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JP2024533556A - 抗体薬物複合体製剤及びその使用 - Google Patents

抗体薬物複合体製剤及びその使用 Download PDF

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JP2024533556A JP2024516790A JP2024516790A JP2024533556A JP 2024533556 A JP2024533556 A JP 2024533556A JP 2024516790 A JP2024516790 A JP 2024516790A JP 2024516790 A JP2024516790 A JP 2024516790A JP 2024533556 A JP2024533556 A JP 2024533556A
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antibody
cancer
seq
sequence
drug conjugate
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JP2024516790A
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リーリー シアオ
チャオホン フー
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シャンハイ ミラコーケン インコーポレイティド
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Abstract

本発明は、抗体薬物複合体又はその塩、クエン酸緩衝液、トレハロース、塩化ナトリウム、及びポリソルベート８０を含む抗体薬物複合体製剤を提供する。抗体薬物複合体は、Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐで表される構造を有し、式中、Ａｂは抗上皮成長因子受容体抗体を表し、Ｌはリンカーを表し、及びＤは細胞傷害性薬剤を表す。注：図１０は、要約書に付随する図である。

Description

発明の分野
本発明は生物医学の分野、特に抗体薬物複合体製剤（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）及びその使用に関する。
発明の背景
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ｃ－ＥｒｂＢ１としても知られている）は、上皮成長因子ファミリーの細胞表面受容体であり、１１８６個のアミノ酸残基から構成される膜貫通型糖タンパク質であり、分子量は１７０ｋＤである。ＥＧＦＲは、Ｉ型チロシンキナーゼ受容体サブファミリーＥｒｂＢ（ＥｒｂＢ１～４）に属し、チロシンキナーゼ活性を有する。ＥＧＦＲは、皮膚や毛包を含む多くの上皮組織で安定して発現される。受容体の変異による上皮成長因子受容体の異常な発現や活性化は、発がんにつながる可能性がある。上皮成長因子受容体の過剰発現が見られる固形腫瘍は数多くあり、例えば結腸直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん及び食道がんなどがある。トランスフォーミング成長因子αや上皮成長因子などの成長因子は、ＥＧＦＲの内因性リガンドである。これらのリガンドは上皮成長因子受容体に結合し、細胞内チロシンプロテインキナーゼ活性を活性化し、多くの下流シグナル伝達経路を開始させ、それによって正常細胞の成長と分化を調節し、腫瘍細胞の浸潤性を高め、血管新生を促進し、そして腫瘍細胞のアポトーシスを阻害する。腫瘍における上皮成長因子受容体の過剰発現と、腫瘍細胞の増殖と分化におけるその重要な役割により、上皮成長因子受容体は腫瘍治療の有望な標的となっている。
現在、市場には２つの抗上皮成長因子受容体抗体があり、１つはヒト－マウスキメラ抗体Ｃ２２５抗体［エルビタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）又はセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（現Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ）］であり、これは表皮成長因子受容体に対して特異的な結合親和性を有し、ＥＧＦやＴＧＦなどのリガンドと上皮成長因子受容体の間の結合をブロックし、そのリン酸化と下流のシグナル伝達を阻害し、それによって腫瘍細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、マトリックスメタロプロテイナーゼ及び血管内皮増殖因子の産生を減少させることができる。米国のＦＤＡは、２００４年に結腸直腸がんの治療に、２００６年に頭頸部がんの治療にエルビタックスを使用することを承認し、現在さらに多くの臨床試験でその他のがんの適応症にも使用することを承認している。臨床的に、結腸直腸がんの治療におけるエルビタックスとイリノテカンの併用の全奏効率（ＯＲＲ）は２３％で、頭頸部がんの治療におけるエルビタックスとフルオロピリミジンなどの化学療法剤の併用のＯＲＲは１３％～３０％である。エルビタックスはヒト－マウスのキメラ抗体であるため、臨床試験の患者の３．７％で抗治療抗体反応を誘発した。
別の抗上皮成長因子受容体抗体はパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ，Ａｍｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）であり、これはトランスジェニックマウス技術を使用して調製された完全ヒト化モノクローナル抗体であり、マウス本来のタンパク質配列を含まない。この抗体は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とし、フルオロピリミジン、オキサリプラチン、及びイリノテカンとの併用、又は化学療法後のＥＧＦＲ陽性転移性結腸直腸がんの治療に使用されることが２００６年９月にＦＤＡにより承認された。２００６年、ＦＤＡは化学療法耐性のある転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）の治療のための単剤療法を承認した。ただし、パニツムマブはＩｇＧ２サブタイプの抗体であり、ＩｇＧ１と比較してＩｇＧ２はＣＤＣ活性やＡＤＣＣ活性などの生物活性が大幅に低下し、さらに、ＩｇＧ２サブタイプの抗体は通常、安定性が劣る。これらが、完全ヒト化抗体パニツムマブが、キメラ抗体エルビタックスと比較して臨床効果において明らかな利点を示さない主な理由である可能性がある。結腸直腸がんの臨床治療における全生存率（ＯＲ）はわずか８％であり、無増悪生存期間は３．６か月延長されただけである。
現在、大量の臨床データにより、エルビタックスとパニツムマブはＥＧＦＲを発現する野生型ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ野生型）に対してのみ治療効果があり、ＫＲＡＳ変異体に対しては腫瘍増殖阻害活性がないことが示されている。従って、米国臨床腫瘍学会（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）が発行したガイドラインは、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体薬がＫＲＡＳ野生型結腸直腸がん患者にのみ適用できると明確に指摘している（Ａｌｌｅｇｒａ ＣＪ， Ｊｅｓｓｕｐ ＪＭ， Ｓｏｍｅｒｉｅｌｄ ＭＲ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＳＲ， Ｈａｍｍｏｎｄ ＥＨ， Ｈａｙｅｓ ＤＦ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｐｉｎｉｏｎ： ｔｅｓｔｉｎｇ ｆｏｒ ＫＲＡＳ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｏ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｎｔｉ－ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００９； ２７：２０９１－２０９６； Ｂａｒｄｅｌｌｉ Ａ， Ｓｉｅｎａ Ｓ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ａｎｄ ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１０； ２８：１２５４－１２６１）。
従って、当技術分野では、治療効果をさらに向上させ副作用を軽減するために、生物活性を有するヒト化抗上皮成長因子受容体抗体薬、特にＫＲＡＳ変異体に対する治療効果を有する抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）などの抗体薬が必要とされている。
本願の発明者らは、広範な実験と創造的努力により、ＥＧＦＲ関連疾患に対して良好な治療効果を有し、従来技術と比較して製剤の安定性が著しく改善された抗ＥＧＦＲ抗体薬物複合体製剤を提供する。
この観点から、本発明の第１の態様において、本発明は、以下を含む抗体薬物複合体製剤を提供する：
濃度１～２０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、又は２０ｍｇ／ｍＬ、又は３～５ｍｇ／ｍＬ、又は２～６ｍｇ／ｍＬ、又は１～７ｍｇ／ｍＬ、又は１～８ｍｇ／ｍＬ、又は１～９ｍｇ／ｍＬ、又は１～１０ｍｇ／ｍＬ）の抗体薬物複合体又はその塩；
