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KR20240054405A - 항체 약물 접합체 제제 및 이의 용도 - Google Patents

항체 약물 접합체 제제 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240054405A
KR20240054405A KR1020247012504A KR20247012504A KR20240054405A KR 20240054405 A KR20240054405 A KR 20240054405A KR 1020247012504 A KR1020247012504 A KR 1020247012504A KR 20247012504 A KR20247012504 A KR 20247012504A KR 20240054405 A KR20240054405 A KR 20240054405A
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KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
cancer
seq
egfr
drug conjugate
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247012504A
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English (en)
Inventor
릴리 시아오
챠오홍 후
Original Assignee
상하이 미라코겐 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 미라코겐 아이엔씨. filed Critical 상하이 미라코겐 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 항체 약물 접합체 또는 이의 염, 시트르산 완충액, 트레할로스, 염화나트륨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 항체 약물 접합체 제제를 제공한다. 상기 항체 약물 접합체는 Ab-(L-D) p (여기서, Ab는 항-표피 성장 인자 수용체 항체이고, L은 링커이며, D는 세포독성제임)로 표시되는 구조를 가진다.

Description

항체 약물 접합체 제제 및 이의 용도
본 발명은 생체의학 분야, 특히 항체-약물 접합체 제제 및 이의 용도에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체 (EGFR; HER1, c-ErbB1로도 알려짐)는 표피 성장 인자 계열의 세포 표면 수용체로서, 1186개의 아미노산 잔기로 구성된 막횡단 당단백질이며, 분자량은 170 kD이다. EGFR은 제1형 티로신 키나제 수용체 아형 ErbB (ErbB 1-4)에 속하며 티로신 키나제 활성을 갖는다. EGFR은 피부와 모낭을 비롯한 많은 상피 조직에서 안정적으로 발현된다. 표피 성장 인자 수용체의 비정상적인 발현이나 수용체 돌연변이로 야기된 활성화로 인해 발암이 초래될 수 있다. 대장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암 및 식도암과 같이 표피 성장 인자 수용체의 과발현이 나타나는 고형 종양이 많다. 형질전환 성장 인자 α 및 표피 성장 인자와 같은 성장 인자들은 EGFR에 대한 내인성 리간드이다. 이러한 리간드들은 표피 성장 인자 수용체에 결합하여 세포내 티로신 단백질 키나제 활성을 활성화시키고, 다수의 하향 신호 전달 경로를 개시함으로써, 정상 세포의 성장과 분화를 조절하고, 종양 세포의 침입력을 강화하며, 혈관생성을 촉진하여 종양 세포의 아폽토시스를 억제한다. 종양에서의 표피 성장 인자 수용체 과발현과 이의 종양 세포의 성장과 분화에서의 중요한 역할 때문에, 표피 성장 인자 수용체는 종양 치료의 유망한 표적이 되었다.
현재, 시중에는 2가지 항-표피 성장 인자 수용체 항체가 있는데, 그 중 하나가 표피 성장 인자 수용체에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 인간-마우스 키메라 항체인 C225 항체 (Erbitux 또는 Cetuximab, ImClone Company (지금은 Eli Lilly Company))로서, 이는 EGF 또는 TGF와 같은 리간드와 표피 성장 인자 수용체 간의 결합을 차단하고, 그의 인산화 및 하향 신호 전달을 억제함으로써, 종양 세포 성장을 억제하고, 아폽토시스를 유도하며, 기질 금속단백질분해효소 및 혈관 내피 성장 인자의 생성을 감소시킬 수 있다. 미국 FDA는 2004년에 대장암의 치료, 2006년에는 두경부암의 치료, 그리고 현재에는 더 많은 임상 시험에서 다른 암 적응증들에 대해 Erbitux의 사용을 승인하였다. 임상적으로, 대장암의 치료에 Erbitux와 이리노테칸의 조합에 대한 전체 반응률 (ORR)은 23%이고, 두경부암 치료에 Erbitux와 플루오로피리미딘과 같은 화학요법제의 조합에 대한 ORR은 13%-30%이다. Erbitux는 인간-마우스 키메라 항체이기 때문에, 임상 시험에서 환자들 중 3.7%에서 항-치료 항체 반응을 유도하였다.
또 다른 항-표피 성장 인자 수용체 항체로는, 파니투무맙 (Vectibix, Amgen Company)을 들 수 있는데, 이는 형질전환 마우스 기술로 제조된 완전 인간화된 단일클론 항체로서, 본래의 마우스 단백질 서열이 없다. 상기 항체는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적으로 삼으며, 2006년 9월에 FDA의 승인을 받았고, 플루오로피리미딘, 옥살리플라틴 및 이리노테칸과 병용하거나 화학요법 후 EGFR 양성인 전이성 대장암 치료에 사용된다. 2006년에, FDA는 화학요법 내성이 있는 전이성 대장암 (mCRC) 치료를 위한 파니투무맙의 단독요법을 승인하였다. 그러나, 파니투무맙은 IgG2 아형 항체로서, IgG1와 비교하였을 때, IgG2는 CDC 활성, ADCC 활성과 같은 생체 활성이 현저히 감소되며; 또한, IgG2 아형 항체들은 일반적으로 안정성이 좋지 않다. 이것은, 완전 인간화된 항체 파니투무맙이 키메라 항체 Erbitux에 비해 임상 효과에서 뚜렷한 장점을 나타내지 않았던 주된 이유일 수 있다. 대장암의 임상 치료의 전체 생존율 (OR)은 8%에 불과했고, 무진행 생존기간도 3.6개월 연장되는데 그쳤다.
현재, 다수의 임상 데이터에 따르면, Erbitux와 파니투무맙은 EGFR이 발현된 야생형 KRAS (KRAS 야생형)에만 치료 효과가 있었고, KRAS 돌연변이체에 대해서는 종양 성장 억제 활성이 없는 것으로 나타났다. 따라서, 미국임상종양학회에서 간행한 지침서를 보면, 항-EGFR 단일클론 항체 약물이 KRAS 야생형 대장암 환자들에게만 적용가능함을 명시적으로 지적하고 있다 (Allegra CJ, Jessup JM, Somerield MR, Hamilton SR, Hammond EH, Hayes DF, et al. American Society of Clinical Oncology provisional clinical opinion: testing for KRAS gene mutations in patients with metastatic colorectal carcinoma to predict response to anti-epidermal growth factor monoclonal antibody therapy. J. Clin Oncol. 2009; 27:2091-2096; Bardelli A, Siena S. Molecular mechanisms of resistance to cetuximab and panitumumab in colorectal cancer. J Clin Oncol. 2010; 28:1254-1261).
따라서, 치료 효능을 더욱 향상시키고 부작용을 감소시키기 위해, KRAS 돌연변이체에 대한 치료 효과가 있는, 생체 활성을 갖는 인간화된 항-표피 성장 인자 수용체 항체 약물, 특히 항체 약물, 예컨대 항체-약물 접합체가 당업계에 필요한 실정이다.
본 출원의 발명자들은, 광범위한 실험과 창의적인 노력을 통해서, EGFR과 관련된 질환들에 대해 우수한 치료 효과를 가지며, 종래 기술에 비해 제제의 안정성이 크게 향상된, 항-EGFR 항체-약물 접합체 제제를 제공하게 되었다.
