 항-미오스타틴 애드넥틴 분자 용액의 안정성을 모니터링하기 위해 이용되는 지표이다. HMW 종은 항-미오스타틴 애드넥틴 분자 단량체 또는 이량체보다 더 높은 분자량을 갖는 다량체 (즉, 사량체, 육량체 등)이다. 전형적으로 "안정한" 약물 제품은 제제가 2-8℃에서 1년 동안 저장되는 경우에 고분자량 종의 백분율 (% HMW)의 증가에 의해 측정된 응집의 증가가 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만인 것일 수 있다. 바람직하게는, 제조된 약물 제품은 약 25% 미만의 HMW 종, 바람직하게는 약 15% 미만의 HMW 종, 보다 바람직하게는 약 10% 미만의 HMW 종, 가장 바람직하게는 약 5% 미만의 HMW 종을 포함한다.

제약 제품, 예를 들어 항-미오스타틴 애드넥틴을 포함하는 단백질의 "보관-수명"은 분해가 발생하기 전까지 제품이 저장되는 시간의 길이이다. 예를 들어, 보관-수명은 제품의 0.1%, 0.5%, 1%, 5% 또는 10%의 분해에 대한 시간으로서 규정될 수 있다.

용어 "동결건조" 및 "동결-건조"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 먼저 동결시킨 다음 주위 압력을 감소시켜 물질 내의 동결된 물이 승화되도록 함으로써 탈수된 물질을 지칭한다.

"재구성된" 제제는 항-미오스타틴 애드넥틴 분자가 재구성된 제제 중에 용해되도록 동결건조 제제를 수성 담체 중에 용해시켜 제조된 것이다. 재구성된 제제는 그를 필요로 하는 환자에 대한 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여에 적합하다.

"등장성" 제제는 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이다. 등장성 제제는 일반적으로 약 250 내지 350 mOsmol/KgH2O의 삼투압을 가질 것이다. 용어 "고장성"은 인간 혈액의 삼투압을 초과하는 삼투압을 갖는 제제를 기재하는데 사용된다. 등장성은, 예를 들어 증기압 또는 빙결 유형 삼투압계를 사용하여 측정될 수 있다.

용어 "완충제"는, 수용액에 첨가되는 경우에, 산 또는 알칼리 첨가시 또는 용매로의 희석시 pH 변동에 대해 용액을 보호할 수 있는 1종 이상의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 완충제는 본원에 기재된 바와 같은 히스티딘, 트리스(TRIS)® (트리스 (히드록시메틸) 아미노메탄), 시트레이트, 숙시네이트, 글리콜레이트 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

용어 "pKa"는 동일한 농도의 산 및 짝염기 형태의 완충제가 존재하는 pH 값 (여기서 산 분자의 절반이 이온화됨)과 동일한 산의 이온화 (산 해리) 상수 (K_a)의 음의 로그 (p)를 지칭한다. 완충제의 p가 완충될 용액의 pH와 동일한 경우에, 완충 시스템이 가장 효과적이다.

"산"은 수용액 중에서 수소 이온을 생성하는 물질이다. "제약상 허용되는 산"은, 이들이 제제화되는 농도 및 방식에서 비독성인 무기 및 유기 산을 포함한다.

"염기"는 수용액 중에서 히드록실 이온을 생성하는 물질이다. "제약상 허용되는 염기"는, 이들이 제제화되는 농도 및 방식에서 비-독성인 무기 및 유기 염기를 포함한다.

"보존제"는 박테리아 작용을 감소시키며 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있는 작용제이다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다. 잠재적 보존제의 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알콜, 예컨대 페놀, 부틸 및 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸을 포함한다.

"계면활성제"는 소수성 부분 (예를 들어, 알킬 쇄) 및 친수성 부분 (예를 들어, 카르복실 및 카르복실레이트 기) 둘 다를 함유하는 표면 활성 분자이다. 본 발명의 제제에서 사용하기에 적합한 계면활성제는 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴록사머 (예를 들어 폴록사머 188); 소르비탄 에스테르 및 유도체; 트리톤; 소듐 라우렐 술페이트; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우르아미도프로필-코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필베타인 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필- 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일- 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 모나쿼트(MONAQUAT)™ 시리즈 (모나 인더스트리즈, 인크.(Mona Industries, Inc.), 뉴저지주 패터슨), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 (예를 들어, 플루로닉스, PF68 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"약물 물질"은 최종 약물 제품의 제제화에 이용된 출발 물질을 지칭한다. 전형적인 항-미오스타틴 애드넥틴 약물 물질 조성물은 10 mg/mL 내지 200 mg/mL의 단백질 농도, 6.6 내지 7.6의 pH 및 < 5%의 % HMW 종을 포함한다.

"제제화된 벌크 용액"은 용기에 충전하기 전의 최종 제제, 예컨대 동결건조를 위해 바이알에 충전하기 전의 제제화된 용액, 또는 IV 및/또는 SC 주사를 위해 시린지에 충전하기 전의 제제화된 용액을 지칭한다.

"약물 제품"은 동결건조된 약물 제품에서와 같이 사용 전에 재구성되거나; 액체 약물 제품에서와 같이 사용 전에 추가로 희석되거나; SC 용액 약물 제품에서와 같이 그대로 이용될 수 있는, 용기 내에 포장된 최종 제제를 지칭한다.

본원에 사용된 "전장 미오스타틴"은 상기 문헌 [McPherron et al. (1997)]에 기재된 전장 폴리펩티드 서열, 뿐만 아니라 대립유전자 변이체 및 종간 상동체를 비롯한 관련 전장 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "미오스타틴" 또는 "성숙 미오스타틴"은 생물학적 활성 성숙 미오스타틴의 단편, 뿐만 아니라 대립유전자 변이체, 스플라이스 변이체 및 융합 펩티드와 폴리펩티드를 비롯한 관련 폴리펩티드를 지칭한다. 성숙 C-말단 단백질은 인간, 마우스, 닭, 돼지, 칠면조 및 래트를 비롯한 다수의 종에서 100% 서열 동일성을 갖는 것으로 보고되었다 (Lee et al., PNAS 2001;98:9306). 인간 프리프로미오스타틴에 대한 서열은 다음과 같다:

인간 프로-미오스타틴에 대한 서열은 다음과 같다:

성숙 미오스타틴에 대한 서열 (인간, 뮤린, 래트, 닭, 칠면조, 개, 말 및 돼지에서 보존됨)은 다음과 같다:

본원에 사용된 "피브로넥틴 기반 스캐폴드" 또는 "FBS" 단백질 또는 모이어티는 피브로넥틴 유형 III ("Fn3") 반복부를 기반으로 한 단백질 또는 모이어티를 지칭한다. 피브로넥틴은 18개의 Fn3 반복부를 갖고, 반복부 사이의 서열 상동성은 낮지만 이들은 모두 3차 구조에서 높은 유사성을 공유한다. 검토를 위해, 문헌 [Bork et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(19):8990-8994 (1992); Bork et al., J. Mol. Biol., 242(4):309-320 (1994); Campbell et al., Structure, 2(5):333-337 (1994); Harpez et al., J. Mol. Biol., 238(4):528-539 (1994)]을 참조한다. Fn3 도메인은 소형이고, 단량체이고, 가용성이고, 안정하다. 이는 디술피드 결합이 결여되어 있고, 따라서 환원 조건 하에 안정하다. Fn3 도메인은 N-말단에서 C-말단으로의 순서로, 베타 또는 베타-유사 가닥, A; 루프, AB; 베타 또는 베타-유사 가닥, B; 루프, BC; 베타 또는 베타-유사 가닥, C; 루프, CD; 베타 또는 베타-유사 가닥, D; 루프, DE; 베타 또는 베타-유사 가닥, E; 루프, EF; 베타 또는 베타-유사 가닥, F; 루프, FG; 및 베타 또는 베타-유사 가닥, G를 포함한다. 7개의 역평행 β-가닥은 안정한 코어를 형성하는 2개의 베타 시트로서 배열되고, 이때 베타 또는 베타-유사 가닥을 연결하는 루프로 구성된 2개의 "면"을 생성한다. 루프 AB, CD 및 EF는 하나의 면 ("사우스 폴")에 위치하고, 루프 BC, DE 및 FG는 대향하는 면 ("노스 폴")에 위치한다.

애드넥틴은 제10 인간 피브로넥틴 유형 III 도메인 (¹⁰Fn3)으로부터 유래된 고친화도 및 특이적 표적-결합 특성을 갖는 치료 FBS 단백질의 한 부류이다.

따라서, 본원에 사용된 "¹⁰Fn3 도메인" 또는 "¹⁰Fn3 모이어티" 또는 "¹⁰Fn3 분자"는 야생형 ¹⁰Fn3 및 그의 생물학상 활성 변이체, 예를 들어 표적, 예컨대 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학상 활성 변이체를 지칭한다.

본원에 사용된 ¹⁰Fn3 도메인 (또는 모이어티 또는 분자)의 "영역"은 루프 (AB, BC, CD, DE, EF 및 FG), β-가닥 (A, B, C, D, E, F 및 G), N-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 1-7에 상응함), 또는 C-말단 (서열식별번호: 1의 아미노산 잔기 93-94에 상응함)을 지칭한다.

"스캐폴드 영역"은 인간 ¹⁰Fn3 도메인의 임의의 비-루프 영역을 지칭한다. 스캐폴드 영역은 A, B, C, D, E, F 및 G β-가닥, 뿐만 아니라 N-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 1-7에 상응하는 아미노산) 및 C-말단 영역 (서열식별번호: 1의 잔기 93-94에 상응하는 아미노산)을 포함한다.

용어 "항-미오스타틴 애드넥틴"은 미오스타틴에 결합하고 이를 길항하며, 인간 야생형 ¹⁰Fn3 도메인 (서열식별번호: 1)으로부터 유래된 적어도 1개의 ¹⁰Fn3 도메인을 포함하는 단백질 분자를 지칭한다. 항-미오스타틴 애드넥틴은 추가의 단백질 도메인 (예를 들어, Fc 도메인)을 추가로 포함할 수 있고, 또한 다량체 형태의 폴리펩티드, 예컨대 이량체, 사량체 및 육량체를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 "폴리펩티드"는 길이, 번역후 변형 또는 기능에 관계없이 2개 이상의 아미노산의 임의의 서열을 지칭한다. "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 아미노산 및 비-천연 아미노산, 예컨대 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 6,559,126에 기재된 것들을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 또한 다양한 표준 화학 방식 중 임의의 것으로 변형될 수 있다 (예를 들어, 아미노산은 보호기를 사용하여 변형될 수 있거나; 카르복시-말단 아미노산은 말단 아미드기로 만들어질 수 있거나; 아미노-말단 잔기는, 예를 들어 친지성을 증진시키는 기를 사용하여 변형될 수 있거나; 또는 폴리펩티드는 화학적으로 글리코실화되거나 또는 안정성 또는 생체내 반감기를 증가시키기 위해 달리 변형될 수 있음). 폴리펩티드 변형은 또 다른 구조, 예컨대 시클릭 화합물 또는 다른 분자의 폴리펩티드에 대한 부착을 포함할 수 있고, 또한 1개 이상의 아미노산을 변경된 배위 (즉, R 또는 S; 또는 L 또는 D)로 함유하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드는 미오스타틴에 결합하도록 변형된 피브로넥틴의 제10 유형 III 도메인으로부터 유래된 단백질이고, 본원에서 "항-미오스타틴 애드넥틴" 또는 "미오스타틴 애드넥틴"으로 지칭된다.

본원에 사용된 "폴리펩티드 쇄"는 각각의 그의 도메인이 비-공유 상호작용 또는 디술피드 결합이 아니라 펩티드 결합(들)에 의해 다른 도메인(들)에 연결된 폴리펩티드를 지칭한다.

"단리된" 폴리펩티드는 그의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 로우리 방법에 의해 결정시 폴리펩티드의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 적어도 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기를 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 1종의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에서 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후에, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않고, 선택된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은, 예를 들어 공중 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 Megalign (DNASTAR™) 소프트웨어를 사용하여, 관련 기술분야의 기술 내의 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 정렬을 측정하기에 적절한 파라미터를 용이하게 결정할 수 있으며, 이는 비교하고자 하는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한다. 예를 들어, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: X/Y의 분율 x 100 (여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 개수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 인지될 것이다.

본원에 사용된 "보존적 치환"은 아미노산을 유사한 특성 (예컨대, 예를 들어, 극성, 수소 결합 잠재력, 산성, 염기성, 형상, 소수성, 방향족 등)을 갖는 아미노산으로 대체하는 것을 비롯하여 (이에 제한되지는 않음), 펩티드의 전체 입체형태 및 기능을 변경하지 않으면서 아미노산 잔기를 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 지칭한다. 예시적인 보존적 치환은 문헌 [Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 (1978 and Supp.)]에서 허용된 점 돌연변이에 대해 규정된 기준을 충족하는 것들을 포함한다. 보존적 치환의 예는 하기 군 내의 치환을 포함한다: (a) 발린, 글리신; (b) 글리신, 알라닌; (c) 발린, 이소류신, 류신; (d) 아스파르트산, 글루탐산; (e) 아스파라긴, 글루타민; (f) 세린, 트레오닌; (g) 리신, 아르기닌, 메티오닌; 및 (h) 페닐알라닌, 티로신. "치환된" 또는 "변형된"에 의해 본 발명은 자연 발생 아미노산으로부터 변경 또는 변형된 아미노산을 포함한다. 이와 같이 본 발명의 문맥에서 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것으로 관련 기술분야에서 이해된다.

본원에 사용된 용어 "애드넥틴 결합 부위"는 특정한 애드넥틴과 상호작용하거나 그에 결합하는 단백질 (예를 들어, 미오스타틴)의 부위 또는 부분을 지칭한다 (예를 들어, 에피토프가 항체에 의해 인식되는 바와 같음). 애드넥틴 결합 부위는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산에 의해 형성된 애드넥틴 결합 부위는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출시 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 애드넥틴 결합 부위는 전형적으로 변성 용매의 처리시 상실된다.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 애드넥틴이 미오스타틴에 대한 친화도를 나타내지만, 관련 기술분야에서 이용가능한 기술, 예컨대 비제한적으로, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 비아코어 검정)에 의해 측정시 상이한 폴리펩티드에 유의하게 결합하지 않는 (예를 들어, 약 10% 미만으로 결합하는) 것을 지칭한다. 이 용어는 또한, 예를 들어 본 발명의 애드넥틴의 결합 도메인이 미오스타틴에 특이적인 경우에 적용가능하다.