濃度１０～５０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、又は５０ｍＭ、又は１９～２１ｍＭ、又は１８～２２ｍＭ、又は１７～２３ｍＭ、又は１６～２４ｍＭ）、及びｐＨ６．３～６．７（例えば、６．３、６．４、６．５、６．６、又は６．７）のクエン酸緩衝液；
濃度１～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、８％、９％、若しくは１０％、又は４～７％、若しくは４．５～６．５％、若しくは５～６％）のトレハロース；
濃度０．１～２％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、又は２％、又は０．２％～０．４％）のＮａＣｌ；並びに
濃度０．０１～０．２％（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、若しくは０．２％、又は０．０２～０．０８％、若しくは０．０３～０．０７％、若しくは０．０４～０．０６％）のツイーン８０；
ここで、前記抗体薬物複合体は式Ｉ、
の構造を有し、
式中：
Ａｂは抗ＥＧＦＲ抗体を表し、ここで前記抗ＥＧＦＲ抗体は重鎖及び軽鎖を含み、ここで重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５～７に示される配列又はそれらの変異体を含み、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１２～１４に示される配列又はそれらの変異体を含み；
Ｌはリンカーを表し、リンカーは６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）であり；
Ｄは細胞傷害性薬剤を表し、前記細胞傷害性薬剤はＭＭＡＥであり；及び
ｐは、１～９（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、若しくは９、又は例えば１～７）、例えば、２～６、３～５、具体的には、例えば３．９、４．０、又は４．１を表す。
なお、トレハロース、ＮａＣｌ、又はツイーン８０の濃度は質量体積濃度（ｗ／ｖ％）を表し、これは、抗体薬物複合体製剤１００ｍＬ当たりのトレハロース、塩化ナトリウム、又はツイーン８０の質量（単位：ｇ）を指すことに注意されたい。
さらに、「クエン酸緩衝液」はクエン酸とクエン酸ナトリウムから調製され、クエン酸とクエン酸ナトリウムの様々な比率を調整することにより様々なｐＨ値が得られる。「クエン酸緩衝液」の濃度とは、クエン酸とクエン酸ナトリウムの合計の濃度を指す。
さらに、上記の「抗体薬物複合体」とは、同じか又は異なるＤＡＲを有するＡＤＣ分子を含む組成物を指すことに注意されたい。
具体的には、本発明は、複数の抗ＥＧＦＲ ＡＤＣ分子を含む組成物を提供する。場合によっては、本明細書に記載の組成物中の各ＡＤＣは、同数の１つ又はそれ以上の細胞傷害性薬剤を含む。他の場合には、本明細書に記載の組成物中の各ＡＤＣは、異なる数の１つ又はそれ以上の細胞傷害性薬剤を含む。
本明細書に記載される抗体薬物複合体において、各抗ＥＧＦＲ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上の細胞傷害性薬剤と結合することができる。
上記の薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、抗ＥＧＦＲ抗体に結合した細胞傷害性薬剤の分子数を指す。本明細書に記載のＡＤＣに含まれる細胞傷害性薬剤の分子数は一般的に整数であるが、本明細書に記載のＡＤＣに含まれる細胞傷害性薬剤の分子数（例えば、式Ｉのｐ）が分数である場合、その分数は、複数のＡＤＣ分子を含む組成物中の各抗ＥＧＦＲ抗体に結合した細胞傷害性薬剤の平均の数を指す。
いくつかの実施態様において、抗体薬物複合体又はその塩の濃度は２ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様において、抗体薬物複合体又はその塩の濃度は４ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液の濃度は１５ｍＭ～２５ｍＭである。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液の濃度は２０ｍＭである。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液のｐＨは６．３～６．５である。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液のｐＨは６．３である。
いくつかの実施態様において、トレハロースの濃度は４％～７％である。
いくつかの実施態様において、トレハロースの濃度は５．５％である。
いくつかの実施態様において、ＮａＣｌの濃度は０．１％～０．５％である。
いくつかの実施態様において、ＮａＣｌの濃度は０．３％である。
いくつかの実施態様において、ツイーン８０の濃度は０．０１％～０．１％である。
いくつかの実施態様において、ツイーン８０の濃度は０．０５％である。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域は、それぞれ配列番号８～１１に示される配列又はそれらの変異体を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域中のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域は、それぞれ配列番号１５～１８に示される配列又はそれらの変異体を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＡの定常領域又はそれらの変異体から選択される。
いくつかの実施態様において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択される。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域は、ヒトラムダ定常領域及びカッパ定常領域又はその変異体から選択される。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号１に示される配列、又は配列番号１に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号１に示される。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号２に示される配列、又は配列番号２に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号２に示される。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域の配列は、配列番号３に示される配列、又は配列番号３に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域の配列は配列番号３に示される。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域の配列は、配列番号４に示される配列、又は配列番号４に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含む。
いくつかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域の配列は配列番号４に示される。
いくつかの実施態様において、トレハロースはトレハロース二水和物である。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液は、クエン酸及びクエン酸ナトリウムから調製される。
いくつかの実施態様において、クエン酸はクエン酸一水和物である。
いくつかの実施態様において、クエン酸ナトリウムはクエン酸ナトリウム二水和物である。
本発明の第２の態様において、本発明は、上記製剤を調製するための、以下を含む方法である：
１）上記の抗ＥＧＦＲ抗体を還元剤と還元反応させて、還元型抗ＥＧＦＲ抗体を得ること；
２）還元方抗ＥＧＦＲ抗体をｖｃＭＭＡＥと結合反応させること；そして
３）結合反応を停止させ、結合反応生成物の緩衝液交換を行って、上記の抗体薬物複合体製剤を得ること。
いくつかの実施態様において、方法は、
（１）上記抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくは１０ｍｇ）を還元緩衝液（好ましくは２５ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に交換し（好ましくは３回）、タンパク質の濃度を検出し、そしてタンパク質の量を算出すること；
（２）工程（１）の生成物にＤＴＴを加えて、室温で１～５時間（好ましくは２時間）反応させて、還元型抗ＥＧＦＲ抗体を得ることであって、ここで、前記ＤＴＴの物質量がタンパク質の物質量の２．０～３．０倍、好ましくは２．５倍であること；
（３）工程（２）の生成物を結合緩衝液（好ましくは５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に交換し（好ましくは３回）、そして遊離チオール基の物質量を算出すること；
（４）工程（３）の生成物にｖｃ－ＭＭＡＥ（すなわち、ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥ）を加えて、室温で１～５時間（好ましくは２時間）反応させることであって、ここで、前記ｖｃ－ＭＭＡＥの物質量が前記還元型抗ＥＧＦＲ抗体の量の１．０～１．５倍、好ましくは１．１倍であること；