이러한 점을 고려하여, 본 발명의 제1 측면에서, 본 발명은 항체-약물 접합체 제제로서, 1-20 mg/mL (예컨대, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL 또는 20 mg/mL, 또는 3-5 mg/mL, 또는 2-6 mg/mL, 또는 1-7 mg/mL, 또는 1-8 mg/mL, 또는 1-9 mg/mL, 또는 1-10 mg/mL) 농도의 항체-약물 접합체 또는 이의 염;
10-50 mM (예컨대, 10 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 또는 50 mM, 또는 19-21 mM, 또는 18-22 mM, 또는 17-23 mM, 또는 16-24 mM)의 농도 및 pH 6.3-6.7 (예컨대, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 또는 6.7)의 시트르산염 완충액;
1-10% (예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 8%, 9% 또는 10%, 또는 4-7%, 또는 4.5-6.5%, 또는 5-6%) 농도의 트레할로스;
0.1-2% (예컨대, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5% 또는 2%, 또는 0.2%-0.4%) 농도의 NaCl; 및
0.01-0.2% (예컨대, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15% 또는 0.2%, 또는 0.02-0.08%, 또는 0.03-0.07%, 또는 0.04-0.06%) 농도의 Tween 80을 포함하며;
상기 항체-약물 접합체가 하기 화학식 I의 구조를 갖는 것인, 항체-약물 접합체 제제를 제공한다:
[화학식 I]
Ab-(L-D) p
상기 식에서:
Ab는 항-EGFR 항체이고, 상기 항-EGFR 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 5-7에 나타낸 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함하고, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 12-14에 나타낸 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함하며;
L은 링커이고, 상기 링커는 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (MC-vc-PAB)이며;.
D는 세포독성제이고, 상기 세포독성제는 MMAE이며;
p는 1-9 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9, 또는 예컨대 1-7), 예컨대, 2-6, 3-5, 특히, 예컨대, 3.9, 4.0 또는 4.1이다.
트레할로스, NaCl 또는 Tween 80의 농도는 질량 부피 농도 (w/v%)이며, 이는 항체-약물 접합체 제제 100 mL당 트레할로스, 염화나트륨 또는 Tween 80의 질량 (단위: g)을 의미한다.
또한, "시트르산염 완충액"은 시트르산과 시트르산나트륨으로부터 제조되며, 이의 다양한 pH 값들은 시트르산과 시트르산나트륨의 비율을 다르게 조정하여 얻는다. "시트르산염 완충액"의 농도는 시트르산과 시트르산나트륨의 총 농도를 의미한다.
또한, 전술한 "항체-약물 접합체"는 동일하거나 상이한 DAR을 갖는 ADC 분자를 포함하는 조성물을 지칭한다는 점에 유의한다.
구체적으로, 본 발명은 복수의 항-EGFR ADC 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 경우에 따라서는, 본원에 기술된 조성물의 각 ADC는 동일한 수의 하나 이상의 세포독성제를 포함한다. 어떤 경우에는, 본원에 기술된 조성물의 각 ADC는 서로 다른 수의 하나 이상의 세포독성제를 포함한다.
본원에 기술된 항체-약물 접합체에서, 각 항-EGFR 항체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 세포독성제와 접합될 수 있다.
상기 언급한 약물-항체 비율 (DAR)은 항-EGFR 항체에 접합된 세포독성제 분자의 수를 가리킨다. 본원에 기술된 ADC에 함유된 세포독성제의 분자수는 일반적으로 정수이고, 본원에 기술된 ADC에 함유된 세포독성제의 분자수 (예를 들어, 화학식 I에서 p)가 분수인 경우, 해당 분수는 다수의 ADC 분자를 포함하는 조성물에서 각 항-EGFR 항체에 접합된 세포독성제의 평균 수를 의미한다.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체 또는 이의 염의 농도는 2 mg/mL-6 mg/mL이다.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체 또는 이의 염의 농도는 4 mg/mL이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 농도는 15 mM-25 mM이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 농도는 20 mM이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 pH는 6.3-6.5이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 pH는 6.3이다.
일부 실시형태에서, 트레할로스의 농도는 4%-7%이다.
일부 실시형태에서, 트레할로스의 농도는 5.5%이다.
일부 실시형태에서, NaCl의 농도는 0.1%-0.5%이다.
일부 실시형태에서, NaCl의 농도는 0.3%이다.
일부 실시형태에서, Tween 80의 농도는 0.01%-0.1%이다.
일부 실시형태에서, Tween 80의 농도는 0.05%이다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역 내의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 각각 서열번호 8-11에 나타난 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역 내의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 각각 서열번호 15-18에 나타난 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgA 불변 영역 또는 이의 돌연변이체로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 람다 및 카파 불변 영역 또는 이의 돌연변이체로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 1에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 1에 나타나 있다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 2에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 2에 나타나 있다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 3에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 3에 나타나 있다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 4에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 4에 나타나 있다.
일부 실시형태에서, 트레할로스는 트레할로스 이수화물이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액은 시트르산 및 시트르산나트륨으로부터 제조된다.
일부 실시형태에서, 시트르산은 시트르산 일수화물이다.
일부 실시형태에서, 시트르산나트륨은 시트르산나트륨 이수화물이다.
본 발명의 제2 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상술한 제제의 제조 방법을 제공한다:
1) 상술한 바와 같은 항-EGFR 항체를 환원제와 환원 반응시켜 환원된 항-EGFR 항체를 수득하는 단계;
2) 상기 환원된 항-EGFR 항체를 vcMMAE와 접합 반응시키는 단계; 및
3) 상기 접합 반응을 종결시키고, 상기 접합 반응 생성물의 완충액 교환을 수행하여 상술한 바와 같은 항체-약물 접합체 제제를 수득하는 단계.
일부 실시형태에서, 상기 방법은
(1) 상술한 항-EGFR 항체 (바람직하게는 10 mg)를 환원 완충액 (바람직하게는 25 mM의 붕산나트륨, pH 8.0, 25 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA를 포함)으로 (바람직하게는 3회) 교환하여, 단백질의 농도를 검출하고, 단백질의 양을 계산하는 단계;
(2) 단계 (1)의 생성물에 DTT를 첨가하여 실온에서 1-5시간 (바람직하게는 2시간) 동안 반응시켜 환원된 항-EGFR 항체를 얻는 단계로서, 상기 DTT의 물질의 양이 상기 단백질의 물질의 양의 2.0-3.0배, 바람직하게는 2.5배인 것인, 단계;
(3) 단계 (2)의 생성물을 결합 완충액 (바람직하게는 50 mM의 Tris, pH 7.2, 150 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA를 포함)으로 (바람직하게는 3회) 교환하고, 유리 티올기의 물질의 양을 계산하는 단계;
(4) 단계 (3)의 생성물에 vc-MMAE (즉, MC-vc-PAB-MMAE)를 첨가하여 실온에서 1-5시간 (바람직하게는 2시간) 동안 반응시키는 단계로서, 상기 vc-MMAE의 물질의 양이 상기 환원된 항-EGFR 항체의 물질의 양의 1.0-1.5배, 바람직하게는 1.1배인 것인, 단계;
(5) 단계 (4)의 생성물에 N-아세틸시스테인을 첨가하고 (바람직하게는 5분) 정치시켜 상술한 항체-약물 접합체를 함유하는 혼합액을 수득하는 단계로서, 상기 N-아세틸시스테인의 물질의 양이 상기 vc-MMAE의 물질의 양의 15-25배, 바람직하게는 20배인 것인, 단계; 및
(6) 단계 (5)의 혼합액을 접합 저장용 농축액 (stock solution)으로 (바람직하게는 3회) 교환하여 항체-약물 접합체 제제를 수득하는 단계를 포함하고,
상기 접합 저장용 농축액이
10-50 mM (예컨대, 10 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 또는 50 mM, 또는 19-21 mM, 또는 18-22 mM, 또는 17-23 mM, 또는 16-24 mM)의 농도 및 pH 6.3-6.7 (예컨대, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6 또는 6.7)의 시트르산염 완충액;
1-10% (예컨대, 1%, 2%, 3%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 8%, 9% 또는 10%, 또는 4-7%, 또는 4.5-6.5%, 또는 5-6%) 농도의 트레할로스;
0.1-2% (예컨대, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5% 또는 2%, 또는 0.2%-0.4%) 농도의 NaCl; 및
0.01-0.2% (예컨대, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15% 또는 0.2%, 또는 0.02-0.08%, 또는 0.03-0.07%, 또는 0.04-0.06%) 농도의 Tween 80을 포함하며;
상기 항체-약물 접합체 제제에서, 항체-약물 접합체의 농도는 1-20 mg/mL (예컨대, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL 또는 20 mg/mL, 또는 3-5 mg/mL, 또는 2-6 mg/mL, 또는 1-7 mg/mL, 또는 1-8 mg/mL, 또는 1-9 mg/mL, 또는 1-10 mg/mL)이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 농도는 15 mM-25 mM이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 농도는 20 mM이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 pH는 6.3-6.5이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액의 pH는 6.3이다.