본원에 사용된 용어 "우선적으로 결합한다"는 본 발명의 애드넥틴이 관련 기술분야에서 이용가능한 기술, 예컨대 비제한적으로, 스캐차드 분석 및/또는 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 경쟁 ELISA, 비아코어 검정)에 의해 측정시 상이한 폴리펩티드에 결합하는 경우보다 적어도 약 20% 더 크게 미오스타틴에 결합하는 상황을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "교차-반응성"은 애드넥틴이 동일한 또는 매우 유사한 애드넥틴 결합 부위를 갖는 1종 초과의 별개의 단백질에 결합하는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "K_D"는 표면 플라즈몬 공명 검정 또는 세포 결합 검정을 사용하여 측정시, 특정한 애드넥틴-단백질 (예를 들어, 미오스타틴) 상호작용의 해리 평형 상수 또는 단백질 (예를 들어, 미오스타틴)에 대한 애드넥틴의 친화도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 "목적하는 K_D"는 고려되는 목적에 충분한 애드넥틴의 K_D를 지칭한다. 예를 들어, 목적하는 K_D는 시험관내 검정, 예를 들어 세포-기반 루시페라제 검정에서 기능적 효과를 도출하는데 요구되는 애드넥틴의 K_D를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "k_ass"는 애드넥틴의 애드넥틴/단백질 복합체로의 회합에 대한 회합률 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "k_diss"는 애드넥틴의 애드넥틴/단백질 복합체로부터의 해리에 대한 해리율 상수를 지칭하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "IC₅₀"은 시험관내 또는 생체내 검정에서 최대 억제 반응의 50%인 수준까지, 즉 최대 억제 반응과 비처리 반응 사이의 절반으로 반응을 억제하는 애드넥틴의 농도를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "미오스타틴 활성"은 ActRIIb에 대한 활성 미오스타틴 단백질의 결합 및 이후 Alk4 또는 Alk5의 동원과 연관된 성장-조절 또는 형태발생 활성 중 하나 이상을 지칭한다. 예를 들어, 활성 미오스타틴은 골격근 질량의 음성 조절제이다. 활성 미오스타틴은 또한 근육-특이적 효소 (예를 들어, 크레아틴 키나제)의 생산을 조정할 수 있고, 근모세포 증식을 자극할 수 있으며, 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 조정할 수 있다. 미오스타틴 활성은 관련 기술분야에 인식된 방법, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

어구 "미오스타틴 활성을 억제한다" 또는 "미오스타틴 활성을 길항한다" 또는 "미오스타틴을 길항한다"는 생체내 또는 시험관내에서 미오스타틴의 활성을 중화시키거나 길항하는 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 능력을 지칭하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 애드넥틴의 활성에 관하여 본원에 사용된 용어 "억제하다" 또는 "중화시키다"는 생물학적 활성 또는 특성, 질환 또는 상태를 비롯하여 (이에 제한되지는 않음), 억제할 진행 또는 중증도를 실질적으로 길항하거나, 억제하거나, 예방하거나, 제지하거나, 늦추거나, 방해하거나, 제거하거나, 중지시키거나, 감소시키거나 또는 역전시키는 능력을 의미한다. 억제 또는 중화는 바람직하게는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 초과이다.

예를 들어, 제약 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 척추동물 대상체에서 정상적으로 발견되는 생물학적 활성 미오스타틴의 순환 수준을 감소시킬 수 있거나, 또는 미오스타틴의 상승된 순환 수준을 유발하는 장애를 갖는 대상체에서 생물학적 활성 미오스타틴의 순환 수준을 감소시킬 수 있다. 미오스타틴 활성의 감소는 본원에 기재된 바와 같은 시험관내 검정, 예를 들어 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 미오스타틴 활성의 감소는 체중의 증가, 근육 질량 증진, 근육 강도 증가, 지방 대비 근육의 비의 변경, 제지방 근육 질량의 증가, 근육 세포의 크기 및/또는 수의 증가, 및/또는 체지방 함량의 감소를 유발할 수 있다.

용어 "PK"는 "약동학"에 대한 두문자어이고, 예로서 대상체에 의한 흡수, 분포, 대사 및 제거를 포함한 화합물의 특성을 포괄한다. 본원에 사용된 "PK 조정 단백질" 또는 "PK 모이어티"는 생물학적 활성 분자에 융합되거나 또는 그와 함께 투여되는 경우에 생물학적 활성 분자의 약동학적 특성에 영향을 미치는 임의의 단백질, 펩티드 또는 모이어티를 지칭한다. PK 조정 단백질 또는 PK 모이어티의 예는 PEG, 인간 혈청 알부민 (HSA) 결합제 (미국 공개 번호 2005/0287153 및 2007/0003549, PCT 공개 번호 WO 2009/083804 및 WO 2009/133208에 개시된 바와 같음), 인간 혈청 알부민, Fc 또는 그의 Fc 단편 및 변이체, 및 당 (예를 들어, 시알산)을 포함한다.

아미노산 서열 또는 화합물의 "반감기"는 일반적으로, 예를 들어 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 천연 메카니즘에 의한 서열 또는 화합물의 클리어런스 또는 격리로 인해, 생체내에서 폴리펩티드의 혈청 농도가 50% 감소하는데 소요되는 시간으로서 정의될 수 있다. 반감기는 공지된 임의의 방식 그 자체로, 예컨대 약동학적 분석에 의해 결정될 수 있다. 적합한 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어 일반적으로 대상체에게 적합한 용량의 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물을 적합하게 투여하는 단계; 상기 대상체로부터 규칙적 간격으로 혈액 샘플 또는 다른 샘플을 수집하는 단계; 상기 혈액 샘플 중 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도를 결정하는 단계; 및 이렇게 얻어진 데이터(의 플롯)로부터, 본 발명의 아미노산 서열 또는 화합물의 수준 또는 농도가 투여시의 초기 수준과 비교하여 50% 감소할 때까지의 시간을 계산하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표준 편람, 예컨대 문헌 [Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al., Pharmacokinetic Analysis: A Practical Approach (1996)]을 참조한다. 또한 문헌 [Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)]을 참조한다.

반감기는 t_1/2-알파, t_1/2-베타, HL_람다_z와 같은 파라미터, 및 곡선하 면적 (AUC)을 사용하여 표현될 수 있다. 본 명세서에서, "반감기의 증가"는 이들 파라미터 중 어느 1개, 이들 파라미터 중 어느 2개, 이들 파라미터 중 어느 3개 또는 이들 파라미터 중 모든 4개의 증가를 지칭한다. "반감기의 증가"는 특히 t_1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘 다의 증가의 존재 또는 부재 하에 t_1/2-베타 및/또는 HL_람다_z의 증가를 지칭한다.

표기법 "mpk", "mg/kg" 또는 "kg당 mg"은 킬로그램당 밀리그램을 지칭한다. 모든 표기법은 본 개시내용 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용된다.

본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "개체", "대상체" 및 "환자"는 뮤린, 원숭이, 인간, 포유동물 가축 (예를 들어, 소, 돼지, 양), 포유동물 스포츠 동물 (예를 들어, 말) 및 포유동물 애완동물 (예를 들어, 개 및 고양이)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 동물, 바람직하게는 포유동물 (비영장류 및 영장류 포함) 또는 조류 종을 지칭하고; 바람직하게는 용어는 인간을 지칭한다. 용어는 또한 닭 및 칠면조를 포함하나 이에 제한되지는 않는 조류 종을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 대상체, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간은 추가로 미오스타틴의 감소된 수준 또는 감소된 생물활성으로부터 이익을 얻을 질환 또는 장애 또는 상태를 갖는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서 대상체, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간은 추가로 미오스타틴의 감소된 수준 또는 미오스타틴의 감소된 생물활성으로부터 이익을 얻을 장애, 질환 또는 상태가 발생할 위험이 있는 것을 특징으로 한다.

용어 "치료 유효량"은 대상체에게 치료 이익을 부여하는데 필요한 작용제의 적어도 최소 용량이지만 독성 용량 미만인 양을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 치료 유효량은 포유동물, 바람직하게는 인간에서 하기 중 하나 이상을 유발하는 양이다: 근육 부피 및/또는 근육 강도의 증가, 체지방의 감소, 인슐린 감수성의 증가, 또는 미오스타틴의 존재가 바람직하지 않은 병리학적 효과를 야기하거나 그의 원인이 되거나 또는 미오스타틴 수준의 감소가 유익한 치료 효과를 유발하는 상태의 치료.

본원에 사용된 용어 "노쇠하다" 또는 "노쇠"는 쇠약, 체중 감소, 이동성 감소, 피로, 낮은 활동 수준, 불량한 지구력 및 감각 신호에 대한 행동 반응 장애 중 2종 이상의 증상을 특징으로 할 수 있는 상태를 지칭한다. 노쇠의 한 특징은 "근육감소증" 또는 근육 질량의 연령-관련 감소이다.

본원에 사용된 용어 "악액질"은 다양한 질환으로부터 유래될 수 있는 근육 소모 가속화 및 제지방 체질량 감소의 상태를 지칭한다.

본 발명의 다양한 측면이 하기 서브섹션에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

II. 미오스타틴 결합 애드넥틴 분자

본원에 제공된 제제에 사용될 수 있는 항-미오스타틴 애드넥틴 분자는 인간 피브로넥틴 유형 III 도메인의 야생형 제10 모듈로부터 유래된 Fn3 도메인 (¹⁰Fn3) (서열식별번호: 1)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제약 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 BC 루프는 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 예컨대 항-미오스타틴 애드넥틴이 미오스타틴에 대한 결합을 유지하도록 하는 보존적 아미노산 치환을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 하나의 루프는 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 또는 FG 루프 중 하나의 루프는 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 또는 FG 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 3에서의 세린은 A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (ii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 4에서의 류신은 M 또는 V로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 5에서의 프롤린은 A, C, D, E, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vi) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 6에서의 히스티딘은 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 7에서의 글루타민은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (viii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 8에서의 글리신은 아미노산 S로 치환되거나; (ix) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 9에서의 리신은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (x) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 10에서의 알라닌은 C, G, L, M, S 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; 또는 (xi) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 11에서의 아스파라긴은 A, C, F, H, P, Q, R, S 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 3에서의 세린은 C, F, I, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (ii) BC 루프 (서열식별번호: 6)의 위치 6에서의 히스티딘은 C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 9에서의 리신은 A, C, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iv) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 10에서의 알라닌은 G, L, M 또는 S로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; 또는 (v) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 11에서의 아스파라긴은 C, H, Q, S 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 3에서의 세린은 아미노산 F 또는 W로 치환되거나; (ii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 6에서의 히스티딘은 C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 7에서의 글루타민은 A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 9에서의 리신은 A, C, H, L, M, N, R, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iv) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 10에서의 알라닌은 아미노산 G 또는 L로 치환되거나; 또는 (v) BC 루프 (서열식별번호: 5)의 위치 11에서의 아스파라긴은 아미노산 H 또는 Q로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 DE 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 발린은 A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 일부 실시양태에서, DE 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 발린은 C, E, I, L, M, Q 또는 T로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다. 일부 실시양태에서, DE 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 발린은 C, E, I, L 또는 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 2에서의 발린은 A, C, F, I, L, M, Q, T, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 3에서의 트레오닌은 A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iv) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 4에서의 아스파르트산은 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (v) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 트레오닌은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vi) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 6에서의 글리신은 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 7에서의 티로신은 A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V 또는 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (viii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 8에서의 류신은 A, C, E, F, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (ix) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 9에서의 리신은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y 로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (x) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 10에서의 티로신은 아미노산 F 또는 W로 치환되거나; 또는 (xi) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 11에서의 리신은 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 2에서의 발린은 A, C, I, L 또는 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (ii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 3에서의 트레오닌은 C, F, H, I, L, M, Q, R, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 4에서의 아스파르트산은 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iv) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 트레오닌은 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (v) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 6에서의 글리신은 A, D, E, F, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vi) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 7에서의 티로신은 C, F, I, L, M, P, T, V 또는 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 8에서의 류신은 C, F, H, I, K, M, N, Q, R, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (viii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 9에서의 리신은 A, C, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (ix) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 10에서의 티로신은 아미노산 W로 치환되거나; 또는 (x) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 11에서의 리신은 A, C, D, E, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T 또는 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 각각 서열식별번호: 5, 6 또는 7에 제시된 바와 같은 BC, DE 및 FG 루프를 포함하며, 여기서 (i) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 2에서의 발린은 아미노산 I로 치환되거나; (ii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 3에서의 트레오닌은 C, F, I, L, M, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 4에서의 아스파르트산은 A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T 또는 V로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (iv) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 5에서의 트레오닌은 A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (v) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 6에서의 글리신은 A, S, T 또는 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vi) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 7에서의 티로신은 F, I, V 또는 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (vii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 8에서의 류신은 F, H, I, M, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; (viii) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 9에서의 리신은 A, C, F, G, I, L, M, T, V 또는 W로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환되거나; 또는 (x) FG 루프 (서열식별번호: 7)의 위치 11에서의 리신은 A, G, L, M, P, Q 또는 R로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된다.

특정 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴은 서열식별번호: 8에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다:

일부 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드는 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10의 비-BC, DE 및 FG 루프 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 미오스타틴에 결합하는 ¹⁰Fn3 도메인을 함유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, ¹⁰Fn3의 비-리간드 결합 서열, 즉 "¹⁰Fn3 스캐폴드"는 ¹⁰Fn3이 리간드 결합 기능 및/또는 구조적 안정성을 보유한다면 변경될 수 있다. 다양한 돌연변이 ¹⁰Fn3 스캐폴드가 보고되었다. 일부 실시양태에서, Asp 7, Glu 9 및 Asp 23 중 하나 이상이 또 다른 아미노산, 예컨대 예를 들어, 비-음성 하전 아미노산 잔기 (예를 들어, Asn, Lys 등)에 의해 대체된다. 이들 돌연변이는 야생형 형태와 비교하여 중성 pH에서 돌연변이 ¹⁰Fn3의 더 큰 안정성을 촉진하는 효과를 갖는 것으로 보고되었다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 02/04523 참조). 유익하거나 중성인 ¹⁰Fn3 스캐폴드에서의 다양한 추가의 변경이 개시되었다. 예를 들어, 문헌 [Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (December 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)]을 참조한다.

특정 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드의 ¹⁰Fn3 도메인은 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 10을 포함한다. 한 실시양태에서, 제제 내의 폴리펩티드의 ¹⁰Fn3 도메인은 서열식별번호: 10을 포함한다.

연장 서열

특정 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴 분자는 N-말단 연장 서열 및/또는 C-말단 연장 서열을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, MG 서열이 서열식별번호: 4에 의해 정의되는 ¹⁰Fn3의 N-말단에 위치할 수 있다. M은 통상적으로 절단되어 N-말단에 G를 남길 것이다. 일부 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 및 표 1에 제시된 바와 같은 N-말단 연장 서열을 포함할 수 있다. 추가로, M, G 또는 MG는 또한 표 1에 제시된 임의의 N-말단 연장부의 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴은 서열식별번호: 4의 T94에 상응하는 트레오닌에서 말단절단될 수 있다. 대안적으로, C-말단 연장부는 서열식별번호: 8의 C-말단 잔기 다음에 부가될 수 있다. 예시적인 C-말단 연장 서열은 표 1에 제시된다.

표 1

특정 실시양태에서, C-말단 연장 서열 ("테일"로도 불림)은 E 및 D 잔기를 포함하며, 8 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 5 내지 10 및 2 내지 4개의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 테일 서열은 서열이 ED의 탠덤 반복부를 포함하는 ED-기반 링커를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 테일 서열은 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 또는 5개의 ED 반복부를 포함한다. 특정 실시양태에서, ED-기반 테일 서열은 또한 추가의 아미노산 잔기, 예컨대 예를 들어 EI, EID, ES, EC, EGS 및 EGC를 포함할 수 있다. 이러한 서열은, 부분적으로, 공지된 애드넥틴 테일 서열, 예컨대 EIDKPSQ (서열식별번호: 20)에 기초하며, 여기서 잔기 D 및 K는 제거되었다. 예시적인 실시양태에서, ED-기반 테일은 ED 반복부 앞에 E, I 또는 EI 잔기를 포함한다.

항-미오스타틴 애드넥틴 이뮤노글로불린 Fc 융합체

한 측면에서, 이뮤노글로불린 Fc 도메인 또는 그의 단편 또는 변이체에 융합된 항-미오스타틴 애드넥틴을 함유하는 제제가 제공된다. 본원에 사용된 "기능적 Fc 영역"은 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 Fc 도메인 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 기능적 Fc 영역은 FcRn에 결합하지만, 이펙터 기능을 보유하지 않는다. FcRn에 결합하는 Fc 영역 또는 그의 단편의 능력은 관련 기술분야에 공지된 표준 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 다른 실시양태에서, Fc 영역 또는 그의 단편은 FcRn에 결합하고, 천연 Fc 영역의 적어도 하나의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항-미오스타틴 애드넥틴)과 조합될 것을 요구하고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 1개의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80% 서열 동일성을 보유할 것이고, 가장 바람직하게는 그와 적어도 약 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 그와 적어도 약 95% 서열 동일성을 보유할 것이다.