（５）工程（４）の生成物にＮ－アセチルシステインを加えて、静置して（好ましくは５分間）、上記の抗体薬物複合体を含む混合溶液を得ることであって、ここで、前記Ｎ－アセチルシステインの物質量が前記ｖｃ－ＭＭＡＥの物質量の１５～２５倍、好ましくは２０倍であること；そして
（６）工程（５）の混合溶液を前記結合原液（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に交換して（好ましくは３回）、抗体薬物複合体製剤を得ること、を含み、
ここで、前記結合原液は、
濃度が１０～５０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、又は５０ｍＭ、又は１９～２１ｍＭ、又は１８～２２ｍＭ、又は１７～２３ｍＭ、又は１６～２４ｍＭ）及びｐＨ６．３～６．７（例えば、６．３、６．４、６．５、６．６、又は６．７）を有するクエン酸緩衝液と；
濃度が１～１０％（例えば、１％、２％、３％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、８％、９％、又は１０％、又は４～７％、又は４．５～６．５％、又は５～６％）のトレハロースと；
濃度が０．１～２％（例えば、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、又は２％、又は０．２％～０．４％）のＮａＣｌと；そして
濃度が０．０１～０．２％（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％又は０．２％、又は０．０２～０．０８％、又は０．０３～０．０７％、又は０．０４～０．０６％）のツイーン８０とを含み；
前記抗体薬物複合体製剤において、抗体薬物複合体の濃度が１～２０ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、又は２０ｍｇ／ｍＬ、又は３～５ｍｇ／ｍＬ、又は２～６ｍｇ／ｍＬ、又は１～７ｍｇ／ｍＬ、又は１～８ｍｇ／ｍＬ、又は１～９ｍｇ／ｍＬ、又は１～１０ｍｇ／ｍＬ）である。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液の濃度は１５ｍＭ～２５ｍＭである。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液の濃度は２０ｍＭである。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液のｐＨは６．３～６．５である。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液のｐＨは６．３である。
いくつかの実施態様において、トレハロースの濃度は４％～７％である。
いくつかの実施態様において、トレハロースの濃度は５．５％である。
いくつかの実施態様において、ＮａＣｌの濃度は０．１％～０．５％である。
いくつかの実施態様において、ＮａＣｌの濃度は０．３％である。
いくつかの実施態様において、ツイーン８０の濃度は０．０１％～０．１％である。
いくつかの実施態様において、ツイーン８０の濃度は０．０５％である。
いくつかの実施態様において、抗体薬物複合体の濃度は２ｍｇ／ｍＬ～６ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様において、抗体薬物複合体の濃度は４ｍｇ／ｍＬである。
いくつかの実施態様において、トレハロースはトレハロース二水和物である。
いくつかの実施態様において、クエン酸緩衝液はクエン酸及びクエン酸ナトリウムから調製される。
いくつかの実施態様において、クエン酸はクエン酸一水和物である。
いくつかの実施態様において、クエン酸ナトリウムはクエン酸ナトリウム二水和物である。
本発明の第３の態様において、本発明は、上記の方法により調製された抗体薬物複合体製剤を提供する。
本発明の第４の態様において、本発明は、上記製剤を含む組成物を提供する。
いくつかの実施態様において、組成物は、腫瘍の治療のための既知の化学療法剤をさらに含み、化学療法剤は、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シクロホスファミド及びタキサン類［例えば、パクリタキセル（タキソール）及びドセタキセル（タキソテレ）］、カペシタビン（キセロダ）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ビノレルビン（ナベルビン）、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤（アリミデクス、フェマラ、アロマシン）、５－ＦＵ／ロイコボリン、イリノテカン（カンプトサール）、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エストラムスチン、ミトキサントロン（ノバントロン）、プレドニゾン、ビンクリスチン（オンコビン）、ドキソルビシン、プレドニゾンなど、又はそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施態様において、組成物は、腫瘍を治療するための既知の免疫療法剤をさらに含み、ここで、免疫療法剤は、例えば、ＰＤ－１モノクローナル抗体（例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ）、ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（例えば、アテゾリズマブ）、ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体、４－１ＢＢモノクローナル抗体、ＶＥＧＦＲ２モノクローナル抗体（例えば、ラムシルマブ及びアパチン）、及びＨＥＲ２モノクローナル抗体（例えば、トラスツズマブ、トラスツズマブバイオシミラー、及びトラスツズマブ－ｄｋｓｔ）など、又はそれらの組み合わせである。
いくつかの実施態様において、組成物は、以下から選択される免疫抑制剤をさらに含む：（１）グルココルチコイド、例えばコルチゾン及びプレドニゾン；（２）微生物代謝産物、例えばシクロスポリン及びタクロリムス；（３）代謝拮抗物質、例えばアザチオプリン及び６－メルカプトプリンなど；（４）ポリクローナル及びモノクローナル抗リンパ球抗体、例えば抗リンパ球グロブリン及びＯＫＴ３など；（５）アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド。具体的には、免疫抑制剤は、例えばメチルプレドニゾロン、プレドニゾン、アザチオプリン、プログラフ、ゼナパックス、シムレクト、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ミゾリビン、シクロホスファミド、フィンゴリモドなどである。
いくつかの実施態様において、組成物は、医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む。
本発明の第５の態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連疾患を予防及び／又は治療するための医薬の調製における、上記製剤又は上記組成物の使用を提供する。
本発明の第６の態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連疾患の予防及び／又は治療に使用するための上記製剤又は上記組成物を提供する。
本発明の第７の態様において、本発明は、ＥＧＦＲ関連疾患を予防及び／又は治療するための方法であって、それを必要とする被験体に、予防的及び／又は治療有効量の上記製剤又は上記組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様において、ＥＧＦＲ関連腫瘍であり、さらに例えば、結腸がん、直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、食道がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、及び脳神経膠腫からなる群より選択される、ＥＧＦＲ過剰発現に関連する腫瘍である。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する腫瘍であり、さらに例えば、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、肺がん、又は膵臓がんである。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する腫瘍であり、さらに例えば、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、及び肺がんからなる群より選択される腫瘍である。
本発明の第８の態様において、本発明は、腫瘍の血管新生を阻害するための、腫瘍の進行を遅延させるための、腫瘍の増殖を阻害するための、又は腫瘍細胞の増殖を阻害するための試薬又は医薬の調製における、上記製剤又は上記組成物の使用を提供する。
本発明の第９の態様において、本発明は、腫瘍の血管新生の阻害、腫瘍の進行の遅延、腫瘍の増殖の阻害、又は腫瘍細胞の増殖の阻害に使用するための上記製剤又は上記組成物を提供する。