일부 실시형태에서, 트레할로스의 농도는 4%-7%이다.
일부 실시형태에서, 트레할로스의 농도는 5.5%이다.
일부 실시형태에서, NaCl의 농도는 0.1%-0.5%이다.
일부 실시형태에서, NaCl의 농도는 0.3%이다.
일부 실시형태에서, Tween 80의 농도는 0.01%-0.1%이다.
일부 실시형태에서, Tween 80의 농도는 0.05%이다.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체의 농도는 2 mg/mL-6 mg/mL이다.
일부 실시형태에서, 항체-약물 접합체의 농도는 4 mg/mL이다.
일부 실시형태에서, 트레할로스는 트레할로스 이수화물이다.
일부 실시형태에서, 시트르산염 완충액은 시트르산 및 시트르산나트륨으로부터 제조된다.
일부 실시형태에서, 시트르산은 시트르산 일수화물이다.
일부 실시형태에서, 시트르산나트륨은 시트르산나트륨 이수화물이다.
본 발명의 제3 측면에서, 본 발명은 상술한 방법으로 제조된 항체-약물 접합체 제제를 제공한다.
본 발명의 제4 측면에서, 본 발명은 상술한 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 종양 치료를 위한 공지된 화학요법제를 추가로 포함하고, 상기 화학요법제는, 예를 들어 독소루비신 (Adriamycin), 사이클로포스파미드 및 탁산 [예를 들어, 파클리탁셀 (Taxol) 및 도세탁셀 (Taxotere)], 카페시타빈 (Xeloda), 젬시타빈 (Gemzar), 비노렐빈 (Navelbine), 타목시펜, 아로마타제 억제제 (Arimidex, Femara, Aromasin), 5-FU/류코보린, 이리노테칸 (camptosar), 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 에스트라무스틴, 미톡산트론 (Novantrone), 프레드니손, 빈크리스틴 (Oncovin), 독소루비신, 프레드니손 등, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 종양 치료를 위한 공지된 면역요법제를 추가로 포함하고, 상기 면역요법제는, 예를 들어 PD-1 단일클론 항체 (예컨대, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙), PD-L1 단일클론 항체 (예컨대, 아테졸리주맙), TIGIT 단일클론 항체, 4-1BB 단일클론 항체, VEGFR2 단일클론 항체 (예컨대, 라무시루맙 및 아파티닙), HER2 단일클론 항체 (예컨대, 트라스투주맙, 트라스투주맙 바이오시밀러 및 트라스투주맙-dkst) 등, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 다음으로부터 선택되는 면역억제제를 추가로 포함한다: (1) 코르티손 및 프레드니손과 같은 글루코코르티코이드; (2) 사이클로스포린 및 타크롤리무스 등과 같은 미생물 대사산물; (3) 아자티오프린 및 6-머캅토퓨린 등과 같은 항-대사물질; (4) 항-림프구 글로불린 및 OKT3 등과 같은 다클론성 및 단일클론성 항-림프구 항체; (5) 사이클로포스파미드와 같은 알킬화제. 구체적으로, 면역억제제는, 예를 들어 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 아자티오프린, 프로그라프, 제나팍스, 시뮬렉트, 사이클로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신, 마이코페놀레이트, 미조리빈, 사이클로포스파미드, 핀골리모드 등이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명의 제5 측면에서, 본 발명은 EGFR 관련 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 상술한 제제 또는 상술한 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 제6 측면에서, 본 발명은 EGFR 관련 질환을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 상술한 제제 또는 상술한 조성물을 제공한다.
본 발명의 제7 측면에서, 본 발명은 예방적 및/또는 치료적 유효량의 상술한 제제 또는 상술한 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, EGFR 관련 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, EGFR 관련 질환은 EGFR 관련 종양, 예컨대 EGFR 과발현과 관련된 종양이고, 추가로, 예를 들어 결장암, 직장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위암, 췌장암 및 뇌 신경교종으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 종양은 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 종양이고, 추가로, 예를 들어 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 결장암, 직장암, 폐암 또는 췌장암이다.
일부 실시형태에서, 종양은 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 종양이고, 추가로, 예를 들어 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 결장암, 직장암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제8 측면에서, 본 발명은 종양 혈관생성을 억제하거나, 종양 진행을 지연시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 또는 종양 세포 증식을 억제하기 위한 시약 또는 약제의 제조에 있어서 상술한 제제 또는 상술한 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 제9 측면에서, 본 발명은 종양 혈관생성을 억제하거나, 종양 진행을 지연시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 또는 종양 세포 증식을 억제하는데 사용하기 위한 상술한 제제 또는 상술한 조성물을 제공한다.
본 발명의 제10 측면에서, 본 발명은 유효량의 상술한 제제 또는 상술한 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 혈관생성을 억제하거나, 종양 진행을 지연시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 또는 종양 세포 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 종양은 결장암, 직장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위암, 췌장암 및 뇌 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 종양은 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 종양이고, 추가로, 예를 들어 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 결장암, 직장암, 폐암 또는 췌장암이다.
일부 실시형태에서, 종양은 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 종양이고, 추가로, 예를 들어 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 결장암, 직장암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 항체-약물 접합체 제제는 다양한 온도 조건에서도 외관이 투명하게 유지되고, DAR이 기본적으로 변화가 없으며, HMW% 및 산성 피크%의 양이 적당하고, 제제 안정성이 종래 기술의 제제에 비해 현저히 향상되어 있다.
도 1은 항체 약물 접합체의 약물/항체 비율을 측정하기 위한 HIC-HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 단일클론 항체와 항체-약물 접합체의 시험관 내에서 세포 억제 활성을 검출한 결과를 나타낸 것으로, 여기서 ○는 단일클론 항체 BA03을 나타내고, ▲는 항체-약물 접합체 MYK-3을 나타낸다.
도 3은 결장암 세포 HT-29에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 나타낸 것으로, ○는 단일클론 항체 BA03을 나타내고, ▲는 항체-약물 접합체 MYK-3을 나타낸다.
도 4는 뇌 신경교종 암세포 U87-MG에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 나타낸 것으로, ○는 단일클론 항체 BA03을 나타내고, ▲는 항체-약물 접합체 MYK-3을 나타낸다.
도 5는 폐암 세포 A549에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 나타낸 것으로, ○는 단일클론 항체 BA03을 나타내고, ▲는 항체-약물 접합체 MYK-3을 나타낸다.
도 6은 KRAS 돌연변이 결장암 세포 LoVo에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 나타낸 것으로, ◇는 단일클론 항체 Erbitux를 나타내고, ▲는 항체-약물 접합체 MYK-3을 나타낸다.
도 7은 마우스에서 HT-29 결장암 이종이식된 종양의 부피에 대한 단일클론 항체 및 항체-약물 접합체의 효과를 나타낸 것으로, 여기서 데이터는 평균 ± 표준 편차로 나타내며; 완충액 대조군과 비교하여, *는 P<0.05, **는 P<0.01, ***는 P<0.001을 나타낸다.