예시적인 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 하위부류로부터 유래되지만, 다른 하위부류 (예를 들어, IgG2, IgG3 및 IgG4)가 또한 사용될 수 있다. 인간 IgG1 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 서열이 하기에 제시된다:

코어 힌지 서열은 밑줄표시되고, CH2 및 CH3 영역은 정규 문자이다. C-말단 리신은 임의적이라는 것이 이해되어야 한다.

융합체는 항-미오스타틴 애드넥틴을 Fc 분자의 각 말단에 부착시켜 형성될 수 있다 (즉, Fc-항-미오스타틴 애드넥틴 또는 항-미오스타틴 애드넥틴-Fc 배열). 특정 실시양태에서, Fc 및 항-미오스타틴 애드넥틴은 링커를 통해 융합된다. 예시적인 링커 서열은 GAGGGGSG (서열식별번호: 40), EPKSSD (서열식별번호: 41), ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (서열식별번호: 42), ELQLEESAAEAQDGELD (서열식별번호: 43), GQPDEPGGS (서열식별번호: 44), GGSGSGSGSGSGS (서열식별번호: 45), ELQLEESAAEAQEGELE (서열식별번호: 46), GSGSG (서열식별번호: 47), GSGC (서열식별번호: 48), AGGGGSG (서열식별번호: 49), GSGS (서열식별번호: 50), QPDEPGGS (서열식별번호: 51), GSGSGS (서열식별번호: 52), TVAAPS (서열식별번호: 53), KAGGGGSG (서열식별번호: 54), KGSGSGSGSGSGS (서열식별번호: 55), KQPDEPGGS (서열식별번호: 56), KELQLEESAAEAQDGELD (서열식별번호: 57), KTVAAPS (서열식별번호: 58), KAGGGGSGG (서열식별번호: 59), KGSGSGSGSGSGSG (서열식별번호: 60), KQPDEPGGSG (서열식별번호: 61), KELQLEESAAEAQDGELDG (서열식별번호: 62), KTVAAPSG (서열식별번호: 63) AGGGGSGG (서열식별번호: 64), AGGGGSG (서열식별번호: 65), GSGSGSGSGSGSG (서열식별번호: 66), QPDEPGGSG (서열식별번호: 67) 및 TVAAPSG (서열식별번호: 68)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴 융합체에 사용되는 Fc 영역은 Fc 분자의 힌지 영역을 포함한다. 본원에 사용된 "힌지" 영역은 IgG1 Fc 영역의 서열식별번호: 39의 위치 1-16에 걸친 코어 힌지 잔기 (DKTHTCPPCPAPELLG; 서열식별번호: 69)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴-Fc 융합체는, 부분적으로 힌지 영역 내의 서열식별번호: 39의 위치 6 및 9에서의 시스테인 잔기로 인해 다량체 구조 (예를 들어, 이량체)를 채택한다. 다른 실시양태에서, 본원에 사용된 힌지 영역은 서열식별번호: 39에 제시된 바와 같은 코어 힌지 서열에 플랭킹된 CH1 및 CH2 영역으로부터 유래되는 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 힌지 서열은 GSTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 70)이다.

일부 실시양태에서, 힌지 서열은 바람직한 약동학적, 생물물리학적 및/또는 생물학적 특성을 부여하는 치환을 포함할 수 있다. 일부 예시적인 힌지 서열은 EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 71; 코어 힌지 영역은 밑줄표시됨), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호 72; 코어 힌지 영역은 밑줄표시됨), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 73; 코어 힌지 영역은 밑줄표시됨), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (서열식별번호: 74; 코어 힌지 영역은 밑줄표시됨), 및 DKTHTCPPCPAPELLGGSS (서열식별번호: 75; 코어 힌지 영역은 밑줄표시됨)를 포함한다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 39의 위치 18에서의 잔기 P는 Fc 이펙터 기능을 제거하기 위해 S로 대체되었으며; 이러한 대체는 서열식별번호: 72, 73 또는 75 중 어느 하나를 갖는 힌지에 예시된다. 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 39의 위치 1-2에서의 잔기 DK는 잠재적 클립 부위를 제거하기 위해 GS로 대체되었으며; 이러한 대체는 서열식별번호: 73에 예시된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 IgG1의 중쇄 불변 영역 (즉, 도메인 CH1-CH3)에 상응하는 서열식별번호: 76의 위치 103에서의 C는 경쇄 부재시 부적당한 시스테인 결합 형성을 방지하기 위해 S로 대체되었으며; 이러한 대체는 서열식별번호: 71-73에 예시된다.

특정 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴-Fc 융합체는 하기 구성을 가질 수 있다: 1)항-미오스타틴 애드넥틴-힌지-Fc 또는 2) 힌지-Fc-항-미오스타틴 애드넥틴. 따라서, 본 발명의 임의의 항-미오스타틴 애드넥틴은 이들 구성에 따라 힌지 서열을 포함하는 Fc 영역에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커가 항-미오스타틴 애드넥틴을 힌지-Fc 모이어티에 연결하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어 예시적인 융합 단백질은 항-미오스타틴 애드넥틴-링커-힌지-Fc 또는 힌지-Fc-링커-항-미오스타틴 애드넥틴 구성을 가질 수 있다. 추가적으로, 융합 폴리펩티드가 생산되는 시스템에 따라, 리더 서열이 융합 폴리펩티드의 N-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어, 융합체가 포유동물 시스템에서 생산될 경우, 리더 서열, 예컨대 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호: 77)가 융합 분자의 N-말단에 부가될 수 있다. 융합체가 이. 콜라이(E. coli)에서 생산될 경우, 융합 서열 앞에 메티오닌이 존재할 것이다.

한 실시양태에서, 제제는 하기 아미노산 서열을 포함하는 Fc-항-미오스타틴 애드넥틴 구축물을 함유한다:

힌지 영역은 밑줄표시되고, 링커는 이탤릭체이고, 리더 서열은 볼드체이고, 항-미오스타틴 애드넥틴 서열은 밑줄표시 및 이탤릭체이다.

Fc 도메인은 하기와 같은 인간 IgG1 CH2 및 CH3 영역:

및 힌지 서열 DKTHTCPPCPAPELLG (서열식별번호: 69)를 포함한다.

III. 항-미오스타틴 애드넥틴을 발현하기 위한 핵산 분자 및 벡터

항-미오스타틴 애드넥틴을 코딩하는 핵산은 화학적으로, 효소적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있다. 코돈 용법은 세포에서의 발현을 개선시키도록 선택될 수 있다. 이러한 코돈 용법은 선택된 세포 유형에 좌우될 것이다. 이. 콜라이 및 다른 박테리아, 뿐만 아니라 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 곤충 세포에 대해 특수화된 코돈 용법 패턴이 개발되어 있다. 예를 들어 문헌 [Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(1):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996); 및 Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)]을 참조한다.

핵산 조작을 위한 일반적 기술은, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 또는 Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) 및 정기적 최신판]에 기재되어 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 포유동물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 이러한 조절 요소는 전사 프로모터, 전사를 제어하기 위한 임의적인 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주 내에서의 복제 능력 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자가 추가적으로 포함된다.

따라서, 제제 내에 사용된 항-미오스타틴 애드넥틴은 직접적으로, 뿐만 아니라 바람직하게는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드인 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생산될 수 있다. 바람직하게는 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단)되는 것이다. 포유동물 시스템에서의 폴리펩티드의 생산을 위한 예시적인 N-말단 리더 서열은 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (서열식별번호: 81)이며, 이는 발현 후에 숙주 세포에 의해 제거된다. 천연 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 신호 서열은, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은, 예를 들어 효모 인버타제 리더, 팩터 리더 (사카로미세스 및 클루이베로미세스 알파-팩터 리더 포함), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더, 또는 PCT 공개 번호 WO 90/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 리딩 프레임에서 단백질을 코딩하는 DNA에 라이게이션될 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터 둘 다는 벡터가 1종 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2 마이크로미터 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에서는 필요하지 않다 (SV40 기점은 전형적으로 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있음).

발현 및 클로닝 벡터는 선택 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라시클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중대 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다 (예를 들어, 바실루스에 대한 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자).

효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC® 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다. 문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판의 부재 하의 성장에 의해 형질전환을 검출하는데 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC® 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로, 숙주 유기체에 의해 인식되고 본 발명의 단백질, 예를 들어 피브로넥틴-기반 스캐폴드 단백질을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 원핵 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예컨대 tan 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터도 적합하다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실질적으로 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치하는 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 출발점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 또 다른 서열은 CNCAAT 영역이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일을 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에 존재한다. 이들 서열 모두는 진핵 발현 벡터 내로 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에서 사용하기에 적합한 프로모팅 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예컨대 엔올라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다. 성장 조건에 의해 제어되는 전사의 추가의 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에서 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 특허 공개 번호 73,657 및 PCT 공개 번호 WO 2011/124718 및 WO 2012/059486에 추가로 기재된다. 또한, 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사는, 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성인 한, 예를 들어 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 시토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터, 열 쇼크 프로모터에 의해 제어될 수 있다.

고등 진핵생물에 의한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입하여 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기점의 하류 쪽 (bp 100-270)의 SV40 인핸서, 시토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸싱 요소에 대해 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 펩티드-코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.

진핵 숙주 세포 (예를 들어, 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에서 사용되는 발현 벡터도 또한 전사의 종결 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 본 발명의 단백질을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 절편을 함유한다. 하나의 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO 94/11026 및 그 안에 개시된 발현 벡터를 참조한다.

재조합 DNA는 또한 단백질을 정제하는데 유용할 수 있는 임의의 유형의 단백질 태그 서열을 포함할 수 있다. 단백질 태그의 예는 히스티딘 태그, FLAG 태그, myc 태그, HA 태그 또는 GST 태그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985)]에서 찾아볼 수 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 바와 같이, 발현 구축물은 숙주 세포에 적절한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 전기천공; 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염; 미세발사체 충격; 리포펙션; 및 감염 (여기서 벡터가 감염원임)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 핵산을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다.

적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 포유동물 세포 또는 박테리아 세포를 포함한다. 적합한 박테리아는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스 종을 포함한다. 효모, 바람직하게는 사카로미세스 종, 예컨대 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)로부터의 효모가 또한 폴리펩티드의 생산에 사용될 수 있다. 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 또한 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 곤충 세포 내의 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))]에서 검토된다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 내피 세포, COS-7 원숭이 신장 세포, CV-1, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), 인간 배아 신장 세포, HeLa, 293, 293T 및 BHK 세포주를 포함한다. 정제된 폴리펩티드는 재조합 단백질을 발현하기 위해 적합한 숙주/벡터 시스템을 배양함으로써 제조된다. 다수의 적용을 위해, 본원에 개시된 다수의 폴리펩티드의 소형 크기가 이. 콜라이에서의 발현을 바람직한 발현 방법으로서 만들 것이다. 이어서, 단백질은 배양 배지 또는 세포 추출물로부터 정제된다.

IV. 단백질 생산

숙주 세포는 본원에 기재된 단백질 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터의 도입, 형질전환체의 선택 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭을 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 항-미오스타틴 애드넥틴을 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄 F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM) (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)], 미국 특허 번호 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502, 또는 미국 특허 번호 RE 30,985에 기재된 다수의 배지도 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 것은 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대 HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 겐타마이신 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요 보충물이 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 이전에 사용된 것이고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.

본원에 개시된 단백질은 또한 세포-번역 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, mRNA를 생산하기 위한 시험관내 전사를 가능하게 하도록, 및 이용되는 특정한 무세포 시스템 (진핵생물, 예컨대 포유동물 또는 효모 무세포 번역 시스템, 또는 원핵생물, 예컨대 박테리아 무세포 번역 시스템)에서의 mRNA의 무세포 번역을 가능하게 하도록 변형되어야 한다.

본 발명의 단백질은 또한 화학적 합성에 의해 (예를 들어, 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)]에 기재된 방법에 의해) 생산될 수 있다. 단백질에 대한 변형도 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.

단백질은 일반적으로 단백질 화학 분야에 공지된 단백질에 대한 단리/정제 방법에 의해 정제될 수 있다. 비제한적 예는 추출, 재결정화, 염석 (예를 들어, 황산암모늄 또는 황산나트륨에 의함), 원심분리, 투석, 한외여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 정상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동, 향류 분배 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 정제 후에, 폴리펩티드는 상이한 완충제 내로 교환되고/거나, 여과 및 투석을 포함하나 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 농축될 수 있다.

정제된 폴리펩티드는 바람직하게는 적어도 85% 순수하거나, 또는 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 98% 순수하다. 순도의 정확한 수치에 관계없이, 폴리펩티드는 제약 제품으로서 사용하기에 충분히 순수하다.

항-미오스타틴 애드넥틴 분자의 단량체, 이량체 및 HMW 종은 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 분리될 수 있다. SEC는 분자 크기에 기초하여 분자를 분리한다. 분리는 분자가 칼럼의 길이를 따라 이동함에 따라 차등 분자 배제 또는 포함됨으로써 달성된다. 따라서, 분해능은 칼럼 길이의 함수로서 증가한다. 항-미오스타틴 애드넥틴 분자 샘플은 TSK 겔 G3000SWxL (300 mm.x7.8 mm, 5 마이크로미터) 및 TSK 겔 SWxL (40 mm x 6.0 mm, 7 마이크로미터) 칼럼 (도소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience), 펜실베니아주 몽고메리)이 탠덤으로 장착된 2695 얼라이언스 HPLC (워터스(Waters), 매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 분리될 수 있다. 200 μg의 주입 중량을 갖는 순수한 샘플은 0.5 ml/분의 유량으로 40 mM NaH2PO4, 60 mM Na2HPO4, 0.1 M Na2SO4, pH 6.8로 이루어진 이동상을 사용하여 분리된다. 샘플은 워터스 2487 이중 파장 검출기를 사용하여 280 nm의 흡광도에서 모니터링된다. 이러한 시스템 사용시, HMW 종은 16.0분 ± 1.0분의 체류 시간을 갖는다. 각각의 피크는 피크하 면적을 위해 적분된다. % HMW 종은 HMW 피크 면적을 총 피크 면적으로 나눔으로써 계산된다.

V. 항-미오스타틴 애드넥틴 활성의 측정

표적 분자 (예를 들어, 미오스타틴)에 대한 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 결합은 평형 상수 (예를 들어, 해리, K_D)의 측면에서 및 동역학적 상수 (예를 들어, 온-레이트 상수, k_on 및 오프-레이트 상수, k_off)의 측면에서 평가될 수 있다. 본원에 제공된 제약 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴의 결합 활성을 평가하기 위한 예시적인 시험관내 및 생체내 검정은 이전에 기재되었고 (예를 들어, 미국 특허 8,933,199; 8,993,265; 8,853,154; 및 9,493,546), 용액 상 방법, 예컨대 동역학적 배제 검정 (KinExA) (Blake et al., JBC 1996;271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004;328:35-43), 비아코어 시스템 (스웨덴 웁살라)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991;23:1; Morton and Myszka, Methods in Enzymology 1998;295:268), 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 (Newton et al., J Biomol Screen 2008;13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008;6:55-68), 및 비아코어 표면 플라즈몬 공명 시스템 (비아코어, 인크.) 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원 상기에 기재된 검정은 예시적이고, 단백질 사이의 결합 친화도를 결정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 형광 기반-전달 (FRET), 효소-연결 면역흡착 검정 및 경쟁적 결합 검정 (예를 들어, 방사성면역검정))이 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 결합 친화도를 평가하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

미오스타틴 활성을 길항하기 위한 항-미오스타틴 애드넥틴의 능력은 다양한 시험관내 검정을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 검정은 다중 후보 애드넥틴을 동시에 스크리닝하도록 하는 고처리량 검정이다. 일부 실시양태에서, 미오스타틴 활성에 대한 항-미오스타틴 애드넥틴의 길항 효과는 실시예 3에 기재된 바와 같이 세포-기반 액티빈 반응 요소 (ARE)-루시페라제 리포터 검정에서 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 미오스타틴을 항-미오스타틴 애드넥틴과 함께 공동-인큐베이션한 후 그 혼합물로 세포를 자극한 대조군에 비해 미오스타틴-유도된 ARE-루시페라제 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과로 감소시킨다. 예시적인 대조군 반응은 세포를 미오스타틴 단독으로 처리하는 것 또는 과량의 벤치마크 미오스타틴 억제제, 예컨대 인간 액티빈 RIIB Fc 키메라 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)) 또는 문헌 [Morrison et al. (Experimental Neurology 2009; 217:258-68)]에 기재된 바와 같은 ActRIIb-Fc와 함께 사전인큐베이션한 미오스타틴으로 처리하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 실시예 3에 기재된 바와 같이 ARE-루시페라제 리포터 활성을 500 nM 이하, 400 nM 이하, 300 nM 이하, 200 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM, 0.5 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하 또는 0.10 nM 이하의 IC50으로 억제한다.