本発明の第１０の態様において、本発明は、上記製剤又は上記組成物の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、腫瘍の血管新生を阻害するための、腫瘍の進行を遅延させるための、腫瘍の増殖を阻害するための、又は腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、結腸がん、直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、食道がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、及び脳神経膠腫からなる群より選択される。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する腫瘍であり、さらに例えば、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、肺がん、又は膵臓がんである。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する腫瘍であり、さらに例えば、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、及び肺がんからなる群より選択される腫瘍である。
有益な効果
本発明の抗体薬物複合体製剤は、異なる温度条件下でも外観が透明なままであり、ＤＡＲは基本的に変化せず、そのＨＭＷ％及び酸性ピーク％の量が中程度であり、そして配合物の安定性が、従来技術と比較して顕著に改善されている。
図１は、抗体薬物複合体の薬物／抗体比を決定するためのＨＩＣ－ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２は、モノクローナル抗体及び抗体薬物複合体のインビトロにおける細胞に対する阻害活性の検出結果を示す。○はモノクローナル抗体ＢＡ０３を示し、▲は抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を示す。
図３は、結腸がん細胞ＨＴ－２９に対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性を示す。○はモノクローナル抗体ＢＡ０３を示し、▲は抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を示す。
図４は、脳神経膠腫細胞Ｕ８７－ＭＧに対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性を示す。○はモノクローナル抗体ＢＡ０３を示し、▲は抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を示す。
図５は、肺がん細胞Ａ５４９に対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性を示す。○はモノクローナル抗体ＢＡ０３を示し、▲は抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を示す。
図６は、ＫＲＡＳ変異大腸がん細胞ＬｏＶｏに対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性を示す。◇はモノクローナル抗体エルビタックスを示し、▲は抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を示す。
図７は、マウスにおけるＨＴ－２９結腸がん異種移植腫瘍の体積に対するモノクローナル抗体及び抗体薬物複合体の効果を示す。ここで、データは平均±標準偏差として表され、緩衝液対照群と比較した場合、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１、及び＊＊＊はＰ＜０．００１を示す。
図８は、ＨＴ－２９結腸がん異種移植モデルのマウスの体重に対するモノクローナル抗体及び抗体薬物複合体の効果を示す。
図９は、ヌードマウスにおけるＫＲＡＳ変異結腸がん細胞ＬｏＶｏを有する異種移植腫瘍に対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性を示す。
図１０は、異なるｐＨのクエン酸緩衝液におけるＭＹＫ－３の品質特性の変化の比較を示す。
実施態様の詳細な説明
以下、実施例を挙げて本発明の実施態様を詳細に説明する。しかしながら、当業者であれば、以下の実施例は本発明を説明するためにのみ使用されるものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。実施例中に特別な条件を記載していないものは、通常、従来の条件又は製造業者が推奨する条件で実施される。製造業者を特定せずに使用した試薬や器具は、いずれも市販されている従来品である。
本発明において、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、特に明記しない限り、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるタンパク質化学及び核酸化学、分子生物学、細胞培養及び組織培養、微生物学、免疫学、及び実験室手順の関連用語はすべて、対応する技術分野で広く使用されている用語及び日常的な手順である。さらに、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
特に明記しない限り、本発明においては、濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、又は数値範囲は、記載された範囲内の任意の整数値、及び必要に応じて、記載された範囲内の分数値を含むものと理解されるべきである。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指し、これは、通常２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対が「軽」（Ｌ）鎖と「重」（Ｈ）鎖を有する。抗体の軽鎖は、κとλの２つのカテゴリーに分類できる。重鎖は、μ、δ、γ、α、εの５つのカテゴリーに分類できる。重鎖の違いにより、抗体はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥの５つのカテゴリーに分類できる。軽鎖と重鎖内では、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接続されており、重鎖はまた約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を有する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び補体系の成分Ｃ１ｑを含む宿主組織又は因子への、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨ及びＶＬはまた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる可変性の高い領域に細分することもでき、ここには、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、３つのＣＤＲと４つのＦＲが以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗体結合部位を形成する。各領域又は構造ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９８７ ａｎｄ １９９１））， 又は Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ （１９８７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７； Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３ の定義に従う。
本明細書に記載のモノクローナル抗体変種は、伝統的な遺伝子工学的方法を通じて得ることができる。当業者は、核酸変異を使用してＤＮＡ分子を修飾する方法を十分に知っている。さらに、重鎖及び軽鎖の変種をコードする核酸分子は、化学合成によっても入手することができる。
本発明において、配列同一性（相同性）及び配列類似性パーセントを決定するために使用されるアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０であり、それぞれ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９７７） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ． ２５： ３３８９－３４０２ 及び Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ に記載されている。ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０を使用して、例えば参考文献に記載されているパラメータ又はデフォルトパラメータを使用して、本発明のアミノ酸配列同一性のパーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するために使用されるソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ を通じて公的に入手可能である。
本明細書に記載されるように、あるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する前記アミノ酸配列には、前記アミノ酸配列と実質的に同一であるポリペプチド配列、例えば、本明細書に記載の方法（標準パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析など）を使用する場合、本発明のポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の同一性を有する配列が含まれる。
本明細書で使用される前記アミノ酸配列の変異体は、前記アミノ酸配列に対して７０％を超える同一性、例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を超える同一性を有する配列、例えば、アミノ酸の３、２、又は１個の置換、欠失、又は付加を有する配列を指す。好ましくは、３つ以下のアミノ酸が置換、付加、又は欠失される。より好ましくは、２つ以下のアミノ酸が置換、付加、又は欠失される。最も好ましくは、１つ以下のアミノ酸が置換、付加、又は欠失される。