도 8은 HT-29 결장암 이종이식 모델 마우스의 체중에 대한 단일클론 항체 및 항체-약물 접합체의 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 결장암 세포 LoVo를 사용한 이종이식된 종양에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 pH의 시트르산염 완충액에서 MYK-3의 품질 특성 변화에 대한 비교를 나타낸 것이다.
이하, 실시예와 함께 본 발명의 실시형태들을 상세히 설명할 것이다. 그러나, 당업자라면 누구나 하기 실시예들이 본 발명을 예시하기 위해 사용된 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 실시예들 중 특별한 조건이 없는 것들은 일반적으로 통상적인 조건 또는 제조사에서 권장하는 조건들 하에 실시된다. 제조사를 명시하지 않고 사용된 시약이나 장비들은 모두 시중에서 구입할 수 있는 기존의 제품들이다.
본 발명에서, 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 과학 기술 용어들은 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 본원에 사용된 단백질 및 핵산 화학, 분자생물학, 세포 및 조직 배양, 미생물학, 면역학, 및 실험실 절차들과 관련된 용어들은 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 용어 및 일상적인 절차들이다. 또한, 본 발명을 보다 잘 이해시키기 위해 관련된 용어들에 대한 정의와 설명을 아래에서 제공한다.
본 발명에서, 달리 명시하지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 수치 범위는 언급된 범위 내의 임의의 정수 값, 적절한 경우 언급된 범위 내의 분수 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 보통 두 쌍의 동일한 폴리펩타이드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 의미하는데, 각각의 쌍에는 하나의 "경쇄" (L) 사슬과 하나의 "중쇄" (H) 사슬이 있다. 항체의 경쇄는 κ와 λ의 2가지 범주로 나눌 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 또는 ε의 5가지 범주로 나눌 수 있다. 중쇄의 차이에 따라 항체는 하기의 5가지 범주로 나눌 수 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 된 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄도 약 3개 이상의 아미노산으로 된 "D" 영역을 가진다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (V H )과 중쇄 불변 영역 (C H )으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 (C H 1, C H 2 및 C H 3)으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (V L )과 경쇄 불변 영역 (C L )으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 C L 로 이루어진다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포들 (예컨대, 효과기 세포) 및 보체 시스템의 성분 C1q를 비롯한, 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. V H 및 V L 도 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 세분될 수 있는데, 여기에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각 V H 및 V L 은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된, 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어져 있다. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역들 (V H 및 V L )은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 각 영역 또는 구조 도메인에 대한 아미노산의 할당은 면역학적 대상 단백질의 카바트 서열 (Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, 메릴랜드주 베데스다 소재 (1987 및 1991)) 또는 초티아와 레스크 (Chothia & Lesk) [(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; 초티아 등 (Chothia et al.) [(1989) Nature 342:878-883]의 정의를 따른다.
본원에 기술된 단일클론 항체 변이체는 통상적인 유전공학 방법을 통해 수득될 수 있다. 당업자라면 누구나 핵산 돌연변이를 사용하여 DNA 분자를 변형하는 방법을 잘 알고 있다. 또한, 중쇄 및 경쇄 변이체를 암호화하는 핵산 분자들도 화학적 합성을 통해 얻을 수 있다.
본 발명에서, 서열 동일성 (상동성) 및 서열 유사성 백분율을 결정하는데 사용되는 알고리즘은, 예를 들어 각각 문헌 [Altschul et al., (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402] 및 [Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들어 참고문헌에 기술된 매개변수 또는 기본 매개변수를 사용하여 본 발명의 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 결정하는데 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하는데 사용되는 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information)을 통해 공중이 이용가능하다.
본원에 기술된 바와 같이, 한 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 상기 아미노산 서열은, 상기 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩타이드 서열, 예를 들어 본원에 기술된 방법 (예컨대, 표준 매개변수를 사용한 BLAST 분석)을 사용하였을 때 본 발명의 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
본원에 사용된 상기 아미노산 서열의 돌연변이체는, 상기 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 예컨대 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일성을 갖는 서열, 예컨대 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 의미한다. 바람직하게는, 3개 이하의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실된다. 보다 바람직하게는, 2개 이하의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실된다. 가장 바람직하게는, 1개 이하의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실된다.
"치환" 변이체는 천연 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고 그 동일한 위치에 다른 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 단일 치환 (단 하나의 아미노산만이 분자 내에서 치환됨) 또는 다중 치환 (동일 분자가 2개 이상의 치환된 아미노산을 가짐)일 수 있다. 다중 치환은 연속적인 부위에서 이루어질 수 있다. 이와 마찬가지로, 하나의 아미노산은 다수의 잔기들에 의해 치환될 수 있으며, 이러한 변이체에는 치환과 삽입이 모두 포함된다. "삽입" (또는 "부가") 변이체는 하나 이상의 아미노산이 천연 서열에 바로 인접한 특정 위치에 삽입된 변이체이다. 어떤 아미노산에 바로 인접하고 있다는 것은 해당 아미노산의 알파-카르복실 또는 알파-아미노 작용기에 대한 부착을 의미한다. "결실" 변이체는 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 변이체이다. 일반적으로, 결실 변이체는 이들 분자의 특정 영역에 1개 또는 2개의 아미노산이 결실되어 있다.
본 발명에서, MMAE의 구조는
이다.
본 발명에서, 화학식 I의 L-D는 아래에 나타낸 구조를 갖는 MC-vc-PAB-MMAE이다:
.
본 발명에서, 항-EGFR 항체 Ab는, 아래에 보이는 바와 같이, 자체의 이황화 결합이 환원된 후에 생성된 티올을 통해 L-D에 연결된다:
.
본 발명에서, 약물항체 비율 (DAR) 또는 약물 부하는 p, 즉 화학식 I의 분자 내 항체당 약물 모듈 (즉, 세포독성제)의 평균 수로 나타낸다: Ab-(L-D) p , 이는 정수 또는 분수일 수 있다. 일반식 I의 ADC는 다양한 약물 모듈과 접합된 항체들의 모음을 포함한다. 접합 반응으로 인한 ADC 제제의 항체당 약물 모듈의 평균 수는 질량 분광법, ELISA, HIC 및 HPLC와 같은 종래의 방법들을 통해 확인할 수 있다. p에서 ADC의 양적 분포도 측정할 수 있다. 경우에 따라서는, 역상 HPLC나 전기영동과 같은 방법으로, 특정 값의 p를 갖는 균질한 ADC를 다른 DAR을 갖는 ADC와 분리, 정제 및 확인할 수 있다.
특정 실시형태에서, 접합 반응에서는 이론적 최대치 미만의 약물 모이어티가 항체에 접합된다. 일반적으로, 항체에는 약물 모이어티를 연결할 수 있는 자유 반응성 시스테인 티올기가 많이 포함되어 있지 않아서; 실제로 항체의 대부분의 시스테인 티올기들은 이황화물 다리로서 존재한다. 특정 실시형태에서, 항체는 반응성 시스테인 티올기를 생성하기 위해 부분적 또는 완전 환원 조건 하에 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)과 같은 환원제로 환원될 수 있다.
본 발명에서 "치료(처리)"는 예방을 위해, 또는 임상 병리의 과정에서 치료(처리)되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경하려는 임상적 개입을 의미한다. 바람직한 치료의 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 완화, 질병의 직간접적 병리학적 결과의 약화, 전이 예방, 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 예후의 제거 또는 개선을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체-약물 접합체를 사용하여 질병 또는 장애의 발병을 지연시키거나, 또는 질병 또는 장애의 진행 속도를 늦춘다. 질병의 성공적인 치료와 개선을 평가하기 위한 상술한 매개변수들은 전문의에게 익숙한 통상적인 절차를 통해 쉽게 측정될 수 있다. 암 치료의 경우, 예를 들어 질병의 진행까지의 시간 (TTP)의 평가 및/또는 반응률 (RR)의 측정을 통해, 효능을 측정할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "대상체"는 척추동물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소), 반려동물 (예컨대, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 랫트가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간을 의미한다.