다른 실시양태에서, 미오스타틴 활성에 대한 항-미오스타틴 애드넥틴의 길항 효과는 미국 특허 8,933,199; 8,993,265; 8,853,154; 및 9,493,546에 기재된 바와 같이 미오스타틴-처리된 세포에서 SMAD 인산화의 정도를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예시적인 대조군 반응은 세포를 미오스타틴 단독으로 처리하는 것 또는 과량의 벤치마크 미오스타틴 억제제, 예컨대 인간 액티빈 RIIB Fc 키메라 (알앤디 시스템즈) 또는 문헌 [Morrison et al. (Experimental Neurology 2009;217:258-68)]에 기재된 바와 같은 ActRIIb-Fc와 함께 사전인큐베이션한 미오스타틴으로 처리하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 실시예 5에 기재된 바와 같이 SMAD 인산화를 12-포인트 또는 4-포인트 억제 반응에서 1 nM 이하, 0.8 nM 이하, 0.6 nM 이하, 0.4 nM 이하, 0.3 nM 이하, 0.2 nM 이하 또는 0.1 nM 이하의 IC50으로 억제한다. 다른 실시양태에서, 10 nM에서의 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 미오스타틴에 의한 SMAD 인산화를 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 또는 그 초과로 억제한다.

추가적으로, 운동 뉴런 질환의 연구를 위한 세포, 조직 배양 및 조직학적 방법을 사용하는 여러 시험관내 모델 시스템이 공지되어 있다. 예를 들어, 글루타메이트 흥분독성에 적용된 래트 척수 기관형 슬라이스는 운동 뉴런 변성을 방지하는데 있어서 항-미오스타틴 애드넥틴의 유효성을 시험하기 위한 모델 시스템으로서 유용하다. 문헌 [Corse et al., Neurobiol. Dis. (1999) 6:335 346]. ALS 연구에 사용하기 위한 시험관내 시스템의 논의에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Bar, P. R., Eur. J. Pharmacol. (2000) 405:285 295; Silani et al., J. Neurol. (2000) 247 Suppl 1:128 36; Martin et al., Int. J. Mol. Med. (2000) 5:3 13]을 참조한다.

본원에 기재된 검정은 예시적이고, 미오스타틴 활성에 대한 판독으로서의 역할을 할 수 있는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법은 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 미오스타틴 길항 효과를 시험하는데 사용하기에 적합하다는 것이 이해되어야 한다 (예를 들어, SMAD 표적 유전자 (예를 들어, Smad 7; 문헌 [Ciarmela et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011;96;755-65])의 mRNA 또는 ARE-함유 유전자의 mRNA의 실시간 RT-PCR).

VI. 제제

피하 투여를 위해, 적은 부피 (< 1.5 mL)로 목적하는 단백질 농도를 전달하는 투여량이 요망된다. 따라서, 본원에 제공된 SC 제제는 수성 담체 중에 안정화 수준의 디사카라이드 및 완충제와 조합된, 적어도 10 mg/mL의 단백질 농도의 항-미오스타틴 애드넥틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도는 약 10 mg/mL 내지 200 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도는 약 10 mg/mL 내지 140 mg/mL이다.

일부 실시양태에서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도는 적어도 약 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL, 90 mg/mL, 95 mg/mL 또는 그 초과이다. 특정 실시양태에서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도는 적어도 약 110 mg/mL, 115 mg/mL, 120 mg/mL, 125 mg/mL, 130 mg/mL, 135 mg/mL, 140 mg/mL 또는 145 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도는 10.7 mg/mL, 21.4 mg/mL, 50.0 mg/mL 또는 71.4 mg/mL이다.

제제 내의 안정화 당은 적어도 5:1의 단백질 대 당의 중량 (w/w) 비의 디사카라이드이다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 중량비는 약 5:1 내지 10:1이다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 비는 약 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1이다. 일부 실시양태에서, 단백질:당 비는 약 6.75:1이다.

일부 실시양태에서, 제제는 약 5% 내지 약 30%의 디사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 10% 내지 약 28%의 디사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 15% 내지 약 25%의 디사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 20% 내지 약 25%의 디사카라이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 약 25%의 디사카라이드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제 중 당의 농도는 약 150 mM 내지 약 800 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 당의 농도는 약 300 내지 약 700 mM이다. 다른 실시양태에서, 제제 중 당의 농도는 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 575 mM, 약 600, 약 625 mM, 약 650 mM, 약 675 mM 또는 약 700 mM이다.

일부 실시양태에서, 디사카라이드는 트레할로스이다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 5 내지 약 30% 트레할로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 10% 내지 약 28% 트레할로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 15% 내지 약 25% 트레할로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 20% 내지 약 25% 트레할로스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 약 25% 트레할로스를 포함한다. 한 실시양태에서, 제제는 22% 트레할로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제제는 23% 트레할로스를 포함한다.

일부 실시양태에서, 디사카라이드는 트레할로스 2수화물이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도는 약 150 mM 내지 약 800 mM이다. 일부 실시양태에서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도는 약 300 내지 약 700 mM이다. 다른 실시양태에서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도는 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 575 mM, 약 600, 약 625 mM, 약 650 mM, 약 675 mM 또는 약 700 mM이다. 한 실시양태에서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도는 600 nM이다.

제제 내의 안정화 당은 SC 시린지를 통한 투여에 바람직하지 않거나 적합하지 않은 점도를 초래할 수 있는 양 이하의 양으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 5 내지 20 cp이다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 약 7 내지 12 cp이다. 일부 실시양태에서, 점도는 약 7-10 cp이다. 일부 실시양태에서, 제제의 점도는 8 cp 미만이다.

제제 내의 완충제는 적어도 20 mM의 양으로 존재하고, 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 일부 실시양태에서, 완충제는 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM 또는 약 35 mM 농도의 히스티딘이다. 한 실시양태에서, 제제는 약 30 mM 히스티딘을 포함한다.

제제의 pH는 약 6.5 내지 약 7.8의 범위에서 유지된다. 특정 실시양태에서, pH는 약 pH 6.6 내지 7.6의 범위에서 유지된다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 약 6.8 내지 7.4이다. 특정 실시양태에서, 제제의 pH는 약 7.0 내지 7.3이다. 일부 실시양태에서, 제제의 pH는 6.9, 7.0, 7.1, 7.2 또는 7.3이다. 일부 실시양태에서, 제제의 pH는 약 7.1이다.

본원의 제제에 사용되는 수성 담체는 제약상 허용되고 (인간에게 투여하기에 안전하고 비-독성임) 액체 제제의 제조에 유용한 것이다. 예시적인 담체는 멸균 주사용수 (SWFI), 정박테리아 주사용수 (BWFI), pH 완충 용액 (예를 들어 포스페이트-완충 염수), 멸균 염수 용액, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

제제는 시각적 미립자의 형성을 추가로 감소시키기 위한 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 약 0.01% 내지 0.5% 농도의 폴록사머 및 폴리소르베이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제의 농도는 약 0.02% 내지 약 0.1%이다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 폴록사머 188이다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80이다. 한 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80이다.

제제는 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM, 바람직하게는 약 0.05 mM 내지 0.2 mM 농도의 킬레이트화제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 킬레이트화제는 DPTA, EDTA 및 EGTA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 제제 내의 킬레이트화제는 약 0.05 mM 농도의 DPTA이다.

보존제가 박테리아 작용을 감소시키기 위해 본원의 제제에 임의로 첨가될 수 있다. 보존제의 첨가는, 예를 들어 다중-사용 (다중-용량) 제제의 생산을 용이하게 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 하기를 포함하며:

(i) 약 10-140 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물; 및

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘,

여기서 제제의 pH는 약 6.8 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10-140 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물; 및

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘,

여기서 제제의 pH는 약 6.8 내지 7.3이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 하기를 포함하며:

(i) 약 10-140 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA; 및

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 6.8 내지 7.3이다.

특정 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10-140 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA; 및

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 6.8 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기를 포함하며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물; 및

(iii) 25-30 mM 히스티딘,

여기서 제제의 pH는 약 7.0 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물; 및

(iii) 25-30 mM 히스티딘,

여기서 제제의 pH는 약 7.0 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기를 포함하며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 25-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA; 및

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.0 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 25-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA; 및

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.0 내지 7.3이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기를 포함하며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

일부 실시양태에서, 제제는 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10-75 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

한 실시양태에서, 제제는 하기를 포함하거나 하기로 본질적으로 이루어지며:

(i) 약 10.7 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

(i) 약 21.4 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

(i) 약 50 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

(i) 약 71.4 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA; 및

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80,

여기서 제제의 pH는 약 7.1이다.

액체 제제에 대한 권장되는 저장 조건은 2-8℃이며, 권장되는 보관 수명은 적어도 12개월이다.

제약 조성물의 보관 수명의 시간 경과 동안 효능 및 안전성을 보장하기 위해, 조성물은 안정성 시험된다. 전형적으로, 안정성 시험은 조성물의 정체, 순도 및 효력에 관한 시험을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 안정성은 의도된 저장 온도 및 상승된 온도 또는 온도들 둘 다에서 시험된다. 순도 시험은 SDS-PAGE, CE-SDS, 등전포커싱, 면역전기영동, 웨스턴 블롯, 역상 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 이온 교환 및 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 다른 시험은 시각적 외관, 예컨대 색 및 투명도, 미립자, pH, 단백질 농도 측정, 수분 및 재구성 시간을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

안정성 시간 경과 동안, 특히 순도 및 효력에 관한 분해 프로파일은 제약 생성물의 조성물 및/또는 제제와 긴밀하게 연관된다. 특히, 적절한 제제의 선택은 분해 프로파일을 유의하게 변화시킬 수 있다. FBS로부터 유래된 단백질 분자 생성물의 전형적인 분해 프로파일은 공유 및 비-공유 고분자량 응집체, 단편, 탈아미드화 및 산화 생성물의 형성을 포함한다. 특히, 탈아미드화 및 산화 생성물 뿐만 아니라 다른 산성 종이 통상적으로 안정성 시험의 시간 경과 동안 발생한다. 일부 경우에, 산성 종은 제약 조성물의 허용되는 보관 수명을 제한한다. 예를 들어 탈아미드화로 인한 산성 종의 형성은, 예를 들어 영상화 모세관 등전포커싱 (icIEF)에 의해 시험될 수 있다. 다른 경우에, 고분자량 응집체의 형성은 제약 조성물의 허용되는 보관 수명을 제한한다. 응집체의 형성은, 예를 들어 SEC (크기 배제 크로마토그래피), DLS, MFI, SDS-PAGE 또는 CE-SDS에 의해 시험될 수 있다.

예를 들어, 제약상 허용되는 안정성을 갖는 항-미오스타틴 애드넥틴 제제는 적어도 약 3개월, 바람직하게는 약 6개월, 및 보다 바람직하게는 약 12개월 또는 그 초과, 예컨대 18개월 이상, 예컨대 적어도 24개월 또는 심지어 36개월 동안 약 5 ± 3℃ 또는 25 ± 2℃의 온도에서 저장되는 경우에, 응집체의 백분율이 SEC 분석을 사용하여 결정할 때 약 10% 미만, 바람직하게는 약 5% 미만, 보다 바람직하게는 약 2% 미만인 것일 수 있다. 추가적으로로 또는 대안적으로, 본 발명의 안정한 항-미오스타틴 애드넥틴 제제는 적어도 약 3개월, 바람직하게는 약 6개월, 및 보다 바람직하게는 약 12개월 또는 그 초과의 기간 동안 약 5 ± 3℃ 또는 25 ± 2℃의 온도에서 저장되는 경우에, 주요 이소형의 변화가 icIEF 분석을 사용하여 결정할 때 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 8% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만인 것일 수 있다.

본원에 제공된 실시예는 SC 제제의 안정성 연구를 기재하며, 이는 SC 제제 내의 항-미오스타틴 애드넥틴 분자의 안정성이 수크로스의 존재 하의 경우에 비해 트레할로스의 존재 하에 증진된다는 것을 입증한다. 트레할로스에 의한 안정화는 10:1 미만의 단백질:트레할로스 비에서 더 우수하였다. 이들 연구에 기초하여, 안정화제로서 과도한 고장성 또는 점도를 갖는 SC 용액을 생성하지 않으면서 최적의 안정성을 제공하는 비로 트레할로스를 선택하였다.

또한 pH 7.0-7.1의 완충제로서 히스티딘을 함유하는 제제는 25℃ 및 37℃에서 저장 후 포스페이트 완충제보다 더 우수한 안정성 (즉, 더 낮은 %HMW)을 나타낸 것으로 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이러한 관찰은 히스티딘 pKa의 관점에서 특히 놀라웠으며 (pka = 6.0), 적어도 부분적으로 항-미오스타틴 애드넥틴이 고유의 완충 능력을 갖는다는 예상외의 발견에 기초한 것으로 보인다. 이는 생성물의 제조 및 보관 수명 동안 필요한 pH 안정성을 달성하기 위해 단백질의 완충 능력을 활용하면서 완충제의 pKa로부터 먼 제제의 생산을 가능하게 한다.

VII. SC 제제의 제조

SC 제제를 위해 개발된 제조 방법은 전형적으로 당, 킬레이트화제 및 계면활성제와의 배합, 이어서 무균성 멸균 여과 및 바이알 또는 시린지 내로의 충전, 임의로 이에 앞서 투석여과 (완충제 교환) 및 한외여과 장치를 사용한 약물 물질의 농축을 포함한다. 단백질 정제는 발효 생물반응기에서의 생산 후 제1 단계이다. 단백질을 다중 칼럼 및 여과 단계를 사용하여 정제하고, 제제 완충제 내로의 접선 흐름 여과를 사용하여 농축시킨다. 농축된 약물 물질을 제제 완충제에 의해 표적 농도로 희석하고, 이 용액을 멸균 여과하고, 환자 사용을 위한 멸균 바이알/시린지 내로 충전한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 제조 및 주사 동안 바이알, 바늘, 시린지 홀드-업을 보상하기 위해 용기를 과충전할 필요가 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 인출 손실을 설명하고 필요한 용량 (라벨 청구량)의 약물 제품이 바이알로부터 인출될 수 있도록 보장하기 위해 5-10% 과량의 약물 제품을 액체 제제의 각각의 바이알 내로 혼입시킨다.

시린지 내 미오스타틴에 결합하는 ¹⁰Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 (또한 본원에서 "항-미오스타틴 애드넥틴"으로 상호교환가능하게 지칭됨)를 포함하는 제제에 대한 단위 투여 형태의 제조는 재조합 세포주에서의 단백질 생산, 정제 바이알 다중 칼럼 단계, 접선 흐름 여과를 사용한 농축 및 제제 완충제 내로의 완충제 교환을 포함한다. 접선 흐름 여과를 위한 농축된 단백질을, 제제 완충제를 사용한 표적 단백질 농도로의 희석에 의해 추가로 가공하고, 희석된 생성물을 여과 후에 1 mL 시린지 (예를 들어, 인슐린 시린지, 투베르쿨린 시린지, 바이오팩(BioPak) 시린지, 네오팩(NeoPak) 시린지) 내로 충전한다. 한 실시양태에서, 이어서 시린지에 울트라세이프(UltraSafe) 수동 바늘 가드를 장착한다.