「置換」変種は、天然配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸がその同じ位置に挿入されたものである。置換は、分子内で１つのアミノ酸のみが置換される単一の置換、又は同じ分子内で２つ以上のアミノ酸が置換される複数の置換であってもよい。連続した部位で複数の置換を行うことができる。同様に、１つのアミノ酸が複数の残基で置換されていてもよく、そのような変種には置換と挿入の両方が含まれる。「挿入」（又は「付加的」）変種は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然配列にすぐ隣接する特定の位置に挿入されるものである。アミノ酸のすぐ隣とは、アミノ酸のα－カルボキシル又はα－アミノ官能基への結合を意味する。「欠失」変種は、天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されているものである。通常、欠失変種では、分子の特定の領域で１つ又は２つのアミノ酸が欠失している。
本発明において、ＭＭＡＥの構造は、以下の通りである：
本発明において、式ＩのＬ－Ｄは、以下で表される構造を有するＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥである：
本発明では、以下に示すように、抗ＥＧＦＲ抗体Ａｂは、それ自体のジスルフィド結合が還元された後に生成されるチオールを介してＬ－Ｄに連結される：
本発明において、薬物抗体比（ＤＡＲ）又は薬物負荷は、ｐ、すなわち、式Ｉ：Ａｂ－（Ｌ－Ｄ）ｐの分子中の抗体当たりの薬物モジュール（すなわち、細胞傷害性薬剤）の平均数で表され、これは整数でも分数でもよい。一般式ＩのＡＤＣには、一連の薬物モジュールと結合した抗体の集合が含まれる。結合反応によるＡＤＣ製剤中の抗体当たりの薬物モジュールの平均数は、従来の手段、例えば質量分析法、ＥＬＩＳＡ、ＨＩＣ及びＨＰＬＣなどで証明することができる。ｐ内のＡＤＣの定量的分布も決定することができる。場合によっては、他のＤＡＲを予測ＡＤＣから特定のｐ値を有する均質なＡＤＣの分離、精製及び検証は、逆相ＨＰＬＣや電気泳動などの手段によって行うことができる。
特定の実施態様において、結合反応で、理論上の最大値未満の薬物部分が抗体に結合される。一般的に、抗体は、薬物部分を連結できる多くの遊離の反応性システインチオール基を含んでいない。実際、抗体内のほとんどのシステインチオール基はジスルフィド架橋として存在する。特定の実施態様において、抗体は、部分的又は完全な還元条件下で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などの還元剤を用いて還元されて、反応性システインチオール基を生成することができる。
本発明において、「治療」とは、予防のため又は臨床病理の過程において、治療される個体又は細胞の自然な経過を変更しようとする臨床的介入を指す。治療の所望の効果には、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的影響の軽減、転移の予防、疾患の進行の遅延、疾患状態の改善又は緩和、及び予後の解消又は改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の抗体薬物複合体は、疾患又は障害の発症を遅らせるため、又は疾患又は障害の進行を遅らせるために使用される。治療の成功及び疾患の改善を評価するための上述のパラメータは、医師が熟知してしている日常的な手順によって容易に測定することができる。がん治療の場合、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、及び／又は奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
本発明において、「被験体」という用語は脊椎動物を指す。いくつかの実施態様において、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されるものではないが、家畜（例えば、牛）、ペット（例えば、猫、犬、及び馬）、霊長類、マウス及びラットが含まれる。いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトを指す。
本発明において、「有効量」とは、必要な用量及び時間で所望の治療効果又は予防効果を達成するのに有効な量を指す。本発明の物質／分子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の音を誘発する物質／分子の能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、物質／分子の毒性又は有害な結果を治療上有益な効果が凌駕している量も包含する。「予防有効量」とは、所望の予防効果を達成するために必要な用量及び時間で有効な量を指す。必ずしもではないが、通常、予防有効用量は、疾患の発症前又は疾患の初期段階で被験体に投与されるため、治療有効量よりも少ないであろう。がんの場合、治療有効量の薬物は、がん細胞の数が減少させ、腫瘍サイズを縮小し、周囲の臓器へのがん細胞の浸潤を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させる）、腫瘍の転移を阻害し（すなわち、ある程度遅くし、好ましくは停止させる）、腫瘍の増殖をある程度阻害し、及び／又はがんに関連する１つ又はそれ以上の症状をある程度軽減する。
疾患の予防又は治療について、本発明の抗体薬物複合体の適切な用量（単独で使用する場合、又は化学療法剤などの１つ又はそれ以上の他の治療薬と組み合わせて使用する場合）は、治療する疾患の種類、抗体薬物複合体の種類、疾患の重症度及び進行度、抗体薬物複合体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療法、患者の病歴、及び抗体薬物複合体に対する反応性、及び主治医医師の判断に依存するであろう。適切には、抗体薬物複合体は、１回又は一連の治療にわたって患者に投与される。
本明細書で使用される「医薬的に許容し得る担体」には、一般的に、使用される用量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に対して、非毒性である医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は安定剤が含まれる。通常、生理学的に許容し得る担体とは、ｐＨ緩衝水溶液を指す。生理学的に許容し得る担体の例には、緩衝液、例えばホスフェート、シトレート、及びその他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化物質；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）が含まれる。
いくつかの実施態様において、医薬的に許容し得る塩は無機酸塩又は有機酸塩であり、ここで、無機酸塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、硫酸塩、又はリン酸塩であり、有機酸塩は、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、α－ケトグルタル酸塩、α－グリセロリン酸塩、アルキルスルホン酸塩、又はアリールスルホン酸塩であり；好ましくは、アルキルスルホン酸塩はメタンスルホン酸塩又はエタンスルホン酸塩であり；アリールスルホン酸塩は、ベンゼンスルホン酸塩又はｐ－トルエンスルホン酸塩である。
医薬的に許容し得る塩は、当分野で周知の標準手順を使用して、例えば、十分な量の塩基性化合物を、医薬的に許容し得るアニオンを提供する適切な酸と反応させることによって得ることができる。
本発明において、ＫＲＡＳ遺伝子はＫ－ＲＡＳ遺伝子と同じ意味を有する。これは、Ｋ－ｒａｓタンパク質をコードするＲＡＳ遺伝子ファミリーのメンバーであり、様々な腫瘍の生成、増殖、移動、拡散、及び血管新生に関連している。その一般的な変異部位は、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子のエクソン２のコドン１２と１３、及びエクソン３のコドン６１である。変異ホットスポットは７つある：Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ａ、及びＧ１３Ｖ／Ｄ。これらの７つの変異は９０％超を占める。本発明の１つの実施態様において、腫瘍は、ＥＧＦＲ過剰発現に関連するＫＲＡＳ遺伝子変異を有する腫瘍である。
本発明において、ＢＲＡＦ（ｖ－ｒａｆマウス肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログＢ１）遺伝子はがん原遺伝子であり、ＲＡＦファミリーのメンバーである。ヒト腫瘍の約８％はＢＲＡＦ変異を有し、ＢＲＡＦ遺伝子変異のほとんどはＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異の形態である。この変異は、腫瘍の成長、増殖、浸潤、及び転移に重要な下流のＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の継続的な活性化を引き起こす。本発明の１つの実施態様において、腫瘍は、ＥＧＦＲ過剰発現に関連するＢＲＡＦ遺伝子変異を有する腫瘍である。