본 발명에서, "유효량"이란 필요한 용량과 시간에서 원하는 치료 또는 예방 효과를 달성하는데 효과적인 양을 의미한다. 본 발명의 물질/분자의 "치료적 유효량"은 개체의 질병 상태, 연령, 성별과 체중, 및 해당 개체에서 원하는 반응을 유도하는 해당 물질/분자의 능력과 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료적 유효량은 물질/분자의 독성 또는 유해한 결과보다 치료적으로 유익한 효과가 더 큰 양을 포함한다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 효과를 달성하는데 필요한 용량과 시간 동안에서 효과적인 양을 의미한다. 반드시 그런 것으로 아니지만, 통상적으로, 예방학적 용량은 해당 질병이 발병하기 전이나 해당 질병의 초기 단계에 대상체에게 투여되기 때문에, 예방학적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 수 있을 것이다. 암의 경우, 치료적 유효량의 약물은 암세포 수를 감소시키고; 종양 크기를 축소시키며; 암세포가 주변 장기들로 침윤하는 것을 억제 (즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단)시키고; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 늦추고, 바람직하게는 중단)시키며; 종양 성장을 어느 정도 억제하고/하거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킨다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체-약물 접합체의 적절한 용량 (단독으로, 또는 화학요법제와 같은 하나 이상의 다른 치료제들과 함께 사용되는 경우)은 치료되는 질병의 유형, 해당 항체-약물 접합체의 유형, 해당 질병의 중증도 및 진행 정도, 해당 항체-약물 접합체가 예방학적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 과거의 치료, 해당 환자의 병력과 해당 항체-약물 접합체에 대한 반응성, 및 주치의의 판단에 따라 달라진다. 적절하게는, 항체-약물 접합체는 환자에게 1회 또는 다수의 치료 과정 동안 투여된다.
본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 일반적으로, 사용되는 용량과 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 일반적으로, 생리학적으로 허용가능한 담체는 pH 완충 수용액을 가리킨다. 생리학적으로 허용가능한 담체의 예로는 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스, 수크로스, 트레할로스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염형성 반대이온; 및/또는 TWEEN™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 PLURONICS™과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 약학적으로 허용가능한 염은 무기산 염 또는 유기산 염이고, 여기서 무기산 염은 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 질산염, 중탄산염, 탄산염, 황산염 또는 인산염이며, 유기산 염은 포름산염, 아세트산염, 프로피온산염, 벤조산염, 말레산염, 푸마르산염, 숙신산염, 타르트산염, 시트르산염, 아스코르브산염, α-케토글루타레이트, α-글리세로포스페이트, 알킬 설포네이트 또는 아릴 설포네이트이며; 바람직하게는, 상기 알킬 설포네이트는 메탄설포네이트 또는 에탄설포네이트이고; 상기 아릴 설포네이트는 벤젠설포네이트 또는 p-톨루엔설포네이트이다.
약제학적으로 허용가능한 염은, 예를 들어 충분량의 염기성 화합물을 생리학적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적절한 산과 반응시킴으로써, 당업계에 익히 공지된 표준 절차에 의해 수득할 수 있다.
본 발명에서, KRAS 유전자는 K-RAS 유전자와 동일한 의미를 갖는다. 이는 K-ras 단백질을 암호화하는 RAS 유전자 계열의 구성원으로, 다양한 종양의 생성, 증식, 이동, 확산 및 혈관생성과 관련되어 있다. 그의 일반적인 돌연변이 부위는 K-RAS 유전자 엑손 2의 코돈 12와 13, 및 엑손 3의 코돈 61이다. 7개의 돌연변이 호발부위 (hotspot)가 있다: G12C, G12R, G12S, G12V, G12D, G12A 및 G13V/D. 이러한 7가지 돌연변이들이 90% 이상을 차지한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 종양은 EGFR 과발현과 관련된 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 종양이다.
본 발명에서, BRAF (v-raf 쥐과 육종 바이러스 종양유전자 상동체B1) 유전자는 전암유전자 (proto-oncogene)로서, RAF 계열의 구성원이다. 인간 종양의 약 8%는 BRAF 돌연변이를 갖고 있으며, 대부분의 BRAF 유전자 돌연변이는 BRAFV600E 돌연변이의 형태이다. 이 돌연변이는 종양 성장, 증식, 침입 및 전이에 중요한, 하향 MEK/ERK 신호전달 경로의 지속적인 활성화를 유도한다. 본 발명의 한 실시형태에서, 종양은 EGFR 과발현과 관련된 BRAF 유전자 돌연변이가 있는 종양이다.
본 발명에서, 20종의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상적인 용법에 따른다. 문헌 [Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참조하며, 상기 문헌은 인용에 의해 본원에 포함된다.
본 발명에서의 항체 BA03은 중국 발명 특허 출원인 CN103772504A의 BA03이다. 그 제조 방법에 대해서는, 해당 특허출원의 실시예 3을 참조한다. 항체의 각 부분의 서열은 다음과 같다:
중쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLSNYDVHWVRQAPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARALDYYDYEFAYWGQGTLVTVSS (서열번호 1).
상기 서열에서, 밑줄 친 부분은 각각 CDR1 (서열번호 5), CDR2 (서열번호 6) 및 CDR3 (서열번호 7)이고;
밑줄이 없는 부분은 각각 FR 1 (서열번호 8), FR2 (서열번호 9), FR3 (서열번호 10) 및 FR4 (서열번호 11)이다.
경쇄 가변 영역의 서열은 다음과 같다:
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCQQNNEWPTSFGQGTKLEIK (서열번호 2).
상기 서열에서, 밑줄 친 부분은 각각 CDR1 (서열번호 12), CDR2 (서열번호 13) 및 CDR3 (서열번호 14)이고;
밑줄이 없는 부분은 각각 FR 1 (서열번호 15), FR2 (서열번호 16), FR3 (서열번호 17) 및 FR4 (서열번호 18)이다.
중쇄 불변 영역의 서열은 다음과 같다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 3).
경쇄 불변 영역의 서열은 다음과 같다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호 4).
특정 실시형태들을 참조하여 아래에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다.
실시예 1: 항체-약물 접합체의 제조 방법
항체 BA03 10 mg을 15 mL의 30 KD 한외여과 장치를 사용하여 총 3회에 걸쳐 환원 완충액 (25 mM 붕산나트륨, pH 8.0, 25 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA)으로 완충액 교환하고 (최종 부피는 약 1 mL였음), 새로운 에펜도르프 원심분리기 튜브 (계량)로 옮겨 칭량하였다. 단백질의 농도를 검출하여 단백질의 총량을 계산하였다. 2.5배 몰량의 DTT를 항체에 첨가하고, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 항온배양하여 계속 혼합하였다. 상기 혼합물을 15 ml의 30 KD 한외여과 장치를 사용하여 총 3회에 걸쳐 커플링 완충액 (50 mM Tris, pH 7.2, 150 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA)으로 완충액 교환하였다. 농축된 용액을 취해, A280으로 단백질의 농도를 측정하고, 칭량하여 단백질의 총량을 계산하였다. 10 μl의 샘플을 취하여 엘만 시험 (Ellman's test)으로 유리 티올기의 수를 측정하였고; 유리 티올기의 몰 농도는 하기 식에 따라 계산하였다:
b: 큐벳의 광학 경로 길이 (보통 1 cm).
유리 티올기의 몰수는 유리 티올기의 몰 농도와 전체 단백질 용액의 부피에 따라 계산하였다.