제제의 단위 투여 형태는 전형적으로 약 0.3 내지 1.5 mL의 제제를 함유한다. 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.3, 0.5, 0.7, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4 또는 1.4 mL의 부피를 함유한다. 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.7 mL의 부피로 제공된다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 미오스타틴에 결합하는 ¹⁰Fn3 도메인을 포함하는 폴리펩티드 5-100 mg을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 7.5 mg, 15 mg, 35 mg 또는 50 mg의 항-미오스타틴 애드넥틴을 포함한다.

일부 실시양태에서, 제제는 본원에 개시된 바와 같이 제조되며, 예를 들어 12L FFTp 백 내에 85-150 mg/mL의 폴리펩티드 농도로 -60℃에서 벌크로 저장한다. 일부 실시양태에서, 제제를 85 mg/mL의 폴리펩티드 농도로 -60℃에서 저장한다. 이어서, 벌크 제제를 해동시키고, 단위 투여 형태의 제조를 위해 적절한 폴리펩티드 농도로 희석한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태 중 제제의 폴리펩티드 농도는 약 10 mg/mL 내지 약 140 mg/mL이다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태 중 제제의 폴리펩티드 농도는 약 10 mg/mL 내지 약 75 mg/mL이다. 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태 중 제제의 폴리펩티드 농도는 10.7 mg/mL, 20.4 mg/mL, 50 mg/mL 또는 71.4 mg/mL이다.

VIII. 투여

본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴을 포함하는 제약 제제는 본원에 기재된 바와 같은 병리상태를 나타낼 위험이 있거나 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 제공된 제제는 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달에 특히 유용하다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 피하 주사에 의해 전달된다.

치료 유효 용량은 투여되는 대상체에 대해 치료 효과를 생성하는 용량을 지칭한다. 치료상 사용될 제약 조성물의 유효량은, 예를 들어 치료 상황 및 목적에 좌우될 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 치료를 위한 적절한 투여량 수준이 부분적으로 분자 전달시 결합제 분자가 사용되는 적응증, 투여 경로 및 환자의 크기 (체중, 체표면 또는 기관 크기) 및 상태 (연령 및 전반적 건강)에 따라 달라질 것임을 인지할 것이다.

정확한 투여량은 치료를 필요로 하는 대상체와 관련된 인자에 비추어 결정될 것이고, 표준 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 투여량 및 투여는 활성 화합물의 충분한 수준을 제공하거나 목적하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려될 수 있는 인자들은 질환 상태의 중증도, 대상체의 전반적 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 감수성 및 요법에 대한 반응을 포함한다.

일반적으로, 항-미오스타틴 애드넥틴은 약 5-200 mg, 보다 바람직하게는 약 5-50 mg의 약 매주 투여량으로 피하로 투여된다. 특정 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴 제제는 7.5, 15, 35 및 50 mg의 매주 투여량으로 피하로 투여된다. 용량 수준은 환자 체중 대역 및 미오스타틴의 예상되는 억제에 기초한다. 특정 실시양태에서, 45 kg 미만의 환자는 마이오스타틴의 70% 억제에 상응하는 7.5 mg 용량을 투여받고, 45 kg 체중 초과의 환자는 동일한 수준의 미오스타틴 억제를 달성하기 위해 15 mg을 투여받는다. 특정 실시양태에서, 45 kg 체중 미만의 환자는 마이오스타틴의 90% 억제에 상응하는 35 mg 용량을 투여받고, 45 kg 체중 초과의 환자는 동일한 수준 (90%)의 미오스타틴 억제를 달성하기 위해 15 mg을 투여받는다.

투여 빈도는 사용되는 제제 중 결합제 분자의 약동학적 파라미터에 좌우될 것이다. 전형적으로, 조성물은 목적하는 효과를 달성하는 투여량에 도달될 때까지 투여된다. 따라서, 조성물은 단일 용량으로서, 또는 시간 경과에 따라 다중 용량으로서 (동일하거나 상이한 농도/투여량으로) 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 정밀화는 상용적으로 이루어진다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인될 수 있다. 예를 들어, 항-미오스타틴 애드넥틴은 보다 덜 빈번하게 (예를 들어, 2주마다 또는 매월) 투여될 수 있다. 추가로, 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 연령은 물론 체중, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 중증도에 대한 조정이 필요할 수 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의한 상용 실험으로 확인가능할 것이다. 항-미오스타틴 애드넥틴은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.

IX. 키트 및 제조 물품

본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 미리 결정된 양의 시약과 본 발명의 치료 또는 진단 방법의 사용에 대한 지침서와의 포장 조합물인 키트로 제공될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 기재된 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 시린지 및 시험 튜브를 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리, 플라스틱 또는 금속으로 형성될 수 있다.

용기는 본원에 제공된 액체 제제를 보유한다. 용기 상의 또는 용기에 부속된 라벨은 저장 및/또는 사용에 대한 지침을 나타낼 수 있다. 라벨은 추가로 SC 제제가 피하 투여에 유용하거나 의도된 것임을 나타낼 수 있다. 제제를 보유하는 용기는, 예를 들어 피하 제제의 반복 투여 (예를 들어, 2-6회의 투여)를 가능하게 하는 다중-사용 바이알일 수 있다. 대안적으로, 용기는, 예를 들어 단위 투여 형태의 피하 제제를 함유하는 사전-충전 시린지일 수 있다.

제조 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예컨대 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 사용에 대한 지침서가 존재하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.

X. 사용 방법

한 측면에서, 본 발명은 미오스타틴-관련 질환 또는 장애, 예를 들어 근육 소모 장애, 근육 위축, 대사 장애 및 골 변성 장애의 치료에 유용한 항-미오스타틴 애드넥틴의 안정한 제제를 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서 본 발명은 대상체에게 유효량의 미오스타틴-결합 폴리펩티드, 즉 항-미오스타틴 애드넥틴을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 미오스타틴-관련 질환 또는 장애를 약화시키거나 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항-미오스타틴 애드넥틴은 포유동물, 특히 인간에게 제약상 허용된다. "제약상 허용되는" 폴리펩티드는 유의한 유해 의료 결과 없이, 예컨대 본질적으로 내독소 무함유 또는 매우 낮은 내독소 수준으로 동물에게 투여되는 폴리펩티드를 지칭한다.

본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 근육 소모 및/또는 근육 위축과 연관된 근육, 신경계 및 대사 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체내 미오스타틴 과다발현은 악액질에 특징적인 징후 및 증상을 유도하고, 미오스타틴 결합제는 미오스타틴의 근육 소모 효과를 부분적으로 해결할 수 있다 (Zimmers et al., Science 2002;296:1486-8). AIDS 환자는 또한 AIDS가 없는 환자 또는 체중 감소를 나타내지 않는 AIDS 환자와 비교하여 미오스타틴 면역반응성 물질의 증가된 혈청 수준을 나타낸다 (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS 1998;95:14938-43). 또한, 미오스타틴의 심장-특이적 제거는 심부전을 갖는 마우스에서 골격근 위축을 감소시키고, 반대로 심장에서 미오스타틴을 특이적으로 과다발현시키는 것은 근육 소모를 유도하기에 충분하다는 것이 관찰되었다 (Breitbart et al., AJP-Heart; 2011;300:H1973-82). 대조적으로, 미오스타틴 녹아웃 마우스는 그의 야생형 대응물과 비교하여 증가된 근육 질량 및 지방 축적의 연령-의존성 감소를 나타낸다 (McPherron et al., J. Clin. Invest. 2002;109:595-601).

본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 예시적인 장애는, 예를 들어 운동 뉴런 질환, 신경근육 및 신경계 장애를 비롯한, 근병증 및 신경병증을 포함한다.

예를 들어, 항-미오스타틴 애드넥틴은 유전성 근병증 및 신경근육 장애 (예를 들어, 근육 이영양증 (Gonzalez-Kadavid et al., PNAS, 1998;95:14938-43), 운동 뉴런 장애, 선천성 근병증, 염증성 근병증 및 대사성 근병증), 뿐만 아니라 후천성 근병증 (예를 들어, 약물 유발 근병증, 독소 유발 근병증, 감염 유발 근병증, 부신생물성 근병증 및 중대 질병과 연관된 다른 근병증)을 치료하는데 사용될 수 있다.

이러한 장애는 뒤시엔느 근육 이영양증, 진행성 근육 이영양증, 베커 유형 근육 이영양증, 데제린-랑도우지 근육 이영양증, Erb 근육 이영양증, 에머리 드레이푸스 근육 이영양증, 지대 근육 이영양증, 안인두 근육 이영양증 (OPMD), 안면견갑상완 근육 이영양증, 선천성 근육 이영양증, 영아 신경축삭 근육 이영양증, 근긴장성 이영양증 (스타인에르트병), 원위 근육 이영양증, 네말린 근병증, 가족성 주기성 마비, 비이영양성 근긴장증, 주기성 마비, 척수성 근육 위축, 척수성 근육 위축 (SMA), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 원발성 측삭 경화증 (PLS), 진행성 근육 위축 (PMA), 원위 근병증, 근세관성/중심핵성 근병증, 네말린 근병증, 미세핵병, 중심핵병, 데스민병증, 봉입체 근염, 피부근염, 다발근염, 미토콘드리아 근병증, 선천성 근무력 증후군, 중증 근무력증, 소아마비후 근육 기능장애, 스테로이드 근병증, 알콜성 근병증, 수술전후 근육 위축 및 ICU 신경근육병증을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

항-미오스타틴 애드넥틴으로 치료될 수 있는 유전성 및 후천성 신경병증 및 신경근병증은 경직 척추 증후군, 근육-눈-뇌 질환, 유전 운동 및 감각 신경병증, 샤르코 마리 투스병, 만성 염증성 신경병증, 진행성 비대성 신경병증, 순대양 신경병증, 루푸스, 길랑-바레 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증, 다발성 경화증, 사르코이드증, 당뇨병성 신경병증, 알콜성 신경병증, 신경병증 관련 질환 (예를 들어, HIV/AIDS, 라임병), 독소 관련 신경병증 (예를 들어, 중금속, 화학요법), 압박 신경병증 (예를 들어, 종양, 포착 신경병증) 및 손상 또는 외상과 연관된 신경병증 (예를 들어, 마미 증후군, 하반신마비, 사지마비)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 근육 이영양증 (예를 들어, 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 유형 근육 이영양증), ALS 및 근육감소증을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴으로 치료될 수 있는 근육 소모와 연관된 추가의 장애는 악액질, 소모 증후군, 근육감소증, 울혈성 폐쇄성 폐 질환, 낭성 섬유증 (폐 악액질), 심장 질환 또는 부전 (심장 악액질), 암, AIDS로 인한 소모, 신부전으로 인한 소모, 신질환, 파행, 투석과 연관된 악액질, 요독증, 류마티스 관절염, 근육 손상, 수술, 손상된 근육의 복구, 노쇠, 불사용 위축, 골다공증, 골관절염, 인대 성장 및 복구를 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 불사용으로 인한 근육 위축을 앓고 있는 대상체에서 근육 부피를 증가시키는데 사용될 수 있다. 불사용 위축은 장기간 요양, 휠체어 생활, 사지 고정화, 기계적 환기를 통한 횡경막의 무부하, 실질 기관 이식, 관절 치환, 졸중, CNS 손상 관련 쇠약, 척수 손상, 중증 화상으로부터의 회복, 좌식 만성 혈액투석, 외상후 회복, 패혈증후 회복 및 마이크로중력에 대한 노출을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 장기간 부동 또는 불사용을 유도하는 임의의 장애 또는 상태를 포함한 다수의 원인으로부터 유발될 수 있다 (Powers et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44).

추가로, 근육 대비 지방 비의 연령-관련 증가 및 연령-관련 근육 위축은 미오스타틴에 관련된 것으로 보인다. 예를 들어, 평균 혈청 미오스타틴-면역반응성 단백질은 청년 (19-35세), 중년 (36-75세) 및 노년 (76-92세) 남성 및 여성 군에서 연령 증가에 따라 증가한 반면, 평균 근육 질량 및 제지방 질량은 이들 군에서 연령 증가에 따라 감소하였다 (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). 따라서, 노화로 인한 근육 위축을 갖는 대상체 및/또는 예를 들어 근육감소증으로 인해 노쇠한 대상체는 또한 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 것이다.

또한, 식용 동물에게 유효 투여량의 항-미오스타틴 애드넥틴을 투여하여 이들 동물에서 근육 질량을 증가시키는 방법이 고려된다. 성숙 C-말단 미오스타틴 폴리펩티드는 모든 종에서 동일하기 때문에, 항-미오스타틴 애드넥틴은 임의의 농업상 중요한 종, 예를 들어 소, 닭, 칠면조 및 돼지 (이에 제한되지는 않음)에서 효과적으로 근육 질량을 증가시키고 지방을 감소시킬 것으로 예상된다.

근육 소모 장애 또는 근육 위축의 치료에 있어서 항-미오스타틴 애드넥틴의 효능은, 예를 들어 근육 질량 또는 부피의 증가, 근육 세포 수의 증가 (증식증), 근육 세포 크기의 증가 (비대증) 및/또는 근육 강도의 증가를 측정하는 1종 이상의 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 근육 부피 증가 효과는 하기 기재된 실시예에서 입증된다. "증가된 근육 질량"을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 근육 함량은 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 투여 전 및 후에 표준 기술, 예컨대 수중 칭량법 (예를 들어, 문헌 [Bhasin et al. New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7] 참조) 또는 이중-에너지 X선 흡수측정법 (예를 들어, 문헌 [Bhasin et al. Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162] 참조)을 사용하여 측정될 수 있다. 근육 크기의 증가는 적어도 약 5-10%, 바람직하게는 적어도 약 10-20% 또는 그 초과의 체중 증가에 의해 증명될 수 있다.

대사 장애

미오스타틴 활성 및/또는 신호전달을 감소시키는 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴은 대사 장애, 예컨대 비만, 제II형 당뇨병, 당뇨병 연관 장애, 대사 증후군 및 고혈당증을 치료하는데 유용하다.

미오스타틴은 제II형 당뇨병의 발병기전에 관여한다. 미오스타틴은 지방 조직에서 발현되고, 미오스타틴 결핍 마우스는 연령 증가에 따라 감소된 지방 축적을 나타낸다. 더욱이, 글루코스 부하, 지방 축적 및 총 체중은 미오스타틴 결여 아구티 치사 황색 및 비만 (Lep^ob/ob) 마우스에서 감소된다 (Yen et al., FASEB J. 8:479, 1994; McPherron et al., 2002). US2011/0008375에 개시된 바와 같이, 미오스타틴 길항제는 노화 마우스 모델에서 근육 대비 지방 비를 감소시키고, 골격근 질량 및 제지방 체질량을 보존하고, STZ-유도된 당뇨병성 마우스에서 신장 비대증을 약화시킬 수 있다.

본원에 사용된 "비만"은 건강에 부정적인 영향이 미칠 수 있을 정도로 과잉 체지방이 축적된 상태이다. 비만은 통상적으로 30 kg/m2 이상의 체질량 지수 (BMI)로서 정의되며, 25 kg/m2 이상의 BMI에 의해 정의되는 과체중과 구별된다 (예를 들어, 문헌 [World Health Organization (2000) (PDF). Technical report series 894: Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Geneva: World Health Organization] 참조). 과도한 체중은 다양한 질환, 특히 심혈관 질환, 제II형 당뇨병, 폐쇄성 수면 무호흡, 특정 유형의 암 및 골관절염과 연관된다.