本発明において、２０種類の従来のアミノ酸及びその略語は従来の用法に従う。参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第２版， Ｅ．Ｓ． Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ． Ｇｒｅｎ， Ｅｄｓ．， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ． （１９９１）） を参照されたい。
本発明における抗体ＢＡ０３は、中国発明特許出願ＣＮ１０３７７２５０４ＡにおけるＢＡ０３である。その調製方法については、特許出願の実施例３を参照されたい。抗体の各部分の配列は以下のとおりである：
重鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＮＹＤＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＤＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号１）。
配列中、下線部はそれぞれＣＤＲ１（配列番号５）、ＣＤＲ２（配列番号６）、及びＣＤＲ３（配列番号７）である；
下線のない部分はそれぞれＦＲ１（配列番号８）、ＦＲ２（配列番号９）、ＦＲ３（配列番号１０）、及びＦＲ４（配列番号１１）である。
軽鎖可変領域の配列は以下のとおりである：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＮＮＥＷＰＴＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （配列番号２）。
配列中、下線部はそれぞれＣＤＲ１（配列番号１２）、ＣＤＲ２（配列番号１３）、及びＣＤＲ３（配列番号１４）である；
下線のない部分はそれぞれＦＲ１（配列番号１５）、ＦＲ２（配列番号１６）、ＦＲ３（配列番号１７）、及びＦＲ４（配列番号１８）である。
重鎖定常領域の配列は以下のとおりである：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ （配列番号３）。
軽鎖定常領域の配列は以下のとおりである：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ （配列番号４）。
以下、特定の実施態様を参照して本発明をさらに説明する。
実施例１：抗体薬物複合体の調製方法
１５ｍＬの３０ＫＤ限外濾過装置を使用して、１０ｍｇの抗体ＢＡ０３を還元緩衝液（２５ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に、合計３回緩衝液交換し（最終容量は約１ｍＬであった）、新しいエッペンドルフ遠心管（秤量済み）に移し、秤量した。タンパク質の濃度を検出し、タンパク質の総量を算出した。２．５倍モル量のＤＴＴを抗体に加え、混合物を室温で２時間インキュベートし、混合を続けた。混合物を、１５ｍｌの３０ＫＤ限外濾過装置を使用して、結合緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）に、合計３回緩衝液交換した。濃縮液を採取し、Ａ２８０によりタンパク質濃度を測定し、秤量して総タンパク質量を算出した。１０μｌの試料を採取し、エルマン試験により遊離チオール基の数を測定し；
そしてその遊離チオール基のモル濃度を以下の式に従って算出した：
ｂ：キュベットの光路長（通常１ｃｍ）。
遊離チオール基のモル数は、遊離チオール基のモル濃度と総タンパク質溶液の体積から算出した。
遊離チオール基のモル数の１．１倍のＶｃ－ＭＭＡＥ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈａｏｙｕａｎ Ｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、カタログ番号ＨＹ－１５５７５）（ＤＭＳＯに溶解されている）を還元抗体に加え、混合物をよく混合して、断続的に混合しながら室温で２時間反応させた。ｖｃ－ＭＭＡＥのモル数の２０倍のＮ－アセチルシステインを反応系に加えた。反応混合物をよく混合し、５分間放置した。１５ｍｌの３０ＫＤ限外濾過装置を使用して、混合物を結合原液（２０ｍＭクエン酸Ｎａ、０．３％ＮａＣｌ、５％トレハロース、０．０５％ツイーン－８０、ｐＨ６．０）に合計３回緩衝液交換して、抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を得た。試料は４℃で保存した。抗体薬物複合体ＭＹＫ－３は、Ｎ－アセチルシステインで結合反応を停止させた後に調製されたことに注意されたい。以後の工程（すなわち、混合物を１５ｍｌの３０ＫＤ限外濾過装置を使用して結合原液に緩衝液交換した）を実行して、保存及び後の使用のために、抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を結合原液中に入れた。
薬物対抗体比の決定：
調製した抗体薬物複合体ＭＹＫ－３をＨＩＣ－ＨＰＬＣで分析（Ｊｕｎ Ｏｕｙａｎｇ， Ｄｒｕｇ－Ｔｏ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＤＡＲ） Ｒａｔｉｏ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， Ｌａｕｒｅｎｔ Ｄｕｃｒｙ （ｅｄ．）， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １７， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ １０４５， ｐ２７５－２８３）して、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を決定した。図１に示すように、スペクトルのピーク面積に基づいて算出された平均ＤＡＲは４．１であった。
実施例２：細胞に対する抗体薬物複合体ＭＹＫ－３のインビトロの阻害活性の検出
細胞に対する阻害活性の検出方法：
１．１ 蘇生した細胞株を３～４世代継代した後、最初に培地を除去し、次に細胞を５ｍＬのＤＰＢＳで１回リンスし、３ｍＬのトリプシンで消化し、培地に再懸濁して、遠心分離機を使って遠心分離した。上清を廃棄した。再度細胞を培地に再懸濁した。０．５ｍＬの細胞再懸濁液を採取して、セルカウンターを用いて細胞を計数した。細胞を９６ウェル細胞培養プレートに入れた（ＤｉＦｉ細胞は１００００細胞／ウェルで播種し、ＨＴ－２９細胞は５０００細胞／ウェルで播種し、Ａ５４９細胞は２０００細胞／ウェルで播種し、Ｕ８７－ＭＧ細胞は３０００細胞／ウェルで播種し、そしてＬｏＶｏ細胞は４０００細胞／ウェルで播種した）。２４時間の培養後、一連の濃度で希釈したモノクローナル抗体ＢＡ０３及び抗体薬物複合体ＭＹＫ－３を加え、７２時間インキュベートした。次に、２０μｌのＣＣＫ８発色試薬を各ウェルに加え、マイクロプレートリーダーで４５０～６５０ｎｍの波長でＯＤ４５０～６５０を試験し、４パラメータフィッティングを実行した。
インビトロの細胞に対する阻害活性の検出結果：
以下の細胞株は、中国科学院上海細胞生物学研究所（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入した。
ＥＧＦＲ高発現のＤｉＦｉ細胞（ヒト結腸直腸がん細胞）における活性：ＭＹＫ－３はモノクローナル抗体ＢＡ０３よりも細胞増殖阻害活性が有意に高く、図２に示すように、ＥＣ５０は約１０倍低下した（ＢＡ０３のＥＣ５０は５１．９ｎｇ／ｍｌで、ＭＹＫ－３のＥＣ５０は５．１ｎｇ／ｍｌであった）。
ＥＧＦＲ発現が中程度及び低い他の腫瘍細胞における活性：モノクローナル抗体自体と比較して、ＭＹＫ－３は、ＥＧＦＲの発現が中程度及び低い（図３、図４、及び図５に示すように）がん細胞（ヒト結腸がん細胞ＨＴ２９、ヒト肺がん細胞Ａ５４９、ヒト脳星状芽細胞腫細胞Ｕ８７－ＭＧ）に対して明らかな細胞増殖阻害活性も示し、ここで、ＨＴ－２９のＥＣ５０は６１１ｎｇ／ｍｌであり、Ａ５４９のＥＣ５０は２８．３μｇ／ｍｌであり、そしてＵ８７－ＭＧのＥＣ５０は５．３μｇ／ｍｌであった。
さらに、我々は、ＥＧＦＲが中程度に発現しているＫＲＡＳ変異体結腸がん細胞であるＬｏＶｏにおけるその活性も試験し（Ｄｕｎｎ ＥＦ， Ｉｌｄａ Ｍ， Ｍｙｅｒｓ ＲＡ， Ｈｉｎｔｚ ＫＡ， Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＤＡ， Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＥＡ， Ｌｉ Ｃ ａｎｄ Ｗｈｅｅｌｅｒ ＤＬ． Ｄａｓａｔｉｎｉｂ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｓ ＫＲＡＳ ｍｕｔａｎｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｒｓ ｔｏ ｃｅｔｒｕｘｉｍａｂ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１１； ３０： ５６１－５７４）、ＭＹＫ－３がＫＲＡＳ変異体結腸がん細胞ＬｏＶｏに対して顕著な腫瘍増殖阻害活性を示すことを見いだした（図６に示すように、ＥＣ５０は３．２μｇ／ｍｌであった）が、ＢＡ０３は単独で使用した場合、その細胞株に対してほとんど阻害活性を示さなかった。
実施例３：マウスにおけるインビボ腫瘍異種移植試験
マウスにおけるインビボの腫瘍移植試験の実験方法：
ＨＴ－２９結腸がん細胞は、ＥＧＦＲの発現が比較的低く、ＢＲＡＦ変異を有する細胞株であり、結腸直腸がんの治療用に現在市販されているＥＧＦＲ標的化モノクローナル抗体エルビタックスは、ＨＴ－２９細胞株に対する増殖阻害活性がなかった。