환원된 항체에, 유리 티올기 몰수의 1.1배인 vc-MMAE (Shanghai Haoyuan Chemexpress Co., Ltd., Cat. HY-15575) (DMSO에 용해됨)를 첨가하고, 상기 혼합물을 잘 섞어 실온에서 2시간 동안 반응시키면서 간헐적으로 혼합하였다. vc-MMAE 몰수의 20배인 N-아세틸시스테인을 상기 반응 시스템에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 잘 혼합하고, 5분간 방치하였다.상기 혼합물을 15 ml의 30 KD 한외여과 장치를 사용하여 총 3회에 걸쳐 접합 저장용 농축액 (20 mM의 Na-시트르산염, 0.3% NaCl, 5% 트레할로스, 0.05% TWeen-80, pH 6.0)으로 완충액 교환하여 항체-약물 접합체 MYK-3을 수득하였다. 상기 샘플은 4℃에서 저장하였다. 항체 약물 접합체 MYK-3은 접합 반응이 N-아세틸시스테인으로 종결된 후에 제조되었다는 점에 유의한다. 후속 단계 (즉, 15 ml의 30 KD 한외여과 장치를 사용하여 상기 혼합물을 접합 저장용 농축액으로 완충액 교환함)를 수행하여 저장과 차후 사용을 위해 항체-약물 접합체 MYK-3를 접합 저장용 농축액 중에 두었다.
약물 대 항체 비율의 결정:
상기 제조된 항체-약물 접합체 MYK-3을 HIC-HPLC (Jun Ouyang, Drug-To-Antibody (DAR) Ratio and Drug Distribution by Hydrophobic Interaction Chromatography and Reverse Phase High Performance Chromatography, Laurent Ducry (ed.), Antibody Drug Conjugates, Chapter 17, Methods in Molecular Biology, Vol 1045, p275-283)로 분석하여 약물 대 항체 비율 (DAR)을 결정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 스펙트럼의 피크 면적에 따라 계산된 평균 DAR은 4.1이었다.
실시예 2: 시험관 내에서 세포에 대한 항체-약물 접합체 MYK-3의 억제 활성 검출
세포에 대한 억제 활성을 검출하는 방법:
소생된 세포주를 3-4세대 동안 계대배양한 후, 먼저 배양 배지를 제거하고, 세포들을 5 mL의 DPBS로 1회 헹구고, 3 mL의 트립신으로 분해시키고, 배양 배지에 재현탁시킨 후, 원심분리기로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 세포들을 배양 배지로 다시 재현탁시켰다. 0.5 mL의 세포 재현탁액을 취해 세포 계수기로 세포수를 계산하였다. 상기 세포들을 96-웰 세포 배양 플레이트에 플레이팅하였다 (DiFi 세포는 웰당 10000개의 세포로 플레이팅하였고, HT-29 세포는 웰당 5000개의 세포로 플레이팅하였으며, A549 세포는 웰당 2000개의 세포로 플레이팅하였고, U87-MG 세포는 웰당 3000개의 세포로 플레이팅하였으며, LoVo 세포는 웰당 4000개의 세포로 플레이팅하였음). 24시간의 배양 후, 다수의 농도로 희석된 단일클론 항체 BA03과 항체-약물 접합체 MYK-3를 첨가하여 72시간 동안 항온배양하였다. 그런 다음, 각 웰에 20 μl의 CCK8 색상 시약을 첨가하고, 마이크로플레이트 판독기 상에서 450-650 nm의 파장으로 OD450-650을 시험한 후, 4-매개변수 피팅을 수행하였다.
시험관 내에서 세포에 대한 억제 활성을 검출한 결과:
다음 세포주들은 중국 과학원 (China Academy of Sciences)의 상하이 세포 생물학 연구소 (Shanghai Institute of Cell Biology)에서 구입하였다.
EGFR 발현이 높은 DiFi 세포 (인간 대장암 세포)에서의 활성: MYK-3이 단일클론 항체 BA03에 비해서 세포 성장 억제 활성이 현저히 높았고, EC50은 도 2에 나타난 바와 같이 약 10배 감소하였다 (BA03의 EC50은 51.9 ng/ml이었고, MYK-3의 EC50은 5.1 ng/ml였음).
중간 및 낮은 EGFR 발현의 다른 종양 세포들에서의 활성: 단일클론 항체 자체에 비해, MYK-3은 중간 및 낮은 EGFR 발현의 암세포 (인간 결장암 세포 HT29, 인간 폐암 세포 A549, 인간 뇌 성상모세포종 세포 U87-MG)에 대해서도 명백한 세포 성장 억제 활성을 나타냈으며 (도 3, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같음), 이 때, HT-29의 EC50은 611 ng/ml였고, A549의 EC50은 28.3 μg/ml였으며, U87-MG의 EC50은 5.3 μg/ml이었다.
또한, 우리는 EGFR이 중간 수준으로 발현되는 KRAS 돌연변이 결장암 세포인 LoVo에서도 그 활성을 시험하였는 바 (Dunn EF, Ilda M, Myers RA, Hintz KA, Campbell DA, Armstrong EA, Li C and Wheeler DL. Dasatinib sensitizes KRAS mutant colorectal tumors to cetruximab. Oncogene 2011; 30: 561-574), MYK-3이 KRAS 돌연변이 결장암 세포인 LoVo에 대해 유의미한 종양 성장 억제 활성을 나타냈지만 (도 6에 도시된 바와 같이, EC50은 3.2 μg/ml였음), BA03은 단독으로 사용되었을 때 해당 세포주에 대해 억제 활성이 거의 없었음을 확인하였다.
실시예 3: 마우스의 생체 내 종양 이종이식 시험
마우스에서 생체 내 종양 이종이식 시험의 실험 방법:
HT-29 결장암 세포는 EGFR 발현이 상대적으로 낮고 BRAF 돌연변이가 있는 세포주였으며, 현재 대장암 치료용으로 시판되고 있는 EGFR 표적화 단일클론 항체인 Erbitux는 HT-29세포주에 대해 성장 억제 활성을 나타내지 않았다.
HT-29 세포 이종이식 모델: 대수 성장기의 종양 세포를 수집하여 계수한 후, 1×PBS 중에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액 농도를 3×10 7 /ml로 조정하였다. 종양 세포를 1 mL 주사기 (4-게이지 바늘)를 사용하여, 3×10 6 /0.1 ml/마우스로 누드 마우스의 오른쪽 등쪽에 피하 접종하였다. 종양 부피가 150-200 mm 3 에 도달하면, 그룹들 간 마우스의 종양 부피와 체중이 균일하게 되도록 마우스를 무작위 블록 방법으로 그룹당 8마리씩 그룹화하였다. 각 그룹에서의 종양 부피 평균값과 모든 실험 동물들의 종양 부피 평균값의 차이는 ±10% 이내였다. 꼬리정맥 투여를 4일에 한 번씩 (1일, 5일, 9일, 13일째) 총 4회 시행하였으며, 정기적으로 마우스의 종양 부피와 체중을 측정하였다. 각 투여 그룹에는 마우스가 8마리였다.