비만을 갖는 대상체는, 예를 들어 BMI (BMI는 대상체의 체중을 그 또는 그녀의 키의 제곱으로 나눔으로써 계산됨), 허리 둘레 및 허리-엉덩이 비 (절대 허리 둘레 (남성에서 >102 cm 및 여성에서 >88 cm) 및 허리-엉덩이 비 (허리 둘레를 엉덩이 둘레로 나눈 것이 남성의 경우 >0.9 및 여성의 경우 >0.85) (예를 들어, 문헌 [Yusuf S, et al., (2004). Lancet 364: 937-52] 참조)), 및/또는 체지방 백분율 (총 체중의 백분율로서 표현되는 총 체지방: 25% 초과의 체지방을 갖는 남성 및 33% 초과의 체지방을 갖는 여성은 비만임; 체지방 백분율은 사람의 BMI로부터 하기 식에 의해 추정될 수 있음: 체지방% = (1.2 * BMI) + (0.23 * 연령) - 5.4 - (10.8 * 성별) (여기서 성별은 여성인 경우 0 및 남성인 경우 1))을 결정함으로써 확인될 수 있다. 체지방 백분율 측정 기술은, 예를 들어 컴퓨터 단층촬영 (CT 스캔), 자기 공명 영상화 (MRI) 및 이중 에너지 X선 흡수측정법 (DEXA)을 포함한다.

용어 "제II형 당뇨병"은 신체의 인슐린이 효과적으로 작용하지 않을 때 유발되는 만성 평생 질환을 지칭한다. 제II형 당뇨병의 주요 성분은 "인슐린 저항성"이며, 여기서 췌장에 의해 생산된 인슐린은 내부 글루코스가 에너지를 생성하도록 하는 지방 및 근육 세포와 연결될 수 없어서, 고혈당증 (높은 혈액 글루코스)을 야기한다. 보상하기 위해, 췌장은 보다 많은 인슐린을 생산하고, 이러한 인슐린 범람을 감지하는 세포는 보다 더 저항성이 되어, 높은 글루코스 수준 및 종종 높은 인슐린 수준의 악순환을 초래한다.

본원에 사용된 어구 "당뇨병과 연관된 장애" 또는 "당뇨병 연관 장애" 또는 "당뇨병 관련 장애"는 통상적으로 당뇨병과 연관 또는 관련된 상태 및 다른 질환을 지칭한다. 당뇨병과 연관된 장애의 예는, 예를 들어 고혈당증, 고인슐린혈증, 고지혈증, 인슐린 저항성, 글루코스 대사 장애, 비만, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 백내장, 당뇨병성 신병증, 사구체경화증, 당뇨병성 신경병증, 발기 기능장애, 월경전 증후군, 혈관 재협착, 궤양성 결장염, 관상동맥 심장 질환, 고혈압, 협심증, 심근경색, 졸중, 피부 및 결합 조직 장애, 족부 궤양, 대사성 산증, 관절염 및 골다공증을 포함한다.

대사 장애의 치료에 있어서 항-미오스타틴 애드넥틴의 효능은, 예를 들어 인슐린 감수성의 증가, 대상체로부터 세포에 의한 글루코스 흡수의 증가, 혈액 글루코스 수준의 감소 및 체지방의 감소를 측정하는 1종 이상의 방법에 의해 결정될 수 있다.

예를 들어, 제II형 당뇨병을 갖거나 당뇨병 발생 위험이 있는 대상체에서 HbA1c 수준이 모니터링될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "헤모글로빈 1AC" 또는 "HbA1c"는 헤모글로빈 B 쇄의 비-효소적 당화의 생성물을 지칭한다. 당뇨병을 갖는 사람에 대한 HbA1c 수준의 바람직한 표적 범위는 미국 당뇨병 협회 (ADA) 가이드라인, 즉 당뇨병에서의 의료 관리 표준 (Diabetes Care 2012;35(Suppl 1):S511-563)으로부터 결정될 수 있다. 현재 HbA1c 표적 수준은 일반적으로 당뇨병을 갖는 사람의 경우 <7.0%이고 당뇨병을 갖지 않는 사람은 전형적으로 6% 미만의 HbA1c 값을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항-미오스타틴 애드넥틴의 효능은 대상체에서 관찰된 HBA1c 수준 감소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 방법은 항-미오스타틴 애드넥틴을 단독으로, 또는 혈당 조절에 대해 관련 기술분야에 공지된 다른 작용제 (예를 들어, 인슐린, GLP1) 또는 관련 기술분야-인식된 당뇨병-관련 합병증을 치료하기 위한 다른 작용제와 조합하여 투여하는 것을 추가로 포함한다.

실시양태

1. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 적어도 10 mg/mL;

(ii) 적어도 5% 농도의 디사카라이드;

(iii) 약 20 내지 약 60 mM 농도의 히스티딘 완충제; 및

(iv) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, 약 6.5 내지 약 7.8의 pH 범위를 갖는 안정한 제약 제제.

2. 실시양태 1에 있어서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도가 약 10 mg/mL 내지 200 mg/mL인 제제.

3. 실시양태 1에 있어서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도가 약 10 mg/mL 내지 150 mg/mL인 제제.

4. 실시양태 1에 있어서, 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도가 약 10 mg/mL 내지 85 mg/mL인 제제.

5. 실시양태 1에 있어서, 제제 중 항-미오스타틴 애드넥틴의 단백질 농도가 약 10.7 mg/mL, 약 21.4 mg/mL, 약 50 mg/mL 및 약 71.4 mg/mL로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.

6. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 디사카라이드가 적어도 5:1의 단백질 대 당의 중량 (w/w) 비로 존재하는 것인 제제.

7. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단백질:디사카라이드 중량비가 약 5:1 내지 10:1인 제제.

8. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단백질:디사카라이드 비가 약 10:1인 제제.

9. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 단백질:디사카라이드 비가 약 6.75:1인 제제.

10. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 5% 내지 약 30%의 디사카라이드를 포함하는 제제.

11. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 15% 내지 약 25%의 디사카라이드를 포함하는 제제.

12. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 20% 내지 약 25%의 디사카라이드를 포함하는 제제.

13. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 약 25%의 디사카라이드를 포함하는 제제.

14. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 디사카라이드의 농도가 약 150 mM 내지 약 800 mM인 제제.

15. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제제 중 디사카라이드의 농도가 약 300 내지 약 700 mM인 제제.

16. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 디사카라이드가 트레할로스인 제제.

17. 실시양태 16에 있어서, 약 5 내지 약 30% 트레할로스를 포함하는 제제.

18. 실시양태 16 또는 실시양태 17에 있어서, 약 15% 내지 약 25% 트레할로스를 포함하는 제제.

19. 실시양태 16-18 중 어느 하나에 있어서, 약 20% 내지 약 25% 트레할로스를 포함하는 제제.

20. 실시양태 16-18 중 어느 하나에 있어서, 약 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 또는 약 25% 트레할로스를 포함하는 제제.

21. 실시양태 16에 있어서, 22% 트레할로스를 포함하는 제제.

22. 실시양태 16에 있어서, 23% 트레할로스를 포함하는 제제.

23. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 디사카라이드가 트레할로스 2수화물인 제제.

24. 실시양태 23에 있어서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도가 약 150 mM 내지 약 800 mM인 제제.

25. 실시양태 23 또는 실시양태 24에 있어서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도가 약 300 내지 약 700 mM인 제제.

26. 실시양태 24에 있어서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도가 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM, 약 575 mM, 약 600, 약 625 mM, 약 650 mM, 약 675 mM 또는 약 700 mM인 제제.

27. 실시양태 24에 있어서, 제제 중 트레할로스 2수화물의 농도가 600 nM인 제제.

28. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 히스티딘이 적어도 20 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.

29. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 히스티딘이 약 20 mM 내지 약 40 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.

30. 실시양태 29에 있어서, 히스티딘이 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM 또는 약 35 mM의 농도로 존재하는 것인 제제.

31. 실시양태 29에 있어서, 히스티딘이 약 20 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 제제.

32. 실시양태 29에 있어서, 히스티딘이 약 25 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 제제.

33. 실시양태 29에 있어서, 히스티딘이 약 30 mM의 농도로 존재하는 것인 제약 제제.

34. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제제의 점도가 약 5 내지 20 cp인 제제.

35. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제제의 점도가 약 5 내지 15 cp인 제제.

36. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 제제의 점도가 7 내지 12 cp인 제제.

37. 실시양태 34에 있어서, 제제의 점도가 약 8 cp 미만인 제제.

38. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, pH가 약 6.6 내지 7.6인 제제.

39. 실시양태 38에 있어서, 제제의 pH가 약 6.8 내지 7.4인 제제.

40. 실시양태 38에 있어서, 제제의 pH가 약 7.0 내지 7.3인 제제.

41. 실시양태 38에 있어서, 제제의 pH가 약 6.9, 7.0, 7.1, 7.2 또는 7.3인 제제.

42. 실시양태 38에 있어서, 제제의 pH가 약 7.1인 제제.

43. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 0.01% 내지 0.5% 농도의 계면활성제를 포함하는 제제.

44. 실시양태 43에 있어서, 계면활성제의 농도가 약 0.02% 내지 약 0.1%인 제제.

45. 실시양태 43 또는 44에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80인 제제.

46. 실시양태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 계면활성제가 0.02% 농도의 폴리소르베이트 80인 제제.

47. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 킬레이트화제를 포함하는 제제.

48. 실시양태 47에 있어서, 킬레이트화제의 농도가 약 0.01 mM 내지 약 0.5 mM인 제제.

49. 실시양태 47에 있어서, 킬레이트화제의 농도가 약 0.05 mM 내지 0.2 mM인 제제.

50. 실시양태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 킬레이트화제가 DPTA, EDTA 및 EGTA로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제제.

51. 실시양태 47 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 킬레이트화제가 DPTA인 제제.

52. 실시양태 51에 있어서, DPTA의 농도가 약 0.05 mM인 제제.

53. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-140 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘; 및

(iv) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

54. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-140 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA;

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

55. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-140 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 25-30 mM 히스티딘; 및

(iv) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 7.0 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

56. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-140 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 25-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA;

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 7.0 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

57. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘; 및

(iv) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

58. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA;

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

59. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA;

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80;

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 7.1인 안정한 제약 제제.

60. 실시양태 53 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 약 10-85 mg/mg mL의 폴리펩티드를 포함하는 제제.

61. 실시양태 58 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 약 10.7 mg/mL, 약 21.4 mg/mL, 약 50 mg/mL 또는 약 71.4 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 제제.

62. (i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA;

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 제제를 약 1.0 mL 이하로 포함하는 단위 투여 형태.

63. 실시양태 63에 있어서, 제제가

(i) 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA;

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, 제제의 pH가 약 7.1인 단위 투여 형태.

64. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 하나의 루프가 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 및 FG 루프에 비해 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 갖는 것인 제제.

65. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프 중 적어도 하나가 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 BC, DE 또는 FG 루프 중 하나의 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는 것인 제제.

66. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인이 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 각각의 BC, DE 또는 FG 루프에 비해 1개의 아미노산 치환을 갖는 것인 제제.

67. 실시양태 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인의 BC, DE 및 FG 루프가 각각 서열식별번호: 5, 6 및 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.

68. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인이 서열식별번호: 8, 9 또는 10의 비-BC, DE 및 FG 루프 영역에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.

69. 실시양태 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, ¹⁰Fn3 도메인이 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.

70. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 Fc 도메인을 포함하는 것인 제제.

71. 실시양태 71에 있어서, 제제 내의 폴리펩티드가 서열식별번호: 78에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.

72. 실시양태 71에 있어서, 제제 내의 폴리펩티드가 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 것인 제제.

73. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩티드가 이량체인 제제.

74. (i) 서열식별번호: 78의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 5-25% 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 20-30 mM 히스티딘; 및

(iv) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

75. 실시양태 75에 있어서, 약 0.02-0.06 mM DTPA를 추가로 포함하는 제제.

76. (i) 서열식별번호: 78의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 25-30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.02-0.06 mM DTPA;

(v) 약 0.01-0.05% 폴리소르베이트 80; 및

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 7.0 내지 7.3인 안정한 제약 제제.

77. (i) 서열식별번호: 78의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 약 10-75 mg/mL;

(ii) 약 600 mM 트레할로스 2수화물;

(iii) 약 30 mM 히스티딘;

(iv) 약 0.05 mM DTPA;

(v) 약 0.02% 폴리소르베이트 80;

(vi) 제약상 허용되는 수성 담체

를 포함하며, pH가 약 7.1인 안정한 제약 제제.

78. 실시양태 77 또는 실시양태 78에 있어서, 약 10.7 mg/mL, 약 21.4 mg/mL, 약 50 mg/mL 또는 약 71.4 mg/mL의 폴리펩티드를 포함하는 제제.

79. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사용으로 제제화되는 제제.

80. 실시양태 80에 있어서, 피하 주사용 제제.

81. 상기 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 약 0.3 mL 내지 1 mL의 부피의 단위 투여 형태로 제공되는 제제.

82. 실시양태 82에 있어서, 단위 투여 형태가 약 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL, 0.6 mL, 0.7 mL, 0.8 mL, 0.9 mL 또는 1.0 mL의 부피로 제공되는 것인 제제.

83. 유효량의 상기 실시양태 중 어느 하나의 제약 제제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 미오스타틴-관련 질환 또는 장애를 약화시키거나 억제하는 방법.

84. 실시양태 84에 있어서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애가 대상체 내 근육의 변성 또는 소모와 연관된 것인 방법.

85. 실시양태 84에 있어서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애가 대사 장애인 방법.

86. 실시양태 84에 있어서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애가 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 베커 근육 이영양증 (BMD), 척수성 근육 위축 및 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.

87. 실시양태 84에 있어서, 미오스타틴-관련 질환 또는 장애가 근육감소증 또는 제II형 당뇨병인 방법.

88. 실시양태 84 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 약 5 mg 내지 200 mg의 투여량으로 투여되는 것인 방법.

89. 실시양태 89에 있어서, 미오스타틴에 결합하는 피브로넥틴 유형 III 제10 (¹⁰Fn3) 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 약 7.5, 15, 35 또는 50 mg의 투여량으로 투여되는 것인 방법.

90. 실시양태 84 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 제제가 피하로 투여되는 것인 방법.

91. 실시양태 84 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 제제가 약 5 mg 내지 약 200 mg의 매주 투여량으로 투여되는 것인 방법.

92. 실시양태 84 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 제제가 약 5 mg 내지 약 50 mg의 매주 투여량으로 투여되는 것인 방법.

93. 실시양태 84 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 제제가 약 7.5 mg, 약 15 mg, 약 35 mg 또는 약 50 mg의 매주 투여량으로 피하로 투여되는 것인 방법.

94. 실시양태 84 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 21세 미만의 소아 환자인 방법.

95. 실시양태 95에 있어서, 대상체가 약 6 내지 12세의 소아 환자인 방법.

96. 실시양태 84 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 약 45 kg 미만이고 약 7.5 mg 내지 약 35 mg의 투여량을 투여받는 것인 방법.

97. 실시양태 84 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 약 45 kg 초과이고 약 15 mg 내지 약 50 mg의 투여량을 투여받는 것인 방법.

참조로 포함

특허 문서 및 웹사이트를 비롯하여 본원에 기재된 모든 문서 및 참고문헌은 전체적으로 또는 부분적으로 본 문서에 기록된 것과 동일한 정도로 본 문서에 참조로 개별적으로 포함된다.

본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 기재되며, 이는 단지 예시적이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명이 상세하게 및 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되지만, 그의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 분명할 것이다.