ＨＴ－２９細胞異種移植モデル：対数増殖期の腫瘍細胞を収集して計数し、次に１×ＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液の濃度を３×１０７／ｍｌに調整した。腫瘍細胞を、１ｍｌシリンジ（４ゲージ針）を用いて、ヌードマウスの背中の右側の皮下に、３×１０６／０．１ｍｌ／マウスで接種した。腫瘍体積が１５０～２００ｍｍ３に達したとき、群間のマウス腫瘍体積及び体重が確実に均一になるように、ランダム化ブロック法によりマウスを１群当たり８匹ずつで群分けした。各群の腫瘍体積の平均値とすべての実験動物の腫瘍体積の平均値との差は±１０％以下であった。尾静脈投与を４日毎に１回に計４回（１日目、５日目、９日目、及び１３日目）行い、定期的にマウスの腫瘍体積と体重を測定した。各投与群のマウスは８匹であった。
マウスにおける腫瘍異種移植試験の実験結果
マウスにおけるＨＴ－２９結腸がん異種移植試験：試験には５つの群があり、これらは、緩衝液群（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３％塩化ナトリウム、５％トレハロース、０．０５％ツイーン８０、ｐＨ６）、ＢＡ０３モノクローナル抗体群（５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＹＫ－３群（１ｍｇ／ｋｇ）、ＭＹＫ－３群（５ｍｇ／ｋｇ）、及び非結合ＡＤＣ群（５ｍｇ／ｋｇ）（ヒトＩｇＧ－ｖｃＭＭＡＥ結合体、ここで、ＩｇＧはヒト血清から精製して得られたＩｇＧであり、この結合体はＭＹＫ－３と同様の方法で調製された）であった。ＭＹＫ－３を投与したマウスの異種移植腫瘍体積は対照群よりも有意に小さく、顕著な抗腫瘍増殖効果を示した（図７）。１８日目では、ＭＹＫ－３を５ｍｇ／Ｋｇ投与した群では、緩衝液群と比較して腫瘍増殖抑制率が最大５４％であり、同用量のモノクローナル抗体ＢＡ０３の群と比較して腫瘍増殖抑制率は最大４６％であり、その腫瘍増殖阻害率は非結合ＡＤＣと比較して最大４２％であった。
マウスの体重：ＭＹＫ－３を投与したマウスの体重は、対照群と比較して有意な変化を示さず（図８を参照）、ＭＹＫ－３がマウスの体重を減少させる毒性効果を有さないことを示している。
実施例４：ヌードマウスにおけるＫＲＡＳ変異体結腸がん細胞ＬｏＶｏを有する異種移植腫瘍に対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性
実施例３のモデル構築（２×１０６細胞／０．１ｍｌ／マウスで腫瘍細胞を接種）及び投与方法に従って、ヌードマウスでＫＲＡＳ変異体結腸がん細胞ＬｏＶｏを有する異種移植腫瘍に対するＭＹＫ－３の増殖阻害活性が試験された。実験は６つの群で行われ、これらは、希釈緩衝液群（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３％ＮａＣｌ、５％トレハロース、０．０５％ツイーン８０、ｐＨ６）、エルビタックスモノクローナル抗体群（３ｍｇ／ｋｇ）、ＭＹＫ－３群（０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇの３つの用量）、及び非結合ＡＤＣ対照群（３ｍｇ／ｋｇ）であった。ここで、非結合対照ＡＤＣは同じ負荷の結合ＡＤＣ対照（これは抗ＣＤ２０ｍＡｂ－ｖｃＭＭＡＥであった）であった。結合体の調製方法はＭＹＫ－３と同様であった。実験結果を図９に示す。
図からわかるように、ＭＹＫ－３は３ｍｇ／Ｋｇの用量でＬｏＶｏ細胞腫瘍の増殖を完全に阻害し、ＭＹＫ－３は１ｍｇ／Ｋｇの用量では３ｍｇ／Ｋｇ用量の市販薬エルビタックスよりも高い活性を示した。
実施例５：ＭＹＫ－３の安定性に対するｐＨの影響
実施例１で得られた抗体薬物複合体を出発点として使用して、本発明者はｐＨについてのより詳細な試験を行った。結果は、最適なＭＹＫ－３配合物のｐＨは６．３であることを示した。すなわち、最適な配合物には、２０ｍＭクエン酸緩衝液、５．５％トレハロース二水和物、０．３％ＮａＣｌ、及び０．０５％ＰＳ８０、ｐＨ６．３を含み、抗体薬物複合体ＭＹＫ－３の濃度は４ｍｇ／ｍＬである。
２０ｍＭクエン酸緩衝液（５．５％トレハロース二水和物、０．３％ＮａＣｌ、及び０．０５％ＰＳ８０を含む）中のＭＹＫ－３の品質に対する異なるｐＨの影響を調べるために、実施例１と同じ手順を行ったが、結合原液の配合物（調査対象の配合物Ｆ１～Ｆ５）は、結合反応をＮ－アセチルシステインでクエンチした後、結合反応生成物を１５ｍｌの３０ＫＤ限外濾過装置を使用して緩衝液交換した。
調査対象の配合物Ｆ１～Ｆ５は、クエン酸緩衝液のｐＨを除き、組成及び濃度が同じであった。具体的には：４ｍｇ／ｍＬの抗体薬物複合体ＭＹＫ－３、２０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．６（Ｆ１）、６．０（Ｆ２）、６．３（Ｆ３）、６．５（Ｆ４）、又は６．７（Ｆ５）、５．５％トレハロース二水和物、０．３％ＮａＣｌ、及び０．０５％ＰＳ８０。
具体的には、結合反応生成物を調査対象の配合物Ｆ１～Ｆ５（ｐＨ：５．６～６．７）に交換し、次に４０±２℃／７５％±５％ＲＨで１０日間試験し、設定した時点で試料を採取して分析した。試験項目には、外観、ｐＨ、タンパク質濃度、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、及びＨＩＣが含まれた。試料が濁っているように見える場合、又は明らかな乳濁がある場合、その後の分析（例えば、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、ＨＩＣ）は実行されない。具体的な実験計画を表１に示す。
外観に関しては、時間の経過とともに、４０℃に３日間置いたＦ１の試料は濁り、４０℃に７日間置いたＦ２の試料は濁り、Ｆ１及びＦ２の試料では、温度を室温及び２～８℃に下げると明らかな乳濁及び沈殿が観察され、そしてｐＨが低くなるほど、より多くの沈殿が発生した。しかし、他の配合物の試料は常に透明なままであり、大きな変化は観察されなかった。
ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、及びＨＩＣの試験データと変化傾向を表２と図１０に示される。４０℃に３日間置いたＦ１の試料は濁ったため、配合物Ｆ１の試料は３日目と７日目にＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、及びＨＩＣの試験を実施しなかった。また、４０℃に７日間置いたＦ２の試料は濁ったため、Ｆ２の試料は７日目にＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、及びＨＩＣの試験を実施しなかった。ＨＩＣデータは、ｐＨ値が異なっても、Ｆ３とＦ４のＤＡＲは基本的に変化しない（図１０ｃ）ことを示している。ＳＥＣデータは、ｐＨの上昇に伴い、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５のＨＭＷ％の成長率が下降傾向を示し、これらの下降傾向は基本的に同じであることを示している（図１０ａ）。ｉＣＩＥＦデータは、ｐＨの上昇に伴い、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５の酸性ピーク％が上昇傾向を示すが、Ｆ３の上昇傾向はＦ４及びＦ５の上昇傾向よりも明らかに低いことを示している（図１０ｂ）。上記の試験データに基づいて、及び外観、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦ、ＨＩＣなどに関する試験結果を考慮すると、ＭＹＫ－３の最適な配合物は、配合物のｐＨが６．３であるＦ３であると決定される。従って、配合物中のクエン酸及びクエン酸ナトリウムの量が調整され、最終配合物はｐＨ６．３の２０ｍＭクエン酸緩衝液となる。
上記のデータに基づいて、最終的なＭＹＫ－３配合物は以下のとおりであった。
本発明の特定の実施態様を詳細に説明したが、当業者であれば、開示されたすべての教示に従って詳細に修正及び置換を行うことができ、これらの変更は本発明の範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって与えられる。

Claims (10)

  1. 濃度１～２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２～６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは４ｍｇ／ｍＬの抗体薬物複合体又はその塩、
    濃度１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～２５ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ、及びｐＨ６．３～６．７、好ましくは６．３～６．５、より好ましくは６．３のクエン酸緩衝液、
    濃度１～１０％、好ましくは４～７％、より好ましくは５．５％のトレハロース、
    濃度０．１～２％、好ましくは０．１～０．５％、より好ましくは０．３％のＮａＣｌ、
    濃度０．０１～０．２％、好ましくは０．０１～０．１％、及びより好ましくは０．０５％のツイーン８０を含む、抗体薬物複合体製剤であって、
    ここで、前記抗体薬物複合体は式Ｉ
    の構造を有しており、
    式中：
    Ａｂは抗ＥＧＦＲ抗体を表し、ここで前記ＥＧＦＲ抗体は重鎖及び軽鎖を含み、ここで重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５～７に示される配列又はそれらの変異体を含み、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１２～１４に示される配列又はそれらの変異体を含み；
    Ｌはリンカーを表し、前記リンカーは６－マレイミドカプロイル－バリン－シトルリン－ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＭＣ－ｖｃ－ＰＡＢ）であり；