마우스에서 종양 이종이식 연구의 실험 결과
마우스에서 HT-29 결장암 이종이식 시험: 본 시험에서는, 완충 용액 그룹 (20 mM의 시트르산나트륨, 0.3% 염화나트륨, 5% 트레할로스, 0.05% Tween 80, pH 6), BA03 단일클론 항체 그룹 (5 mg/kg), MYK-3 그룹 (1 mg/kg), MYK-3 그룹 (5 mg/kg) 및 비결합성 ADC 그룹 (5 mg/kg) (인간 IgG-vcMMAE 접합체, 여기서 IgG는 인간 혈청으로부터 정제하여 얻은 IgG이고, 본 접합체는 MYK-3과 동일한 방법으로 제조하였음)을 비롯한, 5개의 그룹이 있었다. MYK-3을 투여한 마우스의 이종이식 종양 부피는 대조군에 비해 크게 작았는데, 이는 유의미한 항종양 성장 효과를 나타낸 것이다 (도 7). 18일째에, MYK-3 5 mg/Kg 투여 그룹의 경우, 종양 성장 억제율은 완충 용액 그룹과 비교하였을 때 최대 54%였고, 종양 성장 억제율은 동일한 용량의 단일클론 항체 BA03 그룹과 비교했을 때 최대 46%였으며, 종양 성장 억제율은 비결합성 ADC와 비교하였을 때 최대 42%였다.
마우스의 체중: MYK-3를 투여한 마우스의 체중은 대조군에 비해 유의한 변화를 나타내지 않았는데 (도 8 참조), 이는 MYK-3가 마우스의 체중 감소에 대한 독성 효과가 없음을 시사하는 것이다.
실시예 4: 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 결장암 세포 LoVo를 사용한 이종이식된 종양에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성
모델 구성 (2x10 6 개의 세포/0.1ml/마우스로 종양 세포를 접종함) 및 실시예 3의 투여방법에 따라, 누드 마우스에서 KRAS 돌연변이 대장암 세포 LoVo를 사용한 이종이식 종양에 대한 MYK-3의 성장 억제 활성을 시험하였다. 상기 실험은 희석 완충 용액 그룹 (20 mM의 Na-시트르산염, 0.3% NaCl, 5% 트레할로스, 0.05% Tween 80, pH 6), Erbitux 단일클론 항체 그룹 (3 mg/kg), MYK-3 그룹 (0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg의 3가지 용량) 및 비결합성 ADC 대조군 (3 mg/kg)을 포함하여, 여섯 그룹에서 수행하였으며, 이 때, 상기 비결합성 대조군 ADC란 동일한 로딩량의 비결합성 ADC 대조군 (항-CD20 mAb-vcMMAE임)이었다. 접합체의 제조방법은 MYK-3의 방법과 동일하였다. 상기 실험 결과를 도 9에 나타내었다.
도면에서 알 수 있듯이, MYK-3은 3 mg/Kg의 용량에서 LoVo 세포 종양의 성장을 완전히 억제하는 효과를 나타냈으며, MYK-3은 1 mg/Kg의 용량에서 시판 약물인 Erbitux 3 mg/Kg의 용량보다 더 높은 활성을 나타냈다.
실시예 5: MYK-3의 안정성에 대한 pH의 영향
본 발명자들은 실시예 1에서 수득한 항체-약물 접합체를 출발점으로 사용하여, pH에 대해 보다 심층적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 최적의 MYK-3 제제의 pH가 6.3인 것으로 나타났다. 즉, 최적의 제제는 20 mM의 시트르산염 완충액, 5.5% 트레할로스 이수화물, 0.3% NaCl 및 0.05% PS80, pH 6.3을 포함하고, 항체-약물 접합체 MYK-3의 농도는 4 mg/mL이다.
20 mM의 시트르산염 완충액 (5.5% 트레할로스 이수화물, 0.3% NaCl 및 0.05% PS80 함유)에서 MYK-3의 품질에 대한 다양한 pH의 영향을 조사하기 위해, 접합 반응을 N-아세틸시스테인으로 종결시킨 후 15 ml의 30KD 한외여과 장치를 사용하여 접합 반응 생성물을 완충액 교환한 접합 저장용 농축액의 제제 (조사 대상 제제 F1-F5)를 제외하고는, 실시예 1과 동일한 절차를 수행하였다.
조사 대상 제제 F1-F5는 시트르산염 완충액의 pH를 제외하고 조성과 농도가 동일하였다. 구체적으로: 4 mg/mL의 항체-약물 접합체 MYK-3, 20 mM의 시트르산염 완충액, pH 5.6 (F1), 6.0 (F2), 6.3 (F3), 6.5 (F4) 또는 6.7 (F5), 5.5% 트레할로스 이수화물, 0.3% NaCl 및 0.05% PS80.
구체적으로, 상기 접합 반응 생성물을 조사 대상 제제 F1-F5 (pH: 5.6-6.7)으로 교환한 후, 40±2℃/75%±5%RH 하에 10일간 조사한 후, 정해진 시점에 샘플들을 채취하여 분석하였다. 시험 항목에는 외관, pH, 단백질 농도, SEC, iCIEF 및 HIC가 포함되었다. 해당 샘플이 혼탁해 보이거나 명백한 유백색을 띠는 경우에는, 후속 분석을 수행하지 않을 것이다 (예컨대, SEC, iCIEF 및 HIC). 구체적인 실험 설계는 표 1에 나타내었다.
참고: T0은 시작점, D는 날짜, √는 시험을 나타냄.
외관의 측면에서, 시간이 지남에 따라, 40℃에서 3일간 방치했던 F1의 샘플은 혼탁해졌고, 40℃에서 7일간 방치하였던 F2의 샘플도 혼탁해졌으며, 실온과 2-8℃로 온도를 낮추었을 때 F1과 F2의 샘플에서 뚜렷한 유백색과 침전이 관찰되었고, pH가 낮을수록 침전이 더 많이 발생하였으나; 다른 제제들의 샘플은 항상 맑은 상태를 유지하였고 큰 변화는 관찰되지 않았다.
SEC, iCIEF 및 HIC의 시험 데이터와 변화의 경향을 표 2와 도 10에 나타내었다. 40℃에 3일간 방치했던 F1의 샘플들은 혼탁해졌기 때문에, 제제 F1의 샘플들은 3일 및 7일째에 SEC, iCIEF 및 HIC로 시험하지 않았다. 그리고 40℃에 7일간 방치했던 F2의 샘플들은 혼탁해졌기 때문에, F2의 샘플들은 7일째에 SEC, iCIEF 및 HIC로 시험하지 않았다. HIC 데이터는 F3과 F4의 DAR이 기본적으로 서로 다른 pH 값에서 변하지 않음을 보여주고 있고 (도 10c); SEC 데이터는, pH가 증가함에 따라, F3, F4 및 F5의 HMW% 성장률은 하향 추세를 나타내고 있고, 이들의 하향 추세는 기본적으로 동일하였으며 (도 10a); iCIEF 데이터는, pH가 증가함에 따라, F3, F4 및 F5의 산성 피크 %가 상승 추세를 보이지만 F3의 상승 추세는 F4 및 F5의 상승 추세보다 분명히 낮음을 보여주고 있다 (도 10b). 상기 시험 데이터를 토대로 하고 외관, SEC, iCIEF, HIC 등에 대한 시험결과를 고려하여, MYK-3의 최적 제제는 F3인 것으로, 즉 제제의 pH는 6.3인 것으로 판단하였다. 이에 따라, 제제 중의 시트르산 및 시트르산나트륨의 양을 조정하였고, 최종 제제는 pH 6.3의 20 mM의 시트르산염 완충액을 제공하였다.
상기 데이터를 기초로, 최종 MYK-3 제제는 다음과 같았다:
본 발명의 구체적인 실시형태들을 상세하게 설명하였으나, 통상의 기술자라면 누구나 개시된 모든 교시내용에 따라 세부 내용들에 변형과 치환을 수행할 수 있으며, 이러한 변화들도 본 발명의 범위 내에 속한다는 사실을 이해할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구항 및 그와 균등한 것에 의해 주어진다.