실시예 1

A. 항-미오스타틴 애드넥틴의 발현 및 정제

불용성 및 가용성 항-미오스타틴 애드넥틴을 클로닝하고, 발현하고, 정제하는 방법은 이전에 기재되었다 (미국 특허 8,933,199; 8,993,265; 8,853,154; 및 9,493,546). 간략하게, 항-미오스타틴 애드넥틴을 코딩하는 핵산을 pET9d 벡터 내로 클로닝하고, 이. 콜라이 BL21 DE3 plysS 세포에서 발현시켰다. 20 ml의 접종 배양물 (단일 플레이팅된 콜로니로부터 생성됨)을 사용하여 50 μg/ml 카나마이신 및 34 μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 1 리터의 LB 배지 또는 TB-밤샘 발현 배지 (자가 유도)에 접종하였다. LB 배지 내의 배양물을 37℃에서 A₆₀₀ 0.6-1.0까지 인큐베이션한 다음, 이를 1 mM 이소프로필-β-티오갈락토시드 (IPTG)로 유도하고, 30℃에서 4시간 동안 성장시켰다. TB-밤샘 발현 배지에서 성장시킨 배양물을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하고, 이때 온도를 18℃로 낮추고, 19시간 동안 성장시켰다. 배양물을 4℃에서 ≥10,000 g로 30분 동안 원심분리하여 수거하였다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 해동시킨 후, 세포 펠릿을 얼음 상에서 울트라-투락스 균질화기 (이카 웍스(IKA works))를 사용하여 25 ml의 용해 완충제 (20 mM NaH₂PO₄, 0.5 M NaCl, 1x 컴플리트(Complete)™ 프로테아제 억제제 칵테일-EDTA 무함유 (로슈(Roche)), pH 7.4) 중에 재현탁시켰다. 모델 M-110S 미세유동화기 (마이크로플루이딕스(Microfluidics))를 사용하여 고압 균질화 (≥18,000 psi)에 의해 세포 용해를 달성하였다.

불용성 항-미오스타틴 애드넥틴의 경우, 불용성 분획을 4℃에서 ≥23,300 g로 30분 동안 원심분리하여 분리하였다. 용해물의 원심분리로부터 회수한 불용성 펠릿을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl, pH7.4로 세척하였다. 펠릿을 초음파처리하면서 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl pH 7.4 중 6 M 구아니딘 히드로클로라이드 중에 재가용화시키고, 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 재가용화된 펠릿을 0.45 μm 필터로 여과하고, 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/6 M 구아니딘 pH7.4 완충제로 평형화시킨 히스트랩 칼럼 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 칼럼을 추가의 25 칼럼 부피에 대해 동일한 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/6M 구아니딘-HCl, pH 7.4 중 50 mM 이미다졸로 용리시켰다. 정제된 단백질을 50 mM 아세트산나트륨/150 mM NaCl, pH 4.5 또는 PBS, pH 7.2에 대한 투석에 의해 재폴딩하였다.

가용성 항-미오스타틴 애드넥틴의 경우, 0.45 μm 필터를 사용하여 상청액을 정화시켰다. 정화된 용해물을 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl, pH 7.4로 사전-평형화시킨 히스트랩 칼럼 (지이(GE)) 상에 로딩하였다. 이어서 칼럼을 25 칼럼 부피의 동일한 완충제, 이어서 20 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/25 mM 이미다졸, pH 7.4, 그 다음 35 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/40 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척하였다. 단백질을 15 칼럼 부피의 20 mM 인산나트륨/500 mM NaCl/500 mM 이미다졸, pH 7.4로 용리시키고, A₂₈₀에서의 흡광도를 기준으로 하여 분획을 풀링하고, 1x PBS 또는 50 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 8.5 또는 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH 4.5에 대하여 투석하였다. 침전물을 0.22 μm 필터로 여과하여 제거하였다.

B. Fc-포맷화된 항-미오스타틴 애드넥틴의 발현 및 정제

DNA 생성을 위해, 선택된 항-미오스타틴 애드넥틴을 코딩하는 핵산을 pDV-16 플라스미드 내로 클로닝하고 이에 의해 이. 콜라이 Top10 세포를 형질전환시켰다. pDV-16은 변형 버전의 pTT5 (입스 두로처(Yves Durocher), NRC 캐나다)이며, 여기에는 인간 IgG1-Fc 코딩 서열이 도입되었고, 그 앞에 신호 서열이 있고, Fc의 각 말단에 애드넥틴 코딩 서열이 삽입되도록 제한 부위가 포함되었다. 형질전환된 세포를, 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 1 L의 루리아 브로쓰에 접종하고, 37℃에서 225 rpm으로 18시간 동안 회전식 인큐베이터에서 인큐베이션하여 확장시켰다. 박테리아 펠릿을 4℃에서 >10000g로 30분 동안 원심분리하여 수거하였다. 정제된 플라스미드 DNA를 퀴아젠 플라스미드 플러스 메가 키트 (퀴아젠(QIAGEN))를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 기재된 바와 같이 단리하였다. 정제된 DNA를 260nm에서의 흡광도를 사용하여 정량화하고, 사용 전에 -80℃에서 동결시켰다.

HEK 293-EBNA1 (클론 6E) (입스 두로처, NRC 캐나다) 세포를 37℃, 5% CO₂에서 10 L 지이 헬스케어 웨이브(GE Healthcare Wave) 백 내의 2L의 F17 배지에서 2x10⁶개 세포/ml로 확장시키고, 18 rpm으로 8도 각으로 진탕시켜 혼합하였다.

DNA를 하기와 같이 형질감염을 위해 제조하였다: F17 배지를 37℃로 가온하였다. DNA 및 PEI 형질감염 시약을 멸균 생물안전성 후드에서 해동시켰다. DNA (2.25 mg)를 멸균 폴리프로필렌 배양 플라스크 내의 100 ml의 가온된 F17 배지에 첨가하고, 스월링에 의해 서서히 혼합하였다. 별개의 플라스크에서, 6.75 mg의 PEI (1 mg/ml)를 100 ml의 사전-가온된 F17 배지와 합하고, 스월링에 의해 서서히 혼합하였다. 플라스크를 5분 동안 방치시킨 후에, DNA를 함유하는 플라스크에 PEI 용액을 첨가하고 스월링에 의해 서서히 혼합하여 내용물을 합하였다.

DNA:PEI 혼합물을 함유하는 플라스크의 내용물을, 생물안전성 후드 내 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후의 HEK 293-6E 세포를 함유하는 웨이브 백에 첨가하였다. 형질감염된 HEK 293-6E 세포를 함유하는 백을 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 18 RPM으로 8도 각으로 진탕시켜 혼합하였다. 24시간 후에, F17 배지 중에 용해된 100 ml의 멸균 여과 20% 트립톤 N1 (오르가노테크니(Organotechnie), 캐나다)을 배양물에 무균으로 첨가하였다. 세포 및 배지를 상기 기재된 바와 같은 인큐베이션 추가 72시간 후에 수거하였다. 대안적으로, 진탕 플라스크 (2 L 플라스크 내의 0.5 L 배지)에서의 일시적인 HEK 발현을 1:2의 DNA:PEI 비로 수행할 수 있었다. 세포를 4℃에서 6000g로 30분 동안 원심분리하여 조건화 배지로부터 분리하였다. 조건화 배지를 유지하고, 0.2 μM 필터를 통해 여과하고, 4℃에서 저장하였다.

PBS 중에서 사전-평형화시킨 지이 맙셀렉트 슈어 수지를 함유하는 10 ml 크로마토그래피 칼럼에 조건화 배지를 5 ml/분의 비율로 적용하였다. 여과된 조건화 배지를 로딩한 후에, 칼럼을 실온에서 적어도 100 ml의 PBS로 세척하였다. 정제된 생성물을 100 mM 글리신/100 mM NaCl, pH 3.0의 적용에 의해 칼럼으로부터 용리시켰다. 분획을 1/6 부피의 1M 트리스 pH 8을 함유하는 튜브 내로 수집하거나 또는 A280 흡광도에 따라 풀링한 후에 1M 트리스 pH 8을 100 mM까지 첨가하여 pH 중성화하였다. 고분자량 종의 함량이 단백질 A 용리 후에 5% 초과인 경우, 샘플을 PBS 중에서 슈퍼덱스 200 (26/60) 칼럼 (지이 헬스케어)에 의해 추가로 정제하였다. 단량체를 함유하는 SEC 분획을 풀링하고 농축시켰다. 생성된 단백질 A 또는 SEC 풀을 4℃에서 PBS에 대하여 철저하게 투석하고, 0.22 μm 컷오프 필터를 사용하여 멸균 여과한 후 -80℃에서 동결시켰다.

C. 벌크 제조: 포유동물 발현 및 1차 회수: UCOE CHO 시스템

편재성 염색질 개방 요소 (UCOE)를 함유하는 pUCOE 벡터 [밀리포어로부터의 변형된 UCOE 벡터] 내로 클로닝된 항-미오스타틴 애드넥틴-Fc 융합체를 CHO-S 세포에 형질감염시켜 포유동물 리서치 셀 뱅크(Research Cell Bank, RCB)를 생성하였다. 12.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 선택 배지 (CD CHO 배지 (인비트로젠(Invitrogen)) 내 0.04% (v/v) L-글루타민 (인비트로젠) 및 0.01% (v/v) HT 보충제 (인비트로젠))에서 세포를 확장시켜 RCB를 확립하였다. 낮은 계대배양 수 세포를 원심분리를 통해 무균으로 단리하고, 뱅킹 배지 (CD CHO 배지 (인비트로젠) 내 0.04% (v/v) L-글루타민 (인비트로젠), 0.01% (v/v) HT 보충제 (인비트로젠) 및 7.5% (v/v) DMSO) 중에 1 x 10⁷개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다. 이들 세포를 초기에 70% 이소프로필 알콜 조에서 -80℃에서 밤새 동결시키고, 이어서 다음 날 장지간 저장을 위해 액체 질소로 옮겼다.

단일 RCB 바이알을 12.5 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 25 mL의 선택 배지 내로 해동시키고 배양물을 동일한 배지에서 확장시켜 세포 배양을 개시하였다. 세포를 분리 전의 1-2 x 10⁶개 세포/mL 내지 0.2 x 10⁶개 세포/mL의 농도에 도달하도록 하였다. 세포를 일반적으로 생물반응기 시딩 전 2-4주 사이에 유지시켰다. 확장 배양물을 최종 시간까지 계대배양하고, 8 L의 생산 배지 (0.01% (v/v) HT 보충제 (인비트로젠), 0.04% (v/v) 글루타맥스 (깁코(Gibco)) 및 0.005% (v/v) 플루로닉 F-68 (깁코)을 함유하는 인비트로젠 CD CHO 배지)를 함유하는 15 L 생물반응기가 0.2 x 10⁶개 세포/mL의 최종 밀도로 시딩될 수 있는 지점까지 성장하도록 하였다. 생물반응기 배양물을 VCD (생존 세포 밀도), 퍼센트 생존율, pH 및 글루코스 농도에 대해 매일 모니터링하였다. 생물반응기 배양물에 공급 배지를 10% 총 부피 볼루스 첨가로 제3일 및 제6일에 공급하였다. 배양물을 제7일 내지 제9일에 수거하였으며 퍼센트 생존율은 >70%였다. 배양 동안, 생물반응기 배양물을 pH 7.1, 온도 37℃, %DO2 40% 및 100의 일정한 RPM으로 제어하였다.

수거 날, 생물반응기 배양물을 6.0/3.0 μm 깊이 필터에 직접 통과시킨 후, 멸균 백 내로의 멸균 0.8/0.2 μm 여과를 수행하였다. 정화된 멸균 배양물을 2-8℃에서 밤새 저장하였다. 이어서, 정화된 배양물을 30,000 kDa 막을 사용하는 플랫시트 TFF를 통해 농축시켰다. 대략적인 농도는 수거 역가에 따라 6x였다. 이어서, 농축된 상청액을 PETG 병 내로 멸균 여과하고, 직접 가공하거나 -80℃에서 저장하였다.

D. 항-미오스타틴-애드넥틴-Fc 융합체 정제

수거된 배양물 상청액 (순수한 것 또는 농축된 것)을 PBS로 사전 평형화시킨 맙셀렉트 단백질 A 칼럼 상에 로딩하였다. 칼럼을 5CV의 50mM 트리스 pH8.0, 1M 우레아, 10% PG로 세척하였다. 애드넥틴-Fc 융합체를 100 mM 글리신 pH 3.3을 사용하여, 피크를 수집하면서, 1CV의 200 mM 아세트산나트륨 pH 4.5을 사전 충전한 용기 내로 용리시켰다. 피크 용리는 A280에서의 흡광도를 기준으로 하였다.

단백질 A 용리물을 2 M 시트르산의 첨가에 의해 pH 3.0으로 희석하고, 바이러스 불활성화를 위해 실온에서 1시간 동안 놓아두었다. 이어서, 샘플을 pH 4.5에 도달할 때까지 200 mM 삼염기성 인산나트륨으로 희석하였다. 필요한 경우, 용액을 10ms/cm 미만의 보다 낮은 전도도에 이를 때까지 물로 추가로 희석하였다.

희석된 단백질 A 용리물을 음성 포획 모드에서 50mM 아세트산나트륨 pH 4.5로 사전 조건화한 도소 Q 600C AR (도소 바이오사이언스) 상에 통과시켰다. A280에서의 흡광도를 기준으로 하여 통과 피크를 수집하였다. 칼럼을 50mM 아세트산나트륨으로 세척하고, 0.2N NaOH로 스트리핑하였다.

Q 600C AR 통과물을 30kD MWCO 중공 섬유 막 (지이)을 이용하는 접선 흐름 여과를 사용하여, 보유물을 매우 서서히 혼합하면서 제제화하였다. 애드넥틴-Fc 융합체를 5 내지 8 투석부피에 대해 히스티딘 (20-30 mM) 및 디사카라이드 (300 내지 600 mM) pH 7.1-7.8 내로 투석여과한 다음, 표적 단백질 농도로 농축시켰다. 정제된 애드넥틴-Fc 융합체의 벌크 부피를 -60℃에서 12L FFtp 백 내에 85-140 mg/mL의 농도로 저장하였다. 이어서, 정제된 애드넥틴-Fc 융합 단백질을 해동시키고, 분석을 위해 목적하는 단백질 농도로 희석하였다.

실시예 2

본 연구에서, 수크로스 또는 트레할로스 당을 함유하는 25 mM 히스티딘 완충제, pH 6.9 중 항-미오스타틴 애드넥틴에 대해 %HMW 형성 및 %LMW 형성을 연구하였다.

표 1: 항-미오스타틴 애드넥틴 약물 제품 (DP) 특성

표 2: 물질

표 3: 제제

A. 샘플 제조

135 mg/mL 단백질 농도의 항-미오스타틴 애드넥틴의 경우, 히스티딘 완충제 중에서 투석시 -0.4 pH 단위의 pH 이동이 관찰되었다. 이러한 문제를 피하고 거의 중성인 pH에서의 제제의 안정성을 평가할 수 있기 위해, 완충제 pH를 pH 7.3으로 조정하여 생성된 단백질 용액이 pH 6.9이도록 하였다.

표 4: 완충제 제조

적절한 양의 고체를 1600 L 밀리-큐 물 중에 용해시켰다 (표에 따름). pH를 6N HCl을 사용하여 pH 7.3으로 조정하고, 최종 부피를 2L로 조정하였다. 용액을 0.22 μm 필터를 통해 여과하였으며, 완충제에 대해 수득된 최종 pH가 표 5에 제시된다.

표 5: 6N HCl을 사용한 조정 전 및 후 제제 pH에 대한 pH

50 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴 DP 40 mL를 5℃에서의 1회 사이클을 포함하여 5회 사이클 동안 상이한 제제 완충제에 대하여 투석하였다.

표 6: 투석 및 농축 후 농도 조정

투석된 용액을 각각의 조건에 대해 130-140 mg/mL로 농축시키고, 샘플을 5℃, 25℃ 및 35℃에서 저장하였다.