    Ｄは細胞傷害性薬剤を表し、前記細胞傷害性薬剤はＭＭＡＥであり；そして
    ｐは、１～９、好ましくは２～６、より好ましくは３～５を表す、抗体薬物複合体製剤。
  2. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が以下の特徴のうちの１つ又はそれ以上を有する、請求項１に記載の抗体薬物複合体製剤：
    １）前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域は、それぞれ配列番号８～１１に示される配列又はそれらの変異体を含む；
    ２）前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域は、それぞれ配列番号１５～１８に示される配列又はそれらの変異体を含む；
    ３）前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ定常領域又はそれらの変異体から選択され；
    好ましくは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択される；そして
    ４）前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域は、ヒトのラムダ定常領域及びカッパ定常領域又はそれらの変異体から選択される。
  3. 前記抗ＥＧＦＲ抗体が以下の特徴のうちの１つ又はそれ以上を有する、請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体製剤：
    １）前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号１に示される配列、又は配列番号１に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含み；
    好ましくは前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖可変領域の配列は、配列番号１に示される；
    ２）前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号２に示される配列、又は配列番号２に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含み；
    好ましくは前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖可変領域の配列は、配列番号２に示される；
    ３）前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域の配列は、配列番号３に示される配列、又は配列番号３に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含み；
    好ましくは前記抗ＥＧＦＲ抗体の重鎖定常領域領域の配列は、配列番号３に示される；
    ４）前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域の配列は、配列番号４に示される配列、又は配列番号４に示される配列と、７０％を超える、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超える同一性を有する配列を含み；
    好ましくは前記抗ＥＧＦＲ抗体の軽鎖定常領域の配列は、配列番号４に示される。
  4. 前記トレハロースがトレハロース二水和物であり、
    又は、前記クエン酸緩衝液がクエン酸とクエン酸ナトリウムから調製され、
    好ましくは、前記クエン酸がクエン酸一水和物であり、
    好ましくは、前記クエン酸ナトリウムがクエン酸ナトリウム二水和物である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体薬物複合体製剤。
  5. 以下を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の製剤を調製する方法：
    １）請求項１～３のいずれか１項で定義される抗ＥＧＦＲ抗体を還元剤と還元反応させて、還元型抗ＥＧＦＲ抗体を得ること；
    ２）前記還元抗ＥＧＦＲ抗体をｖｃＭＭＡＥと結合反応させること；そして
    ３）前記結合反応を停止させ、結合反応生成物の緩衝液交換を行って、請求項１～４のいずれか１項で定義される抗体薬物複合体製剤を得ること。
  6. （１）請求項１～３のいずれか１項で定義される前記抗ＥＧＦＲ抗体（好ましくは１０ｍｇ）を還元緩衝液（好ましくは２５ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に交換し（好ましくは３回）、タンパク質の濃度を検出し、そしてタンパク質の量を算出すること；
    （２）工程（１）の生成物にＤＴＴを加えて、室温で１～５時間（好ましくは２時間）反応させて、還元型抗ＥＧＦＲ抗体を得ることであって、ここで、前記ＤＴＴの物質量が前記タンパク質の物質量の２．０～３．０倍、好ましくは２．５倍であること；
    （３）工程（２）の生成物を結合緩衝液（好ましくは５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に交換し（好ましくは３回）、そして遊離チオール基の物質量を算出すること；
    （４）工程（３）の生成物にｖｃ－ＭＭＡＥを加えて、室温で１～５時間（好ましくは２時間）反応させることであって、ここで、前記ｖｃ－ＭＭＡＥの物質量が前記還元型抗ＥＧＦＲ抗体の物質量の１．０～１．５倍、好ましくは１．１倍であること；
    （５）工程（４）の生成物にＮ－アセチルシステインを加えて、静置して（好ましくは５分間）、請求項１で定義される抗体薬物複合体を含む混合溶液を得ることであって、ここで、前記Ｎ－アセチルシステインの物質量が前記ｖｃ－ＭＭＡＥの物質量の１５～２５倍、好ましくは２０倍であること；そして
    （６）工程（５）の混合溶液を結合原液に交換して（好ましくは３回）、抗体薬物複合体製剤を得ること、を含む請求項５に記載の方法であって、
    ここで、前記結合原液は、
    濃度が１０～５０ｍＭ、好ましくは１５～２５ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭであり、ｐＨが６．３～６．７、好ましくは６．３～６．５、より好ましくは６．３のクエン酸緩衝液、
    濃度が１～１０％、好ましくは４～７％、より好ましくは５．５％のトレハロース、
    濃度が０．１～２％、好ましくは０．１～０．５％、より好ましくは０．３％のＮａＣｌ、そして
    濃度が０．０１～０．２％、好ましくは０．０１～０．１％、より好ましくは０．０５％のツイーン８０を含み；
    前記抗体薬物複合体製剤において、前記抗体薬物複合体の濃度が１～２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２～６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは４ｍｇ／ｍＬであり、
    好ましくは、前記トレハロースがトレハロース二水和物であり；
    好ましくは、前記クエン酸緩衝液がクエン酸とクエン酸ナトリウムから調製され；
    好ましくは、前記クエン酸がクエン酸一水和物であり；
    好ましくは、前記クエン酸ナトリウムがクエン酸ナトリウム二水和物である、方法。
  7. 請求項５～６のいずれか１項に記載の方法により調製される抗体薬物複合体製剤。
  8. 任意選択的に医薬的に許容し得る担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む、請求項１～４及び７のいずれか１項に記載の製剤を含む組成物。
  9. 請求項１～４及び７のいずれか１項に記載の製剤又は請求項８に記載の組成物の使用であって、
    １）ＥＧＦＲ関連疾患を予防及び／又は治療するための医薬の調製における使用；
    ２）腫瘍の血管新生を阻害するための、腫瘍の進行を遅らせるための、腫瘍の増殖を阻害するための、又は腫瘍細胞の増殖を阻害するための試薬若しくは医薬の調製における使用、からなる群より選択される１つ又はそれ以上である、使用。
  10. 請求項９に記載の使用であって、ここで、
    前記ＥＧＦＲ関連疾患が、ＥＧＦＲ関連腫瘍、さらに例えば、結腸がん、直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、食道がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、及び脳神経膠腫からなる群より選択されるＥＧＦＲ過剰発現に関連する腫瘍；
    又は前記腫瘍が、結腸がん、直腸がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、食道がん、乳がん、腎臓がん、前立腺がん、胃がん、膵臓がん、及び脳神経膠腫からなる群より選択され；
    又は前記腫瘍が、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する腫瘍、さらに例えば、ＫＲＡＳ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、肺がん、又は膵臓がんである腫瘍；
    又は前記腫瘍が、さらに例えば、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する結腸がん、直腸がん、及び肺がんからなる群より選択される、ＢＲＡＦ遺伝子変異を有する腫瘍である、使用。
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