Claims (10)

  1. 항체-약물 접합체 제제로서,
    농도가 1-20 mg/mL, 바람직하게는 2-6 mg/mL, 보다 바람직하게는 4 mg/mL인 항체-약물 접합체 또는 이의 염;
    농도가 10-50 mM, 바람직하게는 15-25 mM, 보다 바람직하게는 20 mM이고, pH가 6.3-6.7, 바람직하게는 6.3-6.5, 보다 바람직하게는 6.3인 시트르산염 완충액;
    농도가 1-10%, 바람직하게는 4-7%, 보다 바람직하게는 5.5%인 트레할로스;
    농도가 0.1-2%, 바람직하게는 0.1-0.5%, 보다 바람직하게는 0.3%인 NaCl;
    농도가 0.01-0.2%, 바람직하게는 0.01-0.1%, 보다 바람직하게는 0.05%인 Tween 80을 포함하며,
    상기 항체-약물 접합체가 하기 화학식 I의 구조를 갖는 것인, 항체-약물 접합체 제제:
    [화학식 I]
    Ab-(L-D) p
    상기 식에서:
    Ab는 항-EGFR 항체이고, 상기 항-EGFR 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 5-7에 나타낸 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함하고, 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 서열번호 12-14에 나타낸 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함하며;
    L은 링커이고, 상기 링커는 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐 (MC-vc-PAB)이며;.
    D는 세포독성제이고, 상기 세포독성제는 MMAE이며;
    p는 1-9, 바람직하게는 2-6, 보다 바람직하게는 3-5이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 것인, 항체-약물 접합체 제제:
    1) 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역 내의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 각각 서열번호 8-11에 나타난 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함함;
    2) 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역 내의 FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역은 각각 서열번호 15-18에 나타난 서열 또는 이의 돌연변이체를 포함함;
    3) 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgA 불변 영역 또는 이의 돌연변이체로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택됨;
    4) 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역은 인간 람다 및 카파 불변 영역 또는 이의 돌연변이체로부터 선택됨.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 하기의 특징들 중 하나 이상을 갖는 것인, 항체-약물 접합체 제제:
    1) 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 1에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 1에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 항-EGFR 항체의 중쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 1에 나타나 있음;
    2) 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 2에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 2에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 항-EGFR 항체의 경쇄 가변 영역의 서열은 서열번호 2에 나타나 있음;
    3) 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 3에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 3에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 3에 나타나 있음;
    4) 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 4에 나타낸 서열, 또는 상기 서열번호 4에 나타낸 서열에 대해 70% 초과, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과의 동일성을 갖는 서열을 포함하고;
    바람직하게는, 항-EGFR 항체의 경쇄 불변 영역의 서열은 서열번호 4에 나타나 있음.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로스가 트레할로스 이수화물이거나;
    또는, 상기 시트르산염 완충액이 시트르산 및 시트르산나트륨으로부터 제조되고;
    바람직하게는, 상기 시트르산은 시트르산 일수화물이며;
    바람직하게는, 상기 시트르산나트륨은 시트르산나트륨 이수화물인 것인, 항체-약물 접합체 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 제제를 제조하는 방법으로서,
    1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 항-EGFR 항체를 환원제와 환원 반응시켜 환원된 항-EGFR 항체를 수득하는 단계;
    2) 상기 환원된 항-EGFR 항체를 vcMMAE와 접합 반응시키는 단계; 및
    3) 상기 접합 반응을 종결시키고, 상기 접합 반응 생성물의 완충액 교환을 수행하여 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 정의된 항체-약물 접합체 제제를 수득하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 항-EGFR 항체 (바람직하게는 10 mg)를 환원 완충액 (바람직하게는 25 mM의 붕산나트륨, pH 8.0, 25 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA를 포함)으로 (바람직하게는 3회) 교환하여, 단백질의 농도를 검출하고, 단백질의 양을 계산하는 단계;
    (2) 단계 (1)의 생성물에 DTT를 첨가하여 실온에서 1-5시간 (바람직하게는 2시간) 동안 반응시켜 환원된 항-EGFR 항체를 얻는 단계로서, 상기 DTT의 물질의 양이 상기 단백질의 물질의 양의 2.0-3.0배, 바람직하게는 2.5배인 것인, 단계;
    (3) 단계 (2)의 생성물을 결합 완충액 (바람직하게는 50 mM의 Tris, pH 7.2, 150 mM의 NaCl, 5 mM의 EDTA를 포함)으로 (바람직하게는 3회) 교환하고, 유리 티올기의 물질의 양을 계산하는 단계;
    (4) 단계 (3)의 생성물에 vc-MMAE를 첨가하여 실온에서 1-5시간 (바람직하게는 2시간) 동안 반응시키는 단계로서, 상기 vc-MMAE의 물질의 양이 상기 환원된 항-EGFR 항체의 물질의 양의 1.0-1.5배, 바람직하게는 1.1배인 것인, 단계;
    (5) 단계 (4)의 생성물에 N-아세틸시스테인을 첨가하고 (바람직하게는 5분) 정치시켜 제1항에 정의된 항체-약물 접합체를 함유하는 혼합액을 수득하는 단계로서, 상기 N-아세틸시스테인의 물질의 양이 상기 vc-MMAE의 물질의 양의 15-25배, 바람직하게는 20배인 것인, 단계;
    (6) 단계 (5)의 혼합액을 접합 저장용 농축액 (stock solution)으로 (바람직하게는 3회) 교환하여 항체-약물 접합체 제제를 수득하는 단계를 포함하고,
    상기 접합 저장용 농축액이
    농도가 10-50 mM, 바람직하게는 15-25 mM, 보다 바람직하게는 20 mM이고, pH가 6.3-6.7, 바람직하게는 6.3-6.5, 보다 바람직하게는 6.3인 시트르산염 완충액;
    농도가 1-10%, 바람직하게는 4-7%, 보다 바람직하게는 5.5%인 트레할로스;
    농도가 0.1-2%, 바람직하게는 0.1-0.5%, 보다 바람직하게는 0.3%인 NaCl; 및
    농도가 0.01-0.2%, 바람직하게는 0.01-0.1%, 보다 바람직하게는 0.05%인 Tween 80을 포함하며,
    상기 항체-약물 접합체 제제에서, 상기 항체-약물 접합체의 농도가 1-20 mg/mL, 바람직하게는 2-6 mg/mL, 보다 바람직하게는 4 mg/mL이고;
    바람직하게는, 상기 트레할로스가 트레할로스 이수화물이며;
    바람직하게는, 상기 시트르산염 완충액이 시트르산 및 시트르산나트륨으로부터 제조되고;
    바람직하게는, 상기 시트르산은 시트르산 일수화물이며;
    바람직하게는, 상기 시트르산나트륨은 시트르산나트륨 이수화물인 것인, 항체-약물 접합체 제제.
  7. 제5항 또는 제6항에 기재된 방법으로 제조된 항체-약물 접합체 제제.
  8. 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제제를 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 기재된 제제 또는 제8항에 기재된 조성물의 용도로서, 상기 용도가 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인, 용도:
    1) EGFR 관련 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제를 제조하는 용도;
    2) 종양 혈관생성을 억제하거나, 종양 진행을 지연시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 또는 종양 세포 증식을 억제하기 위한 시약 또는 약제를 제조하는 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 EGFR 관련 질환이 EGFR 관련 종양, 예컨대 EGFR 과발현과 관련된 종양이고, 추가로, 예를 들어 결장암, 직장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위암, 췌장암 및 뇌 신경교종으로 이루어진 군에서 선택되거나;
    또는, 상기 종양이 결장암, 직장암, 두경부암, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 식도암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위암, 췌장암 및 뇌 신경교종으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는, 상기 종양이 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 종양이고, 추가로, 예를 들어 KRAS 유전자 돌연변이가 있는 결장암, 직장암, 폐암 또는 췌장암이거나;
    또는, 상기 종양은 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 종양이고, 추가로, 예를 들어 BRAF 유전자 돌연변이를 갖는 결장암, 직장암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 용도.
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