B. 결과

제0 시점 (T0)에서의 제제 특징

제0 시점 (T0)에서, 희석되지 않은 샘플을 입자 형성에 대해 시각적으로 검사함으로써 각각의 제제의 외관을 평가하였다. 샘플 중 어느 것도 시각적 미립자의 존재를 나타내지 않았다.

각각의 제제의 희석되지 않은 샘플을 실온에서 평형화시키고, 써모 로스(Thermo Ross) pHerpect pH 프로브 또는 오리온 3 스타(Orion 3 Star)가 구비된 써모 pH 미터 (제조업체: 써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corporation))를 기기 보정 및 샘플 측정에 대한 제조업체의 지침서 (보정 기울기 96.5%)에 따라 사용하여 pH를 측정하였다. 표 7에 제시된 바와 같이, 제제 완충제의 pH 조정에도 불구하고, 샘플의 최종 pH는 여전히 T0에서 6.4-6.6이었으며, 이는 놀랍게도 단백질이 제제에 중요한 완충 역할을 한다는 것을 나타낸다.

표 7: T0에서의 pH 측정

희석되지 않은 제제의 샘플을 실온에서 평형화시키고, SoloVPE를 제조업체의 지침서에 따라 사용하여 단백질 농도 측정을 수행하였다. 모든 농도는 135 mg/mL의 표적 농도의 5% 이내였다. 결과가 표 8에 제시된다.

표 8: T0에서의 농도 측정

바프로 기반 삼투압계 (제조업체: 웨스코(Wescor); 모델# 5520)를 제조업체의 지침서 (샘플 부피 10 μL)에 따라 사용하여 각각의 제제의 희석되지 않은 샘플에 대해 오스몰랄농도 측정을 수행하였다. 추가의 샘플을 그의 각각의 완충제 중에 50 mg/mL의 최종 농도로 희석하고, 오스몰랄농도 측정을 반복하였다. 결과가 표 9에 제시된다.

표 9: 제제 완충제 및 단백질 샘플에 대한 오스몰랄농도 측정

트레할로스는 동일한 농도 수준의 수크로스와 비교하여 가장 낮은 오스몰랄농도를 나타냈다. 제제 완충제 자체와 비교하여, 50 및 135 mg/mL의 샘플은 약간 증가된 오스몰랄농도를 나타냈으며, 이는 오스몰랄농도에 대한 단백질의 효과를 나타낸다. 그러나, 50 mg/mL 샘플과 135 mg/mL 샘플 사이의 차이는 아주 적었으며, 이는 단백질 농도가 제제의 오스몰랄농도에 대한 아주 적은 효과를 갖는다는 것을 시사한다.

m-VROC 점도계 (제조업체: 레오센스(Rheosense)) (샘플 부피는 500 μL였음)를 25℃에서 상이한 유량 (30 내지 300 μL/분)으로 사용하여 점도 측정을 수행하였다. 10% 사카라이드 농도를 갖는 제제는 그의 20% 대응물보다 더 낮은 점도를 가졌다. 각각의 농도에서의 사카라이드의 비교의 경우, 트레할로스는 수크로스보다 더 낮은 점도를 보유하는 것으로 나타났다. 결과가 표 10에 제시된다.

표 10: 25℃에서 135mg/mL의 단백질 샘플에 대한 점도 측정

시간 경과에 따른 제제 안정성

시간 경과에 따른 응집체의 형성을 측정하기 위해, 5℃, 25℃ 및 35℃에서 유지시킨 샘플에 대해 다양한 시점에서 SE-HPLC를 수행하였다. 20% 사카라이드를 함유하는 샘플은 그의 10% 대응물보다 더 낮은 %HMW를 나타냈으며, 이는 제제 중 더 높은 사카라이드 함량이 항-미오스타틴 애드넥틴 DP의 안정성에 유익하였다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 트레할로스를 함유하는 제제는 수크로스와 비교하여, 특히 더 높은 온도 (25℃ 및 35℃)에서 항-미오스타틴 애드넥틴 DP의 훨씬 더 높은 안정성을 입증하였다. (도 2 및 3).

pH의 효과

pH 6.5 및 7.0에서 수크로스 또는 트레할로스의 존재 하에 80 mg/mL의 항-미오스타틴 애드넥틴을 함유하는 제제의 %HMWS를 25℃ 및 35℃에서 2주 동안 저장한 후 조사하였다. 도 5에 제시된 데이터는 pH 7.0에서의 제제가 두 온도에서 더 안정하다는 것을 나타낸다.

추가로, 히스티딘 완충제는 놀랍게도 포스페이트 완충제를 함유하는 이전의 제제보다 pH 7.0에서 더 우수한 안정화 특성 (더 적은 HMWS)을 나타내는 것으로 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).

킬레이트화제 첨가의 효과

Fe²⁺의 존재 및 부재 하에 킬레이트화제를 제제에 첨가한 효과를 또한 조사하였다. 50 μM DPTA의 첨가가 제제를 추가로 안정화시켰다는 것을 입증한 데이터가 또한 실온 (광 노출) 및 35℃ 중 어느 하나에서 1개월 동안 Fe의 존재 및 부재 하에 > 20%의 %HMW 감소에 의해 조사되었다 (예를 들어, 2.8% v. 3.6%; 2.8% v. 3.3%).

실시예 3

본 실시예에서, 실시예 2로부터의 항-인간 미오스타틴 길항제 애드넥틴-Fc 융합 이량체를 함유하는 특정 제제의 점도를 하기 표 11 및 도 4에 나타낸 바와 같이 센티포아즈 단위로 측정하였다 (트레할로스 (tre) 및 수크로스 (suc)는 범례에 나타냄). 단백질 농도 및 용액의 온도의 함수로서 측정을 행하였다. 데이터는 높은 디사카라이드 농도 (550 mM)를 함유하는 제제가 일반적으로 광범위한 항-미오스타틴 애드넥틴 농도에서 피하 사용에 적합한 점도를 보인다는 것을 나타낸다. 데이터는 또한 트레할로스를 함유하는 용액의 점도가 동일한 온도 및 단백질 농도 하에 수크로스를 함유하는 용액의 점도와 비교하여 더 낮다는 것을 나타낸다.

표 11:

실시예 4

본 실시예에서, 실시예 2에 사용된 항-미오스타틴-Fc 융합 이량체를 pH 7.1에서의 30 mM 히스티딘, 600 mM 트레할로스, 0.05 mM DPTA, 0.02% PS80 중 다양한 단백질 농도로 제제화하였다.

1 mL 시린지에서 0.7 mL의 부피로 10.7 mg/mL, 21.4 mg/mL, 50 mg/mL 및 71.4 mg/mL의 단백질 농도로 단위 투여 형태를 제조하였다 (총 약물 제품 각각 7.5 mg, 15 mg, 35 mg 및 50 mg). 시린지를 다양한 저장 조건 하에 수평으로 저장하고, 2주 및/또는 1개월에 SE-HPLC에 의해 분석하였다. 데이터가 표 12-15에 제공된다 (H=수평; RH=상대 습도; RL=실내 광; E=노출됨; P=보호됨).

표 12: 7.5 mg/시린지, 1 mL 유형 1 유리 시린지에 대한 안정성 데이터

표 13: 15.0 mg/시린지, 1-mL 유형 1-유리 시린지에 대한 안정성 데이터

표 14: 35.0 mg/시린지, 1-mL 유형 1 유리 시린지에 대한 안정성 데이터

표 15: 50.0 mg/시린지, 1-mL 유형 1 유리 시린지에 대한 안정성 데이터

이 제제의 점도를 또한 조사하였다. 도 6에 제시된 데이터는 제제의 점도가 모든 온도 및 단백질 농도에서 8 cP 미만으로 유지되었음을 입증한다.

유리한 점도 데이터에 기초하여, 단위 투여 형태의 제제의 동적 힘을 측정하였다. 5℃에서 5 mg/mL, 50 mg/mL 및 75 mg/mL 단위 투여 형태 (1.0 mL 시린지 내 0.7/mL 부피; 27G 바늘)의 120 mm/분의 속도에서의 압출 (활택) 힘은 2.528 내지 2.704 N이었고; 450 mm/분의 속도에서는 5.696 내지 6.123N이었다. 5℃에서 이들 단위 투여 형태의 120 mm/분의 속도에서의 유체역학적 힘은 0.922 N 내지 1.098 N이었고, 450 mm/분의 속도에서는 3.042 내지 3.509 N이었다.

결론

이들 결과는 10% 초과의 디사카라이드 농도를 갖는 제제가 신속한 피하 투여에 적합한 적은 부피의 단위 투여 형태의 생성을 가능하게 하는 오스몰랄농도 및 점도를 여전히 유지하면서 항-미오스타틴 애드넥틴 분자의 안정성에 유의하게 기여한다는 것을 입증한다.

결과는 추가로 놀랍게도 항-미오스타틴 애드넥틴의 고유한 완충 능력이 완충제의 pKa와 상당히 먼 pH 6.9-7.3의 히스티딘 완충제 중에서의 제제화를 가능하게 하여 생리학적 pH에서 안정한 제제를 생성한다는 것을 제시한다.

이들 유리한 특색은 보다 높은 온도, 예를 들어 25℃ 초과, 30℃ 초과, 35℃ 초과 또는 최대 40℃에서 유의한 기간 동안 안정한 제제를 제공하여 의료 시설 외부에서의 저장 및 투여를 가능하게 한다. 이러한 특성은 환자 또는 그의 보호자가 의료 시설로 이동할 필요 없이 가정에서 약물을 투여하는 것을 가능하게 한다는 점에서 특히 유리하다.

아미노산 및 핵산의 서열의 요약

SEQUENCE LISTING <110> BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY <120> STABLE FORMULATIONS OF FIBRONECTIN BASED SCAFFOLD DOMAIN PROTEINS THAT BIND TO MYOSTATIN <130> MXI-607PC <140> PCT/US2018/030851 <141> 2018-05-03 <150> US 62/500,649 <151> 2017-05-03 <160> 83 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(375) <223> Human prepromyostatin <400> 1 Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 1 5 10 15 Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn 20 25 30 Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr 35 40 45 Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu 65 70 75 80 Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val 85 90 95 Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His 100 105 110 Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu 115 120 125 Met Gln Val Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser 130 135 140 Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu 145 150 155 160 Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu 165 170 175 Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu 180 185 190 Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val 195 200 205 Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly 210 215 220 Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr 225 230 235 240 Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys 245 250 255 Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys 260 265 270 Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 290 295 300 Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys 305 310 315 320 Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 325 330 335 Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 340 345 350 Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val 355 360 365 Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 370 375 <210> 2 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(352) <223> Human pro-myostatin <400> 2 Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 1 5 10 15 Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30 Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45 Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60 Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80 Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95 Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110 Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val 115 120 125 Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140 Thr Val Phe Val Gln Ile 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PRT <213> Unknown <220> <223> Mature myostatin conserved in human, murine, rat, chicken, turkey, dog, horse, and pig <400> 3 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 4 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(94) <223> Wild-type human fibronectin type III domain (10Fn3) <400> 4 Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr 1 5 10 15 Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr 20 25 30 Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 35 40 45 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Synthetic: Anti-myostatin adnectin core sequence preceded by N-terminal extension sequence(GVSDVPRDL) and followed by a C-terminal tail (EI)) <400> 10 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Leu Pro His Gln Gly Lys Ala Asn 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Arg Gly Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Val Thr 65 70 75 80 Asp Thr Gly Tyr Leu Lys Tyr Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary leader, AdNT1 <400> 11 Met Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary leader, AdNT2 <400> 12 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Exemplary leader, 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<220> <223> Synthetic: hinge sequence <400> 74 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser <210> 75 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hinge sequence <400> 75 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ser Ser <210> 76 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(330) <223> heavy chain constant region of human IgG1 <400> 76 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 77 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: leader sequence <400> 77 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 78 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-myostatin adnectin Fc-Fusion <400> 78 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu 225 230 235 240 Leu Glu Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala 245 250 255 Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Leu Pro His Gln Gly Lys 260 265 270 Ala Asn Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro 275 280 285 Val Gln Glu Phe Thr Val Pro Gly Arg Gly Val Thr Ala Thr Ile Ser 290 295 300 Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr 305 310 315 320 Val Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Lys Tyr Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr 325 330 335 Arg Thr Glu Ile 340 <210> 79 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-myostatin adnectin Fc-Fusion <400> 79 Gly Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Ser Leu Pro His Gln Gly Lys Ala Asn 20 25 30 Tyr Tyr Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln 35 40 45 Glu Phe Thr Val Pro Gly Arg Gly Val Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Val Thr 65 70 75 80 Asp Thr Gly Tyr Leu Lys Tyr Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr 85 90 95 Glu Ile Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 80 <211> 206 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(206) <223> human IgG1 CH2 and CH3 region <400> 80 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 35 40 45 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 115 120 125 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 130 135 140 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 145 150 155 160 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 165 170 175 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 180 185 190 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205 <210> 81 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: exemplary N-terminal leader sequence for production of polypeptides in a mammalian system <400> 81 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 82 <211> 900 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-myostatin adnectin Fc-Fusion <400> 82 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 60 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 120 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 180 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 240 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 300 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 360 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 420 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 480 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 540 ctctccctgt ctcccgagct gcagctggag gaaagcgccg ctgaggctca ggaaggagaa 600 ctggaaggcg tgagcgacgt gccacgggat ctagaagtgg tggctgctac ccccacaagc 660 ttgctgatca gctggtctct gccgcaccaa ggtaaagcca attattaccg catcacttac 720 ggcgaaacag gaggcaatag ccctgtccag gagttcactg tgcctggtcg tggtgttaca 780 gctaccatca gcggccttaa acctggcgtt gattatacca tcactgtgta tgctgtcact 840 gttactgata cagggtacct caagtacaaa ccaatttcca ttaattaccg gaccgaaatt 900 <210> 83 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Anti-myostatin adnectin Fc-Fusion <400> 83 ggcgtgagcg acgtgccccg ggatctagaa gtggtggctg ctacccccac aagcttgctg 60 atcagctggt ctctgccgca ccaaggtaaa gccaattatt accgcatcac ttacggcgaa 120 acaggaggca atagccctgt ccaggagttc actgtgcctg gtcgtggtgt tacagctacc 180 atcagcggcc ttaaacctgg cgttgattat accatcactg tgtatgctgt cactgttact 240 gatacagggt acctcaagta caaaccaatt tccattaatt accggaccga aattgagcct 300 aagagctccg acaaaaccca cacatgccca ccttgtccag cccccgaact gctgggcggc 360 ccttcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tcccgggaaa 990

Claims

(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 10.7 mg/mL;
(b) 20 내지 25% (w/v) 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 21.4 mg/mL;
(b) 20 내지 25% (w/v) 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 50 mg/mL;
(b) 20 내지 25% (w/v) 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘; 및
(d) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 71.4 mg/mL;
(b) 20 내지 25% (w/v) 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 10.7 mg/mL;
(b) 600 mM 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 21.4 mg/mL;
(b) 600 mM 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 50 mg/mL;
(b) 600 mM 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(a) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 71.4 mg/mL;
(b) 600 mM 트레할로스 2수화물;
(c) 20 내지 30 mM 히스티딘;
(d) 0.05 mM DTPA; 및
(e) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인
안정한 제약 제제.
(i) 서열식별번호: 78을 포함하는 폴리펩티드 약 10 내지 75 mg/mL;
(ii) 약 5 내지 25% (w/v) 트레할로스 2수화물;
(iii) 약 20 내지 30 mM 히스티딘;
(iv) 약 0.02 내지 0.06 mM DTPA;
(v) 약 0.01 내지 0.05% (w/v) 폴리소르베이트 80; 및
(v) 제약상 허용되는 수성 담체
를 포함하며, pH가 약 6.8 내지 7.3인 제제를 약 1.0 mL 이하로 포함하는 단위 투여 형태.